Hepatites - Manual Aula 2

8/18/2019 Hepatites - Manual Aula 2

1/151Diagnóstico das Hepatites Virais - Aula 2

Aula 2 Testes rápidos

A ampliação do acesso ao diagnóstico é um desafio aos programas de saúde pública.

Os testes laboratoriais convencionais são operacionalmente complexos, requerem profissionaisespecializados e infraestrutura laboratorial apropriada. Além disso, o prazo para entrega dosresultados desses testes pode ser longo, levando o indivíduo a se desinteressar pelo resultado do teste e à consequente perda deste pelo sistema de saúde.

Ao final da década de 1980, uma nova estratégia diagnóstica surgiu. Chegaram ao mercado,os testes rápidos. Com o avanço das tecnologias de desenvolvimento e produção, esses testesrevelaram-se eficientes na investigação de doenças infectocontagiosas. Desde 2005, a utilizaçãodos testes rápidos permite atender à crescente demanda pelo diagnóstico de agravos relevantes àsaúde publica, visto que sua utilização aumenta a agilidade da resposta aos indivíduos e permiteseu rápido encaminhamento para assistência médica e início de tratamento.

Testes rápidos são, primariamente, recomendados para testagens presenciais. Podem ser feitoscom amostra de sangue total obtida por punção venosa ou da polpa digital, ou com amostras defluido oral. Dependendo do fabricante, podem também ser realizados com soro e (ou) plasma.

A execução dos testes rápidos, habitualmente, é muito simples e a capacitação de pessoal podeser realizada presencialmente, ou por meio de ensino a distância (EAD).

Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretaçãodos resultados são feitas em, no máximo, 30 minutos. Alémdisso, são de fácil execução e não necessitam de estruturalaboratorial.

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Vantagens dos testes rápidos

A primeira vantagem significativa dos testes rápidos é que eles possibilitam a liberação dosresultados e a assistência ao paciente em uma única consulta.

Os testes rápidos não necessitam de estruturas laboratoriais ou de profissionais graduados parasua execução, assim como dispensam o transporte de amostras e a necessidade de coleta desangue venoso. Além disso, a aplicação de testes rápidos auxilia na prevenção da transmissãovertical, facilita o diagnóstico em populações-chave e promove o acolhimento imediato, dentro daestrutura assistencial do SUS.

Esses testes, que podem ser realizados durante atendimento ou consulta em qualquer local,aumentam a resolutividade do SUS ao facilitar, ao indivíduo, o conhecimento de sua situação

imunológica.

A seguir, estão listadas situações e locais em que se indica a utilização dos testes rápidos.

•Rede de serviços de saúde sem infraestrutura laboratorial, ou localizados em regiões dedifícil acesso.

•Programas do Ministério da Saúde (MS), como o Rede Cegonha, o Programa de Saúde daFamília, o Consultório na Rua e o Quero Fazer, dentre outros.

•Centro de Testagem e Aconselhamento (CTA) e Unidade de Testagem Móvel (UTM).

•Segmentos populacionais flutuantes.

•Laboratórios que realizam pequenas rotinas (rotinas com até cinco amostras diárias paradiagnóstico).

•Prontos-socorros.

•Maternidades.

•Segmentos populacionais mais vulneráveis.•Parcerias sexuais.

•Gestantes que não tenham sido testadas durante o pré-natal, ou cuja idade gestacional nãoassegure o recebimento do resultado do teste, antes do parto.

•Parturientes e puérperas que não tenham sido testadas no pré-natal, ou quando não éconhecido o resultado do teste, no momento do parto.

•Abortamento espontâneo, independentemente da idade gestacional.

•Pessoas em situação de violência sexual.

•Pacientes com diagnóstico de tuberculose.



•Acidentes biológicos ocupacionais.

•Comunicantes1 de portadores de hepatite B.

•Comunicantes1 de portadores de hepatite C.

