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INSTITUTO AGRONÔMICO DE PERNAMBUCO
SEGRETARIA DE AGRICULTURA E REFORMA AGRÁRIA DE
PERNAMBUCO
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO, ESTUDO
MOLECULAR E BIOCONTROLE DE FUNGOS DE SOLO
EM FEIJOEIRO COMUM (Phaseolus vulgaris L.)
RECIFE
2011
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1. IDENTIFICAÇÃO DA PROPOSTA
O feijão é uma leguminosa predominantemente autógama e sua cultura possui
grande importância econômica e social no Brasil, constituindo a principal fonte de
proteína vegetal e ferro na alimentação humana. Sabe-se que o feijoeiro é considerado
sensível tanto ao déficit quanto ao excesso de água no solo e sua produtividade é afetada
por diversos fatores, como por exemplo, as doenças, com destaque para as causadas por
fungos do solo, que podem causar prejuízos severos. Várias ferramentas têm sido
utilizadas para contribuir com o conhecimento desses patógenos a partir do seu
inventário, como técnicas moleculares e o controle integrado, usando outros fungos,
extratos vegetais e a resistência genética, dentre outras. Os marcadores moleculares
vêm sendo utilizados para caracterizar diversidade genética em populações de fungos
fitopatógenos, podendo ser utilizados na avaliação das relações filogenéticas intra e
interespecíficas, identificação de raças e patógenos. A partir do desenvolvimento da
PCR (reação em cadeia da polimerase) novas técnicas moleculares permitiram a análise
de polimorfismos em diferentes grupos de organismos, como os marcadores
moleculares ITS e ISSR que auxiliam na criação de bancos de dados de perfis genéticos
para fins diagnósticos mais rápidos e precisos, além de ajudar na estratégia de controle
de doenças. O método mais utilizado para controle de doenças no campo ainda é o
controle químico, porém o seu uso contínuo e indiscriminado tem oferecido riscos
ambientais e à saúde humana e de animais. Sendo assim, a demanda por novas
tecnologias está se tornando cada vez mais importante para o controle de doenças e
pragas, como é o caso do controle alternativo, utilizando-se extratos vegetais, óleos
essenciais e outros derivados naturais. Do exposto, esse trabalho tem como objetivo
fazer um inventário de fungos de solo que incidem sobre o feijoeiro comum e caupi,
determinar a variabilidade genética de seus patógenos, fazer um estudo molecular
comparativo entre os patógenos comuns às duas espécies vegetais, verificar a inibição
dos isolados fúngicos por extratos vegetais e por Trichoderma sp. Como se sabe, os
fungos do gênero Trichoderma são capazes de agir como agentes de controle de
doenças de várias plantas cultivadas e de atuar como promotores de crescimento e
indutores de resistência de plantas a doenças. O trabalho será realizado no Centro de
Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE), sendo que algumas atividades de apoio
poderão ser executadas na Sede do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA). As
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amostras de feijoeiro com sintomas de doença serão coletadas em todas as áreas de
produção do estado. Em laboratório, serão desinfestadas com hipoclorito de sódio e
pequenos fragmentos de caules e raízes serão transferidos para placas de Petri, contendo
meio de cultura BDA. Para a identificação dos fungos, serão avaliados os aspectos
macroscópicos e microscópicos dos isolados. Além disso, será feita a caracterização
genética de todos os fungos testados nos bioensaios, utilizando-se os marcadores
moleculares ISSR (Internal Simple Sequence Repeat) e análise das regiões ITS (Internal
Transcribed Spacer de DNAr), visando observar as relações filogenéticas entre os
isolados, confrontando com suas identificações taxonômicas. Bioensaios com extratos
de plantas medicinais e espécies de Trichoderma serão conduzidos, visando o controle
alternativo dos fungos isolados. Espera-se que a principal contribuição dessa proposta
seja a elaboração e a disponibilização para o estado de Pernambuco de um inventário de
fungos do solo, de baixo custo e capaz de contribuir para o controle dos patógenos que
afetam o feijoeiro.
Coordenador: ANTONIO FÉLIX DA COSTA (D.Sc. em Fitopatologia - IPA)
2. QUALIFICAÇÃO DO PRINCIPAL PROBLEMA A SER ABORDADO
O feijão é uma leguminosa predominantemente autógama, domesticada há mais
de 7.000 anos e vem de dois centros de origem: o Mesoamericano (México e América
Central) e o da Região Andina. Acredita-se que o feijão tenha se manifestado
inicialmente como erva daninha em cultivos de mandioca e batata-doce na América
Central. Durante milênios, os agricultores cultivaram misturas complexas de tipos de
feijão como cerca viva contra seca, doenças e ataques de pragas. Esse processo produziu
uma variabilidade genética muito grande, com uma variedade grande de cores, textura e
tamanho de grãos, vindo ao encontro das condições de plantio e preferências de sabor,
em diferentes regiões (ARAGÃO & FARIA, 2005).
As culturas do feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) e do feijão-caupi (Vigna
unguiculata (L.) Walp., também chamado por feijão de corda ou macassar, possuem
grande importância econômica e social no Brasil, constituindo a principal fonte de
proteína vegetal e ferro na alimentação humana. Essas leguminosas fornecem quase
todos os aminoácidos essenciais, carboidratos, vitaminas e minerais, além de possuir
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grande quantidade de fibras dietéticas e baixa quantidade de lipídios (AKANDE, 2007;
MACHADO et al., 2008).
Dados disponíveis na FAO (2009) sobre a produção mundial de feijão no ano de
2007 indicam que o Brasil é o segundo maior produtor de feijão comum e o terceiro de
feijão-caupi, com uma área de 3,5 milhões de hectares plantados, enquanto o primeiro
lugar na produção do feijão comum é ocupado pela Índia, mesmo que de vários tipos, e
pela Nigéria para feijão caupi, com uma produtividade média de aproximadamente 732
Kg/ha e 417 kg/ha, respectivamente.
No Brasil, a região Nordeste corresponde à segunda maior produtora do feijão
comum, ficando atrás apenas da região Sul, (CONAB, 2009; LIMA et al., 2002). O
feijão caupi é a principal cultura de subsistência dessa região, especialmente no Sertão
Nordestino (LIMA et al., 2007). Essas culturas são consideradas excelentes opções
como fonte de matéria orgânica para recuperação de solos de baixa fertilidade, ou
esgotados pelo uso intensivo, muito comum no Nordeste. (TEÓFILO et al., 2008).
O feijoeiro adapta-se às mais variadas condições ambientais, o que possibilita
sua exploração sob diferentes sistemas de produção (FROTA et al., 2008; BRITO et al.,
2009). Contudo, sabe-se que o feijoeiro é considerado sensível tanto ao déficit quanto
ao excesso de água no solo (VALADÃO & KLAR, 1996) e sua produtividade é função
de diversos fatores, destacando-se as inter-relações entre solo-água-planta-atmosfera e
manejo da irrigação, visando à máxima produção e à boa qualidade do produto.
Além dos fatores citados acima, dentre os mais importantes na diminuição da
produtividade do feijoeiro, encontram-se as doenças, com destaque para as causadas por
fungos do solo, que podem causar prejuízos severos, com perdas de até 100%, com
diminuição das qualidades fisiológicas, nutricionais e sanitárias do produto colhido,
afetando o preço e sua comercialização (BIAZON, 2003). Os agentes causais dessas
doenças apresentam estruturas de resistência que os ajudam a sobreviver no solo por
vários anos. Esse grupo de patógenos se caracteriza por causar doença no sistema
radicular ou até mesmo na parte aérea das plantas (SARTORATO, 2007).
Dentre os fungos patogênicos ao feijoeiro presentes no solo, podem-se destacar
Sclerotium rolfsii Sacc, Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli J.B. Kendr. & W.C. Snyder,
F.solani f. sp. phaseoli (Mart.) Sacc., Rhizoctonia solani J.G. Kühn, Thanatephorus
cucumeris (A.B. Frank) Donk, Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid., Sclerotinia
sclerotiorum (Lib.) de Bary, Thielaviopsis basicola (Berk. & Broome) Ferraris,
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Phymatotrichum omnivora (Duggar) Hennebert,, e várias espécies de Phytium e outras
espécies de Fusarium (ABAWI & CORRALES, 1990).
As principais doenças do feijoeiro causadas por fungos habitantes do solo são
podridão do colo, murcha-de-fusarium, podridão radicular seca, podridão radicular de
rizoctonia, murcha da teia micélica (mela), podridão cinzenta do caule, mofo branco e
podridão por pitium. Dessas, as mais comuns em feijão-caupi são a murcha-de-fusarium
e a podridão radicular de rizoctonia (ATHAYDE SOBRINHO et al., 2005).
A podridão do colo é importante e freqüentemente observada em áreas quentes,
subtropical e tropical, onde se cultiva o feijoeiro comum (P. vulgaris). Essa doença é
causada por Sclerotium rolfsii Sacc. que sobrevive no solo sob forma de escleródios por
períodos de um a três anos. Tal fungo possui a capacidade de competição saprofítica e
produz elevado número de escleródios, tornando difícil seu controle (DANTAS et al.,
2002).
O agente causal da murcha ou amarelecimento de fusarium é o fungo Fusarium
oxysporum Schlecht f. sp. phaseoli. Esse patógeno produz microconídios,
macroconídios e clamidósporos. Os sintomas dessa doença manifestam-se por perda de
turgescência, amarelecimento, seca e queda progressiva das folhas, além de um
escurecimento do sistema vascular da planta, da base até os ramos laterais.
