Proteínas plasmáticas - Introduçãohomepage.ufp.pt/calmeida/BC/BC5.pdf · A determinação das proteínas plasmáti cas fornece informações sobre o ... Causas de alteração

1

Proteínas plasmáticas - Introdução

As proteínas estão presentes em todos os fluídos do nosso corpo.Analisa-se as proteínas plasmáticas com a finalidade de serem utilizadas como auxiliares de diagnóstico.Mais de 100 proteínas têm função fisiológica no plasma.

Funções das proteínas plasmáticasFunções das proteínas plasmáticas

FUNÇÃO EXEMPLO

Transporteglobulina de ligação à tiroxina (hormonas da tiróide)apolipoproteínas (colesterol, triglicerídeos)transferrina (ferro)

Imunidade humoral imunoglobulinas

Manutenção daManutenção da pressão osmótica todas as proteínas, particularmente a albumina

Enzimas reninafactores de coagulação

Inibidores da protease α1-antitripsina (actua nas proteases)

Tampão todas as proteínas


Quantitativamente a proteína mais importante é a albumina.As outras proteínas designam-se colectivamente por globulinas.

Alterações na concentração das diferentes proteínas podem fornecer informações úteis para o diagnóstico. Causas:

lt ã d t d í t d t í- alteração da taxa de síntese das proteínas- alteração na taxa de remoção das proteínas- alteração no volume de distribuição

A concentração das proteínas é afectada pela postura:aumento de 10 a 20% durante os 30 minutos após o levantar da cama,

devido a um aumento da difusão de fluídos do compartimento vascular para o intesticial.

Aumento num curto espaço de tempo (e não recebeu proteínas por viaendovenosa) - devido a uma diminuição do volume de distribuição(desidratação)

Diminuição acelerada da concentração proteica - devida a um aumento dovolume plasmático.

2


A determinação das proteínas plasmáticas fornece informações sobre o estado de hidratação do paciente.

Causas de alteração da concentração das proteínas plasmáticas totais

AUMENTO DIMINUIÇÃO

− Hipergamaglobulinemia− Paraproteinemia

Aumento da síntese proteica

− Má nutrição e má absorção− Doença hepática− Imunodeficiência humoral

Diminuição da síntese proteica

Hemoconcentração devido à estase do − Hiper-hidratação Aumento do

- Artefacto devido à estase do sangue durante a punção

− Aumento da permeabilidade capilar

volume de distribuição

- Desidratação Diminuição do volume de distribuição

− Estado de perda de proteínas− Estado catabólico

Aumento da excreção/ catabolismo

Proteínas plasmáticas - Principais proteínas plasmáticas

Principais proteínas plasmáticas

CLASSE PROTEÍNAMASSA

MOLECULAR(D)

CONCENTRAÇÃO SÉRICA APROXIMADA

(g/L)P é lb i 76000 0 25Albumina PréalbuminaAlbumina

7600066300

0,2540

α1-globulina α1-antitripsinaα1-glicoproteína ácida

5300044000

2,91,0

α2-globulinaHaptoglobulinaα2-macroglobulinaCeruloplasmina

700000725000134000

2,02,6

0,35Transferrina 76000 3,0

β-globulina Lipoproteínas de baixa densidadeComponentes do complemento (C3)Proteína C reactiva

3000000180000118000

1,01,0

0,01

γ-globulina

IgGIgAIgMIg DIgE

150000180000900000170000190000

14,03,51,5

0,03vestígios

3

Proteínas plasmáticas - Albumina

ALBUMINAProteína mais abundante no plasmaProteína de fase aguda negativaSintetizada no fígadoContribui para o equilíbrio da pressão osmótica coloidal Determina a distribuição do fluído extracelular entre os espaço vascular e extravascularTransporta: hormonas, medicamentos, ác. gordos livres, bilirrubina não conjugada e iões

A interpretação das variações patológicas têm que ser cuidadosas uma vez que são muitos os processos patológicos que causam alterações nas concentrações plasmáticas.

