GILSON JOSÉ CORRÊA - pos.uea.edu.br · sociodemográficos associados à neoplasia do colo uterinoforam estudados a partir da análise de correspondência, sendo empregado o programa

PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM

MULHERES PORTADORAS DE LESÕES INTRA-EPITELIAIS

ESCAMOSAS DE ALTO GRAU E CARCINOMA EPIDERMÓIDE

INVASOR DO COLO UTERINO

GILSON JOSÉ CORRÊA

MANAUS 2005

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS – UEA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS – FMTAM

MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

ii

GILSON JOSÉ CORRÊA

PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM

MULHERES PORTADORAS DE LESÕES INTRA-EPITELIAIS

ESCAMOSAS DE ALTO GRAU E CARCINOMA EPIDERMÓIDE

INVASOR DO COLO UTERINO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Medicina Tropical da Universidade

do Estado do Amazonas em convênio com a

Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, como requisito para obtenção do grau de Mestre

em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Prof° Dr. SINÉSIO TALHARI

Co-orientadora: Profa CRISTINA MARIA BORBOREMA DOS SANTOS

MANAUS 2005

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

CORRÊA, Gilson José Prevalência do Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino / Gilson José Corrêa. Manaus – AM: UEA; FMT-AM; 2005. ix, 70 p.: il. Dissertação (Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas) 1. HPV 2. PCR 3. Câncer do colo uterino I. Título

iv

Este trabalho foi desenvolvido na Fundação de Medicina Tropical do

Amazonas-FMTAM, com recursos parcialmente providos pela Fundação Centro

de Controle de Oncologia (FCECON) e Superintendência da Zona Franca de

Manaus através do convênio nº 035/2002

v

Aos meus pais (in memorian), minha eterna gratidão pela educação e ensinamentos de vida.

Aos meus filhos, Gabriela, Juliana, Giovanna

e Gilson Junior, razão da minha existência.

À minha esposa Kátia Socorro, amiga e companheira de todos os momentos.

vi

AGRADECIMENTOS

À Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical do

Amazonas e Fundação Centro de Oncologia pela construção deste ideal.

Ao Professor Doutor Sinésio Talhari, meu orientador e amigo, pela

transmissão dos conhecimentos, pelo estímulo ao desenvolvimento da pesquisa,

pela exigência de cumprir metas e alcançar objetivos, pelo exemplo de vida médica.

À Professora Cristina Borborema dos Santos, dedicada co-orientadora que

abriu as portas do laboratório de biologia molecular e não mediu esforços para a

realização deste trabalho.

Ao Professor Paulo Costa, odontólogo da Fundação Centro de Controle de

Oncologia, pelo apoio incondicional no trabalho de pesquisa biomolecular, sem o

qual não seria possível a concretização deste projeto.

Ao Dr. Manoel Jesus Pinheiro Coelho, Presidente da Fundação Centro de

Controle de Oncologia, amigo e parceiro, pelo seu incansável esforço na construção

de um hospital humano e na valorização da formação acadêmica e profissional.

Ao Professor Doutor Spartaco Astolfi Filho, por compartilhar o conhecimento

entre as instituições de pesquisa, o que engrandece e dignifica o trabalho do

Laboratório de Biologia Molecular da UFAM.

À Professora Doutora Maria das Graças Vale Barbosa, dinâmica

coordenadora do curso de mestrado da UEA-FMTAM, pela dedicação, carinho,

estímulo e apoio, durante todo o desenvolvimento do nosso curso.

A Felicien Gonçalves Vasquez, pelo trabalho estatístico dos dados.

À Maria da Conceição Santos Tufic, secretária do Curso de Mestrado, pela

prestimosidade.

Aos funcionários da Fundação Centro de Controle de Oncologia, a gratidão.

Aos meus colegas do curso de mestrado, Alex, Claudia, Franklin, Gastão,

Gildo, Ione, Iran, Luiza Anne, Magela, Marianna, Rauíres, Silvia, Socorro Salazar e

Viviane, pelo convívio fraterno e inesquecível.

As pacientes portadoras de câncer do colo uterino, as quais dedicamos este

trabalho, pelo testemunho da fé no Ser Supremo e pelo ensino da valorização do

maior dos bens - a preciosidade da vida humana.

vii

RESUMO

O câncer do colo uterino constitui um importante problema de saúde pública

nos países em desenvolvimento. No Brasil, as maiores taxas de incidência e

mortalidade concentram-se nas capitais das regiões norte e nordeste. Vários

estudos epidemiológicos associam o Papilomavírus humano (HPV) com o

desenvolvimento do câncer do colo uterino. Objetivo: no presente estudo, procurou-

se investigar a presença do HPV em mulheres portadoras de lesão intra-epitelial

escamosa de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino, visando

estimar a prevalência da infecção e pesquisar fatores sóciodemográficos associados

com a doença. Método: estudo transversal, descritivo, prospectivo, com 42 mulheres

entre 18 e 73 anos, incluindo 32 lesões intra-epiteliais escamosas cervicais e 10

carcinomas epidermóides invasores do colo uterino. As seqüências de DNA de HPV

foram pesquisadas, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR) com

iniciadores MY09/MY11 e GP5+/GP6+. Procurou-se, ainda, identificar o sorotipo

infectante, via seqüenciamento do DNA viral, por comparação das seqüências de

nucleotídeos encontradas e as armazenadas no Gene Bank. Os fatores

sociodemográficos associados à neoplasia do colo uterino foram estudados a partir

da análise de correspondência, sendo empregado o programa Statistica versão 6.0

for Windows. Conclusões: detectou-se o HPV, por PCR, nas 42(100%) mulheres

portadoras de lesão intra-epitelial escamosa de alto grau e carcinoma epidermóide,

invasor do colo uterino. Em 24(57,1%) destas amostras conseguiu-se realizar o

seqüenciamento e identificar o sorotipo de HPV. Foram identificados, por ordem

descendente de freqüência, os tipos 16, 33, 31, 56, 66 e 6. O mais comum foi o HPV

16 em 18(75,0%) casos. Na avaliação estatística dos fatores sociodemograficos

pesquisados, tais como a idade do primeiro coito antes dos 16 anos, número maior

que três parceiros sexuais, multiparidade, fumo e baixo nível socioeconômico

demonstraram significativa associação com a população do presente estudo.

Palavras chaves: HPV. PCR. Câncer colo uterino. Lesão intra-epitelial alto grau. FCECON.

viii

ABSTRACT

In developing countries uterine cervical cancer constitute a real public health

problem. In Brazil, the highest rate of incidence and mortality are concentrated in the

capital cities of the north and northeast regions. Several epidemiological studies

associate Human Papillomavirus (HPV) with the development of uterine cervical

cancer. Objective: the present study with sought to investigate the presence of HPV

in women, carries of a high grade squamous intraepithelial lesions and invasive

epidermoide carcinoma cervical. Seeking to estimate the prevalence of the infection

and to research the socialdemographic factors associated with the disease. Method:

transversal, descriptive, prospective study with 42 women between 18 and 73 years,

including 32 high grade squamous intraepithelial lesions and 10 invasive

epidermoide carcinoma cervical. The sequences of DNA of HPV were researched,

using the polymerase chain reaction (PCR) with primers MY09/MY11 and

GP5+/GP6+. It was also tried to identify the infection serum type, through the sequel

of the viral DNA, for comparison of the sequences of nucleotides found and stored in

the Gene Bank. The social demographic factors associated to the uterine cervical

cancer were studied starting from a correspondence analysis, by program Statistic

6.0 version for Windows. Conclusions: HPV was detected, by PCR, in the 42

(100%) women carriers of high grade squamous intraepithelial lesions and invasive

epidermoide carcinoma cervical. In 24 (57,1%) of the these samples it was able to

accomplish the sequels and to identify the serum type of HPV. They were indentified,

by order of descendent and frequency, the types 16, 33, 31, 56, 66, and 6. The most

common was HPV 16 out of 18 (75,0%) cases. In the statistical evaluation of the

socialdemographic factors researched, such as the first sexual intercourse before the

age of 16, women having up to or more than tree sexual partners, multipary, smoking

history and social economic low level of life demonstrated a significant association

with the population in the present study.

Key words: HPV. PCR. Uterine cervical cancer. High grade squamous intraepithelial lesion. FCECON.

ix

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Brasil. Estimativas para o ano 2005 das taxas brutas de incidência por 100.000 e de números de casos novos por câncer, em mulheres, segundo localização primária.

2

TABELA 2 Distribuição das 10 neoplasias malignas, mais freqüentes

no período de 1997 a 2001 – sexo feminino. Manaus. AM. 3

TABELA 3 Probabilidades de regressão, persistência e progressão

das lesões intra-epiteliais cervicais. 15

TABELA 4 Comparação entre métodos de detecção de genomas de

HPV. 21

TABELA 5 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres

portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a idade da população do estudo.

30


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o estado civil.

31


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a renda familiar.

33


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a procedência.

33


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a idade da primeira relação sexual.

34


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a idade da primeira gestação.

35

x

TABELA 11 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o número de partos por via vaginal.

36


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o uso de anticoncepcional hormonal oral.

36


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o fumo.

37


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo sangramento anormal.

38


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo sangramento ao coito.

38


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Caracterização das amostras e respectivos acessos ao Gene Bank.

43

xi

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Representação esquemática do genoma do HPV. 7 FIGURA 2 Demonstração do método de coleta da citologia cervical. 18 FIGURA 3 Escova utilizada para coleta de material ecto e endocervical. 24 FIGURA 4 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres

portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a escolaridade.

32

FIGURA 5 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres

portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a idade da primeira relação sexual.

34


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Análise de correspondência.

39


portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o resultado do exame histopatológico.

40

FIGURA 8 PCR - Demonstração dos fragmentos de 450 pb de HPV

com MY09/MY11, através da eletroforese em gel de agarose (amostras 1 a 40).

41

FIGURA 9 PCR - Demonstração dos fragmentos de 450 pb de HPV

com MY09/ MY11através de eletroforese em gel de agarose (amostras 41 e 42).

42

FIGURA 10 PCR - Demonstração dos fragmentos de 150 pb para HPV

com GP5+/GP6+ (Nested-PCR), através de eletroforese em gel de agarose.

42

FIGURA11 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres

portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Resultado dos sorotipos de HPV identificados nas amostras PCR positivas.

45

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

HPV Papilomavírus humano NIC Neoplasia intra-epitelial cervical LIEBG Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau LIEAG Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau IARC Agência Internacional para o Controle do Câncer INCA Instituto Nacional do Câncer FCECON Fundação Centro de Controle de Oncologia FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas UEA Universidade do Estado do Amazonas UFAM Universidade Federal do Amazonas PCR Reação em cadeia da polimerase

xiii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

O CÂNCER DO COLO UTERINO 1 1.1 Epidemiologia 1 1.1.1 Incidência 1 1.1.2 Mortalidade 4 1.1.3 Fatores de Risco 4 1.2 Papilomavírus Humano (HPV) e Câncer do Colo Uterino 6 1.2.1 Genoma do HPV 7 1.2.2 Patogênese e Papel Oncogênico do HPV 8 1.3 Lesões Precursoras do Câncer do Colo Uterino 10 1.3.1 Lesões Intra-epiteliais Escamosas 10 1.3.2 Lesões Intra-epiteliais Glandulares 11 1.3.3 Terminologia 12 1.3.4 História Natural das Lesões Precursoras 14 1.4 Métodos Diagnósticos 15 1.4.1 Colposcopia 16 1.4.2 Colpocitologia (Teste de Papanicolaou) 17 1.4.2.1 Sistema de Coleta com Base Líquida 18 1.4.3 Exame Histopatológico 19 1.4.4 Métodos Moleculares 19 1.4.4.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 20

2. OBJETIVOS 22 2.1 Geral 22 2.2 Específicos 22

3. METODOLOGIA 23 3.1 Modelo de Estudo 23 3.2 Universo de Estudo 23 3.2.1 População de Estudo 23 3.2.2 Critério de Inclusão 23 3.2.3 Critério de Exclusão 23 3.2.4 Número de Mulheres Participantes do Estudo 23 3.3 Procedimentos 23 3.3.1 Seleção de Pacientes 23 3.3.2 Orientações às Pacientes 24

xiv

3.3.3 Coleta de Material para PCR 24 3.4 Exame Histopatológico 24 3.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 25 3.5.1 Primers (iniciadores) 25 3.5.2 Extração de DNA 25 3.5.2.1 Amostras sem Sangue 25 3.5.2.2 Amostras com Sangue 26 3.5.3 PCR 26 3.5.3.1 PCR para controle do DNA 26 3.5.3.2 PCR para detecção do HPV 27 3.5.3.3 Purificação dos produtos da PCR 27 3.5.4 Seqüênciamento dos Produtos da PCR 28 3.5.4.1 Reação de Sequenciamento 28 3.5.4.2 Precipitação do Produto da Reação de Seqüenciamento 28 3.5.4.3 Eletroforese para Seqüênciamento 29 3.5.4.4 Alinhamento das Amostras Seqüenciadas 29 3.5.5 Análise do Resultado das Sequências Nucleotidicas 29

4. RESULTADOS 30 4.1 Características da População 30 4.2 Análise dos Dados Sociodemográficos 38 4.3 Resultados dos Exames Histopatológicos 40 4.4 Detecção e Identificação de HPV por PCR 41 4.4.1 Reação de Amplificação por PCR 41 4.4.2 Reação de Seqüênciamento 43

5. DISCUSSÃO 46

6. CONCLUSÃO 57

7. BIBLIOGRAFIA 58

8. ANEXOS 68

1

1 INTRODUÇÃO O Câncer do Colo Uterino 1.1 Epidemiologia 1.1.1 Incidência

Em mulheres, em todo o mundo, o câncer do colo uterino é a segunda

neoplasia maligna; a primeira é o câncer de mama. Anualmente, aproximadamente,

400.000 novos casos de câncer cervical são diagnosticados e mais de 200.000

mulheres morrem em conseqüência desta neoplasia (PARKIN et al., 2005). Em

média, 80% destes eventos ocorrem nos países em desenvolvimento (MUNOZ,

2003).

