UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

RODRIGO SCARPARI CARRARO

INFLAMAÇÃO PRECEDE ESTRESSE DE RETÍCULO E DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL NO

HIPOTÁLAMO DURANTE AS ETAPAS INICIAIS DA INSTALAÇÃO DA OBESIDADE

CAMPINAS

2016

RODRIGO SCARPARI CARRARO

INFLAMAÇÃO PRECEDE ESTRESSE DE RETÍCULO E DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL NO

HIPOTÁLAMO DURANTE AS ETAPAS INICIAIS DA INSTALAÇÃO DA OBESIDADE

Orientador: Prof. Dr. Licio Augusto Velloso

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médica da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA DISSERTAÇÃODEFENDIDA PELO ALUNO

RODRIGO SCARPARI CARRARO, E ORIENTADO

PELO PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO.

CAMPINAS

2016

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO

RODRIGO SCARPARI CARRARO

Orientador PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO

MEMBROS:

1. PROF. DR. LICIO AUGUSTO VELLOSO

2. PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHE

3. PROF. DR. JOSÉ DONATO JÚNIOR

Programa de Pós‐Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra‐se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 28 de janeiro de 2016

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais e irmã (Denise, João Marcos e Vanessa) pelo amor incondicional, caráter, valores,

carinho e por trilhar de maneira preciosa meus caminhos sempre incentivando meus estudos e

também comemorando e vibrando junto a mim as conquistas e apoio em momentos difíceis;

Ao meu cunhado Paulo pela grande amizade que fortalece cada vez mais nossos vínculos familiares;

Ao professor Licio Augusto Velloso, que gentilmente aceitou dividir comigo seus conhecimentos

permeando minha carreira científica com entusiasmo e ética. Mais do que orientador científico, você

foi sábio e fundamental ao esclarecer minhas dúvidas e compreender minhas ansiedades e angustias

que de forma singular me fez crescer como profissional;

À professora Alicia Juliana Kowaltowski pela excepcional contribuição intelectual na produção e

execução deste projeto;

Aos grandes amigos e primos Fernando, Giovanni e Danilo, que sempre estiveram comigo em

diversos períodos da minha vida, tanto em momentos tristes como nos mais divertidos e

inesquecíveis;

Ao João Vitor Carvalho, embora nos conhecemos há pouco tempo, criamos um laço forte de amizade

que irei levar para o resto da minha vida. Agradeço também, o companheirismo e de passar tantos

momentos agradáveis fazendo músicas até altas horas;

Ao Deivid Lemos pela recente e grande amizade que cresce a cada dia;

À Fernanda Augustini Pezzato por ser uma pessoa imprescindível na minha vida. Você me ajudou e

entusiasmou na minha escolha para a carreira acadêmica. Admiro seu talento profissional e me

espelho muito em você. Agradeço também, por me confortar nos momentos que mais precisei e pelo

carinho e amizade que levarei comigo pelo resto da vida;

À Gabriela Freitas Pereira de Souza (Gabi). Você foi a minha primeira grande amiga do laboratório,

nos identificamos já na primeira semana e fiz questão de continuar meus experimentos com você,

pois admiro muito sua capacidade, inteligência, pensamento crítico e várias outras características

que poderia escrever mais uma dissertação para falar de suas qualidades e obrigado pela

participação na construção da minha carreira científica;

À Juliana Contin, já que estou neste laboratório por sua causa! A sua excelente palestra no CAEB, me

deixou apaixonado pelo seu conhecimento e entusiasmo pela pesquisa, fato este que sem dúvidas,

foi determinante para que eu buscasse carreira acadêmica;

Ao José Carlos (Zeca) pela amizade que se torna mais sólida a cada dia. Obrigado por me passar

vários conhecimentos tanto profissional quanto da vida;

À Daniela Razolli por estar sempre presente nos experimentos quando precisei de ajuda e pela

parceria não só no laboratório, mas nas mesas de barzinhos e por passar vários momentos

agradáveis e hilários juntos;

À Carina Solon por me ensinar diversas técnicas do laboratório de maneira simples e extremamente

eficiente, também por estar presente nos experimentos, principalmente quando estes eram difíceis e

longos. Agradeço, sobretudo, a companhia em diversos happy hours, e por alegrar estes momentos;

Ao Bruno Chausse, embora recente no laboratório teve um papel ímpar na ajuda de meus

experimentos e na produção da minha aula de qualificação, assim como na produção deste texto.

Agradeço também, a amizade e pelas várias histórias engraçadas que alegra os dias no laboratório;

Ao Alexandre Moura pela amizade e pela agradável companhia nas viagens para congressos, assim

como no laboratório, e que com uma imensa paciência me ensinou diversas teorias de sinalização

celular;

Aos colegas Thiago Matos, Guilherme Nogueira, Lucas Nascimento, Letícia Pires, por serem pessoas

extremamente agradáveis de conviver diariamente tanto em ambiente de trabalho quanto em

momentos de distração e risadas;

Erika Anne, que com muito carinho, teve paciência e calma para me ensinar vários procedimentos e

conceitos biológicos, além de estar sempre presente e disponível quando queremos um ombro

amigo;

Andressa Coope, Carolina Solon, Albina Garcia, Gerson Ferraz, Bruna Bombassaro, Milena Fioravante,

Nathalia Dragano, Livia Bittencourt, Carlos Poblete, Vanessa Bóbbo, Vanessa Oliveira, Mariana

Freschi, Roberta Haddad, Roberta Barbizan, Rafael Marostica, Joseane Morari, Felipe, pelas

discussões científicas, ajudas com experimentos, gargalhadas e por tornarem meus dias no

laboratório mais alegres;

Ao Márcio Cruz, pela paciência e cuidado excepcional com os animais;

Animais de experimentação, que sem saber, acrescentam diariamente valores inestimáveis à ciência;

Agência FAPESP, pelo apoio financeiro que permitiu a realização desta dissertação e meu

desenvolvimento como cientista.

RESUMO

Ácidos graxos saturados de cadeia longa, presentes na dieta, induzem uma resposta inflamatória

muito precoce no hipotálamo, ao ativarem receptores TLR4 e induzirem tanto inflamação, quanto

estresse de retículo endoplasmático (ER stress). Estudos recentes sugeriram que alterações na

função mitocondrial poderiam também desempenhar um papel patofisiológico durante a instalação

da disfunção hipotalâmica na obesidade. Neste estudo avaliamos marcadores de inflamação,

estresse de retículo endoplasmático e alterações mitocondriais em etapas iniciais da obesidade

induzida por dieta. Os nossos resultados demonstram um aumento precoce, no conteúdo de

proteínas relacionadas à inflamação, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α e fractalkina, em camundongos Swiss

submetidos a uma dieta rica em gordura saturada. A exposição dos camundongos a 3 horas de dieta

hiperlipídica foi capaz de aumentar significativamente o conteúdo da fractalkina. Com 6 horas de

exposição, observamos um aumento da chaperona GRP78, proteína envolvida na resposta às

proteínas mal enoveladas (UPR) no retículo endoplasmático, e este aumento se conservou com o

passar dos dias enquanto mantida a oferta da dieta hiperlipídica. As proteínas sensoras de distúrbios

de enovelamento de proteínas no retículo foram afetadas algum tempo depois da indução da

resposta inflamatória, IRE-1α aumentou com 3 dias e ATF6 no 7º dia de exposição à dieta

hiperlipídica. A mitofusina 2, proteína envolvida na dinâmica morfológica mitocondrial, teve redução

após 24 horas de exposição à dieta hiperlipidica e aumento após 7 dias. Como essas alterações

sugerem mudanças morfológicas nas mitocôndrias, utilizamos a seguir a microscopia eletrônica por

meio da qual identificamos variações nos contatos entre as mitocôndrias e o retículo

endoplasmático. Entretanto, a exposição à dieta hiperlipídica nestes períodos não alterou a

respiração mitocondrial no hipotálamo. Desta forma concluímos que o consumo de dieta

hiperlipídica induz rápida resposta inflamatória no hipotálamo de camundongos, o que é seguido de

indução de ER stress. Apesar de terem sido detectadas alterações no conteúdo proteico de pelo

menos uma proteína envolvida na dinâmica morfológica mitocondrial e no número de contatos entre

mitocôndrias com o retículo, tal fato não foi acompanhado de alterações na respiração mitocondrial

no hipotálamo.

Palavras chave: obesidade, inflamação, hipotálamo, mitocôndria, retículo endoplasmático.

