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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LABORATÓRIO DE PESQUISAS CLÍNICAS
RORY CRISTIANE FORTES DE BRITO
Identificação de novos antígenos candidatos
vacinais contra Leishmaniose Visceral Canina no
genoma de L. infantum utilizando a Bioinformática
como ferramenta
OURO PRETO - MG - BRASIL
2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LABORATÓRIO DE PESQUISAS CLÍNICAS
RORY CRISTIANE FORTES DE BRITO
Identificação de novos antígenos candidatos
vacinais contra Leishmaniose Visceral Canina no
genoma de L. infantum utilizando a Bioinformática
como ferramenta
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, da Universidade
federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de mestre em Ciências
Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Dr. ALEXANDRE BARBOSA REIS
COORIENTADORA: Dra. DANIELA DE MELO RESENDE
OURO PRETO – MG – BRASIL
2014
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
B862i Brito, Rory Cristiane Fortes de. Identificação de novos antígenos candidatos vacinaiscontra leishmaniose visceral canina no genoma de L.infantum utilizando a bioinformática como ferramenta[manuscrito] / Rory Cristiane Fortes de Brito. - 2014. 111f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientador: Alexandre Barbosa Reis. Coorientadora: Daniela de Melo Resende.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de OuroPreto. Escola de Farmácia. Programa de Pós-Graduação emCiências Farmacêutica. Área de Concentração: Fármacos e medicamentos.
1. Bioinformática. 2. Leishmaniose Visceral. 3.Clonagem. 4. Pichia stipitis. I. Reis, Alexandre Barbosa.II. Resende, Daniela de Melo. III. Universidade Federal deOuro Preto. IV. Titulo.
CDU: 616.993.161:004
I
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer a DEUS, por me dar saúde e força para levantar todos
os dias.
Aos meus pilares, a minha mãe (Maria Inês), meu pai (Manuel), minhas irmãs Kleizi e Marizia
e Patricia (minha gatíssima), amo vocês.
Aos meus irmão do coração, Guto, Miriam, Sabrina.
Aos meus avós, Sebastião (in memoriam), Tios, Tias, primos, primas, irmãos e amigos que
sempre me apoiaram.
Aos meus irmãos calamitosos, amigos que fiz nesses longos anos de Ouro Preto. À poluta
casa CALAMIDADE PUBLICA pelo aprendizado. À Dona Maria, um anjo de pessoa.
Aos meus orientadores Dra. Daniela de Melo Resende, Dr. Alexandre Barbosa Reis e Dra.
Leoneide Bouillet pelos ensinamentos, tudo o que sou hoje profissionalmente devo maior parte a
vocês. A ciência é uma escola muito difícil e vocês me ensinaram a trilhar o caminho certo.
Aos amigos do LIMP/LPC: Profa. Cláudia, Prof. Evandro, Profa. Paula, Wendel, Tânia, Maria,
Renata, Sheler, Nádia, Bruno, Sapo, Mariana Lana, Henrique, Carol, Kátia, Lucilene, Flávia, Levi,
Fernando, Jamille, Gleise, Perin, Muniz, Diego, Aline e Emilia. Ao João, Marcelo, Tharik, Daiane,
Dayane, Narjara, Mariana e os demais ICs.
Gostaria de agradecer à equipe de pesquisa:
Dr. Jeronimo Conceição Ruiz - CPqRR – FIOCRUZ MG
Dr. Rodrigo Corrêa-Oliveira - CPqRR – FIOCRUZ MG
Dr. Antônio Mauro Rezende - CPqAM – FIOCRUZ PE
MSc Nesley Jesus Daher Oliveira - PUC Minas
Às agências de fomento: CAPES, CNPq, FAPEMIG e UFOP.
II
RESUMO
A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma zoonose na América Latina, e o cão possui um
papel central como reservatório do parasito e na transmissão da infecção para o vetor no ciclo
urbano da Leishmania infantum. A vacinologia reversa permite realizar a predição de epítopos in
silico de células B e T, que são importantes na resposta imune, permitindo o desenho de vacinas
com tempo reduzido. O objetivo deste trabalho foi selecionar genes do protozoário L. infantum
candidatos à vacina contra LVC. Esse objetivo foi divido em duas etapas, sendo a primeira a
seleção de antígenos utilizando ferramentas de bioinformática e a segunda a clonagem e
expressão dos antígenos selecionados em um sistema eucarioto. Na ETAPA I foi realizado o
download do proteoma predito da espécie L. infantum, com 8.241 proteínas, que foi usado em
todas as análises subsequentes. As predições foram feitas utilizando-se os seguintes algoritmos:
a) para MHC-I, NetCTL e NetMHC; b) para MHC-II, NetMHCII; c) para células B, BepiPred,
AAP12 e BCPred12 enquanto que para a predição da localização subcelular das proteínas foram
utilizados Sigcleave, TargetP e WoLF PSORT. Foram analisados 12 alelos MHC-I humanos e
sete alelos MHC-I de camundongos, e no contexto de MHC-II, foram analisados 14 alelos
humanos e três de camundongos. Após a realização das predições, foi necessário o
desenvolvimento de um Banco de Dados relacional em um Sistema Gerenciador de Banco de
Dados (SGBD), o MySQL, para a integração dos resultados e pré-seleção das proteínas baseado
nos seguintes critérios: proteínas secretadas/excretadas ou de membrana plasmática, com
epítopos preditos com afinidade pelos 19 alelos de MHC-I utilizados e epítopos preditos com
afinidade por no mínimo 14 alelos de MHC-II, além de epítopos preditos para células B. Em
seguida, foi feita uma busca por similaridade de sequências com os proteomas preditos de
humano, de cão e de camundongo a fim de evitar reações autoimunes no ato da vacinação, para
isso foi utilizado o algoritmo BLASTp, do pacote Blastall. Após o alinhamento de sequências, as
proteínas com pouca similaridade foram confrontadas com a rede predita de interação proteína-
proteína do parasito, desenvolvida pelo grupo de pesquisa. Na ETAPA II, as proteínas
selecionadas foram clonadas no vetor de clonagem pGEM T easy, seguido da clonagem no vetor
de expressão pPICZα-A, onde os clones foram confirmados pela PCR e digestão enzimática.
Após essa etapa, os plasmídeos pPICZα-A recombinantes foram linearizados e transformados na
levedura Pichia pastoris, integrando-se no gemona da levedura. Os clones recombinantes foram
selecionados por PCR. Através das ferramentas de bioinformática, foram selecionadas quatro
proteínas candidatas a uma vacina contra LVC. Neste trabalho foi mostrado o resultado de
clonagem e expressão de dois genes que codificam duas proteínas.
Palavras-chave: Imunoinformática, Bioinformática, Leishmaniose Visceral Canina,
Leishmania infantum, Clonagem, Expressão, Pichia pastoris.
III
ABSTRACT
Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonose in Latin America, and dogs have a central
role as reservoirs of the parasite and in the transmission of the infection to the vector in the urban
cycle of Leishmania infantum. Reverse vaccinology allows making epitope prediction for T and B
cells in silico, which are important for protective immune responses, allowing the design of
vaccines with reduced cost and time. Previous studies showed the feasibility of making epitope
prediction in proteins of protozoa using open source algorithms. The objective of this work was to
select genes from the protozoan L. infantum candidates to vaccine against CVL, and it was divided
in two steps. The first step was to select antigens using bioinformatics tools and the second was to
clone and express the antigens selected in an eukaryotic system. In first step, the download of the
predicted proteome of L. infantum with 8,241 proteins was made. Then, it was used in all
subsequent analyzes. Epitope prediction was made using the following algorithms: a) to MHC-I,
NetCTL and NetMHC; b) to MHC-II, NetMHCII; c) to B cells, BepiPred, AAP12 and BCPred12,
while for the prediction of subcellular localization of proteins Sigcleave, TargetP and WoLF
PSORT were used. Copies of each algorithm were installed in local servers. Algorithms analyzed
12 human MHC-I alleles and seven mouse MHC-I alleles and, in the context of MHC-II, they
analyzed 14 human alleles and three mouse alleles. A relational Database was developed in a
Management System Database, MySQL, that was responsible for integrating results of all
predictions and pre-selection of proteins based on the following criteria: secreted/excreted or
plasma membrane proteins, with epitopes predicted for binding all 19 MHC-I alleles analyzed and
at least 14 MHC-II alleles, and epitopes predicted for B cell. Next, it was made a search for
sequence similarity with human, dog and mouse predicted proteomes using BLASTp algorithm
from Blastall package, in order to prevent autoimmune reactions upon vaccination. After alignment
of sequences, proteins with little similarity were confronted with the predicted protein-protein
interaction network of the parasite developed in-house. In step II, the selected proteins were
cloned into cloning vector pGEM T easy, followed by cloning into the expression vector pPICZα-A,
and the clones were confirmed by PCR and restriction enzyme digestion. After this, the
recombinant plasmids pPICZα-A were linearized and transformed into the yeast Pichia pastoris,
integrating them into yeast genome. Recombinant clones were selected by PCR. Through
bioinformatics tools four proteins candidates for a vaccine against CVL were selected. In this work,
cloning and expression results for only two genes that encode two proteins were showed.
Key Words: Immunoinformatics, Bioinformatics, Canine Visceral Leishmaniasis, Leishmania
infantum, Cloning, Expression, Pichia pastoris.
IV
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo de vida dos parasitos do gênero Leishmania demonstrando os estágios tanto
no flebotomíneo como no homem................................................................................................... 1
Figura 2 - Desenho esquemático demostrando que as análises de alto rendimento aplicados
em vários aspectos do patógeno e as interações com o organismo hospedeiro podem ser
utilizadas na identificação de vacinas na era genômica. A partir do genoma, transcriptoma,
proteoma, antígenos de superfície e estrutura genômica 3D de um patógeno podem-se identificar
candidatos vacinais. ....................................................................................................................... 2
Figura 3 - A) Representação de nós com alto MCC (circulo azul) e alto Degree (circulo
vermelha); B) Rede predita de interação do proteoma predito de L. infantum desenvolvida por
Rezende e colaboradores (2012).................................................................................................. 16
Figura 4 - Desenho esquemático para a construção do DNA recombinante. ......................... 17
Figura 5 - Mapa do vetor pPICZα-A ....................................................................................... 22
Figura 6 - Mapa do vetor pGEM T easy ................................................................................. 23
Figura 7 - Delineamento metodológico da Etapa I. ................................................................ 27
Figura 8 - Delineamento experimental da Etapa II. ................................................................ 31
Figura 9 - Desenho esquemático da estratégia de clonagem. ............................................... 34
Figura 10 - Esquema representativo do cassete de expressão no genoma da P. pastoris. .... 42
Figura 11 - Desenho esquemático do plaqueamento de microgota para a determinação do
fenótipo dos clones recombinantes da cepa X33. ......................................................................... 43
Figura 12 - Número de epítopos preditos para células T. O algoritmo NetMHCII foi utilizado
para a predição de epítopos de células TCD4+, e os algoritmos NetCTL e NetMHCforam utilizados
para a predição de epítopos de células TCD8+. ............................................................................ 45
Figura 13 - Número de epítopos preditos para células B utilizando os algoritmos BepiPred,
BCPred12 e AAP12. ..................................................................................................................... 46
Figura 14 - Número de proteínas preditas como secretadas/excretadas ou vinculados à
membrana plasmática de L. infantum, utilizando os algoritmos TargetP, Sigcleave e WoLF
PSORT ......................................................................................................................................... 47
Figura 15 - Modelo do Banco de Dados Relacional desenvolvido. ......................................... 48
Figura 16 - Perfil de restrição do mkDNA com Hae III. PM (Peso Molecular low range DNA
ladder); 1 amplicon do mkDNA de L. infantum digerido com Hae III.* representa as quatro bandas
V
do perfil de restrição (40, 60, 80 e 120 pb) compatível com L. infantum. As setas representam o
padrão de peso molecular. ........................................................................................................... 51
Figura 17 - Amplificação dos genes P4 e P5 através da PCR. PM (Peso Molecular 1Kb); P4
(amplicon do gene P4 – 1358 pb); P5 (amplicon do gene P4 – 1583 pb). As setas representam o
padrão de peso molecular. ........................................................................................................... 52
Figura 18 - Triagem dos clones P4 e P5 por PCR. PM (Peso Molecular 1Kb); 1 (Controle
positivo P4 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 2 a 8 (Clones P4); 9 (Controle negativo);
10 (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 11 a 14 (Clone P5). As setas
representam o padrão de peso molecular. .................................................................................... 53
Figura 19 – Confirmação da clonagem por digestão enzimática dos clones. PM (Peso
Molecular 1Kb); 1 (canaleta vazia); 2 (pPGEM/P4 não digerido); 3 a 10 (Plasmídeos
recombinantes P4 digeridos); 11 (Controle positivo P4 utilizando o DNA genômico de L. infantum);
12 (pPGEM/P5 não digerido); 13 (pPGEM/P5 digerido); 14 (Controle positivo P5 utilizando o DNA
genômico de L. infantum). As setas representam o padrão de peso molecular. ........................... 53
Figura 20 - Triagem dos clones P4 por PCR. PM (Peso Molecular 1Kb); 1 (Controle positivo
P4 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 2 a 10 (Clones P4); 11 (Controle negativo); 12 a
15 (Clones P4). As setas representam o padrão de peso molecular. ............................................ 54
Figura 21 - Triagem dos clones P5 por PCR. PM (Peso Molecular 1Kb); 1 (canaleta vazia); 2
(Controle negativo); 3 (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 4 a 18
(Clones P5). As setas representam o padrão de peso molecular.................................................. 54
Figura 22 - Confirmação dos da clonagem por digestão enzimática dos clones. PM (Peso
Molecular 1Kb); 1 (pPICZ/P4 não digerido); 2 a 4 (Plasmídeos recombinantes P4 digeridos); 5
(Controle positivo P4 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 6 (pPICZ/P5 não digerido); 7 e 8
(pPGEM/P5 digerido); 9 (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum). As
setas representam o padrão de peso molecular. .......................................................................... 55
Figura 23 - Determinação do fenótipo das colônias recombinantes. (A) Crescimento dos
clones recombinantes no meio MD. (B) Crescimentos dos clones recombinantes no meio MM. .. 56
Figura 24 – Confirmação da integração do pPICZ/P4 no genoma de P. pastoris. PM (Peso
Molecular); CNi (Controle negativo da integração, o amplicon referente à região AOX1 de P.
pastoris selvagem); CNp (Controle negativo do plasmídeo, amplicon referente à região AOX1 de
um plasmídeo sem inserto); CPp (Controle positivo do plasmídeo, amplicon referente à região
AOX1 do pPICZ/P4); C1 a C5 (Amplicons referentes à região AOX1 de clones recombinantes
pPICZ/P4); CP (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum). As setas
representam o padrão de peso molecular. .................................................................................... 57
VI
Figura 25 - Confirmação da integração do pPICZ/P5 no genoma de P. pastoris. PM (Peso
Molecular); CNr (Controle negativo da reação); CNi (Controle negativo da integração, o amplicon
referente à região AOX1 de P. pastoris selvagem); CNp (Controle negativo do plasmídeo,
amplicon referente à região AOX1 de um plasmídeo sem inserto); CPp (Controle positivo do
plasmídeo, amplicon referente à região AOX1 do pPICZ/P5); C1 a C4 (Amplicons referentes à
região AOX1 de clones recombinantes pPICZ/P5); CP (Controle positivo P5 utilizando o DNA
genômico de L. infantum). As setas representam o padrão de peso molecular. ........................... 58
VII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Comparação entre os genomas de L. major, L. infantum e L. braziliensis. ........... 12
Tabela 2 - Algoritmos utilizados no projeto ............................................................................ 21
Tabela 3 - Localizações preditas pelos algoritmos ................................................................ 29
Tabela 4 - Sequência de iniciadores para amplificação dos genes de interesse .................... 35
Tabela 5 - Interações das proteínas selecionadas, com as demais proteínas do parasito ..... 49
Tabela 6 - Resultados dos critérios técnicos para a seleção das proteínas ........................... 50
Tabela 7 - Vantagens e desvantagens de sistemas heterólogos de expressão de proteínas . 69
Tabela 8 - Proteínas expressas em P. pastoris ...................................................................... 71
VIII
LISTA DE ABREVIATURAS
µg- Micrograma
µL- Microlitro
ANNs - Redes Neurais Artificiais
APP – Amino Acids Pairs
AUC - Area Under Curve
DO600nm- Densidade óptica a 600 nm
EDTA - ácido etilenodiamino tetracético
EtBr – Brometo de Etídio
FDA - Food and Drugs Administration
H2 - Antígenos MHC de camundongos
HLA - antígenos leucocitários humanos
IL- Interleucina
HMM – Hidden Markov Models
IPTG- Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
kb – quilobase
LB - Meio de cultura Luria Bertani
LBLS - Luria Bertani com baixa concentração de sal
LIT - Liver infusion Tryptone
LV – Leishmaniose Visceral
LVC - Leishmaniose Visceral Canina
LVH - Leishmaniose Visceral Humanha MCC - Maximal Clique Centrality
MD - meio mínimo de glicose
MHC-II - Complexo principal de histocompatibilidade de classe II
MM - meio mínimo de metanol
Mut+ Methanol utilization plus
MutS Methanol utilization slow
pb - pares de base
PCR - reação em cadeia da polimerase
IX
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
OMS - Organização Mundial de Saúde
q.s.p - Quantidade suficiente para
RPM - Rotações por minuto
SDS-PAGE- eletroforese em gel de poliacrilamida contendo Dodecil sulfato de sódio
SQL - Structured Query Language
SVM – Support Vector Machine
TAE - Tris Acetato EDTA
TAP - Transportadoras associadas ao processamento de antígenos
TBE - Tris Borato EDTA
U – Unidades de enzima
UV - Ultravioleta
V - Volts
X-Gal - 5-bromo-4-Cloro-3-indolil-β-d-galactopiranosideo
YPD – Meio de extrato de levedura, peptona e glicose.
X
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1 1
REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 4 2
2.1 As leishmanioses ...................................................................................................... 4
2.2 Resposta imune na Leishmaniose Visceral Canina ................................................... 5
2.3 Vacinologia ................................................................................................................ 6
2.4 Vacinas contra leishmanioses ................................................................................... 7
2.5 Vacinologia reversa ................................................................................................... 9
2.5.1 Disponibilidade de sequências genômicas ....................................................... 11
2.5.2 Utilização de algoritmos na predição de epítopos ............................................. 13
2.6 Biologia de sistemas ................................................................................................ 14
2.7 Clonagem e expressão de proteínas heterólogas .................................................... 16
OBJETIVOS ................................................................................................................... 20 3
3.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 20
3.1.1 Objetivo específico I ......................................................................................... 20
3.1.2 Objetivo específico II ........................................................................................ 20
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 21 4
4.1 Materiais .................................................................................................................. 21
4.1.1 Ferramentas de bioinformática ......................................................................... 21
4.1.2 Plasmídeos ...................................................................................................... 22
4.1.3 Linhagens de microrganismos .......................................................................... 23
4.1.4 Meios de cultura ............................................................................................... 24
4.1.5 Antibióticos ....................................................................................................... 25
4.1.6 Soluções em geral ............................................................................................ 25
4.1.7 Marcadores de peso molecular ........................................................................ 26
4.1.8 Enzimas ........................................................................................................... 26
4.2 Métodos .................................................................................................................. 27
XI
4.2.1 ETAPA I – Seleção dos antígenos pela Bioinformática ..................................... 27
4.3 ETAPA II – Clonagem e expressão dos antígenos .................................................. 31
4.3.1 Obtenção de massa úmida de L. infantum ....................................................... 32
4.3.2 Extração de DNA genômico de L. infantum ...................................................... 32
4.3.3 Caracterização da Leishmania por PCR-RFLP (Polimorfismo de tamanho dos
fragmentos de restrição) ........................................................................................................ 33
4.3.4 Estratégia de clonagem .................................................................................... 34
4.3.5 Amplificação dos genes de interesse por PCR (Reação em cadeia da
polimerase) 35
4.3.6 Purificação de DNA .......................................................................................... 35
4.3.7 Preparação de bactérias quimiocompetentes ................................................... 36
4.3.8 Obtenção de DNA plasmidial ............................................................................ 36
4.3.9 Clonagem no vetor pGEM T easy ..................................................................... 37
4.3.10 Clonagem no vetor pPICZα-A .......................................................................... 39
4.3.11 Transformação da levedura P. pastoris X33 ..................................................... 41
RESULTADOS ............................................................................................................... 45 5
5.1 ETAPA I .................................................................................................................. 45
5.1.1 Predição de epítopos de células T .................................................................... 45
5.1.2 Predição de epítopos de células B ................................................................... 46
5.1.3 Predição da localização subcelular de proteínas .............................................. 46
5.1.4 Desenvolvimento do Banco de Dados relacional .............................................. 47
5.1.5 Critérios para pré-seleção das proteínas .......................................................... 48
5.1.6 Busca por similaridade de sequências ............................................................. 49
5.1.7 Buscas na rede de interação proteína-proteína ................................................ 49
5.1.8 Critérios técnicos para a seleção das proteínas ............................................... 50
5.2 ETAPAII .................................................................................................................. 50
5.2.1 Caracterização da espécie de Leishmania por PCR-RFLP............................... 50
5.2.2 Amplificação dos genes de interesse ............................................................... 51
5.2.3 Clonagem no pGEM T easy ............................................................................. 52
XII
5.2.4 Clonagem no pPICZα-A ................................................................................... 54
5.2.5 Transformação da P. pastoris ........................................................................... 55
Discussão ....................................................................................................................... 59 6
6.1 Seleção dos antígenos através de ferramentas de bioinformática ........................... 59
6.2 Clonagem e expressão dos genes selecionados em sistema eucarioto .................. 68
CONCLUSÃO ................................................................................................................. 73 7
PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 74 8
REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 75 9
1
INTRODUÇÃO 1
As leishmanioses são causadas por parasitos protozoários pertencentes à ordem
Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania (ROSS, 1903; LAINSON et al.,
1987). Estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS) indicam que no mundo mais de 350
milhões de pessoas estão sob o risco de contrair leishmaniose e entre 12 e 14 milhões estão
infectadas (WHO, 2010). Atualmente, a Leishmaniose Visceral (LV) encontra-se entre as seis
endemias mais importantes no mundo, atingindo aproximadamente 65 países. Principalmente, é
nas nações pobres como Índia, Sudão, Nepal, Bangladesh e Brasil onde a doença é mais
frequente, concentrando 90% dos casos (DESJEUX, 2004; WHO, 2010). Está representado na
Figura 1 o ciclo de vida de parasitos Leishmania spp.
