INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA ...bdtd.inpa.gov.br/bitstream/tede/1442/1/Dissertacao_Renildo... · 2.1.ORIGEM E CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS ESPÉCIES

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM

DIVERSIDADE CARIOTÍPICA ENTRE DEZ ESPÉCIES DO

GÊNERO ANCISTRUS (SILURIFORMES, LORICARIIDAE)

DA BACIA AMAZÔNICA: ESTRUTURA E MECANISMOS

DE EVOLUÇÃO CROMOSSÔMICA

Renildo Ribeiro de Oliveira

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Tropical e Recursos

Naturais do convênio INPA/UFAM, como parte

dos requisitos para a obtenção do título de mestre

em Ciências Biológicas, área de concentração em

Biologia de Água Doce e Pesca Interior.

MANAUS – AM

2006

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM

DIVERSIDADE CARIOTÍPICA ENTRE DEZ ESPÉCIES DO

GÊNERO ANCISTRUS (SILURIFORMES, LORICARIIDAE)

DA BACIA AMAZÔNICA: ESTRUTURA E MECANISMOS

DE EVOLUÇÃO CROMOSSÔMICA

Renildo Ribeiro de Oliveira

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Tropical e Recursos

Naturais do convênio INPA/UFAM, como parte

dos requisitos para a obtenção do título de mestre

em Ciências Biológicas, área de concentração em

Biologia de Água Doce e Pesca Interior.

Orientadora: Eliana Feldberg, Dra.

Co-orientador: Jansen Alfredo Sampaio Zuanon, Dr.

MANAUS – AM

2006

FICHA CATALOGRÁFICA

FICHA CATALOGRÁFICA

Oliveira, Renildo Ribeiro de.

Diversidade cariotípica entre dez espécies do gênero Ancistrus

(Siluriformes, Loricariidae) da Bacia Amazônica: estrutura e mecanismos

de evolução cromossômica / Renildo Ribeiro de Oliveira. Manaus: 2006.

81 f.: il. color.

Dissertação (mestrado). INPA/UFAM, 2006.

1. Amazônia; 2. Peixes; 3. Hypostominae; 4. Citogenética; 5. Cromossomos

sexuais.

CDD 19 ed. 537.5

Sinopse Com intuito de verificar quais os mecanismos de evolução cromossômica existentes

nas espécies amazônicas pertencentes ao gênero Ancistrus (Hypostominae,

Loricariidae), foram estudadas dez espécies provenientes de diversos pontos da

Bacia Amazônica. As análises revelaram uma grande diversidade cariotípica, tanto

na macroestrutura (número e forma cromossômica) como também nos padrões de

regiões organizadoras de nucléolos e de heterocromatina constitutiva, entre as

espécies desse gênero. A ocorrência de baixos números diplóides sugere que fusões

cêntricas tenham sido eventos importantes na evolução cromossômica deste grupo.

Em contraste com a família Loricariidae, há a presença de sistemas de cromossomos

sexuais em muitas das espécies de Ancistrus. Características biológicas e etológicas

tais como, baixa vagilidade, territorialismo e cuidado parental, podem estar

associadas à grande diversidade cariotípica encontrada nesses peixes.

Palavras–chave: Amazônia; Peixes; Hypostominae; Citogenética; Cromossomos

sexuais.

Dedico essa dissertação às pessoas

que mais amo nessa vida, os meus

pais: João e Santilia, pelo incentivo e

amor nos momentos em que mais

precisei.

A REALIZAÇÃO DESTE TRABALHO SÓ FOI POSSÍVEL GRAÇAS:

Ao programa de Pós-Graduação em Biologia de Água Doce e Pesca Interior do

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia / Universidade Federal do Amazonas.

Ao Laboratório de Genética de Peixes, onde este trabalho foi desenvolvido,

financiado pelos Projetos de Pesquisas Institucionais: PPI: 2-3750, PRONEX/FINEP e

PNOPG/CNPq.

WWF; PDBFF–INPA/Instituto Smithsonian, Fundação O Boticário de Proteção

à Natureza, pelo suporte financeiro às coletas.

Ao Conselho Nacional de desenvolvimento Cientifico e Tecnológico-CNPq,

pela concessão da minha bolsa de mestrado sem a qual este trabalho não teria sido

realizado.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me dado força para superar os obstáculos e dificuldades

encontradas no transcorrer deste trabalho.

À Dra. Eliana Feldberg, por me acolher como um filho, pela cuidadosa

orientação, pelas críticas e sugestões e pela confiança em mim depositada.

Ao Dr. Jansen Zuanon, pela co-orientação, pela amizade e confiança, pelas

valiosas sugestões e críticas, que muito contribuíram para a realização deste trabalho, e

pela realização de algumas coletas.

