homepage.ufp.pthomepage.ufp.pt/calmeida/HE_ficheiros/protocolos HE_CVA10... · Web viewContagem manual de leucócitos com câmara de Neubauer e automática com autoanalisador. 1

Faculdade de Ciências da SaúdeUniversidade Fernando Pessoa

Trabalhos práticos deHematologia

Ciências Farmacêuticas

Prof. Doutora Cristina Vieira Almeida

UFP – Porto

Índice:

Indicações gerais………………………………………………………………..….. Pág. 3

Assiduidade mínima obrigatória …………………………………………………... Pág. 4

Avaliação da componente prática (laboratorial) ………………………………….. Pág. 5

Outras indicações – relatórios/fichas ……………………………………………… Pág. 5

Regras para a elaboração de relatórios………………………………………....….. Pág. 6

Planeamento das aulas de laboratório……………………………………...…..….. Pág. 9

Protocolos para as aulas práticas…………………………………………..…..….. Pág. 10

Trabalho nº 1: Contagem manual de eritrócitos com câmara de Neubauer

e automática com autoanalisador.……………………….....… Pág. 11

Trabalho nº 2: Contagem manual de leucócitos com câmara de Neubauer

e automática com autoanalisador ............................................ Pág. 15

Trabalho nº 3: Contagem manual de plaquetas com câmara de Neubauer

e automática com autoanalisador ……………………………. Pág. 18

Trabalho nº 4: Determinação do hematócrito: Micro-técnica

Doseamento da hemoglobina: Método colorimétrico

Determinação dos índices globulares ou índices

hematimétricos (VGM, HGM e CHGM) .........................Pág. 21

Trabalho nº 5: Determinação da velocidade de sedimentação: técnica de

Westergreen

Execução de um esfregaço sanguíneo e sua coloração (Wright):

estudo morfológico dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas…… Pág. 25

Trabalho nº 6: Determinação manual da fórmula leucocitária a partir de

um esfregaço sanguíneo e automática com autoanalisador ……Pág. 29

Trabalho nº 7: Coloração de um esfregaço para contagem de reticulócitos … Pág. 31

Trabalho nº 8: Electroforese de hemoglobinas …………………………...… ……..Pág. 33

Trabalho nº 9: Determinação do grupo sanguíneo (sistema ABO) e do

factor Rh Prova de Coombs directa e indirecta………..............Pág. 34

Apêndices: Fichas para registo de resultados, observações e cálculos …………… Pág. 39

Cristina Vieira Almeida, FCS/UFP HE, Pág. 2

Indicações gerais:

O trabalho laboratorial exige por parte do aluno uma atitude especial, uma vez que

deverá obter o máximo rendimento de aprendizagem e assimilação dos diferentes

procedimentos e operações que são executados no laboratório.

Para que os objectivos do trabalho sejam atingidos e a segurança no laboratório

mantida, as instruções quanto à execução do protocolo experimental devem ser estudadas

previamente e entendidas por forma a planear o tempo de um determinado trabalho e

saber actuar de imediato caso seja confrontado com alguma contrariedade. Deve-se

trabalhar sem pressas, com método e cuidado para evitar tanto acidentes como danificar o

material de laboratório, que é geralmente bastante caro.

Relembram-se, a seguir, alguns dos cuidados a ter no laboratório:

1. É absolutamente proíbido fumar no laboratório nem qualquer zona do edifício.

2. É absolutamente proíbido comer ou beber dentro do laboratório.

3. É OBRIGATÓRIO USAR BATA BRANCA. A BATA É UM EQUIPAMENTO DE

PROTECÇÃO PESSOAL E DEVERÁ TER O TAMANHO ADEQUADO PARA

PROTEGER O INDIVÍDUO E AS ROUPAS EM CASO DE SALPICOS OU DERRAMES.

4. É proíbido correr, gritar ou comportar-se de outros modos incorrectos.

5. Nunca efectuar pipetagens com a boca, mesmo que seja de água! Usar sempre um

pipetador manual ou pompette.

6. Ter conhecimento prévio da toxicidade, poder corrosivo e inflamabilidade dos reagentes

com que vai trabalhar (em caso de dúvida, perguntar!).

7. Não abrir recipientes de reagentes para cheirar ou espreitar.

8. Limpar imediatamente reagentes que tenham sido derramados.

9. Não verter restos de soluções nas pias, sem perguntar antes ao Professor. Quaisquer

reagentes que tenham de ser vertidos nas pias estão restringidos a soluções muito

diluídas e, quando os verter, ponha a água a correr.

10. Não deitar pontas de pipetas ou outros objectos sólidos na canalização.

11. USO OBRIGATÓRIO DE LUVAS sempre que trabalhar com amostras biológicas. No final

de cada aula prática, as mesmas deverão ser colocadas nos CONTENTORES

ADEQUADOS PARA A REJEIÇÃO DE MATERIAL CONTAMINADO, NÃO CORTANTE.

12. Todo o MATERIAL CORTANTE CONTAMINADO (ex.: material de colheita de sangue,...)

com produtos biológicos deverá ser colocado nos RESPECTIVOS CONTENTORES.

13. O MATERIAL NÃO CONTAMINADO deverá ser colocado no LIXO “NORMAL” e não nos

contentores especiais referidos em 11 e 12.


14. No final da execução do trabalho, não abandonar o laboratório sem antes deixar limpo o

local de trabalho.

15. Antes de sair do laboratório lavar bem as mãos.

Os elementos de cada grupo devem ter consciência do número do seu grupo e de qual o

trabalho que vão executar em cada aula.

Por forma a assegurar a segurança no laboratório, todas as regras de segurança devem ser

rigorosamente cumpridas, devendo o aluno abordar sempre o professor caso haja alguma dúvida

quanto à manipulação de qualquer material e/ou reagente.