As podridões radiculares incitadas por R. solani e de F. solani f. sp. phaseoli são
doenças tipicamente destrutivas, pois maceram os tecidos. R. solani forma tufos de
micélio conhecidos como colchões de infecção que são caracterizados pela maceração
dos tecidos localizados abaixo do nível do solo. No córtex, desenvolve-se uma reação
do hospedeiro mediante a concentração de compostos fenólicos que lignificam as
células adjacentes aos tecidos infectados, promovendo, assim, a cicatrização da área
afetada. Enquanto que, para o F. solani, o processo de patogênese desenvolve-se a partir
de abertura e/ou ferimentos provocados por outros organismos, quando toda raiz é
afetada.
A mela do feijoeiro foi inicialmente descrita tendo como agente etiológico
Rhizoctonia solani, porém atualmente a denominação aceita é Thanatephorus cucumeris
(Frank) Donk. Esse fungo apresenta frutificações brancas, com himênio descontínuo,
formado por um conjunto de basídios. Essa enfermidade afeta toda a parte aérea da
planta e apresenta basicamente dois tipos de sintomas: o produzido por micélio e
escleródio e o produzido por basidiósporos. Os sintomas iniciais aparecem nas folhas
como pequenas manchas aquosas, arredondadas, de cor mais clara que a parte sadia. À
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medida que a infecção progride, ocorre uma intensa produção de micélio de cor
castanho-clara, em ambas as faces da folha, unindo folhas, pecíolos, flores e vagens,
como se fosse uma teia de aranha.
O agente etiológico do mofo branco é o fungo Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de
Barry, que sobrevive principalmente na forma de escleródios. A infecção causada pelas
hifas decorre do contato direto dos tecidos suscetíveis com o micélio no solo. Os
ascósporos produzidos nos apotécios são expelidos forçadamente sob a folhagem do
hospedeiro, germinam e desenvolvem-se tanto sobre tecidos mortos (folhas,
inflorescências caídas no solo) como sobre os tecidos da planta.
A podridão cinzenta do caule é uma doença importante no Nordeste do Brasil,
onde as lavouras estão sujeitas a estresses, principalmente hídrico. Macrophomina
phaseolina (Tassi) Goldi, o agente causal da podridão cinzenta do caule, é um habitante
natural do solo, de grande variabilidade patogênica e alta capacidade de sobrevivência
sob condições adversas. Os prejuízos à cultura do feijão são determinados pela
diminuição do estande, do desempenho produtivo das plantas e da baixa qualidade da
semente produzida quanto ao vigor e sanidade.
Em alguns casos há sinergismo entre esses organismos que causam as doenças.
Nesse caso, os danos produzidos podem ser maiores, ou seja, a interação pode produzir
um dano ainda maior à cultura do que quando isoladamente (BEEBE, 1981).
Os marcadores moleculares vêm sendo utilizados para caracterizar diversidade
genética em populações de fungos fitopatógenos, podendo ser utilizados na avaliação
das relações filogenéticas intra e interespecíficas, identificação de raças e patógenos,
bem como, auxiliar a caracterização de fungos e taxonomia (NOZAKI et al., 2006).
Com o desenvolvimento da PCR (reação em cadeia da polimerase), a partir de
moléculas de DNA, novas técnicas moleculares permitiram a análise de polimorfismos
em diferentes grupos de organismos. Dentre elas podem ser citados os marcadores
moleculares ITS (Internal Transcribed Spacer) e ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
(FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Esses marcadores são ótimas ferramentas
para a criação de bancos de dados de perfis genéticos para fins diagnósticos mais
rápidos e precisos (FUNGARO, 2000). Tais técnicas moleculares apresentam-se como
uma alternativa aos métodos tradicionais, pois analisam o genoma independentemente
do estado fisiológico do organismo e são suficientemente sensíveis para distinguir
espécies estreitamente relacionadas. Além disso, estudos genéticos de microrganismos
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também são realizados, visando auxiliar na estratégia de controle de doenças (SMITH &
REGISTER, 1998).
Nilson et al. (2009) apresentam a região ITS (Internal Transcribed Spacer)
como a sequência nucleotídica mais utilizada para sistemática e taxonomia de fungos no
nível de gênero e espécie. Tal seqüência compreenderia cerca de 650 pb divididas em
sub-regiões denominadas ITS1, ITS2 e o gene 5,8S ribossomal. As sequências ITS1 e
ITS2 são empregadas na discriminação espécie específica e possuem variabilidade e
comprimentos relativamente semelhantes. Diferentes autores têm demonstrado a
utilização de marcadores ITS na identificação de genótipos, no estudo da variabilidade
genética, na discriminação entre isolados quanto à taxonomia e na localização
geográfica dos fungos (PANTOU et al., 2003; REHNER & BUCKLEY, 2005;
VELÁSQUEZ et al., 2007; INGLIS et al., 2008; KOUVELIS et al., 2008).
Oliveira & Costa (2002), estudando a variabilidade genética de Fusarium
solani, conseguiram, por meio de técnicas moleculares, diferenciar formae speciales em
soja e feijoeiro. Cavalcante (2005), utilizando técnica de ISSR e a região ITS do rDNA,
separou todos os isolados de C. gloeosporioides de mangueiras dos isolados de cebola.
Os trabalhos encontrados na literatura são estudos envolvendo análise da
variabilidade genética, estudo de populações e comparação de isolados de uma espécie
de fungo proveniente de culturas diferentes ou de uma mesma cultura de diferentes
regiões (PLOETZ et al., 2005; SHARMA et al., 2005; JULIATTI et al., 2006; CASTRO
2007; NUNES et al., 2009). Entretanto, não se encontraram relatos referentes ao
emprego de marcadores moleculares na comparação de fitopatógenos provenientes de
variedades de uma mesma cultura, como por exemplo, nas variedades de feijão comum
e caupi, tornando necessário o conhecimento da diversidade, distribuição, estruturas
destas comunidades fúngicas e variações na sequência desses isolados.
O método mais utilizado para controle de doenças no campo ainda é o controle
químico, porém o uso contínuo e indiscriminado desses produtos tem oferecido riscos
ambientais e à saúde humana e animal. Sendo assim, a demanda por novas tecnologias
que respeitem o ecossistema e não ofereçam riscos de contaminação estão se tornando
cada vez mais importantes para o controle de doenças e pragas. Uma dessas práticas é o
controle alternativo, utilizando-se extratos vegetais, óleos essenciais e outros derivados
naturais. A utilização de produtos naturais na agricultura tem suas vantagens,
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principalmente em função da baixa toxidez e da rápida degradação, tendo como
resultado uma agricultura menos dependente de agrotóxico (GHINI & KIMATI, 2000;
BERNARDO et al., 2002; FARIAS et al., 2004).
Nesse contexto, Lobato et al. (2006) avaliaram o efeito do óleo de Piper
aduncum L., rico em Dilapiol, em sementes de feijão-caupi, que apresenta uma
substância que vem sendo testada com êxito como fungicida, moluscicida, acaricida,
bactericida e larvicida com a vantagem de ser um produto biodegradável. Por outro
lado, Silva et al. (2009) avaliaram o efeito de extratos de alho, angico e manjericão,
isolados ou combinados entre si e ou em associação ao fungicida Mancozeb, no controle
de F. oxysporum f. sp tracheiphilum, proveniente de sementes de caupi, comparando-se
com o efeito do fungicida químico, onde observaram que o extrato de manjericão teve
ação fungicida. Já o fungicida Mancozeb associado ao extrato de angico proporcionou
uma baixa severidade nas plantas avaliadas.
Além da utilização de extratos de plantas como um controle alternativo contra
fitopatógenos, é lembrada também a aplicação de algumas espécies de fungos no
biocontrole. Os fungos do gênero Trichoderma são de grande importância econômica
para a agricultura, uma vez que são capazes de atuarem como agentes de controle de
doenças de várias plantas cultivadas, promotores de crescimento e indutores de
resistência de plantas a doenças (MOHAMED & HAGGAG 2006, FORTES et al.,
2007). Algumas linhagens desses fungos vêm recebendo grande atenção da pesquisa,
também, por sua versatilidade de ação. Essas são capazes de produzir enzimas que
degradam paredes celulares de outros fungos e produzem também substâncias
antifúngicas (antibióticos) (LOUZADA et al., 2009).
Devido aos prejuízos econômicos causados pelos patógenos de solo que
infectam o feijoeiro comum e caupi, à falta do real conhecimento de sua dimensão no
estado e à escassez de métodos de controle eficientes, econômicos e limpos, é de suma
importância o estudo dos fungos de solo que atacam essas culturas, pelo conhecimento
da sua variabilidade genética, o controle por outros fungos e inibição por extratos
vegetais, objetivando minimizar os danos por eles causados ao feijoeiro, além de reduzir
os efeitos sobre o ambiente pelo não uso de defensivos químicos. As informações
geradas nesse projeto contribuirão para a melhoria dos programas de melhoramento do
feijoeiro e para a redução das perdas ao produtor rural, com aumento da geração de
emprego e renda no setor do agronegócio do feijão em Pernambuco. Além disso, essa
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linha de pesquisa poderá ser aprofundada com a realização de novas pesquisas,
especialmente nas áreas de biologia molecular, avaliação de cultivares para resistência a
esses fungos e melhoramento genético, controle biológico e integrado, além de
formação de recursos humanos.
