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Análise de prevalência de salmonelose em criações não tecnificadas de Gallus

gallus no Distrito Federal

HELENA KOCH GUIMARÃES

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS

BRASÍLIA/DF

MAIO/2006

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

ANÁLISE DE PREVALÊNCIA DE SALMONELOSE EM CRIAÇÕES NÃO TECNIFICADAS DE GALLUS GALLUS NO DISTRITO FEDERAL

HELENA KOCH GUIMARÃES

ORIENTADOR: FRANCISCO ERNESTO MORENO BERNAL CO-ORIENTADOR: VITOR SALVADOR PICÃO GONÇALVES

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PUBLICAÇÃO: 226/2006

BRASÍLIA/DF MAIO/2006

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

ANÁLISE DE PREVALÊNCIA DE SALMONELOSE EM CRIAÇÕES NÃO TECNIFICADAS DE GALLUS GALLUS NO DISTRITO FEDERAL

HELENA KOCH GUIMARÃES

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA DA UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA, COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS NA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO DE DISCIPLINAS DE PRODUÇÃO ANIMAL. APROVADA POR: ______________________________________________________ Prof. FRANCISCO ERNESTO MORENO BERNAL, doutor (UnB) (ORIENTADOR) CPF: 000.810.096-90 E-mail: framobe@unb.br ______________________________________________________ Profa. SIMONE PERECMANIS, doutora (UnB) (EXAMINADORA INTERNA)CPF:010.126.137-39 E-mail:perecmaniss@unb.br ______________________________________________________ Prof. MILTON THIAGO DE MELLO, doutor (EXAMINADOR EXTERNO) CPF: 265.895.677-00 E-mail: anmil@uol.com.br BRASÍLIA/DF, 19 de MAIO de 2006.

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FICHA CATALOGRÁFICA REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA GUIMARÃES, H.K. Análise de prevalência de salmonelose em criações não tecnificadas de Gallus gallus no Distrito Federal. Brasília: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2006, 54 p. Dissertação de Mestrado.

CESSÃO DE DIREITOS NOME DO AUTOR: Helena Koch Guimarães TÍTULO DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO: Análise de prevalência de salmonelose em criações não tecnificadas de Gallus gallus no Distrito Federal. GRAU: Mestre ANO: 2006 É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta dissertação de mestrado e para emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e nenhuma parte desta dissertação de mestrado pode ser reproduzida sem a autorização por escrito do autor. ______________________________________ Helena Koch Guimarães CPF: 852.319.751-68 SQN 316 bloco G apartamento 602, Asa Norte CEP – 70.775-070 - Brasília/DF - Brasil (61)3274-1183 - helenakoch@yahoo.fr

Guimarães, Helena Koch

Análise de prevalência de salmonelose em criações não tecnificadas de Gallus gallus no Distrito Federal. Helena Koch Guimarães; orientação de Francisco E.M.Bernal. - Brasília, 2006.

54 p.; il. Dissertação de Mestrado (M) – Universidade de Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2006.

1.Salmonella 2.Gallus gallus 3.aves caipiras 4. suabe cloacal I. Bernal, F.E.M. II. Dr.

5

Dedico... A minha mãe, amigos e familiares pelo

apoio e compreensão. Aos professores que ajudaram na

minha formação profissional e pessoal.

6

Agradeço...

A minha mãe, pela minha criação e formação.

Aos meus amigos, pelos momentos que passamos juntos, sejam estes

bons ou ruins, e por sempre me apoiarem, mesmo à distância.

Aos meus professores, que sempre me ajudaram neste trabalho e em

outros, em especial aos meus orientadores Francisco e Vitor. As minhas

“orientadoras” que não levam o nome neste projeto, mas que me ajudaram

neste trabalho: Simone Perecmanis, Ângela Patrícia Santana, Débora Cléa

Ruy.

Aos técnicos da EMATER que ajudaram na coleta das amostras e aos

técnicos Hudson, Nara e Daniela do laboratório de microbiologia da UnB que

me auxiliaram nas análises das amostras.

Aos meus amigos e “fotógrafos” de salmonelas que me ajudaram nas

fotos presentes neste trabalho, Taís e Diego.

Ao meu gato Viggo que tanta alegria me proporciona com sua presença

e ao apoio enquanto escrevia este trabalho às três horas da manhã e ele

permanecia quietinho ao lado do computador, me dando forças para continuar

a escrever.

7

“Se você não diz o que pensa,

logo ousará dizer o que não pensa”

Theodore Parker (1810-1860)

8

ÍNDICE

PÁGINA

Introdução 13 Objetivos 14 Revisão de literatura 15

Etiologia das salmoneloses 15 Antígenos 15 Antígenos O” 16 Antígenos “H” 16 Antígenos “K” 16 Exclusão competitiva 17 Nomenclatura 18 Diagnóstico 18 Meios de cultura 20 Epidemiologia 21 Distribuição 21 Hospedeiros suscetíveis 21 Reservatórios e fontes de infecção 22 Morbidade, letalidade e mortalidade em animais 23 Vias de eliminação 23 Transmissão 23

Transmissão entre as aves 24 Salmonelose em animais 25 Salmoneloses em aves 25 Pulorose 27 Tifo aviário 28 Paratifos aviários 29

Diagnóstico diferencial 30 Tratamento 30 Controle e Prevenção 31 Salmonelose em humanos 33 Prevenção das toxiinfecções alimentares 35 Surtos de infecção alimentar 37 Salmonelas em produtos de origem aviária 37 Contaminação em ovos 37

Material e métodos 39 Método de amostragem 39 Análise laboratorial 41 Resumo do esquema utilizado no trabalho 52 Resultados e discussão 53 Conclusões 59 Bibliografia 60

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ÍNDICE DE TABELAS

TABELA PÁGINA Tabela 1- Nomenclatura anterior e atual das subespécies que

compõem a Salmonella enterica 18

10

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA PÁGINA

Foto 1- Rappaport-Vassiliadis 42 Foto 2- Agar MacConkey 42 Foto 3- TSI 44 Foto 4- Agar fenilalanina 45 Foto 5- VM/VP 46 Foto 6- Indol 47 Foto 7- Salicina 48 Foto 8- Citrato de Simmons 49 Foto 9- Arginina 50 Foto 10- Malonato 51

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Análise de prevalência de salmonelose em criações não tecnificadas de Gallus gallus no Distrito Federal.

Resumo geral

A distribuição mundial das Salmonellas já é conhecida, tanto em populações

animais, como em grupos humanos, convertendo-se em sérios problemas de

saúde pública, e juntamente com o gênero Campylobacter, é responsável por

cerca de 90% das toxinfecções alimentares registradas. As populações de

aves de produção encontram-se entre as principais espécies animais

fornecedoras de proteína para os humanos, e acrescentando a fácil

contaminação a nível de campo, as tornam um dos principais grupos de

transmissores das Salmonellas, devido ao alto consumo de aves inteiras ou de

partes ou subprodutos das mesmas. O presente trabalho teve como objetivo

pesquisar a prevalência de salmonelas em 300 aves Gallus gallus adultos

criados em propriedades não tecnificadas do Distrito Federal, bem como

tipificá-las posteriormente na Fundação Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro/RJ e

realizar antibiograma para ver a sensibilidade das salmonelas encontradas a

diferentes antibióticos. De cada ave foi coletado um suabe cloacal que era

incubado no Rappaport-Vassiliadis por 48 horas a 37o C, posteriormente foi

repicado em ágar MacConkey a 37o C por 24 horas e as colônias típicas de

Salmonella eram repassadas no TSI a 37o C por 24 horas, de onde os

resultados típicos eram repassados para diversos testes bioquímicos. Nas

aves analisadas não foi encontrada nenhuma Salmonella.

Palavras chaves: Salmonella, Gallus gallus, ave caipira, suabe cloacal

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Salmonellosis's prevalence analysis in Gallus gallus's farms with no technical means in the Distrito Federal. Abstract

Salmonellas are world-wide spread and besides being cause of disease for

poultry, they still constitute a problem in what concerns public health, since

Salmonella combined with Campylobacter sp. are estimated to be responsible

for over 90% of the cases in the world related to food bacterial toxic infection; in

case of Salmonellas, products derived from aviculture (poultry production), are

the principal responsible. The present work aimed at developing a research on

the predominance of Salmonellas, involving 300 Gallus Gallus poultry raised in

farms with no technical means, in Distrito Federal, as well as typifying them

later in the Foundation Oswaldo Cruz- Rio de Janeiro/RJ and also carrying out

antibiograms to verify the Salmonellas‘susceptibility to different antibiotics. It

was collected- from each poultry- a swab cloacal which was incubated in the

Rappaport-Vassiliads for 48 hours at 37º degrees centigrade; later on, it was

transplanted to a MacConkey agar at 37º degrees centigrade per hour and the

typical Salmonella colonies it was *re-passed to the TSI at 37º centigrade for a

period of 24 hours, from where the typical results it was* re-passed for several

biochemical tests. No Salmonelas were found in the poultry analyzed.

Key words: Salmonella, Gallus gallus, tacky chicken, swab cloacal

13

Introdução

As salmonelas são microorganismos que podem causar doenças

no homem e nos animais (PELCZAR et al, 1981; NASCIMENTO et al, 2000 e

JACOB et al, 2002), sendo um dos gêneros bacterianos mais estudados

(NASCIMENTO et al, 2000).

O gênero Salmonella tem este nome devido ao americano Dr.

Salmon, veterinário bacteriologista do século XIX (KORSAK, 2004). Em 1884,

Salmon e Smith isolaram microorganismos que posteriormente foram

denominados Salmonella Choleraesuis; em 1888, Gärtner descobriu a

Salmonella Enteritidis; em 1889, Loeffler descobriu a Salmonella Typhimurium

(STELLMACHER, 1999).

São conhecidos mais de 2500 sorotipos de Salmonella, no

entanto, apenas 80 a 90 são os mais comuns em casos de infecções nas aves

e nos humanos (BERCHIERI JR, 2000). Dentre esses sorotipos, alguns podem

infectar as aves e também podem estar associados a casos de toxinfecção

alimentar no homem (HUMBERT e SALVAT, 1997 e BERCHIERI JR, 2000).

As toxinfecções alimentares são um grave problema de saúde

pública, sendo que a maioria dessas doenças estão associadas ao consumo de

carne de aves e de produtos avícolas contaminados com os sorotipos

paratifóides de Salmonella e com Campylobacter jejuni (WHITE et al, 1997).

As salmonelas são um grave problema para a avicultura industrial e, portanto,

para a saúde pública (ANDRADE et al, 1995 e TESSARI, 2003), pois o

consumo de carne de frango é cada vez maior (TESSARI et al, 2003).

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Objetivos

O presente trabalho teve como objetivos:

__determinar a prevalência de Salmonella em Gallus gallus adultos

criados em propriedades não tecnificadas do Distrito Federal;

__tipificar as salmonelas encontradas no Instituto Oswaldo Cruz

localizado no Rio de Janeiro/RJ;

__verificar a sensibilidade das salmonelas isoladas a diferentes

antibióticos por meio da realização de antibiogramas.

