Hemoglobinúria Paroxística NoturnaDi ó ti T t tDiagnóstico e Tratamento

» Dra. Nydia Strachman Bacal» Hematologista e Patologista Clínica» MBA em Economia e Gestão na Saúde

Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista ClínicaHematologista e Patologista Clínica

Hemoglobinúria Paroxística NoturnagDiagnóstico por Citometria de Fluxo

• Doença HPN• HAM x Citometria de Fluxo• Antígenos envolvidos• Tamanhos de clones HPN na HPN• Clones HPN em falência medular (Anemia Aplástica)

Clones HPN em Desordens medulares: MDS(Anemia Refratária), Mielopatias (Mielofibrose/ LMC)

• Experiência do HIAE e Conclusão

A Doença: Hemoglobinúria P í i NParoxística Noturna

• Expansão clonal adquirida não maligna de• Expansão clonal adquirida, não maligna de células-tronco hematopoéticas

• Hemoglobinúria noturna icterícia hemosiderinúria• Hemoglobinúria noturna, icterícia, hemosiderinúria• Mutação somática adquirida do gene PIG-A• Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de• Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de

proteínas de superfície• Para diagnóstico os antígenos mais estudados são:• Para diagnóstico os antígenos mais estudados são:

CD55 e CD59 , ambas proteínas inibidoras do complemento e, associadas à patogênese da p , p gdoença clínica.

A Doença: Hemoglobinúria Paroxística NoturnaParoxística Noturna

• Anemia Hemolítica / Trombose e Pancitopenia p• Prevalência: < 1/100.000 (rara)• Sobrevida: 10 a 15 anos • Morte: trombose ou citopenias progressivas• Morte: trombose ou citopenias progressivas

raramente transformação leucêmica (<5%)• Muitos pacientes apresentam hemólise intermitente e

alguns evoluem para remissão espontâneaalguns evoluem para remissão espontânea. • Hemólise intravascular crônica com exacerbações. • Necessidade transfusional e muitas vezes, deficiência de

fferro.• A trombose apresenta predileção pelas veias hepáticas

(S.Budd Chiari). • Pacientes com AA e evidencias laboratoriais de HPN tem

menor probabilidade de trombose.

Quadro laboratorial• Sangue Periférico

– Anemia, Reticulocitosee a, e cu oc ose– Leucopenia e granulocitopenia– Deficiência de ferroDeficiência de ferro

• Medula ósseahiperplasia eritróide– hiperplasia eritróide

– aplasiaU i• Urina – Hemoglobinúria– Hemossiderinúria

Teste de HAMGV com HPN são susceptíveis à lise com complemento

37°C / HCL / pH pMedida colorimétrica da Hb livreHPN: lise de 5% a 80% dos G.V.

Scottish Charles - 1794 (cirurgião)Strübing Paul - 1882 (urina escura matutina, hemólise intravascular, trombose. Defeito no G.V.)Defeito no G.V.)Marchiafava, 1911 / Michelli, 1931 (anemia hemolítica com esplenomegalia e hemoglobinúria e hemosiderinúria)

Ham TH, Dingle JH. Studies on the destruction of red blood cells II. Chronic haemolytic anaemia with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Certain immunological aspects

f fof the haemolytic mechanism with special reference to serum complement.

J Clin Invest 1939;18:657–72.

Teste de HAM• Não existe Falso (-)

Teste de HAMNão existe Falso ( )

• Existe Falso (+)Diseritropoese congênita tipo II mas não seDiseritropoese congênita tipo II , mas não se

o soro do paciente for utilizado ou se os globulos vermelhos do paciente já foramglobulos vermelhos do paciente já foram lisados com anticorpo à frio. Portanto o Teste de Coombs deve ser realizado em paralelo e se (+) invalida o teste de Ham.

AHAI > HPN

Âncora Glicosil Fosfatidil InositolGPIGPI

proteína ancoradaC-terminal

NH2

âncora ancorada

etanolamina

C terminalatravés da

qual um peptídeo se fixa àse fixa à

superfície das células

âncoraGPI

glican

inositolfosfato

glucosamina

inositolfosfato

membrana celular1,2 diacilglicerol

1980. Low et cols.

Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol

Normal HPNcamada bilipídica

Mutação de

A deficiência da âncora GPI resulta na perda de várias proteínas da superfície da célula.

