Guia Biologia Molecular UNFV 2002

8/8/2019 Guia Biologia Molecular UNFV 2002

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I sr ael Barrantes is [email protected] y Biol.Molecular UNFV

UNI VER S I DAD NACI ONAL F EDER I CO VI L L AR R EAL

FACUL T AD DE CI ENCI AS NAT UR AL ES Y MAT EMAT I CAS

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular

_______________________________________________________

GU I A DE P R ACT I CAS

BB II OOLL OOGG AA MMOOLL EE CCUU LL AARR

A UT O RES :

Bil .W. Is rael Barrantes Bust inza

Mg. Car los S ant a Cr uz Car pio

L ima, Agos to de 20 02 .


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I sr ael Barrantes is raelbarrantes@univers ia.edu.peLab.Bioqumica y Biol.Molecular UNFV

Presentacin

El Laborator io de Bioqumica y Biologa Molecular de la Facultad de CienciasNaturales y Matemticas de la Universidad Nacional Federico Vi l larrealpresenta esta Gua de Prcticas para el Curso de Biologa Molecular . Lasprcticas que se han incluido tienen la final idad de famil iar izar al alumno conlos mtodos de mayor importancia en la Bi ologa actual. Pocas universidades

de nuestro pas estn en la capacidad de br indar a sus estudiantes prcticasdel nivel que aqu se propone, por lo que es necesario comprender el esfuerzoque hacen los profesores integrantes del Laborator io en proporcionar losmateriales y reactivos que se usarn durante las prcticas, y seanaprovechados al mximo.

Lima, Agosto del 2,002.

Profesores del Curso de Biologa Molecular :

Bil. W.Israel Barrantes Bustinza.

Mg. Car los Santa Cruz Carpio.


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Bil.I sr ael Barrantes is raelbarr [email protected] y Biol.Molecular UNFV

Medidas de Bioseguridad

1. Asumir de que toda muestra que contiene fluidos biolgicos espotencialmente patgena, dado de que no existe un mtodo quegarantice la inocuidad total .

2. Usar mandi l durante todo el tiempo que se permanezca en ellaboratorio, para proteger la ropa y el cuerpo, y vestir

apropiadamente de acuerdo al procedimiento a real izar, es decir,usar mascari l la, guantes y cubri r el cabello de ser necesario.

3. No inger ir al imentos ni fumar en el interior del laborator io. Algunassustancias txicas tienen la capacidad de ser volti les y por lo tantose encuentran trazas de el las suspendidas en el aire.

4. Leer cuidadosamente el procedimiento a seguir durante unaprctica, con el obj eto de luego estar al tanto de las consideracionesde seguridad especficas de cada reactivo uti l izado (Para tal fin serecomienda leer los Mater ial Safety Data Sheet que viene incluidocon cada reactivo)

5. No uti l izar la l lama del mechero si n cerciorarse antes de que no hayacerca l quidos inflamables, ni mantenga el mechero o cocinaencendida sin necesi dad.

6. Descontaminar apropiadamente: El rea de trabaj o deber siemprecubr irse con papel toal la o absorvente. Los mater iales descartablesdebern ser desechados de acuerdo a la naturaleza del material(vidr ios, derivados del caucho o del plstico, etc.). Los reactivos orestos de reacciones debern eliminarse en contenedores apropiados(En ningn caso arroj ar un qumico o cualquier material al lavabo).

7. Rotular apropiadamente los recipientes, tubos y dems dispensablesempleados para almacenar, con el nombre del material,responsable(s), fecha.

8. En caso de ingeri r o entr ar en contacto con algn reactivo, o de

cualquier accidente, descontaminar rpidamente el rea de trabaj oy luego personalmente, si guiendo las i nst rucciones r equeridasespecficas para cada caso.


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Practica N 1

Aislamiento de cidos Nucleicos

El ADN genmico puede obtenerse a partir de cualquier micro- organismo,planta o animal en cualquier instante durante su desarrol lo, y nos provee decopias moleculares de genes de cada organismo. Este material puedeentonces ser uti l izado para la construccin de bibl iotecas, en anl isis de

hibr idacin, como molde en reacciones de amplificacin y secuenciamiento,entre otras aplicaciones. Los mtodos de aislamiento de cidos nucleicos, sinimportar de que tipo o procedencia, siguen siempre cuatro etapasfundamentales: l si s de clulas, inhibicin de nucleasas, desproteinizacin yprecipitacin de cidos nucleicos. La diferencia entre cada mtodo radica enel pre- t ratamiento, lo cual depender del or igen del material ; ademsdeber tenerse en cuenta de que el mtodo de puri ficacin tiene que serperfectamente compatible con el uso futuro que se piensa dar al ADN o ARNpurificado. El ADN puede aislarse mediante ruptura de tej idos, y luegoexplotando las diferencias en las propiedades de los cidos nucleicos, lasproteinas y dems constituyentes celulares. T ras l a l si s celular , se trata deinhibir las nucleasas, que de otra forma degradar an el mater ial a purificar,

para luego desproteinizar la muestra, ya sea mediante mtodos qumicos(solventes orgnicos, detergentes no inicos) o enzimticos (proteasas).Finalmente, los cidos nucleicos son concentr ados mediante precipitacin enpresencia de etanol o isopropanol, y sales monovalentes como acetato desodio o de amonio, a baj as temperaturas (Sambrook et al . , 2001; Ausubel etal . , 1999; T owner, 1994)

Experimento I

Objetivo. - Aislar el ADN Genmico de Escher ichia col i

Fundamento.- El ADN genmico es fci l de aislar y caracterizar pero ser deescasa uti l idad a menos de que sea de elevado peso molecular como para serposter iormente manipulado mediante tratamientos enzi mticos (T owner,1994). En el caso de las bacterias, el pre- tratamiento se l leva a cabo estdestinado a la digestin de la pared celular para l iberar el contenidocitoslico, para luego separar el cromosoma usando sus propiedadesdiferenciales.

Materiales y Reactivos. -

T r is-HCl 50 mM pH 7.7; High TE (T r is-HCl 25 mM, pH 8.0; EDT A 20 mM); Low

T E (T r is-HCl 50 mM, pH 8.0; EDT A 1 mM); SDS 20%; NaCl 5M; Fenol saturadocon T E; Cloroformo; Alcohol i sopropl ico; Etanol al 70%.