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Revisão de Literatura

1) Etiologia das salmoneloses As salmonelas são bactérias pertencentes à família

Enterobacteriaceae, gênero Salmonella (BIER, 1976 e CARTER, 1988). São

bastonetes gram-negativos, não formadores de esporos (PELCZAR et al, 1981;

CARTER, 1988; PINTO, 1996; GORZYNSKI, 1997 e ITO et al, 2004), aeróbios

e anaeróbios facultativos (BIER, 1976; PELCZAR et al, 1981; CARTER, 1988;

PINTO, 1996; GORZYNSKI, 1997 e KRUININGEN, 1998) com cerca de 2 a 5

µm de comprimento por 0,7 a 1,5 µm de largura (KORSAK, 2004). Devido aos

flagelos peritríquios, são móveis (BIER, 1976; PELCZAR et al, 1981; PINTO,

1996 e KORSAK, 2004), no entanto, algumas salmonelas não possuem flagelo,

portanto são imóveis (TOLEDO, 1996 e GORZYNSKI, 1997), como a

Salmonella Gallinarum e a S. Pullorum (BIER, 1976; BERCHIERI JR, 2000 e

ITO et al, 2004).

1.1) Antígenos As salmonelas possuem antígenos somáticos (designados por O),

flagelares (designados por H) e de virulência ou capsular ocasional (designado

por Vi), que através de sua "combinação" determinam o sorovar com referência

à fórmula antigênica do esquema de Kauffman-White (QUINN et al, 1994 e

OIE, 2004), no qual os microorganismos estão classificados pelos números e

letras atribuídos a diferentes antígenos (PELCZAR et al, 1981). Os diferentes

antígenos das salmonelas são identificados por meio de testes de aglutinação,

utilizando-se anti-soros preparados em coelhos (TRABULSI e TOLEDO, 1996).

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1.1.1) Antígenos "O" Os antígenos "O" são somáticos (BIER, 1976; PELCZAR et al,

1981; TRABULSI e TOLEDO, 1996 e LEVINSON e JAWETZ, 1998) e são

numerados de um a 65 (PELCZAR et al, 1981). De acordo com GORZYNSKI

(1997), a parede celular das bactérias gram-negativas possui três componentes

externos à camada de peptidoglicana: lipoproteína, membrana externa e

lipopolissacarídeo (LPS). O polissacarídeo do LPS é o principal antígeno de

superfície dessas bactérias (designado como "O") e sua especificidade

antigênica é devido às unidades terminais repetidas (trissacarídeos ou

tetrassacarídeos ou pentassacarídeos).

1.1.2) Antígenos "H"

Os antígenos "H" são flagelares e, portanto, são encontrados apenas

nas bactérias móveis, ou seja, que possuem flagelo (PELCZAR et al, 1981;

TRABULSI e TOLDEDO, 1996 e LEVINSON e JAWETZ, 1998). O antígeno "H"

das salmonelas que o possuem, podem alternar reversivelmente os dois tipos

de "H" conhecidos: fase 1 e fase 2. Essa mudança na antigenicidade pode ser

utilizada para fugir da resposta imune do hospedeiro (LEVINSON e JAWETZ,

1998). Existem duas fases de antígenos "H", um e dois; os antígenos da fase

um são designados por letras minúsculas de "a" até "z", “z1“ até “z59“; os

antígenos da fase dois foram numerados, mas devido a reações cruzadas

incluem muitas designações da fase um (PELCZAR et al, 1981).

1.1.3) Antígenos "K" Os antígenos "K" (letra vem da palavra alemã kapsein, que

significa cápsula) de origem polissacarídica (BIER, 1976), sendo que entre as

salmonelas, apenas a Salmonella Typhi possui e é designado por antígeno Vi

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(capsular) (PELCZAR et al, 1981; TRABULSI e TOLEDO, 1996 e LEVINSON e

JAWETZ, 1998).

1.2) Exclusão competitiva As bactérias requerem condições ambientais específicas para a

sua aderência, colonização e patogênese nos animais. Dessa forma, a

população normal de bactérias comensais tem capacidade para excluir por

competição física e química as salmonelas. Para ocorrer a colonização entérica

por patógenos é necessário alguma alteração na homeostase da microbiota

intestinal normal, tais como: modificação rápida na alimentação, modificação

ambiental, uso de antibióticos, altas doses de bactérias infectantes e dano

epitelial causado por outro patógeno. Pesquisas demonstram que a população

de bactérias do intestino pode ser alterada pela inoculação intencional de

bactérias benéficas, ou exclusão competitiva (UGA, 2002). A exclusão

competitiva é utilizada para reduzir a infecção por Salmonella e por outros

patógenos em aves e outras espécies (ITO et al, 2004; OIE, 2004 e

SCHNEITZ, 2005). Segundo SCHNEITZ (2005), estudos realizados em vários

países mostram que o conceito da exclusão competitiva se aplica a todos os

sorotipos de Salmonella.

Pelo Princípio de Nurmi, a exclusão competitiva também

abrangeria um conceito imunológico: no caso de bactérias próximas

filogeneticamente e que teriam antígenos em comum, a infecção e/ou

imunidade por uma, protegeria o animal da outra (FIORENTIN, 2000). Isso é

útil para entender que a infecção por uma salmonela pode proteger o animal da

infecção por outra. O trabalho de RABSCH et al (2005) mostra que na

Alemanha (embora isso já tenha sido comprovado em outros países como

Estados Unidos e Inglaterra) a S. Enteritidis ocupou o nicho ecológico deixado

pela erradicação da S. Gallinarum na avicultura.

18

2) Nomenclatura

A classificação do gênero Salmonella é bastante complexa e por

isso, controversa, o que fez com que surgissem diversas nomenclaturas por

vários anos (CORRÊA e CORRÊA, 1992 e OIE, 2004). A nomenclatura mais

recente considera que o gênero Salmonella consiste em duas espécies: S.

enterica e S. bongori. A S. enterica é dividida em seis subespécies, que são

distinguíveis por certas características bioquímicas. Estas subespécies são

(OIE, 2004):

TABELA 1: NOMENCLATURA ANTERIOR E ATUAL DAS SUBESPÉCIES QUE COMPÕEM A SALMONELLA ENTERICA

Nomenclatura anterior Nomenclatura atual Subespécie I Subespécie enterica Subespécie II Subespécie salamae

Subespécie IIIa Subespécie arizonae Subespécie IIIb Subespécie diarizonae Subespécie IV Subespécie houtenae Subespécie VI Subespécie indica

Observação: na nomenclatura anterior, a subespécie V corresponde atualmente à S. bongori. Fonte: OIE (2004)

Somente para os sorovares da subespécie enterica, os nomes

foram retirados. Estes nomes já não devem ser escritos em itálico e a primeira

letra deve ser escrita em maiúscula. Por exemplo, a Salmonella enterica

subespécie enterica sorovar typhimurium, pode ser escrita como S.

Typhimurium (OIE, 2004).

3) Diagnóstico O diagnóstico definitivo das salmoneloses é feito por isolamento e

identificação ou sorotipagem da bactéria (TOLEDO, 1996; HUMBERT e

SALVAT, 1997; ITO et al, 2004 e PEREIRA e SILVA, 2005). Para as

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salmoneloses, a sorologia não possui valor diagnóstico definitivo, mas permite

detectar as aves ou outros animais que tiveram contato com as salmonelas, o

que constitui uma ferramenta útil em programas sanitários (PEREIRA e SILVA,

2005). Geralmente os testes sorológicos são feitos com uma amostra

representativa da população e possui valor limitado quando os animais são

vacinados (OIE, 2004).

Nas aves, o teste completo de sangue é utilizado no diagnóstico

rápido de S. Pullorum e S. Gallinarum na propriedade (OIE, 2004). Esse exame

sorológico de sangue chamado soroaglutinação em placa tem a vantagem de

selecionar as aves soropositivas para aprofundarem nos exames. Caso se

confirmem positivas, devem ser descartadas da reprodução e retiradas do

contato com as demais. Em galinhas é realizado o abate (BENEZ, 2001).

Para o diagnóstico baseado no isolamento de microorganismos, o

material deve ser coletado assepticamente de tecidos em necropsias ou em

fezes, suabes retais, amostras ambientais, alimentos e matéria-prima de

alimentos (OIE, 2004). As etapas necessárias para o isolamento e a

identificação das salmonelas são, nessa ordem, pré-enriquecimento,

enriquecimento seletivo, plaqueamento, análise bioquímica e tipificação

sorológica (NASCIMENTO et al, 2000 e OIE, 2004). Geralmente, a etapa de

pré-enriquecimento é utilizada na análise de material desidratado ou quando é

necessária para viabilizar o início da pesquisa da bactéria; as demais etapas

são sempre obrigatórias (NASCIMENTO et al, 2000).

O gênero Salmonella pode ser diferenciado de outras

enterobactérias e dentro do mesmo gênero com base em reações bioquímicas,

das quais se incluem o aspecto das colônias em meios diferenciais e a

tipificação sorológica (PELCZAR et al, 1981). As salmonelas apresentam

resultados negativos para os testes bioquímicos de indol, Vogues-Prokaeur

(VP), urease, fenilalanina desaminase e sacarose, e resultados positivos para o

vermelho de metila (VM), lisina descarboxilase, D-glicose produção de ácido e

D-manitol, e resultados variáveis para H2S no três açucares e ferro (TSI),

20

citrato de Simmons, arginina desidrolase, ornitina descarboxilase, motilidade,

malonato, D-glicose produção de gás, dulcitol e maltose (MAPA, 1995).

3.1) Meios de cultura

Todas as enterobactérias crescem bem em ágar sangue e em

ágar MacConkey (QUINN et al, 1994 e LEVINSON e JAWETZ, 1998), sendo

que esse último meio, permite a fermentação da lactose, critério de maior

importância para a identificação dessas bactérias (LEVINSON e JAWETZ,

1998). Embora o MacConkey seja um meio seletivo, ele permite o crescimento

de outras bactérias gram negativas que não são enterobactérias. Também

podem ser utilizados o ágar verde brilhante e o ágar XLD que são mais

seletivos e utilizados para isolar salmonelas, no entanto permite o crescimento

de outras enterobactérias (QUINN et al, 1994). As salmonelas crescem bem

em meios seletivos como o ágar azul de metileno-eosina, Mc-Conkey e

similares, sem fermentar a lactose e, portanto, produzindo colônias

transparentes com cerca de um milímetro de diâmetro após 24 horas a 37o C

no cultivo (CORRÊA e CORRÊA, 1992). Os meios recomendados pelo MAPA

(1995) para isolamento de salmonelas são: ágar MacConkey, ágar verde

brilhante, ágar Hektoen e ágar Rambach.

