Identificação de genes em Resposta ao Estresse

Universidade Federal do

Rio Grande Norte Programa de Pós-Graduação

em Biotecnologia Laboratório de Biologia Molecular e Genômica

Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à

Resposta ao Estresse

Delanne Cristina Souza de Sena Fontinele

Natal

Março 2012

Delanne Cristina Souza de Sena Fontinele

Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à

Resposta ao Estresse

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação RENORBIO - Rede Nordeste de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande Norte / Universidade Estadual do Ceará, como requisito para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia.

Orientadora: Dra. Lucymara Fassarella Agnez Lima

Natal

Março 2012

iii

Dedico este trabalho à DEUS. Hoje e sempre.

Dedico também aos meus pais, Luciano e Lurdinha,

Aos meus irmãos Danielle, Dianne,

Dominique, Luciano Ricardo e Díllia

e ao meu esposo Maurício

por todo amor e compreensão.

À vocês todo o meu amor!

iv

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Luciano e Lourdinha, pelo apoio incondicional. Agradeço

eternamente por todo amor e carinho.

À todos os meus irmãos, Danielle, Dianne, Dominique, Luciano Ricardo e Díllia,

obrigada pelas palavras de incentivo. E ao meu sobrinho Henrique por me fazer

sorrir sempre.

Ao meu esposo Maurício Fontinele pela caminhada lado a lado, desculpe pela

ausência.

Agradeço à Professora Lucymara Fassarella Agnez Lima, pela orientação, pela

“construção e desconstrução” de conhecimentos, pela oportunidade de ingressar

numa área tão apaixonante e pelas tão sábias sugestões.

Aos órgãos de fomento CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico) e CAPES pelo investimento.

Ao Programa RENORBIO (Rede Nordeste de Biotecnologia) e todos que fazem

parte desta Pós-Graduação.

À Coordenadora do Ponto Focal UFRN Profa. Gorete Ribeiro por toda sua

compreensão e atenção.

Ao Prof. Dr. Robert P. Fuchs, ao CNRS (Centre national de la recherche scientifique)

e ao pessoal do IGC (Instabilité du Génome et Cancérogenèse) pelo importantes

contribuições.

À Dra. Rita Napolitano e Dr. Mauro Modesti pela amizade e acolhida na França.

v

À Profa. Dra. Adriana Uchoa, ao Prof. Dr. Hugo de Oliveira, à Dra. Keronninn Bessa

e Dra. Tirzah Petta pelas importantes contribuições como membros da banca.

À Profa. Dra. Marinalva Pinheiro e Profa. Dra. Cristiane de Assis pela leitura da

Tese.

À Professora Katia Castanho Scortecci, agradeço pela paciência, pela bancada, pela

amizade e por todo conhecimento transmitido.

À Rita Barreto pelo companheirismo, pela incansável ajuda na realização deste

trabalho e, principalmente, pela amizade.

Agradecimento especial aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular e

Gênomica (LBMG) e Laboratório de Mutagênese Ambiental (LAMA), Anna Helena,

Abinadabe, Thayse, Leonam, André, Fabrícia (Fafa), Jana Dara, Gizélia (Gi), Maria

Beatriz (Bia), Juliane, Danielle, Acarizia, Sinara, Naldo, Adilson, Déborah Afonso,

Thiago, Marcos Felipe, Joana e a todos que de alguma forma contribuíram para que

este trabalho fosse realizado. Sempre lembrarei de vocês com muito carinho.

Aos metagenômicos Larissa, Uaska, Ralfo pelo árduo trabalho e confidências.

Aos amigos especiais da “Chromo” Fabio Duarte (Fabinho), Viviane, Daniel Chaves

pela disponibilidade. A ajuda de vocês foi essencial.

Às “Docs” Valéria, Fabíola (Fafa),Tatiana, Fernanda. Agradeço imensamente.

Ao trio de “manas” Ana Rafaela (Lelinha), Angélica (Geka) e Amanda pelo carinho.

A toda a família Souza e Sena (tios e primos) pela descontração, em especial a

Vovó Diva pelo exemplo de fortaleza. Aos meus queridos cunhados Emanuel,

Márcio e Eloiza pelo companheirismo.

Amigos Judney, Agnus, Fabiana, Gilliane, Olavo, Patrícia, Luciana, Débora e Érika

pelo incentivo. Em especial a Heloísa (Hêlo) pela alegria.

vi

RESUMO

O seqüenciamento do genoma da espécie Chromobacterium violaceum identificou

um cromossomo simples circular de 4.8 Mb, no qual aproximadamente 40% das

ORFs encontradas são classificadas como hipotéticas conservadas ou hipotéticas.

Algumas regiões gênicas de interesse biotecnológico e biológico vêm sendo

caracterizadas, como por exemplo, genes de detoxificação ambiental e genes de

reparo de DNA, respectivamente. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi

identificar genes de C. violaceum envolvidos com a resposta ao estresse, como por

exemplo, mecanismos de reparo de DNA e/ou manutenção da integridade

genômica. Para tanto, foi construída uma biblioteca genômica de C. violaceum na

cepa DH10B de Escherichia coli (RecA-), a qual foi testada para clones resistentes a

UVC, resultando na seleção de cinco clones candidatos. Foram identificadas quatro

ORFs (CV_3721 a 3724) no clone PLH6A. Das quais, as ORFs CV_3722 e

CV_3724, foram subclonadas e uma atividade sinérgica de complementação foi

observada. A ocorrência de um operon foi confirmada usando cDNA de C. violaceum

em ensaio de RT-PCR. Adicionalmente, foi observada a indução do operon após

tratamento com UVC, dessa forma, esse operon foi relacionado à resposta ao

estresse em C. violaceum. Ensaios de mutagênese com rifampicina após tratamento

com luz UVC mostraram alta freqüência de mutagenicidade para a ORF CV_3722,

subunidade δ’ da Polimerase III. Assim, propomos que esta subunidade de C.

violaceum pode agir em DH10B na síntese translesão utilizando Pol IV em uma via

RecA independente. Em ensaios de viabilidade outros quatro clones (PLE1G,

PLE7B, PLE10B e PLE12H) foram capazes de complementar a função na dose de 5

J/m2. E em ensaios de mutagenicidade PLE7B, PLE10B e PLE12H apresentaram

freqüências de mutação com diferenças significativas em relação ao controle

(DH10B), demonstrando que de alguma forma eles estão envolvidos na resposta ao

estresse em C. violaceum. Estes clones parecem estar inter-relacionados,

provavelmente, regulados por molécula mensageira (como o nucleotídeo c-di-GMP)

e/ou molécula regulatória global (como a subunidade σS da RNA Polimerase). Os

resultados obtidos contribuem para um melhor conhecimento da genética desta

espécie e de seus mecanismos de resposta ao estresse ambiental.

Palavras-chave: HolB; Operon; Mutagênese; Resposta ao Estresse; β-Proteobacteria

vii

ABSTRACT

The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single

circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs

are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of

biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental

detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this

work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones

involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For

this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B

(RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates

clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two

ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation

activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from

C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the

operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress

response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment

with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III

δ’ subunit). In this way, we propose that the C. violaceum δ’ subunit can act in DH10B

in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In

growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were

able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays

PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant

differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are

involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be

interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP)

and/or global regulatory molecule (eg., σS subunit of RNA polymerase).The results

obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response

mechanisms to environmental stress.

Keywords: HolB; Operon; Mutagenesis; Stress Response; β-Proteobacteria

viii

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Mapa funcional das ORFs de C. violaceum. 03 Figura 2. Principais tipos de agentes mutagênicos, lesões e sistemas de

reparo.

08

Figura 3. Esquema de NER bacteriano. 10 Figura 4. Estrutura da forquilha de replicação em E. coli. 17 Figura 5. Fluxograma das atividades realizadas para obtenção de clones

candidatos.

22

Figura 6. Mapa e sítios de clonagem do plasmídeo pBC-SK. 23 Figura 7. Fluxograma das atividades realizadas a partir de clones

candidatos.

26

Figura 8. Figura ilustrativa da seleção de clones em placa após ensaio

UVC.

38

Figura 9. Mapa de localização das ORFs dos clones candidatos no genoma

de C. violaceum.

39

Figura 10. Alinhamento das proteínas HolB de C. violaceum (CV), N.

meningitidis (NM), R. solanacearum (RT), E. coli (EC) e S. flexneri (SF) pelo

programa CLUSTALW2.

43

Figura 11. Estrutura molecular das proteínas HolB mostrando os prováveis

sítios de ligação fornecida pelo I-Tasser.

46

Figura 12. Alinhamento das proteínas PilZ de C. violaceum (CV), N.

meningitidis (NM), Lutiella nitroferrum (LN), Thiobacillus denitrificans (TD),

Dechloromonas aromática (DA) e Pseudomonas aeruginosa (PA) pelo

programa CLUSTALW2.

46

Figura 13. Alinhamento das proteínas Timidilato quinase (TMK – ORF 3723)

de C. violaceum (CV), L. nitroferrum (LN), Laribacter hongkongensis (LH),

Neisseria mucosa (NM) e Neisseria meningitidis (NM) pelo programa

CLUSTALW2.

47

ix

Figura 14. Alinhamento da seqüência protéica da ORF CV_3724 de C.

violaceum (CV3724Y) com proteínas fornecidas pelo Blastp de Lutiella

nitroferrum (LNAlyas), Ralstonia pickettii (RPAlyas), Herminiimonas

arsenicoxydans (HAPspep), Neisseria meningitidis (NMPalys), Burkholderia

cenocepacia (BCPlipo) e Oxalobacteraceae bacterium (OBYceGl) pelo

programa CLUSTALW2.

48


violaceum (CV1667Hyp) com proteínas apresentando domínio diguanilato

ciclase/fosfodiesterase (GGDEF) de L. nitroferrum (LNDCyclpp), P.

aeruginosa (PAWspRpro), E. coli (ECDcyclas) e R. solanacearum

(RSDcyclas) pelo programa CLUSTALW2.

50


violaceum (CV0390H) com proteínas apresentando domínio isocitrato liase

e fosfoenolpiruvato mutase (ICL/PEPM) de Pectobacterium carotovorum

(PCHypot), Sphingobacterium spiritivorum (SSPepmu), Bacillus cereus

(BCCpepm), Listeria monocytogenes (LMTrans), Rhizobium leguminosarum

(RLLyase) e E. coli (ECPrpBl) pelo programa CLUSTALW2.

51

Figura 17. Alinhamento das proteínas ADA de C. violaceum (CV), E. coli

(EC), Klebsiella variicola (KV), Marinomonas posidonica (MP), Spirochaeta

smaragdinae (SS) e P. carotovorum (PC) pelo programa CLUSTALW2.

52


violaceum (CV1311H) com proteínas fornecidas pelo Blastp de Plesiocystis

pacifica (PPHypot), Streptosporangium roseum (SRHypot), Saccoglossus

kowalevskii (SKHypot), Aspergillus clavatus (ACAller) e Cupriavidus

taiwanensis (CTDgbet) pelo programa CLUSTALW2.

54


violaceum (CV1312H) com proteínas fornecidas pelo Blastp de B.

multivorans CGD1 (BM1Hypo), B. multivorans ATCC 17616 (BM2Hypo), B.

sp. TJI49 (BSHypot), Desulfotomaculum kuznetsovii (DKIstBd) e B.

cenocepacia PC184 (BCHypot) pelo programa CLUSTALW2.

55

x


violaceum (CV1313f) com proteínas apresentando domínio da família

ThiJ/PfpI de R. sp (RSIhydr), P. putida (PPIhydr), R. pickettii (RPThPff e

RPAraCf), C. crescentus (CCThPff), C. violaceum (CV1314A) e

Photorhabdus asymbiotica (PAAraCf) pelo programa CLUSTALW2.

56

Figura 21. Alinhamento das proteínas RpoA de C. violaceum (CV), E. coli

(EC), L. nitroferrum (LN), Laribacter hongkongensis (LH), N. meningitidis

(NM) e N. gonorrhoeae (NG) pelo programa CLUSTALW2.

57

Figura 22. A) Ensaio de complementação funcional a UVC do clone PLH6A. 59 Figura 22. B) Ensaio de complementação funcional a UVC dos clones

PLE1G e PLE7B.

60

Figura 22. C) Ensaio de complementação funcional a UVC dos clones

PLE10B e PLE12H.

61

Figura 23. Curva de Sobrevivência do clone PLH6A, ORFs CV_3722 e

CV_3724 e pBC-SK.

63

Figura 24. Freqüência de indução relativa do operon (ORFS CV_3721 a

CV_3724) por RT-PCR.