As estratégias atuais para controlar a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) são ineficientes.
O tratamento de cães com drogas tais como antimoníacos ou anfotericina B é muito agressivo e
possui baixa eficácia, com recidivas ocorrendo na maioria dos animais. Uma proporção
significativa desses cães, embora clinicamente assintomáticos, é capaz de transmitir parasitos
Figura 1 - Ciclo de vida dos parasitos do gênero Leishmania demonstrando os estágios tanto no flebotomíneo como no homem.
Fonte: Centers for Disease Control and Prevention.
2
aos flebotomíneos (ALVAR et al., 1994; GUARGA et al., 2002; REIS et al., 2010). Além disso, o
tratamento sucessivo seguido por recidivas poderia introduzir cepas resistentes do parasito,
representando um risco para a saúde humana. A eliminação de cães infectados, estratégia para
reduzir a prevalência de leishmaniose humana em áreas endêmicas, não é aceita por razões ética
e social (GRADONI et al., 1988; DIETZE et al., 1997; ASHFORD et al., 1998; PALATNIK-DE-
SOUSA et al., 2001). Assim, o desenvolvimento e a aplicação de uma vacina protetora para o
controle da LVC seria uma importante ferramenta, economicamente viável, para a vacinação em
massa de cães. Nesse sentido, alguns autores sugerem o uso de vacinas, seja animal ou para
uso humano, como importante estratégia para minimizar a eutanásia de cães infectados com L.
infantum e diminuir a incidência de Leishmaniose Visceral Humanha (LVH) (MARZOCHI et al.,
1985; DUNAN et al., 1989; DYE, 1996; DA SILVA et al., 2000; DANTAS-TORRES e BRANDAO-
FILHO, 2006), reduzindo as chances de infectividade de flebotomíneos e consequentemente a
transmissão ao homem.
A vacinologia reversa permite fazer a clonagem e a expressão de epítopos preditos para
células T e B, bem como a predição da localização subcelular de proteínas, importantes para uma
resposta imune protetora, permitindo o desenvolvimento de vacinas com tempo reduzido
(ANDRE, 2003; DUMONTEIL, 2009). Na Figura 2 estão representadas algumas das abordagens
da Vacinologia reversa empregadas na busca por novos antígenos.
Figura 2 - Desenho esquemático demostrando que as análises de alto rendimento aplicados em vários aspectos do
patógeno e as interações com o organismo hospedeiro podem ser utilizadas na identificação de vacinas na era genômica. A partir do genoma, transcriptoma, proteoma, antígenos de superfície e estrutura genômica 3D de um patógeno podem-se identificar candidatos vacinais.
Fonte: Adaptado Rinaudo et al (2009).
3
Nesse sentido, este estudo visa a selecionar, clonar e expressar genes do protozoário L.
infantum candidatos a uma vacina contra a LVC. Para fazer a predição dos epítopos, foram
utilizados algoritmos de predição de epítopos de células B e T, além de algoritmos de predição
para a localização subcelular de proteínas de L. infantum. Para a integração dos resultados, foi
desenvolvido um banco de dados relacional em um sistema gerenciador de banco de dados, o
MySQL, essencial na seleção dos possíveis alvos vacinais. Após a pré-seleção de proteínas no
banco de dados, os alvos foram submetidos a uma rede de interação proteína-proteína de L.
infantum desenvolvida pelo grupo de pesquisa de Imunopatologia e Pesquisas clínicas da
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP) em colaboração com o Grupo Informática de
Biossistemas da Fiocruz Minas. Assim, é possível predizer quais os alvos que possivelmente
seriam vitais na biologia do parasito. Além disso, foram feitas buscas por similaridade de
sequências contra os proteomas preditos de humano, cão e camundongo, de modo a evitar a
autoimunidade. Após esses resultados, foram selecionadas quatro proteínas candidatas a uma
vacina contra a LVC. Em seguida, os genes das proteínas foram clonados no vetor de expressão
pPICZα-A em Escherichia coli e transformadas na levedura P. pastoris linhagem X33. Esse
sistema de expressão vem sendo amplamente utilizado para a expressão de proteínas
heterólogas e possui inúmeras vantagens, tais como a simplicidade das técnicas necessárias
para sua manipulação genética; a habilidade de produzir proteínas heterólogas em altos níveis; a
capacidade de realizar modificações pós-traducionais; a viabilidade do sistema de expressão
como Kit comercialmente disponível.
4
REVISÃO DA LITERATURA 2
2.1 As leishmanioses
As leishmanioses são um complexo de doenças parasitárias amplamente distribuídas no
mundo. A complexidade biológica se relaciona com a espécie e a genética do parasito, fatores
extrínsecos como a ecoepidemiologia, a imunidade e fatores nutricionais do hospedeiro
(GARNHAM, 1988; MCMAHON-PRATT e ALEXANDER, 2004). A Organização Mundial de Saúde
(OMS) classifica as leishmanioses em quatro formas clínicas principais: cutânea, cutâneo-
mucosa, cutânea difusa e visceral, devido à amplitude dos aspectos clínicos. A leishmaniose
cutânea é uma doença de baixa gravidade em que frequentemente observa-se cura espontânea.
Já a forma clínica cutâneo-mucosa ou mucocutânea pode causar lesões extremamente mutilantes
na região oronasal e faringeal, enquanto a forma difusa, além de ser um grande desafio
terapêutico, apresenta-se com o estigmatizante aspecto hanseniforme. A leishmaniose visceral, a
mais devastadora de todas as formas clínicas, possui alta mortalidade se não for tratada
(DESJEUX, 2004), podendo manifestar-se desde uma forma assintomática ou inaparente,
passando por uma forma oligossintomática ou subclínica até atingir a forma sintomática que pode
ser aguda ou crônica (conhecido como Kala-azar). A caracterização da LV sintomática crônica
está bem descrita na literatura, tendo como principais sinais/sintomas: febre irregular de longa
duração, perda de peso, esplenomegalia, hepatomegalia, linfadenopatia, anemia, leucopenia,
edema, epistaxe, hipergamaglobulinemia, hematêmese, emagrecimento e debilidade progressiva
(ALENCAR, 1991).
Existem várias formas de transmissão da LV, onde a principal acaba ocorrendo por meio da
picada de fêmeas (dípteros) infectadas da família Psychodidae, subfamília Phlebotominae. No
Novo Mundo a Lutzomyia longipalpis se destaca como a principal espécie, enquanto que no Velho
Mundo temos diversas espécies do gênero Phlebotomus responsáveis pela transmissão
(LAINSON et al., 1987). Em relação ao agente etiológico, existem duas principais espécies de
Leishmania referenciadas como responsáveis pela leishmaniose visceral no mundo (LAINSON et
al., 1987). A primeira é a Leishmania (Leishmania) donovani, que pertence ao complexo
“Donovani” (LAVERAN e MESNIL, 1903), principal causadora de LV na Índia, Sudão, Paquistão,
Nepal e leste chinês, tendo como hospedeiro o homem. A segunda, a Leishmania (L.) infantum
(NICOLLE, 1908), encontra-se amplamente distribuída no Velho Mundo (Ásia, África e Europa) e
5
no Novo Mundo (América do Sul e Central), possuindo como hospedeiro doméstico ou
reservatório o cão, Canis familiaris, animais silvestres como o chacal (Canis aureus) e a raposa
(Vulpes vulpes)(DEANE, 1956).
2.2 Resposta imune na Leishmaniose Visceral Canina
Buscando ampliar o estudo dos processos imunopatológicos envolvidos no curso da LV,
diferentes modelos experimentais têm sido empregados no intuito de se entender melhor os
mecanismos de resistência e susceptibilidade à infecção. Dentre os modelos de maior
importância destacam-se: camundongos, hamsters e cães (HOMMEL et al., 1995; GARG e
DUBE, 2006). Considerando que o cão é o principal hospedeiro e reservatório doméstico da L.
infantum, tem sido proposto que ensaios nesse modelo experimental seriam a melhor estratégia
para o estudo de novas abordagens terapêuticas e imunoprofiláticas (GRADONI, 2001;
GIUNCHETTI et al., 2007; GIUNCHETTI et al., 2008c). Desta forma, estudos neste modelo
experimental seriam uma excelente alternativa, considerando que o cão apresenta uma melhor
proximidade genética com o homem em relação aos modelos experimentais camundongo e
hamster (KIRKNESS et al., 2003; STARKEY et al., 2005), favorecendo não apenas o estudo de
eventos imunopatológicos como também a triagem de imunobiológicos aplicados à espécie
humana. Neste sentido, progredir nos estudos que ampliem o conhecimento da LVC resultará
consequentemente em benefícios para o controle da doença em humanos (REIS, 2001;
GIUNCHETTI et al., 2008a; GIUNCHETTI et al., 2008b). Além disso, o fato de a LV humana e a
canina compartilharem sintomas/sinais clínicos semelhantes reforça ainda mais o uso desse
modelo experimental para LV humana (GENARO et al., 1993; MORENO e ALVAR, 2002; ALVAR
et al., 2004; REIS et al., 2006a; REIS et al., 2009). A análise da resposta imune celular e humoral
em cães naturalmente infectados por L. infantum, portadores de diferentes formas clínicas, foi
amplamente avaliada pelo grupo de pesquisa (MANCIANTI et al., 1988; PINELLI et al., 1994a;
PINELLI et al., 1995; REIS et al., 2006a; REIS et al., 2006b; REIS et al., 2006c; GIUNCHETTI et
al., 2008a; GIUNCHETTI et al., 2008b; REIS et al., 2009). Nesse contexto, foi demonstrado que
durante a fase assintomática da infecção existe uma associação com um aumento de células T
(Thy-1+ e CD5+), intimamente relacionado com as subpopulações de células T CD4+ e
principalmente de células T CD8+. Além disso, Reis e colaboradores (2006) detectaram uma
expressão aumentada de MHC-II (complexo principal de histocompatibilidade de classe II) em
linfócitos totais circulantes em cães assintomáticos. Nesse estudo, observaram-se também
menores títulos de anticorpos circulantes, com presença predominante de IgG1 e uma menor
frequência de intensidade do parasitismo em diversos tecidos em cães assintomáticos. Não foi
6
observada alteração no número de células apresentadoras de antígenos, tais como as células B
(CD21+) e monócitos (CD14+). Os dados reforçam a importância dos eventos celulares na
participação de mecanismos que possivelmente promovem a resposta imune na sobrevida dos
cães com infecção por L. infantum. Em cães oligossintomáticos, considerado como um estágio
intermediário da morbidade na LVC, foi observada uma ligeira queda nos elementos da resposta
celular. Porém, uma nítida expansão da resposta humoral com queda no número absoluto de
células CD21+ (provavelmente devido à sua transformação em plasmócitos ou sequestro para
órgãos linfoides) e uma elevada produção de anticorpos, principalmente da subclasse IgG2 e das
classes IgM, IgE e IgA foi observada (Reis et al., 2006). Por outro lado, cães sintomáticos
apresentam uma nítida imunossupressão celular. Esse quadro de imunossupressão é
caracterizado por uma queda nas populações de linfócitos T (Thy-1+ e CD5+) e suas
subpopulações (T CD4+ e T CD8+), bem como nas populações de células apresentadoras de
antígenos estudadas (linfócitos B e monócitos circulantes) (Reis, 2001). Durante essa fase da
doença, verificou-se também a ocorrência de uma intensa atividade de células B, caracterizada
pela elevada produção de imunoglobulinas de diversas classes e subclasses (IgG2, IgA, IgM e
IgE). A presença marcante de IgG2 e IgE na forma clínica sintomática indica uma possível
associação dessa forma clínica com a resposta imune do tipo 2 (PINELLI et al., 1994a;
MARTINEZ-MORENO et al., 1995; REIS et al., 2006b).
2.3 Vacinologia
A história da vacinologia se iniciou alguns séculos atrás, no ano de 1796, quando nasceu o
conceito de vacina derivado do termo Vaccinae, agente etiológico da varíola. Graças às
observações de Benjamin Jesty e Edward Jenner sobre as ordenhadoras, que não desenvolviam
as lesões ou máculas na pele típicas da varíola, esses pesquisadores inferiram que o material
que infectava as vacas protegia-as da varíola (PALUMBO et al., 2012; SALVI et al., 2012). Muito
se debate sobre quem realmente foi o inventor da primeira vacina. Segundo a história, Jesty foi o
primeiro a inocular o vírus da varíola bovina nos familiares (LANGER et al., 2012). Alguns anos
depois, Jenner validou os experimentos, inoculando o pus em vários indivíduos, por um processo
então chamado de vacinação (CHENG et al., 2012). Na época, a varíola era a principal causadora
de mortes. Nas grandes cidades, muitos indivíduos eram infectados, levando à morte cerca de
20%. Louis Pasteur surgiu com uma nova etapa do desenvolvimento de vacinas, a atenuação
(URBANSKA et al., 2012). Pasteur introduziu os princípios da vacinologia, “isolar, inativar e
injetar”, princípios esses que foram amplamente utilizados no desenvolvimento de várias vacinas
licenciadas (HENRY et al., 2012). Muitos estudos comprovaram que a vacinação é um meio
7
eficaz na proteção da população contra patógenos, e estima-se que a imunização salva a vida de
mais de três milhões de crianças em todo mundo a cada ano (From the World Health
Organization. State of the World's Vaccines and Immunizations, 2002). Várias doenças letais já
foram praticamente erradicadas, por exemplo, sarampo e poliomielite (ANDRE, 2003), mas
infelizmente as doenças infectocontagiosas continuam sendo as principais causas de morte no
mundo. Nesse contexto, a vacinação aparece como uma das intervenções com maior impacto na
saúde coletiva (RINAUDO et al., 2009). Recentemente, duas grandes revoluções no
desenvolvimento de vacinas foram introduzidas, dentre elas o uso da moderna tecnologia do DNA
recombinante produzindo vacinas de subunidades baseadas em biomoléculas compostas por
antígenos específicos. Nesse método, o patógeno é primeiramente estudado para identificar
fatores importantes na patogenia e imunidade, e é feita a identificação de fatores para produção
em larga escala pelas técnicas do DNA recombinante. Esse método gerou duas vacinas
recombinantes muito eficientes, sendo a primeira uma vacina contra hepatite B baseada em uma
proteína do capsídeo viral altamente purificada, e a segunda uma vacina acelular contra
Bordetella pertussis contendo três proteínas altamente purificadas (ANDRE, 1990; GRECO et al.,
1996). Essa estratégia é um método convencional para o desenvolvimento de vacinas que requer
a manutenção do patógeno em condições de laboratório, sendo a identificação e purificação de
antígenos feita diretamente do microrganismo ou através da tecnologia do DNA recombinante,
seguida por testes para avaliar a habilidade de induzir imunidade. Esse método consome tempo e
permite a identificação somente daqueles antígenos que foram purificados em quantidades
disponíveis para serem testados. Visto que muitas proteínas não estão disponíveis como
candidatos a vacina, e que, em alguns casos, o patógeno não pode ser mantido em condições
laboratoriais, isso poderia levar décadas para a produção de uma vacina eficiente (RAPPUOLI,
2001; ADU-BOBIE et al., 2003). A Vacinologia Reversa foi a segunda revolução na área de
desenvolvimento de vacinas, que ocorreu no final do século XX como um resultado do uso da
tecnologia genômica.
2.4 Vacinas contra leishmanioses
Os métodos atuais utilizados para o controle de doenças parasitárias de alta complexidade
como a Leishmaniose estão intimamente relacionados ao controle vetorial ou à eliminação em
massa de seus reservatórios. Devido a isso, os programas governamentais enfrentam grandes
dificuldades na implementação, consolidação e permanência através das ações contínuas e de
sustentabilidade da vigilância epidemiológica principalmente nos países pobres, devido ao seu
alto custo e problemas relacionados com aplicabilidade das ações (THAKUR e KUMAR, 1992;
8
GAFUROV, 1999; DANTAS-TORRES e BRANDAO-FILHO, 2006). Além disso, problemas
relacionados com a alta toxicidade dos fármacos de escolha utilizados para tratamento nos países
em desenvolvimento (antimoniais pentavalentes), além do considerável aumento no número de
cepas resistentes do parasito vêm dificultando o combate a essa doença (KHALIL et al., 1998;
BRYCESON, 2001; CROFT e COOMBS, 2003; DUBE et al., 2005; CROFT et al., 2006). Dessa
forma, se faz necessária a busca por vacinas (AHLUWALIA et al., 2003; WHO, 2004) que sejam
eficazes na proteção contra a leishmaniose visceral, interrompendo o ciclo de transmissão da
doença, de forma que possam ser empregadas em programas de controle pelo Ministério da
Saúde. Inúmeras vacinas têm sido testadas para prevenir a doença, buscando estimular a
imunidade celular (células T), principalmente subpopulações de linfócitos T CD8+. Durante as
últimas décadas, vários grupos têm trabalhado na tentativa de desenvolver uma vacina efetiva
contra leishmaniose utilizando diferentes formulações, tais como o uso de parasitos vivos
(Leishmanização), mortos ou atenuados (vacinas de primeira geração), proteínas recombinantes
de Leishmania, vacinas de DNA e imunomoduladores da saliva de flebotomíneos (vacinas de
segunda geração) (ANDERSEN et al., 2003). Pessoa e Pestana (1940) desenvolveram uma
vacina constituída por 18 cepas dermatotrópicas de Leishmania, provenientes de seis localidades
do Estado de São Paulo, tornando-se o primeiro ensaio clínico vacinal realizado em humanos
(PESSOA e PESTANA, 1940; PESSOA, 1941a; 1941b). Em 1996, Mayrink e colaboradores,
utilizando antígenos de Leishmania (Viannia) braziliensis tratados com mertiolate e o adjuvante
BCG (Bacillus Calmette-Guérin) realizaram os testes de fases I e II em cães desafiados com L.
infantum, mostrando que a vacina induziu proteção. Mais tarde, entretanto, foi demonstrado que
essa formulação não foi eficiente para detectar diferenças entre os grupos controle e vacinado em
ensaios de fase III (XU et al., 2003). Nogueira e colaboradores, utilizando uma vacina composta
pela fucose manose ligante (FML) enriquecida com glicoproteína de Leishmania donovani em
combinação com o adjuvante saponina demonstraram a indução de um efeito protetor em cães de
área endêmica, além da possibilidade de um bloqueio na transmissão do parasito (NOGUEIRA et
al., 2005). No mesmo ano, um teste com uma vacina experimental utilizando antígenos proteicos
excretados-secretados de promastigotas de L. infantum (LiESAP) com o adjuvante muramil
dipeptídeo (MDP) teve êxito na prevenção da infecção por L. infantum (LEMESRE et al., 2005).
Recentemente, o nosso grupo de pesquisa demonstrou que uma formulação vacinal contendo
promastigotas de L. braziliensis mortas e o adjuvante saponina induziu uma forte
imunogenicidade relacionada ao aumento de isotipos de imunoglobulinas, altos níveis de linfócitos
T CD8+, intensa proliferação celular e aumento de óxido nítrico em cães vacinados (GIUNCHETTI
et al., 2007).
O uso de antígenos isolados de Leishmania começou a ser utilizado somente mais tarde.
Molano e coloaboradores, em 2003, utilizando preparações de uma proteína recombinante
quimérica multicomponente, denominada Q, formulada com BCG, demonstraram que o antígeno
9
foi capaz de induzir 90% de proteção em cães imunizados sob condição de infecção
experimental. Vacinas de DNA têm sido testadas com algum sucesso em modelo canino (FENG,
J. et al., 2003; VASILAKI et al., 2003). Em 2003, um coquetel consistindo de antígenos de
proteinases do tipo I (CPB) e II (CPA) de L. infantum foi utlizado em um sistema de vacinação
heterólogo (DNA-proteína) contra Leishmaniose Visceral Canina. Entretanto, a vacinação com as
proteínas recombinantes CPA e CPB de L. infantum utilizando IL-12 como adjuvante não induziu
proteção em cães desafiados (FENG, H. et al., 2003). A primeira vacina que utilizou antígeno
recombinante que foi testada em ensaios de fase III foi descrita utilizando a poliproteína MML,
também conhecida como Leish 111f. Entretanto, esse antígeno quando usado em combinação
com os adjuvantes MPL® - SE ou AdjuPrime falhou em proteger cães com infecção natural por
Leishmania ou em evitar a progressão da doença. (FENG, D. et al., 2003), Fujiwara e
colaboradores (2005) demonstraram que os antígenos recombinantes TSA, LmSTI1 e LeSF,
altamente conservados no genoma de Leishmania, formulados com esses mesmos adjuvantes
comerciais MPL-SE e AdjuPrime, induziram imunogenicidade em cães desafiados com
promastigotas de L. infantum (FUJIWARA et al., 2005).
Em 2008, Fernandes e colaboradores testaram em cães desafiados a vacina Leishtec®,
composta pela proteína recombinante A2, específica de formas amastigotas de L. donovani, e
saponina. Nos animais vacinados, constatou-se uma elevação de IgG total e IgG2, mas o IgG1
não foi detectado pela sorologia convencional; os níveis de interferon gama (IFNγ) aumentaram e
os de IL-10 permaneceram baixos. A vacina Leishmune® foi a primeira vacina comercializada no
Brasil para medidas profiláticas contra a LVC e é composta por antígenos FML e saponina
(NOGUEIRA et al., 2005). Além disso, Borja-Cabrera e colaboradores testaram a Leishmune®
como imunoquimioterápico, combinado com Alopurinol ou Anfotericina B em cães. Os resultados
indicaram que a Leishmune® promove um controle da sintomatologia e latência da infeção
(BORJA-CABRERA et al., 2010).