ABSTRACT

Long-chain saturated fatty acids present in the diet induce a very early inflammatory response in the

hypothalamus through the activation of TLR4 and induction of endoplasmic reticulum stress (ER

stress). Recent studies have suggested that changes in mitochondrial function could play a

pathophysiological role during the installation of obesity-associated hypothalamic dysfunction. In this

study we evaluated inflammatory markers, endoplasmic reticulum stress and mitochondrial

alterations in the initial stages of diet-induced obesity. Our results showed an early increase in the

expression of proteins related to inflammation, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α and fractalkine in Swiss mice

subjected to a diet rich in saturated fat. The exposure of mice to 3 hours fat diet was capable of

increasing the content of fractalkine. Six hours dietary exposure to fat resulted in the increase of the

chaperone GRP78, which is involved in the unfolded protein response (UPR) in the endoplasmic

reticulum. This increase remained steady as far as the high-fat diet was maintained. The ER stress

sensor proteins were affected after the induction of the inflammatory response; thus, IRE-1α and

ATF6 increased 3 and 7 days after dietary fat introduction, respectively. Mitofusin 2, which is

involved in mitochondrial morphological dynamics, was reduced after 24 hours exposure and

increased after 7 days of dietary fat exposure. Because these changes suggest morphological

rearrangements of the mitochondria, we next employed electron microscopy and identified changes

in contacts between mitochondria and the endoplasmic reticulum. However, exposure to high-fat

diet did not alter the mitochondrial respiration as evaluated in hypothalamic explants. Thus, we

conclude that the consumption of a high-fat diet induces rapid inflammatory response in the

hypothalamus of mice, which is followed by ER stress. Although we detected changes in the

expression of at least one protein involved in mitochondrial morphology and dynamics and on the

number of contacts between mitochondria and the endoplasmic reticulum this was not accompanied

by changes in mitochondrial respiration in the hypothalamus.

Key words: obesity, inflammation, hypothalamus, mitochondria, endoplasmic reticulum.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AgRP – Peptídeo Relacionado ao Gene Agouti

ATF4 – Activting transcription fator 4

ATF6 – Activting transcription fator 6

CART – Transcrito Regulado por Cocaína e Anfetamina

DDIT3 – DNA damage inducible transcript 3 (CHOP)

DNA – Ácido Desoxirribonucléico

Eif2α – Eukaryotic inition fator 2α

GRP78 – Glucose-regulated protein 78

HFD – Dieta Hiperlipídica

IL10 – Interleucina 10

IL1β – Interleucina 1β

IL6 – Interleucina 6

LPS – Lipopolissacarídeo

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IRE1-α – Inositol-Requiring Enzyme 1α

MFN1 – Mitofunisa 1

MFN2 – Mitofunisa 2

MyD88 – Fator de Diferenciação Mielóide 88

NFκB – Fator Nuclear kappa B

NPY – Neuropeptídeo Y

OMS – Organização Mundial da Saúde

PBA – Ácido fenil-butírico

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

PERK – Protein Kinase RNA-like endoplasmic reticulum Kinase

POMC – Pró-Ópio Melanocortina

RNAm – Ácido Ribonucléico Mensageiro

TIR – Dominio de Homologia Toll/IL-1R

TIRAP – Proteína Adaptadora Contendo o Domínio TIR

TLR4 – Receptor Toll-Like 4

TLRs – Receptores Toll-like

TNFα – Fator de Necrose Tumoral-α

IMC - Índice de Massa Corpórea

TRAM – Molécula Adaptadora Relacionada à TRIF

TRIF – Proteína Adaptadora Contendo o Domínio TIR

UPR – Unfolded Protein Response

XBP-1 – X-box binding protein 1

SUMÁRIO

Introdução.............................................................................................................................13

Objetivos................................................................................................................................21

Material de Métodos.............................................................................................................22

Resultados e Discussão..........................................................................................................29

Resumo dos Resultados do Estudo........................................................................................49

Conclusão...............................................................................................................................51

Referências............................................................................................................................52

Anexos...................................................................................................................................58

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INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, a obesidade assumiu uma posição de destaque como fator

de risco para as taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Segundo dados

de 2012 da Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 65% da população mundial

vive em países nos quais o sobrepeso e a obesidade matam mais do que a desnutrição.

Os Estados Unidos, líder dessa estatística, apresentou um rápido e alarmante aumento

do número de pessoas obesas desde a década de 80 (Flegal et al., 2012).

No Brasil, o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) mostrou em

2015, que o número de pessoas com sobrepeso e obesidade se aproxima de 60%.

Cerca de 82 milhões de pessoas apresentam o IMC igual ou maior do que 25kg/m2. De

acordo com estes dados, o mais alarmante é o excesso de peso nas mulheres na faixa

etária entre 55 a 64 anos com prevalência superior a 70%. Os números mostraram

ainda que a obesidade acomete um em cada cinco brasileiros de 18 anos (20%), sendo

que o percentual é mais alto entre as mulheres (24% contra 16% dos homens) (IBGE).

Na China, país até então com baixa taxa de obesidade, houve um aumente de três

vezes no número de pessoas obesas entre 1991 e 2006 (Lu et al., 2010). Esses dados

revelam que a obesidade atingiu status de epidemia, acometendo países sem distinção

de renda ou desenvolvimento.

O grande problema associado ao crescimento do número de pessoas obesas no

planeta é o aumento paralelo do número de pessoas acometidas por doenças

associadas ao ganho de peso, tais como, diabetes mellitus do tipo 2 (DM2),

hipertensão arterial, doenças cardiovasculares e ainda alguns tipos de câncer (Danaei

et al., 2009).

A obesidade é caracterizada pela perda do controle homeostático entre a

ingestão alimentar e o gasto calórico. O hipotálamo é o principal centro responsável

pela coordenação e organização dos sinais que integram as informações a respeito das

reservas de energia no organismo desde o estímulo à busca do alimento até ao gasto

energético (Velloso et al., 2011).

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Existem grupos particulares de neurônios responsáveis por essa homeostase

energética central, sendo eles: NPY e AgRP – responsáveis por sinais orexigênicos –

que são estimulados quando há concentrações plasmáticas baixas de insulina e

leptina; e os neurônios anorexigênicos POMC e CART, com maior atividade após as

refeições, quando os níveis de insulina e leptina apresentam elevados no sangue

(Niswender et al., 2004). Estes neurônios são os principais responsáveis por detectar

sinais periféricos e gerar as primeiras respostas fisiológicas e comportamentais para

adequar o metabolismo energético (Velloso et al., 2008).

Nos últimos anos, demonstrou-se que na obesidade experimental ocorre a

ativação de uma resposta inflamatória no hipotálamo, a qual determina o

desenvolvimento de um quadro de resistência à ação dos principais hormônios

anorexigênicos e pró-termogênicos – leptina e insulina – levando assim, a um distúrbio

da homeostase energética (Velloso et al., 2011).

Esta inflamação é oriunda da ativação inicial do sistema imune inato, que é

composto por diversas células efetoras circulantes como: neutrófilos, macrófagos,

mastócitos, eosinófilos, células dendríticas e Natural Killers (NK); e por proteínas

plasmáticas como o complemento, a proteína-C reativa, a lectina de ligação à manose

e os fatores de coagulação, que podem ser rapidamente ativadas na presença de

microorganismos ou de substâncias produzidas na infecção, e desta forma iniciam a

resposta imunológica (Iwasaki et al., 2010; Medzhitov et al., 2000a).

A imunidade inata está por trás da maioria das respostas inflamatórias e é

acionada em primeira instância por macrófagos, leucócitos e mastócitos. Essas células

se tornam ativadas rapidamente se diferenciando em células efetoras cujo papel

principal é eliminar a infecção. Porém, o sistema imune inato pode não ser capaz de

eliminar totalmente o agente agressor podendo então participar da ativação do

sistema imune adaptativo que responde de forma especifica (Iwasaki et al., 2010;

Mogensen et al., 2009; Janeway et al., 2002).

Respostas imunológicas podem ser acionadas por alguns tipos específicos de

ácidos graxos saturados, constituintes naturais de alimentos. Tais respostas parecem

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ser iniciadas através de um receptor específico, conhecido como Toll Like Receptor

(TLRs). Os TLRs são proteínas-transmembrana responsáveis pela detecção da invasão

do organismo por patógenos. Os TLRs são expressos em vários tipos de células do

sistema imune, incluindo macrófagos, células dendríticas, micróglia, linfócitos B e tipos

específicos de linfócitos T. A expressão dos TLRs também é observada em outros tipos

de células como adipócitos, células endoteliais e células do epitélio intestinal (Takeda

et al., 2003).

Atualmente existem 12 membros da família dos TLRs identificados em

mamíferos. TLR 1, 2, 4 e 6 são capazes de reconhecer componentes lipídicos. O TLR4 é

um subtipo de TLR que é responsável pelo reconhecimento de lipopolissacarídeo (LPS)

de bactérias gram-negativas. Da mesma forma com que os receptores TLR4

reconhecem estruturas lipídicas presentes em agentes invasores, ácidos graxos

oriundos do consumo dietético podem também ser reconhecidos por este sistema,

causando a ativação da via do sistema imune, mesmo sem a presença de um

microorganismo invasor (Lee et al., 2001).

A associação dos TLRs com seus ligantes ativa duas vias de sinalização distintas,

a via dependente do fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) e uma via

independente do MyD88 (Takeda et al., 2003). Após sua ativação, os TLRs dimerizam e

sofrem mudanças conformacionais necessárias para o recrutamento de moléculas

adaptadoras contendo um domínio TIR. Há quatro moléculas adaptadoras que

exercem esta função: o MyD88, TRIF, TICAM e TRAM (Yamamoto et al., 2002). O

MyD88 e o TRIF, são responsáveis pela ativação de diferentes vias de sinalização, que

acarretam na produção de citocinas pró-inflamatórias e interferons (IFNs),

respectivamente.