Segundo os dados do “Câncer Incidence in Five Continents”, da Agência

Internacional para o Controle do Câncer (IARC), da Organização Mundial de Saúde,

fica evidente a diferente incidência entre países europeus e americanos e países da

América do Sul, da Ásia e da África. A taxa de incidência mundial é de 16,0/100.000

mulheres (IARC, 2002).

As taxas de incidência mais elevadas encontram-se no Caribe (Haiti –

64.7/100.000), América do Sul (Bolívia – 42,0/100.000, Guyana – 40.7/100.000 e

Peru – 40.5/100.000) e Sul da África (Lesotho – 46,1/100.000). As menores taxas

encontram-se nos países do oeste asiático (Síria – 1,4/100.000; Iraque –

2,1/100.000; Qatar e Jordânia – 2,4/100.000) (IARC, 2002).

Na Europa, as taxas de incidência mais elevadas encontram-se na Sérvia e

Montenegro (34,4/100.000), Bósnia (26,6/100.000) e Romênia (30,3/100.000). As

menos elevadas encontram-se na Finlândia (6,2/100.000), Irlanda (8,4/100.000) e

Islândia (9,2/100.000) (IARC, 2002).

Nos Estados Unidos e no Canadá as taxas de incidência foram de

9,0/100.000 e 9,5/100.0000 mulheres, respectivamente (IARC, 2002).

2

No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), órgão do Ministério

da Saúde, o número de casos novos de câncer de colo do útero esperados para o

Brasil em 2005 é de 20.690, com risco estimado de 22 casos para 100 mil habitantes

(Tabela 1) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).

Sem considerar os tumores de pele, não melanoma, o câncer do colo do útero

é o mais incidente na região Norte (23/100.000). Nas regiões Sul (31/100.000),

Centro Oeste (23/100.000), Sudeste (22/100.000) e Nordeste (18/100.000)

representa o segundo tumor mais incidente, superado pelo câncer de mama

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).

Tabela 1. Brasil. Estimativas para o ano 2005 das taxas brutas de incidência por 100.000 e de números de casos novos por câncer, em mulheres, segundo a localização primária (Ministério da Saúde, 2004).

Localização Primária Neoplasia Maligna

Estimativa dos Casos Novos

Brasil

Estado Capital

Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta

Pele, não melanoma 56.600 60,53 15.010 68,58

Mama Feminina 49.470 52,93 18.220 82,55

Traquéia, Brônquio e Pulmão 8.680 9,31 2.855 12,78

Estômago 7.975 8,62 2.520 11.62

Colo do útero 20.690 22,14 6.600 30,03

Cólon e Reto 13.640 14,60 5.295 23,80

Esôfago 2.450 2,61 525 2,33

Leucemias 4.075 4,35 1.275 5,90

Cavidade Oral 3.895 4,18 1.255 5,66

Pele Melanoma 3.065 3,27 1.010 4,40

Outras Localizações 67.290 71,96 21.945 99,97

Total 237.830 254,35 76.510 348,63

3

No Estado do Amazonas, segundo estimativa do INCA para o ano 2005, a

taxa de incidência para o câncer do colo uterino esperada é de 32,99/100.000, com

530 novos casos de doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).

Em Manaus, capital do estado do Amazonas, a taxa de incidência estimada

para o ano 2005 será a segunda maior do país, com 56,44/100.000 e 470 novos

casos, superada por Belém do Pará, com 56,54/100.000 e 430 novos casos


A Fundação Centro de Controle de Oncologia (FCECON), em Manaus,

referência para o tratamento de câncer na Amazônia Ocidental, registra que no

período de 1997 a 2001, o câncer do colo uterino foi a neoplasia maligna que

apresentou maior incidência: 2.194 (52,1%) casos, entre as localizações primárias de câncer em pacientes do sexo feminino (Tabela 2). É importante ressaltar que os

maiores percentuais de câncer da pele não estão registrados na FCECON, porque

os casos são atendidos nas clínicas/serviços dermatológicos do município

(FCECON, 2004).

Tabela 2. Distribuição das 10 neoplasias malignas, mais freqüentes no período de 1997 a 2001 – sexo feminino. Manaus-AM (FCECON, 2004).

Localização Topográfica Nº de casos Percentual Colo uterino 2.194 52,1% Mama 740 17,6% Pele (*) 166 3,9% Ovário 120 2,8% Estômago 95 2,3% Brônquios/Pulmão 83 2,0% Linfonodos 79 1,9% Laringe 13 0,3% Sistema hematopoético e reticuloendotelial 48 1,1%

Outros tipos 675 16,0% TOTAL 4.213 100,0%

(*) A FCECON não é referência para câncer de pele em Manaus.

1.1.2 Mortalidade

4

Segundo a IARC, a taxa de mortalidade mundial é de 8,9/100.000 mulheres.

As maiores taxas de mortalidade ocorrem na África oriental (20,6/100.000) e as

menores são verificadas na Ásia ocidental (2,2/100.000) e Austrália (2,8/100.000)

(IARC, 2002).

Na Europa, a maior taxa de mortalidade ocorreu em países do centro e leste

europeu - (10,9/100.000); a menor no norte europeu (5,8/100.000) (IARC,2002) .

Dados fornecidos pela “American Câncer Society” mostram que nos Estados

Unidos, na década de 40, a mortalidade era aproximadamente de 14/100.000.

Paulatinamente, esse valor foi decrescendo, atingindo, no final dos anos 80, a cifra

de 5/100.000 (FOCCHI et al, 2000).

De acordo com dados da IARC, a taxa de mortalidade nos Estados Unidos é

de 3,6/100.000 e no Canadá é de 3,7/100.000 (IARC, 2002).

A taxa de mortalidade continua elevada no Brasil e, ao longo dos anos, vem

aumentando: em 1979, a taxa, que era de 3,44/100.000, aumentou para

4,59/100.000 no ano 2000; no período, a variação percentual relativa foi de +33,1%


Segundo dados do INCA, a taxa de mortalidade por câncer do colo uterino,

por 100.000 mulheres, entre 1995 e 1999 foi maior nos estados do Amapá (6,74) e

Amazonas (6,53) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003).

1.1.3 Fatores de risco

Vários estudos epidemiológicos realizados no decorrer do século XX

indicaram consistentemente que o risco de câncer cervical está fortemente

influenciado pelo comportamento sexual e o baixo nível sócio econômico. A idade

prematura do início da vida sexual, a multiplicidade de parceiros e a co-infecção com

outras DST, em mulheres com carcinoma cervical, levaram à pesquisa de possíveis

fatores transmissíveis, sexualmente (DE PALO, 1996).

Nestes estudos, foram identificados vários fatores de risco, associados ao

câncer do colo uterino. Dentre eles, destaca-se os tipos oncogênicos de

5

Papilomavirus humano (HPV), relação sexual precoce, múltiplos parceiros sexuais,

multiparidade, uso prolongado de anticoncepcionais orais, tabagismo, baixo nível

socioeconômico, infecção por Chlamydia trachomatis, deficiência de micronutrientes

e dieta deficiente em vegetais e frutas (BOSCH et al., 1995; SCHIFFMAN et al.,

1996; WALBOOMERS et al., 1999; FRANCO et al., 1999; FERENCZY e FRANCO,

2002, IARC 2005).

No Quadro 1 são apresentados os principais fatores de risco, associados com

o câncer cervical.

Comportamento sexual • Múltiplos parceiros sexuais • Início precoce das atividades sexuais • Não uso dos métodos de barreira • Parceiro promíscuo • Parceiro não-circuncisado

Infecções sexualmente transmissíveis • HPV de alto risco, Chlamydia trachomatis, HSV-2, HIV

Fatores ambientais e biológicos • Tabagismo • Imunocomprometimento • Deficiência de Vitaminas A, C e E • Uso prolongado de anticoncepcionais orais • Paridade • Idade avançada • Predisposição genética?

Fatores socioeconômicos • Baixo poder aquisitivo • Difícil acesso a programas de saúde • População rural • Não realização de exames periódicos

Quadro 1. Fatores de risco para lesão intra-epitelial cervical e câncer do colo

uterino. (Adaptado de Figueiredo, 2004).

6

1.2 Papilomavírus Humano (HPV) e Câncer do Colo Uterino

Com a introdução das técnicas de biologia molecular foi possível detectar

seqüências de DNA viral, o que resultou na descoberta e clonagem molecular do

Papilomavírus humano (HPV) em biópsias de câncer cervical. Este achado levou à

suspeita de que este vírus seria importante na carcinogênese (PFISTER,1997). Os

primeiros trabalhos foram publicados por Hausen et al. (1981), na Alemanha e

Meisels e Morim (1981), no Canadá (FOCHI et al., 2000).

Diversos estudos utilizando PCR (reação em cadeia da polimerase), uma

técnica de alta sensibilidade e especificidade, descrita por Mullis, Faloona, Scharf et

al., (1986) foram fundamentais para estabelecer a associação do HPV com lesões

verrucosas genitais e aos cânceres cervical, vulvar, vaginal, peniano, perianal e anal

(WIELAND e PFISTER, 1999).

Através de estudo realizado em 22 países, com 1.000 amostras de câncer

cervical, constatou-se que em 93% dos casos havia a presença de DNA do HPV.

Acredita-se que as amostras negativas correspondam a tipos ainda não genotipados

ou outros fatores causais desconhecidos (BOSCH et al., 1995).

Um painel de consenso patrocinado pela Agência Internacional para o

Controle do Câncer (IARC), da Organização Mundial de Saúde, concluiu que

existem evidências de peso, tanto do ponto de vista biológico quanto epidemiológico,

para considerar a infecção pelo HPV como a causa do câncer cervical (FRANCO,

1997).

Além do HPV, vários agentes de doenças sexualmente transmissíveis (DST)

têm sido relatados como fatores de risco para o carcinoma cervical. Entre eles

podemos destacar: Chlamydia trachomatis, herpes, citomegalovírus, vírus Epstein-

Barr, Trichomonas vaginalis, vírus da hepatite B e C, Neisseria gonorrhoeae,

Treponema pallidum e HIV, entre outros (MANDELBLATT et al., 1999; GROSS e

BARRASSO, 1999).

7

1.2.1 Genoma do HPV

Os papilomavírus são pequenos vírus DNA tumorais (55 nm), de dupla hélice,

com aproximadamente 8.000 pares de bases nitrogenadas e uma estrutura

icosaédrica não envelopada, composta de 72 capsômeros, pertencente à família

Papovaviridae (DORES, 1994).

O genoma circular é constituído por nove regiões codificadoras dividido em

três segmentos: uma região de ação precoce, por ser a primeira a se expressar

denomina-se early (E), compreendendo seis genes, E1 a E7, necessárias à

replicação viral e com propriedades de transformação oncogênica; uma região de

ação tardia, denominada late (L), que codifica duas proteínas estruturais, as

proteínas L1 e L2 do capsídio viral. A região não codificadora, regulatória, conhecida

como large control region (LCR), contém as sequências de controle para a

replicação e expressão genética do HPV (Figura 1) (TUREK, et al, 1994; DORES,

1994;CARVALHO, 2000).