2.5 Vacinologia reversa
A Vacinologia Reversa é definida como identificação in silico de antígenos, fatores de
virulência seguido da clonagem e expressão dos mesmos. Ela usa sequências de genomas de
interesse, ao invés de células, como material para a identificação de novos antígenos, sendo sua
atividade confirmada posteriormente através de experimentos biológicos (RAPPUOLI, 2001). Em
geral, o objetivo é a identificação de genes que codificam fatores de patogenicidade e proteínas
secretadas ou associadas à membrana a partir de algoritmos específicos, identificando assim
proteínas acessíveis ao sistema imune e que possam mediar o desenvolvimento de uma resposta
10
imune protetora (BAMBINI e RAPPUOLI, 2009). Assim, há diminuição significativa do tempo e do
custo necessários para encontrar novos alvos para o desenvolvimento de vacinas. A possibilidade
de determinar a sequência completa do genoma de uma bactéria em poucos meses e a baixo
custo permitiu o sequenciamento do genoma de muitas bactérias patogênicas em um curto
intervalo de tempo. Hoje, os bancos de dados contêm sequências genômicas completas de mais
de 80 bactérias, além de parasitos tais como Plasmodium falciparum (GARDNER et al., 2002),
Leishmania major (IVENS et al., 2005), Trypanosoma brucei (BERRIMAN et al., 2005) e
Trypanosoma cruzi (EL SAYED et al., 2005). Poderosas tecnologias, tais como sequenciamento
genômico, análises in silico, proteômica, microarranjo e tecnologia de expressão in vivo têm
revolucionado o estudo de microrganismos patogênicos e o desenvolvimento de vacinas. A
disponibilidade de genomas completos e avanços atuais na Biologia Molecular possibilitam que
cada antígeno de um patógeno possa ser testado quanto à sua habilidade de induzir uma
resposta imune protetora. Várias técnicas de predição in silico vêm sendo desenvolvidas para
identificar candidatos vacinais, principalmente proteínas presentes nos genomas de patógenos
com propriedades antigênicas. Dessa forma, o mapeamento de epítopos tem conduzido ao
chamado “epitopo fishing”, o escaneamento de genomas de patógenos para a busca de epítopos
potenciais utilizando algoritmos de predição (DE GROOT e BERZOFSKY, 2004). Um exemplo da
aplicação da vacinologia reversa é a vacina contra Neisseria meningitidis sorogrupo B
(Bexsero®), composta pela quimera de três antígenos selecionados pela análise do genoma do
parasito, mais outras vesículas de membrana da N. meningitidis Sorogrupo B, adsorvidos em
Hidróxido de Alumínio (PIZZA et al., 2000), principal agente etiológico de sepse e meningite em
crianças e jovens. Recentemente, o Bexsero® foi avaliado e aprovado para a introdução no
mercado e comercialização pelo Comité dos Medicamentos para uso Humano da União Europeia
(CARMONA TORRES et al., 2012; RICE et al., 2012). Pizza e colaboradores em 2000, junto com
o Institute for Genomic Research (TIGR), descrevem que é possível aplicar a vacinologia reversa
na predição de alvos vacinas em bactérias (PIZZA et al., 2000). Outros estudos utilizando
análises in silico em bactérias como Staphylococcus aureus e Bacillus anthracis revelaram 15 e
84 proteínas respectivamente, altamente imunogênicas conhecidas e novos candidatos a vacinas
(RINAUDO et al., 2009). Vários outros potenciais vacinais vêm sendo estudados, como, por
exemplo, vacina contra Streptococcus do sorogrupo A, S. pneumoniae causadora de pneumonia,
otite e meningite (CLEMENTS et al., 2012), contra S. pyogenes, causadora de faringite e
pneumonia (DUPKE et al., 2012). Dentro do sorogrupo B de Streptococcus, têm estudos em S.
agalactiae (GALLA et al., 2012). Outras bactérias vêm sendo estudadas, como Chlamydia
trachomatis, Clostridium difficile, Escherichia coli (AICHLER et al., 2012; LANGERS e VAN DIJK,
2012; WANEK et al., 2012). Além disso, e mostrando a possibilidade da utilização dessa
abordagem em organismos mais complexos, em um trabalho recente realizado com o genoma de
L. major foi feita a predição in silico de epítopos de células T CD8+. As predições foram validadas
11
in vivo, apresentando um percentual de imunogenicidade igual a 54% em camundongos testando
26 peptídeos selecionados (HERRERA-NAJERA et al., 2009). Em outro estudo, uma abordagem
de Biologia de sistemas tem sido utilizada para obter um quadro global das respostas imunes
após vacinação em humanos. Isso tem permitido a identificação de novos mecanismos de
regulação da imunidade. Existem várias aplicações potenciais da Biologia de sistemas na
vacinologia (vacinologia de sistemas), entre elas a predição da eficácia vacinal a partir da
identificação de assinaturas moleculares de proteção após vacinação, identificação dos
mecanismos de ação de vacinas e identificação de indivíduos que respondem de maneira sub-
ótima à vacinação, como idosos, crianças, indivíduos imunossuprimidos (MET et al., 2003).
Atualmente, nos EUA, gastam-se cerca de 400 milhões de dólares em todas as etapas de
pesquisa, desenvolvimento, produção e lançamento de vacinas (ANDRE, 1990). Assim, a
vacinologia reversa vem sendo aplicada no desenvolvimento de vacinas contra diversas doenças,
diminuindo o tempo e o custo de desenvolvimento de novas vacinas (BAMBINI e RAPPUOLI,
2009). Estas novas abordagens no desenvolvimento de vacinas têm como objetivo, além de
promover a imunização prévia do indivíduo contra agentes infecciosos, produzir vacinas mais
seguras, eficazes e possivelmente polivalentes.
2.5.1 Disponibilidade de sequências genômicas
Até recentemente, o desenvolvimento de vacinas esteve associado a métodos
convencionais, portanto, gerados por meio de abordagens bioquímicas, imunológicas e
microbiológicas. Com o advento das modernas técnicas de biologia molecular e do
sequenciamento de genomas completos, novas perspectivas têm revolucionado a vacinologia
clássica.
O sequenciamento do genoma humano e de vários outros patógenos proporcionaram um
maior entendimento sobre a imunopatologia humana, e mais precisamente sobre a complexa
interação patógeno-hospedeiro (BRUSIC e PETROVSKY, 2005).
Em 2004, Laurentino e colaboradores mapearam 15% do genoma de L. braziliensis e
compararam com o genoma de L. major. Nesse estudo foi demonstrado que 95% das sequências
exibiram similaridade com proteínas conhecidas de L. major, indicando um alto nível de
conservação entre os dois organismos, os quais compartilharam um ancestral comum antes da
separação do continente americano (FENG et al., 2002).
Apesar da separação entre L. Viannia spp. e L. Leishmania spp. ter ocorrido em torno de 20 a
100 milhões de anos [dependendo se o gênero foi separado por eventos de migração ou
12
separação do supercontinente Gondwanda (NAGAYA et al., 2000; USCHMANN et al., 2000)], a
sintenia é conservada por mais de 99% dos genes entre os três genomas, L. infantum, L.
braziliensis e L. major (PEACOCK et al., 2007). Com base na similaridade de sequência e na
arquitetura de cromosomos, a L. braziliensis é claramente mais distante, consistente com a
classificação do subgênero. L. major e L. infantum possuem 36 cromossomos, ao passo que L.
braziliensis possue 35, em decorrência de uma aparente fusão dos cromossomos 20 e 34
(MIYAKUBO et al., 2000).
Em um estudo, Peacock e colaboradores, comparando o genoma de duas espécies de
Leishmania, L. infantum e L. braziliensis, com o genoma de L. major, observaram que, ao
contrário das outras espécies, L. braziliensis possue componentes de vias de interferência
mediadas por RNA, elementos de transposição associados aos telômeros e retrotransposons
(PEACOCK et al., 2007). Está representado na Tabela 1 as características dos genomas de L.
major, L. infantum e L. braziliensis.
Nesse contexto, a disponibilidade de sequências dos parasitos, L. braziliensis que teve seu
genoma praticamente finalizado em 2006 e do genoma de L. infantum, ambos disponíveis no
Kinetoplastid genomics resource (http://tritrypdb.org/tritrypdb/), poderá fornecer uma fonte
incalculável de dados, gerando informações relacionadas ao desenvolvimento de vacinas.
Em 2013, mais de 12000 genomas completos constavam como sequenciados
(http://www.genomesonline.org/cgi-bin/GOLD/index.cgi), e o impacto da disponibilidade dessa
informação relacionado ao desenvolvimento de vacinas já pode ser avaliado. Como exemplo real
do emprego dessa nova abordagem de estudo que utiliza metodologias computacionais de
predição em associação com dados de proteoma e transcriptoma para o desenvolvimento de
vacinas, temos a identificação de antígenos que compõe a vacina contra o Meningococcus
sorotipo B. Na abordagem de vacinologia reversa descrita por Pizza e colaboradores, em apenas
18 meses foram identificados mais candidatos à vacina do que em 40 anos pelo método
convencional (PIZZA et al., 2000).
Tabela 1 – Comparação entre os genomas de L. major, L. infantum e L. braziliensis.
13
2.5.2 Utilização de algoritmos na predição de epítopos
A imunoinformática ou imunologia computacional se refere a métodos ou ferramentas
computacionais usados nos estudos das funções do sistema imune (BRUSIC e PETROVSKY,
2003). Nos últimos anos houve o ressurgimento do termo Imunologia Teórica (IT) (RAMMENSEE,
2003), que teve origem nos anos 70 a 80, com o encontro internacional em IT realizado no
México. Na época, o encontro era sobre modelos matemáticos para a transmissão da malária.
Com o passar dos anos, a IT tomou outras proporções gigantescas, como bancos de dados
imunológicos, modelagem molecular e sistêmica e imunoinformática estrutural (BRUSIC e
PETROVSKY, 2005).
A imunoinformática vem sendo aplicada emergentemente, como técnica de bioinformática,
que tem seu foco voltado para a estrutura, função e interações das moléculas envolvidas na
imunidade. Um dos seus principais objetivos é a predição in silico da imunogenicidade ao nível de
epítopos. Ferramentas desenvolvidas recentemente, associadas a bancos de dados disponíveis,
podem ser usadas para identificar, caracterizar e fazer a predição de epítopos reconhecidos por
linfócitos T e B, células que têm papel fundamental na infecção e no desenvolvimento de
imunidade protetora em diversas doenças (DE GROOT, 2006).
Uma grande variedade de métodos são normalmente usados em bioinformática, incluindo
redes neurais artificiais (BALDI et al., 2000) e modelos ocultos de Markov (HUGHEY e KROGH,
1996). As redes neurais artificiais são idealizadas para reconhecer padrões não lineares, que
contribuem para interações entre peptídeos e moléculas de MHC (GULUKOTA et al., 1997; BUUS
et al., 2003; NIELSEN et al., 2003), enquanto os modelos ocultos de Markov são desenvolvidos
para caracterizar motivos biológicos com uma composição estrutural própria, e têm sido usados
no campo da imunologia para fazer a predição da ligação de peptídeos em moléculas de MHC
(MAMITSUKA, 1998). Esses métodos são normalmente descritos como métodos de treinamento
computacionais (HUGHEY e KROGH, 1996).
Também é importante investigar a localização subcelular das proteínas, já que as proteínas
imunogênicas devem estar em contato com as células T e B para elicitar uma resposta imune
protetora. Em outras palavras, a localização de uma proteína na célula tem um grande significado
em sua análise funcional (EISENHABER e BORK, 1998). Dessa forma, vários métodos têm sido
desenvolvidos para realizar a predição da localização subcelular das proteínas nos últimos anos
(FENG, 2002; CHOU e SHEN, 2007). Esses métodos podem ser classificados em duas
categorias, sendo a primeira baseada no reconhecimento de sinais de localização N-terminais, e
a segunda baseada na composição de aminoácidos da proteína (NAKAI, 2000). Os preditores
então combinam essas características com métodos de treinamento computacional para decidir
14
qual localização é a mais provável (REINHARDT e HUBBARD, 1998; YUAN, 1999; HUA e SUN,
2001).
Em um estudo recente, o grupo de pesquisa avaliou o desempenho de oito algoritmos de
predição de código livre, NetCTL e NetMHC para células T CD8+, BepiPred, AAP12 e BCPred12
para células B e, para localização subcelular de proteínas, WoLF PSORT, TargetP e Sigcleave.
Esses testes foram feitos em proteínas de protozoários, utilizando epítopos (imunogênicos e não
imunogênicos) testados experimentalmente, disponíveis em bancos de dados de domínio público.
Além disso, desenvolvemos um modelo de banco de dados relacional para integrar as predições
feitas e avaliar os algoritmos. O desempenho foi avaliado através da AUC (Area Under Curve) dos
valores falsos positivos e verdadeiros positivos preditos pelos algoritmos NetCTL, NetMHC,
BepiPred, AAP12 e BCPred12. Para os algoritmos de localização subcelular das proteínas, foram
utilizados os valores de sensibilidade e especificidade para a avaliação do desempenho. Isso
provavelmente se deve ao fato de que poucas proteínas de protozoários tiveram toda sua
extensão investigada quanto à presença de epítopos imunogênicos. Em relação às predições da
localização subcelular, os resultados mostraram que os algoritmos são capazes de fazer a
predição correta da localização das proteínas de tripanosomatídeos, mas WoLF PSORT foi o que
apresentou os melhores índices de acurácia e especificidade (RESENDE et al., 2012).
2.6 Biologia de sistemas
Além da vacinologia reversa, outras metodologias vêm sendo empregadas na descoberta de
novos antígenos (RINAUDO et al., 2009). Dentre essas metodologias destaca-se a Biologia de
sistemas, que utiliza uma abordagem multidisciplinar, investigando estruturas e ou interações
complexas entre todas as partes de um sistema biológico. O foco principal é tentar entender a
interação entre o genoma de interesse e o meio ambiente através de modelos matemáticos
capazes de descrever ou predizer respostas de um indivíduo frente a diferentes exposições
(IDEKER et al., 2001; KITANO, 2002). Para estabelecer as interações é preciso muitos dados de
microRNA, mRNA e proteínas (PULENDRAN et al., 2010). Os primeiros trabalhos usando a
Biologia de sistemas em vacinologia foram sobre a identificação de sinalizações moleculares em
pacientes vacinados com YF-17D (vacina contra a febre amarela) capazes de predizer a eficácia
vacinal (QUEREC et al., 2006; GAUCHER et al., 2008). A Biologia de sistemas é necessária para
que as propriedades das redes biológicas, tais como um estado funcional particular ou robustez,
possam ser quantitativamente entendidas e racionalmente manipuladas (SAUER et al., 2007).
Para alcançar os objetivos na Biologia de sistemas é necessário utilizar alguns métodos, como o
estudo de redes biológicas celulares, por exemplo, rede de interação de proteínas – proteínas (ppi
15
networks). Esses estudos fornecem informação a respeito de quais proteínas de um genoma
interagem e como elas o fazem (HARRINGTON et al., 2008).
As redes de interação de proteína possuem em geral as mesmas características topológicas
de outros tipos de redes biológicas celulares. Diversas metodologias experimentais vêm sendo
empregadas para a construção de redes de interação de proteínas. Podem-se citar metodologias
como duplo híbrido, utilizadas para detectar interações físicas entre proteínas, e métodos de
purificação por afinidade acoplada à espectrometria de massa de alta produção, utilizados na
determinação de complexos proteicos (HARRINGTON et al., 2008). No entanto, estes métodos
podem não ser geralmente aplicáveis para todas as proteínas em todos os organismos, e podem
também ser propícios a erros sistemáticos. Nesse contexto, surgem as abordagens
computacionais para predição em larga escala de interações de proteína-proteína baseadas na
sequência protéica ou nucleotídica (SKRABANEK et al., 2008). Existem atualmente diversas
aplicações para o estudo das redes biológicas celulares. Muito mais do que conhecer a biologia
complexa de um organismo, as redes celulares estão sendo utilizadas para busca de alvos
terapêuticos para drogas e vacinas. Uma das aplicações das redes celulares nesse sentido é o
seu uso na busca de alvos e/ou marcadores para diferentes tipos de câncer. Pujana e
colaboradores (PUJANA et al., 2007) identificaram novos genes associados com risco maior de
câncer de mama. Além disso, Chuang e colaboradores extraíram propriedades funcionais de
proteínas diretamente do estudo topológico de redes de interação para identificar marcadores de
metástase de câncer de mama (CHUANG et al., 2007). Outro estudo importante utilizando redes
de interação está vinculado ao trabalho sobre o interatoma de linfócito B humano, que identificou
interações desreguladas em fenótipos patológicos específicos (MANI et al., 2008). Na área da
parasitologia, foi identificado um grupo de interação de proteínas no interatoma de Plasmodium
falciparum, um dos agentes patológicos da malária, relacionado à invasão celular, sendo
potenciais alvos vacinais (LACOUNT et al., 2005). Outro trabalho desenvolvido recentemente foi
uma lista de candidatos alvos de droga em L. major utilizando uma rede de interação do parasito
(FLOREZ et al., 2010). Recentemente, Rezende e colaboradores desenvolveram redes preditas
de interação proteína-proteína para os proteomas preditos de L. infantum, L. major e L.
braziliensis; essas redes fornecem valores de MCC (Maximal Clique Centrality) e Degree para
diferentes proteínas dos parasitos (REZENDE et al., 2012). O Degree é a própria contagem do
número de vizinhos diretos que um nó (nesse caso, uma proteína) possui. Um nó com alto valor
de Degree é denominado hub (FREEMAN, 1977). Já o MCC é a medida relacionada ao quão
central um nó é para vários cliques (módulos ou subgrafos); além disso, o tamanho dos cliques
influencia diretamente o seu valor. Assim, se um nó com um alto valor de MCC for neutralizado,
provavelmente vários módulos de uma rede serão afetados. No presente estudo, foi utilizada a
rede de interação de proteínas de L. infantum, as buscas foram feitas gentilmente pelo
16
colaborador Antônio Mauro Rezende. A Figura 3 ilustra o significado do MCC, Degree e uma rede
predita do proteoma predito de L. infantum.
2.7 Clonagem e expressão de proteínas heterólogas
O DNA recombinante
Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, a clonagem molecular ganhou grande
interesse a nível biotecnológico. A clonagem consiste no isolamento e propagação de moléculas
de DNA idênticas compreendendo pelo menos duas etapas importantes: a primeira etapa é
chamada de ligação, onde o fragmento do DNA de interesse (inserto) é ligado à outra molécula de
DNA (vetor), formando o DNA recombinante. Na segunda etapa, a molécula do DNA
A
Figura 3 - A) Representação de nós com alto MCC (circulo azul) e alto Degree (circulo vermelha); B) Rede predita de interação do proteoma predito de L. infantum desenvolvida por Rezende e colaboradores (2012).
Fonte: Adaptado Rezende et al (2012)
17
recombinante é introduzida numa célula hospedeira, num processo chamado de transformação. A
célula hospedeira que adquire o DNA recombinante é denominada de célula transformada ou
transformante (NASCIMENTO et al., 1999). A construção do DNA recombinante está
representada na Figura 4.
Nesse contexto, a Escherichia coli surge como umas das principais e mais utilizadas
células hospedeiras para o emprego da tecnologia do DNA recombinante. Ela é extremamente
utilizada por ser um veículo mais intensamente estudado e provavelmente a célula melhor
conhecida de qualquer espécie, tendo o mapa cromossômico definido e bem caracterizado. E. coli
é uma bactéria Gram-negativa constituída de um DNA imerso no citoplasma e um plasmídeo
circular. O processo da expressão gênica (transcrição e tradução) está ligado com a síntese de
novo de RNA mensageiro (RNAm), ficando imediatamente disponível para a tradução. Não há
modificações pós-traducionais, como ocorre em eucariotos.
Figura 4 - Desenho esquemático para a construção do DNA recombinante.
Fonte : Adaptado http://biologia12d.wordpress.com/
18
Produção de proteínas recombinantes
Para a produção da proteína heteróloga de interesse, o gene da proteína a ser expresso
deve primeiramente ser inserido em um vetor de expressão. Os vetores de expressão são
capazes de se autorreplicar e regular a expressão dos genes neles codificados. As estruturas que
formam um vetor são: promotores, origens de replicação, sítios iniciadores e terminadores tanto
da transcrição como da tradução, marcadores seletivos, sítios de múltipla clonagem ou de ligação
do gene isolado. Para a clonagem de genes são utilizados três tipos de vetores: plasmídeos,
bacteriófagos e cosmídeos (LARENTIS et al., 2006).
Atualmente, existem inúmeros sistemas de expressão como bactérias, leveduras, células de
insetos, plantas ou mamíferos. A maior vantagem do sistema de levedura, frente ao bacteriano, é
o potencial que as leveduras em realizar modificações pós-traducionais, tipicamente associadas
com eucariotos superiores, tais como processamento de peptídeo sinal, formação de pontes
dissulfeto, adição de lipídeos e glicosilações O- e N- ligadas. O primeiro sistema desenvolvido
para a expressão de genes heterólogos em fungos foi baseado na levedura do pão,
Saccharomyces cerevisiae. Essa plataforma possui o status de GRAS e foi utilizada com sucesso
na produção de vários fármacos aprovados pela FDA (Food and Drugs Administration), incluindo
a insulina e a primeira vacina recombinante, o antígeno viral da hepatite B (HARFORD et al.,
1987). Para a expressão da proteína de forma bem sucedida, a escolha do sistema de expressão
é de fundamental importância e deve levar em consideração a estrutura da proteína, sua
funcionalidade e complexidade, e também a produtividade desejada (LARENTIS et al., 2006).