3. OBJETIVOS E METAS A SEREM ALCANÇADOS
3.1 Objetivo Geral
Fazer um inventário de fungos de solo da cultura do feijão comum e do
feijão-caupi em Pernambuco, determinar o seu perfil molecular, verificar a
inibição dos isolados fúngicos por extratos vegetais e por linhagens de
Trichoderma.
3.2 Objetivos Específicos
Isolar e identificar fungos do solo de feijoeiro comum e macassar com
sintomas de doença;
Extrair o DNA dos fungos isolados;
Analisar os perfis de amplificação dos isolados utilizando o
polimorfismo de fragmentos de restrição dos produtos de amplificação
da região ITS do locus do rDNA;
Obter o perfil molecular dos fungos isolados por meio de sequências ITS
e ISSR;
Comparar molecularmente as espécies dos fungos patogênicos comuns a
ambas as culturas;
Avaliar o efeito da inibição dos isolados por extratos de alho, alecrim,
arruda e gengibre.
Avaliar o efeito antagonista dos fungos isolados do solo com espécies de
Trichoderma.
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3.3 Metas
Coletar e identificar fungos de solo em todas as regiões produtoras de feijão
por um período de três anos;
Extrair o DNA dos fungos em estudo a partir de julho de 2012;
Selecionar primers, amplificar e analisar os resultados de ISSR até dezembro
de 2012;
Amplificar e analisar os resultados de ITS após o 13° mês;
Obter extratos vegetais até o 16º mês da pesquisa;
Avaliar a ação antagonista por espécies de Trichoderma até o 22º mês da
pesquisa;
Elaborar relatório final do projeto e publicar artigos até o 24º mês da
pesquisa.
4. METODOLOGIA A SER EMPREGADA
4.1 Locais de coleta e Realização dos Experimentos
Os trabalhos serão realizados no Laboratório de Biologia Molecular do Centro
de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE), com algumas atividades de apoio,
no de Fitopatologia do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA). As amostras serão
coletadas nas regiões produtoras do Araripe, do São Francisco, do Agreste Meridional,
Setentrional e Vale do Ipojuca.
4.2 Isolamento, purificação das espécies e identificação dos isolados fúngicos
As amostras de feijoeiro com sintomas de doença serão levadas para os locais de
execução para posterior manipulação. O material vegetal obtido será desinfestado
superficialmente com hipoclorito de sódio. Com auxilio de um estilete esterilizado serão
retirados pequenos fragmentos de caules e raízes que serão transferidos para placas de
Petri contendo meio de cultura BDA (Batata Dextrose Agar) e incubados sob condições
de temperatura e luminosidade adequadas (MENEZES & SILVA, 1997).
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Para a identificação dos fungos serão avaliados os aspectos macroscópicos
(tamanho, cor e aspecto da colônia) e microscópicos dos isolados. Os isolados serão
inoculados, assepticamente, em placas de Petri contendo BDA e acompanhados por até
96h, para posterior identificação.
4.3 Obtenção de micélio para extração de DNA
Para a extração do DNA dos fungos em estudo, conídios provenientes de cada
isolado serão suspensos em três mL de solução Tween 80 (0,1%) e transferidos para
Erlenmeyer contendo 100 mL de meio mínimo líquido. Após a inoculação, os
Erlenmeyers serão mantidos sob agitação a 250 rpm, à temperatura ambiente
(aproximadamente 28oC), por 96 h para crescimento micelial. O micélio será filtrado
por filtração a vácuo, lavado com água destilada esterilizada e estocado a -20oC. A
extração do DNA será realizada de acordo com Raeder & Broda (1985), sendo o
mesmo, em seguida, ressuspenso em tampão TE e mantido a -20oC até o uso (BATISTA
et al., 2008).
4.4 Extração do DNA genômico
A massa micelial será triturada em nitrogênio líquido, em seguida transferida
para microtubos, aos quais será adicionado tampão de extração (Tris-HCl, NaCl, EDTA,
Dodecil Sulfato de Sódio), homogeneizada sob leve agitação manual e os microtubos
incubados a 65ºC por 30 min. Posteriormente, acetato de potássio será adicionado,
procedendo-se à homogeneização e centrifugação a 14.500g. Em seguida, retira-se o
sobrenadante e adiciona-se uma solução de clorofil e álcool isomílico, com nova
centrifugação a 14.500g. A fase aquosa será recuperada, adicionando-se isopropanol
resfriado a 4ºC para a precipitação do DNA. O precipitado será lavado com etanol a
70%, centrifugado por 10 min, seco à temperatura ambiente, ressuspendido em tampão
TE ( Tris-HCl e EDTA) e preservado sob refrigeração a -20ºC.
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4.5 Quantificação do DNA genômico
A concentração de DNA será estimada por meio de eletroforese em Gel de
agarose 0,8% a 3 V. cm-1 de distância entre os eletrodos, com o tampão de corrida Tris-
Borato-EDTA (TBE) 1 X, por comparação com o marcador de peso molecular DNA de
fago lambda λ. Após a eletroforese, o gel será corado em solução de brometo de etídio
durante 30 minutos, observado em transiluminador de luz ultravioleta e fotografado
(SAMBROOK et al., 1989).
4.6 Análise da diversidade genética pelo uso de marcadores moleculares
Os primers correspondentes para amplificação serão oriundos do UBC primer
set 100/9 (University of British Columbia) de acordo com seleção prévia (ESTRADA et
al., 2007; LIANG et al., 2008). Para a reação PCR o volume total será de 20µl,
consistindo de 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 50 mmol/L KCl, 2 mmol/L MgCl2, 0,25
mmol/L dNTPs, 0,2 µmol/L primer, 0,75 U Ex Taq polimerase (INVITROGEN) e 10
ng DNA alvo. A reação de amplificação ocorrerá em termociclador, da seguinte forma:
5 min. 94oC, 40 ciclos de desnaturação 45s a 94oC, anelamento por 45s a 48oC~55oC (de
acordo com cada primer) e extensão 45s a 72oC; extensão final por 5 min. a 72oC
(LIANG et al., 2008). Os produtos de amplificação serão separados em gel de agarose a
1,5% em tampão 1x TBE (100 V por 35 min), corados com Syber 12P12an e
visualizados sob luz ultravioleta, com auxílio do fotodocumentador.
4.6.1 Análise dos dados ISSR
As bandas amplificadas pelos marcadores ISSR serão identificadas como presentes
ou ausentes, sendo denominado “1” para presença e “0” para ausência. Essa
identificação será utilizada para a formação de um fenograma pelo método UPGMA. O
software utilizado será o MEGA 5.0. (BATISTA et al., 2008; LIANG et al., 2008).
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4.6.2 Análise dos dados de ITS
A amplificação da região ITS1-5,8S-ITS2 será realizada em termociclador, sendo a
programação a seguinte: 3 min. a 94oC para desnaturação inicial; 30 ciclos de 1 min.
para desnaturação a 94oC, 1 min. (na temperatura correspondente ao Tm do primer
usado) para anelamento e 2 min. a 72oC para extensão; 5 min. a 72oC para extensão
final. Cada reação será realizada em microtubos 0,5 mL com volume de 50 µl incluindo:
5 µl tampão de reação (20 mM Tris-HCL, pH 8.3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1%
Triton X-100), 100 µM de cada dNTP, 40 pmol de cada primer, 2U Taq polimerase
(INVITROGEN), 50ng DNA alvo e água ultra pura.
A digestão enzimática será realizada com os produtos de amplificação, Mix
contendo enzimas de restrição (separadamente: Mspl, HaeIII e DraI ) em tampão de
restrição específico. Após a incubação de 30 minutos a 7ºC com cada uma das três
enzimas, os fragmentos resultantes serão separados por eletroforese em gel de agarose a
1,5%, utilizando-se marcador de peso molecular 100pb, a 3V.cm-1 de distância entre os
eletrodos, imersos em tampão de corrida TBE 1X. Os fragmentos de restrição serão
corados em solução de brometo etídio, visualizados em transiluminador de luz UV e
fotografados.
A partir das análises dos dados obtidos da região ITS e dos marcadores
moleculares ISSR dos isolados em estudo, serão realizadas comparações entre os fungos
isolados, comuns às duas espécies (feijão e caupi).
4.7 Obtenção de extratos vegetais
Para obtenção de extratos vegetais serão utilizados bulbilhos de alho (Allium
sativum L.), folhas de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), arruda (Ruta graveolens L.) e
rizomas de gengibre (Zingiber officinale Roscoe), em três concentrações: 5%, 10% e
20%.
Para o extrato aquoso, o material será seco em estufa e posteriormente colocado em
Becker e sobre ele, água destilada fervente, na proporção de 1:4 p/v, respectivamente. A
mistura permanecerá em repouso por 2h e será filtrada. O produto filtrado será
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acondicionado em vidro âmbar. Este será mantido em refrigerador a 4ºC, até o momento
de utilização nos bioensaios (CELOTO et al., 2008).
Quanto ao extrato hidroetanólico, o material seco será triturado em liquidificador
contendo solução de etanol a 70%, e filtrado. Para evitar a interferência do etanol, este
será evaporado. Acrescentar-se-á água até o volume inicial e os extratos serão
acondicionados a 4ºC (CELOTO et al., 2008).