Organização das aulas laboratoriais:

As aulas laboratoriais de Hematologia exigirão por parte dos alunos a leitura e preparação

prévia do trabalho que irão executar na aula e, inclusivé, a esquematização de todos os passos

importantes do trabalho em questão, para depois o discutirem no início da aula com o professor.

Nota importante: Cada grupo só deve iniciar o seu trabalho após discussão com o professor sobre

o mesmo.

Assiduidade mínima obrigatória:

Na Faculdade de Ciências da Saúde desta Universidade, os alunos são obrigados a

frequentar 80% das aulas laboratoriais (componente prática), ou seja, comparecer a 12 aulas

completas, num total de 15 aulas previstas para cada aluno (duas aulas iniciais de apresentação e

explicação dos trabalhos práticos, nove aulas laboratoriais, uma aula de reposição, uma aula de

discussão dos relatórios e uma aula de realização de teste prático). O aluno que não complete a

frequência mínima obrigatória na componente prática (laboratorial) é considerado reprovado à

disciplina, não podendo sequer realizar o exame de recurso no final do semestre nem aceder à

época especial de trabalhador-estudante ou finalista. Automaticamente terá que se inscrever à

disciplina no ano seguinte.

Deverá haver um cumprimento escrupuloso do horário das aulas laboratoriais por parte dos

alunos. O não cumprimento será contabilizado na avaliação, podendo até resultar na marcação de

uma falta à aula, sendo igual procedimento aplicado à falta de bata branca.


Avaliação da componente prática (laboratorial):

A avaliação desta componente, feita de modo contínuo durante as aulas, contabilizará os

seguintes elementos de avaliação: [i] Classificação obtida nos dois relatórios completos elaborados

sobre dois dos trabalhos; [ii] Prova final de avaliação (prática) com execução laboratorial de um

trabalho, no sentido de avaliar se as estas aulas atingiram o objectivo formativo previsto: fornecer

competências práticas aos alunos; [iii] No final de cada protocolo o docente responsável entregará

aos alunos uma ficha de preenchimento, sendo devolvida ao docente. Essa ficha abordará o

trabalho executado, devendo ser discutidos os resultados e redigidas as respectivas conclusões,

entre outros factores. O objectivo é reforçar a necessidade dos alunos dominarem os

procedimentos laboratoriais, sob pena de a aula laboratorial ser apenas uma “passagem do tempo”,

para alguns alunos; [iv] A assiduidade e desempenho técnico do aluno, na participação activa no

trabalho experimental e no interesse global demonstrado.

Não há recurso ou época especial para esta componente prática. A classificação obtida na

componente prática será válida para as restantes épocas de avaliação desse ano lectivo.

A fórmula de cálculo da classificação prática laboratorial será a seguinte:

35% (prova de avaliação) + 45 % (média das fichas)+ 20% (média dos relatórios)

Ao aluno só será contabilizada a classificação obtida na componente teórica da disciplina, se

o aluno tiver obtido uma classificação na componente prática igual ou superior a 10 valores.

Se o aluno tiver aprovação na componente prática (laboratorial) e, contudo, reprovar na

avaliação da componente teórica (na avaliação contínua, recurso e época especial), no ano

seguinte só repete a componente teórica da disciplina. A nota obtida na componente prática não é

susceptível de ser melhorada e mantém-se válida durante dois anos lectivos, após o aluno ter

frequentado a disciplina.

Outras indicações – relatórios/fichas:

Muito importante: Após a realização de dois dos trabalhos laboratoriais seleccionados

pelo Professor, o grupo deverá realizar um relatório original completo de cada, que deverá ser

entregue no prazo máximo de 07 dias após a finalização do trabalho. Todos os elementos do grupo

devem participar activamente na elaboração dos relatórios. Os relatórios contendo partes copiadas

de outros relatórios serão fortemente penalizados e os relatórios integralmente copiados não serão

corrigidos nem considerados para avaliação. Para os restantes trabalhos, os alunos deverão

apresentar os resultados experimentais e respectiva apreciação, no final de cada aula laboratorial,

numa ficha de resultados, cedida pela Docente, assinada por todos os elementos do grupo que

estiveram presentes na aula.


Todos os relatórios e todas as fichas de resultados são considerados no cálculo da nota da

componente laboratorial de cada aluno.

Cada relatório ou ficha não entregue é contabilizada como zero no cálculo da nota

laboratorial e os atrasos de entrega de relatórios superiores a uma semana são penalizados em

25% da classificação (o que é equivalente a restringir a escala de classificação de zero a quinze

valores).

Regras para a elaboração de relatórios

Os alunos devem apresentar no prazo máximo de 07 dias após a finalização dos respectivos

trabalhos dois relatórios completos dos trabalhos seleccionados pelo Professor.

Para os restantes trabalhos, devem apenas entregar os resultados experimentais e a

respectiva apreciação no final de cada aula em folha manuscrita e assinada por todos os elementos

do grupo presentes nessa aula.

Os relatórios completos serão elaborados em computador, deverão ser sintéticos, bem

estruturados, e a linguagem utilizada deverá ser simples e directa. Assim, as secções que

compõem um relatório completo são as seguintes:

Página de títuloO título do trabalho deve ser curto e informativo. Nesta página deve incluir-se o nome

dos alunos (e respectivas assinaturas!) e as datas de execução dos trabalhos e de

entrega do relatório.

Introdução e/ou Princípio do TesteNa introdução devem ser mencionados a importância do trabalho e o seu objectivo. O

texto deve ser relativamente curto (uma página, no máximo). A introdução deve ser

informativa na sua globalidade.

Descrever de uma forma objectiva, sempre que necessário, o princípio do teste.

Materiais e MétodosEsta é uma das secções mais importantes num relatório científico, pois a descrição do

método experimental permite a outras pessoas reproduzir a experiência efectuada.