No caso, escolhemos como sistema de expressão uma levedura, Pichia pastoris (CREGG e
HIGGINS, 1995), amplamente difundida na comunidade científica, inclusive a nível industrial. A P.
pastoris (CREGG et al., 1985) é uma levedura metilotrófica, que utiliza como única fonte de
carbono o metanol. As reações acontecem inicialmente em organelas especializadas, os
peroxissomos, e depois no citoplasma. O metanol entra nos peroxissomos e é oxidado por
oxidases específicas em formaldeído e peróxido de hidrogênio, que é decomposto em água e
oxigênio molecular por uma catalase. O formaldeído gerado pelas oxidases entra tanto na via
catabólica para obtenção de energia, quanto na via anabólica para obtenção de biomassa. Os
genes que codificam essas oxidases foram identificados e clonados. A P. pastoris possui dois
genes, AOX1 (alcool oxidase 1) e AOX2 (alcool oxidase 2). A enzima AOX2 possui a mesma
atividade específica que a AOX1, mas com um nível de expressão muito menor devido ao fato do
seu promotor ser mais fraco (CREGG et al., 1989). Existem muitos vetores comerciais que podem
ser usados para expressar proteínas em P. Pastoris. Esses vetores são geralmente do tipo
integrativo e possuem um cassete de expressão formado pelo promotor e pela região terminadora
de transcrição do gene AOX1, além de uma marca de seleção, sendo a mais utilizada o gene
histidinol desidrogenase (HIS4) ou resistência a zeocina. O vetor escolhido para ser utilizado
19
neste estudo, o pPICZα, é um dos vetores que vêm sendo mais empregados na expressão em P.
pastoris. O vetor possui seleção por zeocina, além de possuircomo sinal de secreção o peptídeo
sinal do fator α, o promotor AOX1 e a região terminadora de transcrição do gene AOX1. Outra
grande vantagem é o tamanho desses vetores, que variam de 3,3 a 3,6 kb. A recombinação
homóloga para a integração dos plasmídeos pode ocorrer com um único ‘crossing over’ no locus
his4 ou no locus AOX1, gerando mutantes com fenótipo Mut+ (Methanol utilization plus). Esse
fenótipo se refere à habilidade de metabolizar metanol como única fonte de carbono. Quando a
recombinação ocorre no locus AOX1 através de um duplo ‘crossing over’ entre regiões do vetor e
do genoma, e a região codificadora AOX1 é completamente removida, o fenótipo resultante MutS
(Methanol utilization slow) é causado pela perda de atividade da álcool oxidase codificada pelo
gene AOX1(VASSILEVA et al., 2001).
Dentre as várias linhagens de P. pastoris disponíveis no mercado, escolhemos a linhagem
X33, que possui o genótipo selvagem, podendo gerar clones com fenótipo do tipo MutS e clones
com fenótipo Mut+ por manter os dois genes que codificam para AOX.
20
OBJETIVOS 3
3.1 Objetivo geral
O objetivo geral deste estudo foi selecionar, clonar e expressar genes do genoma de L.
infantum candidatos vacinais contra a LVC.
3.1.1 Objetivo específico I
Selecionar os antígenos utilizando as ferramentas de bioinformática. Este objetivo será
detalhado na ETAPA I do estudo.
3.1.2 Objetivo específico II
Clonar e expressar os antígenos selecionados pela bioinformática. Este objetivo será
detalhado na ETAPA II.
21
MATERIAIS E MÉTODOS 4
4.1 Materiais
4.1.1 Ferramentas de bioinformática
As ferramentas de bioinformática utilizadas no projeto estão referenciadas na Tabela 2.
Tabela 2 - Algoritmos utilizados no projeto
Princípio
Células T CD8
+
NetCTL Através de redes neurais e matrizes de substituição, o algoritmo prediz três
processos: clivagem proteassomal das proteínas, eficiência do transporte pela TAP e ligação dos peptídeos ao MHC-I.
NetMHC Utilizando as redes neurais e matrizes de pontuação e modelos ocultos de
Markov, o algoritmo calculou a afinidade de ligação de peptídeos a diferentes alelos de HLA e H2 de MHC I.
Células T CD4+
NetMHCII Utiliza rede neural artificial para a identificação simultânea do núcleo de ligação
e a afinidade de ligaçãocom moléculas de MHC-II.
Células B
BepiPred Prediz epítopos lineares de células B com base nos modelos ocultos de Markov
e o método de escala de propensão.
BCPred12 Utiliza SVM que analisa e reconhece padrões de antigenicidade.
AAP12 Utiliza a escala AAP juntamente com escala de propensão para predição de
epítopos lineares para células B.
Localização subcelular de
proteínas
WoLF PSORT Baseia-se no nas características dos aminoácidos vizinhos (chamado de kNN)
que analisa peptídeos sinais. composição dos aminoácidos e motivos funcionais para a ligação no DNA.
TargetP Utiliza as informações da porção N terminal das proteínas e discrimina entre
proteínas destinadas à mitocôndria, cloroplasto ou via secretória.
Sigcleave Utilizando as matrizes de peso de cada aminoácido, reporta peptídeos sinais
numa sequência proteíca.
Glicosilações
NetOGlyc Utiliza as redes neurais para predição de O-glicosilação.
NetNGlyc Utiliza as redes neurais para predição de N-glicosilação.
YinOYang Utiliza as redes neurais para predição de sítios de O-β-GlcNAcilação.
Alinhamento de sequências
Blastp Analisa a similaridade entre as sequências, retornando uma lista de resultados
contendo diferentes genes que apresentam graus decrescentes de similaridade com a nossa sequência problema.
Fonte: Elaborado pelo autor. Obs: HLA (antígenos leucocitários humanos); H2 (Antígenos MHC do rato); TAP (Transportadores associadas ao processamento de antígenos); kNN (k-nearest neighbors); AAP (Amino Acids Pairs); SVM (Support Vector Machine).
22
4.1.2 Plasmídeos
pPICZα-A (INVITROGEN): Utilizado tanto para a clonagem em E. coli como para integração
no genoma da P. pastoris dos genes. Possui alguns fatores extremamente importantes: o
promotor AOX1, essencial para a integração no gemona da P. pastoris; fator α, que direciona a
proteína recombinante para a via secretória; um sítio múltiplo de clonagem com sítios de restrição
para 10 enzimas; um epítopo myc na região C-terminal, para detecção da proteína; uma cauda de
histidina (6x His) na região C-terminal, necessária para a purificação e a detecção; o gene Sh ble
de resistência a zeocina como marca de seleção para bactérias e leveduras. Na Figura 5 está
mostrado o mapa do vetor.
Figura 5 - Mapa do vetor pPICZα-A
pGEM®-T Easy Vector (PROMEGA): Utilizado para a clonagem dos genes em E. coli.
Possui o gene lacZ, que codifica para a enzima β galactosidase, também possui o gene que
codifica para a β-lactamase que confere resistência para ampicilina. Vetor linearizado comercial
utilizado para a ligação de fragmentos de PCR adenilados. Esse vetor possui, em suas
Fonte: Manual técnico de expressão em P. pastoris da INVITROGEN.
23
extremidades, uma timina não pareada que facilita a ligação de produtos de PCR que
apresentam, em suas extremidades 3’ e 5’, adeninas não pareadas geradas pela ação de alguns
tipos de DNA polimerases que têm atividade adenosina terminal transferase. É um vetor presente
no citoplasma celular em alto número de cópias, que possui uma região de clonagem com
múltiplos, sítios de enzimas de restrição, flanqueada pelas sequências promotoras das RNA
polimerases virais SP6 e T7. Essa região de clonagem se encontra dentro da sequência
codificante da enzima β-galactosidase (lacZ), o que permite a seleção de clones transformados
com o plasmídeo contendo o inserto de PCR pela análise da cor, azuis ou brancos, sendo
negativas ou positivas respectivamente. Possui também o gene de resistência à ampicilina (Ampr)
e as sequências da origem de replicação plasmidial (ori) e da origem de replicação de fago (f1
ori). Na Figura 6 está mostrado o mapa esquemático desse vetor.
Figura 6 - Mapa do vetor pGEM T easy
4.1.3 Linhagens de microrganismos
Leishmania infantum (MHOM/BR/1974/PP75): A cepa foi caracterizada e mantida no
laboratório cultivadas em meio ágar-sangue, Nicole-Novy-Neal (NNN) associado ao Liver Infusion
Trytose (LIT) e mantidas em estufa refrigerada à temperatura de 23 ± 1°C. A cepa foi utilizada
para a obtenção dos genes de interesse.
Fonte: Manual técnico pGEM® T easy da PROMEGA.
24
Escherichia coli XL10 Gold (STRATAGENE)
Genótipo: endA1 glnV44 recA1 thi-1 gyrA96 relA1 lac Hte Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-
mrr)173 tetR F'[proAB lacIqZΔM15 Tn10(TetR Amy CmR)]. Fenótipo: sistemas de restrição
deficiente, endonuclease deficiente, recombinase deficiente, permite a seleção de colônias azuis
e brancas, resistente à tetraciclina, resistente ao cloranfenicol. Essa linhagem foi desenvolvida
para a eficiente transformação utilizando moléculas grandes de DNA. Essa linhagem foi utilizada
para armazenamento, clonagem e amplificação de DNAs plasmidiais.
Pichia pastoris X-33 (INVITROGEN)
Genótipo: selvagem. Fenótipo: Mut+ (crescimento rápido em meios contendo o metanol como
única fonte de carbono devido à atividade da enzima AOX1).
4.1.4 Meios de cultura
Meio LB (Luria-Bertani): Solução com 1% de triptona, 1% de NaCl, 0,5% de extrato de
levedura, 1,5% de ágar para meio sólido, pH 7,5. O meio foi autoclavado e estocado a 4ºC.
Meio LSLB (Low Salt Luria-Bertani): Preparar solução de 1% de triptona, 0,5% de NaCl,
0,5% de extrato de levedura, (1,5% de ágar para meio sólido), ajustar o pH para 7.5 com NaOH e
autoclavar. Estocar a 4 ºC.
Meio YPD (Meio extrado de levedura peptona e glicose): Preparar solução de 1% de
extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de dextrose e (1,5% de ágar para meio sólido).
Autoclavar. Estocar a 4°C.
Meio MD (Meio mínimo com glicerol): Autoclavar água destilada (adicionar 1,5% de ágar
para meio sólido) e adicionar as soluções-estoque para uma concentração final de 1,34% de
YNB, 4x10-5 % de biotina e 2% de dextrose. Estocar a 4°C.
Meio MM (Meio mínimo com metanol): Autoclavar água destilada (adicionar 1,5% de ágar
para meio sólido) e adicionar as soluções-estoque para uma concentração final de 1,34% de
YNB, 4x10-5% de biotina, 0,5% de metanol. Reservar a 4°C.
Meio BMMY ( Meio complexo tamponado com metanol): Solução 1% de extrato de
levedura , 2% de peptona, 100mM de tampão fosfato de potássio pH6.0, 1,34% de YNB, 4x10-5 %
25
de biotina, 0,5% metanol. Para 1L de solução dissolver 10g de extrato de levedura e 20g de
peptona em 700 ml de água destilada e autoclavar. Em seguida, adicionar as soluções-estoque
de acordo com as concentrações finais descritas.
Meio BMGY (Meio complexo tamponado com glicerol): Utiliza-se os mesmos reagentes
substituindo o metanol por glicerol.
Meio MMY (Meio complexo com metanol): Solução 1% de extrato de levedura, 2% de
peptona, 1,34% de YNB, 4x10-5 % de biotina, 0,5% metanol. Para 1L de solução dissolver 10g de
extrato de levedura e 20g de peptona em 800 ml de água destilada e autoclavar. Em seguida,
adicionar as soluções-estoque de acordo com as concentrações finais descritas.
4.1.5 Antibióticos
Para preservação das suas propriedades, os antibióticos foram estocados a -20 ºC e
adicionados a soluções cuja temperatura não ultrapassasse 50°C. O estoque, os meios de cultura
e as placas contendo Zeocina foram armazenados protegidos da luz, porque esse antibiótico é
fotossensível.
Ampicilina (INVITROGEN): Estoque de 100mg/ml. Dose para seleção de 100μg/ml para E.
coli.
Zeocina (INVITROGEN): Estoque de 100mg/ml. Dose para seleção de 25μg/ml para E. coli e
100μg/ml a 1000μg/ml para P. pastoris.
4.1.6 Soluções em geral
dNTP’s 10 mM
IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) 1 M
X-GAL 1 M
Brometo de etídio 10 mg/ml
Iniciadores
26
4.1.7 Marcadores de peso molecular
Marcadores de massa molecular para proteína (BIORAD): KALEIDOSCOPETM composto
por proteínas multicolor com as seguintes massas moleculares: 10 a 250 kDa.
Marcadores de massa molecular para DNA GeneRuler 1 Kb (FERMENTAS): Composto
por DNA com os seguintes pares de base: 250 a 10.000 pb.
Marcadores de massa molecular para DNA GeneRuler Low range (FERMENTAS):
Composto por DNA com os seguintes pares de base - 25 a 700 pb.
4.1.8 Enzimas
Enzimas de Restrição: Endonucleases de restrição PmeI para linearização do pPICZα-A,
XbaI e EcoRI para digestão do plasmídeo e dos genes de interesse. As enzimas foram
fornecidas pela NEW ENGLAND BIOLABS . As enzimas reconhecem sequências específicas de
DNA e clivam pontos constantes dentro da sequência.
Ligase: A enzima T4 DNA Ligase, fornecida pela INVITROGEN, catalisa a formação de uma
ligação fosfodiéster entre o grupo fosfato 5´ e o grupo hidroxila 3´ do DNA ou do RNA.
DNA Polimerase: Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity, fornecida pela
INVITROGEN, catalisa a polimerização de moléculas de DNA de até 20kb e possui atividade
exonuclease 3´-5´(Proofreading).
Lyticase fornecida pela SIGMA: A enzima lyticase hidrolisa as ligações β1-3 da parede de
leveduras, e foi usada na extração do DNA genômico da P. pastoris.
27
4.2 Métodos
4.2.1 ETAPA I – Seleção dos antígenos pela Bioinformática
O delineamento metodológico da Etapa I esta representada na Figura 7.
Figura 7 - Delineamento metodológico da Etapa I.
Fonte: Autoria própia. ptn = proteína
28
4.2.1.1 Obtenção da sequência genômica
Neste trabalho, foi utilizado o genoma do protozoário L. infantum composto por 36
cromossomos e 8.241 proteínas, disponível no Kinetoplastid Genomics Resource através do
seguinte sítio: http://tritrypdb.org/common/downloads/release-2.2/Linfantum/ .
4.2.1.2 Predição de epítopos de células T
Para a predição de epítopos de células T CD8+, foram instalados localmente os algoritmos
NetCTL (PETERS et al., 2003; NIELSEN et al., 2005; LARSEN et al., 2007) e NetMHC (BUUS et
al., 2003; NIELSEN et al., 2003; NIELSEN et al., 2004). Para a realização das predições, os
algoritmos foram parametrizados para genomas de eucariotos, e foram feitas predições para 12
alelos de humanos e sete de camundongos disponíveis, totalizando 19 diferentes alelos. Os
seguintes alelos utilizados foram: A1, A2, A3, A24, A26, B7, B8, B27, B39, B44, B58, B62, H2-Db,
H2-Dk, H2-Dd, H2-Kb, H2-Kd, H2-Kk, H2-Ld.
Enquanto que para a predição de epítopos de linfócitos T CD4+, foi instalado localmente o
algoritmo NetMHCII (NIELSEN et al., 2007; NIELSEN e LUND, 2009). Para a realização das
predições, o algoritmo foi parametrizado para genomas de eucariotos, e foram feitas predições
para 14 alelos de humanos e três de camundongos disponíveis, totalizando 17 diferentes alelos.
Os seguintes alelos foram utilizados: HLA-DRB1-0101, HLA-DRB1-0301, HLA-DRB1-0401, HLA-
DRB1-0404, HLA-DRB1-0405, HLA-DRB1-0701, HLA-DRB1-0802, HLA-DRB10901, HLA-DRB1-
1101, HLA-DRB1-1302, HLA-DRB1-1501, HLA-DRB3-0101, HLA-DRB4-0101, HLA-DRB50101
H2-IAs, H2-IAd e H2-IAb.
4.2.1.3 Predição de epítopos de células B
Para a predição de epítopos de células B, foram instalados localmente os algoritmos
BepiPred (LARSEN et al., 2006) e BCPreds (CHEN et al., 2007; EL MANZALAWY et al., 2008c;
2008b). Foram utilizados, em conjunto com o BepiPred, dois algoritmos do pacote BCPreds, o
BCPred12 e o AAP12. Para a realização das predições, os algoritmos foram parametrizados para
genomas de eucariotos.
29
4.2.1.4 Predição da localização subcelular de proteínas
No processo de classificação da localização subcelular das proteínas do parasito, utilizamos
as predições geradas por algoritmos empregando a seguinte abordagem: a) matrizes de peso,
empregadas nos pacotes WoLF PSORT (HORTON et al., 2007b), b) SigCleave (do pacote
EMBOSS) e c) TargetP (EMANUELSSON et al., 2000). A Tabela 3 mostra as possíveis
localizações fornecidas pelos algoritmos.
Tabela 3 - Localizações preditas pelos algoritmos
Algoritmo utilizado
MP- Proteínas mitocondriais TargetP e WoLF
PSORT
CP- Proteínas citoplasmáticas WoLF PSORT
NP- Proteínas nucleares WoLF PSORT
SP- Proteínas de secreção TargetP e WoLF
PSORT
PMP- Proteínas de membrana plasmática WoLF PSORT
4.2.1.5 Desenvolvimento do Banco de Dados relacional
Para a integração dos resultados e a definição das proteínas alvo para o desenvolvimento de
vacina, foi construído um banco de dados relacional. Esse banco de dados possibilitou consultas
em linguagem SQL (Structured Query Language), permitindo o cruzamento de informações entre
os resultados obtidos pelos diversos preditores e a extração da informação. O Sistema
Gerenciador de Bancos de Dados (SGBD) escolhido para realizar essa tarefa foi o MySQL, que
pode ser obtido no seguinte sítio: http://dev.mysql.com/downloads/.
4.2.1.6 Critérios para pré-seleção das proteínas
Para a pré-seleção dos candidatos foram definidos critérios de pré-seleção. De acordo com
os critérios, as proteínas pré-selecionadas deveriam ser excretadas/secretadas ou de membrana
plasmática, com epítopos com afinidade por cada uma das moléculas de MHC (para os alelos
envolvidos) pesquisadas, com epítopos de célula B preditos pelos três preditores utilizados.
Fonte: Elaborado pelo autor.
30
4.2.1.7 Buscas por similaridade de sequências
O objetivo foi confrontar as proteínas pré-selecionadas, pela busca no banco de dados, com
o proteoma humano, de cão e camundongo. Isso foi feito utilizando o algoritmo BLASTp, do
pacote Blastall (Basic Local Alignment Search Tool)(ALTSCHUL et al., 1990). Dessa forma,
conseguimos eliminar as proteínas com alto grau de similaridade com os três proteomas, a fim de
evitar possíveis reações de autoimunidade após vacinação. O limite aceitável de similaridade foi
de até 60% (HERRERA-NAJERA et al., 2009)
4.2.1.8 Buscas na rede de interação proteína-proteína
Nesta etapa contamos com a colaboração do Dr. Antônio Mauro Rezende, que juntamente
com a equipe desenvolveram uma rede predita de proteínas do proteoma de L. infantum. As
proteínas com menos de 60% de similaridade com os organismos analisados foram analisadas
nessa rede de interação e foi retornado o grau de centralidade dessas proteínas no proteoma do
parasito e consequentemente na biologia do mesmo. Foram analisados os valores de MCC e
Degree.
4.2.1.9 Critérios técnicos para seleção das proteínas
Um dos critérios foi o número de glicosilações das proteínas. Desse modo, é possível utilizar
algoritmos de reconhecimento de padrões para reconhecer eventuais sítios de modificação em
uma determinada proteína. No caso foram utilizados os algoritmos NetNglyc (GUPTA et al.,
2004), NetOglyc (STEENTOFT et al., 2013) para a predição das glicosilações. Outros critérios
adotados foram a massa molecular e o tamanho das proteínas.
31
4.3 ETAPA II – Clonagem e expressão dos antígenos
O delineamento experimental da Etapa II está representado na Figura 8.
Figura 8 - Delineamento experimental da Etapa II.
Fonte: Elaborado pelo autor.
32
4.3.1 Obtenção de massa úmida de L. infantum
Nesta etapa foram utilizadas promastigotas da cepa de Leishmania infantum
MHOM/BR/1974/PP75 referência da OMS. O parasito é mantido no criobanco de cepas do
Laboratório de Imunopatologia (LIMP) do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas (NUPEB)
da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). A cepa do parasito foi expandida e cultivada em
meio de cultura LIT em estufa biológica refrigerada BOD (FANEM® modelo 347) à temperatura de
23°C ± 1°C. O número de parasitos foi expandido por meio de repiques sucessivos em tubos de
vidro de 3 mL e posteriormente em Erlenmeyers de 25 mL, 50 mL e 500 mL, respectivamente,
para a obtenção final de 2 x 108 células. Após o sétimo dia do último repique, uma alíquota de 20
μL de cada cepa foi removida em capela de fluxo laminar para realização da contagem em
Câmara de Neubauer. Após a contagem e verificação do número de parasitos desejados, as
culturas foram transferidas para tubos de 50 mL (FALCON®, BECTON DICKINSON, EUA), que
foram submetidos à centrifugação em 3.800 x g durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
desprezado e o sedimento suspenso em solução PBS estéril pH 7,2. As células foram lavadas e
centrifugadas por três vezes (2.500 x g durante 10 minutos a 4ºC) em solução de PBS. A massa
úmida obtida foi estocada em freezer a temperatura -80ºC até o momento do uso.