Mutação de gene PIG-A defeito na

acetilglucosaminil

transferase

Proteínas que se ligam a membrana celular através da âncora GPIcelular através da âncora GPI

EnzimasAcetilcolinesteraseAcetilcolinesterase Fosfatase Alcalina LeucocitáriaADP-ribosil transferase

Moléculas de adesãoAntígeno associado a função linfocitária - LFA-3 ou CD58CD66bCD66b

Proteínas de superfície reguladoras de complemento D l ti f t DAF CD55Decay accelerating factor - DAF - ou CD55Homologous Restriction Factor HRFMembrance inhibitor of reactive lysis MIRL ou CD59

Proteínas que se ligam a membrana celular através da âncora GPIcelular através da âncora GPI

ReceptoresFc γ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16)Fc-γ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16) Antígeno de diferenciação monocitária (CD14)

Antígenos eritrocitáriosAntígenos eritrocitários Yt antigens (AchE) Holley Gregory antigen

Antígenos neutrofílicos NB1/NB2

Outras proteínas de superfície de função desconhecidaCAMPATH-1 antigen (CDw52) CD24 GP500

CD55 - DAFDecay Accelerating FactorDecay Accelerating Factor

P ti i d t l d ti ã dParticipa do controle da ativação do Complemento na superfície da célula

Reduz a ação do complexo C4bC2a impedindo ç p pa ativação de C3

Sua deficiência isoladamente não justifica o quadro clínicoquadro clínico

CD59- MIRL MembraneInhibitor of Reactive LysisInhibitor of Reactive Lysis

I ib f ã d C9 j l ltInibe a formação de C9 cujo complexo resulta na lise da célula

Inibe a interação com C8 e C9

Sua inibição resulta em hemólise

Sua reintrodução restaura a resistência aoSua reintrodução restaura a resistência ao Complemento

CD14 - Receptor da proteina que li à d ise liga à endotoxina

O LPS (lipopolissacaride da parede bacteriana) ligada à uma proteina sérica específica se liga à superfície de monócitos e macrófagos através deste receptor.

Este complexo resulta na liberação de citoquinas TNF-α IL-4 e IL-6citoquinas TNF α, IL 4 e IL 6.

MOLÉCULAS LIGADAS AO GPI NA CÉLULA HEMATOPOÉTICA HUMANA

G.V. PMN Monocitos Plts Linfocitos HSC

Reguladoras Complemento

CD 55 (DAF) (+) (+) (+) (+) (+)

CD 59 (MIRL) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

Moléculas de Adesão

CD 48 (+) (+) (+)

CD 58 (LFA-3) (+)

CD66b e CD66c (+)

Enzimas

Acetilcolinesterase (+)

Fosfatase Alc.Leucocitária (+)

CD 157 (+) (+)

Receptores

CD 14 (+)CD 16 (FcγRIII) (+) (+) - linf B( γ ) ( ) ( )

CD 87 (u-PAR) (+) (+) (+) - linf T

Outros

CD 52 (+) (+)( ) ( )

CD 90 (+) - linf T (+)

Proteina Prion (+) (+) (+) (+) (+)

Hoffbrand A. V.;Catovsky D.; Tuddenham E.G.D. Postgraduate Haematology –2005 5a Ed. Blackwell Publishing

Citometria de Fluxo

E it ó itEritrócitosGranulócitosMonócitosLinfócitosLinfócitosPlaquetas

CD55 DAF

CD59 MIRL

Van der Schoot, 1990

Modos de Apresentação

Citometria de Fluxo

Detectores

FotomultiplicadoresFL2

Detectores

FL1

LASER FSC

SSCFL3

Impulsos Elétricos

Di it li ã

Sistema Hidrodinâmico

Injeção daamostra

FL3

Digitalizaçãoamostra

Citometria de Fluxo de células HPN com anti CD59 em eritrócitoscom anti CD59 em eritrócitos

Nú dNúmero deEventos

Tipo I : NormalCélulas HPN Tipo II

Células HPN Tipo III

Intensidade de fluorescência

anti-CD59 Eritrócitos(b) Células de HPN l e HPN III (c) Discreta população de Células HPN I, HPN II e HPN III (d) Discreta população de Células(d) Discreta população de Células HPN I e HPN II (transição indistinta)(e) Células HPN III

Controle isotipo( )(f) Células HPN II indistintas das

Células HPN I e HPN III

Hall e Rosse, 1996

CD55 e CD59 em Granulócitos

Amostra Controle

Paciente Controle isotipo CD 59 CD 55

CD55 e CD59 em EritrócitosAmostra Controle

Paciente Controle isotipo

CD 59 CD 55

CD14 em MonócitosAmostra Controle Atenção !