Contudo, em relatórios de aulas, em que o destinatário final (e por vezes o único) é o

professor (que elaborou ele próprio o protocolo), a transcrição do protocolo

experimental é um desperdício de tempo, por isso, devem faze-lo de uma forma

resumida. Preferencialmente, a metodologia experimental seguida deverá ser

apresentada de forma esquemática (diagrama de sequências).

Resultados experimentaisEsta secção é bastante valorizada na avaliação do relatório e deve incluir todos os

resultados obtidos, os quais poderão ser apresentados, sob a forma de tabela, e os

cálculos a efectuar de forma a obter os valores finais, se assim for necessário.


Discussão dos resultados e ConclusõesTal como as restantes partes do relatório, esta secção deve ser escrita com clareza e

objectividade, de tal forma que o leitor possa distinguir entre as conclusões do trabalho

e as apreciações críticas resultantes da comparação dos dados experimentais com os

resultados teoricamente previsíveis. Esta é a secção mais importante do relatório. A

discussão deverá também incluir as conclusões do trabalho experimental e descrever

a ocorrência, se for o caso, de determinados erros ou desvios que possam ter afectado

os resultados obtidos.

BibliografiaConsiste na listagem, exaustiva e por ordem alfabética de autores ou pela ordem de

citação no texto, de artigos e livros consultados para a realização do trabalho.

ApêndicesEm apêndice deve ser incluída toda a informação não directamente relevante para a

leitura e compreensão do relatório, nomeadamente cálculos pormenorizados,

informações sobre reagentes, rectas de calibração, etc.


Trabalhos práticos a executar:

Trabalho n.º 1Contagem manual de eritrócitos com câmara de Neubauer e automática com autoanalisador

Trabalho n.º 2Contagem manual de leucócitos com câmara de Neubauer e automática com autoanalisador

Trabalho n.º 3Contagem manual de plaquetas com câmara de Neubauer e automática com autoanalisador

Trabalho n.º 4Determinação do hematócrito: Micro-técnica

Doseamento da hemoglobina: Método colorimétrico

Determinação dos índices globulares ou índices hematimétricos (VGM, HGM e CHGM)

Trabalho n.º 5Determinação da velocidade de sedimentação: técnica de Westergreen

Execução de um esfregaço sanguíneo e sua coloração (Wright): estudo morfológico

dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas

Trabalho n.º 6Determinação manual da fórmula leucocitária a partir de um esfregaço sanguíneo e automática com

autoanalisador

Trabalho n.º 7Coloração de um esfregaço para contagem de reticulócitos

Trabalho n.º 8Electroforese de hemoglobinas

Trabalho n.º 9Determinação do grupo sanguíneo (sistema ABO) e do factor Rh

Prova de Coombs directa e indirecta


Planeamento das aulas laboratoriais:

Semanade

aulaslaborat.

Trabalho laboratorial

#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #91ª Apresentação do programa e dos objectivos da componente laboratorial da disciplina de

HEClin. Definição dos critérios de avaliação. Organização dos grupos de trabalho. Indicações sobre a elaboração de relatórios e sobre as folhas de registo de resultados experimentais.

2ª X3ª X4ª X5ª X6ª X7ª X8ª X9ª X

10ª X11ª Semana para reposição de aulas laboratoriais: esta aula está exclusivamente destinadas

aos alunos que ficaram impossibilitados de executarem trabalhos por terem faltasjustificadas (aulas perdidas por motivos de força maior). Os alunos que efectuaramtodos os trabalhos previstos ao longo do semestre não necessitam frequentar estaúltima aula.

12ª Avaliação prática


Protocolos laboratoriais


Trabalho nº 1: Contagem manual de eritrócitos com câmara de Neubauer e automática com autoanalisador.

1. ObjectivoVisualização ao microscópio de eritrócitos. Utilização de uma técnica manual e de uma

técnica automática de contagem de eritrócitos. Comparação entre os resultados obtidos.

2. AmostraSangue venoso com EDTA, perfeitamente homogeneizado em agitador mecânico.

Alternativamente, pode-se utilizar sangue capilar. Neste caso, feita a punção capilar e

removida a primeira gota de sangue com papel de filtro, faz-se a sua aspiração até à

marca pretendida com a pipeta de Thoma e, logo que esta seja limpa exteriormente, faz-

se de imediato a diluição com o líquido diluidor a fim de prevenir a coagulação da amostra.

Portanto, neste caso, é desnecessário o uso de anticoagulante se a técnica for executada

correctamente.

3. Logística

3.1. ReagentesLiquido diluidor (Dacie):

Formol a 40% 1 ml

Citrato trissódico a 3% 99 ml

Etanol 70%

3.2. MaterialTubos de vácuo com EDTA e respectiva agulhas ou lancetas estéreis

Pipeta de Thoma para eritrócitos

Tubo de borracha que se adapta à pipeta e permite a aspiração do liquido diluidor ou

pipetador automático

Agitador mecânico de pipetas de Thoma.

Câmara de Neubauer e respectiva lamela

Câmara húmida (placa de petri contendo algodão embebido em água desionizada)

Microscópio óptico

Contador manual de células

Algodão higienizado

Luvas cirúrgicas


3. Procedimento experimental

Técnica manual

1) adaptar a pipeta de Thoma, perfeitamente limpa e seca, ao tubo de borracha. Retirar a

amostra de sangue perfeitamente homogeneizada do agitador.

2) aspirar o sangue, o mais rigorosamente possível, até à marca 0,5. Limpar exteriormente

a pipeta com papel absorvente.

3) aspirar imediatamente a seguir o líquido diluidor até à marca 101, tendo o cuidado de

não incorporar bolhas de ar e de fazer a aspiração continuamente.