64

Figura 25. Ensaio de mutagênese (Rifampicina) com a ORF CV_3722, ORF

CV_3724, DH10B (pBC-SK), C. violaceum e AB1157 a partir de Luz UVC.

66

Figura 26. Ensaio de mutagênese (Rifampicina) com os clones PLE1G,

PLE7B, PLE12H e PLE10B, DH10B (pBC-SK), C. violaceum e AB1157 a

partir de Luz UVC.

67

Figura 27. Reconstrução de árvore filogenética com proteínas apresentando

domínio da família ThiJ/PfpI.

69

xi

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Proteínas que participam da forquilha de replicação em E. coli. 16 Tabela 2. Cepas e plasmídeo utilizados. 20 Tabela 3. Clones resistentes a ensaio UVC após análise com ferramentas

do BLAST.

40

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

AB1157 Cepa selvagem de Escherichia coli

Água DEPC Água tratada com dietilpirocarbonato

ATCC American Type Culture Collection

BER Reparo por excisão de base

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

c-di-GMP Nucleotídeo diguanilato cíclico ou bis-(3›,5›)-di-guanosina monofosfato cíclico - 2º mensageiro celular

CIAP fosfatase alcalina intestinal de bezerro (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)

CPD Dímeros de pirimidinas do tipo ciclobutano

Cv Chromobacterium violaceum ATCC 12472

DH10B Linhagem de Escherichia coli recA-

DO Densidade Óptica

EDTA Ácido etileno diamina tetra acético

GGDEF Domínio 1 das enzimas Diguanilato ciclase / fosfodiesterase

GGR Reparo genômico global

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

HolB Proteína da subunidade delta’ da DNA Polimerase III

ICL Enzima Isocitrato liase

IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo

Kb Kilobases

KOAc Acetato de potássio

LB Luria-Bertani (meio de cultivo)

mfd Gene mutation frequency decline

MgSO4 Sulfato de magnésio

MMR Reparo por mau pareamento - Mismatch Repair

MSC Múltiplo Sítio de Clonagem

xiii

NaOAc Acetato de sódio

NaOH Hidróxido de Sódio

NEB New England Biolabs

NER Reparo por excisão de nucleotídeo

ORF Opened Reading Frame (quadro aberto de leitura)

pb Pares de base

pBC-SK Vetor de expressão pBluescript

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PEPM Enzima fosfoenolpiruvato mutase

PilZ Proteína de biogênese fimbrial tipo 4

pMol picoMol

RecA Enzima Recombinase A

rpm Rotação por minuto

RR Reparo por Recombinação

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction - Reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

SOS Mecanismo de Resposta SOS

SSB Proteínas de ligação ao DNA fita simples

TAE Tris - base, Ácido Acético e EDTA - Tampão

TCR Reparo acoplado à transcrição

TCRF Fator acoplado ao reparo transcricional

TE Tris e EDTA - Tampão

TLS Translesion Synthesis – Síntese Translesão

TMK Enzima Timidilato quinase

X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-tiogalactopiranosideo

SUMÁRIO 1 Introdução 01 1.1 Chromobacterium violaceum 01 1.2 Genoma de C. violaceum 02 1.3 Mecanismos de Proteção e Resposta ao Estresse 06 1.3.1 Mecanismos de Reparo e Tolerância ao Dano no DNA 07 1.3.2 Síntese Translesão e DNA Polimerases 12 1.3.2.1 Holoenzima DNA Polimerase III 14 2 Objetivos 19 2.1 Geral 19 2.2 Específicos 19 3 Material e Métodos 20 3.1 Cepas bacterianas e plasmídeo 20 3.2 Construção da biblioteca genômica de C. violaceum 21 3.2.1 Extração de DNA genômico de C. violaceum 21 3.2.2 Fragmentação do DNA por Sonicação e Endonucleases de Restrição 22 3.2.3 Vetor de Expressão 23 3.2.4 Obtenção das Construções 25 3.2.5 Seleção de clones por coloração azul-branco 25 3.3 Ensaio de Seleção Funcional 27 3.4 Seqüenciamento de clones resistentes a radiação UVC 28 3.5 Bioinformática para análise das seqüências 28 3.6 Ensaios de Complementação Funcional 29 3.6.1 Curvas de Sobrevivência 30 3.6.2 Curvas de Crescimento 30 3.7 Amplificação e isolamento de ORFs específicas 31

3.8 Níveis de expressão por RT-PCR (Reverse transcriptase-

polymerase chain reaction) 32 3.8.1 Extração de RNA de C. violaceum 33 3.8.2 Obtenção de cDNA de C. violaceum 34 3.8.3 Níveis de expressão por RT-PCR a partir de primers ORF-específicos e de regiões intergênicas 34 3.9 Ensaio de Mutagênese Direta (Rifampicina) (Miller, 1992) 36 3.10 Reconstrução Filogenética para a ORF CV_1313 37 4 Resultados 38 4.1 Biblioteca genômica de Chromobacterium violaceum e Seleção Funcional 38 4.2 Análise das seqüências in silico 39 4.2.1 Análise das seqüências por ferramentas do pacote BLAST e mapas genômicos das ORFs 39 4.2.2 Alinhamento de seqüências das ORFs do clone PLH6A 42 4.2.3 Alinhamento de seqüências das ORFs dos clones PLE1G, PLE7B, PLE10B e PLE12H 49 4.3 Ensaios de complementação funcional para os clones selecionados 58 4.4 Ensaios de Complementação Funcional para o clone PLH6A e ORFs subclonadas 62 4.5 Nível de Expressão por RT-PCR a partir de Primers ORF-Específicos e de regiões intergênicas 63 4.6 Ensaio de Mutagênese Direta (Rifampicina) 65 4.6.1 Mutagênese do clone PLH6A (ORFs CV_3722 e CV_3724) 65 4.6.2 Mutagênese dos clones PLE1G, PLE7B, PLE12H e PLE10B 65 4.7 Reconstrução Filogenética para a ORF CV_1313 68 5 Discussão 70 6 Conclusões 84 Referências Bibliográficas 86

1

1 Introdução

1.1 Chromobacterium violaceum

A -proteobactéria C. violaceum pertence à família Neisseriaceae, sendo

classificada como um organismo de vida livre, saprófito, geralmente não-patogênico,

gram-negativo e aeróbico facultativo. Apresenta distribuição circuntropical, podendo

ser encontrada em amostras de solo e água de regiões tropicais e subtropicais de

diversos continentes (Boone e Castenholz, 2001; Byamukama et al., 2005).

Ocorre em abundância no Rio Negro (Região Amazônica do Brasil), tanto em

corpos de água, como sobre bancos de areia (Dias Jr. et al., 2002). C. violaceum

raramente causa infecções em animais e homens, mas quando isto ocorre, resulta

em alta taxa de mortalidade. Assim, esta bactéria pode atuar como um patógeno

oportunista causando septicemia fatal a partir de lesões na pele com abscessos no

fígado e pulmão (Liu et al., 1989; Ray et al., 2004; Dias et al., 2005; Kim et al.,

2005). Comumente, atinge crianças ou indivíduos que apresentam baixa imunidade,

mas há casos reportados em pessoas consideradas saudáveis (Siqueira et al., 2005;

Ma et al., 2006; Slesak et al., 2009).

A espécie C. violaceum é caracterizada pela produção de violaceína, um

pigmento roxo, insolúvel em água e clorofórmio e solúvel em etanol. A este pigmento

têm sido atribuídas importantes atividades, como por exemplo: 1) ação

antimicrobiana contra determinados patógenos tropicais como os agentes

causadores da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis), doença de Chagas

(Trypanosoma cruzi) e leishmaniose (Leishmania sp.) (Durán et al., 1994; Souza et

al., 1999; Leon et al., 2001; Andrighetti-Frohner et al., 2003); 2) ação antivirótica

(Durán e Menck, 2001); 3) atuação como um composto terapêutico para finalidades

dermatológicas; e 4) capacidade de induzir a apoptose e a diferenciação de células

leucêmicas humanas (Melo et al., 2003). Em função deste último, novas

metodologias de associação da violaceína a outros compostos, como o ácido

ascórbico, vem sendo desenvolvidas objetivando sua utilização como agente

antitumoral (Martins et al., 2010). Para a síntese da violaceína, a C. violaceum

necessita de oxigênio molecular e de L-triptofano. Segundo Caris e colaboradores

(2003), a produção da violaceína é dependente da fonte de carbono utilizada, sendo

2

desfavorecida em presença de glicose e frutose, porém estimulada em glicerol, mais

especificamente em meio contendo ágar.

A C. violaceum apresenta outras características que ampliam seu potencial

biotecnológico, como por exemplo, no controle de pragas agrícolas como insetos,

fungos e nematóides (Durán e Menck, 2001; Vasconcelos et al., 2003), apresentar

capacidade de produzir polímeros com propriedades semelhantes ao polipropileno e

peptídeos com atividade antitumoral (Melo et al., 2000), além da sua possível

utilização no processo de concentração de minério de ouro e na recuperação de

metais pesados, uma vez que possui genes relacionados à produção de cianeto

(radical). Esse produto enzimático pode se complexar a metais pesados e vir a ser

aplicado no desenvolvimento de estratégias de biorremediação de áreas

contaminadas pelo garimpo, método importante para conservação e recuperação

ambiental, já que possibilitaria a não contaminação pelo mercúrio (Lawson et al.,

1999; Campbell et al., 2001).

1.2 Genoma de C. violaceum

Devido ao potencial biotecnológico C. violaceum teve seu genoma

seqüenciado pela Rede Nacional de Seqüenciamento Nucleotídico (Projeto Genoma

Brasileiro – CNPq), da qual o Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG;

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal-RN) fez parte.

Os resultados mostraram um genoma de 4.751.080 pb, com uma média de

64,83 % de conteúdo GC. Foram identificadas 4.431 ORFs, que correspondem a

cerca de 89 % do genoma com um comprimento médio de 954 pb (Vasconcelos et

al., 2003).

biotecnológico vêm sendo caracterizadas, podendo

responsáveis pela detoxificação am

conferem resistência à drogas, como o antibiótico cloranfenicol (Fantinatti

Garboggini

antitumoral (Cheng

influenciando o desenvolvimento de características em resposta a situações de

estresse (formação de celulose, flagelo e fímbrias) que, por sua vez, são regulados

por moléculas

celular

que atuam nessa resposta

% das ORFs encontradas em

conservadas ou hipotéticas, ou seja, as funções bioquímicas e papéis biológicos de

2,7 %

3,7 %

6,1 %

3,2 %

5 %

5,8 %

3 %

3,6 %

Figura 1. Mapa funcional das ORFs de

A partir deste seqüenciamento




Garboggini et al.

antitumoral (Cheng



por moléculas mensageiras

celular (Recouvreux

que atuam nessa resposta

No entanto, como em genomas de outros organismos, aproximadamente 40

das ORFs encontradas em


4,6 %3,4 %

2,7 %

3,6 %

2,9 %6,4 %






et al., 2004); grupos

antitumoral (Cheng et al., 2007)



mensageiras

(Recouvreux et al., 2008)

que atuam nessa resposta (Duarte


das ORFs encontradas em


0,9 %

7,5 %1,8 %






grupos gênicos responsáveis pela biossíntese de agente

., 2007);



mensageiras que atuam na patogênese bacteriana e desenvolviment

., 2008); e mais especificamente

(Duarte et al.


das ORFs encontradas em C. violaceum


21,6 %

17,1 %

4,6 %0,9 %

Figura 1. Mapa funcional das ORFs de C. violaceum

A partir deste seqüenciamento, algumas regiões gênicas de interesse


responsáveis pela detoxificação ambiental (Carepo


gênicos responsáveis pela biossíntese de agente

; genes envolvidos na form



que atuam na patogênese bacteriana e desenvolviment

mais especificamente

et al., 2004) (Figura 1)


C. violaceum

fora


17,1 %

HIPOTÉTICAS CONSERVADAS

HIPOTÉTICAS

PRODUÇÃO E CONVERSÃO DE ENERGIA

CONTROLE DO CICLO CELULAR E MITOSE

METABOLISMO E TRANSPORTE DE AMINOÁCIDO

METABOLISMO E TRANSPORTE DE NUCLEOTÍDEO

METABOLISMO E TRANSPORTE DE CARBOIDRATO

METABOLISMO DE COENZIMA

METABOLISMO DE LIPÍDIO

TRADUÇÃO, ESTRUTURA RIBOSSOMAL E BIOGÊNESE

TRANSCRIÇÃO

REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO

BIOGÊNESE DA PAREDE/MEMBRANA/ENVELOPE CELULAR

MOTILIDADE CELULAR E SECREÇÃO

MODIFICAÇÃO PÓSPROTEÍNA, FUNÇÕES DE CHAPERONAS METABOLISMO E TRANSPORTE DE ÍONS INORGÂNICOS

BIOSSÍNTESE, TRANSPORTE E CATABOLISMO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOSTRANSDUÇÃO DE SINAL

C. violaceum

algumas regiões gênicas de interesse

biotecnológico vêm sendo caracterizadas, podendo-se destacar os genes

biental (Carepo et al.



envolvidos na form




mais especificamente, genes

(Figura 1).


foram classificadas como hipotéticas



HIPOTÉTICAS









TRANSCRIÇÃO




MODIFICAÇÃO PÓSPROTEÍNA, FUNÇÕES DE CHAPERONAS METABOLISMO E TRANSPORTE DE ÍONS INORGÂNICOS


C. violaceum.


se destacar os genes

et al., 2004); genes que



envolvidos na formação de biofilme




, genes

de reparo de DNA


m classificadas como hipotéticas














MODIFICAÇÃO PÓS-TRADUCIONAL, TURNOVER DE PROTEÍNA, FUNÇÕES DE CHAPERONAS METABOLISMO E TRANSPORTE DE ÍONS INORGÂNICOS




, 2004); genes que



ação de biofilme




de reparo de DNA













TRADUCIONAL, TURNOVER DE PROTEÍNA, FUNÇÕES DE CHAPERONAS METABOLISMO E TRANSPORTE DE ÍONS INORGÂNICOS

BIOSSÍNTESE, TRANSPORTE E CATABOLISMO DE

3



, 2004); genes que

conferem resistência à drogas, como o antibiótico cloranfenicol (Fantinatti-


ação de biofilme



que atuam na patogênese bacteriana e desenvolvimento

de reparo de DNA









TRADUCIONAL, TURNOVER DE

METABOLISMO E TRANSPORTE DE ÍONS INORGÂNICOS

BIOSSÍNTESE, TRANSPORTE E CATABOLISMO DE

4

40 % do patrimônio genético desta espécie ainda permanecem desconhecidos

(Figura 1).