Aos professores do curso BADPI, pelos ensinamentos que muito contribuiu para

o meu crescimento como Biólogo.

Aos amigos do Laboratório de Citogenética de peixes do INPA: Maria Claudia,

Carlos, Aldaléia, Celeste, Maria Leandra, Eduardo, Denise, Germano, Maria José,

Arlindo e Jorge Porto, pelas discussões surgidas no decorrer deste período, as quais

contribuíram muito para a realização deste trabalho.

À Maria Claudia Gross, pela amizade e pela ajuda na preparação e interpretação

dos resultados da meiose.

À Maria do Carmo Arruda (Carminha) secretária do curso BADPI, pelo carinho

e atenção com todos os alunos do curso.

À Dra. Ângela Varella, pela atenção, paciência e por nos emprestar sua máquina

fotográfica sem a qual esta dissertação não teria sido entregue no prazo previsto.

Aos professores doutores que constituíram a banca avaliadora deste trabalho:

Orlando Moreira Filho (UFSCar), Roberto Ferreira Artoni (UEPG), Paulo César Venere

(UFMT), Cleusa Yoshiko Nagamachi (UFPA) e Lucia Helena Rapp Py-Daniel (INPA),

pelas contribuições.

Aos meus colegas de turma: Cilene, Luiza, Marcos Valério (Valdir), Lian,

Fábio, Michel, Márcio, Marcelo, Leonardo, Rodrigo, Maria Claudia, Fabiola, Gelson,

Daniela (Dani Tucuxi), Daniela Magalhães (Dani Boto) e Daniel Previateli.

À Rafaela, Liana, Gina, e Silvia, por terem me acolhido em sua casa quando

cheguei a Manaus.

À Ana Maria Dias, pela amizade, pelo carinho e por ser esta pessoa maravilhosa

que sempre me ajudou quando precisei.

À Rosa Maria (Dona Rosinha) e Christianny Oliveira (Chris), pela amizade,

carinho, por terem me acolhido como um integrante da família e pelas comidas

maravilhosas preparadas sempre com muito amor pela Dona Rosinha.

À toda minha família, pela confiança e carinho que foram muito importantes

para suportar a saudade de casa.

À Janaína Brito (Chaveirinho), minha “irmãzinha”, pela amizade verdadeira,

carinho e pela troca de conhecimento e por me agüentar desde a época de graduação.

Aos meus cunhados Marcos, Roberto, Sebastião e Ricardo, por terem se tornado

os irmãos que eu não tive.

Aos meus queridos sobrinhos, Diogo, Thalma, Pamela, Maikon, Rangel,

Rodrigo, Geovana, Milena e Guilherme, por fazer minha vida mais feliz.

Às minhas irmãzinhas, Raimunda, Cristina, Maria Madalena e Carla, pelo amor,

carinho, atenção e pela união que é a melhor característica da nossa família. Amo muito

vocês.

À Maeda, pela ajuda nos momentos que precisei, por ser esta pessoa doce e

carinhosa e principalmente pelo amor que têm dedicado a mim.

Enfim, a todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a

realização deste trabalho.

i

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................... iii

LISTA DE TABELAS................................................................................................... vi

RESUMO....................................................................................................................... vii

ABSTRACT ................................................................................................................. viii

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1

1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS ........................................................................................ 1

1.2. O GÊNERO ANCISTRUS KNER, 1854 ......................................................................... 3

1.3. CITOGENÉTICA DE LORICARIIDAE........................................................................... 4

2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 10

2.1.ORIGEM E CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS ESPÉCIES ESTUDADAS ............. 10

2.2. MÉTODOS ............................................................................................................. 18

2.2.1. Indução de mitoses ....................................................................................... 18

2.2.2. Obtenção de cromossomos mitóticos ........................................................... 18

2.2.3. Obtenção de cromossomos meióticos de machos......................................... 18

2.2.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)....................... 19

2.2.5. Detecção da heterocromatina constitutiva (HC).......................................... 20

2.2.6. Análise cariotípica........................................................................................ 20

3. RESULTADOS ......................................................................................................... 22

3.1. ANCISTRUS RANUNCULUS ....................................................................................... 22

3.2. ANCISTRUS SP.1 “PURUS” ...................................................................................... 25

3.3. ANCISTRUS SP.2 “CATALÃO” ................................................................................. 28

3.4. ANCISTRUS SP.3 “BARCELOS”................................................................................ 31

3.5. ANCISTRUS SP.4 “VERMELHO”............................................................................... 34

3.6. ANCISTRUS SP.5 “RIO BRANCO” ............................................................................ 37

3.7. ANCISTRUS SP.6 “PIAGAÇÚ” .................................................................................. 41

3.8. ANCISTRUS SP.7 “DIMONA” ................................................................................... 44

3.9. ANCISTRUS SP.8 “BALBINA” .................................................................................. 47

3.10. ANCISTRUS SP.9 “TROMBETAS” ........................................................................... 50

4. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 53

ii

4.1. DIVERSIDADE CARIOTÍPICA E MECANISMOS DE EVOLUÇÃO CROMOSSÔMICA NO

GÊNERO ANCISTRUS...................................................................................................... 53