4) terminada a diluição, tapar a extremidade graduada da pipeta com o polegar e a outra

extremidade adaptada ao tubo de borracha com o dedo médio. Imprimir uma leve

agitação manual com movimentos transversais e ondulatórios.

5) retirar o tubo de borracha e colocar a pipeta no agitador durante 5 a 10 minutos.

Entretanto preparar a câmara de contagem e a câmara húmida.

6) adaptar a lamela à câmara de Neubauer e observar a formação dos anéis de Neubauer,

indicadores de uma boa adaptação.

7) retirar a pipeta do agitador e desprezar as primeiras três a quatro gotas. De imediato

proceder ao enchimento da câmara, colocando a extremidade da pipeta em contacto

com a lamela e deixar que a suspensão encha o retículo, penetrando nele por

capilaridade. As duas plataformas centrais devem ficar completamente cheias, mas sem

transbordar para os sulcos laterais e sem bolhas de ar.

Se o enchimento não se fizer correctamente deve colocar-se de novo a pipeta no

agitador, para manter a amostra homogeneizada, e, entretanto, lavar a câmara e secá-

la, preparando-a para repetir a operação de enchimento.

8) colocar a câmara em ambiente húmido e em repouso durante 10 minutos para que as

células sedimentem e permitam uma observação microscópica mais fácil.

9) colocar, então, a câmara sobre a platina do microscópio, baixar o condensador, fechar

parcialmente o diafragma e focar em pequena ampliação.

10) procurar a zona de contagem e fazer a respectiva numeração (ver figura).

11) tendo em conta a diluição da suspensão globular usada e o volume em que se

efectuou a contagem, calculado com base nas dimensões conhecidas da câmara de

Neubauer, determine o número de glóbulos vermelhos por litro de sangue, expressando

o resultado da seguinte forma:

N( ) x 1012/l de sangue


Técnica automáticaUtilizar o Autoanalisador Sysmex (consultar manual do fabricante).

4. Intervalos de referênciaRecém-nascido: 5,01,0 x 1012/lCriança (1 ano): 4,40,8 x 1012/lAdulto:

Homem: 5,51,0 x 1012/lMulher: 4,81,0 x 1012/l

5. Relatório

Identificar o local de contagem de eritrócitos na câmara de Neubauer.

Apresentar pormenorizadamente todos os cálculos necessários para a determinação do

valor dos eritrócitos no sangue (nºGV/L).

Fazer a discussão dos resultados obtidos comparando os resultados obtidos de forma

manual e automática, bem como os que seriam de esperar (comparação com os intervalos

de referência).


Contagem de eritrócitos – quadrados escuros

Contagem de leucócitos – quadrados A, B, C e D

Contagem de plaquetas – quadrado central

Pipetas de diluição de Thoma para glóbulos vermelhos e brancos


Trabalho nº 2: Contagem manual de leucócitos com câmara de Neubauer e automática com autoanalisador.

1. ObjectivoVisualização ao microscópio de leucócitos. Utilização de uma técnica manual e de uma

técnica automática de contagem de leucócitos. Comparação entre os resultados obtidos

de forma manual e automática.


No caso do procedimento manual, pode-se utilizar sangue capilar. Neste caso, feita a

punção capilar e removida a primeira gota de sangue com papel de filtro, faz-se a sua

aspiração até à marca pretendida com a pipeta de Thoma e, logo que esta seja limpa

exteriormente, faz-se de imediato a diluição com o líquido diluidor a fim de prevenir a

coagulação da amostra. Portanto, neste caso, é desnecessário o uso de anticoagulante se

a técnica for executada correctamente.

3. Logística3.1. ReagentesLiquido diluidor (Hayem):

Azul de metileno 0,25 g

Ácido acético 5 ml

Água destilada qbp 100 ml

Etanol 70%


Pipeta de Thoma para leucócitos







Contador manual de células


Luvas cirúrgicasCristina Vieira Almeida, FCS/UFP

HE, Pág. 15


Técnica manual



2) aspirar o sangue, o mais rigorosamente possível, até à marca 0,5. Limpar exteriormente

a pipeta com papel absorvente.






5) retirar o tubo de borracha e colocar a pipeta no agitador durante 5 a 10 minutos.

Entretanto preparar a câmara de contagem e a câmara húmida.















10) procurar a zona de contagem e fazer a respectiva numeração.



Neubauer, determine o número de glóbulos brancos por litro de sangue, expressando o

resultado da seguinte forma:




4. Intervalos de referênciaRecém-nascido: 18,08,0 x 109/l

Criança (1 ano): 12,06,0 x 109/l

Adulto: 7,53,5 x 109/l

5. RelatórioIdentificar o local de contagem de leucócitos na câmara de Neubauer.


valor dos leucócitos no sangue (nºGB/L).



de referência).


Trabalho nº 3: Contagem manual de plaquetas com câmara de Neubauer e automática com autoanalisador.

1. ObjectivoVisualização ao microscópio de plaquetas. Utilização de uma técnica manual e de uma

técnica automática de contagem de plaquetas. Comparação entre os resultados obtidos de

forma manual e automática


No caso do procedimento manual, pode-se utilizar sangue capilar. Neste caso, feita a

punção capilar e removida a primeira gota de sangue com papel de filtro, faz-se a sua

aspiração até à marca pretendida com a pipeta de Thoma e, logo que esta seja limpa

exteriormente, faz-se de imediato a diluição com o líquido diluidor a fim de prevenir a

coagulação da amostra. Portanto, neste caso, é desnecessário o uso de anticoagulante se

a técnica for executada correctamente.