4.3.2 Extração de DNA genômico de L. infantum
A extração do DNA foi realizada a partir de massas úmidas de parasitos obtidos
anteriormente. Para a obtenção do DNA genômico foi utilizado o kit de extração WizardTM
Genomic DNA Purification Kit (PROMEGA®, MADISON, WI, USA) seguindo as recomendações
do fabricante, descrito de forma sucinta a seguir. As massas de parasitos armazenadas em -80°C
foram descongeladas para a retirada de uma alíquota de 200 μL, e a este volume foram
adicionados 700 μL de solução de lise celular. Em seguida, a amostra foi homogeneizada por 10
minutos e centrifugada a 15.000 x g por um minuto em microcentrífuga (EPPENDORF®- Modelo
5418, NY, USA). Posteriormente, foi descartado o sobrenadante e o precipitado agitado com o
auxílio de vórtex (VISION SCIENTIFIC®, KOREA) por 15 segundos. Em seguida, foram
adicionados 200 μL de solução de lise nuclear e 75μL de solução de precipitação protéica.
Novamente, com o auxílio do vórtex, a amostra foi homogeneizada por 30 segundos e
centrifugada a 15.000 x g por três minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo, onde
se adicionaram 200 μL de isopropanol (MERCK®, DARMSTAD, ALEMANHA), e em seguida a
33
amostra foi homogeneizada por aproximadamente 30 segundos. Após esse procedimento, a
amostra foi centrifugada a 15.000 x g por um minuto, o sobrenadante descartado e o precipitado
novamente levado ao vórtex por 15 segundos. Posteriormente, foram acrescentados 500 μL de
etanol a 70% (MERCK®, DARMSTAD, ALEMANHA), sendo a amostra homogeneizada e
centrifugada a 15.000 x g por um minuto. Em seguida, foi desprezado o sobrenadante e a
amostra deixada por 35 a 45 minutos em temperatura ambiente até total evaporação do etanol.
Finalmente, foram adicionados 100μL de solução de hidratação e as amostras foram mantidas
por 24 horas a temperatura ambiente, sendo periodicamente homogeneizadas. Após esse prazo,
foram armazenadas em geladeira a 4°C até o momento da análise da qualidade do DNA extraído
e início da reação de PCR. O DNA extraído foi quantificado no NANOVUE (GE HEALTHCARE®),
que além de fornecer as concentrações do DNA, possibilita analisar a qualidade do DNA através
da razão A260/280.
4.3.3 Caracterização da Leishmania por PCR-RFLP (Polimorfismo de
tamanho dos fragmentos de restrição)
A caracterização molecular da cepa de referência de Leishmania infantum foi feita pela
análise PCR-RFLP. Primeiramente foi realizado um PCR utilizando o par de iniciadores (150) 5’-
GGG (G/T)AG GGG CGT TCT (G/C)CG AA-3’ e (152) 5’-(G/C)(G/C)(G/C) (A/T)CT AT(A/T) TTA
CAC CAA CCC C-3’, direcionados para amplificação da região conservada dos minicírculos de
kDNA de Leishmania (DEGRAVE et al., 1994). A reação constituiu de: 2 µL de tampão 10x
(INVITROGEN®, CARLSBAD, CA, USA), 1,2 µL de MgCl2 25mM, 0,4 μL de dNTPs 10mM, 1,5 μL
de cada iniciador (150 e 152) 10 pmol, 0,5 μL de Taq DNA polimerase (FERMENTAS -
SINAPSE®) 5U/μL, 50 ng de DNA e água ultrapura q.s.p. 20 μL. As condições de amplificação
foram: desnaturação inicial a 94°C por três minutos, seguida por 40 ciclos a 93ºC por 30
segundos, 64°C por um minuto, 72°C por 30 segundos e uma extensão final a 72°C por sete
minutos. O equipamento utilizado foi o termociclador Verit Termal Cycler 96 well (APPLIED
BIOSYSTEMS®, CALIFÓRNIA, USA). Após a realização da PCR, foi realizada a RFLP kDNA
conforme VOLPINI et al. (2004). Resumidamente, 10 μL do produto da PCR foram digeridos,
através da incubação durante três horas a 37°C, por 2U da enzima HaeIII em seu tampão de uso
10x (INVITROGEN®, CARLSBAD, CA, USA) e água ultrapura totalizando 20 μL. Os fragmentos
de restrição foram separados em gel de poliacrilamida 10%, onde foram aplicados 10 μL do
produto restringido em um volume equivalente de tampão da amostra 2X (azul de bromofenol
0,25%, xilenocianol 0,25% e 15% de ficol). A corrida eletroforética foi realizada a 90 V em TBE
34
(Tris-base 89 mM pH 8,0; ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM). Foi utilizado o marcador de peso
molecular de 25 pb (INVITROGEN®, CARLSBAD, CA, USA). Em seguida, os géis foram corados
pelo nitrato de prata 0,2%.
4.3.4 Estratégia de clonagem
A estratégia foi desenhada para a clonagem no plasmídeo pPICZα-A e foram selecionadas
duas enzimas de restrição que estivessem presentes no sítio de clonagem do vetor, mas que não
hidrolizassem os insertos. Para o desenho dos iniciadores de cada gene, foi necessário a inclusão
de sítios de restrição para as endonucleases XbaI e EcoRI, para que os insertos pudessem ser
ligados ao pPICZα-A. Como cada gene possuía um stop codon , foram realizadas mutações sítio
dirigidas, fazendo com que o stop codon ficasse depois da cauda de histidina, o que permite a
expressão da proteína com o epítopo C-myc e a cauda de histidina. A estratégia de clonagem
está representada na Figura 9.
Digestão enzimática com XbaI e EcoRI
Inserto
Vetor
Cauda de histidina
Epitopo C-myc
Figura 9 - Desenho esquemático da estratégia de clonagem.
Fonte: Elaborado pelo autor.
35
4.3.5 Amplificação dos genes de interesse por PCR (Reação em
cadeia da polimerase)
As sequências de genes que codificam para as proteínas P4 e P5, selecionadas por
bioinformática, foram amplificadas por PCR, a partir do DNA genômico da Leishmania infantum
(MHOM/BR/1974/PP75), utilizando os iniciadores descritos na Tabela 4.
Tabela 4 - Sequência de iniciadores para amplificação dos genes de interesse
Oligo Sequência
LinP4-RCB senso 5’ GCA G*AA TTC ATG AAG TTC ATG GAC GTA
LinP4-RCB antisenso 5’ T*CT AGA CAC CGT ATT TTC TTC TCG CCT
LinP5-RCB senso 5’ GCA G*AA TTC ATG GCG TCT GTA GTT GGC A
LinP5-RCB antisenso 5’ T*CT AGA TAC CAT TGG AAT CGC GAG CTG G
*em negrito esta representado os sitios de restrição para as enzimas EcoRI e XbaI respetivamente
Nas reações de PCR foram utilizados os iniciadores específicos para cada gene numa
reação com o volume final de 300 µL, constituída de: 30 µL do tampão 10x para a enzima de alta
fidelidade (INVITROGEN®, CARLSBAD, CA, USA), 12 µL de MgSO4 50 mM, 6 µL de dNTPs
10mM, 12 µL de cada iniciador (senso e antisenso) 10 pmol, 1,5 µL de Platinum® Taq DNA
polimerase High Fidelity 5U/µL (INVITROGEN®, CARLSBAD, CA, USA), 100 ng de DNA e água
ultrapura q.s.p 300 μL. A amplificação ocorreu no aparelho termociclador VeritTermal Cycler 96
well (Applied Biosystems®,Califórnia, USA) sob as seguintes condições de amplificação:
desnaturação inicial a 94ºC por dois minutos, seguida por 32 ciclos a 94ºC por 30 segundos, 60°C
por 45 segundos, 68°C por três minutos. O produto de PCR (10µL) foi submetido a uma corrida
eletroforética em gel de agarose 1% EtBr (Brometo de Etídio) em TAE 1X (Tris-Acetato 0,04M;
EDTA 0,001M pH 8,0), voltagem de 90 V, sendo visualizado em luz UV de transiluminador (UVP-
Transilluminator; Modelo TM-36, USA) e fotografado.
4.3.6 Purificação de DNA
Para a purificação dos fragmentos, foram utilizados os 290 µL restantes do produto de
PCR, que foram submetidos às mesmas condições de fracionamento eletroforético.Os amplicons
correspondentes aos genes que codificam as proteínas em estudo foram obtidos pela
36
amplificação descrita no item anterior e foram purificados pelo kit Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System (PROMEGA®, MADISON, WI, USA), para serem utilizados na clonagem,
seguindo o protocolo do fabricante, descrito a seguir.
Os amplicons de interesse foram cortados do gel de agarose 1,5%. Foram adicionados 10
µL da solução de ligação à coluna para cada 10 mg do gel cortado, vortexando e incubando
depois a 50-60ºC até a dissolução total do gel. Em seguida, a mistura foi transferida para uma
minicoluna, onde foi incubada por um minuto a temperatura ambiente. Logo após a incubação, o
sistema foi centrifugado a 16.000 x g por um minuto. Foram feitas duas lavagens adicionado-se à
minicoluna 700 µL da solução de lavagem, e posterior centrifugação (16.000 x g). Para a eluição
do DNA, a minicoluna foi transferida para um tubo de microcentrífuga, onde foram adicionados 50
µL de água livre de nucleases, sendo incubada por um minuto a temperatura ambiente e
centrifugada por um minuto a 16.000 x g. O DNA obtido foi estocado a -20ºC.
4.3.7 Preparação de bactérias quimiocompetentes
As bactérias E.coli XL-10 GOLD foram pré-inoculadas em sete mL de meio LB (Luria Bertani)
e incubadas sob agitação a 180-200 RPM no Shaker (NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC- modelo I-
42/42R) a 37ºC overnight. A cultura bacteriana foi inoculada em 100 mL de meio LB e novamente
incubada a 37°C a 180-200 RPM. O crescimento foi acompanhado até a cultura atingir uma DO
(A600nm) entre 0,4 e 0,6, correspondendo à fase logarítmica de crescimento. As bactérias foram
centrifugadas a 3.000 x g durante 15 minutos a 4ºC e o sedimento homogeneizado em 50 mL de
CaCl 75 mM, Tris-HCl pH 8,0. A suspensão bacteriana foi incubada em gelo por 20 minutos e
centrifugada como descrito anteriormente. O pellet celular foi ressuspendido em 2,5 mL da
mesma solução, acrescida de 15% de glicerol, sendo distribuído em alíquotas mantidas no gelo e
congeladas a -80ºC até o momento do uso (AUSUBEL, 1994).
4.3.8 Obtenção de DNA plasmidial
A obtenção de DNA plasmidial em pequena escala (miniprep) foi realizada com o kit Wizard®
Plus SV Minipreps DNA Purification System (PROMEGA®, MADISON, WI, USA) seguindo o
protocolo do fabricante. As bactérias contendo os plasmídeos recombinantes (pPICZα-A e
pGEM® T easy) foram repicadas em 10 mL de meio LBLS (baixa concentração de sal) ou LB
37
acrescidos de zeocina 25 µg/mL ou ampicilina 100 µg/mL respectivamente, a 37ºC, sob agitação,
por 16 horas. As culturas bacterianas foram centrifugadas a 10.000 x g por 15 minutos. Os
sobrenadantes foram descartados e os sedimentos ressuspendidos em 250 µL da solução de
ressuspensão. Foram adicionados 250 µL da solução de lise celular e 10 µL da solução de
protease alcalina, misturando bem e incubando por cinco minutos a temperatura ambiente. Em
seguida, foram acrescentados 350 µL da solução de neutralização, misturando bem e
centrifugando depois por 10 minutos a 16.000 x g. O sobrenadante foi transferido para a
minicoluna, que foi acoplada a um tubo coletor, e o sistema foi centrifugado a 16.000 x g por um
minuto, esvaziando o tubo coletor. Ao sistema foram adicionados 750 µL da solução de lavagem,
que foi centrifugado por um minuto a 16.000 x g, esvaziando o tubo coletor. A etapa anterior foi
repetida com 250 µL da solução de lavagem, centrifugando por dois minutos a 16.000 x g. A
minicoluna foi transferida para um tubo de microcentrífuga, e o DNA foi eluído com 100 µL de
água livre de nucleases, sendo centrifugado a 16.000 x g. A minicoluna foi descartada e o DNA
plasmidial foi estocado a -20ºC.
4.3.9 Clonagem no vetor pGEM T easy
Os genes foram clonados no vetor pGEM®
T easy (PROMEGA®, MADISON, WI, USA). Essa
etapa foi feita para confirmar a estratégia de clonagem e para facilitar a digestão dos insertos.
4.3.9.1 Reação de ligação inserto-vetor
Para as reações de ligação, foi padronizada a razão molar oito para um, que se refere a oito
moléculas de inserto (P4 ou P5) para uma molécula de plasmídeo (pGEM). A quantidade de DNA
purificado (inserto) para a ligação foi calculada tendo como base a equação:
ng do inserto = 50 ng plasmídeo × Kb (inserto) × 8 Kb (plasmídeo) 1
38
Levando em consideração o protocolo indicado pelo fornecedor para a reação de ligação,
foram adicionados num tubo de PCR 5 µL de tampão 2X, 1 µL do pGEM T easy, 1 µL da enzima
T4 DNA Ligase (PROMEGA®, MADISON, WI, USA), a quantidade calculada de inserto e água
ultrapura q.s.p 10 µL. A reação foi incubada a 4ºC overnight para a reação de transformação. Os
plasmídeos recombinantes foram denominadas de pGEM/(gene de interesse P4 ou P5), exemplo:
pGEM/P4 se refere ao plasmídeo recombinante pGEM contendo o gene P4.
4.3.9.2 Transformação bacteriana
A transformação bacteriana foi realizada em tubos de microcentrífuga, utilizando 10 µL da
reação de ligação adicionados a 100 µL da bactéria quimiocompetente descongelada no gelo. A
mistura foi incubada no gelo durante 30 minutos. Após esse tempo, foi feito o choque térmico
através da incubação por dois minutos e 30 segundos a 42ºC, seguida pela incubação em gelo
por dois minutos. Após o choque térmico, foram adicionados 900 µL do meio LB (Luria
Bertani)sem antibiótico a cada tubo, os quais foram incubados, sob agitação, a 37ºC por uma
hora. A cultura bacteriana foi sedimentada em microcentrífuga a 3.000 x g por cinco minutos. O
pellet foi homogeneizado em aproximadamente 200 µL de meio LB. Um volume de 100 µL foi
plaqueado em placas de Petri contendo o meio LB ágar (LB acrescido de 1,5% ágar) acrescido de
ampicilina 100 µg/mL, de IPTG 1 mM (Isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo) e de X-Gal 0,04 mg/mL
(5-bromo-4-Cloro-3-indolyl-β-d-galactopiranosideo). As placas foram incubadas em estufa
(QUIMIS APARELHOS CIENTÍFICOS LTDA – modelo Q316M) a 37ºC overnight.
4.3.9.3 Triagem dos clones por PCR
As colônias brancas obtidas na transformação foram repicadas em tubos de microcentrífuga
contendo meio LB e ampicilina 100 µg/mL por 16 horas a 180-200 RPM no Shaker. Para a reação
de PCR, foram utilizados 2 µL da cultura, 1,2 µL de tampão 10X, 0,72 µL de MgCl2 50 mM, 0,24
µL de dNTPs 10mM, 0,9 µL de cada iniciador (senso e antisenso) de cada gene 10 pmol, 0,5 µL
de Taq DNA polimerase 5U/µL (FERMENTAS - SINAPSE®) e água ultrapura q.s.p 12 μL. As
condições de amplificação foram as mesmas da reação de PCR anteriormente descrita (item
4.10.5). Um volume de 10 µL do produto de PCR foi submetido a uma corrida eletroforética em
39
gel de agarose 1,5% EtBr em TAE 1X, sob voltagem de 90 V, e o gel foi visualizado em luz UV e
fotografado.
4.3.9.4 Confirmação dos clones por digestão enzimática
O DNA plasmidial dos clones positivos na triagem por PCR foram utilizados para a realização
da digestão enzimática. Foram adicionados num tubo de PCR 2 µL de tampão IV 10X, 2U de
cada enzima, EcoRI (NEW ENGLAND BIOLABS®) e XbaI (NEW ENGLAND BIOLABS
®), 0,2 µL
de BSA 100X, 100 ng de plasmídeo recombinante e água ultrapura q.s.p 20 µL. As misturas
foram incubadas a 37ºC overnight e fracionadas em gel de agarose 1,5% EtBr em TAE 1X. A
cuba utilizada para eletroforese foi ligada a uma fonte alimentadora, sob voltagem de 90 V por 40
minutos, e o gel foi visualizado em luz UV e fotografado.
4.3.10 Clonagem no vetor pPICZα-A
Para a clonagem no vetor pPICZα-A (INVITROGEN®, CARLSBAD, CA, USA), tanto o vetor
como os plasmídeos recombinantes pGEM/inserto foram submetidos a digestões enzimáticas
com as mesmas endonucleases. As reações de restrição foram feitas com 10 µL de tampão IV
10X, 1 µl de BSA 100X, 20U de cada enzima de restrição EcoRI e XbaI, 1 µg de DNA plasmidial e
água ultrapura q.s.p 100 µL. As reações foram incubadas a 37ºC overnight e fracionadaos em gel
de agarose 1,5% EtBr em TAE 1X sob voltagem de 90 V , e o gel foi visualizado em luz UV. As
bandas de interesse foram excisadas do gel de agarose para posterior purificação pelo kit
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, conforme o protocolo especificado pelo fabricante, e
utilizadas na reação de ligação.
4.3.10.1 Reação de ligação inserto-vetor
Para as reações de ligação, foi padronizada a razão molar oito para um. Para o cálculo da
quantidade de DNA a ser usado foi utilizada a mesma equação do item 4.10.9.1. Tendo em conta
40
o protocolo indicado pelo fornecedor, para a reação de ligação foram adicionados num tubo de
PCR 4 µL de tampão 5X, 50 ng do plasmídeo pPICZα-A, 2,5U da enzima T4 DNA Ligase
(INVITROGEN®, CARLSBAD, CA, USA), a quantidade calculada de inserto e água ultrapura q.s.p
20 µL. A reação foi incubada a 16°C overnight. Esta reação de ligação foi utilizada para a
transformação das bactérias quimiocompetentes. Os plasmídeos recombinantes foram
denominados de pPICZ/(gene de interesse P4 ou P5), exemplo: pPICZ/P4 se refere ao plasmídeo
recombinante pPICZα-A contendo o gene P4.
4.3.10.2 Transformação bacteriana
A transformação bacteriana foi realizada em tubos de microcentrífuga, utilizando 10 µL da
reação de ligação adicionados a 100 µL da bactéria quimiocompetente descongelada em gelo. A
mistura foi incubada em gelo durante 30 minutos. Após esse tempo, foi feito o choque térmico
através da incubação por dois minutos e 30 segundos a 42ºC, seguido pela incubação em gelo
por dois minutos. Após o choque térmico, foram adicionados 900 µL do meio LBLS (meio LB Low
Salt)sem antibiótico a cada tubo, os quais foram incubados, sob agitação, a 37ºC por uma hora. A
cultura bacteriana foi sedimentada em microcentrífuga a 3.000 x g por cinco minutos. O pellet foi
homogeneizado em aproximadamente 200 µL de meio LBLS. Um volume de 100 µL foi plaqueado
em placas de Petri contendo o meio LBLS ágar (LB Low Salt acrescido de 1,5% de ágar) e
ZeocinaTM 25 µg/mL. As placas foram incubadas em estufa a 37 ºC overnight.
4.3.10.3 Triagem dos clones por PCR
As colônias obtidas na transformação foram repicadas em tubos de microcentrífuga contendo
meio LB low salt e ZeocinaTM 25 µg/mL por 16 horas a 180-200 RPM no Shaker. Para a reação
de PCR, foi utilizado o mesmo protocolo descrito no item 4.10.5.
41
4.3.10.4 Confirmação dos clones por digestão enzimática
O DNA plasmidial dos clones positivos na triagem por PCR foram utilizados para a realização
da digestão enzimática. Procedeu-se da mesma forma que foi descrita no item 4.10.9.4.
4.3.11 Transformação da levedura P. pastoris X33
4.3.11.1 Preparo e linearização do vetor recombinante
Os clones pPICZ/P4 e pPICZ/P5 contendo os genes de interesse foram usados para
transformar P. pastoris X-33. O isolamento do DNA plasmidial dos clones foi feito em pequena
escala, conforme descrito anteriormente. Aproximadamente 10 µg dos plasmídeos purificados
foram hidrolisados com a enzima de restrição PmeI, sítio único localizado na sequência do
promotor AOX1. A linearização dos plasmídeos com a enzima de restrição PmeI direciona a
integração do DNA recombinante, por um único “crossing over” entre o locus AOX1 no
cromossomo e o promotor AOX1 no vetor, gerando transformantes fenotipicamente com alta
velocidade de crescimento em metanol, uma vez que mantêm o gene AOX1 endógeno intacto.
Assim, o fenótipo dos transformantes é Mut+.
4.3.11.2 Preparo de células competentes de P. pastoris
Foi feito um pré-inóculo em 5 mL de YPD 2% da levedura a ser transformada e incubada no
shaker a 28ºC por 24 horas a 200 RPM. Um inóculo de 5 mL do pré-inóculo (ou mais,
dependendo da célula) foi feito em 50 mL do caldo YPD 2%, incubando-se no shaker a 28ºC, 200
RPM até atingir a DO600nm =0,8 – 1,0. As células foram coletadas em tubo de 50 mL (FALCON®,
BECTON DICKINSON, EUA), assepticamente, centrifugando por três minutos a 3.000 RPM. O
sobrenadante foi desprezado, lavando-se as células com 20 mL de água estéril gelada,
homogeneizando e vortexando levemente, seguido de centrifugação a 3.000 RPM por três
minutos. As células foram ressuspendidads em 5 mL de LiCl (100mM) e incubadas por no
mínimo 1h30min a 28 ºC e 200 RPM. A suspensão de células competentes foi usada
imediatamente sem estocar.