•Outras situações especiais definidas pelo Depar tamento de DST,Aids e Hepatites virais da Secretaria de Vigilância em Saúde do

Ministério da Saúde (DDAHV) para ações de vigilância, prevençãoe controle das doenças sexualmente transmissíveis.

Tipos de testes rápidos

Existem vários formatos de TR. Os mais frequentemente utilizadossão: imunocromatografia de fluxo lateral; imunocromatografia dedupla migração (ou de duplo percurso – DPP); dispositivos deimunoconcentração; fase sólida (Figura 1).

Figura 1 – Exemplos de testes rápidos (TR): (1a) imunocromatografia de fluxo lateral; (1b)imunocromatografia de dupla migração – DPP; (1c) imunoconcentração; (1d) fase sólida.

Os testes rápidos podem ser realizados com amostras de sangue, soro,plasma ou fluido crevicular gengival.

Notas:

1 - Comunicantes:contatos intradomiciliares,sexuais ou qualquer umque compartilhe objetosde uso pessoal doportador das hepatites

virais (escova de dente,lâmina de barbear e outrosobjetos de uso pessoal).No caso de usuários dedrogas, estão incluídosaqueles que compartilhamquaisquer materiais parao uso (seringas, agulhas,canudos, cachimbos etc.).



Sangue, soro, plasma e fluido crevicular gengival

O sangue circula pelo corpo humano através do coração, de artérias, capilares e veias. Suaprincipal função é o transporte de oxigênio, gás carbônico, hormônios e nutrientes, bem como deresíduos do metabolismo até os órgãos de excreção.

Além disso, o sangue tem papel regulador na distribuição de calor, do equilíbrio ácido-básico e doequilíbrio osmótico, sendo formado por uma fase sólida e por outra líquida.

A fase sólida contém os glóbulos brancos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos emonócitos), os glóbulos vermelhos (hemácias) e as plaquetas. A fase líquida do sangue é oplasma, no qual a fase sólida está suspensa.

Denomina-se sangue total a amostra coletada por punção venosa em tubo contendoanticoagulante ou mesmo o sangue coletado por punção digital. Quando se utiliza uma amostra

de sangue total, significa que não houve a separação da parte sólida e da parte líquida do sangue.

O plasma é um líquido de cor amarelada, que compõe cerca de 55% do volume total do sangue.Contém água, sódio, gases, nutrientes, hormônios, enzimas e proteínas, como fibrinogênio,globulinas e albumina. O plasma é obtido por meio da coleta de sangue, em um tubo contendosubstância anticoagulante.

Por sua vez, o soro é a parte líquida obtida após a coagulação do sangue, coletado em tubo semanticoagulante. Na formação do coágulo, o fibrinogênio é consumido.

O fluido crevicular gengival é o líquido encontrado no sulco gengival, contendo proteínasplasmáticas e anticorpos. Obtém-se esse fluido pressionando a gengiva acima dos dentes. Alguns testes rápidos podem ser feitos com essa amostra biológica.

O Quadro 1 sintetiza informações sobre as amostras biológicas utilizadas em testes rápidos.

Sangue total Soro Plasma Fluido crevicular gengival

Obtido na coletade sangue em tubocontendo algum tipode anticoagulante, oupor coleta com punçãodigital.

Obtido na coleta desangue em tubo semanticoagulante. Nãocontém fibrogênio.

Obtido na coletade sangue em tubocontendo algum tipo deanticoagulante. Contémfibrogênio.

Líquido encontradono sulco gengival.Obtido por meio de umdispositivo específico(Swab), pressionandoa gengiva acima dosdentes. Conhecidopopularmente comofluido oral. Contémproteínas plasmáticas eanticorpos.

Quadro 1 – Sangue total, soro, plasma e fluido crevicular gengival



Os testes rápidos podem ser usados para pesquisar antígenos ou anticorpos contra os agentesinfecciosos para os quais foram projetados. Caso o teste seja para pesquisa de anticorpos,

haverá antígenos (usualmente proteínas sintéticas) imobilizados, na membrana de nitrocelulose,para a captura dos anticorpos presentes na amostra. Caso a pesquisa seja para antígenos, haveráanticorpos imobilizados para a captura dos antígenos presentes na amostra.