3. Logística

3.1. ReagentesLiquido diluidor (Plaxan):

Oxalato de amónio 11,45 g

Tampão fosfato pH 6,8 110 g

Timerosal 0,1 g

Água destilada qbp 1 L

Etanol 70%


Pipeta de Thoma para eritrócitos







Contador manual de célulasCristina Vieira Almeida, FCS/UFP

HE, Pág. 18


Luvas cirúrgicas


Técnica manual



2) aspirar o sangue, o mais rigorosamente possível, até à marca 1. Limpar exteriormente a

pipeta com papel absorvente.






5) retirar o tubo de borracha e colocar a pipeta no agitador durante 10 minutos. Entretanto

preparar a câmara de contagem e a câmara húmida.















10) procurar a zona de contagem e fazer a respectiva numeração.



Neubauer, determine o número de plaquetas por litro de sangue, expressando o

resultado da seguinte forma:




4. Intervalos de referência150,0-400,0 x 109/l

5. RelatórioIdentificar o local de contagem de plaquetas na câmara de Neubauer.


valor das plaquetas no sangue (nºPt/L).



de referência).


Trabalho nº 4: A) Determinação do Hematócrito: MicrotécnicaB) Doseamento da hemoglobinaC) Determinação dos índices hematimétricos ou índices

globulares

1. ObjectivoAprender a utilizar uma técnica manual para determinação do hematócrito e doseamento

da hemoglobina. Utilizar estes e os valores obtidos em outras aulas para determinar os

índices hematimétricos.

A) Determinação do Hematócrito: Microtécnica

2. AmostraSangue venoso com EDTA ou sangue capilar (neste caso usar-se-ão tubos capilares com

revestimento interno de heparina).

3. Logística

3.1. ReagentesEtanol 70%

3.2. MaterialTubos de micro-hematocrito: tubos capilares de 75 mm de comprimento e com um

diâmetro interno de 1 mm. Estes tubos são fornecidos comercialmente com

revestimento interno de heparina.

Plasticina

Centrífuga com adaptador dos capilares



Técnica manual- introduzir o tubo capilar no tubo que contém o sangue com EDTA, perfeitamente

homogeneizado, e, inclinando um pouco os dois, deixar que o sangue suba no tubo por

capilaridade até cerca de 1 cm da extremidade livre do capilar.

- tapar a extremidade livre do tubo com o dedo indicador, como se se tratasse de uma

pipeta, e limpar exteriormente o tubo capilar.


- obturar, então, a extremidade oposta com plasticina, que estará mole, não oferecendo

resistência, sendo menor o risco de quebrar o tubo nos dedos; a coluna de plasticina

deve ficar com uma altura aproximada de 1 cm.

- colocar o tubo num dos sulcos radiais da centrífuga, tendo cuidado de por a extremidade

vedada voltada para a periferia. Fechar a centrifuga.

- centrifugar durante 5 minutos (3500 rpm/12 min).

- retirar o tubo e fazer a leitura do hematócrito, utilizando o dispositivo de leitura da

centrífuga.

Técnica manualAutoanalisador Sysmex

4. Intervalos de referênciaRecém-nascidos: 0,540,10 l/lCriança (3-6 anos): 0,400,04 l/lAdulto:

Homem – 0,470,07 l/lMulher – 0,420,05 l/l


B) Doseamento da hemoglobina

2. Amostra

Sangue venoso com EDTA, oxalato, citrato ou heparina, ou sangue capilar.

3. Logística

3.1. ReagentesEtanol 70%

Total Hemoglobin 525-A (Sigma): reagente de Drabkin, solução padrão de

hemoglobina (18 g/dl).

3.2. MaterialEspectrofotómetro de UV/VIS

Células de volume reduzido

Tubos de ensaio em vidro

Suporte de tubos de ensaio

Pipetas volumétricas (2,0; 4,0; 5,0 e 6,0 ml)

Micropipetas automáticas (20 l)

Luvas cirúrgicas


Técnica Seguir a instruções dadas pelo fabricante.


C) Determinação DOS ÍNDICES hematimétricos ou índices globulares

Determinar o VGM, HGM e CHGM por cálculo matemático a partir dos valores

encontrados (Ht, conc. Hemoglobina, contagem de eritrócitos):

5. RelatórioA) Determinação do Hematócrito: Microtécnica.

Descrever pormenorizadamente a forma de leitura do hematócrito. Comparar o resultado

obtido de forma manual com o valor obtido no autoanalisador e com os intervalos de

referência.

B) Doseamento da hemoglobina

Apresentar a recta de calibração. Determinar o valor da amostra (apresentar os cálculos).

Comparar o resultado obtido de forma manual com o valor obtido no autoanalisador e com

os intervalos de referência.

C) Determinação dos índices hematimétricos ou índices globulares

Apresentar todos os cálculos e tirar as respectivas conclusões (comparar com os

intervalos de referência).


/l)(nx10GV nº(g/l) HbHGM 12

(l/l)Ht (g/dl) HbCHGM

Trabalho nº 5: A) Determinação da velocidade de sedimentação

B) Execução de um esfregaço sanguíneo e a sua coloração

(Wright): estudo morfológico dos eritrócitos, leucócitos e

plaquetas

1. ObjectivoAprender a determinar manualmente a velocidade de sedimentação e a interpretar o seu

resultado.

Aprender a fazer e a corar um esfregaço, após o que o aluno fará um estudo morfológico

das células com base nesse esfregaço.

A) Determinação da velocidade de sedimentação

2. AmostraSangue venoso com anticoagulante (citrato trissódico a 3,8% na proporção de 1/4)

3. Logística

3.2. MaterialPipetas de Westergreen

Papel absorvente


Técnica - Aspirar o sangue para uma pipeta de Westergreen, até à marca zero (feito de forma

automática por um sistema de vácuo).

- Colocar a pipeta no suporte especial, assentando o bico da pipeta na parte inferior dum

disco de borracha e a parte superior numa peça metálica (com um apoio também de

borracha). A pipeta fica rigorosamente na vertical.