Nas condições comuns de isolamento e observação, as bactérias

do gênero Salmonella e Proteus são bastante similares (ambas não fermentam

a lactose, podem produzir H2S), no entanto o Proteus desdobra a uréia

(CORRÊA e CORRÊA, 1992). Os inibidores de bactérias gram positivas: violeta

cristal e verde brilhante; inibidores de coliformes: sais biliares, que favorecem

as salmonelas. O sulfito de bismuto é eletivo para a S. Typhi (BIER, 1976).

21

4) Epidemiologia

4.1) Distribuição

As salmonelas são encontradas em todos os países, mas a maior

prevalência é em áreas de criação animal intensiva, principalmente de suínos e

bovinos e algumas espécies de aves em confinamento (OIE, 2004), mas em

regiões, climas ou estações quentes, a freqüência de casos clínicos é maior

(CORRÊA e CORRÊA, 1992). Os fatores mais importantes para a sua

presença são os portadores crônicos entre os animais e o homem e também a

capacidade da bactéria em conservar-se e multiplicar-se por longos períodos

no meio ambiente (STELLMACHER, 1999).

4.2) Hospedeiros suscetíveis

São susceptíveis às salmonelas, todas as espécies de animais

domésticos (CORRÊA e CORRÊA, 1992 e OIE, 2004), especialmente em aves

e suínos. Animais jovens ou prenhes ou em lactação são mais suscetíveis

(OIE, 2004). Todos os sorovares podem infectar os animais (exceto a S. Typhi)

e o homem (CORRÊA e CORRÊA, 1992 e LEVINSON e JAWETZ, 1998), mas

existe uma certa eletividade desses microorganismos pelas espécies animais,

como por exemplo: S. Typhimurium (todas as espécies, pouco seletivo), S.

Abortus-equi (eqüinos), S. Choleraesuis (suínos), S. Typhisuis (leitões), S.

Dublin (bezerros) e S. Abortus-ovis (ovinos) (CORRÊA e CORRÊA, 1992).

MILLÁN et al (2004) investigaram a presença de salmonelas em

82 pássaros e 123 mamíferos de vida livre, utilizado amostras de fígado,

intestino e baço em cultura. Nas aves, a prevalência encontrada foi de 8,5%

(7/82) e nos mamíferos foi de 7,2% (9/123). Nas aves, foram isolados os

22

seguintes sorotipos: S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Muenchen, sorotipo

6,14:z4,z23.

4.3)Reservatórios e fontes de infecção

As salmonelas possuem vasta distribuição na natureza, sendo

que o trato intestinal dos animais e do homem é seu principal reservatório

(PEREIRA e SILVA, 2005). Os reservatórios dessas bactérias são os animais

portadores inaparentes, animais domésticos e selvagens (CARTER, 1988;

CORRÊA e CORRÊA, 1992 e BERCHIERI JR, 2000). Os répteis são

comumente portadores assintomáticos de salmonelas (OIE, 2004). MILLAN et

al (2004) ressaltam a importância de animais de vida livre como reservatórios

de Salmonella, sendo um risco de contaminação para humanos e animais de

criação.

Alguns animais, especialmente aves e suínos, podem ser

portadores assintomáticos e transmitirem a doença para outros animais e

contaminarem alimentos (OIE, 2004), sendo as mais freqüentes fontes de

contaminação de origem animal para o homem: frango e ovos (LEVINSON e

JAWETZ, 1998).

Segundo FARIAS (2000), a ocorrência de salmonelas em águas

de esgoto e águas poluídas por essas fontes é descrita na literatura em muitos

países, e é reconhecida a transmissão por veiculação hídrica e sabida a

capacidade de sobrevivência dessas bactérias por longos períodos no meio

aquático. Essa autora pesquisou em amostras de águas de esgoto e de águas

de córrego em São Paulo, a presença de salmonela. Todas as amostras

(100%) foram positivas.

23

4.4) Morbidade, letalidade e mortalidade em animais A morbidade nesta doença é variável, geralmente é baixa nas

criações com manejo sanitário adequado e alta onde não há esse tipo de

manejo. A mortalidade varia com a morbidade e com o uso rotineiro de

medicamentos que alteram esses índices que são ativos contra o

microorganismo (CORRÊA e CORRÊA, 1992).

4.5) Vias de eliminação

As salmonelas podem residir na vesícula biliar ou no tubo

intestinal de animais portadores (KRUININGEN, 1998). Essencialmente, as

salmonelas se multiplicam no tubo digestivo, principalmente no ceco, e a

excreção dessas bactérias pode ser massiva no ambiente (HUMBERT e

SALVAT, 1997).

4.6) Transmissão

A infecção geralmente é adquirida via oral (CARTER, 1988;

LEVINSON e JAWETZ, 1998 e STELLMACHER, 1999), mas também pode

ocorrer pelas vias aerógena, conjuntival, transplacentária e pelo ovo

(STELLMACHER, 1999). Ingressando pela via digestiva com a água e

alimentos contaminados, as salmonelas chegam aos intestinos, onde se

instalam e se multiplicam. Dependendo da espécie do hospedeiro, da sua

patogenicidade, da adaptação ao hospedeiro e idade deste, as salmonelas

podem causar grave doença ou passar desapercebidas e permanecer no

hospedeiro por meses ou anos, constituindo um reservatório da bactéria para

animais suscetíveis (CORRÊA e CORRÊA, 1992).

24

Geralmente, infecções e epidemias são causadas por diversos

tipos de produtos alimentares derivados da carne, ovos, leite e aves. Outros

meios de infecção podem ser alimentos e água contaminados com fezes de

roedores, alimentos infectados pelos manipuladores e por equipamentos e

utensílios contaminados. Esporadicamente ocorre contaminação a partir do

contato direto com um animal ou pessoa infectada (CARTER, 1988). A doença

também pode ser transmitida por moscas e utensílios contaminados

(KRUININGEN, 1998). Provavelmente, rações contaminadas por salmonelas

contribuem para a introdução desses microorganismos nos plantéis

(ANDRADE et al, 1995).

ALBUQUERQUE et al (2000) analisaram em uma fábrica

industrial de ração do interior de São Paulo, 136 amostras de ingredientes de

rações, 43 amostras de rações prontas (sendo cinco de suínos e 38 de aves) e

110 amostras de suabes de pó. Das 136 amostras analisadas, 27 (19,85%)

estavam contaminadas com salmonelas, sendo 59,26% em matérias-primas de

origem animal, 29,63% em derivados vegetais e industriais e 11,11% em

derivados lácteos. Das 43 rações prontas analisadas, duas (4,65%) foram

positivas, sendo uma de aves (2,63%) e uma de suínos (20%). O percentual

baixo na ração das aves em relação à de suínos, provavelmente se deve ao

fato de que esta era destinada à alimentação de aves reprodutoras, nas quais

não foram utilizadas matérias-primas de origem animal. Dos 110 suabes de pó,

nenhum recuperou salmonelas.

4.6.1) Transmissão entre as aves Nas aves adultas, alguns sorovares de Salmonella podem se

localizar no aparelho genital, causando a infecção transovarina (BARROW,

2000 e ITO et al, 2004). Isso caracteriza a transmissão vertical, na qual ocorre

a contaminação do ovo dentro da galinha, sendo uma das principais formas de

transmissão do tifo e pulorose aviárias (BERCHIERI JR, 2000 e

SHIVAPRASAD, 2000).

25

No caso da transmissão vertical, caso o embrião sobreviva, pode

ocorrer a contaminação do lote de aves e no caso de morte embrionária,

muitos ovos podem ficar contaminados (HUMBERT e SALVAT, 1997). Após a

postura, nos ninhos, nos galpões de matrizes, nos caminhões e nos

incubatórios, os ovos para incubação podem se contaminar por Salmonella, o

que também caracteriza a transmissão horizontal (ROCHA et al., 2003).

A bactéria pode ser eliminada pelas fezes e contaminar alimentos,

água e cama; pode ocorrer o canibalismo entre aves doentes, ingestão de ovos

contaminados e de forma mecânica: pessoas e outros animais podem

disseminar as salmonelas (BERCHIERI JR, 2000 e ITO et al, 2004).

5) Salmonelose em animais

O tipo de salmonela e a dose de infecção são importantes fatores

a serem considerados na ocorrência da doença, assim como fatores

estressantes para os animais (STELLMACHER, 1999). Os sinais clínicos

variam entre as espécies e com a idade: a salmonelose afeta com maior

freqüência e de forma mais grave os animais novos do que os adultos

(KRUININGEN, 1998).

5.1) Salmoneloses em aves As bactérias do gênero Salmonella podem causar três doenças

em aves: a pulorose causada pela S. Pullorum, o tifo aviário causado pela S.

Gallinarum (BERCHIERI JR, 2000; SHIVAPRASAD, 2000; ITO et al, 2004 e

PEREIRA e SILVA, 2005), e o paratifo aviário, causado pelas outras espécies

26

de salmonelas, exceto as causadoras do tifo e da pulorose (BERCHIERI JR,

2000).

Em aves, as infecções causadas por salmonelas apresentam

amplo aspecto clínico, sendo grave a sintomatologia das salmonelas adaptadas

às aves, que é o caso da S. Pullorum e da S. Gallinarum, enquanto que as

salmonelas paratíficas geralmente não apresentam manifestações clínicas

aparentes, freqüentemente ocasionando uma queda na produtividade do

plantel avícola, mas podendo ser transmitida para outras espécies animais,

através de fezes e aves infectadas ou seus produtos contaminados (PEREIRA

e SILVA, 2005).

ANDRADE et al (1995) analisaram 1304 suabes cloacais de aves

de postura comercial com uma a 72 semanas de vida de seis granjas

comerciais em Goiânia/GO e entorno. Nas granjas sem histórico de problemas

sanitários, a prevalência de Salmonella foi de 3,98% (34/854), enquanto que

nas granjas com problemas sanitários a prevalência foi de 11,33% (51/450); a

média das amostras foi de 6,51% (85/1304).

MURUGKAR et al (2005) pesquisaram 231 suabes cloacais de

pássaros na Índia, sendo que 34 (14,7%) eram positivos. Quatro sorovares

foram identificados: S. Typhimurium (35,3%), S. Gallinarum (35,3%), S.

Enteritidis (23,5%) e S. Paratyphi B (5,9%).

ROCHA et al. (2003) avaliaram 18 lotes de frangos de corte de

três diferentes empresas integradoras em Goiás. Foram coletadas 378

amostras (sendo 198 de órgãos de pintos de um dia e 180 de forros de caixas

de transporte). Nas caixas foram encontradas 11,11% de amostras positivas

(2/180) e nos órgãos de pintos 3,03% (6/198), sendo que neste último, todos

em um mesmo lote. O fato de ter sido encontrada uma maior positividade de

salmonelas em caixas do que em órgãos, pode ser devido ao fato de que as

caixas possuem maior representatividade, pois cada uma, acondiciona em

média 100 pintos, aumentando a probabilidade de isolamento da bactéria.