Testes por imunocromatografia de fluxo lateral

Características: utilizam uma membrana de nitrocelulose subdividida em quatro áreas.

• Área de amostra (A), onde é aplicada a amostra e a solução tampão.

• Área intermediária (I), que contém o conjugado, geralmente composto de ouro coloidalligado a anticorpos (imunoglobulinas).

• Área de teste (T), que contém os antígenos fixados à membrana de nitrocelulose, onde selê o resultado da amostra testada.

• Área de controle (C), local de controle da reação e que permite a validação do teste.

Observe a Figura 2 a seguir.

Metodologias e funcionamento dostestes rápidos mais utilizados no Brasil

Para fins didáticos, os testes serão apresentados considerando-sea investigação de anticorpos contra os agentes infecciosos.

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Figura 2 – Representação esquemática de um teste de imunocromatografia defluxo lateral.



Como funciona?

1. A amostra é colocada no local indicado, na membrana (área A).

2. A solução tampão é colocada sobre a amostra.

3. Os anticorpos da amostra fluem lateralmente pela membrana, passando pela área I, onde

se inicia a ligação com o conjugado e prosseguem em direção à área de teste (T).4. Na área T, o complexo anticorpo-conjugado liga-se aos antígenos do agente infecciosoinvestigado, formando uma linha (ou banda) colorida.

5. O conjugado não ligado ao anticorpo e o excesso do complexo imune continuama migração, ao longo da membrana de nitrocelulose, em direção à área C, onde sãocapturados por anticorpos anti-imunoglobulina, formando outra linha (ou banda) colorida.

Observe a Figura 3 a seguir.

Figura 3 - Ilustração do funcionamento de um teste rápido de fluxo lateral.



Resultado:

Reagente: Quando houver formação de duas linhas coloridas: uma,na área de teste (T) e outra, na área de controle (C).

Não reagente: Quando houver formação de uma linha colorida, somentena área de controle (C).

Inválido:Quando não houver linha colorida, na área de controle (C).

Quadro 2 – Interpretação dos resultados do teste de imunocromatografia de fluxo lateral.

Sempre leia e interprete o resultado do teste em conformidade com as instruções queacompanham o conjunto diagnóstico, fornecidas pelo fabricante do teste rápido.

Os resultados do teste por imunocromatografia de fluxo lateral podem ser visualizados na formade ponto, linha ou banda colorida, dependendo do fabricante.



Testes por imunocromatografia de dupla migração, ou de duplo percurso– DPP (dual path plataform)

Características: utilizam uma membrana de nitrocelulose, na qual estão ligados antígenos e sãosubdivididos em três áreas.

• Área 1, onde se aplicam a amostra e o diluente.• Área 2, onde se aplica o tampão para permitir a migração do conjugado.

• Área 3, que contém os antígenos fixados e onde se faz a leitura do teste e do controle.

Como funciona?

1. A amostra e o tampão são aplicados na área 1 do teste e migram, em direção à área 3.2. Na área 3, há antígenos fixados. Se houver anticorpos na amostra, eles irão se ligar aesses antígenos.

3. Em seguida, adiciona-se o tampão na área 2, que permite a migração do conjugado –composto por proteína A e partículas de ouro coloidal – em direção à área 3. Essa migraçãoocorre perpendicularmente ao fluxo da amostra. Observe na Figura 5.

4. A proteína A, componente do conjugado, liga-se às imunoglobulinas – anticorpos que

já estavam ligados aos antígenos fixados na área 3. Com a concentração do ouro coloidalnessa área, é possível visualizar a presença de uma linha, de cor rosa ou púrpura, que indicaa presença de anticorpos na amostra.

5. O conjugado continua o fluxo até ligar-se ao reagente da área de controle, resultando noaparecimento de uma linha rosa ou púrpura, indicando que o resultado é válido.