Figura 1. Representação esquemática do genoma do HPV (Dôres, 1994)

8

Estes vírus têm sido detectados em grande número de vertebrados; porém,

são altamente específicos da espécie. Atualmente, mais de 100 tipos de HPV são

conhecidos; destes, em torno de 30 tipos estão associados com infecções do trato

anogenital. Os tipos de HPV variam no seu tropismo tecidual, nas suas associações

a lesões diferentes e no seu potencial oncogênico (GROSS e BARRASSO, 1999;

MENENDEZ, 2002; QUINT et al., 2002).

De acordo com a sua capacidade de transformação neoplásica, os HPV

podem ser classificados em grupos de baixo e alto risco. Doze tipos de HPV foram

classificados como de baixo risco: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e

CPC6108. Quinze tipos foram classificados como de alto risco: 16, 18, 31, 33, 35,

39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82. Os tipos 26, 53 e 66 devem ser considerados

provavelmente carcinogênicos (MUNOZ, 2003).

1.2.2 Patogênese e Papel Oncogênico do HPV

Os Papilomavírus humanos (HPV) são inoculados através de

microtraumatismos ou soluções de continuidade nos epitélios pavimentosos íntegros

da pele ou mucosas do hospedeiro. Os vírions perdem o seu invólucro proteíco e o

genoma viral atinge o núcleo da célula, onde ele se estabelece de forma epissomal.

Quando o vírus infecta a célula, existem três possíveis evoluções: a) o organismo

consegue eliminar o vírus; b) a infecção pode permanecer de forma latente, onde o

DNA viral reside no núcleo e a replicação fica ligada ao ciclo celular e c) a infecção

pode ser subclínica ou clínica (PEREYRA, 2000).

Na maioria das mulheres, as infecções pelo HPV são transitórias. Em geral, a

prevalência da infecção pelo HPV é variável, atingindo aproximadamente 20 - 30%

das mulheres entre 20 e 24 anos de idade. À seguir, diminui para aproximadamente

3% a 10% das mulheres com mais de 30 anos de idade (HERRERO et al., 1997a;

HERRERRO et al., 1997b; SELLORS et al., 2000). Em torno de 80% das mulheres

9

jovens que contraem o HPV, as infecções são transitórias, com resolução

espontânea em 12 a 18 meses (HO et al., 1998; FRANCO et al, 1999; THOMAS et

al., 2000, LIAW et al, 200, IARC, 2005).

Geralmente, o câncer se desenvolve à partir de várias alterações genéticas,

que levam à ativação dos oncogenes ou à inativação dos genes supressores de

tumor (GROSS e BARRASSO, 1999).

Experimentos genéticos demonstraram atividade oncogênica dos genes virais

E6, E7 e E5 interagindo com os mecanismos de controle do ciclo celular

(PFISTER,1977).

A proteína E6 dos HPVs genitais de alto risco formam complexos com p53

(proteína de 53KDa). Estudos comprovaram que o gene 53, está localizado no

cromossomo 17 e o produto do gene, a proteína p53, está envolvida nas vias de

reparo ao dano do DNA, levando a uma interrupção do ciclo celular na fase G1 ou

induzindo a apoptose. Por esta atividade de supressão do crescimento tumoral a

p53 tem sido chamada de “guardiã do genoma”. A degradação e inativação de p53

resultam em aumento da instabilidade genética e em acúmulo das mutações

oncogênicas (GROSS e BARRASSO, 1999).

A proteína E7 do HPV 16 forma complexos de alta afinidade com pRB

(proteína do gene supressor do tumor retinoblastoma). O gene RB está localizado no

cromossomo 13 e o produto do gene, a proteína pRB (105KDa) interage com o fator

de transcrição celular E2F na fase G0 e G1 do ciclo celular. Tal interação inibe a

trancrição induzida por E2F dos genes celulares ciclo-regulados, como a timidina

cinase, c-myc, polimerase alfa, necessária para a entrada na fase S do ciclo celular.

A proteína viral E7 pode dissociar o complexo da pRB/E2F. A inativação da pRB e a

liberação do fator de transcrição E2F que passa a ser ativo em todas as fases do

ciclo celular, explica o encurtamento da fase G1 e o crescimento celular

desordenado das células tumorais HPV-positivas (CHELLAPPAN et al., 1992;

GROSS & BARRASSO, 1999; PFISTER, 1977; FOCCHI, 2000).

10

As proteínas E5 (8-10KDa) do HPV podem ser encontradas dentro das

membranas intracelulares do aparelho de Golgi, no retículo endoplasmático e nas

membranas nucleares. A superexpressão somente das proteínas E5 pode modificar

o crescimento celular e resultar em uma franca transformação neoplásica em alguns

sistemas experimentais. Suas atividades transformantes são devido à estimulação

mitogênica através do sinal das vias de transdução dos receptores do fator de

crescimento. Os ceratinócitos que expressam E5 mostraram ter número aumentado

de fator de crescimento epidérmico (EGFRs - epidermal growth factor receptors)

(TUREK e SMITH, 1997;GROSS e BARRASSO, 1999).

Os genes L1 e L2, codificam as proteínas do capsídio viral (DÔRES, 1994).

Estes genes possuem seqüências altamente conservadas entre todos os tipos de

papilomavírus (BERNARD, 1994).

A instabilidade genética provocada por oncoproteínas virais e o aumento

catalítico na expressão da oncoproteína provocada por mutações no genoma viral e

celular identificam o vírus como importante força impulsionadora de progressão

tumoral (PFISTER, 1997).

1.3 Lesões Precursoras do Câncer do Colo Uterino

1.3.1 Lesões Intra-epiteliais Escamosas

O conceito dos precursores do câncer do colo uterino remonta ao final do

século XIX, quando Williams (1888) notou, nas margens dos cânceres invasores,

áreas de epitélio atípico, reconhecidas como sendo não invasoras. Broders (1932)

introduziu o termo carcinoma in situ para designar o padrão microscópico no qual

toda a espessura do epitélio escamoso cervical é completamente substituída por

células anormais indiferenciadas, morfologicamente indistinguíveis do câncer, não

ocorrendo invasão do estroma subjacente (RICHART e WRIGHT, 1995).

11

Reagan et al. (1953) introduziram o termo displasia para distinguir o grupo de

lesões em que os distúrbios da diferenciação epitelial não se estende por toda a sua

espessura. Esta classificação graduava as lesões em três grupos – leve, moderada

e acentuada, de acordo com o grau de atipia celular e da arquitetura epitelial (DE

PALO, 1996).

Com base em estudos epidemiológicos de risco para evolução para o câncer

e pelas características morfológicas de um processo único, contínuo e progressivo,

estas lesões foram agrupadas como “neoplasia intra-epitelial” (NIC), denominação

aplicada por Richart (1968) que classificou-as em três graus, de acordo com a

intensidade das alterações , correspondente às displasia leve ou NIC I, displasia

moderada ou NIC II e displasia acentuada/carcinoma in situ ou NIC III (RICHART e

WRIGHT, 1995).

A neoplasia intra-epitelial cervical grau I (NIC I) é definida pela presença de

células com diferenciação alterada presentes no terço inferior do epitélio. A

neoplasia intra-epitelial cervical grau II (NIC II) é diagnosticada quando as células

com diferenciação alterada ocupam os 2/3 inferiores do estrato epitelial. A neoplasia

intra-epitelial grau III (NIC III) é diagnosticada quando as células indiferenciadas

comprometem mais de 2/3 ou toda a espessura do epitélio, quando a lesão seria

indistinguível do carcinoma in situ (DE PALO, 1996).

Nas últimas décadas, a associação com o Papilomavírus humano (HPV)

ficou bem estabelecida com base em estudos epidemiológicos e métodos

biomoleculares (FIGUEIREDO,2004).

1.3.2 Lesões Intra-epiteliais Glandulares

A lesão precursora reconhecida como tendo sido originada do epitélio

cilíndrico cervical é o adenocarcinoma in situ, que se caracteriza histologicamente

pela substituição total ou parcial do epitélio endocervical por células glandulares de

aspecto neoplásico; mostra aumento da relação núcleo/citoplasma, hipercromasia,

mitoses freqüentes e depleção de muco. Pode assumir vários tipos de diferenciação

celular (CARVALHO, 2000).

12

O adenocarcinoma in situ pode estar associado ao NIC do epitélio escamoso

em um a dois terços dos casos (IARC, 2005).

1.3.3 Terminologia

Em 1988, o National Cancer Institute de Bethesda reuniu, na cidade de

Bethesda (EUA), especialistas em colpocitologia e patologia cervical, com o objetivo

de elaborar uma classificação citopatológica usando terminologia estandartizada.

Deste encontro resultou o “Bethesda System”. Revisada em 1991 e 2001, o Sistema

Bethesda constitui-se, atualmente, no principal meio de comunicação entre o clínico

e o citopatologista (CARVALHO, 2000).

Nesta classificação são consideradas como lesões intra-epiteliais escamosas de

baixo grau – LSIL (do inglês: low grade squamous intraepithelial lesion), as

displasias leves ou NIC I e as alterações citopáticas do HPV. As lesões intra-

epiteliais escamosas de alto grau – HSIL (do inglês: high grade squamous

intraepithelial lesion), as displasias moderadas ou NIC II, as displasias acentuadas

ou NIC III e o carcinoma in situ (BETHESDA SYSTEM, 2001).

Em 1999, a Sociedade Brasileira de Patologia, publicou o Manual de padronização

de laudos histopatológicos, baseado no Sistema Bethesda. Foi incluída a

terminologia “lesão escamosa intra-epitelial cervical”, em associação com o termo

“neoplasia intra-epitelial cervical” (HORTA e FONSECA, 1999).

O Ministério da Saúde, através do Instituto Nacional do Câncer (INCA), em

Seminário Nacional, realizado no Rio de Janeiro em 2003, implantou a

Nomenclatura Brasileira para Laudos Citopatológicos Cervicais. Foi adotada a

terminologia de lesão intra-epitelial em substituição ao termo neoplasia , além de

estabelecer dois níveis, baixo e alto graus, separando as lesões com potencial

morfológico de progressão para neoplasia daquelas mais relacionadas com o efeito

citopático viral, com potencial regressivo ou de persistência. Foi incluída a

13

possibilidade diagnóstica de suspeita de micro-invasão (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2003).

No Quadro 2, apresentamos a nomenclatura adotada pelo Ministério da Saúde

(2003). Por ter a anuência das sociedades científicas envolvidas com a confirmação

diagnóstica e ter sido incorporada pelos serviços do Sistema Único de Saúde

(SUS), escolhemos esta nomenclatura para ser utilizada no presente trabalho.

Quadro 2. Nomenclatura para laudos citopatológicos cervicais – lesões intra-

epiteliais e neoplasias invasoras do colo uterino (Ministério da Saúde, 2003).

NOMENCLATURA BRASILEIRA PARA LAUDOS CITOPATOLÓGICOS

CERVICAIS – lesões intra-epiteliais e neoplasias invasoras do colo uterino

Lesão em células escamosas

Lesão intra-epitelial escamosa de

baixo grau

compreendendo efeito citopático pelo HPV e

neoplasia intra-epitelial cervical grau

Lesão intra-epitelial escamosa de

alto grau

compreendendo neoplasias intra-epiteliais

cervicais grau II e III

Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau, não podendo excluir micro-invasão

Carcinoma epidermóide invasor

Lesão em epitélio glandular

Adenocarcinoma “in situ”

Adenocarcinoma invasor

Cervical

endometrial

Sem outras especificações

Outras neoplasias malignas

Presença de células endometriais (na pós menopausa ou acima de 40 anos, fora

do período menstrual

14

1.3.4 História natural das lesões precursoras

Nas últimas décadas vários estudos trataram de avaliar a história natural da

NIC, com ênfase na regressão, persistência e progressão da doença. (McINDOE et

al., 1984; OSTÖR et al, 1993; MITCHELL et al., 1994; MELNIKOW et al., 1998;

HOLOWATY et al., 1999). Os resultados são influenciados pela metodologia

diagnóstica, critérios morfológicos, localização e extensão da lesão e outros fatores

não relacionados (FIGUEIREDO, 2004).

Estes estudos revelaram que a maioria das lesões de baixo grau é transitória.

Podem regredir espontaneamente em períodos curtos ou não progredirem, enquanto

as lesões de alto grau tem probabilidade muito maior de persistir ou progredir

(IARC, 2005).

Segundo Mitchell et al. (1994), as possibilidades acumulativas para todos os

graus de NIC, seguidos tanto por citologia como histologia, foram de 45% para

regressão, 31% para persistência e 23% para progressão (IARC, 2005).

Syrjänen (1990) acompanhou mais de 500 mulheres infectadas num período

de 8 anos. As lesões genitais foram avaliadas pela colposcopia, citologia, biópsias e

tipificação do HPV, sem qualquer terapia. Observou regressão em 40%, persistência

em 45% e progressão em 15% dos casos (SILVEIRA e PESSINI, 2000).