4.8 Análise da inibição por extratos de plantas medicinais
Ao meio de cultura BDA fundente autoclavado será adicionado, separadamente,
cada um dos extratos em diferentes concentrações e vertidos em placas de Petri. Discos
de cinco mm de diâmetro, contendo micélio dos fungos, serão transferidos para o centro
das placas, quando estas serão incubadas a 25ºC na ausência da luz. Os mesmos
isolados serão inoculados em Placas de Petri contendo BDA sem adição de extratos para
servirem de testemunha. O bioensaio será instalado em três repetições, em blocos
inteiramente casualizados, tendo os extratos como tratamentos, onde será feita a
medição do crescimento radial da colônia em dois eixos ortogonais, sendo
posteriormente calculada a média (DOMINGUEZ et al., 2009). As medidas serão
calculadas pela percentagem de inibição do crescimento micelial de acordo com
Edginton et al. (1971).
4.9 Obtenção dos isolados de Trichoderma
As espécies de Trichoderma serão provenientes de solos com plantios de feijão
comum no Estado de Pernambuco. Para o isolamento das espécies de Trichoderma será
utilizado o meio seletivo TSM (0,12 g de KH2PO4; 0,26 g de MgSO4.7H2O; 0,26 g de
KNO3; 1,0 g de CaCl2.2H2O; 1,0 g de Ca(NO3)2; 1,0 mL de Igepal; 5 g de Sacarose;
20,0 g de 14P14a e 0,0025 g de Vinclozolin), conforme Corabi-Adell (2004).
4.9.1Classificação de antagonismo
Discos de ágar contendo micélio dos fungos de solo isolados de feijoeiro e do
antagonista (5mm de diâmetro) serão retirados de colônias com três dias de cultivo e
15
depositados, simultaneamente, nas extremidades opostas de placas de Petri, contendo
meio BDA solidificado. Será anotado o crescimento micelial diário das colônias, uma
em direção à outra. O encontro das colônias ocorrerá no centro da Placa de Petri, em um
ponto eqüidistante em 3,5 cm de cada disco micélio-ágar. A sobreposição será medida a
cada 24h, considerando o avanço de uma colônia sobre a outra, a partir do ponto de
encontro (LOUZADA et al., 2009).
Após sete dias de cultivo, será avaliado o crescimento micelial dos fungos, baseado
na escala de classes de antagonismo proposta por Bell et al. (1982). A tabela 1 apresenta
essas classes de antagonismo.
Tabela 1: Escala de classes de antagonismo para Trichoderma pareado com fungos
do solo isolados de feijoeiro comum e caupi.
Classe Características
1 Trichoderma cresce e cobre completamente toda a colônia dos fungos
de solo e a superfície do meio;
2 Trichoderma cresce e cobre 2/3 da superfície do meio;
3 Trichoderma e os isolados de solo colonizam cada metade da superfície
do meio e nenhum organismo parece dominar o outro;
4 Isolados dos fungos de solo colonizam 2/3 da superfície do meio;
5 Isolados dos fungos de solo crescem e cobrem completamente toda a
colônia de Trichoderma e a superfície do meio.
5. PRINCIPAIS CONTRIBUIÇÕES CIENTÍFICAS OU TECNOLÓGICAS DA
PROPOSTA
A realização dos estudos previstos nesse projeto atende a uma demanda das
áreas técnicas do Estado, bem como da classe produtora, em razão de não se conhecer
com profundidade a dimensão da presença dessa classe de patógenos, nem o quanto eles
causam de prejuízo à cultura do feijão. A busca por uma possível correlação entre a sua
presença e o nível de fertilidade do solo poderá ajudar na determinação de medidas de
controle desses microrganismos. Por outro lado, tenta-se estudar extratos vegetais que
16
exerçam efeito sobre o controle desses patógenos, bem como o poder de inibição de
fungo de solo, como o Trichoderma, sobre alguns desses agentes patogênicos. Diante
disso, o conhecimento da existência de fungos de solo sobre o feijoeiro e do seu
dimensionamento, bem como da indicação de um produto natural, tal como se prevê a
partir da execução desse projeto, seja pelo emprego de fungo antagonista ou por extratos
vegetais, ou até pela combinação de ambos, terá uma aceitação e um emprego que só
resultará em benefícios para o produtor e para a sociedade. Primeiro, porque irá
controlar um ou vários fungos causadores de doenças ao feijoeiro, cujo controle
químico nem sempre é eficiente e quase sempre não está ao alcance do produtor
familiar, base da produção de feijão do estado, depois, porque não oferecerá perigo para
a saúde humana, dos animais e não contribuirá para a contaminação do lençol freático,
do solo e do ar ambiente.
6. JUSTIFICATIVA PARA O USO DAS INSTALAÇÕES E EQUIPAMENTOS
DO CETENE NO PROJETO.
Apesar de o Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA dispor de um
laboratório de Biologia Molecular bem montado e de um laboratório de Fitopatologia
com condições de realizar as atividades dessa área no projeto com certa eficiência,
vislumbrou-se a utilização da estrutura do Centro de Tecnologias Estratégicas do
Nordeste – CETENE por se reconhecer as vantagens adicionais que essa opção
apresenta para a equipe e para o IPA. Primeiro, que será utilizada toda uma estrutura e
equipamentos novos, em quantidade condizente com as demandas do projeto, com
pouca ou nenhuma necessidade de manutenção, além de se reconhecer a sua qualidade
superior. Segundo, por dispor de uma equipe de alto nível, com quem se espera manter
um excelente entrosamento e troca de experiência, com ganhos na capacitação dos
bolsistas e dos demais membros da equipe técnica. Terceiro, por se reconhecer que esse
pessoal bem treinado poderá vir a ser incorporado por concurso público ao corpo
técnico do IPA, no futuro, resultando em benefícios para essa Instituição e, em
conseqüência, para a sociedade pernambucana. Quarto, em razão de já ter o CETENE
como parceiro de outros projetos aprovados por CNPq, Banco do Nordeste do Brasil e
FACEPE. Quinto, pelo fato de o CETENE, como Instituição Federal, responsável por
17
gerar tecnologias estratégicas para o Nordeste, ser o elo que permitirá a introdução do
IPA nas redes de pesquisa dessa região.
7. PLANOS DE TRABALHO PARA CADA UMA DAS BOLSAS SOLICITADAS
7.1 BOLSA – BCT- 8
TÍTULO: Isolamento e identificação de fungos do solo em feijoeiro comum (Phaseolus
vulgaris L.)
Introdução
O feijão é uma leguminosa predominantemente autógama, domesticada há mais
de 7.000 anos em dois centros de origem: o Mesoamericano (México e América
Central) e o da Região Andina. Acredita-se que o feijão tenha se manifestado
inicialmente como erva daninha em cultivos de mandioca e batata-doce na América
Central. Durante milênios, os agricultores cultivaram misturas complexas de tipos de
feijão como cerca viva contra seca, doenças e ataques de pragas (ARAGÃO & FARIA,
2005).
Atualmente, a cultura do feijão (P. vulgaris) possui grande importância
econômica e social no Brasil, constituindo a principal fonte de proteína vegetal e ferro
na alimentação humana. Dados disponíveis na FAO (2009) sobre a produção mundial
de feijão no ano de 2007 indicam que o Brasil é o segundo maior produtor com uma
área de 3,5 milhões de hectares plantados e o primeiro lugar sendo ocupado pela Índia
com uma produtividade média de aproximadamente 732 Kg/ha, não necessariamente de
P. vulgaris. No Brasil, a região nordeste corresponde à segunda maior produtora no
país, ficando atrás apenas da região Sul (CONAB, 2009; LIMA et al., 2002).
Sabe-se que o feijoeiro é considerado sensível tanto ao déficit quanto ao excesso
de água no solo (VALADÃO & KLAR, 1996) e sua produtividade é função de diversos
fatores, destacando-se as inter-relações entre solo-água-planta-atmosfera e manejo da
irrigação, visando à máxima produção e à boa qualidade do produto.
18
Além dos fatores citados acima, um dos mais importantes na diminuição da
produtividade do feijoeiro é representado pelas doenças, com destaque para as causadas
por fungos do solo, que podem causar prejuízos severos, com perdas de até 100%, com
diminuição das qualidades fisiológicas, nutricionais e sanitárias do produto colhido,
afetando o preço e sua comercialização (BIAZON, 2003). Os agentes causais dessas
doenças apresentam estruturas de resistência que os ajudam a sobreviver no solo por
vários anos (SARTORATO, 2007).
Dentre os fungos patogênicos ao feijoeiro presentes no solo, podem-se destacar
Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli , F.solani f. sp. phaseoli,
Rhizoctonia solani, Thanatephorus cucumeris, Macrophomina phaseolina, Sclerotinia
sclerotiorum, Thielaviopsis basicola, Phymatotrichum omnivorum, e várias espécies de
Phytium (ABAWI & CORRALES,1990).
Devido aos prejuízos econômicos causados pelos patógenos de solo que
infectam o feijoeiro comum, à falta do real conhecimento de sua dimensão no estado e à
escassez de métodos de controle eficientes, é de suma importância o estudo dos fungos
de solo que atacam essa cultura por meio do inventário desses patógenos e a sua
inibição por extratos vegetais, objetivando minimizar os danos das doenças por eles
causadas ao feijoeiro além de reduzir os efeitos sobre o ambiente pelo não uso de
defensivos químicos. Também fornecerá informações imprescindíveis para pesquisas
posteriores, relacionadas ao melhoramento genético, ao controle biológico e integrado
em cultivares de feijão no Estado de Pernambuco. As informações geradas nesse projeto
contribuirão para a melhoria dos programas de melhoramento do feijoeiro e para a
redução das perdas pelo produtor rural, com aumento da geração de emprego e renda no
setor do agronegócio do feijão em Pernambuco.