A comparação das ORFs de C. violaceum com as de outros organismos

revelou similaridades com Ralstonia solanacearum, Neisseria meningitidis e

Pseudomonas aeruginosa (Parkhill et al., 2000; Salanoubat et al., 2000; Stover et al.,

2000). A similaridade encontrada com a R. solanacearum é na maior parte

relacionada com a motilidade celular, modificações pós-traducionais, transporte de

íons inorgânicos e biossíntese de metabólitos secundários (Vasconcelos et al.,

2003). Grande parte das ORFs identificadas apresenta-se especificamente

relacionada à habilidade da C. violaceum em interagir e responder ao ambiente, o

que garante grande adaptabilidade e versatilidade a este organismo (Vasconcelos et

al., 2003). É possível que as ORFs hipotéticas conservadas ou hipotéticas presentes

em C. violaceum possam fornecer genes novos relacionados à resposta ao estresse

com igual ou superior potencial biotecnológico aos identificados até o momento.

Por exemplo, em análise comparativa entre os genomas de C. violaceum e

Escherichia coli foram encontradas 59 e 72 ORFs relacionadas a reparo de DNA,

respectivamente, onde todas as vias de reparo de DNA foram representadas (Duarte

et al., 2004). Esta diferença pode estar relacionada ao fato de E. coli ser o modelo

bacteriano melhor estudado quanto aos mecanismos de reparo de DNA. De fato, em

E. coli são encontrados genes de reparo que não foram localizados em outras

bactérias, o que nos leva a questionar a uniformidade funcional de alguns genes de

reparo de DNA, e até de mecanismos de reparo conhecidos. Considerando que C.

violaceum é uma bactéria de vida livre, estando exposta a uma série de agentes

mutagênicos ambientais como a luz ultravioleta (UV), é possível supor que exista um

número maior de genes envolvidos com a proteção do material genético do que o

inicialmente estimado. Corroborando com essa hipótese, dados recentes de nosso

laboratório indicam que C. violaceum apresenta resistência significativamente

superior que E. coli a agentes como luz UV, peróxido de hidrogênio (H2O2) e alguns

metais pesados (Vieira et al., em preparação), sugerindo que C. violaceum

apresente sistemas mais eficientes de proteção contra estresse oxidativo.

A finalização de projetos genomas de eucariotos e procariotos vem

fornecendo uma base de informações que tem possibilitado o desenvolvimento de

trabalhos de grande interesse biotecnológico. Porém, sabe-se que o

seqüenciamento dos genes permite identificar funções por homologia com genes já

5

descritos, ou seja, como citado anteriormente, apenas parte das seqüências

identificadas possui função conhecida. Entre 20 a 40 % desses genomas têm sido

anotados como ORFs (Open Read Frames) hipotéticas ou hipotéticas conservadas,

ou seja, deve existir uma série de novos genes que permitam ao organismo

responder às adversidades ambientais (Pagani et al., 2012; Windsor e Mitchell-Olds,

2006), a exemplo do que é esperado para C. violaceum. O conhecimento de genes

novos ou novas funções continuam sendo um grande desafio a ser vencido, uma

vez que, se não é observada homologia com seqüências já descritas, em geral não

tem sido possível inferir funções. Além disso, alguns genes são identificados com

funções já descritas, mas com baixa similaridade (< 30 %), sendo, portanto, de

fundamental importância investir no desenvolvimento de métodos para prospecção

de novos genes ou de novas funções para genes com potencial biotecnológico.

A construção de uma biblioteca genômica proporciona a realização de

ensaios funcionais que permitem identificar genes de interesse. Cepas de E. coli

proficientes e/ou deficientes em funções específicas vem sendo utilizadas para

construção de bibliotecas genômicas permitindo conhecer os diferentes genes,

proteínas e sistemas relacionados a resposta ao estresse. A exemplo disso, algumas

cepas proficientes e/ou deficientes em vias de reparo de DNA que visam à seleção

de genes relacionados à resistência a agentes mutagênicos, vem permitindo

conhecer os diferentes sistemas de reparo, bem como, as moléculas envolvidas

nesses processos (Doudney e Rinaldi, 1985; Sambrook e Russell, 2001; Clauß M e

Grotjohann, 2009). Dessa forma, a construção de biblioteca genômica de C.

violaceum em cepa de E. coli deficiente em reparo de DNA nos permite a seleção de

genes candidatos cujas funções estejam relacionadas à resposta ao estresse e a

manutenção da integridade genômica. Assim, utilizando uma abordagem genômica

é possível explorar mecanismos de resposta e defesa em diferentes bactérias, não

se restringindo somente ao modelo clássico normalmente utilizado (E. coli).

A busca de novos modelos bacterianos, principalmente a identificação de

genes novos relacionados à resposta ao estresse pode ampliar nosso conhecimento

a cerca dos mecanismos celulares de defesa desses organismos.

6

1.3 Mecanismos de Proteção e Resposta ao Estresse

A sobrevivência de um organismo depende em parte de sua habilidade de

sentir e responder às mudanças ambientais. A proteção adequada a diferentes

situações de estresse ambiental é uma das características básicas inerente a

qualquer organismo. Uma vez que essas situações podem afetar estruturas,

processos celulares e moleculares, desse modo, mecanismos de proteção são

necessários para neutralizar os potenciais danos causados por essa condição de

estresse, tanto em procariotos como em eucariotos. A regulação de genes induzidos

por estresse pode ocorrer ao nível da transcrição ou tradução ou por modificações

pós-traducionais. Sob condições de estresse, alterações metabólicas, moleculares e

estruturais, como modificações na dupla fita de DNA podem atuar induzindo ou

reprimindo genes. Em bactérias, proteínas induzidas em resposta ao estresse têm

seu papel tanto na sobrevivência como também estão implicadas na manifestação

de sua patogenicidade (Chowdhury et al., 1996; Forsberg et al., 2001; Boor, 2006;

Skoneczna et al., 2007).

Bactérias desenvolveram respostas regulatórias rigorosas frente a situações

de estresse como a privação de aminoácidos, carbono, nitrogênio e limitação de

fosfato. Em E. coli os produtos dos genes relA e spoT regulam o acúmulo de

moléculas efetoras em resposta à estas privações, como as moléculas guanosina

tetrafosfato e pentafosfato (ppGpp e pppGpp, respectivamente). Estes nucleotídeos

hiperfosforilados se ligam diretamente à RNA polimerase bacteriana alterando a

atividade transcricional de alguns genes, como, por exemplo, aqueles que codificam

enzimas metabólicas, especialmente aquelas envolvidas na biossíntese de

aminoácidos e na hidrólise de proteína, bem como, o gene do fator sigma S. Este

fator se liga ao núcleo da RNA polimerase bacteriana e induz a expressão de genes

específicos da fase estacionária e de resposta ao estresse (Dabrowska et al., 2006).

A produção de biofilme é outro exemplo importante de reprogramação da

expressão gênica e síntese proteica que ocorrem nas células e contribui para sua

defesa e seu desenvolvimento. A regulação da expressão gênica para formação do

biofilme requer uma combinação de diferentes sinais ambientais que podem modular

a atividade de redes reguladoras complexas. Atualmente, se conhece pouco a

respeito dessas redes reguladoras da formação de biofilme. Assim, muitos

7

reguladores globais, incluindo reguladores de resposta ao estresse celular e

ambiental, e sistemas quorum sensing, podem afetar tanto a formação, como

manutenção e até mesmo a dispersão do biofilme, tanto em bactérias gram-positivas

quanto em gram-negativas (Landini, 2009).

Logo, a sobrevivência do organismo depende da estabilidade do seu genoma,

que resulta da ação de diferentes mecanismos, como a replicação e os mecanismos

que reparam os danos que ocorrem continuadamente no DNA. Assim, dentre os

mecanismos de resposta ao estresse, as vias de reparo de DNA são constituídos de

moléculas e sistemas bastante conservados em todos os seres vivos, como será

enfatizado adiante.

Estudar os mecanismos envolvidos na proteção ao estresse celular tem

importantes implicações, uma vez que, muitas doenças humanas se desenvolvem

como conseqüência de uma resposta deficiente ao estresse. O conhecimento da

biologia dos organismos envolvidos, de suas relações ambientais e de patogênese,

poderá refletir em avanços nas áreas das ciências da saúde e economia.

1.3.1 Mecanismos de Reparo e Tolerância ao Dano no DNA

Alterações na seqüência de bases do DNA ocorrem espontaneamente e

podem ser intensificadas por agentes mutagênicos biológicos, químicos ou físicos.

Interações com esses agentes endógenos ou exógenos à célula podem gerar uma

variedade de alterações (lesões) na estrutura do DNA. Assim, as lesões podem ser

classificadas como espontâneas ou induzidas, resultantes da ação de agentes

exógenos ou endógenos. Estas lesões podem afetar processos celulares

primordiais, como replicação e transcrição, e ainda resultar em mutações no material

genético (Friedberg et al., 1995, Friedberg et al., 2004).

Desse modo, as células necessitam remover tais lesões do DNA para garantir

que suas funções aconteçam normalmente e que sua integridade genômica seja

mantida. Essa remoção é feita através de uma série de mecanismos de reparo de

DNA, os quais são tão importantes biologicamente que se mantêm conservados em

todos os seres vivos conhecidos até o momento (Eisen e Hanawalt, 1999; Grogan,

2000; Wood et al., 2001).

8

Células deficientes em reparo de DNA são mais susceptíveis à mutagênese e,

conseqüentemente, a predisposição dos organismos a doenças, como o câncer e

processos degenerativos (por exemplo, envelhecimento celular) e/ou morte. As vias

associadas ao reparo do DNA podem ser divididas em três grandes grupos, sendo

eles: 1) reparo direto (fotorreativação e alquil transferência); 2) reparo por excisão

(excisão de base – BER; excisão de nucleotídeos – NER; e reparo por mau

pareamento - Mismatch Repair - MMR) e 3) reparo por recombinação (RR)

(Friedberg e Fischhaber, 2003; Sancar et al., 2004). A Figura 2 mostra os tipos de

sistemas de reparo que atuam sobre as principais lesões no DNA produzidas por

uma ampla variedade de agentes (Morita et al., 2010).

Sistemas de reparo de DNA de alguns organismos representantes de grandes

grupos têm sido detalhadamente estudados (E. coli, Homo sapiens e fungos) (Eisen

e Hanawalt, 1999; Zeibell et al., 2007), embora outras espécies, como a Caulobacter

crescentus, estejam sendo também exploradas (Galhardo et al., 2005; Martins-

Pinheiro et al., 2007).

Figura 2. Principais tipos de agentes mutagênicos, lesões e sistemas de reparo

(Modificado de Morita et al., 2010).