- Decorridos 60 minutos faz-se a leitura da VS (o valor alcançado pela coluna globular na

sua descida)

- À segunda hora procede-se de novo à leitura da VS, tomando a designação de VS à 2ª

hora.

- Determinar o índice de Katz (IK): IK=[VS à 1ª hora + (VS à 2ª hora/2)]/2


Intervalos de referência:Homem Mulher

1ºhora 3-5 mm 4-8 mm

2ºhora 4-12 mm 5-16 mm

IK 2-6 mm 3-8 mm

B) Execução de um esfregaço sanguíneo e sua coloração (WRIGHT): Estudo morfológico dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas

2. AmostraSangue capilar ou sangue venoso com anticoagulante

3. Logística

3.1. Reagentescorante Wright WS-16 (500 ml, Sigma)

3.2. Materiallaminas

suporte de laminas

microscópio

lancetas estéreis

algodão higienizado

luvas cirúrgicas

pipeta Pasteur


Técnica Esfregaço:

- coloca-se uma gota de sangue a cerca de 1 cm de uma das extremidades da lâmina e

de imediato procede-se à sua extensão, que será apoiando outra lâmina, com uma

inclinação de 45ºC sobre a que contém a gota de sangue.


- retrocedendo um pouco com esta segunda lâmina, promove-se o contacto com a gota de

sangue, que se espalhará por capilaridade ao longo da linha de contacto e de seguida

faz-se a sua extensão.

- deixar secar

Coloração de wright:

- esfregaço

- deitar umas gotas de corante

- esperar 1 minuto

- deitar umas gotas de água destilada

- misturar (soprar através de uma pipeta pasteur, a fim de misturar os dois líquidos).

- esperar 2 minutos

- lavar com água destilada

- deixar secar

- estudar a morfologia dos GV, GB e Pt


Glóbulos vermelhos e plaquetas

Neutrófilo

Basófilo

MonócitoLinfócito Eosinófilo

5. Relatório

A) Determinação da velocidade de sedimentação

Apresentar os valores obtidos após 1 e 2 horas. Determinar o índice de Katz. Apresentar

as conclusões.

B) Execução de um esfregaço sanguíneo e a sua coloração (Wright): estudo morfológico

dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas.

Descrever as células encontradas, mas também as não observadas.


Trabalho nº 6: Determinação manual da fórmula leucocitária a partir de um esfregaço de sangue e automática com autoanalisador

1. ObjectivoAprender a diferenciar, por observação microscópica, as várias populações de leucócitos e

a determinar a fórmula leucocitária (contagem diferencial das várias populações de

leucócitos, apresentando os resultados em valores absolutos e relativos). Comparação

entre os resultados obtidos com o método manual e automático.

2. AmostraSangue capilar ou sangue venoso com anticoagulante.

3. Logística

3.1. Reagentescorante Wright WS-16 (500 ml, Sigma)

3.2. Materialtubos de vácuo com EDTA e agulhas

laminas

suporte de laminas

microscópio óptico

lancetas estéreis


luvas cirúrgicas

pipeta pasteur


Técnica Igual à aula anterior


4. Intervalos de referência

GLÓBULO BRANCO Valor absoluto PercentagemNEUTRÓFILOSEOSINÓFILOS

BASÓFILOSLINFÓCITOSMONÓCITOS

1,8-7,0 x 109/L0,04-0,45 x 109/L

0-0,2 x 109/L1,5-4 x 109/L

0,2-0,95 x 109/L

35 – 70%0 – 7%

0 – 1,5%20 – 53%2,5 – 12%

5. Relatório

Apresentar os valores absolutos e relativos encontrados após a contagem diferencial das

células (apresentar os cálculos). Comparar os resultados obtidos com os intervalos de

referência.


Trabalho nº 7: Coloração de um esfregaço para contagem de reticulócitos

1. ObjectivoColoração de um esfregaço para a contagem de reticulócitos. Identificação e contagem de

reticulócitos. Determinação do índice de produção reticulocitária e sua interpretação.

2. Amostrasangue com anticoagulante

3. Logística

3.1. ReagentesSolução de azul brilhante de cresil:

azul brilhante de cresil 0,25 g

soro fisiológico 100 mL

3.2. Materialtubos de vácuo com EDTA e agulhas

laminas

suporte de laminas

microscópio óptico

lancetas estéreis


luvas cirúrgicas

pipeta pasteur


Técnica - mistura 1:1 (sangue e corante)

- incubar a 37ºC (20 a 25 minutos)

- fazer um esfregaço fino

- corar pelo wright

A percentagem de reticulócitos é

determinada em pelo menos 1000 eritrócitos


4. Intervalos de referênciapercentagem: 0,2 – 2,0%

valor absoluto: 25 – 85 x 109/L

5. Relatório

Apresentar todos os cálculos efectuados para determinar o valor absoluto e relativo dos

reticulócitos; o seu valor corrigido e o índice de produção reticulocitária.

Comparar os valores obtidos com os dos intervalos de referência.


Trabalho nº 8: Electroforese de hemoglobinas

1. ObjectivoA electroforese de hemoglobinas é usada em laboratórios clínicos para estudar e

quantificar o conteúdo em hemoglobinas nos fluídos biológicos.

2. Amostrasangue total

3. Logística

3.1. ReagentesVer a técnica fornecida pelo fabricante

3.2. MaterialVer a técnica fornecida pelo fabricante

3. Procedimento experimentalTécnicaVer a técnica fornecida pelo fabricante

4. Intervalos de referênciaHemoglobina A: 96-98%

Hemoglobina A2: 1,5-3,2%

Hemoglobina F: 0,5-0,8%

5. RelatórioFazer uma descrição sumária do procedimento. Apresentar os resultados (se possível

apresentar o traçado do perfil das hemoglobinas) e compara-los com os valores do

intervalo de referência. Apresentar as conclusões.