Ostör et al.(1994), em revisão de estudos publicados sobre o assunto, no

período de 1950 a 1993, demonstrou que a NIC I têm taxa de regressão de 57,0%,

persistência de 32,0%, progressão para NIC III de 11,0% e evolução para invasão

de 1,0%. As NIC II têm taxa de regressão em 43,0%, persistência em 35,0%,

progressão para NIC III em 22,0% e para invasão, em 1,5%. As NIC III têm taxa de

regressão em 32,0%, persistência de 56,0% e progressão para invasão em 12,0%

(Tabela 3) (IARC,2005).

15

Tabela 3. Probabilidades de regressão, persistência e progressão da NIC (Adaptado de Ostör et al., 1994 – IARC, 2005).

Categoria

da NIC Regressão Persistência Progressão à NIC III

Progressão à neoplasia invasiva

NIC I 57,0% 32,0% 11,0% 1,0% NIC II 43,0% 35,0% 22,0% 1,5% NIC III 32,0% 56,0% - 12,0%

Em relação ao tempo de progressão parece que o intervalo médio para a

progressão das lesões precursoras cervicais à neoplasia invasiva é de 10 a 20

anos, podendo evoluir relativamente mais rápido, entre um a dois anos, se houver

persistência de infecção com HPV de alto risco e associação de co-fatores

(PEREYRA, 2000).

1.4 Métodos Diagnósticos

O diagnóstico das lesões precursoras e da neoplasia invasora do colo do

útero baseia-se no triplé clássico: citopatologia (teste de Papanicolaou), colposcopia

e exame histopatológico (JACYNTHO, 2001).

Novos métodos de rastreamento alternativos ou aditivos vem sendo

apresentados e desenvolvidos com o intuito de melhorar a acurácia diagnóstica.

Entre eles podemos destacar: citologia em meio liquido, cervicografia,

especuloscopia, polarprobe, fluorescência induzida pelo laser, colposcopia digital

computadorizada e os métodos moleculares para a detecção da infecção pelo HPV

(captura híbrida, hibridização in situ, reação em cadeia da polimerase - PCR, Dot

blot, Southern blot) (LORINCZ, 1997).

16

1.4.1 Colposcopia

A colposcopia foi introduzida por Hinselmann (1925) e consiste de um

aparelho óptico com magnificação iluminada, permitindo visualização com aumento

de até 40 vezes; sendo possível reconhecer e delimitar os aspectos normais e

anormais da ectocervice, vagina e genitália externa (SINGER,1995).

As características do epitélio cervical podem ser observadas, em detalhes,

depois da aplicação sucessiva de solução salina isotônica, solução de ácido acético

a 3% ou 5% e solução iodo-iodada (solução de Lugol) (IARC,2005).

Sua sensibilidade é da ordem de 80%, com baixa especificidade; os índices

de falso-positividade são de 10 a 15%. Atualmente o método tem adquirido

importância fundamental na identificação das lesões HPV induzidas, possibilitando

precisão diagnóstica bem próxima a 100% dos casos de patologia cervical maligna

ou precursora do carcinoma do colo do útero (FOCCHI, 2000).

A Federação Internacional de Patologia Cervical e Colposcopia aprovou uma

classificação colposcópica revisada e terminologia colposcópica básica no 11º

Congresso Mundial em Barcelona em 2002 Esta nomenclatura foi adotada pela

Associação Brasileira de Genitoscopia, sendo utilizada no Brasil (WALKER, et al.,

2002).

No Quadro 3, estão classificados os achados colposcópicos, segundo a

Nomenclatura de Barcelona, 2002.

17

Quadro 3. Nomenclatura colposcópica (Federação Internacional de Patologia Cervical e Colposcopia – Barcelona, 2002).

I. Achados Colposcópicos Normais

Epitélio escamoso original Epitélio colunar Zona de transformação

II. Achados Colposcópicos Anormais Epitélio acetobranco plano Epitélio acetobranco denso * Mosaico fino Mosaico grosseiro * Pontilhado fino Pontilhado grosseiro * Iodo parcialmente positivo Iodo negativo * Vasos atípicos *

III. Alterações colposcópicas sugestivas de câncer invasivo IV. Colposcopia insatisfatória

Junção escamocolunar não visível Inflamação severa, atrofia severa, trauma, Cervix não visível

V. Miscelânea Condiloma Queratose Erosão Inflamação Atrofia Deciduose

Pólipos

* achados maiores

1.4.2 Colpocitologia (Teste de Papanicolaou)

Papanicolaou e Traut (1943) introduziram a técnica da citologia, baseada na

esfoliação espontânea ou induzida de células normais ou patológicas do colo

uterino. O exame é utilizado em campanhas de massa, na população, para

detecção precoce (screening) de lesões precursoras e neoplasia do colo uterino

(JONES, 1988; MONTANARI e STEFANON, 1996).

18

A coleta cervical é realizada sob controle visual, após a colocação de um espéculo

vaginal, com espátula de madeira (Ayre), que possui uma extremidade moldada

para raspar a ectocérvice em uma amplitude de 360°. Para a coleta endocervical

utiliza-se a citobrush (escovinha de náilon) (Figura 2) (JONES, 1988; SANTOS,

2002).

Segundo Dotters (1988), apenas 1,4% dos esfregaços endocervicais com citobrush

não contém células cervicais. As amostras são espalhadas, rapidamente, sobre

uma lâmina de microscopia e fixadas em alcool etílico a 95% para envio ao

laboratório, onde são coradas e lidas por citotécnicos e citopatologistas. (JONES,

1990; MONTANARI e STEFANON, 1996).

Figura 2. Demonstração do método de coleta de citologia cervical.

1.4.2.1 Sistema de Coleta com Base Líquida

O sistema consiste em amostras celulares esfoliadas, colocadas

imediatamente em fixador e transportadas para o laboratório. Um processador

(ThinPreps) filtra as amostras até que sejam obtidas células suficientes para

preparar uma lâmina de única camada. As células são transferidas para uma área

circular em lâmina de vidro e coradas pelo método de Papanicolaou. As vantagens

desse método são as concentrações de células em pequena área, o não

obscurecimento por sangue, inflamações ou superposições celulares. O maior

problema é a necessidade de repetição da citologia, quando estiverem ausentes os

elementos da zona de transformação. (SHERMAN e KURMAN, 1997).

19

1.4.3 Exame histopatológico

A biópsia dirigida pela colposcopia permite biopsias nas zonas francamente

neoplasica ou colposcopicamente suspeitas, poupando zonas não suspeitas.

(MONTANARI e STEFANON, 1996).

Nas amostras obtidas por conização ou amputação cervical, o material deve

ser inteiramente submetido a exame histológico para minimizar a possibilidade de

perda de algum foco de invasão estromal. As margens cirúrgicas devem ser

adequadamente identificadas nos cortes histológicos, avaliando sua localização

topográfica e extensão da lesão para criptas glandulares (CARVALHO, 2000).

Segundo o tipo histológico, a grande maioria é do tipo escamoso

(epidermóide), responsável por cerca de 94% das neoplasias malignas primárias do

colo uterino. Pode ser subclassificado em: carcinoma de grandes células

queratinizado; de grandes células não queratinizado e de pequenas células não

queratinizado. O adenocarcinoma representa 5% dos casos. Outros tipos

histológicos podem comprometer o colo uterino: adenoescamoso, sarcomas,

linfomas, melanomas, tumores mistos, indiferenciados e tumores metastáticos

(CARVALHO, 2000; RIVOIRE et al, 2001, BERTRAND, 2002).

1.4.4 Métodos moleculares

Atualmente, os testes de exploração com base no ácido nucléico são a forma

mais avançada de metodologia de testagem com base diagnóstica bioquímica nos

estudos HPV. Na análise do DNA ou RNA, os métodos podem ser divididos,

genericamente em três grandes grupos: (1) testes não amplificados, (2) testes

amplificados pelo alvo, (3) testes amplificados pelo sinal. O Quadro 4 mostra os

diversos testes utilizados para detecção do DNA do HPV (LÖRINCZ, 1997).

20

Quadro 4. Métodos de testes para alvos DNA ou RNA HPV (Lörincz, 1997).

Categorias de

testes

Nome do teste

Amplificação do

alvo

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Reação em cadeia da ligase (LCR)

Amplificação com base na seqüência do ácido nucléico

(NASBA)

Amplificação do deslocamento da cadeia (SDA)

Amplificação do

sinal

Sistema de captura híbrida (HCS)

DNA ramificado (bDNA)

Não amplificados Southern blot (SB)

Dot blot

Hibridização com filtro in situ

Southern blot reverso

Northern blot (NB)

Hibridização in situ (ISH)

O método mais simples é a captura híbrida e a reação em cadeia da polimerase

(PCR), por sua alta sensibilidade e especificidade, em detectar seqüências de HPV,

ainda que estas estejam em baixo número nas amostras (BERUMEN et al., 1997).

1.4.4.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A PCR é técnica utilizada para a amplificação in vitro de quantidades diminutas de

seqüências de DNA especificas, através de ciclos repetidos de desnaturação,

hibridização e extensão do primer (LÖRINCZ, 1997).

Em comparação direta, a PCR é comparável ao Southern Blot em sensibilidade e

especificidade. Na tabela 7, a PCR é comparada com os principais métodos

moleculares utilizados na detecção de DNA do HPV (BAUER e MANOS, 1998;

VILLA, et a.l, 1997).

21

Tabela 4. Comparação entre métodos de detecção de genomas de HPV (Adaptado de Villa, 2003).

Hibridização in situ

Southern blot

Captura híbridos

PCR PCR in situ

Sensibilidade (*)

+ (20-50)

+++ (0,01-1)

++ (1-10)

++++ (<0,01)

+++ (1)

Especificidade ++ +++ +++ +++ +++ Praticidade + + ++ +++ + Morfologia +++ - - - - (*) número de cópias do genoma viral/célula

Basicamente, cada ciclo da PCR consiste de três etapas onde ocorrem

eventos distintos: a) desnaturação do DNA-molde (abertura da dupla fita) em alta

temperatura (94ºC - 100ºC); b) anelamento (hibridização dos iniciadores) dos

primers ao DNA-molde em temperatura mais baixa, definida conforme tamanho e a

composição de bases dos oligonucleotídeos iniciadores e c) extensão do primer ou

síntese (reação de polimerização da fita complementar pela DNA polimerase na

temperatura ótima da enzima para a síntese (72ºC para a Taq DNA polimerase). Ao

final de cada ciclo (conjunto das três etapas descritas), ocorre em princípio a

duplicação do DNA-alvo (BAUER e MANOS, 1989; LORINCZ, 1997; GROSS e

BARRASSO, 1999).

A técnica da PCR tem sido aplicada na identificação de DNA do HPV nos

diversos estudos epidemiológicos mundiais e foi escolhida como método para este

trabalho pelo fato de estar entre os melhores diagnósticos e poder ser realizada em

Manaus - Laboratório de Biotecnologia, da Universidade Federal do Amazonas.

22

2. OBJETIVOS 2.1 Geral

Investigar a prevalência de Papilomavírus Humano (HPV) em mulheres

portadoras de lesões escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do

colo uterino, atendidas na FCECON.

2.2 Específicos

• 2.2.1 Estimar a prevalência do HPV, utilizando a reação em cadeia da

polimerase (PCR) nas mulheres envolvidas neste estudo;

• 2.2.2 Identificar, utilizando a PCR, os diferentes tipos de HPV nas amostras

analisadas;

• 2.2.3. Descrever a relevância dos fatores sociodemográficos associados com

a população estudada: idade, raça, estado civil, escolaridade, idade da

primeira relação sexual, número de parceiros sexuais, idade da primeira

gravidez, número de partos, uso de anticoncepcionais hormonais, fumo,

sangramento anormal, sangramento ao coito.

23

3. METODOLOGIA

3.1 Modelo de Estudo Estudo transversal descritivo, não-controlado, prospectivo.

3.2 Universo de Estudo 3.2.1 População de estudo

Mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e

carcinoma epidermóide invasor do colo uterino atendidas na Fundação Centro de

Controle de Oncologia (FCECON), na cidade de Manaus, capital do estado do

Amazonas, Brasil.

3.2.2 Critério de inclusão Mulheres portadoras de lesões escamosas de alto grau e carcinoma

epidermóide invasor do colo uterino, confirmado por exame histopatológico.

3.2.3 Critério de exclusão Mulheres submetidas previamente a crio ou termocauterização, laserterapia,

histerectomia, quimioterapia ou radioterapia.

3.2.4 Número de mulheres participantes do estudo Foram estudadas 42 mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais

escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino, atendidas

no período de 01 de setembro a 30 de dezembro de 2004.

3.3 Procedimentos Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa no Comitê de

Ética da Fundação Centro de Controle de Oncologia (FCECON).