Depois da ativação do TLR, o MyD88 liga-se ao domínio citoplasmático dos

TLRs, o que facilita a associação da quinase 4 associada ao receptor de IL-1 (IRAK4)

com o receptor. A ligação do MyD88 com a IRAK4 permite a fosforilação de resíduos na

quinase 1 associada ao receptor de IL-1 (IRAK1), induzindo a atividade quinase da

IRAK1. A IRAK1 ativada autofosforila resíduos na sua região N-terminal, o que

possibilita a ligação do fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF6) ao complexo

(Takeda et al., 2004). O complexo IRAK1-TRAF6 desliga-se do receptor e interage na

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membrana plasmática com outro complexo pré-formado que inclui a quinase1 ativada

por fator de crescimento transformador β (TAK1), a proteína 1 ligadora da TAK1 (TAB1)

e a proteína 2 ligadora da TAK1 (TAB2) ou a proteína 3 ligadora da TAK1 (TAB3). Esta

interação induz a fosforilação da TAB2/TAB3 e da TAK1, que se desloca em conjunto

com o TRAF6 e TAB1 para o citoplasma. A TAK1 é ativada por fosforilação no

citoplasma, possibilitando a ativação de proteínas pertencentes a diferentes vias como

as do IKK/IκB/NFκB. A potência da resposta inflamatória pode ser ainda maior quando

outras quinases são ativadas pela TAK1, de forma paralela à sinalização do NFκB, como

as proteínas decorrentes da via da JNK e da proteína 38 (P38) (Verma et al., 2010).

O principal fator ambiental responsável pela indução da inflamação

hipotalâmica é o consumo de dietas ricas em gorduras saturadas. Ácidos graxos

saturados de cadeia longa, bastante comuns na dieta ocidental, sinalizam através de

TLR4 a transdução de sinais através de vias inflamatórias, o que resulta no estímulo à

produção de citocinas tais como TNF-α e IL-1-β. Acredita-se que células da micróglia

sejam o principal alvo da ação inflamatória dos ácidos graxos saturados. As citocinas

produzidas neste contexto agem de forma parácrina sobre neurônios do hipotálamo,

levando a ativação de vias inflamatórias de resposta, principalmente através de JNK e

IKK, as quais induzem resistência à ação da leptina e insulina, sendo este o evento que

melhor ilustra a disfunção hipotalâmica na obesidade (Milanski et al., 2009; Thaler et

al., 2012).

A inibição da inflamação hipotalâmica por mecanismos farmacológicos ou

genéticos previne ou reverte o fenótipo de obesidade, colocando a inflamação

hipotalâmica numa posição de destaque na patogênese da obesidade (Velloso et al.,

2011).

Um estudo realizado pelo nosso grupo foi o primeiro a demonstrar que animais

submetidos a uma dieta rica em lipídios de cadeia saturada, exibiam um processo

inflamatório central, com a presença de citocinas pró-inflamatórias no hipotálamo.

Além disso, através da técnica de macroarray, demonstrou-se que a dieta hiperlipídica

promoveu a modulação positiva ou negativa de 170 especificidades de mRNA. Houve

regulação de mRNAs codificadores de proteínas de várias categorias, variando desde

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hormônios e receptores de hormônios até enzimas, proteínas envolvidas com

sinalização celular, fatores de transcrição entre outros. Entretanto, citocinas e

proteínas participantes de resposta pró-inflamatórias, como IL-1β, IL-6 e TNF-α foram

aquelas que sofreram maior modulação (De Souza et al., 2005). Além disso, outro

trabalho do grupo demonstrou que apenas alguns tipos de ácidos graxos saturados são

capazes de induzir uma resposta inflamatória no hipotálamo, levando a resistência a

ação catabólica da insulina e da leptina (Milanski et al., 2009).

Outro mecanismo envolvido com a ativação de inflamação no hipotálamo de

modelos animais de obesidade é o estresse de retículo endoplasmático (ER stress)

(Coope et al., 2012; Zhang et al., 2008; Hosoi et al., 2008; Ozcan et al., 2008). Ao serem

sintetizadas no citosol, pelos ribossomos, as proteínas de membrana e as proteínas

secretórias atravessam a membrana do retículo endoplasmático (ER) ganhando sua

luz. É nessa organela que as proteínas adquirem sua conformação secundária para, a

seguir, adquirir a forma tridimensional e finalmente, em alguns casos, interagirem com

outras proteínas para formar complexos quaternários (Ozcan et al., 2009). Quando há

um processamento inadequado das proteínas, pode ocorrer o acúmulo de formas

proteicas disfuncionais no ER. Infecção viral, toxinas, presença de lipídios, privação ou

excesso de glicose ou nutrientes são algumas das situações que podem desencadear

esse processo (Kim et al., 2007; Kaufman et al., 2002; Ma et al., 2001), e com certa

frequência, podem levar ao desenvolvimento de doenças, como o acúmulo de beta-

amilóide na doença de Alzheimer e de agregados de rodopsina na retinite pigmentosa

(Almeida et al., 2006).

O grande risco ocasionado por esse acúmulo de formas proteicas levou ao

desenvolvimento de mecanismos de salvaguarda celular, dentre eles as chaperonas

cumprem importante papel na organização funcional do ER, ligando-se às proteínas e

protegendo-as de ligações danosas (Brodsky et al., 2012). Quando permanecem por

longos períodos no ER, as proteínas malformadas são direcionadas à degradação num

processo denominado ERAD (ER-associated degradation) (Brodsky et al., 2012).

A funcionalidade do ER, e, por conseguinte, a homeostase celular, são

dependentes do equilíbrio entre a síntese, a liberação proteica e a degradação de

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proteínas anômalas. Caso ocorra um desequilíbrio nesse processo, ocorrerá acúmulo

de proteínas no ER gerando uma condição conhecida como estresse de retículo (ER

stress) (Brodsky et al., 2012).

Com o objetivo de preservar a integridade funcional do ER, uma complexa

resposta celular, conhecida como unfolded protein response (UPR), é ativada na célula

em ER stress (Hetz et al., 2013). O objetivo biológico principal da UPR é garantir que,

por um determinado período de tempo, a célula possa ampliar sua capacidade de fluxo

de proteínas através do ER. Para tal, ocorre um aumento da síntese de proteínas

estruturais e funcionais do ER, as quais contribuem para permitir que o ER se adapte às

necessidades momentâneas e reduza o acúmulo de proteínas malformadas na sua luz.

No entanto, em razão da magnitude do distúrbio que leva ao ER stress, ou mesmo pelo

tempo excessivo de sua manutenção, esses mecanismos podem não ser suficientes e,

neste caso, serão ativadas vias apoptóticas (Hetz et al., 2013). As principais proteínas

da membrana do RE envolvidas na indução da UPR são PERK, ATF6 e Ire1 (Shen et al.,

2004). No estado basal, estas três proteínas são inibidas pela ligação da chaperona

Grp78 (BIP) (Bertolotti et al., 2000). O recrutamento da Grp78 pelas proteínas

desdobradas libera a atividade da PERK, ATF6 e Ire1, que desencadeiam eventos

distintos que se relacionam inicialmente à adaptação da célula à situação que gerou o

distúrbio no funcionamento do RE, mas que também podem desencadear a execução

da apoptose.

A proteína PERK, na resposta ao estresse, é ativada quando há o

desacoplamento da GRP78 de seu sítio específico na PERK e por meio de

oligomeriazação e transfosforilação a PERK fosforila e inativa a subunidade alfa do

eIF2α (eukaryotic translational iniciation factor 2 α) levando à redução da tradução de

proteínas, e por conseguinte, o aporte proteico para o interior do retículo é reduzido

(Yoshida et al., 2007; Hotamisligil et al., 2010). A ativação da PERK, pode ainda,

aumentar a síntese de ATF4 (Activating transcription fator 4) e este promove a

regulação de vários genes envolvidos na UPR (Herbert et al., 2007). A IRE1 possui um

domínio no lúmen do RE sensível às proteínas mal formadas e uma porção

citoplasmática que possui um domínio quinase e um domínio RNAse. Uma vez ativa, a

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IRE1α converte o RNA mensageiro imaturo da proteína XBP-1 (x-box binding protein)

em RNA mensageiro maduro por um mecanismo não convencional de splicing. A

proteína traduzida a partir deste RNA maduro ativa a transcrição de genes que

compõem o ERAD, induz a expressão de proteínas envolvidas na síntese de lipídeos, a

biogênese do RE e também a produção de chaperonas, tais como a GRP78

(Hotamisligil et al., 2010). Se o estresse for crônico, o domínio citoplasmático pode

interagir com a TRAF2 e promover o aumento de síntese de NFkB e de proteínas

inflamatórias (Rasheva et al., 2009). O ATF6 é um fator de transcrição presente na

membrana do RE e, quando liberado da GRP78, é ativado e encaminhado para o

aparelho de Golgi onde sofre clivagem por atividade das enzimas: S1P (site-1 protease)

e S2P (site-2 protease), produzindo um fator de transcrição no citosol que se transloca

para o núcleo e promove a produção de chaperonas e XBP-1. (Hotamisligil et al., 2010).