Causas de hipoalbuminemiap

Diminuição da síntese: má nutrição, má absorção e doença hepática

Aumento do volume de distribuição: hiperhidratação, aumento da permeabilidade capilar (septicemia e hipoxemia)

Aumento da excreção/degradação: síndroma nefrótico, queimaduras, hemorragia, estados catabólicos (febre, trauma, doença maligna)

Proteínas plasmáticas - α1-globulinas

α1-GLOBULINASα1-ANTITRIPSINA

Inibidor as proteaseÉ uma proteína de fase aguda. A sua concentração aumenta em estados de

inflamação aguda.Constitui cerca de 90% das α -globulinasConstitui cerca de 90% das α1-globulinasForma activa: MMDeficiências hereditárias de α1-antitripsina podem originar:

hepatite neonatal que se pode transformar, no adulto, em cirrose (o defeito é devido na substituição de um aminoácido por outro que leva à proteína formar agregados que não podem ser secretados do fígado e causam danificação do tecido hepático)e efisema (devido à falta do inibidor natural da enzima elastase, que resulta em mudanças destrutivas no pulmão) - risco aumentado em pessoas que fumam

Risco aumentadoem deficiências

Homozigóticos (ZZ)

Estas anomalias podem ser detectadas antes do nascimento por exame do sangue fetal - focagem isoeléctrica antecedida pela PCR (pollimerase chain reaction)

Valores elevados: - inflamações - gravidez- uso de contraceptivos

4


α1-FETOPROTEÍNASintetizada pelo fígado fetalDetectada no soro materno até ao 7 ou 8 mês de gravidezPensa-se que protege o feto do ataque imunológico materno (após o nascimento desaparece do soro. Está aumentado, por exemplo, em

i )carcinomas)Valores elevados: - alterações do tubo neural

- espinha bífida- sofrimento fetal, parto prematuro ou gémeos- tirosinose (aminoacidopatia)- doença hemolítica do recém-nascido- hepato-carcinoma- tumores das gonadas nos adultos

Valores baixos: - risco do síndrome de Down (alterações no cromossoma 21)Teste de despite (“screening”): 15 a 20 semanas de gestação


α1-GLICOPROTEÍNA ÁCIDASintetizada pelo fígado (existe na membrana das plaquetas)Homologia com imunoglobulinas e haptoglobulina (podem ter resultado de uma proteína comum)Função: - interfere no metabolismo das hormonas esteróides, na coagulação

f ã d l é ie formação de colagénio- transporta hormonas esteróides

Valores elevados: - inflamação- gravidez- cancro- pneumonia- artrite reumatóide

Valores baixos: - problema hepático grave

Banda α1-globulinas:Os seus níveis estão elevados nas doenças inflamatórias agudas e crónicas, neoplasias, após traumas ou cirurgias e durante a gravidez ou estrogenioterapia. Nos hepatocarcinomas, a elevação pode acontecer pelo aumento da alfa-fetoproteína.

5

Proteínas plasmáticas - α2-globulinasα2-GLOBULINAS

HAPTOGLOBULINASintetizada nos hepatócitos e nas células do sistema reticuloendotelial (pequena quantidade)É constituída por dois tipos de cadeias (duas α e duas β). A cadeia β contém o local de ligação para a hemoglobina (cadeia α)Impede a perda da hemoglobina e do ferro na urinaValores elevados: - estados inflamatórios

- doenças reumáticas- queimaduras- síndrome nefrótico

Valores baixos: doença hemolítica do recém-nascido e após transfusões -serve para avaliar o grau de hemólise

CERULOPLASMINASintetizada no fígadoContém 6 a 8 átomos de cobre (ligados à apoceruloplasmina)Tem actividade enzimática: histaminase, cobre e ferro oxidaseAs mulheres apresentam valores mais elevadosValores elevados: gravidez, estados inflamatórios, doenças malignas, contraceptivosValores baixos: doença de Wilson (defeito na incorporação de Cu na

ceruloplasmina que fica menos estável diminuíndo a sua concentração), síndrome nefrótico, dieta pobre, síndrome de má absorção


α2-MACROGLOBULINASintetizada pelo fígadoInibidor de proteasesTransportador de moléculas (IL-6, IL-2, insulina, factores de crescimento)As mulheres apresentam valores mais elevadosAs mulheres apresentam valores mais elevadosValores elevados: - contraceptivos, lesão hepática e diabetes

Níveis elevados de α2-macroglobulina associados à diminuição de albumina acontecem na síndrome nefrótica.