27

PEREIRA e SILVA (2005) coletaram 160 amostras de soro

sanguíneo, 44 suabes cloacais e 58 suabes ambientais em nove propriedades

rurais de galinhas caipiras em Uberlândia (MG). O soro sanguíneo foi analisado

pela prova de soroaglutinação rápida (SAR); os suabes cloacais foram feitos

nas mesmas galinhas que foram coletados o sangue, com um pool de três a

cinco suabes por amostra; os suabes ambientais foram coletados

principalmente de locais como ninhos e poleiros. O SAR demonstrou que

88,9% (8/9) das propriedades e 35,5% (57/160) das aves foram positivas; com

os suabes cloacais, Salmonella sp foi isolada em 11% (1/9) das propriedades e

2,27% (1/44) das aves; através dos suabes ambientais, 55,55% (5/9) das

propriedades e 29,31% (17/58) das aves foram positivos para a salmonela.

A Instrução Normativa número 78 (MAPA, 2003) estabelece

normas para o monitoramento das salmoneloses − S. Pullorum, S. Gallinarum,

S. Enteritidis e S. Typhimurium − em estabelecimentos avícolas que realizam

comércio nacional e internacional, e à transferência nacional de seus produtos.

Dessa forma, os estabelecimentos de linhas puras, bisavoseiros e avoseiros

devem ser livres das quatro salmonelas; os matrizeiros devem ser livres para

as S. Pullorum e S. Gallinarum e livres e/ou controlados para a S. Enteritidis e

para a S. Typhimurium. Os estabelecimentos de postura comercial, frango de

corte e ratitas não são abrangidos por essa Instrução Normativa.

5.1.1) Pulorose Geralmente acomete aves com até três semanas de vida e a

transmissão vertical é a principal forma de disseminação da pulorose, que

quando ocorre, quase sempre apresenta grande mortalidade. Embora várias

espécies de aves como perus, codornas, papagaios, faisões e outras possam

se infectar com a S. Pullorum, palmípedes e pombos são considerados mais

resistentes à infecção. As galinhas são os hospedeiros naturais dessa bactéria

e as linhagens leves são mais resistentes do que as pesadas. As aves

28

acometidas podem apresentar sinais clínicos que variam de uma simples

sonolência e perda de apetite, até diarréia branca a branco-amarelada, penas

arrepiadas, asas caídas e morte. Nas aves adultas, os sinais clínicos não são

evidentes e geralmente são poucas aves acometidas; geralmente essas aves

têm uma diminuição na postura, penas arrepiadas, crista pálida, diarréia

branco-amarelada a amarelo-esverdeada, depressão e desidratação

(BERCHIERI JR, 2000).

CARDOSO et al (2003) examinaram para a pulorose, 9940

amostras de soro de aves reprodutoras com idade de seis a 68 semanas de

três empresas avícolas de São Paulo. Os soros foram analisados pela técnica

de soroaglutinação rápida em placa (SAR) e os positivos para esse teste eram

submetidos ao teste de soroaglutinação lenta em tubos (SAL). Na prova de

SAR, 2,17% dos soros foram positivos (216/9940) e a prova de SAL revelou

0,41% (41/9940) de soros positivos. No entanto, a positividade sorológica para

a pulorose nas aves reprodutoras necessita uma análise mais detalhada para

nortear as investigações, já que o diagnóstico definitivo é obtido com o

isolamento, identificação e tipificação da Salmonella spp.

5.1.2) Tifo Aviário

As aves adultas são mais comumente acometidas pela doença,

embora ela seja patogênica para aves de todas as idades (BERCHIERI JR,

2000 e ITO et al, 2004). A mortalidade é alta, acometendo 40-80% do plantel, e

as aves que adoecem, morrem em sete a 14 dias. Igualmente à pulorose, as

linhagens leves são mais resistentes do que as demais – pesadas e semi-

pesadas (BERCHIERI JR, 2000).

29

5.1.3) Paratifos aviários Diversos sorotipos de Salmonella já foram isolados de aves com e

sem o quadro da doença, o mais comum é S. Typhimurium, mas outros, tais

como S. Enteritidis, S. Agona, S. Infantis, S. Hadar, S. Senftenberg e S.

Heideberg também são freqüentemente isolados. As aves jovens são mais

suscetíveis do que as adultas (BERCHIERI JR, 2000).

As bactérias do gênero Salmonella causadoras do paratifo

compreendem atualmente, mais de 2500 sorotipos de salmonelas que não

possuem hospedeiro específico (PEREIRA e SILVA, 2005). Essas bactérias

causam graves problemas para a indústria avícola, gerados pela introdução

dessas bactérias na cadeia alimentar (BARROW, 2000). O sistema intensivo de

criação utilizado na avicultura industrial favorece a introdução, instalação,

permanência e disseminação das salmonelas paratíficas. As salmonelas

paratíficas apresentam uma epidemiologia complexa devido a existência de

diversas fontes de infecção (ZANATTA et al, 2003).

Embora a maioria das infecções causadas por salmonelas sejam

enzoóticas, a Salmonella Enteritidis é responsável por uma pandemia nas aves

domésticas e no homem desde a metade do século XX (THORNS, 2000),

enquanto que no Brasil, ela surgiu como um grande problema avícola e de

saúde pública desde 1993 (SILVA e DUARTE, 2002).

Por se adaptar bem ao intestino de galinhas e perus, as

salmonelas paratíficas podem ser eliminadas nas fezes por várias semanas e

também podem invadir a circulação e infectar órgãos tais como ovário, fígado,

baço e coração. Com a contaminação do aparelho reprodutor e da cloaca

(fezes), o ovo pode se contaminar, gerando a contaminação vertical

(BERCHIERI JR, 2000). Em aves, na forma aguda pode ocorrer diarréia severa

de coloração variável entre castanho e vermelho a diarréia branca, que neste

caso é excesso de urina com uratos causados por lesões renais; febre, perda

de peso, perda de apetite e da sede. As penas podem ficar emboladas, com

30

mancha rocha no abdômen (hepatomegalia), pinta preta no lado direito do

abdômen dos filhotes (hiperplasia da vesícula biliar) e morte rápida. As lesões

observadas na necropsia de aves mortas por salmonelose podem ser: fígado

aumentado de volume com pontos brancos de necrose, vesícula biliar

aumentada com grande quantidade de bile; rins congestos ou esbranquiçados

devido à grande quantidade de uratos no tecido renal e nos ureteres;

congestão pulmonar, inflamação necrótica do intestino; baço aumentado e

friável e pus nas articulações (BENEZ, 2001).

TESSARI et al (2003) analisaram 130 lotes de pintos de corte

recém-nascidos, sendo que 24,62% (32/130) dos lotes foram positivos para

salmonelas, sendo 24 (18,46%) para Salmonella Enteritidis e oito (6,15%) para

Salmonella enterica subespécie enterica (O: 9,12).

5.2) Diagnóstico diferencial

A pulorose, por acometer as aves do nascimento até a terceira

semana de vida, deve ser diferenciada de outras doenças como encefalomielite

aviária, aspergilose, colibacilose e outras salmoneloses; em aves adultas, a

pulorose deve ser diferenciada da doença de Marek, pasteurelose, colibacilose

e outras salmoneloses. O tifo aviário deve ser diferenciado de doenças como

Marek, colibacilose, pasteurelose, micoplasmoses e outras salmoneloses. Os

paratifos aviários devem ser diferenciados das outras salmoneloses e de

doenças bacterianas septicêmicas (BERCHIERI JR, 2000).

5.3) Tratamento

Em aves, o tratamento pode ser eficaz, mas não tem efeito sobre

o indivíduo portador, pois esta característica não é perdida (BERCHIERI JR,

2000; BENEZ, 2001 e ITO et al, 2004). O uso de antibióticos de sensibilidade

constatada deve ser por seis a sete dias (BENEZ, 2001).

31

Comumente as salmonelas apresentam resistência a antibióticos

causada por diversos fatores, como por plasmídeos (LEVINSON e JAWETZ,

1998 e BERCHIERI JR, 2000), por resistência cromossômica (THRELFALL et

al, 1997), pela alteração na estrutura das proteínas ligantes ao antibiótico, pela

redução da permeabilidade da membrana externa (o que diminui a capacidade

do antibiótico atingir as proteínas ligantes apropriadas) e pela inativação do

antibiótico por beta-lactamases bacterianas (no caso das penicilinas)

(WIKIPEDIA, 2006), daí a importância em se realizar antibiogramas. Para

diminuir o risco de resistência aos antibióticos é preciso o uso cauteloso no

tratamento e na profilaxia das salmoneloses, após o antibiograma, para que a

eficácia do uso dos antibióticos se sustente a longo prazo (MURUGKAR et al,

2005). Não é recomendado o tratamento das aves contra a pulorose, pois é

uma doença de erradicação compulsória (ITO et al; 2004).

5.4) Controle e Prevenção Considerando que a distribuição do gênero Salmonella é universal

e que infecta grande variedade de aves domésticas e de vida livre, geralmente

assintomáticas, o seu controle é difícil e medidas de biossegurança como

prevenção da infecção em plantéis industriais são importantes (PEREIRA e

SILVA, 2005).

As salmoneloses estão entre os problemas de maior prevalência

na avicultura industrial, o que requer um elaborado programa de prevenção e

controle com medidas que evitem a transmissão vertical e horizontal. A

obtenção de pintinhos de um dia livres de salmonelas é essencial para o

sucesso de programas que visem a prevenção e o controle desse

microorganismo, o que por si é importante para o sucesso econômico da

avicultura intensiva, pois a qualidade dos pintinhos de corte é um reflexo direto

da cadeia produtiva (TESSARI et al, 2003). Em incubatórios, seleção dos ovos,

o afastamento das aves soropositivas para a salmonela nos matrizeiros e

32

limpeza e desinfecção de ovos e incubadora são medidas que devem ser

adotadas (BENEZ, 2001 e TESSARI et al, 2002).

As carcaças das aves devem ser recolhidas rapidamente antes

que outras aves as biquem e jogadas em cova com cal ou cremadas (BENEZ,

2001). Os comedouros e os bebedouros devem ser limpos diariamente; os

ratos devem ser eliminados; a água deve ser tratada; e sempre que possível os

animais jovens devem ser criados separados dos adultos (CORRÊA e

CORRÊA, 1992). O uso de rações não contaminadas é outro importante fator a

ser considerado para a não contaminação das aves em um plantel (SOUZA et

al, 2002).

Em lotes com aves infectadas, alguns métodos de profilaxia são

considerados eficazes: abate de reprodutores contaminados, barreiras

sanitárias em relação à entrada de novos lotes, tratamento térmico dos

alimentos, utilização de probióticos, seleção de raças de aves geneticamente

resistentes a salmonelas, eventualmente vacinação e tratamento com

antibióticos (HUMBERT e SALVAT, 1997). O controle na produção de aves

deve ser realizado a partir de necropsias diagnósticas em todas as aves

mortas, cultura bacteriana de ovos cheios e mortos, cultura de fezes, evitar a

superpopulação, limpeza adequada, quarentena de aves que vieram de outros

locais ou que saíram para feiras e exposições, medicamentos de forma

estratégica (BENEZ, 2001).