C t lPaciente

Controle isotipo

InteressanteInteressante

• Pode ocorrer diminuição do percentual de eritrócitos CD55/CD59 negativos devido à hemólise.

• Eritrócitos com CD59 positivos apresentam vida média maior do que os eritrócitos com CD 59 negativos.

A id d d i h óli hi l i ã• A severidade da anemia por hemólise e hipoplasia não está correlacionada com o percentual de CD59 positivos

Fujioka 1994

Diagnóstico por Citometria de g pFluxo

G ld S dGold Standart

PraticidadePraticidade

Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal)Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal)

Eritrócitos: interferentes na avaliação do clonemeia-vida diminuídatransfusões

Detecção de pequenos clones

Células HPN na HPNExpressão variável de antígenos ligados através do GPI em 3 linhagens celulares

CD59eritrócitos

CD59granulócitos

CD14monócitos

p g g g

Controle normal

Paciente 1

Paciente 2

Paciente 3Sharon 1996

Interessante

Pacientes com menos de 20% de células anormaisPacientes com menos de 20% de células anormais raramente apresentam hemoglobinúria mas podem ter hemólise e hemossiderinúria.

Qualquer ponto de corte é arbitrário, mas <5% deQualquer ponto de corte é arbitrário, mas 5% de glóbulos vermelhos tipo HPN não se observa anemia hemolítica.

Clone de células HPN III maior que 60%, apresentam hemoglobinúria, mas às vezes, isto não ocorre por razões desconhecidas

Indicação de Pesquisa de células HPN

Pancitopenias sem causa definida,principalmentese apresentar reticulocitosese apresentar reticulocitose

T b d ti ã d fi idTromboses de repetição sem causa definida

Hemólise intravascular sem causa definida

Clone de células HPN em síndromes defalência medular

Anemia AplasticaHPN Mielodisplasia

11/29 pacientes com Anemia Aplástica (38%) com presença de células HPN.p p ( ) p çSchubert J, 1994

Aumento de células HPN em 21 dos 119 pacientes com Anemia Refratária (17,6%)

AR HPN (+)

ARHPN (-) P

Anormalidades cariotípicas (%) 1 / 21 (4.8) 21 / 64 (32.8) .01p ( ) ( ) ( )

Contagem de plaquetas (x 103/μL) 31 (4-121) 91 (9-126) .01

Resposta terapêutica a ciclosporina (%) 7 / 9 (77.8) 0 / 8 (0) .002Progressão para SMD avançada ou LMA (%) 0 / 21 (0) 4 / 65 (6.2) .57

P i él l HPN t d i t f lê i d d l ó

Wang H, 2002 Blood

Pesquisar células HPN em todos os pacientes com falência de medula óssea antes do tratamento, para auxílio na escolha terapêutica.

Clone de células HPN em

Relação entre HPN e AAA

sindromes de falência medular• Relação entre HPN e AAA• Paciente menos hemolítico e mais pancitopenico pode

evoluir para AA• AAA-Doença auto imune orgão específica mediada por

linfócitos T citotóxico ativado (CD8) que inibe HSC• HPN-Expansão de clone de célula T anormalHPN Expansão de clone de célula T anormal• Tratamento de imunosupressão melhora AAA e HPN• HPN é uma forma de AAA, HPN dano auto imune ao

t ll t ã áti d PIG Astem cell e mutação somática do gene PIG-A• Mutação do PIG-A pode ser demonstrada em população

normal em 10/1.000.000

Pesquisa de HPN• Exames realizados desde 19/01/2004;

• Até 29/03/2007: 107 solicitações;• 5 casos positivos (4,7%).