Estas respostas da UPR promovem a regulação da homeostase celular, porém,

sob ativação crônica, a resposta de estresse pode ativar a via de apoptose. Embora

pouco conhecido, a resposta à apoptose pelo estresse de retículo envolve diferentes

mecanismos, por exemplo, ativação direta da via das caspases e de fatores de

transcrição mediadores da apoptose (CHOP) (Momoi et al., 2004; Kadowaki et al.,

2004; Oyadomari et al., 2004)

Um interessante avanço na caracterização da disfunção hipotalâmica na

obesidade (considerando a participação da inflamação e do ER stress) foi estabelecido

recentemente, em um estudo que avaliou a conexão entre o ER stress e a função de

mitocôndrias em neurônios do hipotálamo. De acordo com este estudo, durante

etapas iniciais da instalação da obesidade induzida por dieta, desenvolve-se um defeito

no processo de fusão e fissão de mitocôndrias em neurônios do hipotálamo. Tal

defeito tem por base a redução na associação física ente mitocôndrias e o ER. Assim,

este estudo expandiu o valor do defeito funcional do ER em células do hipotálamo

durante a obesidade (Schneeberger et al., 2013).

Além dessas duas vias – inflamação e ER stress – outras vias e proteínas foram

recentemente relacionadas com o processo de desenvolvimento da obesidade

(Dietrich et al., 2013). Embora já descrito em meados do século XX mudanças

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morfológica em mitocôndrias, apenas em 2007 foi demonstrado que as mitocôndrias

apresentam um alto dinamismo morfológico regulado pelos processos da fusão e

fissão mitocondrial (Cerveny et al., 2007) e para que isso ocorra, é preciso da ação de

diversas proteínas presentes na membrana mitocondrial, por exemplo, mitofunisa 1

(MFN1), mitofusina 2 (MFN2) (Chen et al., 2003; Santel et al., 2001), OPA1 (Cipolat et

al., 2004) e Drp1 (Reddy et al., 2011; Cipolat et al., 2004; Smirnova et al., 1998).

Um estudo demostrou que as mitocôndrias em neurônios AgRP apresentam um

dinamismo morfológico dependente do estado de alimentação do animal. Quando o

animal é privado de alimento, as mitocôndrias presentes nesta população de

neurônios apresentam um tamanho reduzido, formato mais circular e em maior

número, indicando processos de fissão mitocondrial. Por outro lado, quando o animal

é submetido à dieta hiperlipídica, as mitocôndrias passam a apresentar um tamanho

maior, mais alongadas e em menor número, evidenciando o processo de fusão

mitocondrial (Dietrich et al., 2013).

Estudos mostram que animais alimentados por dieta hiperlipídica apresentam

uma redução no número de contato de mitocôndrias com o retículo endoplasmático

acompanhado por um ER stress em neurônios POMC. Este fenômeno foi reproduzido

em animais knockout para MFN2 em neurônios POMC (Cerveny et al., 2007).

Desta forma, de acordo com os principais estudos realizados nesta área,

existem três mecanismos envolvidos com o desenvolvimento da disfunção

hipotalâmica na obesidade, quais sejam: inflamação, ER stress e alterações

mitocondriais. Entretanto, nenhum estudo até o momento avaliou qual destes

mecanismos é o mais precoce. Assim sendo, investigamos a relação temporal entre

eles, para definir a sequência de eventos que culmina com a instalação da disfunção

hipotalâmica na obesidade. Consideramos que ao definir adequadamente a sequencia

de eventos que culmina com a disfunção hipotalâmica na obesidade, forneça substrato

para que se progrida no desenvolvimento de métodos profiláticos e terapêuticos mais

eficientes para a prevenção e tratamento da obesidade.

21

OBJETIVOS

Geral

Definir o perfil temporal de deflagração da inflamação, do estresse de retículo

endoplasmático e de alterações mitocondriais no hipotálamo de animais alimentados

com dieta hiperlipídica.

Específicos

Avaliação da evolução temporal entre os parâmetros de inflamação,

estresse de retículo e alterações mitocondriais.

Inibição do TNF-α por infliximab e avaliação do conteúdo proteico dos

três mecanismos estudados.

Inibição do ER stress por PBA (ácido fenil-butírico) e avaliação do

conteúdo proteico dos três mecanismos estudados.

22

MATERIAL E MÉTODOS

Modelo animal

Foram utilizados camundongos Swiss, machos, obtidos do Centro de Bioterismo

da UNICAMP com cinco semanas de vida e mantidos em gaiolas individuais,

climatizadas, em ciclo claro-escuro de 12 horas e com ração e água ad libitum. Todos

os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa

da FCM – UNICAMP (Projeto CEUA: 3233-1).

Protocolos experimentais

Ao atingirem 5 semanas de vida os camundongos foram pesados, numerados e

separados em 8 grupos. Um grupo recebeu dieta padrão e os outros 7 receberam dieta

rica em ácidos graxos saturados (HFD), em diferentes tempos, a saber: 3, 6 e 12 horas

e 1, 3, 5 e 7 dias. Após completar o tempo determinado de dieta, os animais foram

submetidos a anestesia e eutanásia e em seguida o hipotálamo foi extraído e utilizado

nos experimentos. Para a separação dos animais, foi utilizada a “separação em Z”,

(para as médias serem iguais entre os grupos). A composição das dietas está na Tabela

1.

O grupo de camundongos ao qual ofertamos HFD em equivalência calórica com

o grupo ração foi denominado pair feeding. Para isso, calculamos o consumo diário de

ração pelos animais e mensuramos a quantidade calórica e igualamos essa quantia

com a HFD.

Os animais que receberam tratamento com inflixmab e PBA receberam as

doses nas concentrações de 10mg/kg ou 80mg/kg respectivamente. A primeira dose

foi administrada 12 horas antes da introdução à HFD, a segunda dose concomitante a

introdução da HFD e a terceira e última dose 12 horas depois. Assim, submetemos os

animais à 24 horas com HFD e todos os animais foram eutanasiados sempre no mesmo

horário (entre 9 e 10 horas da manhã).

23

Dissecção do hipotálamo.

Os animais foram anestesiados através de injeção intraperitoneal de tiopental

sódico (15 mg.kg-1). A perda dos reflexos pedioso e corneano foram utilizadas para

avaliação da eficiência da anestesia. Confirmada a eficácia anestésica, os animais

foram submetidos a eutanasia por decapitação. Após a abertura do crânio, o

hipotálamo foi retirado e homogeneizado para quantificação de proteínas por western

blot ou para quantificação de RNA mensageiro por RT-PCR em tempo Real.

Tabela 1. Composição das dietas controle e hiperlipídica ou rica em gordura

saturada, utilizadas nos experimentos.

Controle Hiperlipídica rica em saturados

Amido (Q.S.P) 467,5 115,5

Caseína 200 200

Amido de Milho Dextrinizado 132 132

Sacarose 100 100

Óleo de Soja 40 40

Banha 0 312

Celulose microfina (Fibra) 50 50

Mix Minerais 35 35

Mix Vitaminas 10 10

L-Cistina 3 3

Bitartarato de colina 2,5 2,5

Total 1000 1000

Western Blot

As amostras foram homogeneizadas em aproximadamente 10 volumes de

tampão de solubilização contendo 1% Triton X-100, 100 mM Tris (pH 7,4), 100 mM de

pirofosfato de sódio, 100 mM de fluoreto de sódio, 10mM de EDTA, 10 mM de

vanadato de sódio; 2 mM PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina a 4 °C em “Polytron PTA

20S Generator” (Brinkmann Instruments mode PT 10/35) com velocidade máxima por

30 segundos. O homogeneizado foi centrifugado a 11.000 rpm a 4 °C em um rotor

24

“Beckman 70,1”, por 40 minutos para remoção de material insolúvel. A proteína total

do sobrenadante foi determinada por meio do método colorimétrico pela reação do

biureto com leitura 540 ηM por ELISA. O sobrenadante foi utilizado para o ensaio de

imunoprecipitação e/ou preparação de extrato total proteico (ET). Os extratos totais

proteicos ou os imunocomplexos ressuspensos em tampão de Laemmli, foram

aplicados em gel de poliacrilamida para separação por eletroforese (gel não

desnaturante). As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de

nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-RAD banhadas com tampão de

transferência durante aproximadamente 40 minutos a 19 Volts. A ligação do anticorpo

às proteínas não específicas foi minimizada pela pré-incubação das membranas de

nitrocelulose com tampão de bloqueio (5 % de leite em pó desnatado; 10 mmol/L de

Tris, 150 mmol/L de NaCl, 0,02 % de Tween 20) por 1 hora. Então, as membranas de

nitrocelulose são incubadas de 12 horas a 3 dias com um anticorpo específico. A

detecção do complexo antígeno-anticorpo fixo à membrana de nitrocelulose foi obtida

por quimiluminescência utilizando um kit da Amersham e seguindo as orientações do

fabricante. Após a revelação das auto-radiografias as bandas identificadas foram

quantificadas por meio de densitometria óptica.