A criação de animais domésticos com resistência aumentada para

salmonelose é uma alternativa atrativa, já que os métodos tradicionais de

controle aplicados geralmente possuem falhas. Nestes existem custos com o

uso de vacinas, problemas de saúde pública, pois os antibióticos utilizados

podem gerar cepas resistentes, ou medidas parcialmente efetivas, como o uso

de probióticos com a exclusão competitiva. Então, a criação de animais

resistentes, juntamente com a adoção de boas práticas de higiene é uma

opção mais fácil de ser adotada, pois apresentam baixo risco para controlar a

doença e a colonização pelas salmonelas. Sem dúvida, em várias espécies é

33

forte a correlação entre a resistência genética à salmonelose. A redução do

número de animais infectados e dos níveis de bactéria infectando os alimentos

dos animais é um importante fator na redução das zoonoses transmitidas pelos

alimentos de origem animal (WIGLEY, 2004).

As vacinas têm sido indicadas na redução da infecção por

Salmonelas em reprodutoras, mas não é utilizada em frangos de corte (ITO et

al, 2004). Apenas as matrizes podem ser vacinadas (somente contra a S.

Enteritidis), sendo vedado o uso em avoseiros, bisavoseiros e em reprodutoras

primárias (MAPA, 2003). Muitas vacinas inativadas são utilizadas contra as

salmoneloses e algumas vacinas vivas são disponíveis comercialmente. Faltam

dados referentes à eficácia de campo, embora testes laboratoriais indiquem

que seja útil seu uso (OIE, 2004).

6) Salmoneloses em humanos

Geralmente as salmoneloses são zoonoses, exceto aquelas

causadas por espécies adaptadas ao homem, como é o caso do sorotipo Typhi

(CORRÊA e CORRÊA, 1992), que é o agente da febre tifóide, e S. Newport, S.

Enteritidis e S. Typhimurium as mais associadas às infecções alimentares

(PINTO, 1996), sendo esta última a responsável pelos maiores incidentes

(CORRÊA e CORRÊA, 1992 e PINTO, 1996).

Comumente é descrita a presença de Salmonella na população e

no meio ambiente, dado o isolamento desse gênero bacteriano em vários tipos

de amostras e em diferentes localidades (FARIAS, 2000 e OIE, 2004). A

circulação de cepas de salmonelas resistentes a antibióticos oriundas de

animais ou do homem aumentam os riscos de disseminação e persistência

dessa zoonose (FARIAS, 2000).

34

Trabalhos como de MURUGKAR et al (2005) demonstram a

correlação entre casos humanos e em animais, já que neste estudo, os

mesmos sorovares isolados de casos humanos, também foram isolados de

animais (pássaros, suínos e bovinos).

Em muitos países, as zoonoses bacterianas de origem alimentar

são a causa mais freqüente de doenças intestinais no homem. Juntamente com

o gênero Campylobacter, as bactérias do gênero Salmonella são as

causadoras de mais de 90% dos casos registrados de toxinfecção alimentar de

origem bacteriana no mundo. As aves domésticas e os produtos da avicultura

são incriminados na maioria das doenças de origem alimentar causadas pelas

salmonelas (THORNS, 2000).

Em circunstâncias normais, os produtos alimentícios não contêm

bactérias pertencentes ao gênero Salmonella, portanto, quando encontradas

são consideradas como um perigo potencial para a saúde humana (SHARF,

1972). Do ponto de vista sanitário, a pesquisa de salmonelas nos vários

alimentos de origem animal é de grande importância, já que na maioria das

vezes, a contaminação humana se dá pelo consumo desses alimentos

contaminados (DE PAULA et al, 1974 e ROITMAM et al, 1987).

A ocorrência de surtos veiculados por alimentos originados da

suinocultura tem sido pequena, fato este que pode ser explicado pela utilização

de tratamento térmico adequado em carnes de frango e suína, enquanto que

os ovos são consumidos crus ou semi-crus (NADVORNY et al, 2004).

A maioria dos microorganismos para serem patogênicos ao

homem necessitam estar presentes sob a forma viável nos alimentos e são

relativamente sensíveis às altas temperaturas, sendo destruídos pelo

cozimento adequado dos alimentos ou pela sua pasteurização. As infecções

causadas por bactérias não esporuladas, como é o caso das salmonelas, se

enquadram neste caso (PINTO, 1996).

35

Os alimentos mais suscetíveis à contaminação por salmonelas

são as carnes frescas, principalmente carcaças de aves (PINTO, 1996;

ALMEIDA FILHO et al, 2003 e SCHLUNDT et al, 2004), o leite, os queijos e

chocolates (PINTO, 1996) e os ovos (ALMEIDA FILHO et al, 2003 e

SCHLUNDT et al, 2004).

Em humanos são descritas três principais formas de salmonelose:

febres entéricas, septicemia e enterocolite (CARTER, 1988 e LEVINSON e

JAWETZ, 1998). Os sintomas mais comuns são diarréias, vômitos, dores

abdominais e febre, que aparecem entre 12 e 36 horas após a ingestão do

alimento contaminado (PINTO, 1996).

6.1) Prevenção das toxinfecções alimentares O problema de salmonelose transmitida por alimentos de origem

avícola pode ser combatido principalmente em dois pontos: na granja, com

programas de prevenção e controle e na indústria com a adoção de boas

práticas de fabricação (NADVORNY et al, 2004). A total prevenção da

contaminação dos alimentos de origem aviária é praticamente impossível,

devido à ampla distribuição das salmonelas no ambiente e à existência de

portadores assintomáticos. Mas a adoção de medidas higiênico-sanitárias no

manuseio e preparo dos alimentos, o controle de rações para animais, a

higiene na criação, transporte e abate de animais contribuem para a redução

dos níveis de contaminação. Concomitantemente, devem ser adotadas

medidas como controle da temperatura, desidratação, acidificação, entre outras

que visem a evitar a intensa proliferação das salmonelas do processamento até

o produto final. Também seria interessante, quando possível, garantir a

destruição das salmonelas, por exemplo, se utilizando da pasteurização com

temperaturas na faixa de 60o a 75o C (ROITMAM et al, 1987).

36

NUNES et al (1995) analisaram 53 amostras de carcaças e cortes

de frangos em Goiânia/GO, sendo 13,20% das amostras positivas (7/53). Os

sorotipos isolados foram: S. Brandenburg, S. Typhimurium, S. Derby, S. Agona.

SANTOS et al (2000) pesquisaram a presença de Salmonella em

150 carcaças de frango congeladas, de quatro marcas comerciais obtidas no

comércio de Jaboticabal (SP). Foram isoladas salmonelas em 32% das

amostras(48/150), e as 48 amostras pertenciam a 11 sorotipos. Entre as

marcas houve diferença de positividade nas amostras, o que sugere que

existam grandes diferenças na qualidade dos programas de higiene das

granjas, incubatórios e abatedouros, e mesmo assim, todas as marcas estão

fora dos parâmetros desejados.

CARDOSO et al (2000) coletaram 120 amostras congeladas de

carcaças de frangos (peito, coxa, sobre-coxa, lingüiça e salsicha) em dois

abatedouros em Descalvado/SP. Todas as amostras estavam ausentes de

Salmonella.

BAÚ et al (2001) pesquisaram em Pelotas (RS) a presença de

salmonelas em 124 amostras de produtos de frango e foram encontradas

salmonelas em 10,5% das amostras (13/124). Dos 13 isolamentos, dez (77%)

foram tipificados como S. Enteritis, um (7,7%) como S. Anatum e dois (15,3%)

como S. enterica subespécie enterica sorovar 3,10:e, h:-.

ALMEIDA FILHO et al (2003) analisaram 20 amostras frescais e

20 inspecionadas de carcaças de frango, no total 18 (45%) estavam

contaminadas por salmonelas e não houve diferença estatística entre os dois

tipos de amostras.

37

6.2) Surtos de infecção alimentar

Em 2000, no Rio Grande do Sul, dos 99 relatórios finais de

investigação de surtos de doenças transmitidas por alimentos realizados pela

Secretaria de Saúde do Rio Grande do Sul, 74 foram devido às salmonelas.

Os alimentos preparados com ovos (como maionese caseira, tortas, mouses,

bolos, omeletes e salgadinhos em geral) estavam envolvidos em 72,2% dos

surtos de salmonelose e a carne de frango em 11,4%, de onde conclui-se que

83,6% dos surtos tiveram alimentos oriundos da cadeia avícola (NADVORNY et

al, 2004).

MURUGKAR et al (2005) analisaram 112 amostras de casos

humanos de diarréia na Índia e encontraram 23 (20,5%) de salmonelas, sendo

três sorovares identificados, S. Enteritidis (47,8%), S. Typhimurium (43,5%) e

S. Paratyphi B (8,7%).

7) Salmonelas em produtos de origem aviária

7.1) Contaminações em ovos

Embora sejam considerados relativamente livres de bactérias em

comparação a outros alimentos, os ovos são apontados como veiculadores de

muitas bactérias, principalmente as do gênero Salmonella, o que provoca

surtos de toxinfecções alimentares (ANDRADE et al, 2004). No Brasil, a

maioria dos ovos comerciais é produzida por galinhas mantidas em gaiolas,

enquanto uma pequena parte provém de ovos de descarte de incubatórios que

são produzidos por matrizes em ninhos com cama de maravalha. Parte desses

ovos, oriundos de reprodutoras, apresenta defeitos na casca que facilitam a

passagem de salmonelas da superfície para as estruturas internas, o que

aumenta o risco de contaminação. Os ovos também podem se contaminar via

38

transovariana, onde a contaminação ocorre na gema e, portanto, os processos

de desinfecção dos ovos não são eficientes (OLIVEIRA e SILVA, 2000). A

contaminação dos ovos pode ocorrer logo após a postura, quando estes

entram em contato com material fecal, cama, ninhos e/ou gaiolas contaminados

(SOUZA et al, 2002).

OLIVEIRA e SILVA (2000) analisaram 1240 ovos comerciais de

galinhas em Campinas (SP). Foram isoladas salmonelas na casca de 12

(9,6%) e na gema de quatro (3,2%). O único sorovar identificado foi a

Salmonella Enteritidis.

BAÚ et al (2001) analisaram 564 ovos em Pelotas/RS. As

amostras de superfície (casca) e conteúdo (clara e gema) não apresentaram

contaminação por salmonelas.

Em Goiânia/GO, ANDRADE et al (2004) analisaram 816 ovos de

galinha, sendo 336 ovos em granjas de postura, 195 ovos em supermercados,

165 ovos em feiras livres e 120 ovos em pequenos postos de venda

(mercearias); provenientes de granjas comerciais e também de pequenas

propriedades que comercializavam ovos "caipiras". 27,68% dos ovos de

granjas foram positivos para a salmonela, 35,38% dos ovos de supermercados,

58,18% dos ovos de feiras livres e 60% dos ovos de mercearias; sendo a

média de contaminação 40,44%.