3.3.1 Seleção de pacientes

24

No período de 01 de setembro a 30 de dezembro de 2004, foram incluídas no

estudo, mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e

carcinoma epidermóide invasor do colo uterino, comprovadas através de exames

histopatológicos, atendidas na FECON.

3.3.2 Orientações às pacientes

As participantes do estudo foram esclarecidas quanto ao objetivo do trabalho,

riscos e benefícios associados ao estudo e assegurado a inteira confidencialidade

dos registros. Após consentirem, assinaram a declaração do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo I), e responderam a uma Ficha de

Triagem e Questionário padrão (Anexo II) (modificado de ALENCAR et al.,1993)

3.3.3 Coleta de Material para PCR

As amostras do estudo foram coletadas da região cervical uterina (ecto e

endocérvice), com o auxílio de escovas do tipo citobrush (Figura 3) e acondicionadas

em tubos eppendorf de 1,5 ml contendo 400 µl de solução tampão TE (Tris-HCl 10

mM pH=8,0 e EDTA 1 mM) e mantidas a -20ºC até o momento do manuseio no

laboratório.

Figura 3. Escova utilizada para coleta de material ecto e endocervical.

3.4 Exame Histopatológico

Os exames histopatológicos foram realizados nos Serviços de Patologia do

Sistema Único de Saúde.

25

3.5 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

As amostras foram submetidas à reação em cadeia da polimerase,

conforme técnica descrita por Bauer e Manos (1988).

3.5.1 Primers (iniciadores)

Na reação de PCR foram utilizados os iniciadores consenso MY11 e MY09

que amplifica um fragmento de 450 pb da região de transcrição tardia L1 (Manos et

al, 1989) e os inciadores gerais GP5+/GP6+, que amplificam 140 a 150 pb da região

L1, que se superpõe com MY (de Roda Husman et al., 1995). No Quadro 5 são

apresentados as seqüências de base nitrogenadas dos iniciadores usados neste

estudo.

Quadro 5. Sistemas de iniciadores MY09/MY11 e GP5+/GP6+.

Autor Designador Iniciador Seqüência

Manos et al, 1989

L1, 448-454 pb degenerado

MY09 5’-CGTCCMAARGGAWACTGATC -3’ MY11 5’-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3’

de Roda Husman

et al, 1995

L1, 140-150 pb não degenrado

GP5+ 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’

GP6+ 5’- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3

M = A+C; R = A+G; W = A+T; Y = C+T

3.5.2 Extração de DNA

O protocolo utilizado para a extração do DNA das amostras foi descrito por

Bauer e Manos (1998):

3.5.2.1 Amostras sem Sangue

26

Para a extração do DNA, foram adicionados 400 µL de “TPK” aos 400 µL da

amostra coletada. Essa mistura foi levada ao banho–maria a 55-60º C por 60

minutos e depois fervida por dez minutos. As amostras preparadas ficaram

congeladas a – 20° C até sua utilização.

3.5.2.2 Amostras com Sangue

As amostras com sangue foram submetidas a extração do DNA pelo método

fenol:clorofórmio, conforme técnica descrita por Sambrook et al. (1989). Utilizou-se

400 µL das amostras preparadas anteriormente, aos quais foram adicionados 400 µL

de fenol, homogeneizadas por dez minutos e centrifugadas a 6.000 rpm por dez

minutos. Coletou-se o sobrenadante (cerca de 360 a 400 µL) e adicionou-se 400 µL

de fenol:clorofórmio;álcool isoamílico (25:24:1). Homogeinizadas por 10 minutos e

centrifugadas a 10.000 rpm. Coletou-se o sobrenadante (cerca de 100 a 290 µL) e

adicionou-se (10%) do volume total de cada amostra de NaCl 3M mais 4 µL de

glicogênio 1µg/ml. Adicionou-se 1000 µL de etanol a 100% e misturou-se até a

homogeneização.Deixou-se precipitando por doze horas a - 20º C. Centrifugou-se a

10.000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi descartado com o auxílio de

uma micropipeta. A seguir, lavou-se o sedimento com aproximadamente 500 µL de

etanol a 70 % gelado. Centrifugou-se a 10.000 rpm por cinco minutos. Descartou-se

o sobrenadante com cuidado para não perder o concentrado de DNA. Deixou-se

secar e diluiu-se em 30 µL H20. A amostra permaneceu sob temperatura de – 20° C

até sua utilização.

3.5.3 PCR

3.5.3.1. PCR para controle do DNA

O sistema de reação foi composto de: 2,2 µL de água Milli-Q; 2,5 µL de Tp

10x (500 mM KCl e 100 mM Tris-HCl (pH 8,5)); 2,5 µL de MgCl2 50 mM 2,5 µL do

“pool” de dNTP (10 mM); 2,5 µL do iniciador MY09 (5pmol); 5,0 µL do iniciador

ISO4M (PONTES, 2003); 0,3 µL da Enzima Taq polimerase 5U/µL e 5,0µL da

solução contendo a amostra de DNA, totalizando um volume final de 20µL,

conforme a técnica de Bauer e Manos, 1998.

27

As reações de PCR foram realizadas com 35 ciclos de amplificação em

aparelho termociclador Eppendorf - Mastercycler Gradient, conforme o seguinte

programa: um minuto à 95ºC para desnaturação, um minuto à 55ºC para anelamento

e um minuto à 72ºC para a síntese. Após os 35 ciclos, seguiram-se cinco minutos a

72ºC para extensão.

3.5.3.2 PCR para detecção do HPV Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese, em gel de agarose a

1,5%, corado com brometo de etídio (1,0µg/ml) por vinte minutos, visualizados sob

luz ultravioleta e fotografados com equipamento da Pharmacia Biotech, Image Master

VDS FTI-500.

3.5.3.3 Purificação dos produtos da PCR

As amostras que revelaram a amplificação do fragmento de 450 pb foram

submetidas à purificação em colunas “QIAquick PCR Purification Kit – QIAGEN”,

conforme o seguinte procedimento: a) em um tubo de 600 µL adicionou-se 35 µL da

amostra amplificada, acrescentou-se 175µL de solução de binding (cinco vezes o

volume da amostra). Colocou-se esta mistura na coluna de purificação e centrifugou-

se por um minuto. O tampão que passou pela coluna, contido no tubo suporte foi

descartado após a centrifugação. Nesta mesma coluna, adicionou-se 500 µL do

tampão de lavagem e centrifugou-se por um minuto. Descartou-se o volume

centrifugado, contido no tubo suporte da coluna. Centrifugou-se por mais um minuto,

afim de retirar o excesso de álcool. Trocou-se o tubo suporte da coluna por um tubo

Eppendorf de 2 mL limpo e adicionou-se 30 µL do tampão de eluição no centro da

coluna, e deixou-se embeber por dois minutos. Centrifugou-se por dois minutos. O

produto centrifugado constituiu-se no material purificado. Nestes procedimentos de

purificação utilizou-se uma microcentrífuga tipo Eppendorf-Centrifuge 5410 e as

centrifugações processaram-se a 12.000 giros. Do volume de 30 µL eluido retirou-se

3 µL para análise por meio de eletroforese, em gel de agarose. A amostra foi

preparada adicionando-se aos 3 µL, 5 µL de água e 2 µL de tampão TEB 5X.

Guardou-se o restante para fins de sequenciamento de nucleotídeos da amostra.

28

3.5.4 Sequenciamento dos Produtos da PCR

3.5.4.1 Reação de Sequenciamento

As amostras foram seqüenciadas utilizando-se os iniciadores MY09 ou

MY11, e GP5+ ou GP6+ em seqüenciador automático MegaBace 1000 (Amersham

Biociences).

Para o seqüenciamento foi utilizado o seguinte sistema de reação: 5,0 µL do

DNA; 4,0 µL do pré – mix DYEnamic ET – terminator Kit; 1,0 µL do iniciador MY09

ou MY11 ou GP5+ ou GP6+, 5 pmol/µL, cumprindo o seguinte programa: 95ºC por

vinte e cinco segundos; 95ºC por quinze segundos; 50ºC por vinte segundos; 60ºC

por um minuto, repetidos por 30 ciclos de amplificação.

Nas amostras seqüenciadas com GP5+/GP6+, que amplificam um fragmento

de aproximadamente 140 a 150 pb, específicos da região L1QLA (quadro de leitura

aberta) – Nested PCR, utilizou-se 1,0 µL do iniciador.

3.5.4.2 Precipitação do Produto da Reação de Seqüenciamento

Após a reação de seqüenciamento foi realizada a precipitação. Ao produto da

reação de seqüenciamento foi adicionado 1µL de acetato de amônia e 27,5 µL de

etanol absoluto. Este sistema foi misturado, utilizando-se o agitador por um minuto e

incubado durante vinte minutos à temperatura ambiente, envolvida em papel

alumínio para evitar a incidência de luz.

Após incubação, a placa foi centrifugada a 4.000 rpm por quarenta minutos,

em centrífuga refrigerada Eppendorf 5804R. Descartou-se o sobrenadante. A placa

foi centrifugada invertida a 1.000 rpm por um pulso de alguns segundos. Em

seguida, deixou-se secar por quinze minutos, para evaporar o etanol. O DNA foi

ressuspendido adicionando-se 10 µL de tampão (fornecido com o Kit). A placa foi

vedada e agitada em vortex por dois minutos. Foi realizada mais uma centrifugação

a 1.000 rpm por um pulso de alguns segundos.

29

Após esta amplificação foi realizada a reação de precipitação. Em seguida as

amostras foram submetidas ao seqüenciador automático MegaBace (Amershan

Pharmacia Biotech). O método original do seqüenciador foi descrito por Sanger e

Coulson (1977).

3.5.4.3 Eletroforese para Seqüênciamento

As decodificação da seqüência nucleotídica do fragmento amplificado foi

realizado em seqüenciador automático MegaBace 1000 (Amershan Pharmacia

Biotech). A eletroforese capilar em gel de poliacrilamida foi realizada segundo as

recomendações padrão do fabricante. Para injeção utilizou-se 3 KV por oitenta

segundos. A corrida processou-se a 6KV, por 200 minutos, sob temperatura de

44ºC. 3.5.4.4 Alinhamento das Amostras Seqüenciadas

Para o alinhamento das seqüências de nucleotídeos obtidas foi utilizado o

programa de computador CLUSTAL W (BioEdit).

3.5.5 Análise do Resultado das Sequências Nucleotidicas

Para a confirmação e identificação do tipo do HPV, foi realizada comparação

de todas as seqüências nucleotídicas das amostras seqüenciadas, submetendo-as

ao Banco de Dados Mundial de Nucleotídeos – GeneBank. Utilizou-se o programa

BLAST (Altschul et al.,1997).

3.5.5 Análise dos Dados Os dados pesquisados foram tabulados em planilhas Excel e realizado

análise multivariada, onde se calculou as freqüências absolutas simples, relativas e

acumuladas para os dados qualitativos e médias, medianas e desvio-padrão (DP)

para os dados quantitativos. O software utilizado na análise foi o programa Epi-Info

3.0 for Windows.

30

Agregados, os dados sociodemográficos foram submetidos à Análise de

Concordância, utilizando-se o programa Statistica versão 6.0.

4. RESULTADOS 4.1 CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO

A população do estudo foi composta de 42 mulheres sexualmente ativas,

sendo constituída de 100% de mulheres pardas, cor característica da maioria da

população que habita o Estado do Amazonas.

A faixa etária média foi de 40,8 (DP:4,1) anos (Tabela 5). A idade mínima

registrada foi de 18 anos - uma mulher portadora de lesão escamosa de alto grau

(LIEAG), e a idade máxima de 73 anos - uma mulher com carcinoma epidermóide

invasor.

Um caso de carcinoma epidermóide invasor do colo uterino foi diagnosticado

em mulher de 24 anos.

Tabela 5. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a idade da população do estudo.

Idade (anos) n % Acumulada (%) < 35 15 35,7 35,7 35 |--- 50 15 35,7 71,4 ≥ 50 12 28,6 100,0 Total 42 100,0 -

Média: 40,8; DP: 14,1; Mediana: 39; Mín.: 18 Máx.: 73

31

Segundo o estado civil, 14 (33,3%) das mulheres eram casadas e 10 (23,8%)

mantinham união estável, totalizando 24 (57,1%) com relação conjugal sob o mesmo

teto (Tabela 6).

Tabela 6. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o estado civil.

Estado civil n % Solteira 9 21,4 Casada 14 33,3

União estável 10 23,8

Viúva 7 16,7

Divorciada/separada 2 4,8

Total 42 100,0

O maior nível de escolaridade da população do estudo foi o ensino médio,

não havendo registro de mulheres com nível superior. Do total, 31 (73,3%) tinham

cursado parcialmente ou concluído o ensino fundamental, 10 (23,8) concluíram o

ensino médio e 1(2,4%) era analfabeta (Figura 4).