9

O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é o principal sistema de remoção

de danos causados por luz UV e por agentes químicos que destorcem a dupla

hélice. É o sistema de reparo mais flexível e pode agir sobre uma ampla variedade

de adutos de DNA reconhecendo distorções na molécula. Como também descrito

anteriormente, os substratos do NER incluem dímeros de pirimidinas do tipo

ciclobutano (CPDs; dímeros de pirimidina = T-T, C-C, C-T) ou (6-4) fotoprodutos,

adutos químicos, DNA cross-links e alguns tipos de danos oxidativos (Batty e Wood,

2000; Nakano et al., 2009; Morita et al., 2010). O sistema NER já foi descrito em

espécies representantes de todos os reinos dos seres vivos (Morita et al., 2010).

O sistema NER tem duas sub-vias de reparo, o reparo genômico global

(global genomic repair - GGR) e o reparo acoplado à transcrição (transcription-

coupled repair - TCR) (Crowley e Hanawalt, 1998; Svejstrup, 2002; Gillet e Schärer,

2006; Maddukuri et al., 2007; Farnell, 2011). O GGR realiza remoção de lesões em

todo o genoma, enquanto o TCR remove preferencialmente e mais rapidamente

lesões na fita que está sendo transcrita. No GGR, em procariotos também

denominado sistema de reparo UvrABC, há a participação de quatro proteínas,

UvrA, UvrB, UvrC e UvrD que realizam a retirada da lesão que está impedindo a

replicação. A DNA polimerase replicativa interrompe sua atividade quando encontra

algum uma lesão (por exemplo, os dímeros gerados pela luz UV), levando a

interrupção da replicação. A atuação do sistema UvrABC inicia com o

reconhecimento e excisão da lesão. A UvrA forma dímeros que interagem com UvrB

(complexo UvrA2B); o complexo formado reconhece e se liga a lesão (UvrA2B -

DNA), resultando em mudança conformacional do complexo seguido de liberação

das moléculas de UvrA. A UvrC logo é recrutada ao complexo UvrB-DNA e excisa a

lesão do DNA através dos dois sítios catalíticos, um no N-terminal e o outro no C-

terminal, onde atuam no lado 3’ e 5’, respectivamente. A UvrD Helicase atua

retirando a seqüência excisada (12-13 nucleotídeos). Posteriormente, a DNA

polimerase I preenche a lacuna formada, que é unida pela DNA ligase restaurando a

molécula (Figura 3) (Grossman et al. 1986; Nakano et al., 2009; Jaciuk et al., 2011).

O TCR requer a participação das mesmas quatro proteínas e, adicionalmente, da

RNA polimerase e pelo menos um fator acoplado ao reparo transcricional, como o

TRCF (transcription-repair coupling factor) em E. coli que é transcrito a partir do

gene mfd (mutation frequency decline). No TCR, o bloqueio da atividade da RNA

polimerase é responsável pelo início do reparo - ela interrompe a transcrição quando

10

encontra um aduto. Após a paralisação da transcrição o TRCF libera a RNA

polimerase do DNA e em seguida recruta UvrA que se liga ao DNA. As reações

subseqüentes procedem da mesma forma como no GGR (Mellon e Hanawalt, 1989;

Selby e Sancar, 1993; Svejstrup, 2002; Truglio et al., 2006; Farnell, 2011).

Figura 3. Esquema de NER bacteriano. Inicialmente há o reconhecimento e

excisão da lesão pela UvrA2B e UvrC, seguida da atuação da Helicase (UvrD); logo

após a DNA polimerase I preenche a lacuna que é unida pela DNA ligase (Nakano et

al., 2009).

11

Algumas proteínas como a RecA são peças-chaves em determinados

sistemas e a caracterização de sua(s) função(ões) permite conhecer diferentes

mecanismos. Em E. coli a proteína RecA atua de duas formas: como fator essencial

em sistemas de recombinação pelas vias recBCD ou recF e como regulador

(positivo) do sistema SOS (Goerlich et al., 1989; Konola et al., 2000; Bichara et al.,

2006). O reparo por recombinação é uma estratégia livre de erro (error-free) já que

se utiliza da recombinação homóloga, assim, a informação contida na fita

complementar serve de molde para replicação, havendo a troca entre seqüências

idênticas ou quase idênticas do DNA. Como citado anteriormente, o reparo por

recombinação mediado pela proteína RecA em E. coli atua por duas possíveis vias

independentes, via RecF e via RecBC (Bichara et al., 2006).

Alguns mecanismos fogem ao padrão dos sistemas de reparo já que não

retiram a lesão. Estes são denominados mecanismos de tolerância, como por

exemplo, a Síntese Translesão (TLS; síntese de DNA sujeito a erro ou error-prone)

em função da Resposta SOS. No Sistema SOS a presença da lesão no DNA regula

mais de 40 genes envolvidos na expressão de proteínas de reparo de DNA,

replicação e recombinação sob o controle do repressor LexA, que atua regulando as

seqüências promotoras presentes nestes genes (Schlacher et al., 2006). A RecA

pode auxiliar a resposta de tolerância celular de duas maneiras, por reparo por

recombinação (RR) e/ou síntese translesão (TLS); ela cliva o repressor transcricional

LexA, levando a ativação do sistema SOS, resultando no aumento dos níveis de

algumas proteínas do sistema de recombinação genética (RecA, RecN, RecQ e

RecD), do NER (UvrABC), de síntese translesão (síntese de DNA sujeito a erro,

error-prone) [DNA Pol II (polB), Pol IV (dinB) e Pol V (UmuDC)] e SfiA. Assim, RecA

age aumentando a capacidade de reparo de DNA das células, como também, a

tolerância ao dano, replicação do DNA e mutagênese (Wagner et al., 2002; Asad et

al., 2004). Entretanto, dependendo da natureza e contexto da lesão, Pol II e Pol IV

podem estar envolvidas em síntese translesão livre de erro (error-free) (Napolitano et

al., 2000).

Os mecanismos de tolerância já foram descritos em diversos organismos

(bactérias, eucariotos, etc.) (Friedberg et al., 1995; Cox, 2001; Pham et al., 2001).

Em C. violaceum foram identificadas algumas das proteínas que participam da

resposta SOS, mas o repressor transcricional da resposta SOS, o LexA, está

ausente neste organismo (Duarte et al., 2004), além da DNA Polimerase II e da

12

subunidade

da DNA Pol III. Por outro lado, há quatro prováveis genes dnaQ

(subunidade ) distribuídos no genoma.

Embora seja comum a conservação das funções de enzimas de reparo entre

as diversas espécies, muitas vezes não ocorre a conservação da seqüência protéica

(Grogan, 2000). Assim, as enzimas de reparo são caracterizadas através da

identificação dos substratos que atuam e de como atuam (mecanismo), podendo

esta caracterização ser obtida por meio de diferentes metodologias, entre elas

ensaios in vivo utilizando cepas mutantes. Em estudos recentes, foram identificadas

novas enzimas atuando em alguns sistemas de reparo, podendo as mesmas se

sobrepor as funções de enzimas já conhecidas. Possivelmente essas novas enzimas

podem funcionar como alternativas a ausência ou quantidade de outras, podendo

ainda participar de diferentes vias de reparo (Alseth et al., 2006; Morita et al., 2008).

1.3.2 Síntese Translesão e DNA Polimerases

A Síntese Translesão (TLS) é mediada por DNA polimerases especializadas.

Em resumo, existem três grupos de DNA Polimerase em E. coli, em cada um desses

grupos participam uma ou mais dessas enzimas com funções relacionadas, embora

específicas, como anteriormente citado e mostrado abaixo:

- Grupo I: DNA Pol I (Família A): Replicação (enzimática) e Exonuclease 5’–3’

(remoção de Primer);

- Grupo II: DNA Pol II (Família B), IV e V (Família Y): Reparo de DNA;

- Grupo III: DNA Pol III (Família C): Replicação = Replicase (maior fidelidade e

processividade).

Assim, a DNA Polimerase I é uma enzima replicativa, mas sua principal

função é de exonuclease 5’–3’ que permite que sejam removidos os primers de RNA

formados pela primase e sua substituição por desoxinucleotídeos (DNA) tanto em

filamentos contínuos (leading) como tardios (lagging). As DNA Polimerases II, IV e V

estão envolvidas nos sistemas de reparo de DNA e têm um papel importante no

resgate de forquilhas de replicação paradas, embora algumas (II e IV) possam

ultrapassar alguns tipos de danos ao DNA (bypass) (Napolitano et al., 2000; Wagner

et al., 2002).

13

Diferentes DNA Polimerases auxiliam a Holoenzima DNA Polimerase III (Pol

III, replicativa) a passar pelo dano (bypass), seja por uma forma livre de erro (error-

free), em que o desoxinucleotídeo certo é inserido frente à lesão, ou por uma forma

suscetível ao erro (error-prone), onde qualquer desoxinucleotídeo (certo ou errado)

pode ser inserido frente ao dano (Wagner et al., 2002). No entanto, se o

desoxinucleotídeo errado for inserido podem surgir mutações no DNA lesionado

(Zhang et al., 2000). Segundo Wang (2001) a justificativa que se tem a respeito

desse comportamento “errado” da TLS é atribuída a importância biológica de se

manter vivo, principalmente para procariotos, já que são unicelulares, ou seja, o

importante é sobreviver mesmo que para isso ocorra mutação. Além disso, a TLS

pode promover o aumento de mutações, processo essencial a todas as espécies,

seja ela um procarioto ou um eucarioto, visto que as mutações permitem a evolução.

Pol II e Pol IV estão envolvidas em síntese translesão e mutagênese (in vivo)

e podem ter sua síntese aumentada quando necessário, enquanto a DNA

Polimerase V (Pol V) ocorre apenas nas células SOS-induzidas (Wagner et al.,

2002). Sabe-se que essas enzimas podem atuar sozinhas ou combinadas com

outras polimerases e podem competir entre elas devido à especificidade, frente a

uma ampla variedade de lesões (Fuchs et al., 2001; Wagner et al., 2002). A

mutagênese SOS é em grande parte resultado da ação da DNA Pol V devido a sua

baixa fidelidade durante a síntese tornando-a susceptível a erro (error-prone). Esta

polimerase é composta do polipeptídeo UmuD'2C que é composto por proteínas

codificadas pelo operon umuDC. Além da função em TLS de UmuD'2C, foi

observada que os produtos gênicos de umuDC participam de checkpoint no DNA

(DNA damage checkpoint), isso ocorre devido a formação de diferentes produtos

gênicos a partir de alelos variantes de umuC, em que cada um destes produtos

podem atuar em funções distintas (Beuning et al., 2009). Pol V é estritamente

regulada na célula a fim de evitar sobrecarga de mutação genômica, embora possa

ter alguma atividade na presença unicamente de DNA fita simples (Schlacher et al.,

2006). Por outro lado, filamentos da nucleoproteína RecA (RecA*), formados por

ligação da RecA ao DNA fita simples (single-stranded DNA) com ATP, são

essenciais para TLS catalisada por Pol V tanto in vivo como in vitro (Patel et al.,

2010). A proteína de ligação ao DNA fita simples (SSB; single-strand DNA-binding

protein) também é requerida para a ação da Pol V além de RecA (Maor-Shoshani e

Livneh, 2002; Arad et al., 2008).

14

Evidências sugerem que a DNA Pol III pode participar do processo de reparo

a lesão na quebra da dupla fita de DNA (DSB - double-strand-break) após estresse,

inclusive competindo com outras DNA polimerases. Além disso, as cinco

polimerases tem capacidade de ligação ao ß

clamp (“grampo”) e mais de uma

poderia ou não estar presente ao mesmo tempo, embora somente uma torna-se

funcional (Indiani et al., 2005; Hastings et al., 2010). Desse modo, embora o clamp

faça parte da holoenzima DNA Pol III há a interação com outras proteínas ou

subunidades protéicas, esse processo tem sido estudado para a compreensão da

maquinaria de ação de replissomas, já bastante caracterizados, contudo, há muito a

ser investigado para compreender completamente a ação de seus constituintes.

1.3.2.1 Holoenzima DNA Polimerase III

Replissomas são maquinarias multiprotéicas dinâmicas capazes de reproduzir

as duas fitas do DNA simultaneamente. A análise da estrutura e função do

replissoma da Holoenzima DNA Polimerase de E. coli possibilita generalizar essas

informações para outras bactérias e células eucarióticas. Como por exemplo, em um

estudo proposto há mais de 30 anos por Sinha e colaboradores (1980) em que se

permitiu a compreensão do funcionamento básico do replissoma em bacteriófago T4,

mostrando haver a utilização de clamps de fixação ao DNA e carreadores desses

clamps (clamp loaders) para coordenar as ações necessárias ao modelo de síntese

incluindo a fita descontínua (lagging). Esse modelo foi bastante esclarecedor, já que

todas as células apresentam clamps e sliding clamps, o que permitiu fazer

inferências a outros organismos, como por exemplo, E. coli (Yao e O’Donnell, 2008).