4.1.1. MECANISMOS DE CROMOSSOMOS SEXUAIS ................................................... 59

4.2. RELAÇÃO ENTRE A DIVERSIDADE CARIOTÍPICA E CARACTERÍSTICAS DA BIOLOGIA E

ETOLOGIA DOS PEIXES DO GÊNERO ANCISTRUS ............................................................. 65

5. CONSIDERAÇÃO FINAIS..................................................................................... 68

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 70

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Espécies estudadas (nome e valores de comprimento total). A) Ancistrus

ranunculus (11 cm), B) Ancistrus sp.1 “Purus” (9 cm), C) Ancistrus sp.2 “Catalão” (13

cm), D) Ancistrus sp.3 “Barcelos” (11 cm), E) Ancistrus sp.4 “Vermelho” (14 cm), F)

ancistrus sp.5 “Rio Branco” (17 cm), G) Ancistrus sp.6 “Piagaçu” (7 cm), H) Ancistrus

sp.7 “Dimona” (10,5 cm), I) Ancistrus sp.8 “Balbina” (9,5 cm), J) Ancistrus sp.9

“Trombetas” (5,3 cm) ..................................................................................................... 16

Figura 2. Mapa da Amazônia brasileira, em destaque os locais de coleta .................... 17

Figura 3. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus ranunculus, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciado (caixas) os cromossomos sexuais e os portadores

de RONs impregnadas com nitrato de prata................................................................... 23

Figura 4. A e B- Metáfases de Ancistrus ranunculus preparadas para observação de

bandas C; C- Idiograma mostrando a distribuição da heterocromatina constitutiva nesta

espécie ............................................................................................................................ 24

Figura 5. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.1 “Purus”, com coloração



Figura 6. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.1 “Purus”preparadas para observação de


espécie ............................................................................................................................ 27

Figura 7. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.2 “Catalão”, com coloração



Figura 8. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.2 “Catalão” preparadas para observação de


espécie ............................................................................................................................ 30

Figura 9. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.3 “Barcelos”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciado (caixas) cromossomos sexuais e os portadores de

RONs impregnadas com nitrato de prata........................................................................ 32

iv

Figura 10. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.3 “Barcelos” preparadas para observação

de bandas C; C- Idiograma mostrando a distribuição da heterocromatina constitutiva

nesta espécie ................................................................................................................... 33

Figura 11. Cariótipo de macho de Ancistrus sp.4 “Vermelho”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciado (caixas) os cromossomos portadores de RONs

impregnadas com nitrato de prata................................................................................... 35

Figura 12. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.4 “Vermelho” preparadas para observação


nesta espécie. .................................................................................................................. 36

Figura 13. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.5 “Rio Branco”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciado (caixa) os cromossomos sexuais e os portadores


Figura 14. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.5 “Rio Branco” preparadas para

observação de bandas C; C- Idiograma mostrando a distribuição da heterocromatina

constitutiva nesta espécie ............................................................................................... 39

Figura 15. Células meióticas de Ancistrus sp.5 “Rio Branco” observadas em coloração

convencional: A- paquíteno evidenciando cromossomos sexuais com heteropicnose

positiva (seta); B e C- célula diplotênica evidenciando 22 bivalentes autossômicos e o

bivalente sexual com heteropicnose negativa (seta); D- diacinese 22 bivalentes +

sexuais em heteropicnose negativa (seta); E- metáfase I evidenciando cromossomos

dispostos na placa equatorial e sexual com heteropicnose negativa (seta)..................... 40

Figura 16. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.6 “Piagaçu”, com coloração



Figura 17. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.6 “Piagaçu” preparadas para observação


nesta espécie ................................................................................................................... 43

Figura 18. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.7 “Dimona”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciado (caixa) os cromossomos portadores de RONs


v

Figura 19. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.7 “Dimona” preparadas para observação


nesta espécie ................................................................................................................... 46

Figura 20. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.8 “Balbina”, com coloração



Figura 21. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.8 “Balbina” preparadas para observação


nesta espécie ................................................................................................................... 49