42
4.3.11.3 Transformação da levedura
Para a transformação integrativa, foram preparados três tubos de microcentrífuga para a
cepa, um branco e dois testes, com concentrações diferentes de DNA. Nos tubos foram
adicionados 300 µL da suspensão de células competentes. O DNA carreador (esperma de
salmão-10 mg/mL) foi desnaturado a 950C por cinco minutos e mantido no gelo até o uso. O DNA
plasmidial linearizado (aproximadamente 10 µg) foi parcialmente desnaturado antes do uso a
650C por cinco minutos. A mistura contendo a suspensão de células, o DNA carreador e o DNA
plasmidial linearizado foi incubada na estufa a 300C por uma hora, seguido de um choque térmico
em banho maria a 420C por 20 minutos. Após o choque térmico, a mistura foi centrifugada a 4.000
x g por um minuto desprezando o sobrenadante assepticamente. Foi adicionado 1 mL de sorbitol
1M, homogeneizando e centrifugando a 4.000 x g por um minuto, e o sobrenadante foi
desprezado assepticamente. O pellet foi ressuspendido em 200 µL de sorbitol 1M e plaqueado
com pérolas de vidro em meio YPD ágar acrescido de zeocina 125 µg/mL. A incubação foi feita a
28-300C por 72 horas ou mais. A transformação da linhagem X-33 com a construção linearizada
favorece uma recombinação simples (inserção) no locus AOXI genômico da levedura, como está
mostrado na Figura 10.
Figura 10 - Esquema representativo do cassete de expressão no genoma da P. pastoris.
Fonte: Manual técnico de expressão em P. pastoris da INVITROGEN.
43
4.3.11.4 Seleção dos clones pelo fenótipo
Como já descrito, a cepa X-33 teoricamente gera clones Mut+, porém, com a presença da
sequência AOX1 no plasmídeo existe a possibilidade da recombinação ocorrer na região 3’
AOX1, interrompendo o gene AOX1 selvagem e originando transformantes que utilizam metanol
de forma lenta (MutS). Para selecionar o fenótipo dos clones recombinantes, foi utilizada a técnica
do plaqueamento de microgota. Para isso, 20 µL da cultura dos clones selecionados pela zeocina
foram plaqueados no meio MM e MD ágar. As placas foram incubas a 28-300C por dois dias. As
colônias Mut+ devem crescer bem nas duas placas, uma vez que são capazes de utilizar metanol
ou dextrose como fonte de carbono, e as colônias MutS devem crescer bem na placa MD e
crescer pouco ou nada em placas MM, já que não conseguem metabolizar metanol. Os clones
foram plaqueados de acordo com a Figura 11.
Figura 11 - Desenho esquemático do plaqueamento de microgota para a determinação do fenótipo dos clones
recombinantes da cepa X33.
Fonte: Manual técnico de expressão em P. pastoris da INVITROGEN.
44
4.3.11.5 Confirmação da integração por PCR
Após a análise do fenótipo, foram selecionados somente os clones Mut+, e a eficiência da
recombinação foi avaliada através de PCR de colônias utilizando-se como molde o DNA
genômico da levedura. Um mL de cultura dos clones Mut+ foi centrifugado a 14.000 x g por 10
minutos e o pellet resuspendido em EDTA. Posteriormente foram adicionados 2,5U da enzima
lyticase. A partir do passo descrito, segue-se o mesmo protocolo para extração de DNA genômico
de L. infantum. Nas reações de PCR foram utilizados os iniciadores específicos para a região
AOX1 e para cada gene numa reação com o volume final de 12 µL, seguindo-se o mesmo
protocolo para triagem dos clones nos vetores pGEM T easy e pPICZα-A. Para a amplificação do
locus AOX1 foram utilizados os seguintes iniciadores: 5´ AOX1---5´ GAC TGG TTC CAA TTG
ACA AGC 3´; 3´ AOX1 ---5´GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC 3´.
45
RESULTADOS 5
Os resultados encontrados estão do presente trabalho estão descritos nas ETAPAS I e II, mostradas abaixo.
5.1 ETAPA I
Estão descritos todas as predições de epitopos, localização subcelular das proteínas e os
critérios utilizados para a seleção dos antígenos através das ferramentas de Bioinformática.
5.1.1 Predição de epítopos de células T
Após a realização da predição de epítopos de células T CD4+ com o NetMHCII (referente ao
MHC de classe II) e de células T CD8+ com NetMHC e NetCTL (referentes ao MHC de classe I),
os resultados foram parseados com parsers específicos, e inseridos no banco de dados
relacional. No contexto das células T CD4+, o algoritmo NetMHCII realizou 5.859.600 predições,
enquanto que em relação as células T CD8+, os algoritmos NetCTL e NetMHC realizaram
1.700.109 e 277.398 predições respectivamente. Na Figura 12 está representado o número de
epítopos preditos e inseridos no banco de dados, tanto para as células T CD4+ como T CD8+.
Figura 12 - Número de epítopos preditos para células T. O algoritmo NetMHCII foi utilizado para a predição de epítopos de células TCD4
+, e os algoritmos NetCTL e NetMHCforam utilizados para a predição de epítopos de células TCD8
+.
Fonte: Autoria própria.
46
5.1.2 Predição de epítopos de células B
Após a predição dos epítopos de células B pelos algoritmos BepiPred, BCPred12 e AAP12,
foi feito o parseamento e integração no banco de dados dos resultados.Os algoritmos BepiPred
BCPred12 e AAP12 realizaram 47.482, 957.493 e 2.361.313 predições respectivamente. Os
resultados estão representados na Figura 13.
5.1.3 Predição da localização subcelular de proteínas
Após realizar a predição da localização subcelular de proteínas usando o WoLF PSORT, o
TargetP e o Sigcleave. As proteínas secretadas, excretadas ou vinculados à membrana
plasmática foram selecionados pelos parseadores e inseridas no banco de dados. O algoritmo
TargetP realizou 894 predições de proteínas secretadas, enquanto que os algoritmos Sigcleave
e WoLF PSORT realizaram 1983 e 2020 predições respectivamente, entre proteínas secretadas e
vinculados a membrana plasmática. Na Figura 14 estão representados os resultados parseados
da predição da localização subcelular das proteínas do parasito.
Figura 13 - Número de epítopos preditos para células B utilizando os algoritmos BepiPred, BCPred12 e AAP12.
Fonte: Autoria própria.
47
5.1.4 Desenvolvimento do Banco de Dados relacional
O esquema do Banco de Dados Relacional desenvolvido foi extremamente importante para a
criação de um ambiente capaz de integrar todos os dados validados e as informações
relacionadas com predições de epítopos MHCI (algoritmos NetCTL e NetMHC), predições de
epítopos MHCII (algoritmo NetMHCII), predições de epítopos de células B (algoritmos BepiPred,
BCPred12 e AAP12), predições da localização subcelular de proteínas (algoritmos WoLF PSORT,
TargetP e Sigcleave). Para isso, foi escolhido o Sistema Gerenciador de Banco de Dados MySQL,
que possibilita fazer buscas específicas no banco de dados, de modo a responder diferentes
perguntas. Nesse banco de dados, foram criadas nove tabelas para dados obtidos através dos
preditores e mais duas tabelas, uma chamada tabela chave, que comporta todas as informações
do proteoma predito da L. infantum, e a outra composta por todos os alelos (humanos e de
camundongo) utilizados para os três algoritmos, NetMHC, NetMHCII e NetCTL. A tabela chave se
relaciona com todas as tabelas de preditores, como mostra a Figura 15.
Figura 14 - Número de proteínas preditas como secretadas/excretadas ou vinculados à membrana plasmática de L. infantum, utilizando os algoritmos TargetP, Sigcleave e WoLF PSORT
Fonte: Autoria própria.
48
Figura 15 - Modelo do Banco de Dados Relacional desenvolvido.
5.1.5 Critérios para pré-seleção das proteínas
Para pré-selecionar os candidatos, foi necessário a realização de buscas no banco de dados
relacional, levou-se em conta os algoritmos WoLF PSORT(localização subcelular de proteínas),
AAP12, BCPred12 e Bepipred (células B), NetMHC e NetCTL (ligantes de MHC de classe I) e
NetMHCII (ligantes de MHC de classe II). As buscas foram feitas utilizando comandos na
linguagem SQL (Structured Query Language). Usando esses critérios de busca, encontramos 545
proteínas bastante imunogênicas.
Fonte: Desenvolvida in house.
49
5.1.6 Busca por similaridade de sequências
Usando o algoritmo BLASTp, (alinhamento local de sequências de proteínas), do pacote
Blastall, todas as 545 proteínas foram confrontadas com os proteomas preditos de cão,
camundongo e humano, e as proteínas com mais de 60% de similaridade foram excluídas. Após
essas análises, 282 proteínas com pouca similaridade com os três organismos analisados foram
selecionadas.
5.1.7 Buscas na rede de interação proteína-proteína
As 282 proteínas selecionadas na etapa anterior foram analisadas na rede de interação
proteína-proteína de L. infantum, obtendo-se o índice de MCC e o Degree de 28 proteínas. O
Degree se refere ao número de interações que uma proteína (denominada nó) faz com os
vizinhos, sendo um nó com alto Degree chamado de hub. O valor de MCC mostra o quão central
um nó é em relação aos outros. Quanto maior for esse valor, maiores são as chances de a
neutralização desse nó afetar outros nós vizinhos, desestabilizando a rede (REZENDE et al.,
2012). Esses resultados são interessantes, levando em consideração que proteínas vitais para a
biologia de parasito provavelmente sofrem menos mutações, fazendo com que essas proteínas
sejam alvos promissores no desenvolvimento de vacinas. Entre as 28 proteínas obtidas após
essas buscas, foram selecionadas as com maiores valores de MCC e Degree, levando-se em
conta também alguns critérios discutidos a seguir. A Tabela 5 mostra as proteínas selecionadas e
os valores de MCC e Degree.
Tabela 5 - Interações das proteínas selecionadas, com as demais proteínas do parasito
MCC Degree
P2 264 7
P3 7 8
P4 11 7
P5 6 5
Fonte: Autoria própria.
50
P2 P3 P4 P5
Glicosilações 9 3 0 0
Aminoácidos 893 974 447 522
Massa molecular 101 kDa 107 kDa 51 kDa 57 kDa
Pares de bases 2682 2925 1344 1569
5.1.8 Critérios técnicos para a seleção das proteínas
Além dos critérios de seleção, adotaram-se alguns critérios “técnicos” para a seleção das
proteínas, levando em consideração a clonagem e a expressão das proteínas. O primeiro critério
foi o tamanho do gene, consequentemente, o massa molecular da proteína traduzida, dando-se
preferência para genes menores, para facilitar a clonagem e a expressão das proteínas. O
segundo foi o número de glicosilações de cada proteína, selecionando-se proteínas com menos
glicosilações devido à menor capacidade da P. pastoris em adicionar cadeias de carboidratos. A
tabela abaixo mostra os resultados das proteínas selecionadas.
Tabela 6 - Resultados dos critérios técnicos para a seleção das proteínas
5.2 ETAPAII
5.2.1 Caracterização da espécie de Leishmania por PCR-RFLP
Na Figura 16 estão representados os resultados referentes à PCR-RFLP para os produtos
de amplificação de 120pb (pares de base) obtidos na reação de PCR para a região conservada
do minicírculo do kDNA, seguida pela digestão da enzima de restrição HaeIII. A adição de HaeIII
levou à formação de um perfil de restrição de acordo com a espécie Leishmania infantum.
Fonte: Autoria própria.
51
VOLPINI et al. (2004), ao realizarem a amplificação da região conservada do minicírculo do
cinetoplasto (mKDNA) que possui 120 pares de base (pb) em diferentes amostras biológicas de
Leishmania spp. seguido da digestão enzimática pela endonuclease HaeIII verificaram diferentes
padrões de restrição para cada espécie do parasito. As amostras que não apresentavam
restrição, isto é, matinham no gel os 120 pb após a digestão por HaeIII, pertenciam à espécie L.
amazonensis. Por outro lado, as amostras que apresentavam perfil de restrição de tamanhos de
80 e 40 pb pertenciam à espécie L. braziliensis e por fim as amostras que possuíam fragmentos
de 120, 80, 60 e 40 pb pertenciam à espécie L. infantum. Esses resultados demonstram que a
PCR-RFLP pode ser usada como uma técnica rápida, prática e segura para identificação de
espécies de Leishmania em diferentes amostras biológicas. HAJJARAN et al. (2011), avaliando
amostras obtidas de pacientes com leishmaniose cutânea, demonstraram que a PCR-RFLP pode
ser utilizada como uma poderosa técnica.
5.2.2 Amplificação dos genes de interesse
Serão apresentados somente os resultados para P4 e P5. Com o objetivo de clonar as
proteínas selecionadas em bactérias, utilizou-se a PCR para amplificar as regiões que codificam
Figura 16 - Perfil de restrição do mkDNA com Hae III. PM (Peso Molecular low range DNA ladder); 1 amplicon do mkDNA de L. infantum digerido com Hae III.* representa as quatro bandas do perfil de restrição (40, 60, 80 e 120 pb) compatível com L. infantum. As setas representam o padrão de peso molecular.
50 pb
75 pb
100 pb
PM 1
Fonte: Autoria própria.
52
cada gene, gerando amplicons com 1358 e 1583 pb(s). Como DNA molde utilizou-se o DNA
genômico da cepa de Leishmania infantum caracterizada anteriormente. A Figura 17 mostra os
amplicons de P4 e de P5.
5.2.3 Clonagem no pGEM T easy
Através dos genes amplificados e purificados foram realizadas as reações de ligação no vetor
pGEM T easy. A célula competente E. coli DH5-α foi transformada com o vetor construído,
denominado pGEM/P4 ou P5. Após a transformação, as células foram plaqueadas em meio LB
com ampicilina. Foram selecionadas colônias desta placa, como sendo possíveis clones
recombinantes com a construção pGEM/P4 ou P5 correta. Foi realizada uma triagem desses
clones por PCR utilizando os iniciadores específicos para cada gene, e o DNA plasmidial dos
clones positivos (Figura 18) foi purificado através de miniprep.
Figura 17 - Amplificação dos genes P4 e P5 através da PCR. PM (Peso Molecular 1Kb); P4 (amplicon do gene P4 – 1358 pb); P5 (amplicon do gene P4 – 1583 pb). As setas representam o padrão de peso molecular.
Fonte: Autoria própria.
53
Na Figura 19 está mostrada a confirmação da clonagem por digestão enzimática do DNA
plasmidial. Pela análise da Figura 18, pode-se observar o perfil de digestão, onde os clones
positivos apresentam duas bandas, uma referente ao plasmídeo (3.000 pb) e a outra referente ao
gene de interesse.
Figura 18 - Triagem dos clones P4 e P5 por PCR. PM (Peso Molecular 1Kb); 1 (Controle positivo P4 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 2 a 8 (Clones P4); 9 (Controle negativo); 10 (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 11 a 14 (Clone P5). As setas representam o padrão de peso molecular.
Figura 19 – Confirmação da clonagem por digestão enzimática dos clones. PM (Peso Molecular 1Kb); 1 (canaleta vazia); 2 (pPGEM/P4 não digerido); 3 a 10 (Plasmídeos recombinantes P4 digeridos); 11 (Controle positivo P4 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 12 (pPGEM/P5 não digerido); 13 (pPGEM/P5 digerido); 14 (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum). As setas representam o padrão de peso molecular.
Fonte: Autoria própria.
Fonte: Autoria própria.
54
5.2.4 Clonagem no pPICZα-A
Para a construção dos vetores recombinantes, foram realizadas reações de digestão com os
vetores pGEM/P4 e P5 para a liberação do inserto, e com o vetor pPICZα-A. As reações de
digestão foram visualizadas em gel de agarose. A partir daí, procedeu-se com as mesmas etapas
descritas no item anterior. Nas Figuras 20 e 21 estão representadas as triagens dos clones por
PCR.
Figura 20 - Triagem dos clones P4 por PCR. PM (Peso Molecular 1Kb); 1 (Controle positivo P4 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 2 a 10 (Clones P4); 11 (Controle negativo); 12 a 15 (Clones P4). As setas representam o padrão de peso molecular.
Figura 21 - Triagem dos clones P5 por PCR. PM (Peso Molecular 1Kb); 1 (canaleta vazia); 2 (Controle negativo); 3 (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 4 a 18 (Clones P5). As setas representam o padrão de peso molecular.
Fonte: Autoria própria.
Fonte: Autoria própria.
55
A Figura 22 mostra o perfil de digestão dos plasmídeos dos clones selecionados por PCR.
Pela análise da Figura, pode-se observar o perfil de digestão do DNA plasmidial, onde os clones
positivos apresentam duas bandas, uma referente ao plasmídeo (3.600 pb) e a outra referente ao
gene de interesse.
5.2.5 Transformação da P. pastoris
A estratégia utilizada para amplificação dos genes e ligação ao vetor possibilita a expressão
das proteínas com cauda de histidina na posição C-terminal, já que o códon de terminação da
tradução, dessa forma, ficou localizado após a sequência que codifica a cauda de histidina. Após
a confirmação das construções positivas em bactéria, o DNA plasmidial de cada construção foi
extraído e hidrolisado com a enzima PmeI e, em seguida, usados para transformar células
competentes de P. pastoris, linhagem X-33 (Mut+). A integração pela linearização do vetor com a
enzima PmeI orientou a integração por único “crossing over” no locus AOX1 cromossomal. Assim,
o gene AOX1, permanece intacto e a linhagem é fenotipicamente Mut+ (CREGG et al., 1989).
Figura 22 - Confirmação dos da clonagem por digestão enzimática dos clones. PM (Peso Molecular 1Kb); 1 (pPICZ/P4 não digerido); 2 a 4 (Plasmídeos recombinantes P4 digeridos); 5 (Controle positivo P4 utilizando o DNA genômico de L. infantum); 6 (pPICZ/P5 não digerido); 7 e 8 (pPGEM/P5 digerido); 9 (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de
L. infantum). As setas representam o padrão de peso molecular.
Fonte: Autoria própria.
56
5.2.5.1 Seleção dos clones pelo fenótipo
As colônias recombinantes selecionadas foram plaqueadas, pela técnica de microgota, em
meios MD e MM ágar. As colônias com fenótipo Mut+ têm o crescimento ótimo nos dois meios,
enquanto que o fenótipo MutS tem crescimento ótimo somente no meio MD. Isso se deve à
ruptura do promotor AOX1 que ocorre no fenótipo MutS. A Figura 23 mostra o crescimento das
colônias nos meios acima citados.
5.2.5.2 Análise da integração do vetor no genoma da P. pastoris
Foram selecionadas algumas colônias transformantes de P. pastoris para o repique em meio
YPD acrescido de zeocina. Após o crescimento, foi feita a extração do DNA genômico dos clones
para a análise por PCR. Foram analisadas cinco amostras de DNA para o gene P4 e quatro para
o gene P5. Para os iniciadores AOX1 foi utilizado como DNA molde o DNA genômico da levedura
selvagem, sem integração; como um controle, o plasmídeo pPICZα-A sem inserto (controle
negativo); o plasmídeo recombinante pPICZ/P4 ou P5 e as amostras de DNA dos clones
recombinantes. Para os iniciadores dos genes foi utilizado o DNA genômico de L. infantum como
controle positivo dos genes e as amostras de DNA dos clones recombinantes. A Figura 24 mostra
(B)
(A)
Figura 23 - Determinação do fenótipo das colônias recombinantes. (A) Crescimento dos clones recombinantes no meio MD. (B) Crescimentos dos clones recombinantes no meio MM.
Fonte: Autoria própria.
57
o perfil obtido após amplificação do gene P4 e o promotor AOX1 integrado no genoma de P.
pastoris.
Com a PCR utilizando os iniciadores AOX1, pode-se notar que, se o inserto está integrado no
genoma de P. pastoris, tem-se a visualização de duas bandas, uma referente ao gene AOX1 da
levedura (aproximadamente 2,2 kb) e a outra referente ao gene de interesse mais o promotor
AOX1(aproximadamente 2 kb – 1353 pb do gene P4 e 588 pb do promotor AOX1). De acordo
com a Figura 23, os clones C1 e C4 o gene P4 foi integrado no genoma da levedura.
Posteriormente realizou-se PCR utilizando os iniciadores do gene P4, e como está representado
na Figura. Os clones positivos exibiram uma banda corresponde ao tamanho do gene P4 (1353
pb), confirmando assim a integração do gene de interesse no genoma de P. pastoris.
Na Figura 25 está mostrada a confirmação da integração do gene P5 no gemona de P.
pastoris. Para a análise da integração do gene P5, foi usado o mesmo raciocínio que para o gene
P4. Pode-se observar na Figura 24, o gene P5 é um pouco maior que o gene P4. Assim, os
amplicons do gene AOX1 e do gene P5 mais o promotor AOX1 (aproximadamente 2,2 kb) se
sobrepõem. Então, para confirmar a integração, usamos o PCR utilizando os iniciadores do gene
P5, podendo-se observar que o clone C1 é positivo para a integração no genoma de P. pastoris.
Figura 24 – Confirmação da integração do pPICZ/P4 no genoma de P. pastoris. PM (Peso Molecular); CNi (Controle negativo da integração, o amplicon referente à região AOX1 de P. pastoris selvagem); CNp (Controle negativo do plasmídeo, amplicon referente à região AOX1 de um plasmídeo sem inserto); CPp (Controle positivo do plasmídeo, amplicon referente à região AOX1 do pPICZ/P4); C1 a C5 (Amplicons referentes à região AOX1 de clones recombinantes pPICZ/P4); CP (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum). As setas representam o
padrão de peso molecular.
Fonte: Autoria própria.
58
Figura 25 - Confirmação da integração do pPICZ/P5 no genoma de P. pastoris. PM (Peso Molecular); CNr (Controle negativo da reação); CNi (Controle negativo da integração, o amplicon referente à região AOX1 de P. pastoris selvagem); CNp (Controle negativo do plasmídeo, amplicon referente à região AOX1 de um plasmídeo sem inserto); CPp (Controle positivo do plasmídeo, amplicon referente à região AOX1 do pPICZ/P5); C1 a C4 (Amplicons referentes à região AOX1 de clones recombinantes pPICZ/P5); CP (Controle positivo P5 utilizando o DNA genômico de L. infantum). As setas representam o padrão de peso molecular.