Procedimiento. -

1. Cultivar por 14 horas las cepas de Escher ichia col i en 5 mL del medio LBa 37 Ccon agitacin.

2. Colectar las clulas por centr ifugacin durante 10 minutos a 2500 RPM


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3. Resuspender las clulas en 1 mL de la solucin "High TE".4. Adicionar 30 uL del stock de NaCl 5M y 10 uL del stock de SDS. Agitar el

contenido del tubo.5. Agregar 0.5 mL de Fenol saturado con TE y homogenizar por inversin

cuidadosamente por 5 minutos.6. Centr ifugar a 3000 RPM por 10 minutos, para separar las fases.7. Aspirar la fase superior (acuosa) que conti ene al ADN, y transfer ir la a

un tubo nuevo.8. Adicionar a la fase acuosa 1 mL de Cloroformo, y homogenizar por

inversi n durante 5 minutos. Centr ifugar 10 minutos. Aspir ar la faseacuosa que contiene al ADN y transferir la a un tubo nuevo de centr fugade 2 mL.

9. Repeti r el procedimiento (8) hasta obtener una fase acuosacompletamente clara.

10. Adicionar 1 volumen de alcohol isopropl ico helado, y dej ar en reposopor una hora en hielo. Luego centr ifugar por 15 minutos.

11. El iminar cuidadosamente el sobrenadante, y enj uagar el sedimento con1 mL de etanol al 70%. T rasladar el contenido a un tubo demicrocentr fuga.

12. Centr ifugar en la microcentr fuga durante 10 minutos. El iminar el

alcohol y dej ar secar a medio ambiente.13. Resuspender el sedimento con 300 uL de la solucin "Low TE".

Experimento II

Objetivo. - Pur i ficar ADN cromosmico animal.

Fundamento.- Mtodo de aislamiento de ADN genmico sin emplearextraccin con fenol ni centr ifugacin. Adaptado de Laird (1991). El mtodogeneral es descri to en Sambrook et al .(2001).

Materiales y Reactivos.-

100mM T r is HCl pH 8.5; 10mM T r is HCl pH 7.5; 0.5M EDT A; 10% SDS; 5M NaCl;20mg/ml Proteinasa K; isopropanol; agua bidesti lada.

Procedimiento

1. Lsis: El buffer de l si s se agrega al tej ido o clulas (usualmente 0.5mL). La digest in se completa despus de varias horas a 37 (clulas, 2-3 hrs.) o 55 (tej idos) en agitacin.

Buffer de Lsis:

100mM T r is HCl pH 8.5 5ml0.5M EDTA 0.5ml10% SDS 1ml5M NaCl 2ml20mg/ml Proteinasa K 0.25mlCompletar hasta 50ml con agua bidesti lada.


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2. Precipi tacin: Se agrega un volumen de isopropanol al l isado, y semezcla por inversi n hasta que se complete la precipitacin (unos 10-20 minutos); (debe desaparecer la vi scosidad).

3. Recuperacin del Precipi tado: El ADN precipitado se recuperalevantndolo con una punta descartable de micropipeta. Debe secarseal ambiente el exceso de lquido. El ADN luego se debe resuspender en20 a 500ul de 10mM T r is HCl, 0.1mM EDTA, pH 7.5. , dependiendo delvolumen de clulas o tej ido procesado. La resuspensin total requierede varias horas de agitacin a 37 55 (mej or overnight). Esimportante que el ADN est totalmente resuspendido para asegurarsede remocin reproducible en al cuotas para el anl i si s.

Experimento III

Objetivo. - Puri ficar ADN cromosmico vegetal .

Fundamento.- El ADN vegetal es ms difici l de obtener de una forma que sealuego clonable o digerible, que el proporcionado por clulas animales, debido

principalmente a la presencia de metabol itos secundarios y pol isacaridos, loscuales interfieren con el procedimiento de ext raccin y se co- purifican con elADN; algunos de estos problemas pueden superarse usando hoj as sin expandir.Los tej idos de plantas son robustos y por lo tanto requieren pre- tratamientosintensi vos, tales como largas i ncubaciones enzimticas, mol ido en nitrgenolquido con polvo de almina seguida por extraccin con el tampn CT AB, etc.El mtodo aqu descrito proporciona cantidades r elativamente puras de ADNgenmico, que puede usarse como molde de amplificacin con fines defingerpr inting molecular (RAPDs, microsatl ites u otras metodologas) (Griffiny Griffin, 1994).


T r isHCl 1 M pH 7.4, EDT A 0.5M, NaCl 5M, SDS 10%, Cloroformo, AlcoholIsopropl ico, Etanol Absoluto, Buffer T E (T r isHCl 50 mM pH 8.0, EDT A 1 mM).

Procedimiento. -

1. Colocar hoj as de quinua (0.15 grs) con 400 L del buffer de maceracinen un tubo de microcentr fuga nuevo. Homogenizar hasta que semuestre de color verde intenso.

Buffer de Maceracin:

1M T r is HCl pH 7.4 10ml0.5M EDTA 2.5ml10% SDS 2.5ml5M NaCl 2.5mlAgua Bi dest i lada hasta completar 50 mL

2. Sedimentar en la microcentr fuga a 14,400 RPM por 1 minuto.


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3. Agregar un volumen de cloroformo y mezclar por inversi on. Dejarreposar 5 minutos a temperatura ambiente. Centr ifugar por 5 minutosen la microcentr fuga. T rasvasar el sobrenadante a un tubo nuevo.

4. T rasvasar 300 L del sobrenadante, y precipitar con 0.1 volumenes deNaCl 5M con uno de los siguientes alcoholes:

Alcohol Isopropl ico 1 volumenEtanol Absoluto 2 volumenes

5. Dejar reposar a temperatura ambiente por 5 minutos, luego sedimentaren la microcentr fuga a velocidad mxima por 5 minutos.

6. Dejar secando a temperatura ambiente. Resuspender en 100 L de agual ibre de nucleasas (deionizada 18 MOhm), o en buffer T E (T r i s-HCl 10mM, EDTA 1 mM). El producto final es de 20 ng/L de ADNaproximadamente.

Experimento IV

Objetivo. - Aislar ADN Plasmdico de cepas de E.col i usadas comnmente entecnologas de ingeniera gentica.