Estudos recentes revelam mecanismos relacionados ao replissoma que lhe

permite contornar as lesões em qualquer uma das fitas de DNA (Yao e O’Donnell,

2008). Durante estes processos as polimerases têm funções específicas no

replissoma, embora as mesmas possam realizar outras funções, como citado

anteriormente (Hastings et al., 2010). Os mecanismos que estão por trás dessas

ações podem envolver giros no DNA, facilitando a síntese dos fragmentos de

Okazaki que surgem a partir da fita descontínua (lagging) (Yao e O’Donnell, 2008).

15

Todos os replissomas celulares contêm algumas atividades enzimáticas em

comum. Estas incluem enzimas como: 1) DNA helicase – desnatura a dupla-hélice

de DNA; 2) DNA primase – produz os curtos RNA iniciadores (RNA primers) para

iniciar a síntese de DNA e 3) DNA polimerases – polimerizam fitas novas a partir das

fitas moldes contínuas (leading) e descontínuas (lagging). As proteínas de ligação ao

DNA fita simples (SSBs) evitam a renaturação do DNA e a ação de nucleases. Para

a replicação das células de todos os grupos de seres vivos (archea, eubactéria e

eucariotos) são utilizados “grampos deslizantes” (sliding clamps) circulares, que são

constituídos por proteínas que envolvem a dupla fita de DNA e mantém a DNA

polimerase de alta processividade ligada à molécula (Jeruzalmi et al., 2002;

O’Donnell, 2006; Reyes - Lamothe et al., 2010).

Os clamp loaders são espirais pentaméricos que se ligam ao DNA de uma

forma estrutural específica, este complexo abre o clamp que está sendo carreado,

localiza e o abre em torno da molécula de DNA, usando energia a partir de hidrólise

de ATP para esta reação. A estrutura do clamp em E. coli ligado ao DNA tem

algumas implicações, por exemplo, como diferentes polimerases funcionam sobre os

sliding clamps e como ocorre a troca entre elas (Yao e O’Donnell, 2008). O núcleo

ativo da pol III (core) consiste de três subunidades,

(DNA polimerase),

(3’-5’

exonuclease) e . Em cada uma das fitas contínua e descontínua um núcleo da Pol

III associa-se ao clamp para em seguida processar a síntese de DNA (O’Donnell,

2006).

Na Tabela 1 estão identificadas as proteínas que participam da forquilha de

replicação em E. coli e um resumo de suas funções. Na Figura 4 pode-se observar a

estrutura da forquilha de replicação em E. coli, em que há presença das moléculas

envolvidas, como a Helicase DNA B; a Primase DNA G; a Holoenzima DNA

Polimerase III com o núcleo (core) das fitas contínua e descontínua, mais o clamp

loader e o sliding clamp; e a proteína de ligação ao DNA fita simples.

16

Tabela 1. Proteínas que participam da forquilha de replicação em E. coli

(Lamothe et al., 2010).

Subunidade No Gene Função

Núcleo Polimerase III

2 dnaE DNA Polimerase (Replicativa) / Interação com o clamp

2 dnaQ Exonuclease 3’ – 5’ (Revisora)

2 holE Liga e estimula a subunidade

ß Clamp ß

4 dnaN Sliding clamp

Clamp loader (complexo ) /

3 dnaX ATPase, Liga o clamp ao DNA e a DNAB

1 holA ATPase, Liga-se ao clamp e o abre

’ 1 holB ATPase, Auxilia na montagem e estabilização do clamp loader

1 holC Liga SSB

1 holD Liga

a , estabiliza o clamp loader

Primase DNA G 1 dnaG Síntese de Iniciador de RNA

Helicase DNA B 6 dnaB Abre/desenrola a fita de DNA

Ligação ao ssDNA SSB 4 ssb Liga ssDNA, evita a formação de pontes de hidrogênio

17

Figura 4. Estrutura da forquilha de replicação em E. coli. Os sliding clamps são

montados (ß clamp) em volta do DNA pela maquinaria multiprotéica do clamp loader

(complexo ); este complexo carrega o clamp, localiza e o abre em torno da

molécula de DNA, usando energia a partir de hidrólise de ATP para esta reação.

Somado a essas moléculas, o núcleo da DNA Polimerase III (Pol III Core) é o sítio

catalítico da Holoenzima. Na maquinaria de replicação temos o envolvimento ainda

de outras moléculas: Helicase DNA B; Primase DNA G; e proteína SSB (Modificado

de Yao e O’Donnell, 2008).

18

Como citado anteriormente, os sistemas de reparo são bem conservados

desde bactérias mais simples até eucariontes mais complexos. A ausência da

proteína LexA em C. violaceum pode indicar uma resposta SOS constitutiva ou a

regulação por alguma outra proteína ainda desconhecida (Duarte et al., 2004). Em

outras ß-proteobacteria a proteína LexA também não está presente, com exceção na

espécie Ralstonia solanacearum, sugerindo uma perda deste gene em um evento

evolutivamente recente para essas ß-proteobacterias (C. violaceum, Neisseria

gonorrhoeae e N. meningitidis). Curiosamente, a DNA Polimerase II e a subunidade

da DNA Pol III também não estão presentes em C. violaceum, entretanto, há

quatro prováveis genes dnaQ (subunidade ) presentes no genoma deste

organismo. Dados relevantes obtidos a partir de estudos com esse microorganismo

podem ser extrapolados para outros organismos, incluindo a espécie humana. A

ampla relação entre deficiência em sistema de reparo de DNA e propensão a

formação de tumores e envelhecimento (Eisen e Hanawalt, 1999; Costa et al., 2003;

Maddukuri et al., 2007; Fousteri e Mullenders, 2008; Shuck et al., 2008) indica que

novas informações podem abrir diversas perspectivas na área de saúde humana.

Deste modo, pelo seu potencial biotecnológico C. violaceum mostra-se um

organismo interessante ao conhecimento de seus genes e enzimas relacionadas às

vias de reparo / replicação, bem como, aos diferentes mecanismos de defesas, já

que se trata de um organismo de vida livre.

Além disso, C. violaceum pode ser considerado um modelo para estudo de ß-

proteobacterias, e bactérias de vida livre, cuja genética tem sido pouco explorada em

relação ao que tem sido feito com bactérias classicamente patogênicas.

Neste contexto, o presente trabalho visa contribuir para melhorar o

conhecimento genético de C. violaceum, principalmente, com a identificação de

genes associados a processos celulares em resposta ao estresse (p. ex.: estratégias

de defesa / replicação / reparo de DNA). Com esse propósito, foi realizada a

construção da biblioteca genômica de C. violaceum, a partir desta foi feita a seleção

e isolamento de clones de interesse, com posterior caracterização funcional. As

análises destes clones em um perfil funcional e genômico possibilitaram fazer

inferências a respeito da interação entre esses genes e, pelo menos em parte, do

comportamento de C. violaceum em resposta à luz ultravioleta.

19

2 Objetivos

2.1 Geral

O principal objetivo deste trabalho foi identificar genes de C. violaceum

(linhagem ATCC 12472) envolvidos com a resposta ao estresse, mais

especificamente, mecanismos de reparo de DNA e/ou manutenção da integridade

genômica.

2.2 Específicos

Para tanto, foram definidos os seguintes objetivos específicos:

- Selecionar clones de C. violaceum que expressem genes relacionados à

tolerância e/ou resistência a luz ultravioleta (UVC);

- Seqüenciar clones selecionados e analisar as seqüências in silico para

identificação de genes e predição de possíveis funções;

- Analisar os clones de interesse por ensaios de complementação funcional e

mutagenicidade;

- Identificar por RT-PCR (Transcriptase Reversa) as possíveis ORFs em

operon, bem como, analisar sua expressão a partir de variações e análise relativa.

84

6 Conclusões

- Neste trabalho um operon em C. Violaceum indutível em resposta ao

tratamento foi identificado envolvido com resposta ao estresse. Apesar deste operon

ser encontrado em outros organismos, sua ativação sob estresse não havia sido

relatada anteriormente;

- O sinergismo observado em relação ao aumento da sobrevivência de

DH10B na presença das ORFs CV_3722 e CV_3724 após tratamento com UV

sugere que as proteínas codificadas por estes genes atuam em resposta ao estresse

em vias independentes;

- A ORF CV_3724 é homologa a uma proteína hipotética conservada e

nossos dados abrem perspectivas para a caracterização de sua função em relação à

resposta ao estresse;

- Podemos destacar uma possível contribuição das ORFs CV_3721 (PilZ) e

CV_3723 (TMK), uma vez que estas podem estar envolvidas em processos que

podem favorecer o crescimento sob estresse, como a produção de biofilme e síntese

de desoxinucleotídeos, respectivamente;

- A ORF CV_3722 (HolB) devido a sua contribuição a mutagênese pode

complementar a deficiência de RecA por sua atividade sobre a ativação do

clamp

ter um efeito estimulante na atividade da Pol IV;

- Os clones PLE1G, PLE7B, PLE10B e PLE12H complementam a cepa

DH10B por desempenharem funções à resposta celular frente ao estresse;

- A ORF CV_1667 (PLE1G) que apresenta domínio GGDEF com função

relacionada a biossíntese do nucleotídeo c-di-GMP (2º mensageiro) deve favorecer a

sobrevivência do organismo devido a função regulatória deste mensageiro, o que

permite uma resposta inter-relacionada com outras proteínas, como a PilZ (ORF

CV_3721) na formação de biofilme;

- A ORF CV_0391 que codifica uma proteína hipotética com domínios

ICL/PEMP) (PLE7B) pode estar atuando no aumento de mutagenicidade no clone

devido à atividade desta proteína no fornecimento de energia, evento primordial aos

processos celulares de defesa e sobrevivência;

85

- A capacidade de complementação e mutagenicidade do clone PLE10B na

da cepa DH10B não pode ser indicado devido a não identificação das ORFs

hipotéticas (CV_1311 e 1312 sem domínios conservados), bem como, da não

associação de função específica da Isonitrila Hidratase (ORF CV_1313) relacionada

a estas atividades;

- Mesmo de forma redundante, a ORF CV_4160 (subunidade a

da RNA Pol

de C. violaceum) deve ter contribuído na complementação (viabilidade) da cepa

DH10B, já que atua na transcrição, processo essencial na resposta celular a agentes

estressores;

- Os dados obtidos neste trabalho são relevantes uma vez que a resposta ao

estresse em bactérias de vida livre é mal compreendido.

86

Referências Bibliográficas

Abdallah J, Caldas T, Kthiri F, Kern R and Richarme G. YhbO Protects Cells against

Multiple Stresses. Journal of Bacteriology, 189(24): 9140–9144. 2007.

Adnan M, Morton G, Singh J, Hadi S. Contribution of rpoS and bolA genes in biofilm

formation in Escherichia coli K-12 MG1655. Mol. Cell. Biochem., 342(1-2): 207-

213. 2010.

Alm RA, Bodero AJ, Free PD and Mattick JS. Identi cation of a Novel Gene, pilZ,

Essential for Type 4 Fimbrial Biogenesis in Pseudomonas aeruginosa, Journal of

Bacteriology, 178(1): 46–53. 1996.

Alseth I, Rognes T, Lindback T, Solberg I, Robertsen K, Kristiansen KI, Mainieri D,

Lillehagen L, Kolsto AB and Bjoras M. A new protein superfamily includes two

novel 3-methyladenine DNA glycosylases from Bacillus cereus, AlkC and AlkD.

Mol Microbiol, 59(5): 1602. 2006.

Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W and Lipman DJ.

Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search

programs. Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402. 1997.

Amikam D and Galperin MY. PilZ domain is part of the bacterial c-di-GMP binding

protein. Bioinformatics, 22(1): 3–6. 2006.

Andrighetti-Frohner CR, Antonio RV, Creczynski-Pasa TB, Barardi CR and Simões

CM. Cytotoxicity and potential antiviral evaluation of violacein produced by

Chromobacterium violaceum. Mem Inst Oswaldo Cruz, 98(6): 843-848. 2003.

Arad G, Hendel A, Urbanke C, Curth U and Livneh Z. Single-stranded DNA-binding

Protein Recruits DNA Polymerase V to Primer Termini on RecA-coated DNA*.

Journal of Biological Chemistry, 283(13): 8274–8282. 2008.

Asad NR, Asad LMBO, Almeida CED, Felzenszwalb I, Cabral-Neto JB and Leitão,

AC. Several pathways of hydrogen peroxide action that damage the E. coli

genome. Genetics and Molecular Biology, 27(2): 291-303. 2004.

Bandyopadhyay S and Cookson MR. Evolutionary and functional relationships within

the DJ1 superfamily. BMC Evolutionary Biology, 4: 6(1-9). 2004.