ZANATTA et al (2003) analisaram 77 lotes de aves reprodutoras

utilizando suabes cloacais e ovos bicados, sendo que 13 lotes (16,88%)

apresentaram-se positivos, sendo 11 em suabes de cloaca e dois em amostras

de ovos bicados, apenas um lote foi positivo para suabes e ovos bicados. Os

sorotipos isolados foram Salmonella Heidelberg (sete lotes), S. Enteritidis

(quatro lotes) e Salmonella sp (dois lotes). Esses resultados demonstram a

importância do monitoramento bacteriológico nas aves reprodutoras, pois todos

os lotes examinados estavam bem clinicamente.

39

Material e Métodos 1) Método de amostragem

Considerando que não havia registros prévios de salmonelose na

população de aves Gallus gallus de criações não tecnificadas do DF, a

amostragem foi delineada pensando em dois resultados possíveis. Se não

fosse encontrada nenhuma amostra positiva seria possível demonstrar com um

grau de confiança pré-determinado que a doença estaria ausente daquele tipo

de sistema de criação, ou que apenas poderia estar presente com prevalência

inferior ao limiar de detecção da amostragem. Se fossem detectadas aves

positivas, a presença da infecção estaria confirmada, acima do limiar de

detecção da amostragem e seria calculado o intervalo de confiança do valor de

prevalência estimado.

Assim sendo, estabeleceu-se que se a população alvo estivesse

infectada, a prevalência de aves infectadas seria igual ou superior a 1,0%.

Este limiar de detecção é justificado pelo alto poder de difusão da salmonela.

Considerando esta premissa, a amostragem de 300 aves permitiria encontrar

pelo menos uma ave infectada, com probabilidade, ou grau de confiança, de

95% (NOORDHUIZEN et al, 1997 e CANNON, 2001) considerando uma

população total que tende para infinito (e.x. 30.000).

Como a sensibilidade do teste não é perfeita, ou seja, de 100%,

tornou-se necessário recalcular o limiar de prevalência detectável pela

amostragem. Como não foi encontrado na literatura o valor da sensibilidade do

teste utilizado e assumindo um valor conservador de 70%, seria possível com a

amostragem de 300 aves detectar a doença com grau de confiança de 95%, se

a sua prevalência mínima fosse de aproximadamente 1,5%, de acordo com a

fórmula de NOORDHUIZEN et al (1997) e CANNON (2001):

40

( )( ) ( )( )[ ]Se

SeDNn

D 12111 /1 −−−−

≅α

Onde:

n = tamanho da amostra

α= grau de confiança = 0,95

N = número de unidades animais em risco (total da população) = 30.000

D = número de unidades animais com doença/infecção = 450 ou 1,5%

Se = sensibilidade do teste = 0,7

Considerando estes parâmetros de amostragem, o tamanho da

amostra (n) seria de 283 aves. Assim, a amostragem de 300 aves permitiria

evitar possíveis perdas amostrais, sempre possíveis durante o trabalho de

campo ou mesmo no laboratório. As coletas foram realizadas entre julho e

setembro de 2005, em diferentes áreas do Distrito Federal (DF), totalizando 12

áreas: Alexandre de Gusmão, Brazlândia, Ceilândia, Gama, Jardim, PAD/DF,

Paranoá, Planaltina, Rio Preto, São Sebastião, Sobradinho e Taquara; algumas

regiões foram excluídas da amostragem, como é o caso de Vargem Bonita e

Parque Nacional (por se tratarem de áreas de preservação ambiental e que,

portanto, não permitem a criação de aves), e Pipiripau e Tabatinga (por se

tratarem de áreas de cultivo intensivo de hortaliças, que, dessa forma,

praticamente não possuem criação de aves). Em cada área foram amostradas

cinco unidades de criação e cinco aves em cada uma destas, num total de 300

aves adultas amostradas. Em cada uma das áreas amostradas existe um

escritório da EMATER, que forneceu um técnico para acompanhar as coletas.

Devido à falta de informações sobre todos os criadores de galinhas de criações

não tecnificadas, as unidades de criação não foram sorteadas por um processo

aleatório formal. No entanto, a sua escolha não foi direcionada nem sujeita a

qualquer viés de seleção, pois nenhuma foi escolhida por algum motivo

especial (exemplo: suspeita de que houvesse ou não a presença da bactéria

pesquisada). Devido à impossibilidade de numerar todas as aves nas unidades

de criação, já que muitas vezes nem os proprietários sabem quantas aves

possuem, as aves amostradas foram as que primeiro foram pegas, sem

41

qualquer critério de seleção. Vale ressaltar que apenas aves adultas foram

amostradas, já que nem todas as propriedades possuíam pintinhos.

2) Análise laboratorial

A metodologia utilizada foi a recomendada pelo Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA (1995) com algumas

modificações. De cada ave foi coletado um suabe de cloaca; cada suabe era

colocado em um tubo contendo o meio de transporte Stuart (Oxoid) até a

chegada das amostras ao laboratório de microbiologia. O meio de transporte

Stuart (Oxoid) utilizado para o transporte das amostras apresenta a seguinte

composição: glicerofosfato de sódio (10,0 gramas/litro ou g/l), tioglicolato de

sódio (0,5 g/l), cisteína hidroclorada (0,5 g/l), cloreto de cálcio (0,1 g/l), azul de

metileno (0,001 g/l) e ágar (5,0 g/l). O pH do meio é 7,4 ± 0,2. No preparo do

meio foi adicionado 16 gramas para cada um litro de água destilada; após o

preparo, os tubos contendo cinco mililitros de meio Stuart (Oxoid) foram

autoclavados a 121o C por 15 minutos. Na pesagem dos meios foi utilizada

balança analítica Marte, na medição de pH, o pHmêtro VWR Scientific, na

incubação a estufa 37o C Quimis e na esterilização dos meios, o autoclave

Phoenix.

Após a chegada, os suabes eram repassados para tubos

individuais de Rappaport Vassiliadis (Acumedia) e ficavam incubados na

estufa de 37o C por aproximadamente 48 horas. Cada litro de Rappaport-

Vassiliadis (Acumedia) foi preparado da seguinte maneira: caseína

enzimática (4,54 gramas), cloreto de sódio (7,20 gramas), fosfato

dihidrogenado de potássio (1,45 gramas), cloreto de magnésio anidro (13,4

gramas), verde malaquita oxalato (0,036 grama). O pH é de 5,1 ± 0,2; e para

cada 26,6 gramas de meio foi adicionado um litro de água destilada. Em cada

42

tubo foram colocados cinco mililitros e posteriormente foram autoclavados a

116o C por 15 minutos.

Foto 1: Rappaport-Vassiliadis; à direita, o meio antes de ser incubado

com o suabe cloacal, os demais foram incubados por 48 horas a 37o C.

Depois, eram repicados no ágar MacConkey (Acumedia) e

permaneciam na estufa 37o C por 24 horas.

Foto 2: ágar MacConkey; colônias de bactérias que consomem a lactose

(róseas) e algumas colônias não consumidoras de lactose (transparentes a beges).

O ágar MacConkey (Acumedia) que foi utilizado no

plaqueamento era composto de: ágar (13,5 g/l), cloreto de sódio (5,0 g/l), cristal

43

violeta (0,001 g/l), lactose (10,0 g/l), peptona de carne (1,5 g/l), peptona de

caseína (1,5 g/l), peptona de gelatina (17,0 g/l), sais biliares (1,5 g/l), vermelho

neutro (0,03 g/l). O pH final tinha o valor de 7,1 ± 0,2 a 25 o C; para cada litro

de água destilada são adicionados 50 gramas do meio, posteriormente

autoclavado a 121o C por 15 minutos e depois foi transferido para as placas

dentro da capela de fluxo laminar. Em cada placa de 7,5 centímetros de

diâmetro são distribuídos 15 ml e nas placas de 9,0 centímetros de diâmetro

(placas que podiam ser divididas e plaquear dois materiais diferentes) foram

colocados 20 ml do meio.

O ágar MacConkey possui a lactose como açúcar fermentável,

portanto bactérias que fermentam a lactose possuem colônias rosas no meio,

enquanto que as não fermentadoras de lactose atacam a peptona (fonte de

nitrogênio), resultando metabólitos alcalinos e ficam transparentes ou cor palha

(QUINN et al, 1994). Como inibidores de outros microorganismos, possui sais

biliares e cristal violeta (BIER, 1976 e QUINN et al, 1994).

Após esse período, as colônias típicas de salmonela eram

repicadas no ágar tríplice açúcar ferro ou TSI (Merck). Para o preparo deste

meio foram adicionados 65 gramas em um litro de água destilada; a

composição por litro era a seguinte: peptona de caseína (15,0 g/l), peptona de

carne (5,0 g/l), extrato de carne (3,0 g/l), extrato de levedura (3,0 g/l), cloreto de

sódio (5,0 g/l), lactose (10,0 g/l), sacarose (10,0 g/l), D-glicose (1,0 g/l), citrato

de amônio e ferro III (0,5 g/l), tiossulfato sódico (0,5 g/l), vermelho de fenol

(0,024 g/l) e ágar (12,0 g/l). O pH final deve ficar em 7,4 ± 0,2 a 25o C e em

cada tubo foram distribuídos três mililitros, posteriormente autoclavados a 121o

C por 15 minutos.

44

Foto 3: TSI; meios de coloração negra indicam a produção de H2S (os

dois tubos mais à esquerda), produção de gás (os três tubos mais à direita), dos resultados possíveis para as salmonelas estão os três tubos mais à esquerda.

O princípio do TSI é a fermentação da glicose, da lactose e da

sacarose, bem como a produção de sulfeto de hidrogênio ou H2S (ANVISA,

2004). Em meio contendo peptona, as bactérias reduzem o enxofre por

hidrogenação, com a produção de H2S que se liga aos íons férricos e formam o

sulfato ferroso em precipitado negro insolúvel (OLIVEIRA, 2000). Se a bactéria

fermenta apenas a glicose, ocorre reação ácida no fundo do tubo, dando cor

amarela e reação alcalina na superfície de cor vermelha; no entanto, se a

bactéria fermenta a glicose e a lactose e/ou a sacarose (dois ou três açúcares),

acontece uma reação ácida em todo o meio, ficando todo ele amarelo

(ANVISA, 2004). A produção de gás é evidenciada com o acúmulo deste no

fundo do tubo e a produção de H2S torna o meio enegrecido. Se não ocorre a

fermentação dos açúcares, a cor do meio permanece inalterada, ou seja,

vermelha (OLIVEIRA, 2000).

Dos resultados possíveis do TSI, os característicos para

salmonelas eram repassados para três testes: fenilalanina (Micromed),

vermelho de metila/Vogues Proskaeur ou VM/VP (Merck) e indol - preparado

de acordo com OLIVEIRA (2000), da seguinte maneira: 0,5 gramas de cloreto

de sódio (Dinâmica), 1,0 grama de L-triptofano (Vetec), 1,5 gramas de

neopeptona (Difco) e 100 mililitros de água destilada.