Fundamento.- Existen numerosas formas de aislar plasmidos pero un mtodoen particular (Birboim y Doly, 1979) si gue si endo universalmente popular porser rpido, reproducible y provee de varios microgramos de plsmido, el cualestar l isto para manipularse luego con enzimas. El aislamiento se consigue entres pasos esencialmente: La pared celular bacteriana es debil itada usandolisozima, y luego se lisan las clulas usando un agente quelante y undetergente a pH elevado; finalmente el debr i scelular insoluble, que consi stede ADN genmico y proteinas, es precipitado uti l izando concentracioneselevadas de sales y centr ifugacin, dejando el plsmido en solucin.


T r isHCl 1M pH 8.0, EDT A 0.5M pH 8.0, SDS 20%, NaOH 10N, Acetato de Potasi o3M pH 5.2, Etanol al 70%, Etanol Absoluto.

Procedimiento. -

1. T ransferi r una sla colonia bacteriana a 2 mL de medio LB que contieneel antibitico apropiado (en nuestro caso, Ampici l ina hasta 100 ug/mL).

Incubar el cultivo toda la noche (overnight) a 37C, con agitacinvigorosa.

2. T rasvasar 1.5 mL del cultivo a un tubo de microcentr fuga. Centr ifugara 12,000g por 30 seg. Remover el medio (sobrenadante), dejando elpel let seco.

3. Resuspender el pel let en la 100 uL de la Solucin I fr a (T r isHCl 25 mMpH 8. 0, EDTA 10 mM) mediante agitacin vigorosa


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4. Agregar 200 uL de la Solucin II (NaOH 0.2N, SDS 1%). Mezclar elcontenido por inversin cinco veces; conservar el tubo en hielo.

5. Aadir 150 uL de Solucin II I (Acetato de Potasio 3M pH 5.2). Mezclar enel agitador por diez segundos; conservar en hielo por 5 minutos.

6. Centr ifugar a 12,000g por 5 minutos a temperatura ambiente.T ransferi r el sobrenadante a un tubo nuevo.

7. Agregar 2 volmenes de etanol a temperatura ambiente. Mezclar en elagitador. Permitir que la mezcla permanezca 2 minutos a temperaturaambiente.

8. Centr ifugar a 12,000g por 5 minutos. Remover el sobrenadante poraspiracin o invertir lo sobre papel toal la.

9. Enj uagar con 1 mL de etanol al 70% a 4C; remover el sobrenadante ysecar el pel let al aire por 10 minutos.

10. Redisolver los cidos nucleicos en 50 uL de TE (T r isHCl 10mM, EDT A1mM pH 8.0). Agitar brevemente. Almacenar a -20C.

Pregunt as de Repaso

1. Porqu los cidos nucleicos precipitan en presencia de alcohol ysales?

2. Cules pre- tratamientos debern emplearse, primero en el caso deaislar ADN genmico a partir de pequeos invertebrados, y luegopara aislar ADN de levaduras?

3. Qu est rategia deber uti l izarse para separar las diferentesfracciones de tr anscritos nacientes y maduros?

4. Qu cantidad de ADN genmico se pueden aislar a parti r de cienl infocitos humanos?


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Practica N 2

Electroforesis de cidos Nucleicos

El problema de real izar separaciones de biomolculas grandes es enfrentadofrecuentemente en las ciencias de la vida, tanto para anl isi s cual i- comocuantitativos de mezclas o de preparaciones individuales. En l a mayor a decasos es deseable causar el mnimo de dao a las molculas de manera que

sus propiedades no cambien de manera significativa. Los mtodos actualespara la separacin de biomolculas descansan por lo tanto en procesos f sicosque causan el mnimo de desnatural izacin, lo cual resulta en la mxi maretencin de cualquier actividad biolgica. Un gran grupo de mtodos deseparacin estn basados en algunas propiedades qumicas o biolgicas, o eninteracciones de la molcula que se investiga, y algunas otras estn basadasen diferencias en pesos moleculares o cargas netas, o a veces unacombinacin de las dos propiedades. Los mtodos electroforticos puedendisearse para explotar cualquiera de los dos, o ambos parmetros, aunquelas diferencias en tamao son las pr incipales en el caso de las separaciones decidos nucleicos.

Experimento I

Objetivo. - Caracterizar los cidos nucleicos usando electroforesi s en geles deagarosa

Fundamento.- Los geles de agarosa son el medio ms popular paraseparaciones electroforticas de cidos nucleicos de mediano y gran tamao.Las concentraciones ms tpicas de agarosa van de 0.3 hasta 2.5 %, y estaconcentracin depende de los tamaos de los cidos nucleicos a separar.Aunque los geles de agarosa carecen de fuerza mecnica (especialmente losms di luidos), la manipulacin se faci l i ta por el uso de geles hor izontales, los

cuales pueden ser soportados por lminas de vidr io o de plstico (Andrews,1994).


Materiales: Camara electroforetica, fuente de poder, camara fotografica,rol lo fotografico B/N ASA 100, recipiente para tincion, T ransIluminador UV,Lentes UV, Cinta maski ng. Reactivos: Agarosa (grado biologia molecular),Buffer de Corr ida T AE 10X (T r is-Acetato 400 mM, EDT A 20 mM), Buffer deMuestra (Concentraciones finales: Fi col l-400 2%, EDT A 10 mM, SDS 0.1%, Azulde bromofenol 0.025%, Xylene-Cyanol 0.025%), Bromuro de Et idio 10 mg/mL

Procedimiento. -

1. Preparacion del Gel de Agarosa: Se preparan 150 mL de Buffer deCorr ida T AE 1X a parti r del stock 10X. Luego se disuelven 0.24 gr deAgarosa en 30 mL de Buffer T AE 1X en un vaso de precipitado, paratener un gel de 0.8% de concentracion (apropiado para separarfragmentos de acidos nucleicos entre 0.5 10 Kb.). Calentarbrevemente el recipiente para disolver, y dej ar enfr iar .


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2. Preparacion de la Camara El ectroforetica: Colocar la base del gelsobre la camara electroforetica, y delimitar con cinta maski ng tapelos l imites del gel , y luego el peine que marcara los pozos. Vertir laagarosa cuando este l ista, y dej ar solidificar . Una vez sol ido, seagrega un poco de Buffer de Corr ida T AE 1X, y se reti ra el peine. Losiguiente sera colocar los electrodos, ayudandose de cinta maskingpara suj etar los.