32

2,4% (1)

23,8% (10)

73,3% (31)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

Não Alfabetizada Fundamental Medio

%

Figura 4. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a escolaridade.

A renda familiar de 27 (64,3%) da população foi de um salário mínimo - R$

260,00 (duzentos e sessenta reais) – ref.12/2004 (Tabela 7). A maioria, 36 (85,7%),

relatou renda entre um a três salários mínimos. Importante salientar que esta é a

clientela do Sistema Único de Saúde, em Manaus – renda baixa.

33

Tabela 7. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres

portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e

carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a

renda familiar.

Renda (salários

n % Acumulada 1 27 64,3 64,3

2 a 3 9 21,4 85,7

4 a 6 4 9,5 95,2

>6 2 4,8 100,0

Total 42 100,0 -

Segundo a procedência, 22(52,4%) eram do interior do estado do Amazonas,

sendo 11(26,2%) da cidade de Manaus. (Tabela 8). A Fundação Centro de Controle

de Oncologia (FCECON), em Manaus, é referência para o tratamento oncológico na

região norte.




procedência.

Procedência n % Manaus 11 26,2

Interior do Amazonas 22 52,4

Outro Estado do Norte 6 14,3

Outro Estado da Federação 3 7,1

Total 42 100,0

34

Na Tabela 9 verifica-se que 32(76,2%) da população do estudo tiveram a

primeira relação sexual antes dos 16 anos de idade. A idade mínima foi de 12 anos.

Tabela 9. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a idade da primeira relação sexual.

Idade da primeira relação

n % ≤ 16 32 76,2 > 16 10 23,8

Total 42 100,0


Quanto ao número de parceiros sexuais, 7(16,7%) tiveram um parceiro

sexual, 14(33,3%) dois parceiros e 21(50%) três ou mais parceiros sexuais (Figura

5).

Figura 5. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o número de parceiro sexual.

0

5

10

15

20

25

1 2 3

16,7%(7)

33,3%(14)

50,0%(21)

35

Do total de pacientes do estudo, 41(97,6%) informaram a idade da primeira

gestação: 34,1% tiveram a primeira gestação antes dos 16 anos e 65,9% após 16

anos. A mediana foi 17 anos e a idade mínima, 13 anos (Tabela 10). Uma mulher

não engravidou.




idade da primeira gestação.

Idade da primeira gestação n % ≤ 16 14 34,1 > 16 27 65,9

Total 41 100,0


Segundo o número de partos, por via vaginal, 40(95,2%) responderam:

33(82,5%) – três ou mais partos (Tabela 11). Duas mulheres não tiveram partos:

uma não engravidou; a outra engravidou uma vez, evoluindo com abortamento

(Tabela 11).

36



carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o

número de partos por via vaginal.

Número de partos n % < 3 7 17,5 ≥ 3 33 82,5

Total 40 100,0


Na Tabela 12 são apresentados os dados segundo a utilização de

anticoncepcional oral. Verifica-se que 26(61,9%) não utilizaram

anticoncepcional hormonal oral. Nas 16(38,1%) que usaram o método, a

utilização foi de forma irregular nos últimos 10 anos. Tabela 12. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres


37


uso de anticoncepcional hormonal oral.

Uso de anticoncepcional

n % Sim 16 38,1 Não 26 61,9

Total 42 100,0

Em relação ao tabagismo, as mulheres participantes do estudo relataram que

utilizavam cigarros em quantidades que variavam de cinco a vinte cigarros/dia. Ao

todo, 9 (21,4%) eram fumantes ativas, 15(35,7%) ex-fumantes e 16(42,9%) não

fumavam (Tabela 13).




fumo.

Fumo n % Fumante 9 21,4

Ex-fumante 15 35,7 Não fuma 18 42,9

Total 42 100,0

Nas tabelas 14 e 15 observa-se que 27(64,3%) da população não relatava

sangramento anormal, nem sangramento ao coito no último ano antes do

diagnóstico de neoplasia maligna do colo uterino.

38



carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo

sangramento anormal.

Sangramento anormal n % Sim 15 35,7 Não 27 64,3

Total 42 100,0



carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo

sangramento ao coito.

Sangramento no coito n % Sim 15 35,7 Não 27 64,3

Total 42 100,0

4.2 Análise dos dados sociodemográficos

Na Figura 6, é apresentado o resultado da Análise de

Correspondência (AC), tendo como objetos as características sócio-econômicas e

como descritores as pacientes. A interpretação deste gráfico deve ser feita na

seqüência, a Dimensão 1 primeiro e depois a Dimensão 2.

39

id

ec

esc

rf

proc

pr

np

pgnfant

fu

san

sin

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Dimensão 1

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2D

imen

são

2 PACIENTES Características Sócio-Econômicas

id=idad; ec= estado civil; proc=procedência; esc= escolaridade; rf= renda familiar; ant= uso de anticoncepcional; pr=primeira relação; np= número de parceiros; pg=primeira gestação; nf=número de partos; san=sangramento anormal; fum=fumantes.

Figura 6. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em

mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto

grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Análise de

Correspondência das características sociodemográficas da

população do estudo.

Deste modo, um grupo de pacientes (representados pelas bolas) e situados a

esquerda do gráfico apresentam características comuns de estado civil (ec),

40

sinusorragia (sin), idade (id), uso de anticoncepcional (ant) e sangramento (san).

Enquanto que, outro grupo, situado à direita do gráfico, tem características comuns

de número de parceiros (np) e renda familiar (rf).

As características que ficam no centro do gráfico: escolaridade (esc), número

de partos (nf), primeira gestação (pg) e primeira relação (pr) são comuns aos dois

grupos.

Na Dimensão 2, é possível observar que existem pacientes com

características comuns de renda familiar (rf), procedência (proc) e fumantes (fum),

situados na porção superior do gráfico.

4.3 RESULTADOS DOS EXAMES HISTOPATOLÓGICOS

Em relação ao exame histopatológico, critério básico de inclusão no estudo,

(32) 76,2% eram portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau

(LIEAG) e 10 (23,8%) portadoras de carcinoma invasor do colo do útero (Figura 7).

76,2% (32)

23,8% (10)

Câncer invasor Lesão de alto grau

■ Câncer invasor

■ LIEAG

41

Figura 6. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o resultado do exame histopatológico. 4.4 Detecção e Identificação de HPV por PCR

4.4.1 Reação de amplificação por PCR

Das 42 amostras testadas, 100% foram positivas para DNA HPV.

Dentre estas, 59,5% (25/42) foram positivas na primeira reação usando

os iniciadores consenso MY09 e MY11 (Figura 8 e 9). As demais

amostras, 40,5% (17/42) foram positivas na segunda reação, utilizando-

se os iniciadores GP5+/GP6+ (Figura 10).

Figura 8. PCR - Demonstração dos fragmentos de 450 pb de HPV com MY09/MY11, através da eletroforese em gel de agarose (amostras 1 a 40).

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

450 pb

42

Figura 9. PCR - Demonstração dos fragmentos de 450 pb de HPV com MY09/MY11 através de eletroforese em gel de agarose (amostras 41 e 42).

Figura 10. Demonstração dos fragmentos de 150 pb para HPV com GP5+/GP6+ (Nested-PCR), através de eletroforese em gel de agarose.

41 42 43 44 M B1 B2 B3 C1 C2 C3 C4

03 05 06 12 13 14 15 Lad. 16 17 18 20 22 23 27 30

32 36 39 B1 B2 B3 Lad. BR C1 C2 C3 C4

450 pb

150 pb

43

4.4.2 Reação de Sequenciamento

Foram seqüenciadas 24(57,1%) das amostras e através da

comparação de nucleotídeos com as seqüências depositadas no Gene

Bank, por meio do programa BLAST, foram identificados os seus tipos

virais (Tabela 16).


portadoras de lesão intra-epitelial escamosa de alto grau e carcinoma

invasor do colo uterino. Caracterização das amostras e respectivos

acessos ao Gene Bank.

AMOSTRA ACESSO AO GENEBANK TIPO DE HPV

B08 AF534061 16

C02 AF536179 16

C04 U45887 33

D02 AF534061 16

D04 AF402678 16

44

D05 X744831 56

D08 AF534061 16

E01 AF534061 16

E08 AY147908 66

E10 AF534061 16

E11 AF534061 16

E12 AF534061 16

F01 AF402678 16

F02 AF402678 16

F10 Af534061 16

F12 AF534061 16

G01 AF534061 16

G08 HPU45896 33

G10 X00203 6

G11 AF402678 16

G12 DQ057331 31

H01 AF534061 16

H02 AF536179 16

H12 AF534061 16

Na figura 11 são apresentados os resultados das amostras

positivas pela PCR e os percentuais de sorotipos mais prevalentes de

HPV. Do total de 24 amostras, 18(75%) eram HPV tipo 16 e 2(8%) HPV

tipo 33. As demais amostras, 4(17%) foram positivas para os tipos 31,

56, 66 e 6.

45

Figura 11. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres


carcinoma escamoso invasor do colo uterino. Resultado dos sorotipos

de HPV identificados nas amostras PCR positivas.

HPV 16

75% (18)

HPV 33

8% (2)

HPV 31, 56, 66, 6

17% (4)

46

5. DISCUSSÃO

A prevalência de 100% de HPV, através da PCR, em 42 mulheres portadoras

de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor

encontradas neste estudo, situa-se na faixa dos achados da literatura mundial.

Estatisticamente, o tamanho desta amostragem é pequeno, considerando a

média anual de 450 casos de câncer do colo uterino registrados na FCECON e a

expectativa para 2005 ser de 530 novos casos no Amazonas – 470 casos ocorreriam

em Manaus (INCA, 2004).

Em estudos realizados na última década, conduzidos por diversos autores,

utilizando a PCR, foram encontradas prevalências de DNA HPV situando-se na faixa

de 90% a 100% em lesões intra-epiteliais de alto grau e câncer invasor (BOSCH et

al.,1995; LIAW et al.,1995; KONYA et al.,1995, CHEN et al., 1999; WALBOOMERS

et al., 1999; DEPUYDT et al., 200; MUNOZ, et al.,2003, CHANG et al.,2005).

Bosch et al. (1995), realizando estudo multicêntrico em 22 países, com 1000

amostras de câncer cervical constatou que em 93% dos casos havia a presença do

DNA do HPV. Naquela época, acreditava-se que as amostras negativas

correspondiam a tipos não genotipados ou outros fatores causais desconhecidos.

Liaw et al. (1995), observou prevalência de 92% no estudo de mulheres com

lesões intra-epiteliais de alto grau e câncer cervical invasor. Konya et al. (1995),

encontrou a presença de HPV em 98% de amostras obtidas de biópsias de câncer

cervical invasor. Chen et al. (1999), revelou prevalência de HPV em 91,9% (171/186

casos) de mulheres com câncer cervical.

Walboomers et al. (1999), relatou que o HPV está presente em 99,7% de

pacientes com câncer do colo uterino. Depuydt et al. (2001), demonstrou prevalência

de HPV de 95,4% em 109 pacientes com lesão intra-epitelial cervical.

Munoz et al. (2003), estudando 3.846 pacientes em 9 países, encontrou

prevalência de HPV em 90,7% de 1.918 amostras de câncer cervical; foram

47

histologicamente confirmadas, e o grupo controle de 1928 mulheres, sem doença

maligna, a incidência foi de 13,4%.

Em recente trabalho, com amostragem inferior ao nosso estudo, Chang et al.

(2005), analisando 25 amostras biopsiadas de câncer cervical, utilizando os métodos

da PCR e Southern blot , encontraram prevalência de 100% para DNA do HPV.

Em comparação com estudos realizados no Brasil, por Eluf-Neto et al. (1994),

Noronha et al. (1999) , Santos et al. (2001) e Oliveira et al.(2003), verificamos que

esses autores encontraram prevalência de HPV em 84%, 70,3%, 76% e 95%,

respectivamente.

Eluf Neto et al.(1999), em São Paulo, estudando 199 casos confirmados

histologicamente de câncer invasivo e 225 controles, utilizando a PCR, revelou

prevalência de HPV em 84% nos casos de câncer invasor, e 17% nos controles.

Noronha et al. (1999), em Belém do Pará, estudou 228 mulheres portadoras

de lesões em cérvice uterina, através da PCR e hibridização dot blot . Distribuidos

em três grupos, conforme o diagnóstico exame histopatológico, o grupo A constituído

de 155 mulheres com carcinoma epidermóide invasor ou com adenocarcinoma, o

grupo B com 54 portadoras de lesão intra-epitelial cervical de alto grau e o grupo C

de 19 pacientes com doença benigna (cervicite crônica) observaram-se prevalências

de HPV em 70,3%, 63,0% e 36,8%, respectivamente.