Figura 22. Cariótipo de macho de Ancistrus sp.9 “Trombetas”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciado (caixa) os cromossomos portadores de rons


vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Informações citogenéticas disponíveis para espécies de loricariídeos da Tribo

Ancistrini (sensu Armbruster, 2004) ................................................................................ 8

Tabela 2. Alguns dados morfométricos das espécies de Ancistrus do presente estudo. 14

Tabela 3. Síntese das características cariotípicas das dez espécies de Ancistrus

analisadas no presente estudo......................................................................................... 52

vii

RESUMO

A tribo Ancistrini pertencente à subfamília Hypostominae (Siluriformes: Loricariidae),

compõe um grupo de peixes cuja sistemática é ainda pouco conhecida e estudos

filogenéticos são escassos. Ancistrus, gênero tipo da tribo Ancistrini, engloba 53

espécies válidas e pelo menos seis espécies amazônicas ainda não descritas. Com o

objetivo de verificar os mecanismos de evolução cromossômica existentes em espécies

pertencentes ao gênero Ancistrus, foram estudadas dez espécies provenientes de

diversos pontos da bacia amazônica. As análises revelaram uma grande diversidade

cariotípica, tanto na macroestrutura (número e fórmula cromossômica) como também

nos padrões de regiões organizadoras de nucléolos e de heterocromatina constitutiva. O

número diplóide variou de 34 a 52 cromossomos e o número de braços de 68 a 82. A

RON variou tanto na localização no cromossomo (terminal, intersticial, braço longo e

braço curto) como na posição no cariótipo. Poucos cromossomos apresentaram

heterocromatina constitutiva, as quais foram distribuídas em blocos discretos dispostos

em posição centromérica, terminal ou intersticial. A ocorrência de números diplóides

baixos (menor que 52) sugere a presença de fusões cêntricas na evolução cromossômica

deste grupo. Além da diversidade cariotípica, sistemas de cromossomos sexuais foram

registrados para sete das 10 espécies analisadas sendo: duas ZZ/ZW, três XX/XY e dois

sistemas múltiplos XX/XY1Y2 e Z1Z1Z2Z2/Z1Z2W1W2. Peixes do gênero Ancistrus

exibem baixa vagilidade, territorialismo e cuidado parental. Estas características

etológicas podem criar uma barreira ao fluxo gênico entre populações, permitindo

especiações micro-alopátricas e resultando na grande diversidade cariotípica encontrada

nestas espécies.

viii

ABSTRACT

The tribe Ancistrini belongs to the subfamily Hypostominae (Siluriformes:

Loricariidae). Phylogenetic studies of this group of fishes are few, leaving their

systematics relatively unknown. Ancistrus, the type genus of the Ancistrini tribe,

contains 53 valid species and at least six Amazonian species that have yet to be

described. In order to explore mechanisms of chromosome evolution in the genus

Ancistrus, we studied 10 species collected from locations across the Amazon basin. We

found a large karyotypic diversity among the ten species, in both macrostructure

(chromosome number and formula) and pattern of nucleolar organizer regions and

constitutive heterochromatin. The diploid number varied between 34 and 52

chromosomes and the number of arms varied between 68 and 82. The RON varied in

both chromosome location (terminal, interstitial, long arm, short arm) and karyotype

position. Few chromosomes presented constitutive heterochromatin; when present, this

heterochromatin was distributed in discrete blocks in the centromeric position, terminal

or interstitial. The occurrence of low diploid numbers suggests the presence of centric

fusions in the chromosomal evolution of this group. Besides documenting karyotypic

diversity, we also studied the sex chromosome systems of seven of the 10 species. We

found two cases of ZZ/ZW, three cases of XX/XY, and two multiple systems:

XX/XY1Y2 and Z1Z1Z2Z2/Z1Z2W1W2. Fish of the genus Ancistrus exhibit low vagility,

territoriality and parental care. These ethological characteristics may create a gene flow

barrier among populations, allowing microallopatric speciation and resulting in the large

karyotypic diversity found in these species.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Considerações gerais

A bacia amazônica abriga a maior e mais diversa ictiofauna do mundo,

com estimativas que variam de 1500 a 6000 espécies (Goulding, 1980; Reis et

al., 2003). A família Loricariidae, a maior dentre os Siluriformes com

aproximadamente 683 espécies válidas (Reis et al., 2003; Armbruster, 2004)

constitui um grupo muito abundante e diversificado nesse ecossistema (Fisch-

Muller et al., 2001), ocupando uma grande diversidade de habitats, que vão

desde o leito dos grandes rios, áreas de várzeas e de igapós, até igarapés de

terra-firme (Junk et al., 1983; Sabino & Zuanon, 1998; Anjos, 2005).