45

O ágar fenilalanina (Micromed) é preparado adicionando-se 26

gramas do meio em um litro de água destilada. Cada litro era composto por: L-

fenilalanina (2,0 g), cloreto de sódio (5,0 g), fosfato dissódico (1,0g), ágar (15,0

g) e extrato de levedura (3,0 g). O pH a 25o C ficou em 7,0 ± 0,2. Para

preparar o meio foi necessário adicionar 26 gramas em um litro de água

destilada. Em cada tubo foram colocados três mililitros, que posteriormente são

autoclavados a 121o C por 15 minutos. Segundo OLIVEIRA (2000), esse ágar

analisa a propriedade de algumas bactérias transformarem felilalanina em

ácido fenilpirúvico, que é uma característica do gênero Proteus. Após a

incubação em estufa a 37o C por cerca de 18 a 24 horas, foi necessário pingar

0,2 mililitros de cloreto férrico a 10% (Vetec) sobre o cultivo, se a cor mudava

para verde, indicaria positividade.

Foto 4: ágar fenilalanina; resultado verde (à esquerda) indica

positividade.

O meio VM/VP (Merck) tinha a seguinte composição em cada

litro: peptona de carne (7,0 g), D-glicose (5,0 g) e tampão fosfato (5,0 g).

Foram colocados 17 gramas do meio em um litro de água destilada, com pH

final de 6,9 ± 0,2 a 25o C. Em cada tubo foram colocados três mililitros do

preparo e autoclavados a 121o C por 15 minutos. De acordo com OLIVEIRA

(2000), o teste é baseado no indicador VM para determinação do pH se a

46

bactéria fermenta a glicose, sendo que todos os membros da família

Enterobacteriaceae o fazem. Neste caldo, após 18 a 24 horas, ocorre a

produção de metabólitos ácidos, devido à fermentação. Para a leitura do teste

VM, foi necessário pingar duas a três gotas da seguinte solução, que era assim

preparada: 0,1 g de vermelho de metila, 300 ml de álcool etílico a 95% e

completar até 500 ml com água destilada. Se for positivo seria observada uma

coloração vermelha, se for negativo, cor amarela. O VP mede a produção de

acetilmetilcarbinol oriundo da fermentação da glicose; para realizar o teste,

basta após a execução do teste VM, no mesmo tubo adicionar 0,6 ml de

solução alfa-naftol a 5% (Vetec) e 0,2 ml de solução aquosa de KOH a 40%.

Na medição das soluções a serem adicionadas ao teste, foram utilizadas

micropipetas de 2,0 ml da Pipetman.

Foto 5: VM/VP; teste do VM, positivo (à esquerda) e negativo (à direita).

O indol é resultante da degradação do triptofano por certas

bactérias, que com a adição dos reagentes, produz coloração avermelhada.

Primeiramente é adicionado um mililitro de xilol e, posteriormente, 0,5 ml de

Reativo de Erlich (fórmula: 1,0 g dep-dimetilaminobenzaldeído, 95,0 ml de

álcool etílico absoluto e 20,0 ml de ácido clorídrico concentrado) nas paredes

do tubo. Se for positivo, haverá a formação de um “anel” vermelho debaixo do

indol acumulado pelo xilol; reação negativa tem o “anel” incolor (OLIVEIRA,

2000).

47

Foto 6: indol; à esquerda, resultado positivo e à direita, negativo.

Segundo o MAPA (1995), as salmonelas são negativas para a

fenilalanina, para o indol e para o VP, e são positivas para o VM.

Apenas as amostras com resultados negativos na fenilalanina,

indol e VP, e positivo para o VM eram repassados para os outros bioquímicos:

arginina (Merck), citrato de Simmons (Bencton Dickinson), glicose

(Sigma), lactose (Merck), lisina (Isofar), malonato (Merck), manitol

(Inlab), motilidade - meio motilium (Difco), ornitina (Sigma), sacarose

(Sigma), salicina (Difco) e sorbitol (Vetec). Os resultados para esses

testes variam de acordo com os diferentes sorotipos de Salmonella, sendo

utilizado para a interpretação dos resultados, o preconizado por MAPA (1995) e

por OLIVEIRA (2000). Nesta fase também eram utilizados os anti-soros

Salmonella polivalente e somático (Probac).

Os açúcares, ou seja, glicose, lactose, manitol, sacarose, salicina

e sorbitol tem todos a mesma base para açúcares, preparada de acordo com

OLIVEIRA (2000):

__10,0 g de peptona, sendo utilizada a neopeptona (Difco),

__1,0 g de extrato de carne (Oxoid),

48

__5,0 g de cloreto de sódio (Dinâmica),

__0,018 g de indicador de Andrade, que tem a seguinte composição: 5,0 g de

fucsina ácida (Quimibrás), 150 ml de hidróxido de sódio (Vetec ou

Dinâmica) e 1000 ml de água destilada,

__1000 ml de água destilada,

__o açúcar foi adicionado na proporção de 1% a esta solução acima descrita,

exceto a salicina na proporção de 0,5%.

Em cada tubo foram colocados três mililitros do preparado e um tubo de

Durham invertido, depois autoclavados a 121o C por 15 minutos. Depois de

inoculada a amostra da bactéria, o meio permanecia na estufa 37o C por 18 a

24 horas. O meio tem coloração rosa clara, e no caso de um resultado positivo,

tem cor rosa mais escuro que o original.

Foto 7: salicina (açúcar); à esquerda, positivo, à direita, negativo.

A composição do Citrato de Simmons (Bencton Dickinson)

utilizado foi: fosfato dihidrogenado de amônio (1,0 g/l), fosfato dipotássico (1,0

g/l), cloreto de sódio (5,0 g/l), citrato de sódio (2,0 g/l), sulfato de magnésio (0,2

g/l), ágar (15,0 g/l) e azul de bromotimol (0,08 g/l). Para cada litro de água

destilada, adicionaram-se 24,2 gramas do ágar Citrato de Simmons (Bencton

Dickinson). O pH deveria ficar em 6,9 ± 0,2 e depois de colocar cerca de três

49

mililitros do meio em cada tubo, estes foram autoclavados por 15 minutos a

121o C. As bactérias que conseguem utilizar o citrato como fonte única de

carbono crescem neste meio, alterando a cor original que é verde, para o azul.

Foto 8: citrato de Simmons; à esquerda, resultado positivo, os demais são negativos (cor original do meio permanece inalterada).

Para o preparo dos aminoácidos arginina, lisina e ornitina foi

utilizada a mesma base, preparada de acordo com MERCK: 5,0 g/l de peptona

de carne (Vetec), 3,0 g/l de extrato de levedura (Difco), 1,0 g/l de glicose

(Sigma), 0,016 g/l de púrpura de bromocresol (BDH Chemicals) e

completada com água destilada para um litro. Posteriormente, com esta base

pronta, cada aminoácido era colocado na proporção de 1% (exemplo: para o

preparo da arginina, era adicionado 1% da mesma à base). O pH deveria ficar

ajustado em 6,7 ± 0,2. Em cada tubo foram colocados três mililitros do meio;

depois esterilizados a 121o C por 15 minutos. Segundo OLIVEIRA (2000), após

a inoculação das bactérias nos tubos, estes devem ter parafina (no caso deste

trabalho foi utilizado óleo) e ficar incubado por quatro dias. O meio muda de cor

para o amarelo (inicialmente são violetas) devido à produção de ácido oriundo

do consumo de glicose. Se ocorre a descarboxilação (pelo consumo do

aminoácido), posteriormente o meio se torna novamente violeta. Para cada

aminoácido testado, deve se ter o controle (que tem apenas a base comum

para os aminoácidos) que sempre fica amarelo.

50

Foto 9: arginina (aminoácido); à esquerda, resultado positivo, à direita, resultado negativo e no meio, cor original do meio.

O protocolo utilizado para o preparo do malonato foi o mesmo

seguido por OLIVEIRA (2000), como a seguir: extrato de levedura (1,0 g),

sulfato de amônio (2,0 g), fosfato duplo de potássio (0,6 g), fosfato

monopotássico (0,4 g), cloreto de sódio (2,0 g), malonato de sódio (3,0 g),

glicose (0,25 g), azul de bromotimol (0,025 g) e água destilada (1000 ml). O pH

deveria ficar entorno de 6,7. Em cada tubo foram colocados três mililitros do

preparado, posteriormente autoclavados a 121o C por 15 minutos. O meio fica

incubado a 37o C por 24 horas. Segundo a ANVISA (2004), este teste serve

para verificar se um microorganismo consegue utilizar o malonato de sódio

como única fonte de carbono, o que gera a alcalinização do meio. A

interpretação do teste: se for positivo, fica azul, se for negativo, fica verde (cor

do meio preparado).

51

Foto 10: malonato; positivo (à esquerda), negativo (à direita).

A finalidade do teste de motilidade é observar se a bactéria é

móvel ou não. Para isso, inocula-se verticalmente a bactéria com o uso de um

fio bacteriológico, perfurando lentamente o meio. Dessa forma, os

microorganismos móveis migram pela linha do inoculado e geram turvamento

do meio, enquanto que os imóveis crescem apenas na linha do inoculado, o

restante do meio permanece inalterado ou límpido (ANVISA, 2004). O meio

utilizado para observar a motilidade foi o Motilium (Difco) que é composto de:

bactotriptose (10,0 g/l), cloreto de sódio (5,0 g/l) e ágar bacteriológico (5,0 g/l).

Para o preparo foi necessário adicionar 20 gramas em um litro de água

destilada, o pH deveria ficar em 7,2 ± 0,2 e deve-se distribuir três mililitros em

cada tubo; posteriormente, autoclavar por 15 minutos a 121o C. O meio

inoculado deveria permanecer por 18 a 24 horas em estufa a 37oC.

52

2.1) Resumo do esquema utilizado no trabalho

Suabe cloacal coletado e transportado em meio de transporte Stuart

Rappaport-Vassiliadis (24-48 horas a 37o C)

MacConkey (18-24 horas a 37o C)

Colônias Típicas de Salmonella Colônias Não-Típicas de Salmonella

NÃO é SALMONELLA

TSI (18 a 24 horas a 37o C) resultados não típicos

de Salmonella

Resultados típicos de Salmonella

Tipificação na Fundação Indol, Fenilalanina e VM/VP Oswaldo Cruz

Resultados típicos de Salmonella

Muitos resultados Demais Testes bioquímicos e Compatíveis Anti-soro Salmonella polivalente flagelar e somático p/ Salmonella

53

Resultados e Discussão

Das 300 amostras de suabes cloacais analisadas, nenhuma foi

positiva para o gênero Salmonella. Este resultado permite demonstrar, com

grau de confiança de 95%, que a salmonelose está ausente das criações de

aves não tecnificadas no DF, considerando um limiar de prevalência detectável

de 1,5%. Podemos então considerar que a salmonelose ou não está presente

ou circula neste tipo de criação com prevalência muito baixa.