• Técnica• CD 55 – PE / CD59 – FITC (Immunotech)• CD 14 (clone My4) – PE (Coulter)• CD 64 – FITC (Immunotech)• CD13 PE (B D )• CD13 – PE (B.D.)• Glicoforina A (CD235) – PE (Dako)

Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: 223 233Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: 223-23342: 234-238 – Aug 15, 2000

Pratical Haematology – Dacie JV., Lewis SM

Controle de QualidadeControle de Qualidade• Proficiência através dos interlaboratoriais

• CAP - desde Abril/2006; -média de 51 laboratórios participantes.CD55/CD59

• UKNEQAS - desde Novembro/2004;UKNEQAS desde Novembro/2004;média de 65 laboratórios participantesCD55/CD59/CD14CD55/CD59/CD14CD16 / CD24 / CD66b

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - HemáciasLEFS, 56 anos 08/03/2006 Hemácias

Ausência de expressão antigênica d CD55 46 5%

Ausência de expressão antigênica d CD59 34 9% d él ldo CD55 em 46,5% do CD59 em 34,9% das células identificadas por Glicoforina A

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - NeutrófilosLEFS, 56 anos 08/03/2006 Neutrófilos

Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - NeutrófilosLEFS, 56 anos 08/03/2006 Neutrófilos

Controle normal: CD59 (+) = 100 0%

Ausência de expressão antigênica de 100,0%

gCD59 em 82,7% das células identificadas pelo CD13.

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - MonócitosLEFS, 56 anos 08/03/2006 Monócitos

Controle normal: CD14(+) = 99 8% Ausência de expressão do CD14 em Controle normal: CD14(+) = 99,8% p98,3% das células CD 64 (+)

RTS, 16 anos – 16/05/2006 Hemácias não realizado pois recebeuHemácias -não realizado, pois recebeu

transfusão. Neutrófilos:

Controle normal: CD55(+) = Ausência de expressão de CD55Controle normal: CD55(+) = 99,0%

Ausência de expressão de CD55 em 5,7% dos neutrófilos

RTS, 16 anos – 16/05/2006 - NeutrófilosRTS, 16 anos 16/05/2006 Neutrófilos

Controle normal: CD59(+) = 99,3% Ausência de expressão do CD59 em 6 1% das células CD13 (+)6,1% das células CD13 (+).

RTS, 16 anos – 16/05/2006 – MonócitosRTS, 16 anos 16/05/2006 Monócitos

Controle normal: CD14(+) = 99 0% Ausência de expressão do CD14 emControle normal: CD14(+) = 99,0% Ausência de expressão do CD14 em 14,3% das células CD64+.

HPN – Acompanhamento e T ê iTerapêutica

• Tratamento de suporte: pÁcido fólico, ferro suplementar se necessárioTransfusãoC ti óid tCorticóide – controversoprofilaxia com anticoagulante em caso de trombosetromboseterapia trombolítica (tPA)

• Transplante e terapia imunosupressora - ATG e ciclosporina• Eculizumab – inibe a ativação do complemento (C5)

reduz hemólise intravascular, diminui hemoglobinuria e diminui a necessidade de transfusão

Raiola AM, Van Lint MT, Lamparelli T. Haematologica 85 (1): 59-62 -2000.Hillmen P., Hall C., Marsh JC. New England Journal of Medicine 350: 552-9 2004

ConclusõesConclusõesO estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica deO estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica de citometria de fluxo é o método de escolha para o diagnóstico de HPN devido à maior sensibilidade.

As proteínas mais estudadas são o CD55 e CD59 em granulócitos e eritrócitos e CD14 em monócitos.

A CMF permite a detecção de quantidades pequenas de células com deficiência parcial ou total das proteínascélulas com deficiência parcial ou total das proteínas dependentes de GPI,

M ó i h líti d liMesmo após crises hemolíticas severas, pode-se analisar a ausência de expressão na população de leucócitos.

• EQUIPE •

Ana Claudia M Brito• Ana Claudia M. Brito João Carlos C Guerra

• Nydia Strachman Bacaly• Alexandra M.Cavalcante• Ruth Hissae Kanayama• Sonia Tsukasa Nozawa

• Obrigada !

• nsbacal@einstein.br• hemato@chsp.org

Gene PIG-A Localizado noLocalizado no braço curto do cromossomo X

Xp22

Miyata, 1993 Science