Para mensurar a quantidade proteica das citocinas pró-inflamatórias e anti-

inflamatórias, utilizamos os anticorpos primários: anti-TNF- α (policlonal de coelho, SC

-8301), anti-IL-1β (anticorpo policlonal de cabra, SC- 8481), anti-IL-6 (policlonal de

coelho, SC- 7920) e IL-10 (anticorpo policlonal de cabra, SC -1783). Para mensurar as

proteínas relacionadas ao estresse de retículo endoplasmático foram utilizados: anti-

eIf2a (policlonal de coelho, SC-11386), anti-EIF2S1 (phospho S51) (policlonal de coelho

ab-3215), anti-XBP 1 (policlonal de coelho –61950), anti-IRE 1α (policlonal de coelhoSC-

20790), anti-IRE 1 (phopho S724) (policlonal de coelho ab-48187), anti-PERK (policlonal

de coelho sc-13073), anti-pPERK (policlonal de coelhoSC-32577R), anti-ATF4

(monoclonal de camundongo ab50546), anti-GRP78 BIP (monoclonal de coelho

ab21685) e anti-DDIT3 (monoclonal de coelho ab11419). Para verificar os níveis de

Mfn2 na mitocôndria, utilizamos o anticorpo anti-Mitofusin 2 (monoclonal de coelho

ab-50843).

25

Extração de RNA

As amostras foram homogeneizadas em reagente de Trizol (Invitrogen, São

Paulo, Brasil) por 30s usando um homogeneizador de tecidos (Polytron-Agregate,

Kinematica, Littau/Luzern, Switzerland) na velocidade máxima. Em seguida foram

centrifugadas a 6.000 rpm, e o conteúdo total de RNA foi isolado de acordo com as

instruções do fabricante e quantificado por espectrofotometria. A integridade do RNA

foi verificada por eletroforese em gel de agarose. A síntese de cDNA foi realizada com

2μg do total de RNA usando o Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied

Biosystems).

Real Time PCR

Alíquotas de 2μg de RNA foram submetidas à transcrição reversa utilizando-se

primers hexaméricos randômicos e Superscrit Maloney MLV transcriptase reversa. A

avaliação de resultados foi realizada por eletroforese em gel de agarose 3 %. As

reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqMan TM

(Applied Biosystems), que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada

com um fluoróforo. Os genes que avaliamos foram: TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10,

fractalkine, XBP-1s, CHOP e eIF2α. O gene GAPD (TaqManTM - Applied Biosystems) foi

escolhido como controle endógeno da reação, o qual serviu para normalizar a

expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. A sonda GAPD é marcada

com o fluoróforo VIC. Antes de iniciar o experimento de quantificação relativa da

expressão dos genes acima foi realizada a validação do sistema para os mesmos e para

o controle endógeno (GAPD), para verificar se as eficiências de amplificação são

semelhantes e próximas a 100%. Esse passo é essencial para que o controle endógeno

possa ser utilizado para normalizar os valores de expressão relativa do gene de

interesse. A validação consiste na amplificação dos cDNAs em triplicatas de 7

concentrações diferentes (diluições seriadas de 3 vezes) de uma amostra escolhida

aleatoriamente, tanto com os oligonucleotideos do gene de interesse quanto do

controle endógeno. Em seguida, foi construída uma curva padrão a partir do logaritmo

da concentração das amostras pelo Ct (Threshold Cycle: ciclo em que cada curva de

amplificação atravessa o limiar de detecção (Threshold), o qual e definido

26

arbitrariamente). Nessa curva, foram obtidos os valores da inclinação (slope) da curva

e da confiabilidade das replicas. Dessa forma, a eficiência de um sistema é calculada

através da formula: E = 10 (-1/slope) - 1. Para a placa de validação dos genes foram

feitas triplicatas da amostra de cDNA dos tecidos referentes aos tratamentos citados

acima em 7 concentrações diferentes. Após o cálculo da eficiência de amplificação do

gene de interesse e do controle endógeno foi construído um gráfico de dispersão com

a finalidade de definir a amplitude de concentrações para as quais o sistema será

eficiente. Para a construção do gráfico foram utilizados os mesmos valores de

logaritmo da concentração das amostras no eixo X e a diferença entre as medias dos

Cts do controle endógeno e as medias dos Cts do gene de interesse para cada

concentração no eixo Y. Em seguida, foi obtida uma linha de tendência para estes

valores, a qual possui uma equação de reta na qual foi possível verificar o valor da

inclinação desta reta. Para que um o sistema fosse considerado eficiente, o valor da

inclinação teve que ser menor que 0,1 (quanto mais próximo de zero for este valor,

menor e a inclinação da curva e, portanto, mais constante é a diferença entre as

medias dos Cts do gene de interesse e do controle endógeno). Os pontos no gráfico,

correspondentes às concentrações, que estiveram mais próximos à linha de tendência

foram considerados validados (o sistema tem próximo de 100% de eficiência nestas

concentrações). Para a quantificação relativa do gene em estudo, as reações de PCR

em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 3 μL de TaqMan Universal

PCR Master Mix 2x, 0,25 μL da solução de oligonucleotideo e sonda, 2,75 μL de agua e

4,0 μL de cDNA, sendo que o controle negativo foi realizado com 4,0 μL de água, ao

invés do cDNA. Os ciclos utilizados no termociclador foram: 50 oC por 2 minutos, 95 oC

por 10 minutos, 40 ciclos de 95 oC por 15 segundos e 60 oC por 1 minuto. Os valores da

expressão gênica relativa foram obtidos pela analise dos resultados no programa 7500

System SDS Software (Applied Biosystems).

27

Microscopia eletrônica de transmissão

Os camundongos foram perfundidos com solução fixadora (paraformaldeído a

4%, 0,125% de glutaraldeído, em tampão de fosfato [PB] 0,06 M [ pH = 7,4 ]). Após a

perfusão, foi realizada a extração do cérebro. Foi utilizado o osteótomo entre o osso e

a dura-máter para quebrar e retirar pequenos pedaços de osso até chegar ao bulbo

olfatório. A dura-máter e a foice do cérebro foram rebatidas com delicadeza para

evitar que as mesmas não danificassem o encéfalo; o arco zigomático foi removido e

os ossos temporais afastados. Em seguida, foi realizado um corte no nível do bulbo

olfatório e elevando-se o encéfalo e expondo o nervo trigêmeo. Os nervos foram

cortados e suavemente o encéfalo foi removido da cavidade craniana. Após a extração,

foi feita a crioproteção do encéfalo, imergindo-o em uma solução de sacarose

(C12H22011 PM 342,3) à 30% em PB 0,1 M pH 7,4 a 4 ºC durante 48h.

Para avaliação morfológica das mitocôndrias do tecido nervoso do núcleo

arqueado do hipotálamo, o tecido foi dissecado e pré-fixado em solução de 2,5%

glutaraldeido e 2% paraformaldeído em tampão de cacodilato 0,05M (pH 7,2) com

0,001M de cloreto de cálcio por 2h, pós-fixados em tetróxido de ósmio no mesmo

tampão por 1h, e então corados com solução aquosa 0,5% de acetato de uranila por

18h. As amostras foram desidratadas em acetona e embebidas em meio de baixa

viscosidade. Os blocos foram seccionados em ultramicrotomo, corados com solução

aquosa 3% de acetato de uranila e acetato de chumbo e examinados com microscópio

eletrônico de transmissão Tecnai G2 Spirit Twin (FEI, Hillsboro, OR). Para verificar o

número do contado entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático rugoso

(mitocôndria-RE), foi utilizado o teste duplo cego, e foram consideradas positivas

(contato mitocôndria-RE) aquelas mitocôndrias nas quais as cristas fossem facilmente

identificáveis e que tangenciassem o retículo.

28

Análise da respiração mitocondrial hipotalâmica

Os animais foram eutanasiados e o cérebro retirado com muito cuidado para

não perder as referências anatômicas, retiramos o hipotálamo do cérebro e cortamos

um fragmento cerca de 2 a 3 mg da região inferior do hipotálamo. Em seguida, este

tecido foi colocado no interior da câmera do equipamento Oroborus. O consumo de O2

foi monitorado em suspensões com concentrações proteicas de 0,125 mg/ml sob as

mesmas condições tamponantes usadas na medida de H2O2 mitocondrial, valendo-se

de um eletrodo de Clark que opera sob agitação contínua a 37oC, acoplado a um

sistema Oroboros de respirometria de alta resolução (Hütter et al., 2006). O tampão

utilizado contém KCl 150 mM, Hepes 10 mM, fosfato inorgânico 2 mM, MgCl2 2 mM,

0,1% BSA e pH ajustado para 7,2 com adição de KOH. Após as amostras serem

colocadas na câmara do equipamento, esperamos cerca de 15 minutos para obter a

calibração adequado do sistema. Em seguida adicionamos Saponina 50 μM para

permeabilizar as células, piruvato 5 mM e malato 3 mM em concentrações saturantes

para servir como substrato do complexo I. Após 6 minutos, adicionamos ADP 5 mM

também em concentração saturante. Seis minutos depois, foi adicionado oligomicina 2

μg/ml; e, finalmente, pós 6 minutos adicionamos rotenona 1 μM.

Análise estatística

Os resultados foram apresentados em média e desvio padrão da média. Para

análise estatística, primeiramente aplicamos o teste de Levene para verificar as

homogeneidades das variâncias. Para a comparação de médias entre dois grupos,

aplicamos o teste t de Student para amostras independentes. Quando necessário, foi

utilizada análise de variância (ANOVA) e quando indicado, o teste de Tukey HSD para

comparação múltipla de médias. Em todos os casos o nível de significância para

rejeição da hipótese de nulidade será de 5% (p<0,05). Os dados foram analisados

utilizando o programa "Statistic for Windows", versão 7.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK,

USA).