Objetivos
Geral
Fazer um inventário de fungos do solo da cultura do feijoeiro comum (P.
vulgaris) em Pernambuco
Específicos
Isolar fungos do solo de feijoeiro comum com sintomas de doença;
19
Identificar os fungos isolados de feijoeiro comum;
Implementar um banco de dados de fungos patogênicos ao feijoeiro
comum, com formação de uma micoteca setorial.
Metodologia Proposta
Local de coleta e realização dos experimentos: O trabalho será realizado no Centro de
Tecnologias Estratégicas do Nordeste – CETENE, com algumas atividades de apoio
executadas no Laboratório de Fitopatologia, na Sede do Instituto Agronômico de
Pernambuco (IPA), e as amostras, coletadas nas regiões produtoras de feijão dos Sertões
do Araripe e do São Francisco, e do Agreste.
Isolamento e purificação das espécies fúngicas: o material vegetal obtido será
desinfestado superficialmente com hipoclorito de sódio. Com auxilio de um estilete
esterilizado serão retirados pequenos fragmentos de caules e raízes que serão
transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura Batata Dextrose Agar (BDA),
acrescido de cloranfenicol (100 mg/L) e incubados sob condições de temperatura e
luminosidade adequadas (MENEZES, 1997).
Identificação dos isolados: os isolados serão inoculados, assepticamente, em placas de
Petri contendo BDA e acompanhados por até 96h. Serão avaliados os aspectos
macroscópicos (tamanho, cor e aspecto da colônia) e microscópicos dos isolados.
Quando necessário, será utilizada a técnica de microcultivo em lâmina de acordo com
Ridell (1950). Os resultados serão comparados com base em literatura específica, como,
por exemplo, chaves de Identificação.
Resultados Esperados
Como resultado desse estudo, espera-se isolar o maior número possível de fungos de
solo, de modo a permitir conhecer-se a amplitude de variação desse tipo de patógeno do
feijoeiro comum em Pernambuco, causador de altos prejuízos a essa cultura, a começar
20
pela redução acentuada de sua população. A apropriação desse conhecimento facilitará a
adoção de medidas de controle, especialmente daquelas de menor impacto ambiental ou
que não cause danos à saúde do produtor familiar e de suas criações, público
responsável pela quase totalidade da produção no Estado e no Nordeste. Em se tratando
de uma área de produção de agricultores familiares, que não usam defensivos agrícolas
nem se recomendariam por razões econômicas e ambientais, o emprego de produtos
alternativos para o controle desses patógenos seria, literalmente, a “solução da lavoura.”
Portanto, os resultados serão publicados em informes com linguagem simples e
divulgados por meio da Extensão Rural. Ao final do projeto, um banco de dados e uma
micoteca de fungos de solo do feijoeiro comum estarão formados nas sedes das
Instituições parceiras.
Cronograma de Atividades
ATIVIDADES semestre
I
semestre
II
semestre
III
semestre
IV
Coleta de plantas infectadas por fungos
do soloX X X
Isolamento e identificação de espécies
fúngicasX X X X
Elaboração de relatório final X
21
7.2 BOLSA – BCT- 6
TÍTULO: Isolamento e identificação de fungos do solo em feijão-caupi e avaliação de
extratos vegetais e Trichoderma no biocontrole de patógenos de solo dos feijões comum
e caupi
Introdução
O feijão-caupi (V. unguiculata) conhecido também como feijão-de-corda ou
feijão-macassar, é uma das leguminosas de maior poder de adaptação, versáteis e
nutritivas entre as espécies cultivadas. Mundialmente, a cultura ocupa 13,9 milhões de
hectares distribuídos nas regiões tropicais e subtropicais da África, da Ásia e das
Américas, com produção de 4,9 milhões de toneladas de grãos. O Brasil é o segundo
produtor mundial dessa cultura, com 1,5 milhão de hectares cultivados e produção de
492,3 mil toneladas (SINGH et al., 2002). Nas regiões Nordeste e Norte do Brasil, o
feijão-caupi é produzido principalmente em unidades de agricultura familiar,
desempenhando importante papel sócio-econômico (MELO et al., 2005). O Estado de
Pernambuco se destaca como produtor de V. unguiculata atingindo em 2004 uma área
colhida de 167.601 ha e produção de 47.574 toneladas (IBGE, 2005).
A murcha-de-fusarium e a rizoctoniose, causadas pelos fungos Fusarium
oxysporum f.sp. tracheiphilum (E.F. Smith) Snyder & Hansen e Rhizoctonia solani
Kühn, respectivamente, são as doenças mais freqüentes e de maior intensidade nas
culturas de V. unguiculata, no Nordeste brasileiro (ATHAYDE SOBRINHO et al.,
2005). A murcha-de-fusário é muito importante no Sertão de Pernambuco, causando
sérios prejuízos à produção. Por outro lado, a rizoctoniose é importante no Agreste,
tendo em vista o plantio sucessivo ao feijão comum realizado no período úmido, sendo
ambas as leguminosas altamente suscetíveis a R. solani (ASSUNÇÃO et al., 2003;
ELOY & MICHEREFF, 2003).
22
O método mais utilizado para controle de doenças no campo ainda é o químico,
porém o uso contínuo e indiscriminado desses produtos tem oferecido riscos ambientais
e à saúde humana. Sendo assim, a demanda por novas tecnologias que respeitem o
ecossistema e não ofereçam riscos de contaminação estão se tornando cada vez mais
importantes para o controle de doenças e pragas. Uma dessas práticas é o controle
alternativo, utilizando-se extratos vegetais, óleos essenciais e outros derivados naturais
(BERNARDO et al., 2002). A utilização de produtos naturais na agricultura tem suas
vantagens, principalmente em função da baixa toxidez e da rápida degradação, tendo
como resultado uma agricultura menos dependente de agrotóxico (GHINI & KIMATI,
2000; FARIAS et al., 2004). Além da utilização de extratos de plantas como um
controle alternativo contra fitopatógenos, é citada a aplicação de algumas espécies de
fungos no biocontrole. Os fungos do gênero Trichoderma são de grande importância
econômica para a agricultura, uma vez que são capazes de atuarem como agentes de
controle de doenças de várias plantas cultivadas, promotores de crescimento e indutores
de resistência de plantas a doenças (MOHAMED & HAGGAG 2006, FORTES et al.,
2007).
Objetivos
Objetivo Geral
Fazer um inventário de fungos do solo da cultura do feijão-caupi e verificar a
ação de extratos vegetais e de espécies de Trichoderma no biocontrole dos patógenos de
solo das culturas de feijão-caupi e de arranca.
Objetivos Específicos
Coletar, isolar e identificar taxonomicamente os fungos de solo patogênicos ao
feijão-caupi;
Avaliar a ação dos extratos vegetais de alho, alecrim arruda e gengibre no
controle dos fungos isolados de feijão-caupi e feijão comum;
Avaliar o efeito antagonista das espécies de Trichoderma sobre os fungos
patogênicos a essas duas culturas;
Montar um banco de dados e uma micoteca setorial de fungos de solo que
infectam o feijão-caupi.
23
Metodologia Proposta
- Local de coleta: amostras de feijão-caupi com sintomas de doença serão coletadas nas
regiões produtoras do Sertão do Araripe, do São Francisco, no Agreste Meridional e na
zona da Mata Norte e Sul.
- Isolamento e identificação: o material vegetal obtido será desinfestado
superficialmente com hipoclorito de sódio e com auxilio de um estilete serão retirados
pequenos fragmentos de caules e raízes que serão transferidos para placas de Petri
contendo meio de cultura BDA, acrescido de cloranfenicol (100mg/L). Para a
identificação dos fungos serão avaliados os aspectos macroscópicos (tamanho, cor e
aspecto da colônia) e microscópicos dos isolados e os resultados comparados de acordo
com a literatura específica. Quando necessário, será utilizada a técnica de microcultivo
proposta por Ridell (1950).
- Obtenção de extratos vegetais e análise da inibição dos fitopatógenos: para a
obtenção dos extratos, será confeccionada uma solução estoque, onde uma porção de
300g de cada material vegetal será triturada e submetida ao processo de extração aquosa
à temperatura de 100ºC, conforme Celoto et al. (2008). A solução será filtrada e
acondicionada em frascos de vidro âmbar. Em seguida, o extrato será adicionado ao
BDA fundente (45ºC) nas concentrações de 5, 10 e 20%.
Para análise do efeito dos extratos sobre os fitopatógenos, disco (5mm de
diâmetro) contendo micélio dos fungos serão transferidos para o centro das placas com
BDA (controle) e BDA acrescido das concentrações dos extratos, e depois incubadas a
25ºC na ausência de luz.. O bioensaio será realizado em três repetições, e após o
desenvolvimento dos fungos será avaliado o crescimento das colônias, sendo as medidas
calculadas pela percentagem de inibição do crescimento micelial de acordo com
Edginton et al. (1971).
- Biocontrole dos fungos fitopatógenos por espécies de Trichoderma: as espécies de
Trichoderma serão isoladas de solos com plantios de feijão comum e caupi no Estado de
Pernambuco. Para analisar o biocontrole, discos contendo micélio dos fungos de solo
isolados de feijoeiro e das espécies de Trichoderma serão inoculadas, simultaneamente,
em extremidades opostas das placas de Petri, contendo meio BDA solidificado. Serão
24
realizadas medições diárias do crescimento das colônias, uma em direção à outra, sendo
que o encontro das colônias ocorrerá no centro da placa de Petri, em um ponto
equidistante em 3,5 cm de cada disco micélio-ágar. A sobreposição será medida a cada
24h, considerando o avanço de uma colônia sobre a outra, a partir do ponto de encontro
(LOUZADA et al., 2009). A classificação da inibição dos fungos fitopatógenos causada
pelo o antagonista Trichoderma será baseada na escala de classes de antagonismo
proposto por Bell et al. (1982).