α2-globulinasIncluem a haptoglobina, a alfa-2-macroglobulina e a ceruloplasmina. Raramente se encontram alterações nesta banda eletroforética, já que a diminuição de um componente é compensada pelos demaisdiminuição de um componente é compensada pelos demais.

Níveis elevados de alfa-2-macroglobulina associados à diminuição da albumina acontecem na síndrome nefrótica.Os níveis de haptoglobina e de ceruloplasmina podem apresentar-se elevados em numerosas situações que levam à reacção de fase aguda.

6

Proteínas plasmáticas - β-globulinas

β-GLOBULINAS

TRANSFERRINASintetizada pelo fígado, sistema reticuloendotelial (em pequena quantidade), contém dois iões férricosProteínas de fase aguda negativaTempo de semi-vida de 7 diasFunções: - transporte de ferro - para os locais que armazenam ferro

(apoferritina-ferritina) e para a medula óssea (hemoglobina)- impede a perda do ferro pelo rim- impede a deposição de ferro nos tecidos

Diagnóstico diferencial das anemias e monitorização do tratamentoUm aumento de ferro ligado à transferrina – hemocromatose

Valores baixos: inflamação, doenças malignasValores elevados: anemia por deficiência em ferro


PROTEÍNA C REACTIVASintetizada pelo fígadoProteínas de fase agudaNão é detectável em indivíduos saudáveisNa electroforese aparece entre a região da γ lenta e a βp g γ βPode iniciar a opsonização, fagocitose e lise celular como resposta à reacção inflamatóriaValores elevados: - febre reumática

- infecções bacterianas

COMPLEMENTOConjunto de proteínas que participam na reacção imune Circulam na forma de precursores não funcionaisCirculam na forma de precursores não funcionaisValores elevados: estados inflamatóriosValores baixos: - má nutrição

- lupus eritomatoso- coagulopatias intravasculares disseminadas

Beta-lipoproteínas (LDL)

7


B-globulinas

Composta pelas beta-lipoproteínas (LDL), transferrina, C3 e outros componentes do complemento, beta-2-microglobulina e antitrombina III.

A redução dessa banda não é frequenteA redução dessa banda não é frequente.

Está frequentemente elevada nos casos de icterícia obstrutiva e menos frequentemente em alguns casos de hepatite. Quase sempre, está elevada nos casos de cirrose hepática. Nesses casos, pode aparecer junto com sobreposição ou fusão das bandas beta e gama pelo aumento de IgA, que ocorre nas cirroses hepáticas, infecções de pele ou trato respiratório e na artrite reumatóide.

Elevações causadas provavelmente pelo aumento dos componentes do ç p p pcomplemento podem ocorrer em hipertensão maligna, doença de Cushing, poliarterite nodosa e carcinomas.

A anemia por deficiência de ferro leva ao aumento da transferrina.

O hipotireoidismo, a cirrose biliar, as nefroses e alguns casos de diabetes mellitus podem se evidenciar pelo aumento de colesterol e consequente aumento das beta-lipoproteínas (LDL).

Proteínas plasmáticas - γ-globulinas

γ-GLOBULINAIMUNOGLOBULINAS

Ig A, Ig G, Ig E, Ig M, Ig D

Características das imunoglobulinas

Classe Cadeia pesada

Conc. sérica média (g/L) Função

IgG γ 14,0 anticorpo que existe em maior quantidade na resposta imune secundária

IgA α 3,5secretado como um dímero

anticorpo que existe em maior quantidade nas secreções mucosas (ex.:saliva, muco bronquial)

secretado como um pentameroIgM µ 1,5

secretado como um pentameroanticorpo que existe em maior quantidade na resposta

imune primária

IgD δ 0,03presente na superfície dos linf. B

anticorpo envolvido no reconhecimento antigénico?

IgE ε Vestígiospresente na superfície dos mastócitos e basófilos provável papel na imunidade contra helmintas e

associado com reacções de hipersensibilidade imediata

8


IMUNOGLOBULINAS (cont.)