29

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para definir a evolução temporal entre a inflamação, o ER stress e as alterações

mitocondriais, durante o desenvolvimento do distúrbio funcional do hipotálamo em

animais alimentados com dieta hiperlipídica, submetemos os camundongos a

diferentes períodos (3, 6 e 12 horas e 1, 3, 5 e 7 dias) de ingestão de dieta preparada

com 35% (massa/massa) de gordura, predominantemente saturada. Camundongos do

grupo controle foram alimentados com ração convencional pelos mesmos períodos de

tempo. Ao final do tempo estipulado para cada subgrupo, os camundongos foram

utilizados nos procedimentos experimentais.

O impacto do consumo da HFD na inflamação hipotalâmica

A primeira análise foi realizada pelo método de Western Blot, assim pudemos

mensurar a quantidade de proteínas específicas relacionadas à inflamação, em seguida

fizemos também a análise por PCR e mensuramos a quantidade de transcritos

relacionados a inflamação.

A Figura 1 apresenta os resultados obtidos com a mensuração da expressão

proteica de citocinas pro- e anti-inflamatórias no hipotálamo. Houve um aumento da

expressão de todas as proteínas avaliadas após 24 horas de consumo de HFD. Com 3 e

5 dias de dieta apenas o TNF- α se manteve elevado, sendo que com 5 e 7 dias ocorreu

uma diminuição no conteúdo de IL-6 quando comparado ao controle. Após 7 dias de

consumo da dieta rica em gordura saturada a quantidade das citocinas TNF-α e IL-1β

voltou a aumentar. A proteína IL-10 apresentou um significativo aumento nas 12

primeiras horas da ingestão de dieta hiperlipídica.

30

Figura 1: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de citocinas. Normalização por α-tubulina. (n≥6; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

A Figura 2 apresenta os resultados obtidos em ensaios de RT-PCR nos quais

mensuraram-se transcritos codificadores de proteínas envolvidas na resposta

inflamatória em hipotálamo de camundongos alimentados com ração ou HFD nos

tempos de 3, 6, 12, 24 horas e 3, 5 e 7 dias. Por este método, podemos notar um

aumento precoce da expressão gênica das citocinas pró-inflamatórias. Thaler já havia

descrito em 2012 um aumento da expressão gênica hipotalâmica das citocinas IL-6 e

TNF-α 24 horas após o início de consumo de dieta hiperlípica (Thaler et al., 2012). Seu

estudo mostrou que a diminuição na expressão da IL-6 ocorreu após 7 dias de

consumo de dieta e voltou a subir no 28º dia de exposição a dieta hiperlipídica. Já a

citocina TNF-α, apresentou uma diminuição após 3 dias de consumo e um posterior

aumento da expressão também no 28º dia de consumo da dieta (Thaler et al., 2012).

Nossos resultados mostram que a atividade inflamatória em resposta a HFD é ainda

mais precoce, sendo detectada apos 6 horas.

31

Citokines (mRNA)

0

1

2

3

4

IL-1

TNF-

IL-6

IL-10

Fractalkina

CTL 3H 6H 12H 24H 3D 5D 7D

*

**

** *

* *

Tempo

mR

NA

(re

lati

vo

ao

co

ntr

ole

)

Figura 2: Avaliação quantitativa por real-time PCR de transcritos envolvidos na inflamação, normalização

por GAPDH. (n≥6; *P<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

A elevação precoce e a persistência no incremento da expressão do transcrito

da fractalkina nos levou a realizar novo experimento com tempos mais curtos de

exposição à HFD. A Figura 3 mostra, por Western blot, que a expressão proteica de

fractalkina se eleva a partir de 3 horas apos o início do consumo de HFD.

Figura 3: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de fractalkina em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 3 horas, 6 horas, 5 dias ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n≥3; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

Portanto, o conteúdo de proteínas inflamatórias foi aumentado em

camundongos Swiss após horas de exposição à dieta hiperlipídica, sendo a fractalkina a

mais precoce – 3 horas. Porém, para esclarecer se a modulação da expressão de

32

proteínas inflamatórias se deve a uma maior proporção de ácido graxo na dieta ou a

um aumento na ingestão calórica, pois nos primeiros dias de oferta de HFD, os

camundongos apresentam um aumento na ingestão calórica (Figura 4), fizemos um

experimento em que foi oferecido somente a quantidade calórica de HFD igual àquela

consumida pelos camundongos controle alimentados com ração. O grupo de

camundongos alimentados somente com HFD sem limite de ingestão calórica foi

denominado ad libitum. Enquanto o grupo ao qual ofertamos HFD em equivalência

calórica com o grupo ração foi denominado pair feeding. O experimento teve sub-

grupos avaliados após 12 e 24 horas e 3 dias de exposição a HFD (Figura 5).

Raç

ão

1º D

ia-H

FD

2º D

ia-H

FD

3º D

ia-H

FD

7º D

ia-H

FD

14º D

ia-H

FD

21º D

ia-H

FD

0

10

20

30

40

HFD

Ração

*

* * *

*

Co

nsu

mo

de d

ieta

(kcal/

dia

)

Figura 4: Ingestão calórica em 24 h de camundongos com oferta ilimitada de ração ou dieta hiperlipídica (HFD) (n=20; *p<0,05 vs. controle – linha tracejada).

Este experimento revelou que algumas proteínas eram moduladas

positivamente principalmente em decorrência da quantidade de calorias ingeridas (IL-

10 e TNF-α), enquanto, pelo menos uma, IL-6, era estimulada pela simples presença de

proporções mais elevadas de ácidos graxos na dieta (Figura 5).

33

Figura 5: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de IL-10 (a), TNF-α (b) e IL-6 (C) em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica (HFD) sem restrição quantitativa (ad libitum) ou com quantidade igual aquela consumida por camundongos alimentados com ração (pair feeding). Os tempos de oferta de ração foram 12 horas para IL-10, 3 dias para TNF-α e 24 horas para IL-6. Normalização por α-tubulina (n=4; *p<0,05 vs. HFD ad libitum).

O impacto do consumo da HFD no desenvolvimento da resposta a proteínas

mal enoveladas

Estudos pregressos haviam demonstrado que o consumo de excesso de ácidos

graxos na dieta pode causar o acúmulo de proteínas mal enoveladas no retículo

endoplasmático e gerar uma condição conhecida como estresse do retículo

endoplasmático (ER stress) (Brodsky et a., 2012). Numa tentativa de restabelecer a

integridade funcional do ER, uma resposta celular, conhecida como unfolded protein

response (UPR) é ativada na célula em ER stress (Schönthal et al., 2012). E as principais

proteínas da membrana do RE envolvidas na indução da UPR são PERK, ATF6 e Ire1

(Lumeng et al., 2007) (Figura 6).

34

Figura 6: Vias de sinalização em resposta ao ER stress (Adaptado de Axel H. Schönthal et al., 2012).

A indução de ER stress muitas vezes é precedida pela modulação da expressão

de chaperonas do retículo. Neste estudo utilizamos PCR em tempo real para avaliar o

impacto do consumo de HFD na expressão de transcritos de duas chaperonas do

retículo, GRP78 e GRP94. A Figura 7 mostra que ambas as chaperonas apresentam

aumento de expressão de seus transcritos entre 3 horas e 3 dias após o início do

consumo de HFD. A seguir utilizamos a técnica de Western blot para avaliar a dinâmica

temporal da expressão de GRP78. Para tal, camundongos foram alimentados com

ração convencional ou HFD por diferentes períodos de tempo e extratos proteicos do

hipotálamo foram utilizados nos experimentos. O conteúdo proteico da chaperona

GRP78 apresentou um aumento significativo a partir de 6 horas de exposição à HFD,

sugerindo uma resposta a proteínas mal enoveladas no interior do retículo

endoplasmático (Figura 8).

35

CHAPERONAS

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

GRP94

GRP78

* * * *p=0,066 **

* *

CTL 3H 6H 12H 24H 3D 5D 7D

Tempo

mR

NA

(re

lati

vo

ao

co

ntr

ole

)

Figura 7: Avaliação quantitativa por real-time PCR de transcritos de GRP78 e GRP94, normalização por GAPDH. (n≥6; *P<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

Figura 8: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de GPR78 em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n=8; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

36

Após a liberação da Grp78 do ATF6, um mecanismo de ativação é disparado.

Então o ATF6 desligado da Grp78 transloca-se para o aparelho de Golgi, onde

proteases residentes o clivam e liberam o fator de transcrição ativo no citosol. Um dos

alvos do ATF6 ativo é o gene do XBP-1 (Ye et al., 2000). Num segundo momento, a IRE-

1α desempenha um papel essencial na reparação celular que visa adaptar a célula ao

acúmulo de proteínas mal enoveladas. Após sua ativação, esta enzima processa uma

região do mRNA do fator de transcrição XBP-1, que foi transcrito pela ação do ATF6. O

XBP-1, induz a expressão de genes relacionados ao aumento do processamento de

proteínas acumuladas no RE, na tentativa da retomada da homeostasia do RE. Ao

analisar proteínas da via de sinalização da IRE-1α, identificamos uma modulação

positiva desta proteína a partir do 3°dia de consumo de HFD, assim como um aumento

do XBP-1s no 7º dia de exposição à HFD (Figura 9). Se a ativação da IRE-1α persistir, o

XBP-1 produzido pelo seu processamento alternativo induz, tardiamente, a transcrição

do gene da proteína p58kip. Esta última exibe notável atividade inibidora sobre a PERK,

liberando, desta forma, a tradução de diversos mRNAs que se acumularam na célula

durante a UPR, inclusive CHOP, a qual tem um papel determinante na apoptose

desencadeada pela UPR (Rao et al., 2004).