Os loricariídeos representam um importante recurso sócio-econômico

na região amazônica, tanto para a pesca ornamental (Ferraz, 1999; Zuanon,

1999), como também para a pesca artesanal e comercial, onde compõem uma

parte significativa dos desembarques (Petrere Jr., 1978; Goulding, 1980;

Batista & Petrere Jr., 2003). Além disso, têm grande participação na pesca de

subsistência, sendo um recurso alimentar muito utilizado por moradores

ribeirinhos (Batista et al., 1998).

Na Amazônia, os loricariídeos são popularmente conhecidos como

acaris ou bodós. Caracterizam-se por apresentar o corpo totalmente recoberto

por placas ósseas, dispostas em várias séries; boca situada em posição ventral

e em forma de ventosa; dentes alongados e geralmente bífidos, ou em forma de

colher, dispostos em uma única série em cada maxila. Possuem intestino

enovelado e extremamente longo, reflexo de seus hábitos alimentares,

2

predominantemente, detritívoros-iliófagos, (Ferreira et al., 1998; Power,

1990). Muitas espécies apresentam respiração acessória ou aérea, realizada

através do estômago, o que lhes permite sobreviver em ambientes aquáticos

extremamente pobres em oxigênio (Val & Almeida-Val, 1995; Lowe-

McConnell, 1999).

A morfologia altamente diferenciada faz dos loricariídeos um dos

grupos mais bem caracterizados entre os Siluriformes (de Pinna, 1998;

Zuanon, 1999). Segundo Armbruster (2004), cinco subfamílias são

reconhecidas entre os Loricariidae: Loricariinae (~209 espécies),

Hypoptopomatinae (~79 espécies), Neoplecostominae (~7 espécies),

Upsilodinae (~5 espécies) e Hypostominae (~386 espécies) (o número de

espécies baseado em Reis et al., 2003).

Apesar desta recente classificação, os loricariídeos representam um

grupo ainda relativamente confuso no que se refere aos aspectos taxonômicos e

sistemáticos. Muitas classificações divergentes foram feitas para essa família

(e.g., Kner, 1854; Bleeker, 1862; Eigenmann & Eigenmann, 1890; Regan,

1904; Gosline, 1945; Isbrücker, 1980; Howes, 1983; Schaefer, 1987). Tal

situação reflete a carência de estudos filogenéticos para esse grupo; além

disso, muitas espécies novas de loricariídeos continuam sendo coletadas em

áreas pobremente amostradas de diferentes sistemas hidrográficos,

especialmente na Amazônia (Armbruster, 2003).

Pertencente à subfamília Hypostominae, a tribo Ancistrini (~217

espécies) compõe um grupo de peixes cuja sistemática é ainda pouco

3

conhecida, não sendo muito numerosos os estudos filogenéticos feitos sobre

essa tribo. Com base em estudos morfológicos, esta já foi considerada uma

subfamília (Isbrücker, 1980), já comportou gêneros que não formavam um

grupo natural, sendo portanto, um grupo não monofilético, incluindo

representantes de Hypostominae (Howes, 1983), como também um grupo

monofilético bem definido (Schaefer, 1987) de composição mais restrita. Com

base em análises filogenéticas, utilizando seqüências parciais de rDNA

mitocondrial de 58 espécies de loricariídeos, foi considerada um grupo

parafilético, incluindo Loricariinae e parte de Hypostominae (Montoya-Burgos

et al., 1998).

1.2. O gênero Ancistrus Kner, 1854

Ancistrus, gênero tipo da tribo Ancistrini, é composto por um grupo de

espécies amplamente distribuídas no Neotrópico e especialmente diversificado

no sistema do rio Amazonas. Engloba 53 espécies válidas, e pelo menos seis

espécies amazônicas ainda não descritas (Fisch-Muller et al., 2001; Fisch-

Muller, 2003).

As espécies do gênero Ancistrus apresentam o corpo largo e deprimido,

cuja largura pode ser cinco a seis vezes maior que a sua altura; cabeça grande;

focinho largo com borda nua (sem placas), sendo a borda nua mais estreita nas

fêmeas e mais larga nos machos. Um número variável de tentáculos cutâneos

apresenta-se dispostos sobre o focinho, sendo pequenos nas fêmeas e maiores e

4

bifurcados nos machos. As espécies são geralmente de pequeno porte, podendo

atingir 15 cm de comprimento (Burgess, 1989).

Espécies de Ancistrus, bem como loricariídeos de uma maneira geral,

possuem pouca vagilidade e permanecem escondidos em troncos, fendas de

pedras e outros abrigos, durante o dia. Via de regra, possuem hábitos noturnos,

são territorialistas e apresentam cuidado parental, construindo ninhos e

protegendo seus ovos e filhotes (Burgess, 1989; Zuanon, 1999).