3. Preparacion de las Muestras: Los acidos nucleicos a estudiar semezclan en una proporcion 1:6 con el Buffer de Muestra sobre untrozo de parafi lm o luna de reloj , y cada muestra se siembra en unode los pozos del gel.

4. Cor r ida Electroforetica: Se conectan los electrodos a la Fuente dePoder, y se dej a correr a 60 80 voltios durante 1 - 3 horas, ohasta que el azul de bromofenol haya migrado 2/3 de la longitud delgel.

5. T incion del Gel de Agarosa: T rasladar el gel a un recipiente quecontenga Bromuro de Etidio (concentracion final 0.5 ug/mL). Agitarpor 5 minutos. Luego, enjuagar pr imero con agua corr iente y despuescon agua dest i lada. (Sharp et al . , 1973).

6. Visual i zacion y Fotografia: El gel teido se coloca sobre el T rans

Iluminador UV y se observan teniendo en cuenta el usar lentes deproteccion. La vista se toma en cuarto oscuro con una camara fi j ausando un fi l tro roj o, con el diafragma completamente abierto si seuti l iza pelicula blanco y negro ASA 100. La fotografia es tomada conuna exposicion de 15 20 segundos.

Experimento II

Objetivo. - Caracterizar los cidos nucleicos usando electroforesi s en geles depoliacr i lamida

Fundamento.- Los geles de pol iacr i lamida son formados por la pol imer izacinvinl ica de los monmeros de acr i lamida en largas cadenas aleator ias depoliacr i lamida, las cules son entre- cruzadas por la inclusin en la mezcla depequeas cantidades de un co- monmero bifuncional apropiado, de formausual bisacr i lamida. Las cadenas entre- cruzadas forman una estructura degel, cuyo tamao de poro viene determinado por las concentraciones i nicialestanto de acri lamida como del co- monmero. La polimer izacin procede porun mecanismo de radicales l ibres, y la manera ms comn de iniciarlo esempleando persulfato de amonio, el cual produce radicales l ibres de oxgenovia un mecanismo de catl isis por base, siendo las bases usadas generalmenteaminas al ifticas terciarias (como el T EMED, por ej emplo).


Materiales: Camara electroforti ca, fuente de poder, papel fotogrfico,equipamiento para impresin de fotografas, recipiente para tincion, Cintamaski ng, cinta selladora de geles, papel tissue. Reactivos: Pol iacr i lamida(Acri lamida: Bi sAcrilamida 19:1 en Urea 7M, grado biologia molecular), Bufferde Corr ida T BE 10X (T r is-Borato 400 mM, EDT A 20 mM), Persul fato de amonio10%, T EMED, Solucin Fij adora Stop (Acido Acti co Glacial 10%), Solucin de


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T incin (AgNO3 1 gr/Lt, HCOH 0.056%), Solucin de Revelado (Na2CO3 30 gr/Lt,HCOH 0. 056%, Na2S2O3 . 5 H2O 2 mg/Lt), Solucin de Unin (3 uL Bind Si laneen 1 mL etanol 95%, cido actico glacial 0.5%)

Procedimiento. -

1. Preparacin de la Cmara El ectrofortica: Limpiar meticulosamentelas placas de vidr io pr imero durante cinco minutos con papel ti ssuesaturado con 1 mL de la solucin de unin recin prpeparada, y luegocon 2 mL etanol al 95%. Repeti r este procedimiento al menos unavez. Ensamblar las placas de vidr io con los espaciadores y clamps, ysel lar con cinta selladora de geles; asegurarse de el iminar los canalesde aire presionando fi rmemente.

2. Preparacin del Gel de Pol iacr i lamida: Preparar un gel depoliacr i lamida al 6% en buffer T BE, mezclando ambas soluciones enun beaker de 50 mL. Agregar 250 uL de la solucin APS y 15 uL deT EMED (para un gel de 40 mL). Cargar inmediatamente en una placade electroforesi s vertical preparada con anticipacin, utilizando unapipeta, y evitando la formacin de burbuj as; luego colocar el peineespaciador y esperar la gelificacin completa (unos 30 minutos).

Luego de la pol imer izacin, retirar los clamps y la cinta, luegocuidadosamente reti rar el peine. Enj uagar la parte superior del gelcon buffer de corr ida y el peine con agua desti lada.

3. Preparacion de las Muestras: Despues del termociclaj e desecuenciamiento, se aaden 3 uL de Solucin Stop deSecuenciamiento (ver protocolo de secuenciamiento). Calentar lasreacciones a 70C por 2 minutos i nmediatamente antes de cargar de3.0 a 3.5 uL de cada reaccin en el gel de pol iacr i lamida al 6%..

4. Cor r ida Electrofortica: Llenar los electrodos con buffer de corr idaT BE 1X. Se conectan los electrodos a la Fuente de Poder, y se dejacorrer a 300 voltios durante toda la noche, (Correr a un voltaj econstante).

5. Fi j acin del Gel: T rasl adar el gel a un recipiente que contenga laSolucin de Fi j acin Stop y agitar bien por 20 minutos o hasta queel buffer de muestra haya desaparecido.

6. Lavado del Gel: Enj uagar el gel tres veces (de dos minutos cada uno)con agua ultra-pura con agitacin. Levantar el gel y dejarlo secardurante 10 20 segundos antes de tr ansferir lo al siguiente lavado.

7. T incin del Gel: T ransfer ir el gel a la solucin de tincin y agitarbien por 30 minutos.

8. Revelado del Gel: Sumergir el gel en un recipiente que contengaagua ultrapura, secar y colocar inmediatamente el gel en unrecipiente con la solucin de revelado helada. Agitar bien hasta quelas primeras bandas sean visibles, agregar todo el resto de lasolucin de revelado, y continuar hasta que todas las bandas seanvisibles. Luego agregar 1 Lt de la solucin de fi j acin stop e incubaren agitacin por 2 3 minutos. Enj uagar el gel dos veces por 2minutos cada vez en agua ultrapura. Dejar secar el gel atemperatura ambiente o uti l izando procedimientos decalentamiento.


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9. Visual i zacin del Gel: Colocar el gel sobre un fondo de luz blancavisible o amari l la. Para regist ros permanentes, revelar en papel deimpresin fotogrfico.


1. Porqu la electroforesi s se realiza en concentraciones baj as de sales?

2. El oxgeno es un impulsor de la polimer izacin, pero por encima deciertos niveles se convierte en un inhibidor de la misma. Questrategias pueden emplearse para evitar este tipo de problemas?