Santos et al. (2001), analisou 74 mulheres em Goiás, sendo 18 portadoras de

lesão intra-epitelial de alto grau, 48 câncer escamoso invasor, 4 adenocarcinomas e

1 carcinoma adenoescamoso. Foi detectado DNA HPV em 56/74 (76%) dos casos.

Oliveira et al. (2003), em Niterói , estudou 43 mulheres com lesões benignas e

malignas do colo uterino, incluindo 14 lesões intra-epiteliais de alto grau e 8

carcinomas. Detectou a presença de DNA HPV em 41/43 (95%) dos casos. Esta

amostragem não é comparável aos nossos dados, considerando o número inferior

de lesões malignas estudadas.

48

No Amazonas, em dois trabalhos distintos realizados anteriormente, Castro

(2001) e Souza (2004) relacionaram o HPV com a cérvice uterina, utilizando o

método da PCR, para estimar taxas de prevalência.

Castro (2001), no estudo de 144 pacientes em Manaus, em dois grupos de 83

e 61 pacientes encontrou DNA de HPV em 39,28% e 6,45%, respectivamente.

Souza (2004) detectou HPV em 10 amostras (14,2%) de 70 pacientes HIV positivas

atendidas na FMTAM.

Em ambos os trabalhos, realizados em Manaus, não havia comprovação

histológica de patologia cervical, o que pode ter contribuído para taxas de

prevalência inferiores às estatísticas mundiais.

Em nossa casuística o percentual de HPV detectado foi de 100%. Deste total,

24(57,1%) das 42 amostras tiveram seus seqüênciamentos realizados. As 14

amostras restantes não puderam ser seqüenciadas por não apresentarem leitura

satisfatória, algumas possivelmente em razão de ajustes na metodologia.

Para a confirmação e identificação do tipo do HPV foi realizada comparação

de todas as seqüências nucleotídicas das amostras seqüenciadas, submetendo-as

ao Banco de Dados Mundial de Nucleotídeos – GeneBank. Utilizou-se o programa

BLAST (Altschul et al.,1997).

No presente estudo, dentre as amostras seqüenciadas, os tipos de HPV

foram assim distribuídos: HPV 16 - 18(75%) amostras, HPV 33 - 2(8%) e os tipos 31,

56, 66 e 6, uma amostra de cada, com percentual inferior a 5%.

Os tipos de HPV detectados no presente estudo estão de acordo com o

referido na literatura. Todos os tipos de HPV detectados são considerados de risco

oncogênico por vários autores (WALBOOMERS et al., 1999; GROSS E BARRASSO,

2000; QUINT et al., 2002; MUNOZ et al.,2003; IARC, 2005).

49

Bosch et al. (1995), detectaram 50% de prevalência para o HPV 16 nas

amostras positivas. No trabalho de Munoz et al. (2003), o HPV 16 foi também, o tipo

mais comum encontrado nos casos de câncer cervical, seguindo-se por ordem

decrescente os tipos 18, 45, 31, 33, 52, 58 e 35. Em nosso trabalho, a freqüência do

HPV 16 foi de 75%.

Em recente estudo, realizado por Andersson et al.(2005), avaliando 215

amostras de biópsias positivas para HPV, associadas com lesões benignas, pre-

malignas e malignas do colo uterino, foram identificados 15 tipos oncogênicos de

HPV. Nos 45 casos de carcinoma escamoso invasor os tipos detectados mais

freqüentes foram os HPV 16 e 18 (76%) e os menos freqüentes foram HPV 31, 33,

52, 56, 67,70 e 73 (2 a 4%). Neste estudo não foi observada infecção por mais de

um tipo de HPV. Com exceção do HPV 18, estes dados percentuais estão similares

aos obtidos em nosso trabalho.

A nítida predominância do tipo 16, encontrada em lesões intra-epiteliais

escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor (figura 11), demonstra

semelhanças com outros trabalhos realizados em diferentes regiões geográficas do

Brasil (ELUF NETO et al., 1999; NORONHA et al., 1999; LORENZATO et al., 2000;

SANTOS et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2003).

No Amazonas, Castro (2001) encontrou uma representatividade de 66,6%

para o HPV 16 em 19 amostras seqüenciadas, no grupo de pacientes com lesões

sugestivas de malignidade no colo uterino. Nossos dados não são discordantes dos

obtidos por Castro; ao todo observamos do total de 24 amostras, 18(75%) eram HPV

tipo 16.

Em recente estudo realizado por Chang et al. (2005), em Taiwan, analisando

25 amostras de biópsias de câncer cervical, através da PCR e Southern blot, foi

encontrado prevalência de 100% para DNA do HPV tipo 18 e a associação com HPV

tipo 16 em 7 das 25(28%) amostras.

Segundo Pfister (1997), o HPV 16 é o tipo mais prevalente em amostras de

câncer cervical, existindo flutuação geográfica. O HPV 18 predomina no sudeste da

50

Ásia e o HPV 45 tem maior incidência na África Ocidental. O HPV 39 e o 59 parecem

estar restritos às Américas Central e do Sul.

Nas amostras seqüenciadas não detectamos a presença do HPV 18, tipo este

predominante nos adenocarcinomas e nos tumores adenoescamosos, responsáveis

por aproximadamente 5% dos cânceres cervicais (BERTRAND, 2002). Vale ressaltar

que não obtivemos amostras de adenocarcinomas.

Segundo Pfister (1997), o HPV 66 parece ocorrer infreqüentemente, não

atingindo percentual significativo em estudos de grande amostragem. Tawheed et al.

(1991), analisando 160 biópsias de lesões anogenitais encontrou 4 amostras de

neoplasia intra-epitelial contendo DNA do HPV tipo 66, dentre as quais 3 estavam

associadas com outros tipos de HPV.

Muñoz et al. (2003), consideram o HPV 66, juntamente com o HPV 26 e 53,

tipos provavelmente oncogênicos. O sorotipo HPV 66 foi encontrado em 1(4,1%) das

amostras seqüenciadas de nossas pacientes. Não detectamos o HPV tipo 26 e HPV

tipo 53.

O HPV tipo 6 representou 4,1%(1) do nosso trabalho. De acordo com o

potencial oncogênico, é considerado como tipo de baixo risco, tendo sido encontrado

associado o HPV tipo 6 com lesões anogenitais benignas e malignas (Gross e

Barrasso, 1999).

Quanto aos fatores sociodemográficos pesquisados, em relação a raça, a cor

parda (100%) representada nesta amostra, é uma característica própria da maioria

da população que habita o Estado do Amazonas.

Várias estatísticas mostraram maior número de casos de câncer do colo do

útero em populações negras, índias americanas, americanas espanhóis e latino-

americanas que vivem no território sudoeste norte-americano (DISAIA e

CREASMAN, 1997; GOODMAN et al., 1986; JORDAN E KEY, 1981; MORROW e

TOWNSEND, 1987).

51

A incidência do carcinoma do colo uterino é menor, em relação à população

geral, na população muçulmana, mas é ainda menor na população hebraica (DE

PALO, 1996).

Ao contrário disso, as mulheres judias e as mulheres Amish parecem ter um

risco menor que o médio (PRIDAN e LILIENFELD, 1971; CROSS et al., 1968).

É possível que a disponibilidade de cuidados de saúde e práticas sexuais de

uma classe social, religião ou grupo étnico possa representar os papéis principais no

risco evidente de aparecimento da neoplasia cervical (JONES, 1988).

Em relação à faixa etária, a idade das 42 mulheres variou de 18 a 73 anos,

com mediana de 39 anos. Um caso de lesão intra-epitelial escamosa de alto grau

ocorreu em idade de 18 anos e um caso de câncer invasor na idade de 24 anos.

Hatch (1989) demonstrou que o câncer do colo do útero incide entre mulheres

com média de idade de 52,2 anos, mostrando distribuição de casos bimodal, com

picos entre 35 e 39 anos e 60 e 64 anos. Para outros autores, a faixa etária do

câncer invasivo é de 45 a 55 anos (média 48 anos) e a fase de lesão de alto grau

acontece cerca de 10 anos antes. (GUSBERG e MCKAY, 1971; FOCCHI et.al.,

(2000).

No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA) a incidência por

câncer do colo do útero torna-se evidente na faixa etária de 20 a 29 anos e o risco

aumenta rapidamente até atingir seu pico geralmente na faixa etária de 45 a 49

anos.

A renda familiar das pacientes do presente estudo foi menor ou igual a um

salário mínimo – R$ 260,00 (Ref. Dez/2004), representada por 64,3% da população

estudada; isto reflete a baixa condição sócio econômico das mulheres acometidas

pela doença. Vale a pena ressaltar que a FCECON atende predominantemente a

clientela do SUS e isto pode representar um viés em relação às pacientes com

melhor condição socioeconômica que procuram as clínicas particulares.

52

O baixo poder aquisitivo, tem implicações com o estado nutricional e talvez

possa parecer ter influências negativas, diminuindo a imunidade do hospedeiro do

HPV e contribuindo como co-fator no desenvolvimento de lesões precursoras do

câncer cervical.

Estudos de caso-controle demonstraram que a elevada ingestão de alimentos

contendo beta-caroteno e vitamina C, e em menor extensão a vitamina A, pode ter

ação protetora contra o câncer cervical. (VERREAULT, et al.,1989 e HERRERO et

al., 1991). Por outro lado, em grande estudo, caso-controle, conduzido nos Estados

Unidos não se conseguiu identificar qualquer efeito relacionados com estes fatores

dietéticos (ZIEGLER et al., 1990).

Em estudo epidemiológico demonstrou-se que a determinação dos níveis de

vitamina E, tidos como normais no grupo-controle, decresciam à medida que

aumentava a gravidade de lesão intra-epitelial cervical (CUZICK et al., 1990).

Segundo Focchi et al.(2000), é provável que a dieta possa influenciar

diferenças regionais na incidência do câncer cervical entre países ou que as trocas

metabólicas no organismo das hospedeiras de câncer invasivo possam influenciar a

ingestão destes nutrientes, levando aos distúrbios detectados.

Em relação ao nível de escolaridade, (31)73,3% das nossas pacientes

estavam cursando ou concluíram o ensino fundamental; (10)23,8% estavam

cursando ou concluíram o ensino médio e (1)2,4% era analfabeta, não havendo

registro de pacientes com nível superior.

A desinformação sobre programas de detecção do câncer cervical, a

dificuldade de acesso aos serviços de atenção primária e a associação com fatores

comportamentais sexuais em populações não esclarecidas quanto aos riscos de

infecções sexualmente transmissíveis, podem contribuir para o aumento da

incidência desta doença.

A maioria da população estudada (32)76,2% teve a primeira relação sexual

antes dos 16 anos e (21)50,0%, três ou mais parceiros sexuais.

53

Diferentes autores chegaram à mesma constatação, caracterizando a

associação do câncer do colo uterino com a atividade sexual. Estudos conduzidos

durante os últimos 25 anos, indicam consistentemente que o risco de câncer cervical

é fortemente influenciado por duas medidas da atividade sexual: o número de

parceiros sexuais e a idade do primeiro intercurso, e pelo comportamento sexual do

marido ou dos parceiros masculinos da mulher (FRANCO, 1997).

Usando o instrumento estatístico da análise de risco relativo, demonstrou-se

risco aumentado para o aparecimento de neoplasia cervical em mulheres com

múltiplos parceiros sexuais e pouca idade no início da atividade sexual. (HARRIS et

al.,1980).

Quando comparado com mulheres com apenas um parceiro sexual, o risco de

carcinoma in situ, atualmente incluído na terminologia de lesão intra-epitelial de alto

grau, aumentou 8 vezes entre as mulheres com três a cinco parceiros sexuais e,

quando o número foi maior que seis parceiros, o risco aumentou para 14,2 vezes.

(HARRIS et al.,1980).

Outros fatores de risco, tais como história conjugal instável, gestações

multiplas, casamento precoce e idade precoce da primeira gravidez, são

provavelmente relacionados com os dois fatores principais de múltiplos parceiros e

início precoce das relações sexuais. (JONES, 1990).

A idade da primeira gestação ocorreu depois dos 16 anos em (27)65,9%. Em

relação ao número de partos, a maioria (33)82,5% da população estudada relatou

antecedentes de 3 ou mais partos via vaginal.

Segundo Franco (1997), dois grandes estudos caso-controle multicêntricos

demostraram efeito independente para a paridade. Um desses estudos foi conduzido

em quatro regiões metropolitanas dos Estados Unidos e, o outro, em quatro países

latino-americanos. Ambos os estudos, mostraram tendência linear na relação risco e

paridade, mais evidente no estudo latino-americano, onde é maior a proporção de

mulheres multíparas.