1.3. Citogenética de Loricariidae

A família Loricariidae pode ser considerada um grupo de peixes ainda

pouco estudado em nível cromossômico. Segundo Kavalco et al. (2005), os

dados citogenéticos disponíveis para esse grupo referem-se a aproximadamente

70 espécies, o que representa cerca de 10% do total estimado de espécies,

segundo Reis et al. (2003). Estudos têm mostrado que esta família apresenta

uma grande diversidade cariotípica, com o número diplóide variando de 36 em

Rineloricaria latirostris (Loricariinae) (Giuliano-Caetano, 1998) a 96 em

Upsilodus sp. (Upsilodinae) (Kavalco et al., 2005).

A maioria dos estudos citogenéticos, nessa família, foi conduzida com

espécies da subfamília Hypostominae, na qual o número diplóide varia de 38 a

80 cromossomos (Artoni, 1996; Artoni & Bertollo, 1996; Alves et al., 2003),

sendo que na tribo Ancistrini o número diplóide varia de 38 a 52 cromossomos

(Tabela 1); em Loricariinae, este número varia de 2n=36 a 2n=74 (Artoni,

1996; Giuliano-Caetano, 1998; Alves et al., 2003); nas subfamílias

5

Hypoptopomatinae e Neoplecostominae o número diplóide de 54 cromossomos

parece ser o mais comum entre as espécies estudadas (Andreata et al., 1992);

e, em Upsilodinae, há um único registro de 2n=96 cromossomos em Upsilodus

sp. (Kavalco et al., 2005).

As alterações mais comumente envolvidas na evolução cromossômica

dos peixes são os rearranjos Robertsonianos (fusões e fissões cêntricas) e os

rearranjos não Robertsonianos (inversões, deleções, duplicações e

translocações) (Denton, 1973). Em Ancistrini, as inversões pericêntricas e

paracêntricas são provavelmente os principais rearranjos cromossômicos

envolvidos no processo de evolução cariotípica (Alves et al., 2003). Tais

formas de rearranjo mantêm o número modal 2n=52 cromossomos,

predominantemente dos tipos metacêntrico e submetacêntrico, na maioria das

espécies estudadas. No entanto, esses mesmos autores sugerem que fusão

cêntrica seja o mecanismo responsável pela redução do número diplóide

encontrado em algumas espécies desta tribo (Lara, 1998; Alves et al., 2003;

Mariotto, 2003; Souza, 2003) (Tabela 1).

A maioria das espécies de peixes Neotropicais estudada

citogeneticamente não apresenta cromossomos sexuais diferenciados (Moreira-

Filho et al., 1993; Centofante et al., 2002). As espécies da família Loricariidae

até agora analisadas, também apresentam, em geral, um homomorfismo em

relação à presença destes tipos de cromossomos (Artoni & Bertollo, 2001;

Alves et al., 2005; Kavalco et al., 2005). Entretanto, alguns casos de

cromossomos sexuais em Loricariidae foram descritos e são dos tipos XX/XY

6

e ZZ/ZW. Entre espécies de Hypostominae, mecanismos do tipo XX/XY foram

observados em Hypostomus macrops (Michelle et al., 1977) e em uma

população de Ancistrus cf. dubius (Mariotto, 2003) e do tipo ZZ/ZW em

Hypostomus sp.G (Artoni et al., 1998), em uma população de Ancistrus cf.

dubius (Mariotto et al., 2004) e em Hemiancistrus spilomma (de Oliveira et

al., no prelo). Em Hypoptopomatinae, observou-se o tipo XX/XY em

Pseudocinclus tietensis (Andreata et al., 1992) e o tipo ZZ/ZW em duas

populações de Microlepidogaster leucofrenatus (Andreata et al., 1993; 1994).

Já entre os Loricariinae, o tipo ZZ/ZW foi observado em Loricariichthys

platymetopom (Scavone & Júlio Jr., 1995).

Quanto às regiões organizadoras de nucléolos (RONs), a ocorrência de

sistemas simples, com sítios na posição terminal, é a mais comum para os

loricariídeos (Artoni & Bertollo, 1996; Kavalco et al., 2005). Contudo, há

registros de sistemas múltiplos, com esses sítios localizados em posição

intersticial para algumas espécies (Artoni, 1996; Artoni & Bertollo, 1996;

Artoni & Bertollo, 2001; Souza, 2003; de Oliveira et al., no prelo.).