Resultados esperados
Espera-se que os dados obtidos nessa pesquisa possa gerar um banco de dados
sobre fungos de solo que causam doenças ao feijoeiro, bem como fornecer informações
sobre controle biológico por meio da ação de fungos antagonistas e pela aplicação de
extratos vegetais sobre os fungos fitopatógenos. Ainda o projeto pretende disponibilizar
para o estado de Pernambuco um produto natural à base de vegetal e/ou fungo, de baixo
custo e capaz de contribuir para o controle de fitopatógenos que incidem sobre as
culturas mencionadas. Além disso, essa linha de pesquisa será aprofundada com a
realização de novos estudos, especialmente nas áreas de biologia molecular, avaliação
de cultivares para resistência a esses fungos e melhoramento genético.
Cronograma
ATIVIDADES semestre
I
semestre
II
semestre
III
semestre
IV
Coleta de plantas infectadas por fungos do solo X X X
Isolamento e identificação de espécies fúngicas X X X X
Avaliação dos efeitos dos extratos vegetais sobre
os fungos isoladosX X X
Avaliação da ação antagonista por Trichoderma X X
Elaboração de relatório final X
25
7.3 BOLSA – BCT- 6
TÍTULO: Caracterização molecular de fungos de solo das culturas do feijão comum e
feijão-caupi.
Introdução
O feijão é uma leguminosa que apresenta uma grande importância
socioeconômica para a agricultura do Brasil, visto que é um dos componentes básicos
da dieta alimentar da população, sendo importante fonte de proteínas, vitaminas e
minerais, além de apresentar um alto conteúdo de ácidos graxos poliinsaturados e
carboidratos (MACHADO et al., 2008). Dentre os diversos tipos de feijão, as espécies
P. vulgaris (feijão comum ou de arranca) e V.unguiculata (de corda ou macassar) são
muito cultivadas no Brasil, sendo consideradas principais culturas de subsistência,
principalmente na região Nordeste (LIMA et al., 2007).
O feijoeiro é comumente atacado por inúmeras pragas e doenças, que são
responsáveis por grande perda de produtividade da cultura. Um grupo de patógenos de
grande importância para o feijoeiro são os fungos presentes no solo que atacam o
sistema radicular e a parte aérea das plantas, formando lesões que prejudicam o
desenvolvimento das mesmas ou causam a sua morte (MOURA, 2005).
Dentre as doenças e os fungos patogênicos ao feijoeiro presentes no solo,
podem-se destacar podridão do colo (Sclerotium rolfsii), murcha-de-fusarium
(Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli), podridão radicular seca (Fusarium solani f. sp.
phaseoli), podridão radicular de rizoctonia (Rhizoctonia solani), murcha da teia micélica
(mela) (Thanatephorus cucumeris), podridão cinzenta do caule (Macrophomina
phaseolina), mofo branco (Sclerotinia sclerotiorum,) e podridão por pitium (Pythium
sp.) (ABAWI & CORRALES, 1990; ATHAYDE SOBRINHO et al., 2005).
Técnicas da biologia molecular, tais como a amplificação da região ITS do
rDNA (NILSSON et al., 2009) e os marcadores moleculares (MOURA, 2005; CIAT,
2007) têm sido utilizadas para a detecção, caracterização e análise de polimorfismos dos
26
patógenos, melhorando assim o nosso conhecimento sobre a diversidade, distribuição e
papel desses patógenos. A biologia molecular também está contribuindo para o
conhecimento das relações filogenéticas entre os patógenos, o que auxilia na criação de
bancos de dados de perfis genéticos, obtendo diagnósticos mais rápidos e precisos, além
de ajudar no controle de doenças (NOZAKI et al., 2006; FUNGARO, 2000).
Objetivos
Geral
Determinar o perfil molecular de fungos do solo das culturas do feijão comum e
feijão-caupi coletados em Pernambuco.
Objetivos Específicos
Obter o perfil molecular dos fungos isolados por meio de sequências ITS e
ISSR;
Analisar e comparar os perfis de amplificação dos isolados;
Analisar o perfil molecular de patógenos comuns às duas culturas, procurando
dissimilaridades entre eles;
Formar banco de dados de perfis moleculares de fungos de solo de feijoeiro em
Pernambuco.
Metodologia Proposta
Será feita uma suspensão dos conídios provenientes produzidos em BDA de
cada isolado em solução Tween 80 (0,1%). Após esta, os isolados serão inoculados em
meio mínimo líquido, mantidos sob agitação de 250 rpm à temperatura ambiente
(±28oC), por 96 h. O micélio será filtrado por filtração a vácuo, lavado com água
destilada esterilizada e armazenado em freezer a -20C até a extração de DNA.
A extração do DNA será realizada de acordo com Raeder & Broda (1985), em
seguida, ressuspenso em tampão TE. Os produtos obtidos serão armazenados em freezer
27
(-20C) até seu uso como molde em reações de PCR (BATISTA et al., 2008). A
concentração de DNA será estimada por meio de eletroforese em Gel de agarose 0,8%
por comparação com o marcador de peso molecular DNA do fago lambda λ.
A caracterização genética dos fungos de solo da cultura do feijão comum (P.
vulgaris) e feijão-caupi (V. unguiculata), será realizada utilizando-se o marcador
molecular ISSR (Internal Simple Sequence Repeat) e análise das regiões ITS (Internal
Transcribed Spacer de DNAr).
Os produtos amplificados pelos marcadores ISSR serão verificados em gel de
agarose 1,5%, corados com Syber 27P27na, visualizados sob luz UV e fotografados. As
bandas obtidas serão identificadas como presentes (1) ou ausentes (0). Em seguida, será
construído um fenograma pelo método UPGMA, utilizando o programa MEGA 5.0.
(BATISTA et al., 2008; LIANG et al., 2008).
A amplificação da região ITS será feita com iniciadores dirigidos a esse sítio,
utilizando um programa térmico que incluirá desnaturação inicial a 94ºC, 40 ciclos de
desnaturação, anelamento e extenção, seguidos de um período final de extensão a 72º C.
Os produtos amplificados dessa região serão submetidos a digestão com as enzimas de
restrição Mspl, HaeIII e DraI e o padrão será conferido por eletroforese em gel de
agarose 1,5%, utilizando-se marcador de peso molecular de 100pb. Os fragmentos de
restrição serão corados com syber green, visualizados em fotodocumentador e
fotografados.
Resultados Esperados
Espera-se ao final desse estudo a obtenção do perfil molecular dos fungos de
solo que causam doenças em feijoeiro comum e caupi e o aumento do conhecimento
sobre a variabilidade genética desses fungos. Além de contribuir para a disseminação
dos conhecimentos sobre a biologia molecular, espera-se que esses dados auxiliem nas
tomadas de decisão em programas de melhoramento genético dessas culturas, visando à
obtenção de plantas resistentes aos esses patógenos.
28
Cronograma de Atividades
ATIVIDADES semestre
I
semestre
II
semestre
III
semestre
IV
Extração e quantificação de DNA dos
fungos em estudo;
X X X
Seleção de primers e amplificação,
utilizando os marcadores ISSR;
X X X
Análise dos resultados dos marcadores
moleculares ISSR;
X X X
Amplificação e análise de restrição das
regiões ITS;
X X X
Análise dos perfis de amplificação da
região ITS dos isolados;
X X
Análise e comparação dos resultados
obtidos;
X X
Análise do perfil molecular de patógenos
comuns às duas culturas
X
Elaboração de relatório final X
29
8. IDENTIFCAÇÃO DOS DEMAIS PARTICIPANTES DA EQUIPE E DE SUAS
RESPECTIVAS ATIVIDADES NO PROJETO
1. ANTONIO FÉLIX DA COSTA (D.Sc. em Fitopatologia - IPA) Coordenador,
colaborador em fitopatologia;
2. NEIVA TINTI DE OLIVEIRA (D.Sc.em Genética de Fungos - UFPE) Colaboradora
em genética de fungos;
3. LUCIANA GONÇALVES DE OLIVEIRA (D.Sc. em Biologia de Fungos - IPA)
Colaboradora em sistemática de fungos;
4. CLAUTENES GOMES ROCHA (M.Sc. em Biologia de Fungos -IPA) Colaboradora
em taxonomia de fungos e biocontrole;
5. CRISTINA DE SOUZA MOTTA (D.Sc. em Ciências Biológicas - UFPE)
Colaboradora em sistemática de fungos;
6. LAUREEN MICHELLE HOULOU KIDO (D.Sc. em Ciências - CETENE)
Colaboradora em biologia molecular e bioinformática;
7. ROSINEIDE DA SILVA LOPES (M.Sc. em Biologia de Fungos –Em curso de
doutorado em Ciências Biológicas –UFPE/IPA) Colaborador em controle biológico;
8 ARAESKA CARENNA DE ALMEIDA FERREIRA (M.Sc. em Biologia de Fungos -
IPA) colaboradora em biologia molecular;
9. LÍLIAN VIEIRA DE MEDEIROS (M.Sc. em Biologia de Fungos – IPA)
Colaboradora em biologia molecular;
10. JULIANA MENEZES JULIÃO - (Bel. em Ciências Biológicas - IPA) colaboradora
em fitopatologia.