Veja na figura 4 como funciona um teste DPP:

Figura 4 – Imunocromatografia de dupla migração DPP



Resultados:

Reagente: Quando houver formação de duas linhas coloridas: uma na áreade teste (T) e outra na área de controle (C).

Não reagente: Quando houver formação de uma linha colorida somente na áreade controle (C).

Inválido:Quando não houver linha ou banda colorida na área de controle,

o resultado é inválido.

Quadro 3 – Interpretação dos resultados do teste de imunocromatografia de dupla migração – DPP

Para ser considerado válido, um teste rápido deve sempreapresentar a linha controle visível, ao final da reação,independentemente do resultado da amostra.

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Testes por imunoconcentração ( flow through)

Características: utilizam um dispositivo contendo os itens a seguir:

• Uma membrana de nitrocelulose ou de náilon, na qual estão imobilizados antígenos doagente infeccioso investigado.

• Uma membrana absorvente, que está sob a membrana de nitrocelulose.• Conjugado composto de proteína A conjugada com ouro coloidal.

Observe a figura 5 a seguir.

Figura 5 – Representação esquemática de um teste de imunoconcentração

Como funciona?

1. A amostra é colocada sobre a membrana. Ao passarem pela área onde estão imobilizadosos antígenos do agente infeccioso investigado, os anticorpos da amostra, quando estãopresentes, ligam-se, formando um complexo.

2. Em seguida, é adicionado o conjugado. A proteína A do conjugado vai se ligar aosanticorpos do complexo e a concentração do ouro coloidal permitirá a visualização de umponto colorido.

3. A reação será válida se houver o aparecimento de um círculo colorido, na área de controle

(C).



Resultado:

Conforme é indicado pelo fabricante, na área de reação existem dois locais para leitura do teste:

• área de controle (C);

• área de teste (T).

Observe adiante, no quadro 4, como você deve interpretar o teste.

Reagente: Quando houver formação de um círculo colorido na área decontrole (C) e um círculo colorido na área de teste (T).

Não reagente: Quando houver formação de um círculo colorido somente naárea de controle (C).

Inválido:O resultado de um teste rápido somente será válido, quandohouver formação de um círculo colorido, na área de controle(C). Quando não surgir cor na área de controle, o teste é inválido.

Quadro 4 – Interpretação dos resultados do teste de imunoconcentração



Testes rápidos por aglutinação

Características: utilizam partículas em suspensão, como gelatina, látex ou poliestireno, revestidascom antígenos.

Como funciona?

1. Os anticorpos, presentes na amostra, ligam-se aos antígenos adsorvidos à partícula,aglutinando-os.

2. Essa aglutinação é visualizada a olho nu.

É importante saber que a interpretação dos testes por aglutinação apresenta maior grau dedificuldade em comparação com outras metodologias. O padrão de reatividade apresentado poramostras fracamente reagentes é muito similar ao apresentado por amostras não reagentes.

Utilize controles positivos e negativos fornecidos pelo fabricantee (ou) produzidos em seu laboratório e interprete os resultados

segundo as orientações contidas nas instruções de uso do teste.

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Testes rápidos por fase sólida

Características: baseiam-se no princípio metodológico de um ELISA4 indireto. A fase sólida se apresenta na forma de um pente com 12dentes. Cada dente contém os itens listados a seguir.

•

Uma área com anticorpos anti-imunoglobulina humana (para ocontrole da reação).

• Uma área com antígenos.

• Alguns kits podem apresentar mais antígenos no pente.

Como funciona?

1. O dente do pente é colocado em um recipiente que contém aamostra.

2. As imunoglobulinas (anticorpos) da amostra vão se ligar àsanti-imunoglobulinas da área de controle e formarão um complexo.Se estiverem presentes, os anticorpos vão se ligar à área comantígeno, formando um complexo.