54

Figueiredo (2004), refere estudos controlados que demonstram um aumento

de 5 vezes no risco de desenvolvimento de câncer cervical em mulheres multíparas -

mais de dez gestações.

Na presente investigação, (26)61,9% das mulheres não fizeram uso de

anticoncepcional hormonal oral. Nas (16)38,1% que utilizaram o método, não foi

assegurada a utilização regular e contínua nos últimos 10 anos.

Vários estudos evidenciaram risco aumentado, principalmente entre as

usuárias de anticoncepcionais orais de longo prazo, após o ajuste dos maiores

fatores de discrepância (CLARKE et al., 1985; BRINTON et al., 1986; BRINTON et

al., 1987; SHIFFMANN et al., 1996, FRANCO et al., 1999; FERENCZY e FRANCO,

2002).

Vale ressaltar que Irwin et al.(1988), interpretava esta associação como uma

possível tendenciosidade de detecção, pois as usuárias de pílulas submetem-se a

exames ginecológicos mais freqüente do que as não usuárias, portanto tendo uma

taxa de detecção precocemente aumentada da doença (JONES, 1988).

Segundo Trindade (2001), a maior exposição sexual ou a diminuição do uso

dos métodos de barreira podem contribuir para o aumento de risco nas usuárias de

anticoncepcionais hormonais.

Em relação ao tabagismo, o número de mulheres fumantes de cigarros

representou (9)21,4% do total de mulheres pesquisadas. Um percentual maior

24(57,1%) ocorreu quando acumulamos o número de fumantes com ex-fumantes.

Winkelstein (1977), levantou a hipótese de que o tabagismo estivesse

relacionado ao carcinoma do colo uterino. Esta hipótese baseava-se na observação

de que o tabagismo estivesse estreitamente relacionado ao mesmo tipo histológico

(carcinoma epidermóide) predominante no pulmão, laringe e colo do útero (DE PALO

e VECCHIONE, 1996).

55

Lyon et al (1983), estudando 217 mulheres com carcinoma in situ

encontraram risco relativo de 3.0 para as fumantes de cigarros, depois de controlar

outros fatores de risco entre os quais, os sócio-econômicos e sexuais (JONES,

1988).

Em estudo semelhante, realizado por Harris et al. (1980), verificou-se

risco três a quatro vezes aumentado de NIC entre as mulheres que fumavam 20 ou

mais cigarros por dia (JONES, 1988).

Barton et al. (1988), demonstrou a associação do tabagismo com nítida

depleção numérica das células de Langerhans do epitélio cervical normal. A

imunodepressão local que se instaura após a diminuição das células de Langerhans

pode explicar como o tabagismo contribui para o desenvolvimento da neoplasia

cervical (DEPALO, 1996).

Uma ação carcinogênica direta dos metabolitos da nicotina, sobre o epitélio

da cérvice uterina e a diminuição da resposta imune com diminuição de células

“natural Killer” e dos níveis de IgG e IgA parecem contribuir para o desenvolvimento

oncogênico na cérvice, anus e vulva. O número de cigarros e o tempo de consumo

apresentam correlação positiva. (GOODMAN et al.,1986; SCHIFFMAN et al., 1987;

YORDAN e WILBANKS, 1989; MEANWELL, 1991; HERBST et al.,1992).

No estudo realizado a concentração de nicotina e de seu maior

metabólito, a cotinina, observou-se maior concentração sérica no muco cervical do

que no plasma de mulheres fumantes ativas, não ocorrendo nas fumantes passivas

ou não fumantes (HELLBERG et al.,1988).

A 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK), poderoso

carcinógeno do tabaco, pode ser agente carcinogênico independente, não só para

tumores do colo do útero como, também, para os de outros órgãos. (HELLBERG et

al.,1988).

56

Em revisão de literatura, concluiu-se que, dos 33 estudos publicados, a

maioria confirmava a associação positiva entre fumo e câncer do colo do útero

(WINKESLTEIN, 1990).

Em relação ao sangramento anormal e/ou sangramento ao coito, o mesmo

percentual (15)35,7% de mulheres responderam afirmativamente ter apresentado

estas sintomatologias. Considerando o alto percentual de mulheres assintomáticas

27(64,3%) acreditamos que as lesões intra-epiteliais cervicais e o câncer do colo

uterino em fases iniciais de invasão possam ter passado despercebidos pela maioria

da população.

Segundo Carvalho (2000), o câncer do colo uterino se desenvolve sem

qualquer sintomatologia específica, nas suas etapas iniciais pré-invasivas,

manifestando-se por sangramentos, somente quando o tumor invade o estroma

cervical.

O acesso das mulheres aos programas de detecção precoce e o tratamento

adequado das lesões precursoras do câncer do colo uterino, têm sido reconhecido

como a melhor estratégia para reduzir a mortalidade e controlar a doença.

57

6. CONCLUSÕES

1. Detectou-se, através da PCR, a presença de DNA do HPV em 100% das 42

pacientes.

2. Na análise de homologia foram identificados os sorotipos de HPV 16, 31, 33 e

56, considerados de alto potencial oncogênico; o sorotipo HPV 66, tipo

considerado provavelmente oncogênico e o sorotipo HPV 6, classificado

como de baixo risco .

3. O sorotipo HPV-16, foi o mais prevalente em 18 (75%) das 24 amostras

seqüenciadas.

4. A relação sexual precoce (antes dos 16 anos), múltiplos parceiros sexuais,

multiparidade (igual ou maior que 3 partos via vaginal), baixo nível de

escolaridade, baixa renda familiar e fumo foram os principais fatores

sociodemográficos associados com a população estudada.

5. Os dados obtidos através deste trabalho confirmam os dados existentes na

literatura mundial e indicam a importância da prevenção da transmissão

sexual do HPV, o fator principal para o desenvolvimento das lesões intra-

epiteliais de alto grau e câncer epidermóide invasor do colo uterino nestas

pacientes.

58

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ANEXO I

FICHA TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO INVESTIGADOR: Gilson José Corrêa INSTITUIÇÃO: Fundação Centro de Controle de Oncologia TELEFONE: (92) 3656-1211 TÍTULO: Prevalência de HPV em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor. DESCRIÇÃO E OBJETIVO DO ESTUDO

Este é um estudo epidemiológico. Seu objetivo é investigar a presença de Papillomavírus humano (HPV) em

mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino em pacientes atendidas na FCECON, na cidade de Manaus, através do método da PCR, visando estimar a prevalência da infecção na população pesquisada.

Eu recebi a explicação de que eu serei uma das pacientes participantes do projeto. Minha participação será absolutamente voluntária. Este estudo foi desenhado para avaliar quantas mulheres são portadoras de HPV no grupo pesquisado e assim determinar a prevalência da infecção. Se eu voluntariamente concordar, eu permitirei que sejam feitos os exames necessários, inclusive a PCR, para identificar a presença do HPV com descrição dos tipos específicos, para confirmação diagnóstica. Estou ciente da importância de ser questionada sobre mim mesmo no que se refere a algumas questões de saúde e condições de vida.

Todos os procedimentos serão realizados na FCECON. RISCOS ASSOCIADOS AO ESTUDO

Fui orientada que os exames da PCR podem dar resultados falso-positivos e

falso-negativos, induzindo a erros de interpretação. BENEFÍCIOS

Participando neste estudo, estarei me beneficiando do exame da PCR, importante para verificar a presença ou não do HPV e sua associação com o câncer do colo uterino. Além disso, estarei contribuindo para o conhecimento de quantas pessoas são afetadas por este tipo de doença.

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CONFIDENCIALIDADE E AVALIAÇÃO DOS REGISTROS

Minha participação neste estudo será confidencial e os registros ou resultados ao estudo serão divulgados ao nível científico e autoridades de saúde pública a fim de que sejam tomadas atitudes que garantam a saúde da população.

Minha identidade permanecerá sempre em confidencialidade. DIREITO A RETIRADA DO ESTUDO

Eu tenho direito de fazer qualquer pergunta referente aos riscos potenciais ou conhecidos para mim durante minha participação neste estudo.

Eu serei notificada com referência a qualquer nova informação relacionada com o estudo. Eu serei capaz de contatar o Dr. Gilson José Corrêa, cujo número de telefone é (92)236-5069 ou (92) 81285023. PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA

A minha participação neste estudo é voluntária. Se eu recusar a participação neste estudo, não haverá qualquer tipo de retaliação ou perda de benefícios a que tenha direito.

Eu tenho o direito de manter uma cópia assinada deste documento.

CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO Após ter recebido informações claras, eu concordo com minha participação no estudo.

/ / Assinatura do Paciente do Estudo Data

/ /

Assinatura da 1ª Testemunha Data / /

Assinatura da 2ª Testemunha Data / /

Assinatura do Investigador Data

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ANEXO II

FICHA DE TRIAGEM E QUESTIONÁRIO

I. TRIAGEM 1. Informações sobre o estudo e confiabilidade do estudo 2. Consentimento da paciente em participar do estudo 2.1 ( ) Sim

2.2 ( ) Não 3. Identificação com as iniciais da paciente_____________ 4. Data de nascimento _____/_____/_____ 5. Ultima menstruação _____/_____/_____ 5.1 ( ) não sabe informar

5.2 ( ) menopausada 6. Qual a sua procedência? 6.1 ( ) Manaus

6.2 ( ) Interior do estado do Amazonas 6.2 ( ) Outro estado da região norte 6.3 ( ) Outro estado da federação

7. Você já teve seu útero removido (histerectomia)? Fez crio ou termocauterização, laserterapia, quimioterapia ou radioterapia? 7.1 ( ) Sim

7.2 ( ) Não 7.3 ( ) Não sabe informar

8. Resultado do exame colpocitológico: Data do exame:____/____/____ 8.1. ( ) NIC III/Ca “in situ”

8.2 ( ) Carcinoma microinvasor 8.3 ( ) Carcinoma escamoso invasor 8.4 ( ) Adenocarcinoma

9. Resultado de biópsia/exame histopatológico: 9.1 ( ) NIC III/Ca “in situ”

9.2 ( ) Carcinoma microinvasor 9.3 ( ) Carcinoma escamoso invasor 9.4 ( ) Adenocarcinoma

II. QUESTIONÁRIO 10. Qual seu estado civil? 10.1 ( ) Solteira

10.1 ( ) união estável 10.2 ( ) Casada 10.3 ( ) Divorciada/separada 10.4 ( ) Viúva

11. Qual o nível mais elevado de escolaridade que você completou? 11.1 ( ) Primeiro grau incompleto

11.2 ( ) Primeiro grau completo 11.3 ( ) Segundo grau incompleto 11.4 ( ) Segundo grau completo 11.5 ( ) Curso profissionalizante após o segundo grau 11.6 ( ) Universidade

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12. Qual a sua renda familiar? 12.1 ( ) 1 salário mínimo

12.2 ( ) 2-3 salários mínimos 12.3 ( ) 3-4 salários mínimos 12.4 ( ) 5-6 salários mínimos 12.5 ( ) acima de 6 salários mínimos

13. Idade da 1ª relação sexual__________ 14. Idade da 1ª gestação_____________ 15. Você está grávida no momento? 15.1 ( ) Sim

15.2 ( ) Não 15.3 ( ) Não sabe informar

16. Nº total de abortos ____________ 17. Nº de partos normais _____________ 18. Nº de partos cesáreos _____________ 19. N° total de partos 20. Você utilizou anticoncepcional oral ou injetável nos últimos 10 anos? 20.1 ( ) sim

20.2 ( ) não 21. Qual das seguintes situações melhor descrevem o seu hábito de fumar? 21.1 ( ) Eu nunca fumei

21.2 ( ) Eu fumei no passado, mas não fumo atualmente 21.3 ( ) Eu geralmente fumo menos de uma carteira por dia 21.4 ( ) Eu geralmente fumo em torno de uma carteira ou mais por dia

22. Qual o número de parceiros sexuais que você já teve na vida? 22.1 ( ) um

22.2 ( ) dois 22.3 ( ) três 22.4 ( ) quatro 22.5 ( ) cinco ou mais

23. Sangramento uterino anormal no último ano? 23.1 ( ) Sim

23.2 ( ) Não 24. Sangramento ao coito no último ano? 24.1 ( ) Sim

24.2 ( ) Não 25. Pesquisa para HIV: 25.1 ( ) nunca fez exame

25.2 ( ) negativo 25.3 ( ) positivo

1. OBSERVAÇÕES: 2. RESULTADO DO EXAME HISTOPATOLÓGICO: 3. RESULTADO DA PCR:

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GILSON JOSÉ CORRÊA - pos.uea.edu.br · sociodemográficos associados à neoplasia do colo uterinoforam estudados a partir da análise de correspondência, sendo empregado o programa