3. Qu diferencias funcionales exi sten entr e los pr incipios deelectroforesis verticales y hor izontales de cidos nucleicos?

4. Porqu la movil idad electrofortica de los cidos nucleicos no esalterada por el pH (como s ocurre con las proteinas)?


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Practica N 3

Clonamiento Molecular

Exper imento I

Objetivo. - Digerir el ADN empleando enzimas de restr iccin.

Fundamento.- Reaccin de digestin con endonucleasas de restr iccinestndar, segun la gua de protocolos de la fi rma Promega Corp. (Madison,EE.UU.).


Buffer de Digestin E 10X, Albmina de Suero Bovino Aceti lada 10 g/L,Enzima de Restr iccin Bam HI 10 U/L (Promega); Agua deionizada (Sigma);ADN para digerir .

Procedimiento. -

1. Determinar la concentr acin del ADN a cortar con la enzi ma derestr iccin, por su absorvancia a 260 nm (espectro ultravioleta)usando el cociente de conversin. Alternativamente, puedeest imarse la concentracin por comparacin con estndares decantidad de ADN sobre un gel de agarosa.

2. Sedimentar brevemente por centr ifugacin los tubos con el ADN acortar , el buffer de digest in E, el Ac-BSA, y la enzi maBam HI, paracolectar sus contenidos al fondo de los tubos.

3. Disponer de una reaccin y seguir las indicaciones que se describen a

continuacin:

Component e Cant idad

Agua Deionizada 17.3 X LRE 10X Buffer E 2 LAc-BSA 10 g/L 0.2 LADN a digerir X L

Mezclar por pipeteoBamHI 10 U/L 0.5 L

Incubar a 37 Cpor 2 4 horas

4. Llevar 5 L de la reaccin de digestin a una electroforesi s en gel deagarosa al 0.8 1% para verificar la accin de la enzima. Elfragmento l iberado o l ineal izado podr recuperarse desde el gel parasu posterior subclonamiento.


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Experimento II

Objetivo. - Clonar ADN en un vector plasmdico

Fundamento.- Mtodo descrito por Mezei y Storts (1994). Patentecomercial izada por la fi rma Promega Corp. (Madison, EE.UU.)


T 4 DNA Ligasa 3 U/L, Buffer de T 4 DNA Ligasa 10X, Vector Plasmdico pGEM-T(Promega); Agua Deionizada 18 Mohm (Sigma); Producto de Ampl i ficacin porPCR.

Procedimiento. -

1. Determinar la concentr acin del producto de PCR (ampl ificado) porsu absorvancia a 260 nm (espectro ultravioleta) usando el cocientede conversin. Alternativamente, puede estimarse la concentracinpor comparacin con estndares de cantidad de ADN sobre un gel deagarosa.

2. Optimizar la relacin inserto : vector segn la ecuacin de relacin.3. Sedimentar brevemente por centr ifugacin los tubos con el vector

pGEM-T , el ADN control de insercin, el ADN amplificado, y el vectorsin cortar, para colectar sus contenidos al fondo de los tubos.

4. Disponer de un juego de reacciones, como se describe acontinuacin:

Componente Reaccin Estndar Control Posi tivo Contr ol de FondoAgua Deioni zada 7 X 5 7Buffer 10X 1 1 1Vector pGEM-T 50 ng 1 1 1Producto de PCR X - -ADN Control Inserto - 2 -T 4 DNA Ligasa 1 1 1Volumen Fi nal 10 L 10 L 10 L

5. Mezclar las tres reacciones por pipeteo. Incubar por una noche a4C. Esta reaccin de ligacin deber ser uti l izada inmediatamenteen una transformacin de clulas competentes para facil i tar supropagacin. El ampl ificado podr ser subclonado a otro vectorplasmdico para su posterior estudio, previa digestin con enzimas derestriccin (Mezei y Storts, 1994).

Experimento III

Objetivo. - Preparar y transformar clulas competentes

Fundamento.-Mtodo descrito en Sambrook et al . , (1989) basado en Mandely Higa (1970).



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E.col i cepa DH5, medio de cultivo Luria Bertani (LB) caldo, LB agar,Ampici l ina 100 ug/mL, CaCl2 100 mM, ADN plasmdico.

Procedimiento. -

Pr eparacin de Clulas Competentes:

1. Inocular 10 mL de medio LB caldo con una sola colonia de E.col icepa DH5, e incubar toda la noche a 37 grados

2. Inocular 10 mL de LB caldo con 400 uL del crecimiento nocturno, eincubar hasta que la densi dad ptica alcance 0.5

3. Colectar las clulas por centr ifugacin y trasvasar las a un tubonuevo. Resuspender las clulas en 1 mL CaCl2 100 mM en hielodurante 5 minutos; colectar nuevamente las clulas porcentr ifugacin, y resuspender en 200 uL de CaCl2 100 mM eincubar en congelacin por una hora.

T ransformacin con ADN Plasmdico:

4. T omar 50 uL de clulas competentes y agregarles 1-20 ug de ADNplasmdico (pADN) e incubar por congelacin por una hora.

5. Heat Shock: Colocar las clulas en bao mara a 42 grados por 2minutos; luego enfr iar el tubo en hielo por 5 minutos.

6. Opcional. T iempo de Expresi n: Agregar 1 mL de medio LB,resuspender las clulas e incubar a 37 grados por 1 hora. Mej orala ef iciencia uti l i zando medio SOC.

7. Concentrar las clulas por centr i fugacin; sembrar todo o

diluciones, en placas con medio LB agar que contienen ampici l inahasta una concentracin de 100 ug/mL; incubar a 37 gradosovernight.

Experimento IV

Objetivo. - Real izar el seguimiento de un cln recombinante

Fundamento.-Mtodo descri to por Dale y Greenaway (1984).


Mondadientes estr i les al autoclave; buffer de corr ida de electroforesis T AE1X; buffer de l sis (SDS 5%, Azul de Bromofenol 0.05%, Gl icerol 50%, en bufferde corr ida); agarosa; bromuro de etidio.

Procedimiento. -


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1. Preparar una solucin de agarosa al 1% en buffer de corr ida deelectroforesi s T AE 1X, calentar y dist r ibuir como un gel hor izontal .

2. Ut i l izando un extremo romo de un mondadientes estri l , coger unacolonia bacteriana y resuspenderla en 100 uL de buffer de corr ida deelectroforesis T AE 1X mediante rotacin.