As imunoglobulinas são constituídas por duas cadeias H (pesadas) e duas L (leves) ligadas por pontes dissulfureto.p p

Diferenças na cadeia H - IgA, IgG, IgE, IgM e IGDAs cadeias leve são só de dois tipos: K, λ

o recém-nascido não sintetiza IgG, mas esta atravessa a placentaIgA é mais elevada nos homensIgM e IgG são mais elevadas nas mulheresIgE depende da condição alérgica do indivíduoIgE depende da condição alérgica do indivíduo

As imunoglobulinas derivadas da proliferação de um único clone designa-se por imunoglobulina monoclonal


IMUNOGLOBULINAS (cont.)HIPOGAMAGLOBULINEMIA- causas fisiológicos: à nascença a concentração de IgA e IgM é baixa e

a IgG diminui (IgG maternos)- causas patológicas: deficiências congénitas (doença de Bruton);

deficiências adquiridas (doenças hematológicas, ex.: leucemias linfática crónica; estados de perda de proteínas, ex.: síndroma nefrótico)

HIPERGAMAGLOBULINEMIA- causas fisiológicos: infecção aguda ou crónica- causas patológicas: doenças autoimunes (doença reumatóide e lupus

eritomatoso sistémico) e doenças hepáticas graves (algumas tendo por base uma doença autoimune)tendo por base uma doença autoimune)

PARAPROTEÍNASÉ uma imunoglobulina produzida por um único clone de células da série dos linfócitos (normalmente plasmócitos). São moléculas idênticas(aparece um pico discreto na electroforese)

9


IMUNOGLOBULINAS (cont.)PARAPROTEÍNAS (cont.)Aparece, por exemplo: - Mieloma múltiplo - proliferação maligna disseminada de células

plasmáticas (IgG e IgA)- Leucemia linfática crónica (IgM)- Fisiológico - aumenta com a idade

PESQUISA LABORATORIAL- Electroforese de proteínas: essencial para a detecção de paraproteínas- Pesquisa na urina: 20% dos mielomas, o tumor produz apenas as

cadeias leves que são rapidamente excretadas para a urina (não detectadas no soro) - proteínas de Bence Jones

- As proteínas de Bence Jones precipitam a 45-60ºC, mas redissolvem-se pela ebulição

Proteínas plasmáticas - Análise quantitativa e semiquantitativa

Muito complicado ecomplicado e

demorado

Mais usado

10


Valores de referência para as proteínas sérica: 60-80 g/L


11



12

Técnicas de separação de proteínasELECTROFORESE

Há separação das proteínas num suporte sólido (normalmente acetato de celulose e agarose), de acordo com as suas características de carga eléctrica.

No final temos 5 fracções:

Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínas

No final temos 5 fracções:Albumina (fracção mais negativa), α1-globina, α2-globina, β-globina e γ-globina

(fracção menos negativa)

preparação da tira de acetato de celuloseColocar uma tira num recipiente com tampão (pH=9). Deve-se deixar embeberlentamente a tira e depois mergulha-la no tampão durante, no mínimo, 10minutos.

preparação da tina de electroforesepreparação da tina de electroforeseColocar em cada recipiente da tina (marcados com + e -) cerca de 150 ml detampão.

preparação do aplicador e aplicaçãoNumerar, em primeiro lugar, de 1 a 8 as referências de trabalho.Encher os poços base do aplicador da direita para a esquerda, fazendocoincidir a sua numeração com a numeração da lista de trabalho. O soro 1 éentão colocado no 1º poço do lado direito.Encher cada um dos 8 poços da base do aplicador com cerca de 18 µl de soro,de cada um dos pacientes.

ELECTROFORESE (cont.)

Retirar a tira do tampão e coloca-la suavemente entre duas folhas de papel defiltro de forma a retirar o excesso de tampão. Depois, colocar a tira, bemestirada, na ponte.

aplicação e migração


ap cação e g açãoColocar a ponte com a tira na Tina de electroforese (migração: - → +).