Fonte: Autoria própria.
59
Discussão 6
6.1 Seleção dos antígenos através de ferramentas de
bioinformática
Na última década, houve uma crescente evolução na aplicabilidade da vacinologia reversa,
uma abordagem inovadora para o desenho racional de vacinas. Essa evolução corrobora com o
aumento da utilização de poderosas ferramentas de bioinformática que culminou na
disponibilização de ferramentas extremamente eficientes no processo de identificação de
peptídeos imunogênicos, e a predição de epítopos por métodos computacionais representa uma
das abordagens mais promissoras para desenvolvimento de vacinas. Além disso, as abordagens
experimentais de triagem de epítopos (como, por exemplo, ELISpot) consomem tempo, têm custo
elevado e muitas vezes há ineficiências na identificação de epítopos (DREXLER et al., 2003;
SNYDER et al., 2004; PASQUETTO et al., 2005). Assim, a vacinologia reversa, também
conhecida como imunoinformática, permite a busca por imunofármacos, novos antígenos
vacinais, em um curto período de tempo com custos reduzidos (ANDRE, 2003; DUMONTEIL,
2009). Outra vantagem dessa metodologia é a possibilidade de identificar fatores de virulência e
patogenicidade, sendo esses fatores importantes no mecanismo de infectividade de patógenos
(Bambini; Rappuoli, 2009). Esses métodos teóricos vêm sendo utilizados para pré-selecionar
antígenos candidatos vacinais. Dessa forma, a imunoinformática assume um papel importante no
combate às doenças emergentes e reemergentes, como os vírus Influenza, HIV e Vaccinia
(NAGASHIMA et al., 2000; MOUTAFTSI et al., 2006; BRUMME et al., 2007). Nesse contexto, o
presente trabalho propõe uma nova abordagem para a identificação de antígenos no genoma de
L. infantum. Para isso, empregamos a vacinologia reversa juntamente com ferramentas de
bioinformática na identificação de alvos vacinais contra a LVC. A LVC é uma zoonose que vem se
destacando devido à ineficácia das estratégias atuais de controle (Desjeux 2004, MS 2009).
Assim, se faz necessária a busca por vacinas (AHLUWALIA et al., 2003; WHO, 2004) que sejam
eficazes na proteção contra a leishmaniose visceral, capazes de interromper o ciclo de
transmissão da doença e que possam ser empregadas em programas de controle pelo Ministério
da Saúde.
60
Assim, a primeira etapa realizada em nosso trabalho foi selecionar genes no genoma de L.
infantum canditados a uma vacina contra a LVC. Portanto, foi aplicada a bioinformática na
predição de epítopos de células T (CD4+ e CD8+), de células B e na predição da localização
subcelular das proteínas do parasito, utilizando algoritmos de código livre. Além disso, os
resultados das predições foram integrados em um banco de dados relacional desenvolvido in-
house e foram utilizados critérios para a seleção dos antígenos. Inicialmente, foi necessária a
instalação local de todos os algoritmos de predição e um treinamento em linhas de comando,
Linux, conhecimentos básicos em linguagem de programação PERL e SQL. Os programas
utilizados foram selecionados levando em consideração a disponibilidade para a instalação local,
uma vez que adotamos a análise do proteoma total de L. infantum. Existem inúmeros programas
computacionais para a predição de epítopos, mas a maioria está disponível somente para
predições na web. Como o genoma de L. infantum possui 36 cromossomos, com 8.241 genes
codificantes (PEACOCK et al., 2007), a predição na web seria impraticável devido ao grande
volume de dados gerado.
Os algoritmos preditores geralmente são treinados com modelos como as Redes Neurais
Artificiais (ANNs), Modelos ocultos de Markov (HMM), Máquinas de vetores de suporte ou SVM
(Suport Vector Machine), escala de propensão (características físico-químicas dos aminoácidos),
acoplados a matrizes de pontuação ou substituição. Essas matrizes permitem que o programa
considere a evolução conservativa das proteínas. Considerando a importância dos algoritmos de
predição, e antes de iniciar a discussão dos dados, vale a pena considerar a avaliação dos
algoritmos de código livre selecionados para predição do potencial imunogênico das proteínas.
Atualmente, enfrenta-se um paradigma em relação aos métodos utilizados para a predição de
epítopos em proteínas de protozoários. Dessa forma, existem diversos métodos de predição nos
quais são utilizados arquivos de treinamento que possuem dados provenientes principalmente de
vírus e bactérias, mas nenhum possui amplamente em sua base de treinamento dados de
protozoários. Isso se deve à falta de dados experimentais validados de epítopos de protozoários
em um número suficiente para validar a predição in silico. Desse modo, a interpretação do
desempenho dos preditores descritos na literatura deve ser feita com extrema cautela, uma vez
que o desempenho dos algoritmos de predição de epítopos depende do conjunto de dados
utilizado como treinamento e também do viés composicional das proteínas desse conjunto.
Existem diversos problemas nesse processo com relação aos genomas de tripanosomatídeos,
principalmente quanto à predição de epítopos em proteínas desses parasitos, especialmente
porque os proteomas apresentam características físico-químicas bem peculiares e estão sub-
representados nas bases de dados de treinamento dos algoritmos (PETERS et al., 2003;
LARSEN et al., 2006; EL MANZALAWY et al., 2008a; 2008b; NIELSEN e LUND, 2009;
LUNDEGAARD et al., 2010).
61
Em um estudo conduzido por Resende e colaboradores em 2012, foi feita a avaliação do
desempenho de algoritmos de código livre para a predição computacional de epítopos e da
localização subcelular frente ao genoma de parasitos. A comparação entre os algoritmos foi
realizada com base em valores de AUC (Area Under Curve), isto é, a probabilidade de que uma
predição positiva selecionada aleatoriamente tenha uma pontuação mais alta do que uma
predição negativa selecionada aleatoriamente. Foram avaliados NetCTL e NetMHC para ligantes
de MHC de classe I, BepiPred, AAP12 e BCPred12 para epítopos de células B e para localização
subcelular de proteínas WoLFPSORT, TargetP e Sigcleave. Os epítopos positivos e negativos,
testados experimentalmente e provenientes de proteínas de parasitos, foram obtidos na base de
dados do IEDB (Immune Epitope Database, http://www.iedb.org/), que atualmente representa a
principal fonte de epítopos lineares e conformacionais. Em relação à predição de epítopos de
células T, NetCTL e NetMHC obtiveram valores de AUC de 0,66 e 0,60 respectivamente.
BepiPred, AAP12 e BCPred12 apresentaram valores de AUC de 0.53, 0,52 e 0,62
respectivamente, mas AAP12 e BCPred12, quando utilizados em conjunto, apresentaram valor de
0,77. Embora para a predição de epítopos já tenham sido relatados valores maiores de AUC para
esses preditores (LARSEN et al., 2006; LARSEN et al., 2007), considerando o viés composicional
das proteínas de parasitos os resultados mostram que, quando combinados, esses algoritmos
podem ser utilizados como poderosas ferramentas para a predição de epítopos em proteínas
desses organismos. Já para a seleção de proteínas de parasitos com localização subcelular
confirmada experimentalmente, foi utilizado o banco de dados Uniprot (http://www.uniprot.org/).
Dentre os preditores de localização subcelular, WoLFPSORT obteve o melhor resultado, com um
acurácia de 85,39%, demostrando ser ótimo para predizer a localização das proteínas de
protozoários (SIGUSCH et al., 1998).
Neste trabalho, após a realização das predições, os arquivos gerados pelos preditores foram
formatados com scripts desenvolvidos in-house, de modo a possibilitar sua inserção no banco de
dados relacional também desenvolvido por nós. Para a predição de epítopos de células T CD4+,
selecionamos um programa que usa as ANNs (redes neurais artificiais), o NetMHCII, que permite
a identificação simultânea de núcleo de ligação e afinidade de ligação entre os peptídeos e a
molécula de MHC de classe II (NIELSEN e LUND, 2009). Foram encontrados aproximadamente
seis milhões de epítopos entre ligantes fracos (WB) e ligantes fortes (SB). Para esse algoritmo
foram utilizados 17 alelos de MHC de classe II, sendo 14 alelos humanos e três alelos de
camundongo. Em um trabalho publicado em 2005 por Lindblad-Toh e colaboradores, foi
confirmado o alto grau de similaridade entre os genomas humano, de cão e de camundongo,
(LINDBLAD-TOH et al., 2005), validando assim a extrapolação das predições feitas.
Em relação aos nossos resultados de predição de epítopos de células T CD8+, foram preditos
ligantes para diferentes alelos de MHC de classe I utilizando os algoritmos NetMHC e NetCTL.
Esses dois são os algoritmos disponíveis com maior acurácia (PETERS et al., 2005). O NetMHC
62
usa uma matriz de substituição juntamente com HMM e ANNs, mensurando a afinidade de
ligação com moléculas de MHC de classe I, e por esse algoritmo foram analisados sete alelos de
MHCI de camundongo. Já o NetCTL usa ANNs juntamente com matriz de substituição para
predição da clivagem proteassomal, do transporte pelo TAP e da afinidade de ligação com MHC.
Por esse algoritmo foram analisados 12 alelos de MHCI humanos. Comparando os resultados dos
dois algoritmos representados na Figura 12, pode-se observar que o NetCTL encontrou muito
mais epítopos do que o NetMHC, provavelmente devido ao número de alelos utilizados.
A eficiência do processamento e da apresentação de um antígeno via MHC é extremamente
importante para uma resposta celular efetiva, principalmente no caso da Leishmaniose visceral,
onde a resposta celular assume um papel fundamental na resistência à doença. As células T
CD4+ assumem um papel importante na produção de IFN-, facilitando a eliminação do parasito
dentro dos macrófagos. Por outro lado, os linfócitos T CD8+ atuam como células citotóxicas,
eliminando as células infectadas pelo parasito (MURRAY et al., 1983; MOSMANN et al., 1986;
BOGDAN, 2001; TONUI et al., 2004; TONUI e TITUS, 2007). Por esses motivos, a predição dos
epítopos para as células T é um dos principais resultados encontrados neste trabalho. Inúmeros
trabalhos já publicados utilizando ferramentas de bioinformática demostraram que, no caso da
leishmaniose, o foco principal e o mais importante é a predição de epítopos com afinidade para as
moléculas de MHCI e II. Nesse contexto, Saffari e colaboradores identificaram epítopos
específicos de cisteíno proteases de L. major. A predição dos epítopos ligantes de MHCI foram
realizadas pelo NetCTL, enquanto que o BcePred foi utilizado para epítopos de células B
(SAFFARI e MOHABATKAR, 2009). Em outro estudo, Guerfali e colaboradores paralelamente
realizaram experimentos in vivo com camundongos BALB/c (susceptível) e C57BL/6 (resistente) e
predições in silico partindo do proteoma predito de L. major. Para isso, utilizaram algoritmos para
predizer as proteínas secretadas (usando o SignalP) e as proteínas com mais epítopos ligantes
de MHCI (utilizando os algoritmos Bimas, Syfpeithi, Rankpep e PREDBALB/c) para os alelos de
C57BL/6 e de BALB/c. Os resultados encontrados indicam um número de epítopos preditos para
BALB/c bem maior que os preditos para C57BL/6, que pode ser explicado por achados
experimentais que mostram um papel mais importante de células T CD8+ em camundongos
BALB/c quando comparados ao C57BL/6 (GUERFALI et al., 2009). Em 2012, John e
colaboradores utilizaram uma abordagem bastante similar à nossa. Utilizando o algoritmo BLAST,
eles selecionaram as proteínas em comum entre os proteomas de L. major e de L. infantum,
selecionando em seguida todas a proteínas secretadas e de membrana plasmática através dos
algoritmos WoLF PSORT e TMHMM. A seguir, excluíram as proteínas com alta similaridade com
os proteomas de humano e de camundongo. Finalmente, identificaram os epítopos ligantes de
MHCI pelos algoritmos Bimas e Syfpeithi e de MHCII pelos algoritmos ProPred1 e ProPred. Após
todas as análises, das 8.122 proteínas em comum entre as duas espécies de Leishmania, foram
63
obtidos 19 epítopos ligantes de MHCI e II que pertencem a proteínas secretadas ou de membrana
plasmática.
Em relação à predição de epítopos lineares de células B, selecionamos os algoritmos AAP12,
BCPred12 e BepiPred. O primeiro é treinado com uma escala de antigenicidade AAP (Amino
Acids Pairs) juntamente com escala de propensão. O algoritmo faz o pareamento dos
aminoácidos de peptídeos, que são comparados com epítopos e não epítopos, e o peptídeo que
tiver maior número de pares de aminoácidos que se encontram em um epítopo terá uma maior
chance de ser epítopo. Além disso, considera as propriedades físico-químicas dos aminoácidos
(CHEN et al., 2007). O segundo algoritmo é treinado com máquinas de vetores de suporte (SVM),
que analisa e reconhece padrões de antigenicidade de peptídeos(EL MANZALAWY et al., 2008b).
O terceiro e último utiliza os HMM juntamente com a escala de propensão ‘Parker’, comparando
janelas de 5 a 7 aminoácidos, e o resíduo central é comparado com janelas de aminoácidos que
são epítopos ou não epítopos (LARSEN et al., 2006). Baseado na metodologia de cada um
desses algoritmos pode-se discutir sobre os resultados encontrados, onde nota-se que o número
das predições do AAP12 foi excessivamente maior que BCPred12 e BepiPred, e que BepiPred foi
o algoritmo que realizou menos predições. Isso se justifica pela metodologia do BepiPred, porque
torna-se muito mais difícil encontrar epítopos fazendo uma comparação entre janelas de
aminoácidos onde o resíduo central deve ser exatamente o mesmo que o resíduo presente em
uma janela de um epítopo. Em contraste, utilizando a escala de antigenicidade AAP torna-se bem
mais fácil encontrar epítopos e os resultados estão representados na Figura 13. O papel da
resposta humoral na LVC ainda é bem elucidado, existem muitos conflitos na literatura sobre o
tema. Reis e colaboradores (2006), demostraram que o nível de imunoglobulinas detectado em
cães sintomáticos era maior que em cães assintomático, e que esses níveis estariam ligados ao
intenso parasitismo tecidual. Sendo assim a LVC é marcada pela ativação policlonal dos linfócitos
B, com o aumento da produção de imunoglobulinas (REIS et al., 2006a; REIS et al., 2006b; REIS
et al., 2006c). Ainda não há um consenso na literatura em relação ao subtipo de imunoglobulinas
e a correspondência com a susceptibilidade/resistência a LVC (DAY, 2007). Para alguns autores
já demostraram que algumas imunoglobulinas como IgA, IgE e IgM podem ser marcadores da
LVC (ALMEIDA et al., 2005; INIESTA et al., 2005; RODRIGUEZ-CORTES, FERNANDEZ-
BELLON, et al., 2007). Outros autores demostraram a correlação entre a IgG e a sintomatologia
da doença, em que a IgG1 estaria ligado a susceptibilidade e a IgG2 ligado a resistência a doença
ou em cães vacinados. Entretanto, muitos trabalhos evidencia a IgG2 associada a sintomatologia
enquanto que a IgG1 estaria relacionada a resistência a doença, evidenciando a presença
predominante desta imunoglobulina em cães assintomático (REIS et al., 2006a; REIS et al.,
2006c). Essa inconformidade entre achados das imunoglobulinas correlacionadas com a
susceptibilidade e resistência a LVC pode ser explicada pelos antígenos utilizados nos testes
empregados para detecção dos níveis de anticorpos, em alguns dos trabalhos foram utilizados
64
antígenos purificados ou recombinantes de Leishmania em que IgG1 e IgG2 detectadas estariam
relacionadas a susceptibilidade e resistência respectivamente (DEPLAZES et al., 1995; SOLANO-
GALLEGO et al., 2001; RAFATI et al., 2005; SANTOS et al., 2007). Enquanto que nos estudos
em que se utilizaram antígenos brutos de Leishmania infantum, as imunoglobulinas IgG1 e IgG2
detectadas estariam relacionadas a resistência e susceptibilidade a LVC (REIS et al., 2006b).
Levando em consideração os trabalhos acima citados, pode-se discutir qual a real contribuição da
resposta humoral na LVC, assim, os nossos resultados de epítopos de células B poderão ter
contribuição num futuro próximo para a elucidação da resposta humoral na LVC. Isso porque, em
nossos critérios de pré-seleção dos antígenos levou-se em consideração proteínas com epitopos
de células B (com scores altos), e num futuro, poderemos detectar os níveis e os subtipos de
imunoglobulina de animais vacinados com esses superantígenos obtidos nesse trabalho e com
outros antígenos que não possuam epítopos capazes de ativar as células B (esses epítopos
poderão ser obtidos a partir do nosso banco de dados relacional).
No contexto da localização subcelular das proteínas, foram selecionados os algoritmos
TargetP, Sigcleave e WoLF PSORT. Inicialmente, o TargetP foi desenvolvido para predição da
localização de proteínas de plantas, mas atualmente vem sendo utilizado para eucariotos,
podendo ser parametrizado para plantas e “não plantas”. O programa é treinado com as ANNs
baseando-se na porção N-terminal da sequência proteica e discrimina entre proteínas destinadas
à mitocôndria, ao cloroplasto e à via secretória (EMANUELSSON et al., 2000). O Sigcleave utiliza
matrizes de peso para identificar peptídeos sinais em procariotos e eucariotos. O algoritmo
consegue discriminar entre proteínas citosólicas e não citosólicas considerando as regiões N-
terminal, região hidrofóbica (região h) e a região polar da porção C terminal (região c) (VON
HEIJNE, 1986). Já o WoLF PSORT utiliza o método de kNN (k-Nearest Neighbors, convertendo a
localização de aminoácidos em vetores numéricos buscando peptídeos sinais, composição de
aminoácidos e motivos funcionais para a ligação ao DNA. Tem a particularidade de fornecer
diversas localizações, entre elas proteínas secretadas/excretadas e proteínas de membrana
plasmática (HORTON et al., 2007a). Os resultados do WoLF PSORT e Sigcleave representados
na Figura 14 foram bastante similares aos resultados encontrados em um trabalho de John e
colaboradores (2012). Eles identificaram, utilizando o WoLF PSORT, 2.260 proteínas
secretadas/excretadas e de membrana plasmática, realizando um screening das proteínas em
comum entre o proteoma de L. infantum e de L. major (total de 8.122 proteínas). Comparando os
resultados do WoLF PSORT e do Sigcleave com os do TargetP, pode-se observar que esse
último algoritmo fez um número menor de predições de proteínas. Isso poderia ser devido a
metodologia empregada pelo TargetP que é capaz de predizer a localização subcelular de
proteínas do cloroplasto, mitocôndria e de secreção. Baseado nisso, os resultados do o algoritmo
TargetP representados na Figura 14 são de proteínas secretadas enquanto que os resultados do
algoritmo WoLF Psort e Sigcleave representados são de proteínas secretadas ou vinculadas a
65
membrana plasmática. Das 2.020 predições realizadas pelo WoLF PSORT, 1.212 foram
referentes a proteínas de membrana plasmática e 808 a proteínas secretadas. Enquanto que as
1.983 predições realizadas pelo Sigcleave correspondem a proteínas que não são citosólicas,
podendo ser secretas ou de membrana plasmática. Na realidade, para a busca final dos
antígenos foram considerados somente os resultados do WoLF PSORT, uma vez que ele foi
identificado como tendo maior acurácia entre os três para predição de localização subcelular em
proteínas de protozoários (Resende et al., 2012). Foram selecionadas proteínas de membrana e
secretadas ou excretadas, uma vez que essas proteínas estão em contato mais próximo com o
sistema imune do hospedeiro. Além disso, tem sido demonstrado em diversos estudosa alta
imunogenicidade de proteínas que são secretadas pelo parasito, tanto em modelo murino
(UZONNA et al., 2001; TONUI et al., 2004; ROSA et al., 2007) quanto em hamster e humanos
curados da Leishmaniose Visceral (GARG e DUBE, 2006) e em cães infectados com L. infatum
(LEMESRE et al., 2005; LEMESRE et al., 2007), demostrando o potencial vacinal de proteínas
secretadas de Leishmania.
Um dos pontos chave deste trabalho foi a criação e utilização do banco de dados relacional.
Esse banco de dados relacional foi desenvolvido em um Sistema gerenciador de banco de dados
(SGBD) que trabalha de forma integrada e sincronizada para viabilizar o armazenamento, a
manipulação e a recuperação de dados. O SGDB selecionado foi o MySQL, que utiliza a
linguagem SQL para as buscas ou consultas. Considerando o volume de dados gerados pelos
preditores, manualmente seria impossível a integração dos dados e a definição dos antígenos
promissores. Por isso, o banco de dados relacional foi de suma importância para integrar,
relacionar e realizar as consultas de modo a identificar os antígenos (no caso, genes do parasito)
promissores. Desse modo, a modelagem do banco relacional permite realizar buscas específicas,
de acordo com as perguntas que ser quer responder. Por exemplo, pode-se consultar epítopos
específicos para células B com o objetivo de desenvolver kits de diagnóstico sorológico da
Leishmaniose visceral; pesquisar proteínas específicas de um compartimento celular que sejam
ligantes de uma molécula de MHC para um estudo mais aprofundado, entre outras inúmeras
aplicações.
Para a realização das consultas no banco de dados relacional, após as consultas para
identificar apenas as proteínas secretadas/excretadas ou presentes na membrana plasmática
preditas pelo WoLF PSORT, foram definidos critérios de seleção dos candidatos vacinais. Assim,
entre as proteínas pré-selecionadas pelo WoLF PSORT, procurou-se identificar aquelas com
epítopos preditos tanto para células T como para células B. As proteínas selecionadas possuem
epítopos distribuídos ao longo da proteína com afinidade pelos 19 alelos de MHCI pesquisados.