3. Agregar 25 uL de buffer de l si s y calentar l os tubos a 65C en baomara durante 30 minutos. Agitar cada tubo por 20 segundos en unvortex, y regresar lo al bao mara hasta que est listo el gel deelectroforesis.

4. Cargar 15 uL de cada muestra mientr as se encuentre cal iente encada pozo del gel de agarosa al 1%. Correr el gel hasta que el azul debromofenol alcance el tercio inferior. Desempacar el sistemaelectrofortico y teir con bromuro de etidio, y visual izar las bandasen un transi luminador.


1. Con qu propsito se emplea la albmina durante el experimento dedigestin con enzimas de restr iccin?

2. Qu propiedad se aprovecha para l igar directamente fragmentos dePCR con el vector pGEM-T ?

3. Qu cambios subcelulares se esperan durante la etapa del heat shocken la transformacin con clulas competentes?

4. Mencione la importancia de apl icar el seguimiento sobre muestrascl nicas de impacto en sald pbl ica.


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Practica N 4

Amplif icaciones

Exper imento I

Objetivo. - Clonar cidos nucleicos in vitro mediante PCR.

Fundamento.- Mtodo ideado por Mul l is et al .(1987). El protocolo descr itoest basado en el artculo or iginal (Saiki et al . , 1988). Reaccin de digestincon endonucleasas de restr iccin estndar, segun la gua de protocolos de lafirma Promega Corp. (Madison, EE.UU. ).


Soluciones: PCR Buffer 10X (Perkin Elmer), MgCl2 25mM (Perkin Elmer), dNT Ps2.5 mM (Perkin Elmer), Primer Forward INT GF 10 M (Life Technologies),Primer Reverse INT ER 10 M (Life T echnologies), DNA 25 ng/L (NewEngland Biolabs), Ampl iT aq DNA Pol imerasa 5 U/L (Perkin Elmer).

Procedimiento. -

1. A un tubo nuevo de microcentr fuga de 0.2 mL agregar:

Reactivo Volumen (L)Agua 18 MOhm 33.5PCR Buffer 10X 5.0MgCl 2 25mM 3.0DNT P mix 2.5 mM 4.0

Pri mer INTGF 10 M 1.0Pri mer INT ER 10 M 1.0

Mezclar y centr ifugar

DNA molde 25 ng/L 2.0

T aq DNA Polymerase 5 U/L 0.5

Volumen Final 50L

2. Cubri r con aceite mineral si el termociclador lo requiere.

Concentr aciones Finales.T r is-HCl, 20 mM pH 8.4 (a 22C)

KCl, 50 mMMgCl 2, 1.5 mMPr imers, 200 mM cada uno.dNT Ps, 200 M de cada uno.Ampl iT aq DNA Polymerase, 2.5U

3. Real izar el siguiente ciclaj e:


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Denaturacin Inicial 94C 5

Denaturacin 94C 45

Hibr idacin 40C 30

Extensin 72C 2

Extensin Final 72C 10

4. Analizar 10 L de la reaccin mediante una electroforesi s en gel deagarosa al 2%, o almacenar la reaccin a -20Chasta su uso.

Experimento II

Objetivo. - Secuenciar cidos nucleicos mediante el mtodo de terminacin decadena por didesoxi nucletidos.

Fundamento.-Mtodo ideado por Sanger (1977). El protocolo corresponde aldel ki t Si lver Sequence - DNA Sequencing System (Promega, Madison). Mtodoideado por Mull is et al .(1987).


Soluciones: PCR Buffer 10X (Perkin Elmer), MgCl2 25mM (Perkin Elmer), dNT Ps2.5 mM (Perkin Elmer), Primer Forward INT GF 10 M (Life Technologies),Primer Reverse INT ER 10 M (Life T echnologies), DNA 25 ng/L (NewEngland Biolabs), Ampl iT aq DNA Pol imerasa 5 U/L (Perkin Elmer).

Procedimiento. -

1. Para cada j uego de reacciones de secuenciamiento, etiquetar cuatrotubos de microcentrfuga (G, A, T , C). Agregar 2 L del d/ddNT P mix a

cada tubo. Agregar una gota (unos 20 L) de aceite mineral a cadatubo. T apar los tubos y almacenar en hielo hasta que se uti l izen.

2. Para cada j uego de cuatro reacciones de secuenciamiento, mezclar lossiguientes reactivos en un tubo de microcentr fuga:

Reactivo Volumen (L)

pGEM-3Zf(+) ADN molde, 4 g. 4.0

Buffer de Secuenciamiento 5X 5.0pUC/M13 Forward Primer (4.5 pmol) 3.6

Agua Libre de Nucleasas hasta: 16. 0 L

3. Agregar 1.0 L de T aqDNA Pol imerasa grado secuenciamiento (5 U/L)al mix primer/molde. Mezclar brevemente por micropipeteo.

4. Agregar 4 L del mix enzima/primer/molde a las paredes de cada tuboque contiene el mix d/ddNTP, y mezclar brevemente. Centr ifugar enuna microcentr fuga.


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5. Colocar los tubos de reaccin en un termociclador que ha sidoprecalentado a 95C, y uti l i zando el perfi l siguiente, comenzar elprograma de ciclaj e.

Denaturacin Inicial 95C 2

Denaturacin 95C 30

Hibr idacin 42C 30

Extensin 70C 1

45 - 60 ciclos, luego 4C

6. Despus de completado el termociclaj e, agregar 3 L de solucion stopde secuenciamiento a la pared de cada tubo. Centr ifugar brevementeen una microcentr fuga para detener las reacciones.

7. Calentar las r eacciones a 70C por 2 minutos i nmediatamente antes decargar 3.0-3.5 L de cada reaccin a un gel de poliacr i lamida al 4-6%(19:1 acri lamida : bisacr i lamida) con Urea 7M en buffer T BE, conespaciadores de 0.4 mm.


1. Porqu se necesi ta emplear una pol imerasa termoestable durante elclonamiento in vit ro?

2. Proponga un mtodo que permita ampl ificar cadenas de aminocidoscon las mismas ventaj as que el PCR t iene para los cidos nucleicos

3. Qu ventaj as presenta el mtodo de Sanger (enzimtico), sobre el deMaxam Gilbert (de degradacin de la cadena)?

4. Qu condiciones del mtodo de terminacin de cadena hacen posiblesu automatizacin?


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transferencia y colocar el gel una vez que se haya cumplido con laneutr al izacin.