Colocar o aplicador na base que tem os soros. Premir o botão suave elentamente para que os pentes mergulhem nas amostras. Esperar durante 10-15 segundos. Levantar lentamente o botão para permitir que o soro emexcesso caia dos pentes. Fazer a aplicação na tira premindo o botão durante10 a 15 segundos, levantando-o lentamente ao fim desse tempo. Fazer estaaplicação 2 vezes. Atenção: a aplicação é feita no lado negativo.

Colocar a tampa da Tina e ligar a fonte de alimentação regulando-a para 225 Vd t 20 i t V i i ã ã d t ídurante 20 minutos. Vai ocorrer a migração e a separação das proteínas.

Lavar de imediato o aplicador (para o soro não secar nos pentes) mergulhandoos pentes na água do recipiente de lavagem e fazendo 5 a 10 aplicações empapel absorvente ou lavar os pentes com água corrente e depois com águadestilada.Deixar secar à temperatura ambiente. Lavar a base com os soros com águadestilada e secar com uma toalha.

13

ELECTROFORESE (cont.)coloração e transparentização

Após 20 minutos de separação, desligar a fonte de alimentação e seguir os seguintes passos:

· Coloração: colocar a tira num recipiente com corante, deixando embebe-la


Coloração: colocar a tira num recipiente com corante, deixando embebe la primeiro na superfície e depois mergulha-la durante 10 minutos.

· Lavagem: efectuar 3 lavagens sucessivas da tira com solução de lavagem. Deixar ficar cerca de 2 minutos + 2 minutos + 3 minutos em cada recipiente de lavagem.

· Transparentização: colocar a tira num recipiente com o transparentizador durante 3 minutos.

· Secagem: colocar a tira sobre uma lâmina de vidro, usando as mãos protegidas com umas luvas Com outra lâmina de vidro passar sobreprotegidas com umas luvas. Com outra lâmina de vidro passar sobre a primeira para retirar bolhas de ar e fixar melhor à lâmina, usando-a também para cortar o excesso de tira. Levar à estufa a 80ºC durante 5-10 minutos.

Depois de retirar a lâmina da estufa, deixar arrefecer à temperatura ambiente. Não por os dedos nem encostar nada às zonas de migração. Qualquer mancha provoca erros de leitura.


Valores de referência:Percentagem (%): Valor absoluto (g/L):

Albumina: 52 – 65 32 – 56Alfa-1: 2,5 – 5,0 1 – 4Alfa-2: 7,0 – 13,0 4 – 12Beta: 8,0 – 14,0 5 – 11Gama: 12,0 – 22,0 5 – 16

14

Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínasElectroforese das proteínas no soro e correlação patológica

E:- diminuição da capacidade de

sintetizar albumina e aumento da excreção

- compensação dada pelo aumento da gamaglobulinas (manter a pressão oncótica)( p )

- continuidade entre β e γdada pela IgA

F:- secreção feita pela

proliferação monoclonal de plasmócitos

- normalmente sem estar presente a quantidade normal de Ac policlonaisnormal de Ac. policlonais (células normais são substituídas por um clone maligno)

Proteínas plasmáticas - Técnicas de separação de proteínasElectroforese das proteínas no soro e correlação patológica (cont.)

D:- existe uma quase completa

ausência da fracção gama

Ex.:- ocorre normalmente em

neonatais antes daneonatais antes da maturação do sistema imune

- após quimioterapia para erradicação de alguma malignidade

H:- diminuição da maioria das

fracções (diminuição da síntese e aumento da excreção das proteínas deexcreção das proteínas de baixo peso molecular)

- contudo a fracção α2 pode estar relativamente aumentada devido à coexistência de uma resposta de fase aguda (haptoglobulina) ou preferencialmente uma retenção de moléculas grandes (α2-macroglobulina)

15

Outras técnicas de separação de proteínas

ELECTROFORESE E IMUNOFIXAÇÃO


Outras técnicas de separação de proteínas

ELECTROFORESE EM DUAS DIMENSÕES

FOCAGEM ISOELÉCTRICA


FOCAGEM ISOELÉCTRICA

PRECIPITAÇÃO

SEPARAÇÃO EM COLUNA

Documents

Proteínas plasmáticas - Introduçãohomepage.ufp.pt/calmeida/BC/BC5.pdf · A determinação das proteínas plasmáti cas fornece informações sobre o ... Causas de alteração