37

Figura 9: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de IRE1a (a) e XBP1s (b) em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n=6; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

Ao analisarmos a via da PERK, verificamos diferenças no conteúdo proteico da

CHOP apenas com 12 horas de exposição à HFD (Figura 10). O perfil de modulação

proteica da proteína ATF4 foi tardio, pois houve apenas uma tendência no aumento de

sua expressão proteica no 7º dia de exposição à HFD.

O aumento da expressão proteica de ATF6 ocorreu a partir do 7º dia de

exposição à HFD, embora já apresentasse uma tendência de aumento com 5 dias

(p=0,08) (Figura 11). Portanto, dentre as 3 proteínas presentes na membrana do

retículo endoplasmático, envolvidas da UPR e estresse de retículo, a ATF6 apresentou

um aumento mais tardio, sugerindo que com 7 dias de exposição à HFD a célula

apresenta um sinal consistente de indução de estresse de retículo endoplasmático,

uma vez que neste mesmo período de tempo, várias outras proteínas também se

apresentam com conteúdo aumentado.

Diante destes resultados fica claro que a inflamação precede o estresse de

retículo após a exposição à dieta hiperlipídica.

38

Figura 10: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de pPERK (a), eif2a (b), ATF4 (c) e CHOP (d) em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias (em a e c) ou 12 horas, 24 horas ou 3 dias (em b e d). Normalização por α-tubulina. (n≥3; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

Figura 11: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de ATF6 em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n=8; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

39

O impacto do consumo da HFD no desenvolvimento de alterações

mitocondriais no hipotálamo

Na última parte do estudo avaliamos o impacto do consumo da HFD em

aspectos morfológicos e funcionais das mitocôndrias no hipotálamo. A proteína

mitofusina 2 (MFN2) está envolvida, juntamente com as proteínas OPA-1 e mitofusina

1 (MFN1), na regulação da fusão de mitocôndrias (Parra et al., 2011). Além disso, a

MFN2 desempenha um papel importante na conexão entre a mitocôndria e o retículo

endoplasmático rugoso (Boland et al., 2013). As mitocôndrias têm quatro

compartimentos: a membrana mitocondrial externa (OMM), o espaço intermembranar

(IMS), a membrana mitocondrial interna (IMM), e a matriz mitocondrial (Scheffler et

al., 2001). MFN1 e MFN2 estão localizadas na OMM, onde participam da regulação da

fusão da OMM enquanto OPA-1 localiza-se na IMM, onde participa da regulação da

fusão de IMM (Zorzano et al., 2010). A região C-terminal das proteinas MFN1 e MFN2

tem uma conformação espiral enrolada e desempenha papel importante ao

estabelecer a comunicação entre mitocôndrias através de complexos homo ou

heterotípicos formados entre mitocôndrias adjacentes. Essa interação medeia a fusão

da OMM e participa da fixação e fusão de IMM (Chiong et al., 2014). A Figura 12 ilustra

a participação de MFN1, MFN2 e OPA-1 no processo de fusão de mitocôndrias.

Figura 12: Representação esquemática da participação das proteínas mitofusina-1 (MFN-1), mitofusina-2 (MFN2) e OPA-1 na dinâmica da fusão mitocondrial (Adaptado de Chiong et al., 2014).

40

Por meio de Western blot (Figura 13), observamos que a MFN2 sofre uma

redução da sua quantidade proteica no hipotálamo após 24 horas de exposição à HFD.

Após 3 e 5 dias seus níveis proteicos retornam ao normal e, finalmente, com 7 dias há

aumento da expressão hipotalâmica de MFN2 em camundongos alimentados com

HFD.

Figura 13: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de MFN2 em camundongos alimentados com ração (CTL) ou dieta hiperlipídica por 6, 12 ou 24 horas, 3, 5 ou 7 dias. Normalização por α-tubulina. (n=8; *p<0,05 vs. respectivo controle – linha tracejada).

Questionamos a seguir, se as alterações de expressão hipotalâmica de MFN2 se

devem à ingestão calórica ou à presença de uma proporção maior de ácidos graxos na

dieta. Para responder a esta pergunta, repetimos o protocolo de pareamento de

ingestão calórica, como na Figura 5, e avaliamos a expressão hipotalâmica de MFN2

por Western blot. A Figura 14 mostra que não existem diferenças significativas no

padrão de expressão proteica da MFN2 quando limitamos a quantidade de Kcal

ingeridas por dia, sugerindo que a modulação de MFN2 se deve predominantemente a

presença do ácido graxo na dieta e não à quantidade calórica ingerida.

41

Figura 14: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de mitofusina 2 (MFN2) em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica (HFD) sem restrição quantitativa (ad libitum) ou com quantidade igual aquela consumida por camundongos alimentados com ração (pair feeding). Os tempos de oferta de ração foram 12 horas, 24 horas ou 3 dias. Normalização por α-tubulina (n≥4).

As alterações de níveis proteicos de MFN2 nos levaram a aventar a hipótese

que a HFD pudesse alterar aspectos funcionais das mitocôndrias hipotalâmicas. Para

explorar esta hipótese utilizamos o equipamento Oroboros para determinar aspectos

da respiração mitocondrial em fragmentos de hipotálamo obtidos de camundongos

alimentados com ração ou com HFD por 24 horas ou 7 dias. Os fragmentos de

hipotálamo foram inicialmente tratados com saponina, que é um detergente utilizado

para permeabilizar as células fazendo com que os compostos químicos utilizados no

experimento possam ter acesso às mitocôndrias. A primeira etapa, após a

permeabilização, foi a adição dos substratos para o complexo 1 da membrana interna

mitocondrial – malato e piruvato (MP). A segunda etapa foi a adição de ADP ao

sistema. A terceira etapa consistiu na adição de oligomicina, um inibidor da ATP-

sintase. A quarta e última etapa consistiu na adição da rotenona, um inibidor do

complexo 1 da cadeia fosforilativa mitocondrial. A Figura 15 mostra que o consumo de

HFD não resultou em modificações da respiração mitocondrial no hipotálamo de

camundongos.

42

Figura 15: Respiração mitocondrial em fragmentos do hipotálamo de camundongos alimentos com ração (CTL) ou pro 1 ou 7 dias com HFD (n=6). PM, piruvato e malato; ADP, difosfato de adenosina; OLIG, oligomicina; ROT, rotenona.

Como a nossa hipótese de que alteração dos níveis proteicos de MFN2 poderia

se associar a alteração funcional da mitocôndria se revelou nula, decidimos, a seguir

avaliar por meio de microscopia eletrônica de transmissão, o número de contatos

entre mitocôndrias e o retículo endoplasmático rugoso. Estudos anteriores haviam

demostrado que tais contatos podem ser afetados em neurônios hipotalâmicos de

animais obesos (Schneeberger et al., 2013). Assim camundongos foram alimentados

com ração ou HFD por 1, 3, 5 ou 7 dias e o hipotálamo foi obtido para as respectivas

análises. A Figura 16 mostra com pequeno aumento que os contatos podem ser

facilmente identificados em neurônios de camundongos de diferentes grupos.

Figura 16: Microscopia eletrônica de transmissão mostrando os contatos entre as mitocôndrias

e o retículo endoplasmático (seta vermelha) em camundongos submetidos a 24 horas e 3 dias de HFD e

no grupo controle alimentado com ração.

43

A Figura 17 mostra com maior detalhe um contato entre mitocôndria e o

retículo endoplasmático rugoso.

Figura 17: Microscopia eletrônica mostrando detalhes do contato entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático (seta vermelha) em camundongos submetidos à 3 dias de HFD.

A Figura 18 ilustra múltiplos contatos de uma forma mais clara. Para tal,

mitocôndrias foram preenchidas com a cor púrpura e o retículo endoplasmático

rugoso marcado em amarelo. As mitocôndrias que fazem contato com o retículo são

marcadas com um asterisco vermelho.

Figura 18: Microscopia eletrônica de transmissão mostrando uma representação dos contatos entre as mitocôndrias e o retículo endoplasmático em camundongos submetidos a 3 dias de HFD e grupo controle com ração. Mitocôndria (púrpura), Retículo endoplasmático (amarelo) e contatos de mitocôndria com retículo (asterisco vermelho).

44

A seguir contabilizamos o número de contatos relativo ao número total de

mitocôndrias em neurônios hipotalâmicos de camundongos alimentados com ração ou

com HFD por 1, 3, 5 ou 7 dias. A Figura 19 mostra que houve uma redução significativa

de contatos a partir de 3 dias de alimentação com HFD.

CTL

1 Dia

HFD

3 Dia

s HFD

5 Dia

s HFD

7 Dia

s HFD

0

10

20

30

40

50

*

*

*

% M

ito

cô

nd

ria-R

E /

Mit

ocô

nd

ria t

ota

l

Figura 19: Proporção do número de contatos entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático em neurônios hipotalâmicos de camundongos alimentados com ração ou com HFD por 1, 3, 5 ou 7 dias (n=3; *p<0.05 vs. respectivo controle alimentado com ração - linha tracejada).