11. DANDARA WENNE TEIXEIRA DE SANTANA LIMA – (Lic. em Ciências Biológicas – IPA) Colaboradora em Fitopatologia.
9. CRONOGRAMA DE ATIVIDADES
DESCRICAO DAS ATIVIDADES SEMESTRE I SEMESTRE II SEMESTRE III SEMESTRE IV
1 – Coleta de plantas infectadas por fungos do
solo
XX
X
2 – Isolamento e identificação de espécies
fúngicas
XX
X X
3 – Extração e quantificação de DNA dos fungos
em estudo
X X X
4 – Seleção de primers, amplificação de ISSR X X X
5- Análise dos resultados dos marcadores
moleculares ISSR
X X X
6- Amplificação e análise de restrição da região
ITS
X X X
7- Análise dos perfis de amplificação da região
ITS dos isolados
X X X
8- Análise e comparação dos resultados das duas X X
31
culturas de feijão
9– Elaboração de relatórios final X
10 – Publicação dos resultados em periódicos
científicos
X
10. GRAU DE INTERESSE E COMPROMETIMENTO DE EMPRESAS COM O
ESCOPO DA PROPOSTA, QUANDO FOR O CASO
Não há
11. INDICAÇÃO DE COLABORAÇÕES OU PARCEIRIAS JÁ
ESTABELECIDAS COM OUTROS CENTROS DE PESQUISA NA ÁREA
O projeto contará com a colaboração técnica da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE) e do Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE),
por meio dos seus pesquisadores mencionados.
12. DISPONIBILIDADE EFETIVA DE MATERIAL DE CONSUMO E OUTROS
RECURSOS NECESSÁRIOS AO DESEVOLVIMENTOS DO PROJETO
Os recursos financeiros necessários à aquisição de material de consumo para a
realização das atividades desse projeto estão assegurados em razão de projeto
semelhante aprovado pelo Banco do Nordeste, no valor de R$ 81.086,00 (oitenta e um
mil e oitenta e seis reais), já do conhecimento do CETENE. Outros recursos necessários
estão garantidos a partir da disponibilidade de equipamentos e material permanente,
constantes em laboratórios das Instituições parceiras, especialmente do CETENE, cuja
comprovação será anexada à documentação complementar.
13. ESTIMATIVAS DOS RECURSOS FINACEIROS DE OUTRAS FONTES
QUE SERÃO APORTADOS PELOS EVENTIAS AGENTES PÚBICOS E
PRIADOS PARCEIROS
Não há previsão de aporte de recursos financeiros de outras fontes ou parceiros,
entretanto estão assegurados os recursos necessários para combustível pelo IPA, dentro
do programa de melhoramento da cultura do feijão, atividade normal na Instituição,
presente em todo o Estado.
14. REFERÊNCIAS
ABAWI, G.S.; CORRALES, M.A.P. Root rots of beans in Latin America and Africa:
diagnoses, research methodologies and management strategies. Colômbia. CIAT. 1990.
p 114.
AKANDE, S.R. Genotype by environment interaction for cowpea seed yield and
disease reactions in the forest and derived savanna agro-ecologies of south-west
Nigeria. American-Eurasian Journal of Agricultural & Environmental Science, v.
2, p. 163-168, 2007.
ARAGÃO, F.J.L.; FARIA, J.C. Obtenção de feijoeiro resistente ao vírus do mosaico
dourado. Disponível em:
http://www.cenargen.embrapa.br/publica/trabalhos/am2004/arquivos/21060402.pdf.
Acesso em: 02 de agosto de 2010.
ASSUNÇÃO, I.P.; MICHEREFF, S.J.; MIZUBUTI, E.S.G.; BROMMONSCHENKEL,
S.H. Influência da intensidade da murcha de fusário no rendimento do caupi.
Fitopatologia Brasileira, v. 28, p. 615-619. 2003.
ATHAYDE SOBRINHO, C.; VIANA, F.M.P.; SANTOS, A.A. Doenças fúngicas e
bacterianas. In: FREIRE FILHO, F.R.; LIMA, J.A.A.; RIBEIRO, V.Q. (Eds.). Feijão-
caupi: avanços tecnológicos. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2005.
cap.12, p. 461-484.
BATISTA, P. P.; SANTOS, J. F.; OLIVEIRA, N.T.; PIRES, A. P. D.; MOTTA,
C.M.S.; LUNA-ALVES LIMA, E.A. Genetic characterization of Brazilian strains of
Aspergillus flavus using DNA markers. Genetics and Molecular Research, v.7, p.
706-717, 2008.
BERNARDO, R. SHWAN-ESTRADA, K.R.F., POVH, F.P., SALVATORI, R.K.
STANGARLIN, J.R. Atividade antibacteriana de plantas medicinais. Summa
Phytopathologica, v. 28 p. 1-10, 2002.
34
BELL, D.K.; WELLS, H.D.; MARKHAM, C.R. In vitro antagonism of Trichoderma
species against six fungal plant pathogens. Phytopathology, v. 72, p. 379-382, 1982.
BEEBE 1991. Beebe, S. Pudricuones radicales del frijol y su control. Cali, Colombia:
CIAT, 1981. 52p. (CIAT. Serie 045B-06.07.).
BIAZON, V.L. Crestamento bacteriano comum do feijoeiro: efeito da adubação
nitrogenada e potássica e aspectos relacionados à doença. 2003. Dissertação
(Mestrado da Faculdade de Ciências Agronômicas) - Universidade Estadual Paulista,
São Paulo, 2003.
BRITO, M. de M.P.; EDSON, T.M.; SILVA, C. Marcha de absorção do nitrogênio do
solo, do fertilizante e da fixação simbiótica em feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.)
Walp.) e feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) determinada com uso de 15N. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, v. 33, p. 895-905, 2009.
CASTRO, N.R. Murcha de Fusarium em Helicônia spp.: ocorrência, variabilidade e
resistência genética. 2007, 98f. Tese (Doutorado em Fitopatologia) - Universidade Federal
Rural de Pernambuco, Recife, 2007.
CAVALCANTE, F.C.N. Variabilidade de isolados de Colletotrichum gloeosporioides, quanto
a patogenidade a frutos de mangueira (Mangifera indica L.), marcadores RAPD e região ITS do
rDNA. 2005. Dissertação (Biologia de Fungos) - Universidade Federal de Pernambuco, Recife,
2005.
CELOTO, M.I.B.; PAPA, M.F.S.; SACRAMENTO, L.V.S.; CLEOTO, F.J. Atividade
antifúngica de extratos de plantas a Colletrotichum gloesporioides, v. 30, p.1-5, 2008.
CIAT (Centro internacional de agricultura Tropical). Aplicação de biotecnologia na
gestão de doenças do feijão., África, 2005. Disponível em:
35
http://webapp.ciat.cgiar.org/africa/pdf/highlight27_port.pdf. Acessado em 25 de Agosto
de 2011.
CONAB, COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO. Oitavo levantamento
de avaliação da safra 2008/2009. Disponível em:
<http://www.conab.gov.br/conabweb/download/safra/7graos_08.09.pdf >. Acesso em: 08 de
set.) 2009.
CORABI-ADELL, C. Biodiversidade do gênero Trichoderma (HYPOCREALES –
FUNGI) mediante técnicas moleculares e análise ecofisiográfica. 2004. 220 p. Tese
(Doutorado em Biociências) - Universidade Estadual de São Paulo, Rio Claro, 2004.
DANTAS S. A.F.; OLIVEIRA, S.M.A., COELHO, R.S.B.; SILVA, R.L. X.
Identificação de fontes de resistência em feijoeiro a Sclerotium rolfsii.
Fitopatologia Brasileira, v. 27, p. 528-531, 2002.
DOMINGUES, R.J.; SOUZA, J.D.F.; TÖFOLI, J.G.; MATHEUS, D.R. Ação in vitrode
extratos vegetais sobre Colletrotichum acutatum, Alternaria solani e Scletotium rofsii.
Arquivo do Instituto de Biologia, v. 76, p. 643-649, 2009.
EDGINTON, L.V.; KNEW, K.L.; BARRON, G.L. Fungitoxic spectrum of
benzimidazole compounds. Phytopathology, v. 62, p. 42-44, 1971.
FARIAS, M.A.A. Produtos naturais de Streptomyces spp. e de plantas utilizáveis no
biocontrole de microrganismos fitopatogênicos. 2004. Tese (Doutorado) - Universidade
Federal da Paraíba, João Pessoa, 2004.
FAO (Food and agriculture). 2009. Crops, Cow peas, dry. Disponível em
http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx . Acesso em: 15 de maio de 2011.
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores
moleculares em análise genética. Brasília: Embrapa-Cenargen, 1998. 220p.
ELOY, A.P.; MICHEREFF, S.J. Redução no rendimento do caupi em duas épocas de
plantio devido à murcha-de-fusário. Summa Phytopathologica, 29: 330-333, 2003.
36
FORTES, F.O.; SILVA, A.C.F.; ALMANÇA, M.A.K.; TEDESCO, S.B. Promoção de
enraizamento de microestacas de um clone de Eucalyptus 36P. Por Trichoderma spp.
Revista Árvore, v. 31, p. 221-228, 2007.
FROTA, K. M. G.; MENDONÇA, S.; SALDIVA, P. H. N.; CRUZ, R. J.; ARÊAS, J.