Batty DP and Wood RD. Damage recognition in nucleotide excision repair of DNA.

Gene, 241: 193-204. 2000.

87

Beuning PJ, Chan S, Waters LS, Addepalli H, Ollivierre JN and Walker GC.

Characterization of Novel Alleles of the Escherichia coli umuDC Genes Identi es

Additional Interaction Sites of UmuC with the Beta Clamp. Journal of Bacteriology,

191(19): 5910–5920. 2009.

Bichara M, Pinet I, Origas M and Fuchs RP. Inactivation of recG stimulates the RecF

pathway during lesion-induced recombination in E. coli, DNA Repair (Amst), 5(1):

129-137. 2006.

Black CG, Fyfe JAM and Davies JK. Absence of an SOS-like system in Neisseria

gonorrhoeae. Gene, 208: 61-66.1998.

Bloom LB, Chen X, Fygenson DK, Turner J, O’Donnell M, Goodman MF. Fidelity of

Escherichia coli DNA Polymerase III Holoenzyme. The effects of ß,

complex

processivity proteins and e proofreading exonuclease on nucleotide

misincorporation efficiencies. Journal Biological Chemistry, 272(44): 27919–

27930. 1997.

Bonifati V, Rizzu P, Squitieri F, Krieger E, Vanacore N, Swieten JC, Brice A, Duijn

CM, Oostra B, Meco G and Heutink P. DJ-1 (PARK7), a novel gene for

autosomal recessive, early onset parkinsonism. Neurol Sci 24(3): 159–160. 2003.

Boone DR and Castenholz RW. In: Garrity, GM, ed.-in-chief. Bergey´s manual of

systematic bacteriology. vol. 1. 2nd ed. New York: Springer. 721p, 2001.

Boor KJ. Bacterial Stress Responses: What Doesn’t Kill Them Can Make Them

Stronger. PLOS Biology, 4(1): 18-20. 2006.

Bullard JM, Pritchard AE, Song M, Glover BP, Wieczorek A, Chen J, Janjic N and

McHenry CS. A Three-domain Structure for the

Subunit of the DNA Polymerase

III Holoenzyme

Domain III Binds ' and Assembles into the DnaX Complex.

Journal of Biological Chemistry, 277(15): 13246–13256. 2002.

Bunting KA, Roe SM, Pearl LH. Structural basis for recruitment of translesion DNA

polymerase Pol IV/DinB to the b-clamp. EMBO Journal, 22(21): 5883-5892. 2003.

Burnouf DY, Olieric V, Wagner J, Fujii S, Reinbolt J, Fuchs RPP and Dumas P.

Structural and Biochemical Analysis of Sliding Clamp/Ligand Interactions Suggest

a Competition BetweenReplicative and Translesion DNA Polymerases. J. Mol.

Biol., 335: 1187–1197. 2004.

Butala M, Zgur-Bertok D, Busby SJ. The bacterial LexA transcriptional repressor.

Cell. Mol. Life Science, 66(1), 82-93. 2009.

88

Byamukama D, Farnleitner AH, Kansiime F, Mana M, Burtscher M and. Mach RL.

Contrasting occurrence of Chromobacterium violaceum in tropical drinking water

springs of Uganda. Journal of Water and Health, 03.3: 229-238. 2005.

Campbell SC, Olson GJ, Clark TR and McFeters G. Biogenic production of cyanide

and its application to gold recovery. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 26: 134-139.

2001.

Carepo MSP, Azevedo JSN, Porto JIR, Bentes-Souza AR, Batista JS, Silva ALC and

Schneider MPC. Identification of Chromobacterium violaceum genes with

potential biotechnological application in environmental detoxification. Genetics

and Molecular Research, 3(1): 181-194. 2004.

Caris ME, Porto LM, Hauk P, Antonio RV. Produção de Desoxiviolaceína por

Chromobacterium violaceum. In: Resumos SINAFERM, Florianópolis – SC, 2003.

Casanueva AL, Paul L, Patrick S and Abratt VR. An AraC/XylS family transcriptional

regulator homologue from Bacteroides fragilis is associated with cell survival

following DNA damage. Federation of European Microbiological Societies

Microbiol Lett., 278: 249-256. 2008.

Chaperon DN. Construction and Complementation of In-Frame Deletions of the

Essential Escherichia coli Thymidylate Kinase Gene. Applied and Environmental

Microbiology, 72(2): 1288–1294. 2006.

Chen WP and Kuo TT. A simple and rapid method for the preparation of gram

negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Res., 21: 2260. 1993.

Cheng Y, Yang M and Matter AM. Characterization of a Gene Cluster Responsible

for the Biosynthesis of Anticancer Agent FK228 in Chromobacterium violaceum

No. 968. Applied and Environmental Microbiology. 11(73): 3460–3469. 2007.

Chowdhury R, Sahu GK and Das J. Stress response in pathogenic bacteria. J.

Biosci., 21(2): 149–160. 1996.

Clauß M and Grotjohann N. Comparative mutagenesis of Escherichia coli strains with

different repair deficiencies irradiated with 222-nm and 254-nm ultraviolet light.

Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 673(2):

83-86. 2009.

Coenye T, Van Acker H, Peeters E, Sass A, Buroni S, Riccardi G, Mahenthiralingam

E. Molecular mechanisms of chlorhexidine tolerance in Burkholderia cenocepacia

biofilms. Antimicrob. Agents Chemother., 55(5): 1912-1919. 2011.

89

Costa RM, Chigancas V, Galhardo RS, Carvalho H, Menck CF. The eukaryotic

nucleotide excision repair pathway. Biochimie, 85(11):1083-1099. 2003.

Cox MM, Goodman MF, Kreuzer KN, Sherratt DJ, Sandler SJ, Marians KJ.The

importance of repairing stalled replication forks. Nature, 404(6773): 37-41. 2000.

Cox MM. Historical overview: searching for replication help in all of the rec places.

P.N.A.S. (USA), 98(15): 8173-8180. 2001.

Crowley DJ and Hanawalt PC. Induction of the SOS Response Increases the

Efficiency of Global Nucleotide Excision Repair. Journal of Bacteriology, 180(13):

3345–3352. 1998.

Curti E, McDonald JP, Mead S, Woodgate R. DNA polymerase switching: effects on

spontaneous mutagenesis in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 71(2): 315-331.

2009.

Dabrowska G, Prusiniska J

and Goc A. The stringent response--bacterial mechanism

of an adaptive stress response. Postepy Biochem., 52(1): 87-93. 2006.

Davidsen T, Tuven HK, Bjørås M, Rødland EA and Tønjum T. Genetic Interactions of

DNA Repair Pathways in the Pathogen Neisseria meningitidis. Journal of

Bacteriology, 189(15): 5728–5737. 2007.

Dewitt SK and Adelberg EA. The Occurrence of a Genetic Transposition in a Strain of

Escherichia coli. Genetics, 47(5):577-585. 1962.

Dias JP, Silvany S, Saraiva MM, Ruf HR, Guzmán JD and Carmo EH.

Chromobacteriosis in Ilhéus, Bahia: epidemiologic, clinical and laboratorial

investigation. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 38(6): 503-

506. 2005.

Dias Jr LC, Motta JDN, Rettori D and Duran N. Semiempirical INDOS/S study on the

absorption spectrum of violacein. Journal of Molecular Structure, 580: 85-90.

2002.

Doudney CO and Rinaldi CN. Modification of survival after ultraviolet light exposure

in a wild-type and a polA strain of Escherichia coli B/r by preirradiation treatment

with chloramphenicol or rifampin. Mutat Res., 144(3): 151-158. 1985.

Du X, Choi IG, Kim R, Wang W, Jancarik J, Yokota H and Kim SH. Crystal structure

of an intracellular protease from Pyrococcus horikoshii at 2-Å resolution. PNAS,

97(26): 14079–14084. 2000.

90

Duarte FT, Carvalho FM, Bezerra e Silva U, Scortecci KC, Blaha CAG, Agnez-Lima

LF, Medeiros SRB. DNA repair in Chromobacterium violaceum. Gen Mol Res.

3(1): 167-180. 2004.

Durán N and Menck CF. Chromobacterium violaceum: a review of pharmacological

and industrial perspectives. Crit Rev Microbiol, 27(3): 201-222. 2001.

Durán N, Antonio RV, Haun M and Pilli RA. Biosynthesis of a trypanocide by

Chromobacterium violaceum. World Journal of Microbiology and Biotechnology,

10(6): 686-690. 1994.

Eisen JA and Hanawalt PC. A phylogenomic study of repair genes, proteins and

processes. Mutation Research, 435: 171-213. 1999.

Eschenlauer SCP, Coombs GH and Mottram JC. PFPI–like genes are expressed in

Leishmania major but are pseudogenes in other Leishmania species. FEMS

Microbiol Lett, 260: 47–54. 2006.

Fantinatti-Garboggini F, Almeida R, Portillo VA, Barbosa TAP, Trevilato PB, Ramalho

Neto CE, Coêlho RD, Silva DW, Bartoleti LA, Hanna ES, Brocchi M and Manfio

GP. Drug resistance in Chromobacterium violaceum. Genetics and Molecular

Research, 3(1): 134-147. 2004.

Farnell DA. Nucleotide Excision Repair in the Three Domains of Life. WURJ: Health

and Natural Sciences 2(1): 1-6. 2011.

Forsberg L, Faire U and Morgenstern R. Oxidative Stress, Human Genetic Variation,

and Disease. Archives of Biochemistry and Biophysics, 389(1): 84-93. 2001.

Fousteri M and Mullenders LHF. Transcription-coupled nucleotide excision repair in

mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects. Cell Res, 18(1):

73-84. 2008.

Friedberg EC and Fischhaber PL. DNA Replication Fidelity. Encyclopedia of the

Human Genome, 2: 167-171. 2003.

Friedberg EC, McDaniel LD and Schultz RA. The role of endogenous and exogenous

DNA damage and mutagenesis. Curr Opin Genet Dev, 14(1): 5-10. 2004.

Friedberg EC, Walker GC, Siede W. SOS responses and DNA damage tolerance in

prokaryotes. In: DNA Repair and Mutagenesis. Washington DC: American Society

for Microbiology Press; 1995. p. 407-464.

91

Fuchs RP, Koffel-Schwartz N, Pelet S, Janel-Bintz R, Napolitano R, Becherel OJ,

Broschard TH, Burnouf DY and Wagner J. DNA polymerases II and V mediate

respectively mutagenic (-2 frameshift) and error-free bypass of a single N-2-

acetylaminofluorene adduct. Biochem Soc Trans, 29(Pt 2): 191-195. 2001.

Fujii S and Fuchs RP. Biochemical basis for the essential genetic requirements of

RecA and the beta-clamp in Pol V activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

106(35): 14825-14830. 2009.

Fujii S, Isogawa A and Fuchs RP. RecFOR proteins are essential for Pol V-mediated

translesion synthesis and mutagenesis. The EMBO Journal, 25: 5754–5763.

2006.

Galhardo RS, Rocha RP, Marques MV and Menck CFM. An SOS-regulated operon

involved in damage-inducible mutagenesis in Caulobacter crescentus. Nucleic

Acids Research, 33(8): 2603–2614. 2005.

Garibyan L, Huang T, Kim M, Wolff E, Nguyen A, Nguyen T, Diep A, Hu K, Iverson A,

Yang H and Miller JH. Use of the rpoB gene to determine the specificity of base

substitution mutations on the Escherichia coli chromosome. DNA Repair (Amst),

2(5): 593-608. 2003.

Gillet LCJ and Schärer OD. Molecular mechanisms of mammalian global genome

nucleotide excision repair. Chemical Reviews, 106(2): 253–276. 2006.

Goda M, Hashimoto Y, Takase M, Herai S, Iwahara Y, Higashibata H, Kobayashi M.

Isonitrile Hydratase from Pseudomonas putida N19–2. Cloning, sequencing, gene

expression, and identification of its active amino acid residue. Journal of

Biological Chemistry, 277(48): 45860-45865. 2002.

Goerlich O, Quillardet P and Hofnung M. Induction of the SOS response by hydrogen

peroxide in various Escherichia coli mutants with altered protection against

oxidative DNA damage. Journal of Bacteriology, 171(11): 6141-6147. 1989.

Grant SGN, Jessee J, Bloom FR and Hanahan D. Differential plasmid rescue from

transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(12): 4645-4649. 1990.

Grimm C, Evers A, Brock M, Maerker C, Klebe G, Buckel W and Reuter K. Crystal

structure of 2-methylisocitrate lyase (PrpB) from Escherichia coli and modelling of

its ligand bound active centre. Journal of Molecular Biology, 328(3): 609-621.

2003.

92

Grogan DW. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends

Microbiol, 8(4):180-185. 2000.