Sabe-se que a diversidade cromossômica pode fornecer informações

valiosas para o entendimento das relações filogenéticas entre os peixes. Dessa

forma, informações cariotípicas como a posição do centrômero, a distribuição

da heterocromatina, a posição, a localização e o número das regiões

organizadoras de nucléolos, podem ser utilizadas para auxiliar na elucidação

de problemas taxonômicos e filogenéticos (Pieczarka, 1995; Almeida-Toledo,

1998). Feldberg et al. (2003), usando informações citogenéticas disponíveis

7

para a família Cichlidae e comparando-as com propostas filogenéticas

existentes para esse grupo, puderam inferir sobre os principais rearranjos

cromossômicos e caminhos que provavelmente ocorreram no processo

evolutivo deste grupo.

1.4. Objetivo

Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar,

citogeneticamente, espécies do gênero Ancistrus, de várias localidades da

bacia amazônica e inferir sobre os possíveis mecanismos de evolução

cromossômica entre as espécies deste gênero.

8

Tabela 1. Informações citogenéticas disponíveis para espécies de loricariídeos da Tribo Ancistrini (sensu Armbruster, 2004). (2n=número diplóide; M=metacêntrico; SM=submetacêntrico; ST=subtelocêntrico; A=acrocêntrico; C. sex= cromossomos sexuais; RONs=regiões organizadoras de nucléolos; p=braço curto; q=braço longo).

Espécie Rio/Estado Brasileiro 2n Fórmula cariotípica C. sex Localização das RONs Ref.

Ancistrus n. sp.1 São Francisco/Acre 38 30M/SM+8ST (M) 5p, intersticial 1

Ancistrus cf. dubius Pantanal/ Mato Grosso 42 24M+10SM+8ST (SM) 16p, intersticial 2

Ancistrus cf. dubius Pantanal/ Mato Grosso 42 24M+10SM+8ST (XX/XY) (SM) 16p, intersticial 2

Ancistrus cf. dubius Pantanal/ Mato Grosso 44 18M+10SM+8ST+8A (ZZ/ZW) (SM) 13p, intersticial 3

Ancistrus sp. Iguaçu/Paraná 48 18M+14SM+12ST+4A (ST) p, terminal 4

Ancistrus ranunculus Xingu/Pará 48 8M+18SM+6ST+16A (ST) 15, proximal 5

Ancistrus n. sp.2 Betari/São Paulo 52 32M/SM+20ST/A (ST) 24p, terminal 1

Ancistrus multispinnis Itapocu/Santa Catarina 52 28M/SM+24ST/A (ST) 17p, terminal 1

Hemiancistrus sp. Araguaia/Mato Grosso 52 20M+20SM+8ST+4A (SM) 9p, terminal 6

Hemiancistrus spinosissimus Araguaia/Mato Grosso 52 26M+22SM+4ST (SM) 17p, terminal 8

Hemiancistrus spilomma Araguaia/Mato Grosso 52 ♀25M+21SM+6ST ♂24M+22SM+6ST

(ZZ/ZW) (M) 29p, terminal; (SM) 8q, terminal; (M) 3p, terminal

8

Megalancistrus aculeatus Paraná/Paraná 52 26M+26SM (SM) p, Intersticial 4

Panaque cf. nigrolineatus Araguaia/Mato Grosso 52 26M+20SM+6ST (A) p, terminal 6

Baryancistrus cf. niveatus Xingu/Pará 52 16M+32SM+4ST (M) 3p, intersticial 7

Baryancistrus sp.1 Jarí/Pará 52 8M+34SM+10ST (SM) 18p, intersticial 5

Baryancistrus sp.2 Xingu/Pará 52 18M+30SM+4ST (M) 6p, intersticial 5

9

Cont. Tabela 1 Baryancistrus sp.3 Xingu/Pará 52 14M+26SM+12ST (M) 4p, intersticial 5

Parancistrus sp.1 Xingu/Pará 52 20M+26SM+6ST (M) 8p, intersticial 5

Peckoltia vittata Xingu/Pará 52 16M+20SM+14ST+2A (ST) 9q, terminal 5

Peckoltia sp.1 Jarí/Pará 52 18M+26SM+6ST+2A (SM) 10q, terminal; 25q, terminal

5

Peckoltia sp.2 Jarí/Pará 52 16M+16SM+18ST+2A (SM) 17q, terminal; 18q, terminal

5

Referências: 1= Alves et al. (2003); 2= Mariotto (2003); 3= Mariotto et al. (2004); 4= Lara (1998); 5= Souza (2003);

6= Artoni & Bertollo (2001); 7= Souza et al. (2004); 8= de Oliveira et al. (no prelo);

10

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Origem e características morfológicas das espécies estudadas

Foi analisada, no presente estudo, a estrutura cariotípica de dez

espécies de peixes pertencentes ao gênero Ancistrus, as quais foram

coletadas em vários pontos da bacia amazônica. Algumas coletas foram

realizadas aproveitando excursões de outros projetos com objetivo de obter

um número maior de espécies de diferentes localidades. A princípio, cada

lote de exemplares, de cada localidade, foi considerado como uma entidade

biológica distinta, para posterior análise e discussão dos resultados obtidos

(Figura 1 e 2). Para uma melhor caracterização das espécies foi feita uma

breve descrição morfológica, baseada em algumas proporções corporais e

nos padrões de colorido (material fresco), de modo a facilitar a

identificação das espécies em ocasiões futuras (Segundo S. Fisch-Muller

comunicação pessoal, a maioria dessas espécies ainda não foram descritas).