3. Em seguida, o pente será colocado em outro recipiente, que

contém o conjugado (anti-imunoglobulinas conjugadas com umaenzima), e haverá a ligação das anti-imunoglobulinas do conjugadocom os complexos formados na etapa anterior.

4. Em seguida, o pente será colocado em um terceiro recipiente,que contém o substrato (cromógeno + H2O2). A presença dosanticorpos será revelada pela formação de círculos coloridos, naárea do controle e nas áreas que contêm anticorpos.

Figura 6 – Representação esquemática do pente de reação de um TR por fase sólida

4 - ELISA (do inglêsenzyme-linked

immunosorbent assay ) éum teste imunológico comrevelação enzimática. Édo tipo indireto porque oconjugado é composto poruma anti-imunoglobulina

humana ligada a umaenzima.



Resultado:

Conforme é indicado pelo fabricante, na área de reação existem três locais para leitura do teste:um na área de controle (C) e dois na área específica com diferentes antígenos.

Confira a seguir como você deve interpretar os resultados.

Reagente para HIV-1: Quando houver formação de um círculo colorido na área indicada para HIV-1 ena área de controle (C).

Reagente para HIV-2: Quando houver formação de um círculo colorido na área indicada para HIV-2 ena área de controle (C).

Não reagente:

Quando houver formação de um círculo colorido somente na área de controle(C).

Inválido: Quando não houver círculo colorido na área de controle (C).

Quadro 5 – Interpretação dos resultados do teste rápido por fase sólida


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Referências

1.BRANSON, B. M. Point-of-Care Rapid Tests for HIV Antibodies. J Lab Med , 27(7/8): 288-295,2003.

2.GREENWALD, J.L.; BURSTEIN G.R.; PINCUS J.; BRANSON B. A Rapid Review of Rapid HIV.Current Infectious Disease Reports; 8:125-131, 2006.

3.OMS – ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Guidelines for use in HIV testing and counsellingservices in resource-constrained settings. Geneva, 50p. 2004.

4.FERREIRA JR., O. C.; FERREIRA, C.; RIEDEL, M.; WIDOLIN, M. R. V.; CRIPPEN, P.; BARBOSA

JR., A.; BRADY, W.; for the hiv rapid test study group. Evaluation of Rapid Tests for anti-HIVDetection in Brazil. Aids [S.l.], v. 19, suppl. 4, p.S70-S75, 2005.

5.Scalioni, L.P., Villar, L.M.; Performance of rapid hepatitis C vírus antibody assays among high-and low-risk populations. Journal of Clinical Virology, 60, 200-205, 2014.

6.Grobusch, M.P.; Hänscheid, T.; Point-of-care tests: where is the point. The Lancet Infectiousdiseases, 14, 922, 2014.

7. FIEBIG, E. W.; WRIGHT, D. J.; RAWAL, B. D.; GARRETT, P. E.; SCHUMACHER, R. T.; PEDDADA,L.; HELDEBRANT, C.; SMITH, R.; CONRAD, A.; KLEINMAN, S. H.; BUSCH, M.P. Dynamics of HIVviremia and antibody seroconversion in plasma donors: implications for diagnosis and staging ofprimary HIV infection. Aids, [S.l.], v. 17, p. 1871-1879, 2003.

8. GADELHA, S. R.; SHINDO, N.; CRUZ, J. N.; MORGADO, M. G.; GALVÃO-CASTRO, B. Molecularepidemiology of of human immunodeficiency virus-1 in the state of Ceara, Northeast, Brazil.

Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, [S.l.], v. 98, n. 4, p.461-3, 2003.

9.GRANADE, T. C.; PHILLIPS, S. K.; BELL, C. J.; PAU, C. P.; PAREKH, B.; HANNON, W. H.; GWINN,M.; REDUS, M. A.; SCHOCHETMAN, G.; GEORGE, J. R. Factors influencing HIV-1 banding patternsin miniaturized western blot testing of dried blood spot specimens. Journal of ImmunologicalMethods, [S.l.], v. 154, n. 2, p.225- 233, 1992.

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