Trabalho nº 9: A) Determinação do grupo sanguíneo e do factor Rh

B) Prova de Coombs directa e indirecta

1. ObjectivoDeterminação do grupo sanguíneo e do factor Rh, frequente no laboratório.

Realização da prova de Coombs (Teste antiglobulina) directa e indirecta importante em

diversas situações (anemias hemolíticas auto-imunes, reacções de transfusão devidas a

incompatibilidades sanguíneas, detecção de anticorpos irregulares, detecção de

antigénios do tipo Rh).

2. AmostraSangue capilar e sangue venoso com anticoagulante

3. Logística

3.1. Reagentessoro fisiológico

soro Anti-ABO, soro Anti-D e soro coombs V (Reatrol).

3.2. Materiallaminas

suporte de laminas

microscópio

lancetas estéreis


estufa a 37ºC

centrífuga

tubos de ensaio de vidro

micropipetas automáticas

proveta volumétrica (pequena)

pipetas pasteur e pequenos agitadores

luvas cirúrgicas


3. Procedimento experimentalTécnicaA) GRUPO SANGUÍNEO E Rh

Detecção de antigénios de superfície realizando uma

reacção de aglutinação entre determinado as aglutininas da

superfície do G.R. e anticorpos anti-aglutininas (exemplo:

detecção do antigénio A).

EXECUÇÃO:

- Deitar uma gota de soro anti-A, anti-B, anti-AB e anti-Rh

- Deitar uma gota de sangue em cada lâmina (4)

- Em cada lamina misturar o soro com o sangue

- Observar quanto à aglutinação

Soro anti-A Soro anti-B Soro anti-A Soro anti-B

B) PROVA DE COOMBS

Baseia-se no princípio de que um anticorpo específico antiglobulina humana actuar como

uma ponte que induz a aglutinação dos eritrócitos ligados com imunoglobulinas humanas

ou complemento.


PROVA DE COOMBS INDIRECTA:A prova de Coombs indirecta é usada para detectar a reacção “in vitro” de anticorpos e

eritrócitos após uma fase apropriada de incubação.

EXECUÇÃO:Preparação de uma suspensão a 5% (v/v) de glóbulos vermelhos ORh+:

- lavar 3 vezes com soro fisiológico glóbulos do grupo O Rh+. Entre cada lavagem

centrifugar a 1500-2000 r.p.m. durante 5 a 10 minutos.

- preparar uma solução a 5% (v/v) (2 gotas em 2 mL de suspensão)

- marcar 3 tubos: 1, 2 e A (controlo negativo, controlo positivo e amostra)

- em cada tubo colocar:

1 – 4 gotas de suspensão de GV

2 – 2 gotas da suspensão de GV + 2 gotas de soro anti-D

A – 2 gotas da suspensão de GV + 2 gotas de soro teste

- agitar suavemente, a fim de obter uma boa mistura

- incubar 30 minutos a 37ºC

- centrifugar a 1000 r.p.m. durante 2 minutos

- lavar os glóbulos 3 vezes com soro fisiológico, centrifugar e decantar após cada lavagem

- deitar em cada tubo 2 gotas de soro de coombs

- misturar bem e centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 minuto

- observar se existe aglutinação

- agitar levemente o tubo e examinar macroscopicamente se há aglutinação. Os negativos

podem ser confirmados microscopicamente.

INTERPRETAÇÃO:Tubo 1: ausência de aglutinação

Tubo 2: aglutinação

Tubo A: aglutinação – presença de Ac no soro teste

ausência de aglutinação – ausência de Ac no soro teste


PROVA DE COOMBS DIRECTA:A prova de Coombs directa é usada para detectar anticorpos ligados “in vivo” a eritrócitos.

EXECUÇÃO:Preparação dos glóbulos a testar:

- lavar os eritrócitos a ser testados 4 vezes com grandes volumes de soro fisiológico.

Decante a seguir à última lavagem

- ressuspender os glóbulos em soro fisiológico de forma a obter uma suspensão a 5% (v/v)

(2 gotas em 2 mL de suspensão)

- simultaneamente preparar uma suspensão a 5% de GV O Rh+ (já foi preparada aquando

da Prova de Coombs indirecta)

- marcar 3 tubos: 1, 2 e A (controlo negativo, controlo positivo e amostra)

- deitar no tubo:

1 e 2 – colocar 1 gota da suspensão de GV O Rh+

A – colocar 1 gota da suspensão de GV teste

- deitar no tubo:

1 – 2 gotas de soro fisiológico

2 – 2 gotas de soro anti-D

A - 2 gotas de soro anti-globulina humana

- misturar bem

- centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 minuto

- agitar levemente o tubo e examinar macroscopicamente se há aglutinação. Os negativos

podem ser confirmados microscopicamente.

INTERPRETAÇÃO:Tubo 1: ausência de aglutinação

Tubo 2: aglutinação

Tubo A: aglutinação – presença de GV sensibilizados

ausência de aglutinação – ausência de GV sensibilizados

5. Relatório(A) Determinação do grupo sanguíneo e do factor Rh

Identificar a amostra. Descrever o que aconteceu após a adição de cada soro à amostra

de sangue. Apresentar os resultados (grupo sanguíneo e factor Rh).


(B) Prova de Coombs directa e indirecta

Descrever resumidamente os procedimentos. Apresentar e discutir os resultados

descrevendo o que é que aconteceu, ou não, durante e no final do trabalho, com a

amostra e controlos.