7. T ransferencia: Llevar a cabo la transferencia en un perodo de 2 a 24horas dependiendo de la concentracin del gel y del tamao de losfragmentos de DNA que se van a transferi r . Al final de latransferencia separar a la membrana del gel y enj uagarlabrevemente en la solucin SSC 2X.

8. Fi j acin Covalente: Colocar la membrana con la cara de unin al DNAhacia abaj o sobre un papel Whatman 3MM saturado con 400 mM deNaOH por 10 minutos. Lavar en SSC 2X y secar al aire. La membranasecada de esta manera es estable a temperatura ambiente por 2das; para real izar inmediatamente la hibr idacin, se debe secar alvaco a 80 grados por 30 minutos. La membrana seca se almacenaentre dos lminas de papel Whatman en una bolsa plastica atemperatura ambiente.


1. Cules son las pr incipales diferencias entr e el Southern, Northern y

Western blot?2. Qu ventaj as y desventaj as se presentan al emplear nitrocelulosa o

nylon como membrana soporte para la transferencia?3. Existen actualmente tecnologas que permiten el seguimiento de

mil es de transcritos de manera cual i- y cuantitativa automatizada.Mencione al menos tres de estas nuevas tecnologas (3) con surespectivo pr incipio.


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Apndice No.1: Relaciones de Uso Frecuente en Biologa Molecular.

Conversiones Comunes:

1 g = 1 x 10-6 gr 1 Unidad A260 DNA doble cadena = 50 g/mL1 ng = 1 x 10-9 gr 1 Unidad A260 DNA cadena simple = 33 g/mL1 pg = 1 x 10-12 gr 1 Unidad A260 RNA cadena simple = 40 g/mL

1 g de 1,000 pb DNA = 1. 52 pmol 1 g de DNA pBR322 = 0.36 pmol

1 Kb DNA = 333 aminocidos de = 3.7 x 104 MWcapacidad codificante

Igualdades en Bases Nitrogenadas:

A + G = C+ T (DNA de cadena doble)

T m = 4 (G+C) + 2 (A+T) T h = T m - 5 (*) valores aproxi mados

( )

)675()(%419.59

)(33.0)(67.02

1

%

ntsGCTm

nts

DHVBRKYMXNSCG

GC

+=

++++++++++++

=

(*) valores reales

Concentracin del ADN de Doble Cadena:

[ ]20

1260mL

mgOD

DNA

= 1 Unidad OD260 = 50 g/mL

Relacin Inserto Vector:

)ng()Kb(

)Kb()ng(insertoolarrelacin_m

vector

insertovector=

Bi blioteca Genmica:

C: capacidad del vectorg : tamao del genomap : probabil idadN : nmero de clones requerido

Eficiencia de T ransformacin:

g)(

_

plsmido

coloniasnmeroET =

( )

=

g

c

pN

1ln

1ln


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Apndice No.2: Composicin de Buffers y Soluciones Stock.

T r is-HCl 1M.Disolver 121.1 gramos de T ri s base en 800 mL de agua desti lada. Aj ustar el pHal valor deseado aadiendo las siguientes cantidades de HCl concentrado:

pH HCl (mL)7.4 707.6 608.0 42

Llevar a un l itro, dist r ibuir en al cuotas y ester i l izar en el autoclave.

EDT A 0.5M, pH 8.0Aadir 186. 1 gramos de acido etilen-diamino-tetr a-acti co disdicodihidratado (EDT A) a 700 mL de agua dest i lada. Agitar vigorosamente con unagitador magntico. Aj ustar el pH a 8.0 con NaOH 10N, aproximadamente 50mL. Enrazar a un litro con agua desti lada. Dist r ibuir en al cuotas y autoclavar.

Buffer T E.

T r is-HCl 10 mM pH 8.0EDTA 1 mM

Buffer de T ransformacinCaCl2 50 mM

MOPS 100 mM, pH 6. 5RbCl10 mM

SDS 20%Disolver 20 gramos de SDS en 80 mL de agua desti lada, calentar a 68 C paradisolver. Aj ustar el pH a 7.2 aadiendo gotas de NaOH 10N. Enrazar a unvolumen de 100 mL.

NaCl 5MDisolver 292. 2 gr. de NaCl en 800 mL de agua desti lada. Aj ustar el volumen aun li tro con agua dest i lada. Dist r ibuir en al cuotas y ester i l izar en elautoclave.

Acetato de Sodio 3MDisolver 408.1 gramos de acetato de sodio tr ihidratado en 800 mL de aguadesti lada. Aj ustar el pH a 5.2 con cido actico glacial . Aj ustar el volumen aun litro con agua dest i lada. Dispensar en al cuotas y ester i l izar en elautoclave.

Acetato de Potasio 5MDisolver 49. 1 gramos de acetato de potasio en 50 mL de agua dest i lada,aj ustar el pH a 7.5 con cido acti co glacial 3M. Llevar a 100 mL. Dispensar enal cuotas y esteri l izar en el autoclave.

Glucosa 0.5MDisolver 9.01 gramos de glucosa en agua desti lada y l levar a 100 mL. Dispensaren al cuotas y ester i l izar en el autoclave.


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Bromuro de Etidio.Aadir 100 mg. de bromuro de etidio en 10 mL de agua dest i lada. Disolveruti l izando un agitador magntico, por var ias horas hasta asegurarse totaldisolucin. Envolver el recipiente en papel de aluminio, o transfer ir lasolucin a una botella oscura, y almacenar a temperatura ambiente.

T AE 10XPara 500 mL, pesar 24.2 gramos de T r i s base; adicionar 5.71 mL de cidoactico glacial para aj ustar el pH a 7.4, mas 10 mL de EDT A 0.5M, disolver loshasta 500 mL con agua desti lada. Dispensar en al cuotas y esteri l izar en elautoclave.

Buffer de Muestra 10XFicol l 400 20% (en su lugar se puede uti l izar sucrosa); SDS 1%; Xylene Cyanol0.25%; EDTA disdico pH 8.0 100 mM; Azul de Bromofenol 0.25%.

Stock de Ampicilina 50 mg/mLDisolver 500 mg de Ampici l ina en 5 mL de etanol absoluto y 5 mL de aguadesti lada. Conservar a -20C.