O impacto da inibição de TNF-α e ER stress na expressão de MFN2, GPR78, IL-

6 e IL-10 no hipotálamo de camundongos alimentados com HFD

A avaliação de variação temporal de marcadores de inflamação, ER stress e

anomalias mitocondriais revelou que os eventos hipotalâmicos mais precoces que

decorrem do consumo de HFD são as elevações nas expressões proteicas de fractalkina

e GPR78, sugerindo que distúrbios inflamatórios e alterações do retículo

endoplasmático sejam os primeiros a serem afetados pelo consumo de quantidades

elevadas de ácidos graxos. Para avaliar o impacto da resposta inflamatória e do ER

stress no distúrbio hipotalâmico induzido pelo consumo de HFD, camundongos foram

tratados com um inibidor de TNF-α, o anticorpo monoclonal imunoneutralizador,

infliximab, na concentração de 10mg/kg (Araújo et al., 2007), ou com uma chaperona

química capaz de inibir o ER stress, PBA, com concentração de 80mg/kg (Ayala et al.,

45

2012), e as expressões proteicas de MFN2, GPR78, IL-6 e IL-10 foram determinadas por

Western blot.

A Figura 20 mostra que o tratamento com infliximab aumentou a quantidade

proteica de MFN2 no hipotálamo de camundongos alimentados com HFD por 24 horas.

Houve ainda uma tendência a aumento da expressão de GPR78.

Figura 20: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de MFN2 e GPR78 em camundongos tratados com salina ou infliximabe (inflix) e a seguir alimentados por 24 h com dieta hiperlipídica. Normalização por α-tubulina. (n=7; *p<0,05 vs. salina + 1D HFD).

A Figura 21 mostra que o tratamento com PBA apresentou um aumentou na

quantidade proteica de MFN2 no hipotálamo de camundongos alimentados com HFD

por 24 horas.

Figura 21: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de MFN2 e GPR78 em camundongos tratados com salina ou PBA e a seguir alimentados por 24 h com dieta hiperlipídica. Normalização por α-tubulina. (n=7; *p<0,05 vs. salina + 1D HFD).

46

A Figura 22 mostra que o tratamento com PBA foi o suficiente para elevar mais

ainda a quantidade proteica de IL-6 quando camundongos são submetidos à 24h de

HFD. Quando os animais são tratados com infliximab e submetidos à 24h de HFD a

proteína IL-10 também apresenta um significativo aumento.

Figura 22: Avaliação quantitativa por Western blot da expressão hipotalâmica de IL-6 em camundongos tratados com salina ou PBA (a). (b) Avaliação de IL-10 em camundongos tratados com salina ou infliximabe (inflix) e a seguir alimentados por 24 h com dieta hiperlipídica. Normalização por α-tubulina. (n≥4; *p<0,05 vs. salina + 1D HFD).

Os resultados deste estudo mostram que o consumo de HFD resulta na indução

de inflamação, ER stress e alterações, predominantemente estruturais, das

mitocôndrias no hipotálamo de camundongos. A resposta inflamatória ocorre de

forma muito rápida, poucas horas apos o início do consumo de HFD. A elevação de

GPR78, apesar de não ser sinônimo de ER stress, revela que o retículo endoplasmático

rugoso dispõe de um eficiente mecanismo sensor para a presença de quantidades

elevadas de ácidos graxos na dieta, entretanto, marcadores clássicos de ER stress são

detectados apenas apos 3-7 dias de consumo da HFD. Por fim, no período analisado

neste estudo, 1-7 dias, não detectamos alterações funcionais das mitocôndrias.

Entretanto, com 24 h de exposição à HFD houve redução da expressão de MFN2 o que

foi seguido, após 3 dias, de uma redução nos contatos entre mitocôndrias e retículo

endoplasmático rugoso. Tendo por base estes resultados e os resultados de outros

47

estudos publicados previamente, propomos um mecanismo que explica as alterações

hipotalâmicas precoces induzidas pelo consumo de HFD.

O esquema na Figura 23 propõe que ao ativar o receptor TRL4, na membrana

plasmática, por conta do alto consumo de dieta hiperlipídica, há a sinalização precoce

de toda a cascata de reação desta via aumentando a quantidade de fatores de

transcrição, por exemplo, o NFκB, e desta forma aumentando a transcrição de

proteínas inflamatórias. Quando estas proteínas são liberadas das células, estas ativam

seus respectivos receptores celulares e também aumentam a transcrição de mais

proteínas inflamatórias formando um feedback positivo. Porém, essa produção é

modulada pela ação de proteínas anti-inflamatórias, por exemplo, IL-10. Mediante a

uma intensa transcrição proteica, há um acúmulo de proteínas mal enoveladas no

interior do retículo endoplasmático, sinalizando desta forma, a resposta a proteínas

mal enoveladas (UPR). Diante de uma ação inflamatória e de estresse de retículo, as

mitocôndrias começam a apresentar alterações já constatadas a partir do terceiro dia

de exposição à dieta hiperlipídica. Contudo, estes eventos são revertidos

transitoriamente por um período curto; porém, se a oferta de gordura saturada é

contínua e em alta quantidade, além destes três importantíssimos mecanismos

voltarem a se modificar outros fenômenos são desregulados podendo ocasionar danos

irreversíveis ao hipotálamo.

48

Figura 23: Quando o estímulo da HFD ativa o receptor TRL4 na membrana plasmática (MP), aumenta a

quantidade de NFκB, levando a um aumento de proteínas inflamatórias. Estas ao serem liberadas da

célula, ativam seus respetivos receptores formando uma reação de feed back positivo, que só é

modulada por ação de proteínas anti-inflamatórias. Diante de uma intensa produção proteica no

interior da célula, o RE fica saturado e desencadeia uma resposta ao estresse – a UPR. Uma vez essas

respostas ativadas, as mitocôndrias começam a apresentar alterações morfológicas e funcionais.

49

RESUMO DOS RESULTADOS DO ESTUDO

O consumo de dieta hiperlipíca rica em gordura saturada (HFD) promove uma

alteração precoce no conteúdo proteico da quimiocina fractalkina – 3 horas –

indicando que neste momento há um sinal para recrutamento de microglia para iniciar

uma resposta inflamatória. A chaperona GRP78 apresentou uma modulação positiva a

partir de 6 horas de consumo de HFD e se manteve elevado por quase todo o tempo

avaliado, com exceção do quinto dia, sugerindo uma resposta a proteínas mal

enoveladas no interior do retículo endoplasmático (RE). A proteína IL-10 teve um pico

de conteúdo proteico em 12 horas de ingestão de HFD e uma gradativa redução nos

dias subsequentes, porém no sétimo dia de alimentação com HFD o conteúdo proteico

aumentou novamente. Em 24 horas de ingestão de HFD verificamos uma resposta bem

característica e pertinente da inflamação, pois houve uma modulação positiva nas

proteínas IL-10, IL-6, IL-1β e TNF-α. Concomitante a este evento, constatamos a

redução no conteúdo proteico da proteína MFN2 e um aumento no sétimo dia de

consumo da dieta. Esta alteração no conteúdo de MFN2 não se acompanhou de

alterações na respiração mitocondrial nos mesmos períodos, porém, há uma redução

no número de contatos de mitocôndria com o retículo endoplasmático a partir do

terceiro dia à exposição da dieta. As vias de estresse de retículo (ER stress),

apresentaram alterações significativas a partir de 3 dias de consumo de HFD com a IRE-

1α, porém, em 7 dias houve um sinal bem claro de estresse com o conteúdo

aumentado de várias outras proteínas – ATF6, XBP-1, GRP78 e tendência no ATF4

(Figura 24).

Figura 24: Esquema temporal dos eventos gerados após consumo de HFD.

50

Verificamos ainda, a inter-relação entre os 3 mecanismos – inflamação, ER

stress e alterações mitocôndrias. Quando os animais foram tratados com infliximab e

submetidos a 24 horas de HFD, houve um aumento da quantidade proteica de MFN2,

GRP78 e IL-10, quando comparamos com o grupo tratado com salina e HFD e quando

foram tratados com PBA e submetidos a 24 horas de HFD, houve um aumento proteico

de MFN2 e IL-6, entretanto, a expressão de GRP78 permaneceu inalterada.

51

CONCLUSÃO

A inflamação precede o estresse de retículo e alterações mitocôndrias no

hipotálamo de animais submetidos à dieta hiperlipídica. Além de confirmar a inter-

relação entre os 3 mecanismos – inflamação, ER stress e alterações mitocôndrias – na

obesidade, pois quando utilizamos fármacos para inibir a ação do TNF-α ou o ER stress,

verificamos alterações e reversão de alguns dos marcadores que antes se

apresentavam modificados com exposição à HFD. Assim, nossos resultados demostram

a dinâmica de expressão de alterações nos processos inflamatórios, de ER stress e de

alterações mitocondriais no hipotálamo durante a gênese da obesidade. Os resultados

deste estudo oferecem um avanço na compreensão do distúrbio hipotalâmico na

obesidade e pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para a

prevenção e tratamento da obesidade.

52

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ANEXOS

Certificado de aprovação do comitê de ética para o uso de animais para pesquisa.