Da mesma forma, essas proteínas possuem epítopos com afinidade por pelo menos 14 dos 17
alelos de MHCII pesquisados e ainda possuem epítopos de células B preditos pelos três
preditores utilizados. Das 2.020 proteínas secretadas/excretadas ou de membrana, 540 estavam
66
dentro dos critérios propostos, o que corresponde a um percentual de 26,7%. Os critérios podem
eventualmente sofrer modificações no caso de possíveis falhas dos testes in vitro e in vivo. Desse
modo, em um curto período de tempo podemos identificar outras proteínas promissoras com
outras peculiaridades.
Outro ponto importante foi a busca por similaridade de sequências das proteínas
selecionadas com os proteomas de humano, de cão e de camundongo utilizando a ferramenta
BLAST. O BLAST é um algoritmo amplamente utilizado para fornecer informações de similaridade
de sequência quando se trata de desenvolvimento de vacinas (AMELA et al., 2007). Essa
pesquisa de similaridade é extremamente importante para evitar reações de autoimunidade, onde
antígenos com pouca similaridade são ótimos potenciais vacinais. Em 2009, Herrera-Najera e
colaboradores propuseram um limite de identidade de 80% entre antígenos e os organismos a
serem vacinados contra leishmaniose tegumentar causada por L. major (HERRERA-NAJERA et
al., 2009). Desse modo, sendo mais conservadores, foi estabelecido um limite de 60% de
similaridade para a seleção das proteínas promissoras neste trabalho.
Com a era pós-genômica, a visão sobre o papel desempenhado pelas proteínas dentro da
célula sofreu mudanças, e as proteínas assumem um papel dentro de uma rede de interações
proteína-proteína, possuindo uma função celular dentro de módulos funcionais (REZENDE et al.,
2012). Sendo assim, as 282 proteínas com menos de 60% de similaridade com os três proteomas
dos organismos hospedeiros foram analisadas quanto à sua posição em uma rede predita de
interação proteína-proteína de L. infantum (Rezende et al., 2012). Desse modo, foram
encontrados os valores de MCC e Degree para as proteínas pré-selecionadas (Tabela 4). Quanto
maior for o valor de MCC, maiores são as chances de uma neutralização desse nó afetar outros
nós vizinhos, desestabilizando a rede. As proteínas com alto valor de Degree são chamadas de
hubs, e geralmente são as mais ancestrais e conservadas com um maior número de interação
com as outras proteínas (FRASER et al., 2002; REZENDE et al., 2012). Esses resultados são
interessantes, levando em consideração que proteínas importantes na biologia do parasito
provavelmente sofrem menos mutações, fazendo com que essas proteínas sejam alvos
promissores no desenvolvimento de vacinas. Dentre as 28 proteínas obtidas após essas buscas,
foram selecionadas as com maiores valores de MCC e Degree. Portanto, partindo de 8.241
proteínas do parasito foram selecionadas quatro proteínas promissoras (neste trabalho foram
abordadas apenas duas das quatro). As proteínas receberam codificações de modo a facilitar a
realização dos testes experimentais. A P4 representa a proteína LinJ.36.2160, Manosil
transferase. As manosiltransferases são enzimas que possuem um papel fundamental, em vias
metabólicas para a formação de glicoproteínas (O-glicosilação ou manosilação). Esses O-glicanos
são fundamentais para a estabilidade, função e localização de proteínas da membrana
plasmática, afetando vários processos celulares. No caso de fungos, essas enzimas assumem um
protagonismo em relação síntese da parede celular representando um fator de virulência que vem
67
sendo estudado em vários trabalhos (GENTZSCH e TANNER, 1996; GEMMILL e TRIMBLE,
1999). Em relação à Leishmania spp, estudos anteriores demostram o potencial que os N-
glicosilados interferirem no crescimento do parasito. Como por exemplo, tratamento de
promastigotas L. amazonensis com Tunicamicina, um potente inibidor da via metabólica do
oligossacarídeo dolicol, diminui o crescimento e a infectividade do parasito (Inhibition of in vivo
and in vitro infectivity of Leishmania donovani by tunicamycin). Esse estudo é muito contestado
devido ao efeito citotóxico da tunicamicina. A P5 representa a LinJ.36.5700, uma proteína
hipotética conservada, por ser hipotética, poderá dar origem a inúmeros outros estudos, como por
exemplo, estudos de função.
Os resultados encontrados fortificam no contexto geral a vacinologia reversa, ou seja, a
utilização de ferramentas de bioinformática permite predizer epítopos com grande potencial para
serem utilizados na composição, principalmente, de vacinas. Tendo em conta o pipeline
desenhado por nós na primeira etapa do projeto podemos notar que a metodologia proposta para
a predição de epítopos foi capaz de detectar inúmeros antígenos encontrados na literatura. Após
a realização da predição de epítopos de células T e B obtivemos resultados surpreendentes e
animadores no que se diz respeito a antígenos já estudos e com resultados publicados na
literatura, como por exemplo, os antígenos LACK, KMP11 (RODRIGUEZ-CORTES, OJEDA, et
al., 2007), CPA e CPB (RAFATI et al., 2005; RAFATI et al., 2006), LieSAP componente da vacina
Canileish® comercializada na Europa (LEMESRE et al., 2005), ortólogo da proteína A2 de L.
donovani componente da vacina Leishtec® (FERNANDES et al., 2008), o ortólogo da gp36 do
complexo ligante de fucose e manose (FML) (SARAIVA et al., 2006) componente da vacina
Leishmune e ortólogos das proteínas TSA, LeIF e LmsT que compõem a vacina Leish111-f
(COLER et al., 2007).
Outro ponto interessante é que estes antígenos foram sendo eliminados a partir da etapa de
predição da localização celular tendo em vista que os nossos critérios eram para proteínas
secretadas e ou de membrana plasmática, muitos desses antígenos são intracelulares. Também
muitas foram eliminadas através da confrontação com a rede predita de interação proteína-
proteína, que é capaz de mensurar ou predizer as interações que as proteínas realizam umas
com as outras dentro do sistema biológico do parasito, então podemos especular que todos esses
antígenos já estudados não estariam na rede predita ou não possuem muitas interações com
outras possivelmente não desempenham funções vitais na biologia do parasito. Nesse contexto
os antígenos selecionados por nós são extremamente promissores no desenvolvimento de novas
vacinas contra a Leishmaniose.
De modo geral, os resultados obtidos neste trabalho são inéditos. Considerando todos os
trabalhos referenciados anteriormente, nenhum partiu do screening do proteoma total de L.
infantum obtendo proteínas com potencial antigênico tão expressivo como foi obtido neste estudo.
68
6.2 Clonagem e expressão dos genes selecionados em sistema
eucarioto
Em relação à expressão de proteínas recombinantes de Leishmania candidatas vacinais,
vários trabalhos encontram-se na literatura. Estudos sobre a expressão de diversas proteínas
heterólogas, como proteínas de superfície, intracelulares, secretadas, de choque térmico e de
várias vias metabólicas, vêm sendo conduzidos na tentativa de desenvolver uma vacina eficaz
contra leishmaniose. Em 1994, Charest e Matlashewski identificaram uma proteína específica de
amastigota de L. donovani, a proteína A2. Utilizando um sistema procarioto, E. coli, realizaram a
clonagem e expressão no vetor pET16b fusionado a uma cauda de histidina, e a expressão foi
induzida por IPTG (CHAREST e MATLASHEWSKI, 1994). Quatro anos mais tarde, Webb e
colaboradores (1998) identificaram a proteína TSA (Thiol specific antioxidant). Realizaram uma
triagem do potencial imunogênico do extrato de promastigotas de L. major utilizando soro de
camundongos vacinados com uma biblioteca de cDNA de amastigotas de L. major. Assim
identificaram a proteína TSA, que foi clonada e expressa em E. coli no vetor pET17b (WEBB et
al., 1998). Outro estudo, conduzido por Sachdeva e colaboradores (2009), realizou a expressão
da glicoproteína (gp63) de promastigota de L. donovani em E. coli (SACHDEVA et al., 2009).
Levando em consideração a expressão de proteínas de Leishmania em sistemas eucariotos, há
poucos trabalhos relatados como, por exemplo, um estudo realizado por Pirdel e colaboradores
(2012), que obtiveram a proteína recombinante rLPG (recombinant Lipophosphoglycan) de L.
infantum através da expressão no sistema eucarioto L. tarentolae. O plasmídeo recombinante
contendo o gene LPG foi transfectado na L. tarentolae com sucesso e isso representou um
avanço na expressão de proteínas de Leishmania em um sistema eucarioto (PIRDEL et al., 2012).
Antes de discutirmos sobre os nossos resultados, vale a pena discutir um pouco sobre os
sistemas de expressão. Desde a aprovação da primeira proteína recombinante para uso humano
(Human insulin receives FDA approval, 1982), a insulina humana produzida em E. coli, a
tecnologia do DNA recombinante e a engenharia de proteínas se estabeleceram de forma
eficiente na indústria para a produção de proteínas. Mais de 300 proteínas biofarmacêuticas e
anticorpos se encontram no Mercado, com vendas superiores a 100 bilhões de dólares (LANGER,
2012) e com um crescimento anual entre 15 e 18% (SCHRODER, 2008). Durante muitos anos, a
E. coli foi considerada o principal sistema de expressão de proteínas heterólogas, sendo a
primeira escolha e a mais comum para a superexpressão de genes heterólogos por apresentar
inúmeras vantagens, como fácil manipulação e facilidade de transformação por diversos
plasmídeos e phagos (LAVALLIE e MCCOY, 1995). Mas esse sistema de expressão apresenta
algumas desvantagens, como dificuldade em produzir moléculas mais complexas como, por
exemplo, moléculas que requerem pontes de dissulfeto (YADAVA e OCKENHOUSE, 2003). Na
69
Sistema Vantagens Desvantagens
Bons níveis de expressão; escolha de expressão: celular ou secreção;
baixo custo; condições de cultura simples; escalonável; realiza a
maioria das modificações pós-traducionais; dobramento eficiente; livre
de endotoxina
Níveis de expressão bem altos; baixo custo; condições de cultura
simples; crescimento rápido; escalonável; escolha de expressão
intracelular ou de secreção; secreção proteica eficiente com purificação
simples; extensas modificações pós-traducionais; dobramento
eficiente; N-glicosilação mais comparável aos eucariotos em relação a
S. cerevisiae ; livre de endotoxina
Escherichia coli
Níveis de expressão bem altos; baixo custo, condições de cultura
simples; crescimento rápido; escalonável; protocolos simples; vários
parâmetros podem ser alterados para melhorar a expressão
Saccharaomyces
cerevisiae
P. pastoris
Linhagens engenheiradas podem ajudar a minimizar o
problema da ponte dissulfeto; glicosilação diferente
em comparação as células mamíferas; tendência em
hiperglicosilar as proteínas; as estuturas de N-glicano
são alergênicas
O uso de metanol em grande escala é perigoso;
glicosilação diferente em comparação as células
mamíferas
Formação ineficiente de pontes dissulfeto; mau
dobramento de proteínas no citoplasma; formação de
corpúsculo de inclusão; redobramento ineficiente in
vitro pode anular as vantagens; uso de códons
diferentes para eucariotos; modificações pós-
traducionais mínimas; endotoxinas
última década, a levedura P. pastoris vem se destacando no cenário da expressão de proteínas
heterólogas em organismos eucariotos. Dadashipour e colaboradores (2011) avaliaram a
expressão da enzima liase hidroxinitrila em dois diferentes sistemas de expressão, eucarioto e
procarioto. Como sistema procarioto foi utilizado a E. coli enquanto que os sistemas eucariotos
utilizados foram principalmente a P. pastoris e a L. tarentolae. Os resultados demostraram altos
níveis de expressão de proteínas nos sistemas eucariotos em relação ao sistema procarioto, e as
proteínas expressas em E. coli apresentaram menor solubilidade em relação às proteínas
expressas nos sistemas eucariotos (DADASHIPOUR et al., 2011).
Assim, estão representadas na Tabela 7 algumas vantagens e desvantagens dos sistemas
de expressão procarioto e eucarioto.
Tabela 7 - Vantagens e desvantagens de sistemas heterólogos de expressão de proteínas
Fonte: Baseado no PDB (Protein Data Bank)
70
As leveduras têm sido utilizadas pelo homem há milhares de anos, e sua manipulação causou
um grande impacto na indústria alimentícia, consequentemente influenciando o desenvolvimento
sócio-econômico da humanidade. No processo de produção de alimentos, inúmeros exemplos,
como a cerveja, o vinho e o fermento biológico são derivados da manipulação das leveduras,
sendo a S. cerevisiae a principal levedura envolvida (BLANQUET et al., 2001). Com o advento da
tecnologia recombinante, a S. cerevisiae ganhou um papel de destaque em estudos de genética e
biologia molecular, sendo modificada geneticamente nos anos 70. Depois se começou o
desenvolvimento de vetores de expressão nessa levedura, por conseguinte, houve uma
alavancada na expressão de proteínas heterólogas em sistemas eucariotos (PETRANOVIC et al.,
2010). Ao longo das últimas décadas, outras leveduras têm sido estudadas como sistemas
alternativos de expressão por apresentarem vantagens sobre S. cerevisiae, entre esses, destaca-
se P. pastoris. Nesse contexto, para o nosso estudo foi escolhido para a expressão das proteínas
heterólogas de L. infantum o sistema eucarioto, especificamente a P. pastoris, uma levedura
metilotrófica que possui a capacidade de crescimento em meio contendo o metanol como única
fonte de carbono (CREGG et al., 1993). A levedura pode ser encontrada comercialmente (pela
INVITROGEN) com diferentes promotores, mas o mais comum e utilizado é o promotor AOX, que
regula a produção da enzima álcool oxidase, responsável por induzir a expressão da proteína
heteróloga. A enzima álcool oxidase catalisa a oxidação do metanol produzindo o formaldeído,
que é utilizado para a geração de energia pela célula. A escolha da Pichia pastoris se deveu ao
fato de se tratar de um organismo eucarioto, apresentando algumas vantagens em relação à
utilização de bactérias, como por exemplo, a disponibilidade de um ambiente capaz de realizar
modificações pós-traducionais, que incluem enovelamento e glicosilação, entre outras, e por ser
atualmente o mais eficiente na produção de proteínas heterólogas (LI et al., 2007). Os níveis de
expressão de proteínas recombinantes produzidas por esse sistema de expressão variam muito
(Tabela 7). Dependendo das características da proteína de interesse, são necessárias
modificações para a otimização da produção. São relatadas características como tamanho,
modificações pós-traducionais, solubilidade e complexidade estrutural (SREEKRISHNA et al.,
1997). Levando em consideração essas características, existem inúmeros trabalhos visando à
expressão de proteínas heterólogas em P. pastoris relatados na literatura como, por exemplo, o
fragmento C da toxina do tétano que apresentou rendimentos de 12 g/L (CLARE et al., 1991).
Contrastando com esses resultados, Murphy e colaboradores (1998) demostraram resultados
para a expressão da IL-17 humana com rendimentos de 0,35 mg/L (MURPHY et al., 1998). Em
fermentadores, o rendimento de expressão através da P. pastoris está de modo geral entre 10 a
500 mg/L. No presente estudo, trabalhou-se com duas proteínas identificadas por ferramentas de
bioinformática, sendo uma delas hipotética conservada (proteína P5). Por esse motivo, a
expressão dessa proteína poderá demandar maior tempo, visto que não se tem informações
sobre a real função e nem trabalhos publicados sobre ela. Esse será um grande desafio e
71
ProteínasNíveis de
expressão (g/L)
Onde é
expressaReferência
TNF (Tumor Necrosis
Factor)10 Intracelular (Sreekrishna et al., 1989)
EGF (Mouse
Epidermal Growth
Factor)
0.45 Secretada (Clare et al., 1991b)
IFN-α2b (Human
Interferon)0.4 Intracelular (Garcia et al., 1995)
CD38 Humano 0.05 Secretada (Fryxell et al., 1995)
Receptor de
serotonina
(camundongo)
0.001 Secretada (Weiss et al., 1995)
esperamos alcançar resultados muito interessantes e assim dar continuidade nos estudos sobre
essa proteína.
Serão discutidas as abordagens utilizadas na clonagem e a integração dos genes que
codificam para as proteínas P4 e P5 no genoma da P. pastoris. Anteriormente aos experimentos,
foi necessário o desenho dos iniciadores para cada gene, inserindo sítios de clivagens para as
enzimas EcoRI e XbaI. Nas abordagens de desenho dos iniciadores e estratégia de clonagem foi
utilizado o software de análise de sequências de DNA pDRAW32. O desenho dos iniciadores foi
feito com o máximo de cuidado, e foi necessário realizar mutações sítio-dirigidas para eliminar os
codons de parada presentes nas sequências dos genes. Com o software foi possível conferir in
silico as fases de leitura do DNA recombinante pPICZα-A contendo os genes P4 e P5.
Além disso, foi necessária a caracterização molecular da espécie de leishmania que seria
utilizada no estudo. Para isso, foi extraído o DNA genômico da Leishmania, no qual foi realizada a
técnica padrão-ouro, PCR-RFLP do kDNA de Leishmania (VOLPINI et al., 2004). Através da
técnica, foi confirmada a espécie como L. infantum, que apresenta um perfil de restrição do kDNA
característico, com quatro bandas de 40, 60, 80 e 120 pares de bases, como representado na
Figura 16.
Tabela 8 - Proteínas expressas em P. pastoris
Fonte: Manual técnico de expressão em P. pastoris da INVITROGEN.
72
O DNA genômico foi utilizado para a amplificação dos genes P4 e P5. No caso das
Leishmanias, a expressão gênica é diferente em relação aos outros eucariotos, os genes estão
em geral organizados em grupos gênicos direcionais que se assemelham às unidades de
transcrição policistrônicas de procariotos (MARTINEZ-CALVILLO et al., 2004). Esse tipo de
organização gênica e de transcrição policistrônica possui implicações severas na regulação
gênica. A amplificação dos genes foi evidenciada pela visualização dos amplicons com tamanho
esperado (Figura 17), resultado satisfatório visto que se partiu de proteínas preditas. Além disso,
as proteínas não possuem ensaios experimentais, incluindo uma proteína hipotética conservada,
cuja função ainda é desconhecida. Esses resultados comprovaram que o desenho dos iniciadores
foi executado com sucesso. No entanto, será feito o sequenciamento para confirmação da
sequência gênica.
Após a amplificação dos genes, procedeu-se com a clonagem no vetor pGEM, com a
finalidade de aumentar a eficiência de clonagem da região codificadora dos genes, de forma a
possibilitar a obtenção do clone na orientação senso. Os fragmentos de interesse foram liberados
dos clones pGEM/P4 ou P5 com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI e tratados com T4 DNA
polimerase. Os fragmentos de DNA resultantes foram subclonados no vetor de expressão
pPICZα-A. Todas as clonagens foram confirmadas por PCR (utilizando os iniciadores específicos
de cada gene) e por digestão enzimática (com EcoRI e XbaI) (Figuras 19 e 21).
Após a confirmação das construções em bactéria, o DNA plasmidial de cada construção foi
extraído e hidrolisado com a enzima PmeI. Em seguida, o DNA obtido foi utilizado na
transformação de células quimiocompetentes de P. pastoris, linhagem X33 (Mut+), e a obtenção
de transformantes demonstra que a integração ocorreu. A enzima de restrição PmeI hidrolisou os
clones na região promotora 5’AOX1, favorecendo a integração do DNA transformado na região
AOX1 genômica. A inserção ocorreu por recombinação homóloga entre a região 5’ do promotor
AOX1 e uma região 3’ terminadora homóloga, comuns no plasmídeo e no genoma de P. pastoris.
A integração pela linearização do vetor com a enzima PmeI orientou a integração por único
“crossing over” no locus AOX1 cromossomal (CLARE et al., 1991). Assim, o gene AOX1,
responsável pela utilização de metanol, permanece intacto e a linhagem é fenotipicamente Mut+
(CLARE et al., 1991). O fenótipo Mut+ ocorre quando a inserção do cassete de expressão no
genoma de P. pastoris mantém o gene AOX1 do genoma da levedura. Desse modo, são
produzidos recombinantes com alta velocidade de crescimento em metanol. Além disso, já foram
realizados os experimentos de expressão (resultados não mostrados) e atualmente estão sendo
realizadas as padronizações das reações de Western blot.
73
CONCLUSÃO 7
Este trabalho é um dos primeiros a utilizar o proteoma total de L. infantum, empregando
poderosas ferramentas de bioinformática para identificar proteínas candidatas vacinais contra a
LVC. Foi possível fazer a predição de epítopos de células B e T e dada localização subcelular de
proteínas, utilizando algoritmos de código livre. Após as predições, foi feita a integração de todos
os resultados da predição de epítopos, e a pré-seleção de antígenos promissores para o desenho
de uma vacina contra a LVC foi feita utilizando o Banco de Dados Relacional desenvolvido e
modelado pelo grupo de pesquisa.
Foi possível confrontar as proteínas selecionadas com uma rede de interação proteína-
proteína do parasito e analisar o grau de interação das proteínas pré-selecionadas através dos
índices de MCC e Degree.
Além disso, foi possível a amplificação dos genes que codificam as proteínas selecionadas
utilizando-se iniciadores que foram desenhados durante o desenvolvimento desse trabalho. Os
genes foram clonados em vetores de procariotos e eucariotos utilizando bactérias como células
hospedeiras.
Em relação à expressão, foi possível realizar a integração do plasmídeo recombinante
contendo os genes de interesse no genoma de P. pastoris utilizando o vetor de expressão
pPICZα-A.
74
PERSPECTIVAS 8
Após a confirmação da expressão das proteínas P4 e P5 por Western blot, será feita
a purificação das mesmas;
Conclusão dos experimentos de expressão das proteínas P2 e P3
Serão realizados os ensaios de imunogenicidade in vitro através da técnica de ELISA;
Será submetido um artigo científico;
Serão conduzidos os experimentos in vivo em camundongos BALB/c utilizando os
antígenos individualmente ou conjugados juntamente com um adjuvante.
75
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