Devido ao fato de não ter sido encontrada nenhuma salmonela,

não foi possível realizar os outros dois objetivos do trabalho, ou seja, tipificação

das salmonelas no Instituto Oswaldo Cruz no Rio de Janeiro/RJ e verificação

da sensibilidade a diferentes antibióticos através da realização de

antibiogramas. Desde 1985, houve um aumento na incidência de salmonelose

em muitos países. No entanto, desde a década de 90 em vários países, a

incidência de salmoneloses tem diminuído devido à implementação de medidas

de controle, incluindo maior consciência pública do risco da doença

(SCHLUNDT et al, 2004).

Os resultados encontrados neste trabalho são compatíveis com o

único trabalho encontrado na literatura com isolamento de salmonelas em

galinhas caipiras que é o trabalho de PEREIRA e SILVA (2005) no qual

analisaram 44 suabes cloacais, em nove propriedades rurais de galinhas

caipiras em Uberlândia (MG), tendo isolado Salmonella sp em apenas uma

ave. Neste trabalho, os autores utilizam a metodologia preconizada pelo MAPA

(1995) através da Portaria 126 de 03/11/95, mas como essa portaria permite

uma certa “escolha” de meios e temperaturas de incubação, fica vago apenas

citá-la, sem descrever sucintamente como foi realizado o procedimento

laboratorial.

54

Em aves comerciais, geralmente a prevalência encontrada é

maior do que a encontrada por PEREIRA e SILVA (2005), tal como o trabalho

de ZANATTA et al (2003) que analisaram 77 lotes de aves reprodutoras

utilizando suabes cloacais e dos quais 11 lotes (14,28%) apresentaram-se

positivos. ANDRADE et al (1995) analisaram 1304 suabes cloacais de aves de

postura comercial, tendo encontrado prevalência de Salmonella de 3,98%

(34/854) nas granjas que não tinham histórico de problemas sanitários,

enquanto que nas granjas com problemas sanitários a prevalência foi de

11,33% (51/450) e a média das amostras foi de 6,51% (85/1304). Em outras

aves, como no trabalho de MURUGKAR et al (2005) onde foram pesquisados

231 suabes cloacais de pássaros na Índia, foram encontrados 34 positivos

(14,7%) e no trabalho de HOFER et al (1997), onde analisaram no período de

1962 a 1991, 2210 amostras suspeitas de Salmonella em diversas aves

doentes e portadoras, em diversas regiões do país. Dessas amostras, 2123 ou

96,06% foram positivas, sendo 1756 (82,71%) em Gallus gallus, com maior

predominância em animais jovens; dessas 2123 amostras positivas, seis ou

0,28% foram no Distrito Federal, enquanto Santa Catarina contribuiu com 1032

ou 48,61% das amostras. Dentre os materiais enviados para análise, estavam

sangue, vísceras como coração, fígado e pulmão, material encefálico, saco de

gema, ovário, oviduto, vesícula biliar e medula de ossos longos. Nestes dois

últimos trabalhos, as prevalências encontradas (14,7% e 96,06%) podem ser

explicadas pelo fato de que as aves amostradas já estavam doentes, o que

aumenta muito a probabilidade de que as aves pudessem estar com

salmonelas. Em todos esses trabalhos, as prevalências encontradas foram

superiores às de PEREIRA e SILVA (2005) e da presente pesquisa. O presente

estudo reforça a evidência de que a prevalência de salmonela em aves criadas

“soltas” é menor do que a de aves comercias, que são criadas confinadas.

No trabalho de GAMBIRAGI et al (2003) foram pesquisadas 300

amostras de sangue pela técnica de soroaglutinação rápida em placa (SAR) e

300 suabes cloacais pela técnica de isolamento bacteriano, de pintos de corte

de um dia de três empresas localizadas em Fortaleza/CE. Utilizando-se a

técnica de soroaglutinação rápida em placa (SAR) foram detectadas 100

55

amostras positivas (33,3%) e através do isolamento bacteriano nenhuma

amostra foi positiva, portanto resultando em 100% de negatividade, resultado

que está de acordo com o encontrado no presente trabalho. O fato de não

serem encontradas aves positivas no isolamento bacteriano, mas existirem

aves positivas no SAR demonstra que nem sempre aves que são positivas

neste teste possuem anticorpos para salmonelas (teste não é 100%

específico). Já no trabalho de BUCHALA (2003), onde foram pesquisados 406

soros de aves caipiras provenientes de 15 criações localizadas próximas a três

matrizeiros de São Paulo, com status sanitário oficial de livres de salmoneloses

e micoplasmoses, foi observado 16,5% (67 aves) de positividade para a S.

Pullorum através da técnica de soroaglutinação em placa. O intervalo de

confiança foi de 95% (12,9% - 20,1%). Por este trabalho, pode-se concluir que

as aves têm contato com o agente etiológico da pulorose, mas não é possível

afirmar que elas sejam portadoras dele, pois não foi realizado nenhum teste

microbiológico para isolamento da salmonela. Segundo PEREIRA e SILVA

(2005), a sorologia não possui valor diagnóstico definitivo para as

salmoneloses, apenas detecta animais que tiveram contato com essa bactéria.

Na pesquisa de GAMA (2001), foram realizadas análises

microbiológicas em mecônio de caixas de transporte de 12 lotes (614 caixas)

de pintinhos de reposição de empresas de produção de ovos de São Paulo.

Foram escolhidos quatro lotes positivos e um negativo para serem

acompanhados até a 52a semana de idade (analisados no primeiro dia de vida,

primeira semana e depois a cada três ou quatro semanas), quando foram

também analisados os ovos. Dos 12 lotes examinados, quatro foram positivos

(129 caixas). Nos lotes positivos no primeiro dia de vida, as amostras de fezes

na primeira semana também foram positivas; depois desse período, houve

variação: o lote 1 foi positivo para salmonelas nas semanas 11, 34 e 42; o lote

2 teve amostras positivas na semana 4 e 11, permanecendo negativo até o

final do experimento; o lote três permaneceu positivo até o final do

experimento, enquanto que o lote 4 ficou negativo desde a quarta semana e o

lote negativo acompanhado, sempre foi negativo. Na 52a semana, foram

analisados 500 ovos de cada lote: o lote 1 teve um positivo (0,2%), o lote 3 teve

56

10 (2,0%) positivos e os demais lotes (2, 4 e 5) foram negativos. Esses

resultados demonstram que, com o passar da idade, aves antes positivas,

podem se tornar negativas.

A menor prevalência de Salmonella encontrada em aves de fundo

de quintal e caipiras pode ser explicada pelo fato que essas aves são criadas

em um espaço maior do que aves comercias (poedeiras e frangos de corte),

onde nessas criações, uma ave infectada dissemina muito rapidamente a

bactéria para as demais, pois são criadas mais de dez aves por metro

quadrado, portanto, as fezes de uma ave contaminada entram em contato com

água, rações e cama, sendo fonte de contaminação para as demais aves.

Outra explicação para o resultado encontrado no presente estudo,

é que as bactérias que colonizam o intestino no início da vida das aves

persistem com o passar do tempo, integradas à microbiota intestinal (FURLAN

et al, 2004). Se nas primeiras semanas de vida, ocorrer um atraso do

desenvolvimento da microbiota intestinal, as galinhas estarão muito sensíveis a

infecções por salmonelas. Antes de serem introduzidos os sistemas de

produção intensivos, os pintinhos recém-eclodidos adquiriam uma variedade

completa de bactérias intestinais durante os primeiros dias de vida e bicando

fezes de aves adultas (SCHNEITZ, 2005). Essa grande variedade de bactérias

intestinais inibe o crescimento de bactérias patogênicas (FURLAN et al, 2004),

que é o caso das salmonelas. Hoje, no entanto, o desenvolvimento da flora

intestinal em aves comerciais está notavelmente atrasado, já que o contato

entre as gerações foi "cortado". Isso deixa as ninhadas vulneráveis à salmonela

e a outros enteropatógenos (SCHNEITZ, 2005). Portanto, no caso de galinhas

de fundo de quintal em que aves de todas as idades são criadas no mesmo

ambiente, espera-se que essas galinhas estejam menos vulneráveis a infecção

por salmonelas.

Pelo princípio da exclusão competitiva, dois microorganismos não

podem ocupar simultaneamente o mesmo lugar, ou seja, duas bactérias que

“pretendem” ocupar o mesmo sítio, excluem uma a outra, pois quando uma o

57

está ocupando, a outra não poderia estar (FIORENTIN, 2000). Dessa forma,

pode-se concluir que a microbiota intestinal normal de um animal impeça a

colonização por outras bactérias que não são normais do intestino (como é o

caso das salmonelas), por já estarem ocupando a mucosa intestinal

fisicamente e também por produzirem substâncias que inibem a adesão e o

crescimento de outras bactérias. Portanto, para ocorrer a colonização por

salmonelas, seria necessário ocorrer uma falha nesse mecanismo. Segundo

UGA (2002), isso poderia ser causado por alterações na homeostase

bacteriana normal, causada por mudanças bruscas na alimentação dos

animais, uso de antibióticos, dano epitelial e por altas doses de bactérias

infectantes. Analisando essas possibilidades, as aves amostradas neste

estudo, além de terem uma alteração nessa microbiota normal, ainda teriam

que ter a bactéria presente no ambiente. Dessa forma, espera-se que as

galinhas criadas livremente (sem confinamento) não sofram um estresse

constante, e portanto, estejam mais resistentes a infecções entéricas (e logo

por salmonelas) e outras doenças, que também poderiam deixar as aves mais

suscetíveis a salmoneloses.

As farinhas de origem animal utilizadas na alimentação das aves

são uma importante fonte de salmonelas para esses animais (SILVA et al, 2000

e GABIS, 1991 apud SOUZA et al, 2002). No caso das aves amostradas,

poucas unidades de criação (não é possível precisar o número exato)

alimentam esses animais com rações.

Outro fato que pode explicar o resultado encontrado é o fato de

apenas galinhas adultas (mas de idades indefinidas) terem sido amostradas.

Embora possam ocorrer em aves de qualquer idade, as salmonelas paratíficas

e a S. Pullorum geralmente acometem aves jovens (pintinhos). A única

salmonela que ocorre mais freqüentemente em aves adultas é a S. Gallinarum.

Neste trabalho foram amostradas apenas aves adultas devido ao fato de que,

nem todas as propriedades possuíam pintinhos.

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No caso da S. Pullorum e da S. Gallinarum onde existe alta

mortalidade entre as aves é mais difícil detectar a presença do agente, pois as

aves positivas geralmente morrem. No caso das salmonelas paratíficas, onde

muitas vezes as aves podem não apresentar nenhum sinal clínico é mais fácil o

isolamento da bactéria.

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Conclusões O presente estudo permite estimar, com grau de confiança de

95%, que a salmonelose está ausente das criações de aves não tecnificadas

do DF, ou que estando presente a sua prevalência seria inferior ao limiar de

detecção da amostra, ou seja, 1,5%. Em ambos os casos, esta situação

epidemiológica deve estar associada a: ausência da bactéria no ambiente onde

as aves amostradas vivem ou a maior resistência dessas aves à infecção por

salmonelas.

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