Grossman L, Caron PR and Oh EY. The involvement of an E. coli multiprotein

complex in the complete repair of UV-damaged DNA. Basic Life Sci., 38: 287-94.

1986.

Guenther B, Onrust R, Sali A, O’Donnell M and Kuriyan J. Crystal Structure of the '

Subunit of the Clamp-Loader Complex of E. coli DNA Polymerase III. Cell, 91:

335–345. 1997.

Halio SB, Blumentals II, Short SA, Merrill BM and Kelly RM. Sequence, Expression in

Escherichia coli, and Analysis of the Gene Encoding a Novel Intracellular

Protease (PfpI) from the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus.

Journal of Bacteriology, 178(9): 2605–2612. 1996.

Hastings PJ, Hersh MN, Thornton PC, Fonville NC, Slack A, FrischRL, Ray MP,

Harris RS, Leal SM, Rosenberg SM. Competition of Escherichia coli DNA

Polymerases I, II and III with DNA Pol IV in Stressed Cells. PLoS ONE, 5(5): 1-10

(e10862). 2010.

Hengge R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nat Rev Microbiol, 7(4): 263-

273. 2009.

Indiani C and O'Donnell M. Mechanism of the delta wrench in opening the beta

sliding clamp. J. Biol. Chem., 278(41): 40272-40281. 2003.

Indiani C, McInerney P, Georgescu R, Goodman MF, O’Donnell M. A sliding-clamp

toolbelt binds high- and low-fidelity DNA polymerases simultaneously. Molecular

Cell, 19: 805–815. 2005.

Jaciuk M, Nowak E, Skowronek K, Tanska A and Nowotny M. Structure of UvrA

nucleotide excision repair protein in complex with modified DNA. Nature Structural

and Molecular Biology, 18(2): 191-197. 2011.

Jafri S, Urbanowski ML and Stauffer GV. The Glutamic Acid Residue at Amino Acid

261 of the a Subunit Is a Determinant of the Intrinsic Ef ciency of RNA

Polymerase at the metE Core Promoter in Escherichia coli. Journal of

Bacteriology, 188(23): 6810–6816. 1996.

Jenal U. Cyclic di-guanosine-monophosphate comes of age: a novel secondary

messenger involved in modulating cell surface structures in bacteria? Current

Opinion in Microbiology, 7(2): 185-191. 2004.

93

Jeruzalmi D, O'Donnell M and Kuriyan J. Clamp loaders and sliding clamps. Curr

Opin Struct Biol, 12: 217-224. 2002.

Kedzierska B, Szambowska A, Herman-Antosiewicz A, Lee DJ, Busby SJW,

Wegrzyn G and Thomas MS. The C-terminal domain of the Escherichia coli RNA

polymerase a subunit plays a role in the CI-dependent activation of the

bacteriophage pM promoter. Nucleic Acids Res., 35(7): 2311–2320. 2007.

Kelley LA and Sternberg MJE. Protein structure prediction on the Web: a case study

using the Phyre server. Nature Protocols, 4(3): 363-371. 2009

Kim MH, Lee JL, Suh JT, Chang BS and Cho KS. A Case of Chromobacterium

infection after car accident in Korea. Yonsei Medical Journal. 46 (5): 700-702.

2005.

Kim SR, Matsui K, Yamada M, Gruz P, Nohmi T. Roles of chromosomal and

episomal dinB genes encoding DNA pol IV in targeted and untargeted

mutagenesis in Escherichia coli. Mol. Genet. Genomics, 266(2): 207-215. 2001.

Kleibl K. Molecular mechanisms of adaptive response to alkylating agents in

Escherichia coli and some remarks on O6-methylguanine DNA-methyltransferase

in other organisms. Mutation Research, 512(1): 67-84. 2002.

Kobayashi S, Valentine MR, Pham P, O'Donnell M, Goodman MF. Fidelity of

Escherichia coli DNA polymerase IV. Preferential generation of small deletion

mutations by dNTP-stabilized misalignment. J. Biol. Chem., 277(37): 34198-

34207. 2002.

Konola JT, Sargent KE and Gow JB. Efficient repair of hydrogen peroxide-induced

DNA damage by Escherichia coli requires SOS induction of RecA and RuvA

proteins. Mutat Res, 459(3): 187-194. 2000.

Landini P. Cross-talk mechanisms in bio lm formation and responses to

environmental and physiological stress in Escherichia coli. Research in

Microbiology, 160:259-266. 2009.

Lawson EN, Barkhuisen M, Dew DW. Gold solubilisation by cyanide producing

bacteria Chromobacterium violaceum. In: Amils, R., Ballester, A. (Eds.),

Biohydrometallurgy and the Environment Toward the Mining of the 21st Century.

Process Metallurgy (Elsevier, Amsterdam), 9A: 239-246. 1999.

Leon LL, Miranda CC, Souza AO and Durán N. Antileishmanial activity of the

violacein extracted from Chromobacterium violaceum. Journal of Antimicrobial

Chemotherapy, 48(3): 449-450. 2001.

94

Liu CH, Chu RM, Weng CN, Lin YL and Chi CS. An acute pleuropneumonia in a pig

caused by Chromobacterium violaceum. J. Comp. Pathol. 100: 459-463, 1989.

Lothigius Å; Sjöling Å; Svennerholm A-M and Bölin I. Survival and gene expression of

enterotoxigenic Escherichia coli during long-term incubation in sea water and

freshwater. Journal of Applied Microbiology, 108(4): 1441-1449. 2010.

Ma SE, Chuang S, Cheung TD, Kam K and Tsang HT. A fatal case of

Chromobacterium violaceum septicemia in Hong Kong. Southeast Asian J Trop

Med Public Health, 37(6). 2006.

Maddukuri L, Dudzinska D and Tudek B. Bacterial DNA repair genes and their

eukaryotic homologues: 4. The role of nucleotide excision DNA repair (NER)

system in mammalian cells. Acta Biochimica Polonica, 54(3): 469-482. 2007.

Mah TFC and O'Toole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.

Trends Microbiol., 9(1): 34-39. 2001.

Maor-Shoshani A and Livneh Z. Analysis of the Stimulation of DNA Polymerase V of

Escherichia coli by Processivity Proteins. Biochemistry, 41: 14438-14446. 2002.

Maor-Shoshani A, Hayashi K, Ohmori H, Livneh Z. Analysis of translesion replication

across an abasic site by DNA polymerase IV of Escherichia coli. DNA Repair, 2:

1227-1238. 2003.

Marchler-Bauer A, Lu S, Anderson JB, Chitsaz F, Derbyshire MK, Deweese-Scott C,

Fong JH, Geer LY, Geer RC, Gonzales NR, Gwadz M, Hurwitz DI, Jackson JD,

Ke Z, Lanczycki CJ, Lu F, Marchler GH, Mullokandov M, Omelchenko MV,

Robertson CL, Song JS, Thanki N, Yamashita RA, Zhang D, Zhang N, Zheng C,

Bryant SH. CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of

proteins. Nucleic Acids Res, 1-5. 2010.

Martins D, Frungillo L, Anazetti MC, Melo PS, Durán N. Antitumoral activity of L-

ascorbic-acid-poly-D,L-(lactide-co-glycolide) nanoparticles containing violacein.

International Journal of Nanomedicine, 5: 77-85. 2010.

Martins-Pinheiro M, Marques RC and Menck CF. Genome analysis of DNA repair

genes in the alpha proteobacterium Caulobacter crescentus. BMC Microbiol,

7(17): 14p. 2007.

Matsuoka M and Mcfadden BA. Isolation, Hyperexpression, and Sequencing of the

aceA Gene Encoding Isocitrate Lyase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology,

170(10): 4528-4536. 1988.

95

Mattick JS. Type IV pili and twitching motility. Annual Review of Microbiology, 56:

289-314. 2002.

McGrew DA and Knight KL. Molecular Design and Functional Organization of the

RecA Protein. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 38: 385–

432. 2003.

McKenzie GJ, Lee PL, Lombardo MJ, Hastings PJ and Rosenberg SM. SOS mutator

DNA polymerase IV functions in adaptive mutation and not adaptive amplification.

Mol. Cell., 7(3): 571-579. 2001.

Mellon I and Hanawalt PC. Induction of the Escherichia coli lactose operon

selectively increases repair of its transcribed DNA strand. Nature, 342: 95-98.

1989.

Melo PS, Justo GZ, Azevedo MB, Duran N and Haun M. Violacein and its beta-

cyclodextrin complexes induce apoptosis and differentiation in HL60 cells.

Toxicology, 186(3): 217-225. 2003.

Melo PS, Maria SS, Vidal BC, Haun M, Duran N. Violacein cytotoxicity and induction

of apoptosis in V79 cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim., 36(8): 539-43, 2000.

Méndez-Ortiz MM, Hyodo M, Hayakawa Y and Membrillo-Hernández J. Genome-

wide Transcriptional Profile of Escherichia coli inResponse to High Levels of the

Second Messenger 3’,5’-Cyclic Diguanylic Acid. Journal of Biological Chemistry,

281(12): 8090-8099. 2006.

Miller JH. A short course in bacterial genetics (A laboratory manual and handbook

for Escherichia coli and related bacteria). Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1992.

Morita R, Nakagawa N, Kuramitsu S and Masui R. An O6-methylguanine-DNA

methyltransferase-like protein from Thermus thermophilus interacts with a

nucleotide excision repair protein. J Biochem, 144(2): 267-277. 2008.

Morita R, Nakane S, Shimada A, Inoue M, Lino H, Wakamatsu T, Fukui K, Nakagawa

N, Masui R, and Kuramitsu S. Molecular Mechanisms of the Whole DNA Repair

System: A Comparison of Bacterial and Eukaryotic Systems. J Nucleic Acids, 10:

32p. 2010.

Mukhamed KS and Glushenkova AI. Natural phosphonolipids. Chemistry of Natural

Compounds, 36(4): 329-341. 2000.

96

Nakano T, Salem AMH, Terato H, Pack SP, Makino K and Ide H. Comparison of the

activities of bacterial and mammalian nucleotide excision repair systems for DNA-

protein crosslinks. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 53: 225-226. 2009.

Napolitano R, Janel-Bintz R, Wagner J and Fuchs RP. All three SOS-inducible DNA

polymerases (Pol II, Pol IV and Pol V) are involved in induced mutagenesis.

EMBO J., 19: 6259-6265. 2000.

Narayanan B., Niu W., Joosten HJ, Li Z, Kuipers RKP, Schaap PJ Dunaway-Mariano

D and Herzberg O. Structure and Function of 2,3-Dimethylmalate Lyase, a PEP

Mutase/Isocitrate Lyase Superfamily Member. J. Mol. Biol., 386: 486–503. 2009.

Neuwald AF, Aravind L, Spouge JL and Koonin EV. AAA+: A Class of Chaperone-

Like ATPases Associated with the Assembly, Operation, and Disassembly of

Protein Complexes. Genome Research, 9: 27-43. 1999.

O’Donnell M. Replisome Architecture and Dynamics in Escherichia coli. Journal of

Biological Chemistry, 281(16): 10653-10656. 2006.

Pagani I, Liolios K, Jansson J, Chen IA, Smirnova T, Nosrat B, Markowitz VM and

Kyrpides NC. The Genomes OnLine Database (GOLD) v.4: status of genomic and

metagenomic projects and their associated metadata. Nucleic Acids Research,

40(1): 571-579. 2012.

Pagès V, Fuchs RPP. How DNA lesions are turned into mutations within cells?

Oncogene, 21: 8957-8966. 2002.

Park AY, Jergic S, Politis A, Ruotolo BT, Hirshberg D, Jessop LL, Beck JL, Barsky D,

O’Donnell M, Dixon NE and Robinson CV. A Single Subunit Directs the Assembly

of the Escherichia coli DNA Sliding Clamp Loader. Structure, 18: 285–292. 2010.

Parkhill J, Achtman M, James KD, Bentley SD, Churcher C, Klee SR, Morelli G,

Basham D, Brown D, Chillingworth T, Davies RM, Davis P, Devlin K, Feltwell T,

Hamlin N, Holroyd S, Jagels K, Leather S, Moule S, Mungall K, Quail MA,

Rajandream MA, Rutherford KM, Simmonds M, Skelton J, Whitehead S, Spratt

BG and Barrell BG. Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria

meningitides Z2491. Nature, 404(6777): 502-506. 2000.

Patel M, Jiang Q, Woodgate R, Cox MM and Goodman MF. A new model for SOS-

induced mutagenesis: how RecA protein activates DNA polymerase V. Critical

Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 45(3): 171–184. 2010.

97

Pham P, Rangarajan S, Woodgate R and Goodman MF. Roles of DNA polymerases

V and II in SOS-induced error-prone and error-free repair in Escherichia coli.