A. G. Cholesterol-lowering properties of whole cowpea seed and its protein isolate in
hamsters. Journal of Food Science, v. 73, p. 235-240, 2008.
FUNGARO, M.H.P. PCR na micologia. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v. 3, p. 12-
16, 2000.
GHINI, R. KIMATI, H. Resistência de fungos a fungicidas. Jaguariúna: Embrapa
Meio Ambiente, 2000. 78p..
IBGE. Levantamento Sistemático da Produção Agrícola.2005. Disponível em:
http://www.ibge.gov.br/. Acesso em: 06 de set. 2011
INGLIS, G,D.; DUKE, G,M.; GOETTEL, M,S.; KABALUK, J.T. Genetic diversity of
Metarhizium anisopliae var. anisopliae in southwestern British Columbia. Journal of
Invertebrate Pathololy, v. 98, p. 101-113, 2008.
JULIATTI, F. C.; SILVA, C.C.N.; GIOVANINI , M.P.; GOULART, L.R.; JULIATTI, F.C. and
POLIZEL, A.C. Agressividade e divergência genética por RAPD de isolados de Colletotrichum
gloeosporioides coletados em lavouras cafeeiras de Minas Gerais. Bioscience Journal, v. 22,
p. 159-169, 2006.
KOUVELIS, V,N.; GHIKAS, D,V.; EDGINGTON, S.; TYPAS, M,A.; MOORE, D.
Molecular characterization of isolates of Beauveria bassiana obtained from
overwintering and summer populations of Sunn Pest (Eurygaster integriceps). Letters
in Applied Microbiology, v. 46, p.414-420, 2008.
LIANG, H.; CHENG, Z.; YANG, X.; LI, S.; DING, Z.; ZHOU, T.; ZHANG, W.;
CHEN, J. Genetic diversity and structure of Cordyceps sinensis populations from
extensive geographical regions in China as revealed by Inter-Simple Sequence Repeat
markers. The Journal of Microbiology, v. 46, p. 549-556, 2008.
37
LIMA, J. S.S.; MARTINS-FILHO, S.; LOPES, J.C.; GARCIA, G. O.; SCHIMIDT
NETO, R. Qualidade fisiológica de sementes de feijão produzidas em solo compactado.
Revista Brasileira de Sementes, v. 24, p. 111-117, 2002.
LIMA, C.J.G.S.; OLIVEIRA, F.A.; MEDEIROS, J.F.; OLIVEIRA, M.K.T.; JÚNIOR,
A.B.A. Resposta do feijão caupi a salinidade da água de irrigação. Revista Verde, v. 2,
p. 79-86, 2007.
LOUZADA, G. A. S.; CARVALHO, D. D. C.; MELLO, S. C. M.; LOBO-JÚNIOR, M.;
MARTINS, I.; BRAÚNA, L. M. Potencial antagônico de Trichoderma spp. Originários
de diferentes agroecossistemas contra Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium solani. Biota
Neotropica, v. 9, p. 145-149, 2009.
LOBATO, K. S, D. G. C. SANTOS, C. F. OLIVEIRA-NETO, F. C. OLIVEIRA, R. C.
L. COSTA e M. H. L. SILVA. Disponível em:
http://www.cpamn.embrapa.br/anaisconac2006/resumos/TS05.pdf. Acesso em 17 de
agosto de 2011.
MACHADO, C.M.; FERRUZZI M.G.; NIELSEN, S.S; Impacto f the hard-to-cook
phenomenon on phenolic antioxidants in dry beans (Phaseolus vulgaris). Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.56, p.3102- 3110, 2008.
MELO, F.B. et al. Fertilidade do solo e adubação. In: FREIRE FILHO, F.R. et al.
Feijão caupi: avanços tecnológicos. Brasília: EMBRAPA, 2005. cap.6, p.231-242.
MENEZES, M.; SILVA, D.M.W. Guia prático para isolamentos de fungo
fitopatogênicos. Recife, PE: UFRPE, 1997, 120p.
MOHAMED, H.A.L.A.; HAGGAG, W.M. Biocontrol potential of salinity tolerant
mutants of Trichoderma harzianum against Fusarium oxysporum. Brazilian Journal of
Microbiology, v. 37 p. 181-191, 2006.
38
MOURA, R.R. 2005 Associação de marcadores RAPD a locos de resistência de
feijoeiro a Colletotrichum lindemuthianum. Dissertação (Mestrado). Instituto
Agronômico- IAC, campinas – SP.
NILSSON, R,H.; RYBERG, M.; ABARENKOV, K.; SJÖKVIST, E.;
KRISTIANSSON, E. The ITS region as target for characterization of fungal
comuniqueis using emerging sequencing technologies. FEMS Microbiology Letters, v.
296, p. 97-101, 2009.
NOZAKI, M. H. CAMARGO, M., LEMOS, E.G.M.; AUKAR, A.P.A.; BARRETO, M.
Caracterização molecular através da técnica FAFLP de isolados de Diaporthe citri.
Summa Phytopathologica, v. 32, p. 147-150, 2006.
NUNES, C. C.;MAFFIA, L. A.;MIZUBUTI, E. S. G.; BROMMONSCHENKEL, S. H.;
SILVA, J. C. Genetic diversity of populations of Hemileia vastatrix from organic and
convencional coffee plantations in Brazil. Australasian Plant Pathology, v. 38, p.
445-452, 2009.
OLIVEIRA, V.C.; COSTA, J.L.S. Análise de restrição de DNA ribossomal amplificado
(ARDRA) pode diferenciar Fusarium solani f. sp. phaseoli de F. solani f. sp. glycines.
Fitopatologia Brasileira, v. 27, p. 631-634, 2002.
PANTOU, M.P.; MAVRIDOU, A.; TYPAS, M. IGS sequence variation, group-I introns
and the complete nuclear ribosomal DNA of the entomopathogenic fungus Metarhizium:
excellent tools for isolate detectem and phylogenetic analysis. Fungal Genetics and
Biology, v. 38, p. 159-174, 2003.
PLOETZ R.C.; SCHNELL R.J.; YING Z.; ZHENG, Q.; OLANO. C.T.;
MONTAMAYO, J.C.; JOHNSON, E.S. Analysis of molecular diversity in Crinipellis
perniciosa with AFLP markers. The European Journal of Plant Pathology, v. 111, p.
317-326, 2005.
39
QUEIROZ, T. M. DE; ANDRADE M. J. B. de; CARVALHO J. A. 2004. Cultivo do
feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris l. cv BRS-MG Talismã) submetidos a diferentes
tensões de água no solo.Artigo em Hypertexto. Disponível em:
http://www.hidrosense.com.br/admin/artigos/arquivos/artigos/manejofeijoeirodiftensoes.p
df. Acesso: 11/9/2011.
RAEDER, U.; BRODA, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters
in Applied Microbiology, v. 1, p. 17-20, 1985.
RHENER, S,A.; BUCKLEY, E. A. Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and
EF1-alfa sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps
teleomorphs. Mycologia, v. 97, p. 84-98, 2005.
RIDDELL, R.W. Permanent stained mycological preparation obbtained by slide culture. Mycologia, v. 42, p. 265-270, 1950.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory
manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 1989, 956 p.
SARTORATO, A. Desafios no Controle de Doenças na Cultura do Feijoeiro na região Centro-Oeste. 2006. Artigo em Hypertexto. Disponível em:<http://www.infobibos.com/Artigos/2006_3/D3/Index.htm>. Acesso em: 11/9/2011
SHARMA, M.; GUPTA, S.K.; SHARMA, T.R. Characterization of variability in
Rhizoctonia solani by using morphological and molecular markers. Journal of
Phytopathology, v. 153, p.449-456, 2005.
SILVA, J.A.S.; PEGAGO, C.M.; RIBEIRO, V.V.; BRITO,N.M.; NASCIMETO, L.C. .
Efeito de extratos vegetais no controle de Fusarium oxysporum f. sp tracheiphilum em
sementes de caupi. Ciência e Agrotecnologia v. 33, p. 611-616, 2009.
SINGH, G., SINGH, O.P. & MAURYA, S. Chemical and biocidal investigations on
essential oils of some Indian Curcuma species. Progress in Crystal Growth and
Characterization of Materials ,v. 45, p. 75-81. 2002.
40
SMITH, J. S. C.; REGISTER, I. J. C. Genetic purity and testing technologies for seed
quality: a company perspective. Seed Science Research, v. 8, p. 285-294, 1998.
TEÓFILO, E.M.; DUTRA, A.S; PITIMBEIRA, J.B.; DIAS, F.T.C.
ARBOSA, F. de S. Potencial fisiológico de sementes de feijão caupi
produzidas em duas regiões do Estado do Ceará. Revista Ciência
Agronômica, v. 39, n. 3, p. 443-448, 2008.
VALADÃO, L. T.; KLAR, A. E. Evapotranspiração do feijoeiro (Phaseolus vulgaris
L.) em dois níveis do lençol freático. In: Congresso nacional de irrigação e
drenagem, 1996, Campinas. Anais... Campinas: Associação Brasileira de Irrigação e
Drenagem, 1996, p.163-176.
VELÁSQUEZ, V,B.; CÁRCAMO, M,P.; MERIÑO, C,M.; IGLESIAS, A,F.; DURÁN,
J,G. Intraspecific differentiation of Chilean isolates of the entomopathogenic fungi
Metarhizium anisopliae var. anisopliae as revealed by RAPD, SSR and ITS markers.
Genetics and Molecular Biology, v. 30, p. 89-99, 2007.