Stock de IPT G 100 mMDisolver 1.2 gramos de isopropil - t iogalactsido (IPT G) en 40 mL de aguadesti lada, luego enrazar hasta 50 mL con agua desti lada. Fi l trar y almacenar a4C.

St ock de X-Gal 50 mg/mLPesar 100 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indol i l -beta-D-galactosido (X-Gal) ydisolver los en 2 mL de N,N -dimeti l formamida. Cubrir con papel de aluminio yalmacenar a -20C.

Medio de Cult ivo Lur ia Bertani.

Para un l itro de caldo, disolver 10 gramos de bactopeptona (o bactotr iptona),5 gramos de extracto de levadura y 5 gramos de NaCl. Aj ustar el pH a 7.5 conNaOH 1N, y esteri l i zar en el autoclave. Cuando sea necesar io agregarampici l ina hasta 100 ug/mL, despues de autoclavar. Para placas LB-Amp,agregar 15 gramos de agar granulado, autoclavar; dejar enfr iar el medio hasta55C, y agregar ampici l ina (hasta 100 ug/mL). Verter 30 mL en placas petr i de85 mm. Si es necesario, flamear la superficie del medio con un mechero paraeliminar burbujas. Dejar endurecer el agar. Almacenar a temperaturaambiente por una semana o a 4C por un mes. Para placas L B-Amp/IPT G/X-Gal, agregar IPT G hasta 500 mM y X-Gal 80 ug/mL, y verter a las placas.

SSC 20XPara un litro, pesar y disolver 175 gramos de NaCl y 88.2 gramos de citratotr isdico en 800 mL de agua dest i lada. Una vez disuelto l levar a un litro yesterilizar.


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Apndice No.3: Gua de Problemas.

1. Qu condiciones de termociclaj e apl icar a para ampl ificar un fragmento X,uti l izando como pr imer s los siguientes ol igonucletidos: Upstream 5 AGGT T C GT T CGG GC 3 ; Downstream 5 GT C GT A T AT T AT ATT 3 ; si elamplificado esperado es de 1.5 Kb?

2. Qu cantidad de un inserto (en ng) de 1.7 Kb de longitud, se necesitarn

para clonar con 50 ng del vector pUC19, si se quiere una relacin inserto -vector de 1:3 [Dato: tamao de pUC19 = 2.8 Kb]

3. Cul es el T m del siguiente ol igonucletido: 5 AGG T T C GAT CGA T CG G3 , en condiciones de PCR (NaCl 50 mM)?

4. Una molcula de ADN es cortada con una enzi ma de restr iccin, y luego

anal izada mediante una electroforesi s en gel de agarosa. Una sla bandaes vista tras l a tincin del gel. Expli que.

5. Se quiere construir una bibl ioteca genmica del chimpanc (6 x 109 pb por

clula dipl iode). Calcular cuantos clones se necesitarn, si se quiere que el99. 5% de los genes del mono estn en la bibl ioteca, si el tamao promediode fragmentos a clonar es 2 x 104 pb; adems decidir que tipo de vectorser a el ms apropiado para estos fines.

6. Cul de los si guientes ol igonucletidos es el si tio de la enzi ma derestriccin IbaVI?

(a) 5 AAT T T C3 (b) 5 GAT CCG 3(c) 5 AGT ACT 3 (d) 5 AAT AT C3(e) 5 GGACT A 3

7. En un experimento se contaron 4500 colonias t ransformantes en una placacon medio selectivo, cuando se sembr una di lucin 1/100 de clulastratadas con 3 ul de una muestra de cccDNA, de concentracin 200 ng/ul .Determinar el mtodo de transformacin uti l izado, y la eficiencia detransformacin obtenida.

8. La absorvancia de una muestra de cidos nucleicos a 260 nm es 0.48.Calcular su concentracin en ng/ul, si para cuantificar se di luy 1/100;determinar adems si dicha muestra podr a ser uti l izada para una digestincon enzi mas de restr iccin, si la OD280=0.36.

9. Calcular el tamao de un fragmento de ADN que migr 5.4 cms, si losfragmentos del estndar (lambda DNA/Hind III) migraron 1.9, 4.0, 4.8, 5.7,7.2, 7.5, y 10.5 cms en una electroforesi s en gel de agarosa al 1%.

10. Qu cantidad de ADN mitocondr ial (en ug) se podran aislar de cienl infocitos humanos?

11. Calcular la concentracin del ol igonucletido 5 GT C GT A T AT T AT AT T 3 ;

en mol/mL, cuyo OD260=0.42, uti l izando una cubeta de cuarzo de 1 cm de


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grosor [Coeficientes de Extincin (ml/mol): A=15.4; G=11.7; C=7.3;T =8.8]

12. Determinar la cantidad de un producto de PCR de 200 bp, obtenido tras 25ciclos de ampli ficacin a partir de 1 g de ADN humano.

13. Cuntas unidades de la enzima Eco RI se necesi tarn para digeri r 4 g delplsmido pBluescr iptIISK(+), si dicho vector tiene un solo sitio para la

enzi ma? [Datos: tamao del vector=2.9 Kb; factor de digestin delvector=2.5; sitios Eco RI en DNA=5; tamao de DNA=48 Kb]

14. Qu cantidad de ADN genmico se podr an aislar de 24 parsitos deLeishmania mexicana(8 x 107 pb por genoma diploide)?

15. Con la fi nal idad de const ruir una bibl ioteca genmica del gal l ito de las

rocas (1 x 108 pb por clula diploide), se llevan a cabo digest iones con laenzi ma de rest r iccin Not I (5 GCGGCCGC 3 ). Determinar: T amao y nmero de los fragmentos obtenidos; T ipo de vector de clonamiento ms apropiado; y El nmero de clones mnimo necesar io, con 95% de xito.

16. Una muestra de ADN tiene 23% de adenosina. Calcular su T m si su longitudaproximada es de 100 nucletidos.

17. La densidad ptica a =260 nm de una muestra de cidos nucleicos es deOD260=0.56; descr iba el tipo de cido nucleico analizado, si laconcentracin aproximada obtenida por electroforesi s es de 19. 8 g/mL.

18. Calcular la cantidad de una muestra de ADN (en gramos) de 1 Kb, obtenidatras 30 ciclos de ampl ificacin por PCR, si se parti de una sla molculacomo molde [Dato: 1 Kb 3.7 x 104 Da]


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Bibliografa

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