ApêndicesFichas para registo de resultados,

observações e cálculos


Universidade Fernando PessoaFaculdade de Ciência da Saúde

LICENCIATURA EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP1: CONTAGEM MANUAL DE ERITRÓCITOS COM CÂMARA DE NEUBAUER E AUTOMÁTICA COM AUTOANALISADOR

1. Volume de sangue aspirado para a pipeta de Thoma: _______________

2. Diluente utilizado e volume aspirado com a pipeta de Thoma:

3. Valor da diluição (na pipeta de Thoma) da amostra de sangue:

4. Na câmara de Neubauer, local de contagem dos eritrócitos:

5. Número total de eritrócitos contados:

6. Volume total de contagem dos eritrócitos (na câmara de Neubauer):

7. Valor final encontrado (Nº eritrócitos/L):


8. Conclusões acerca do valor encontrado relativamente ao valor esperado e em relação ao valor do autoanalisador:




HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP2: CONTAGEM MANUAL DE LEUCÓCITOS COM CÂMARA DE NEUBAUER E AUTOMÁTICA COM AUTOANALISADOR

1. Volume de sangue aspirado com a pipeta de Thoma: _______________



4. Na câmara de Neubauer, local de contagem dos leucócitos:

5. Número total de leucócitos contados:

6. Volume total de contagem dos leucócitos:

7. Valor final encontrado (Nº leucócitos/L):






HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP3: CONTAGEM MANUAL DE PLAQUETAS COM CÂMARA DE NEUBAUER E AUTOMÁTICA COM AUTOANALISADOR

1. Volume de sangue aspirado com a pipeta de Thoma: _______________



4. Na câmara de Neubauer, local de contagem das plaquetas:

5. Número total de plaquetas contados:

6. Volume total de contagem dos plaquetas:

7. Valor final encontrado (Nº plaquetas/L):






HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP4A: DETERMINAÇÃO DO HEMATÓCRITO: MICROTÉCNICA

1. Amostra de sangue utilizada: ____________ ___

2. Valor de hematócrito encontrado:


TP4B: DOSEAMENTO DA HEMOGLOBINA

1. Qual a função do reagente de Drabkin`s ?:


2. Valor de absorvância encontrado para a amostra:

3. Qual a equação da recta de calibração e o coeficiente de correlação:

4. Valor de hemoglobina total da amostra:

5. Comparação entre o valor para a amostra e o valor de hemoglobina esperado (intervalo de referência) e o dado pelo autoanalisador:

TP4C: DETERMINAÇÃO DOS ÍNDICES HEMATIMÉTRICAS OU ÍNDICES GLOBULARES

1. Valor do volume globular médio: _______________

2. Valor da hemoglobina globular médio:

3. Valor da concentração da hemoglobina globular médio:


4. O que pode concluir dos valores encontrados:




HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP5A: DETERMINAÇÃO DA VELOCIDADE DE SEDIMENTAÇÃO

1. Leitura após a primeira hora: _______________

2. Leitura após a segunda hora:

3. Valor do índice de Kats:

4. Conclusões acerca do valor encontrado relativamente ao valor esperado:

TP5B: EXECUÇÃO DE UM ESFREGAÇO SANGUÍNEO E A SUA COLORAÇÃO (WRIGHT): ESTUDO MORFOLÓGICO DOS ERITRÓCITOS, LEUCÓCITOS E PLAQUETAS

1. Células identificadas: _______________


2. Qual a objectiva utilizada na observação das células:

3. Quais são as células que predominam na periferia do esfregaço:

4. Quais são as células que predominam no centro do esfregaço: 5. Quantos lóbulos tem, em média, o núcleo dos neutrófilos:

6. Quantos lóbulos tem o núcleo dos eosinófilos:

7. Característica do núcleo do monócito:

8. Relação volume do núcleo/volume do citoplasma do linfócito (grande ou pequena?):




HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP6: DETERMINAÇÃO MANUAL DA FÓRMULA LEUCOCITÁRIA A PARTIR DE UM ESFREGAÇO DE SANGUE E AUTOMÁTICA COM AUTOANALISADOR

Preencher os quadros seguintes:Valores em percentagem

Neutrófilos Linfócitos Eosinófilos

Monócitos

Basófilos

ManualMXD=

Automático MXD=

Valores absolutosNeutrófilos Eosinófilos Linfócitos Monócito

sBasófilos

Manual


MXD=Automático

MXD=

2. Conclusões acerca dos resultados encontrados:




HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP7: COLORAÇÃO DE UM ESFREGAÇO PARA CONTAGEM DE RETICULÓCITOS

1. Corante utilizado para a coloração dos reticulócitos:

2. O que é que este corante vai corar:

3. O que é um reticulócito:

4. Valor absoluto e relativo (%) encontrado para os reticulócitos:

5. Determinação da % corrigida dos reticulócitos (factor de correcção=Ht/0,45):


6. Valor absoluto encontrado para os reticulócitos:

7. Determinação do índice de produção reticulocitária (I.P.R=% ret. Corrigida/tempo médio de maturação, do reticulócito, no sangue periférico):




HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP8: ELECTROFORESE DE HEMOGLOBINAS

1. Valor encontrado para a hemoglobina A:

2. Valor encontrado para a hemoglobina A2:

3. Valor encontrado para a hemoglobina F: :

4. Valor da voltagem aplicada na migração e qual o tempo de migração: :

5. Valor do pH do tampão utilizado e qual a carga das proteínas da amostracolocada nesse tampão: :

6. As proteínas migram, durante a electroforese, do pólo positivo para onegativo ou do pólo negativo para o positivo. Porquê? :

7. Qual das hemoglobinas migra mais rapidamente e mais lentamente no gel: :


8. Conclusões:




HE – PRÁTICA

Nomes: Números:________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________________________________________________ _______________

Data: _____/ _____/ _____ Grupo nº: _________________

TP9A: DETERMINAÇÃO DO GRUPO SANGUÍNEO E DO FACTOR RH



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