P.N.A.S. (USA), 98(15): 8350-8354. 2001.

Rao F, See RY, Zhang D, Toh DC, Ji Q, Liang ZX. YybT is a Signaling Protein That

Contains a Cyclic Dinucleotide Phosphodiesterase Domain and a GGDEF

Domain with ATPase Activity. Journal of Biological Chemistry, 85: 473-482. 2010.

Ray P, Sharma J, Marak RS, Singhi S, Taneja N, Garg RK, Sharma M.

Chromobacterium violaceum septicaemia from north India. Indian J Med

Res.,120(6): 523-526, 2004.

Recouvreux DOS, Carminatti CA, Pitlovanciv NA, Rambo CR, Porto LM and Antônio

RV. Cellulose Biosynthesis by the Beta-Proteobacterium, Chromobacterium

violaceum. Current Microbiology, 57(5): 469-476. 2008.

Reyes-Lamothe R, Sherratt D and Leake MC. Stoichiometry and Architeture of Active

DNA Replication Machinery in Escherichia coli. Science, 328: 498-501. 2010.

Reynes JP, Tiraby M, Baron M, Drocourt D and Tiraby G. Escherichia coli

Thymidylate Kinase: Molecular Cloning, Nucleotide Sequence, and Genetic

Organization of the Corresponding tmk Locus. Journal of Bacteriology, 178(10):

2804–2812. 1996.

Rippa V, Cirulli C, Di Palo B, Doti N, Amoresano A and Duilio A. The Ribosomal

Protein L2 Interacts with the RNA Polymerase a Subunit and Acts as a

Transcription Modulator in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 192(7): 1882-

1889. 2010.

Rodríguez-Rojas A and Blázquez J. The Pseudomonas aeruginosa pfpI Gene Plays

an Antimutator Role and Provides General Stress Protection. Journal of

Bacteriology, 191(3): 844–850. 2009.

Ryjenkov DA, Tarutina M, Moskvin OV and Gomelsky M. Cyclic Diguanylate Is a

Ubiquitous Signaling Molecule in Bacteria: Insights into Biochemistry of the

GGDEF Protein Domain. Journal of Bacteriology, 187(5): 1792–1798. 2005.

Salanoubat M, Genin S, Artiguenave F, Gouzy J, Mangenot S, Arlat M, Billault A,

Brottier P, Camus JC, Cattolico L, Chandler M, Choisne N, Claudel-Renard C,

Cunnac S, Demange N, Gaspin C, Lavie M, Moisan A, Robert C, Saurin W,

Schiex T, Siguier P, Thebault P, Whalen M, Wincker P, Levy M, Weissenbach J

and Boucher CA. Genome sequence of the plant pathogen Ralstonia

solanacearum. Nature, 415(6871): 497-502. 2000.

98

Sambrook J and Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third ed. Cold

Spring Harbor Laboratory Press, New York. 2001.

Sancar A, Lindsey-Boltz LA, Unsal-Kacmaz K and Linn S. Molecular mechanisms of

mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu Rev Biochem,

73: 39-85. 2004.

Sanger F, Nicklen S and Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors, 24: 104-108. 1977.

Saro FJL, Georgescu RE, Goodman MF and O'Donnell M. Competitive processivity-

clamp usage by DNA polymerases during DNA replication and repair. The EMBO

Journal, 22(23): 6408-6418. 2003.

Sato H, Hashimoto Y, Fukatsu H and Kobayashi M. Novel Isonitrile Hydratase

Involved in Isonitrile Metabolism. Journal of Biological Chemistry, 285(45):

34793–34802. 2010.

Schirmer and Jenal. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signaling.

Nature Reviews (Microbiology), 7: 724-735. 2009.

Schlacher K, Cox MM, Woodgate R and Goodman MF. RecA acts in trans to allow

replication of damaged DNA by DNA polymerase V. Nature, 442: 883–887. 2006.

Selby CP and Sancar A. Molecular Mechanism of Transcription-Repair Coupling.

Science, 260: 53-57. 1993.

Shuck SC, Short EA, Turchi JJ. Eukaryotic nucleotide excision repair: from

understanding mechanisms to influencing biology. Cell Res, 18(1): 64-72. 2008.

Sinha NK, Morris CF and Alberts BM. Efficient in vitro replication of double-stranded

DNA templates by a purified T4 bacteriophage replication system. J. Biol. Chem,

255(9): 4290-4293. 1980.

Siqueira IC, Dias J, Ruf H, Ramos EAG., Maciel EAP, Rolim A, Jabur l, Vasconcelos

l and Silvany C. Chromobacterium violaceum in Siblings, Brazil. Emerging

Infectious Diseases, 11: 1443-1445. 2005.

Skoneczna A, Micialkiewicz A and Skoneczny M. Saccharomyces cerevisiae

Hsp31p, a stress response protein conferring protection against reactive oxygen

species. Free Radical Biology & Medicine, 42: 1409–1420. 2007.

99

Slesak G, Douangdala P, Inthalad S, Silisouk J, Vongsouvath M,

Sengduangphachanh A, Moore CE, Mayxay M, Matsuoka H and Newton PN.

Fatal Chromobacterium violaceum septicaemia in northern Laos, a modified

oxidase test and post-mortem forensic family G6PD analysis. Ann Clin Microbiol

Antimicrob. 8: 24. 2009.

Souza AO, Aily DCG, Sato DN and Durán N. Atividade da violaceína in vitro sobre o

Mycobacterium turbeculosis H37RA. Revista do Instituto Adolfo Lutz. 58(1): 59-

62, 1999.

Stover CK, Pham XQ, Erwin AL, Mizoguchi SD, Warrener P, Hickey MJ, Brinkman

FS, Hufnagle WO, Kowalik DJ, Lagrou M, Garber RL, Goltry L, Tolentino E,

Westbrock-Wadman S, Yuan Y, Brody LL, Coulter SN, Folger KR, Kas A, Larbig

K, Lim R, Smith K, Spencer D, Wong GK, Wu Z, Paulsen IT, Reizer J, Saier MH,

Hancock RE, Lory S and Olson MV. Complete genome sequence of

Pseudomonas aeruginosa. PA01, an opportunistic pathogen. Nature, 406(6799):

959-64. 2000.

Su JY and Sclafani RA. Molecular cloning and expression of the human

deoxythymidylate kinase gene in yeast. Nucleic Acids Research, 19(4): 823–827.

1991.

Svejstrup JQ. Mechanisms of transcription-coupled DNA repair. Nature Reviews

Molecular Cell Biology, 3(1): 21–29. 2002.

Tagliabue L, Macia A Antoniani D and Landini P. The yddV-dos operon controls

biofilm formation through the regulation of genes encoding curli fibers’ subunits in

aerobically growing Escherichia coli. FEMS Immunol Med Microbiol, 59: 477–484.

2010.

Takinowaki H, Matsuda Y, Yoshida T, Kobayashi Y and Ohkubo T. The solution

structure of the methylated form of the N-terminal 16-kDa domain of Escherichia

coli Ada protein. Protein Science, 15: 487–497. 2006.

Taverna P and Sedgwick B. Generation of an Endogenous DNA-Methylating Agent

by Nitrosation in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 178(17): 5105–5111.

1996.

Tenorio E, Saeki T, Fujita K, Kitakawa M, Baba T, Mori H, Isono K. Systematic

characterization of Escherichia coli genes/ORFs affecting biofilm formation. FEMS

Microbiol. Lett., 225(1): 107-114. 2003.

100

Thomas MS, Zou C, Ishihama A and Glass RE. The Effect of a Nested Set of C-

terminal Substituted Deletions on the Function of the a Subunit of

Escherichia coli RNA Polymerase. Inst. J. Biochem. Cell Biol., 29: 1475-1483.

1997.

Truglio JJ, Croteau DL, Van Houten B and Kisker C. Prokaryotic nucleotide excision

repair: the UvrABC system. Chem Rev 106: 233–252. 2006.

Vasconcelos ATR, Almeida DF, Hungria M, Guimarães CT, Antônio RV, Almeida FC,

Almeida LGP, Almeida R, Gomes JA, Andrade EM, Araripe J, Araujo MFF, Astolfi

Filho S, Azevedo V, Baptista AJ, Bataus LAM, Baptista JS, Belo A, Berg CVD,

Bogo M, Bonatto S, Bordingnon J, Brigido MM, Brito CA, Brocchi M, Buryti HA,

Camargo AA, Cardoso DDP, Carneiro NP, Carraro DM, Carvalho CMB, Cascardo

JCM, Cavada BS, Chueire LMO, Creczynski-Pasa TB, Cunha Junior NC,

Fagundes N, Falcão CL, Fantinatti F, Farias IP, Felipe MSS, Ferrari LP, Ferro JA,

Ferro MIT, Franco GR, Freitas NSA, Furlan LR, Gazzinelli RT, Gomes EA,

Gonçalves PR, Grangeiro TB, Grattapaglia D, Grisard EC, Hanna ES, Jardim SN,

Laurino J, Leoi LCT, Lima, LFA, Loureiro MF, Lyra MCCP, Madeira HMF, Manfio,

GP, Maranhão AQ, Martins WS, Mauro SMZ, Medeiros SRB, Meissner RV,

Moreira MAM, Nascimento FF, Nicolas MF, Oliveria JG, Oliveira SC, Paixão RFC,

Parente JA, Pedrosa FO, Pena SDJ, Pereira JO, Pereira M, Pinto LSRC, Pinto

LS, Porto JIR, Potrich DP, Ramalho Neto CE, Reis AMM, Rigo LU, Rondinelli E,

Santos EBP, Santos FR, Schneider MPC, Seuanez HN, Silva AMR, Silva ALC,

Silva DW, Silva R, Simões IC, Simon D, Soares CMA, Soares RBA, Souza EM,

Souza KRL, Souza RC, Steffens MBR, Steindel M, Teixeira SR, Urmenyi T,

Wassen R, Zaha A, Simpson AJG. The complete genome of Chromobacterium

violaceum reveals remarkable and exploitable bacterial adaptability. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 100: 11660-11665, 2003.

Vericat JA, Guerrero R and Barbé J. Inhibition of the SOS Response of Escherichia

coli by the Ada Protein. Journal of Bacteriology, 170(3): 1354-1359. 1988.

Wagner J, Etienne H, Janel-Bintz R and Fuchs RP. Genetics of mutagenesis in E.

coli: various combinations of translesion polymerases (Pol II, IV and V) deal with

lesion/sequence context diversity. DNA Repair (Amst), 1(2): 159-167. 2002.

Wang Z. Translesion synthesis by the UmuC family of DNA polymerases. Mutat Res,

486(2): 59-70. 2001.

101

Weber H, Polen T, Heuveling J, Wendisch VF and Hengge R. Genome-wide analysis

of the general stress response network in Escherichia coli: sigma S-dependent

genes, promoters, and sigma factor selectivity. Journal of Bacteriology, 187:

1591–1603. 2005.

Wilson MA, Amour SVS, Collins JL, Ringe D and Petsko GA. The 1.8-Å resolution

crystal structure of YDR533Cp from Saccharomyces cerevisiae: A member of the

DJ-1ThiJPfpI superfamily. PNAS, 101(6): 1531–1536. 2004.

Windsor AJ and Mitchell-Olds T. Comparative genomics as a tool for gene discovery.

Current Opinion in Biotechnology, 17(2): 161-167. 2006.

Wood RD, Mitchell M, Sgouros J and Lindahl T. Human DNA repair genes. Science,

291: 1284-1289. 2001.

Woodgate R, Ennis DG. Levels of chromosomally encoded Umu proteins and

requirements for in vivo UmuD cleavage. Mol. Gen. Genet., 229(1): 10-16. 1991.

Wu YH, Franden MA, Hawker JRJr, McHenry CS. Monoclonal antibodies specific for

the alpha subunit of the Escherichia coli DNA polymerase III holoenzyme. J. Biol.

Chem., 259(19): 12117-12122. 1984.

Yao NY and O’Donnell M. Replisome dynamics and use of DNA trombone loops to

bypass replication blocks. Mol BioSyst., 4(11): 1075-1084. 2008.

Zeibell K, Aguila S, Shi VY, Chan A, Yang H and Miller JH. Mutagenesis and Repair

in Bacillus anthracis: the Effect of Mutators. Journal of Bacteriology, 189(6):

2331–2338. 2007.

Zhang Y, Yuan F, Wu X, Rechkoblit O, Taylor JS, Geacintov NE and Wang Z. Error-

prone lesion bypass by human DNA polymerase eta. Nucleic Acids Res, 28(23):

4717-4724. 2000.

This document was created with Win2PDF available at http://www.win2pdf.com.The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.This page will not be added after purchasing Win2PDF.

http://www.win2pdf.com

Documents

Identificação de genes em Resposta ao Estresse