Lotes de exemplares-testemunho foram depositados na coleção de peixes do

INPA (Tabela 2).

Ancistrus ranunculus: cinco exemplares (3 ♂ e 2 ♀) foram

adquiridos junto a exportadores de peixes ornamentais (Turkys Aquarium),

originários do rio Xingu, região de Altamira, Pará. Esta espécie apresenta

dorsalmente, coloração de fundo escura e/ou preta uniforme e não

apresentando pintas pelo corpo; ventralmente, coloração cinza uniforme; a

nadadeira dorsal possui coloração preta uniforme (Figura 1A).

Ancistrus sp.1 “Purus”: 12 exemplares (5 ♂ e 7 ♀) foram adquiridos

junto a exportadores de peixes ornamentais (K2), originários do rio Purus

11

na região de (Santa Maria). Esta espécie apresenta dorsalmente, coloração

de fundo marrom com pintas amareladas maiores que a pupila distribuídas

pelo corpo; ventralmente, coloração marrom com manchas difusas; a

nadadeira dorsal possui coloração de fundo preta com listras horizontais

claras (Figura 1B).

Ancistrus sp.2 “Catalão”: 12 exemplares (5 ♂ e 7 ♀) foram

coletados no Lago Catalão, localizado na região de confluência dos rios

Solimões e Negro (S03º10’45.0”, W059º54’25.4”). Esta espécie apresenta

dorsalmente, coloração de fundo preta com pintas amareladas menores que

a pupila distribuídas pelo corpo; ventralmente, coloração escura, com

manchas pequenas difusas; a nadadeira dorsal possui coloração de fundo

preta com listras horizontais claras (Figura 1C).

Ancistrus sp.3 “Barcelos”: 11 exemplares (7 ♂ e 4 ♀) foram

coletados no rio Demeni, médio rio Negro. Esta espécie apresenta

dorsalmente, coloração de fundo preta com pintas brancas muito pequenas

(pontilhado fino); ventralmente, coloração escura com pintas claras bem

definidas maiores que as do corpo; a nadadeira dorsal possui coloração

preta com pontilhado branco e borda branca (Figura 1D).

Ancistrus sp.4 “Vermelho”: cinco exemplares (5 ♂) foram coletados

no rio Demeni, médio rio Negro. Esta espécie apresenta dorsalmente,

coloração de fundo cinza/amarronzado sem pintas; ventralmente, coloração

amarronzada com manchas claras bem definidas e muito pequenas;

coloração da nadadeira dorsal cinza uniforme (Figura 1E).

12

Ancistrus sp.5 “Rio Branco”: 12 exemplares (6 ♂ e 6 ♀) foram

coletados no igarapé Macoari, afluente do rio Branco, no estado de Roraima

(S01º10’30,9”, W061º51’05,3”). Esta espécie apresenta dorsalmente,

coloração de fundo marrom escuro com pintas vermelhas menores que a

pupila; ventralmente, coloração escura com pequenas manchas difusas; a

nadadeira dorsal possui coloração escura com pintas vermelhas (Figura 1F).

Ancistrus sp.6 “Piagaçu”: sete exemplares (3 ♂ e 4 ♀) foram

coletados no Lago Aiapuá, localizado na margem esquerda do rio Purus, na

Reserva de Desenvolvimento Sustentável Piagaçú-Purus (S04º27’26”,

W062º11’56”). Esta espécie possui dorsalmente, coloração de fundo cinza

escura com pintas brancas minúsculas; ventralmente, coloração cinza

amarelado com pontilhado bem definido, que nos exemplares menores,

assemelha a ocelos; coloração da nadadeira dorsal cinza escura com

pontilhado minúsculo (Figura 1G).

Ancistrus sp.7 “Dimona”: oito exemplares (6 ♂ e 2 ♀) foram

coletados em um igarapé localizado a 80 km ao norte de Manaus, na

Fazenda Dimona (S02º19’45,5”,W60°04’39,0”) que é uma das áreas de

estudo do projeto Dinâmica Biológica de Fragmentos Florestais

(INPA/Smithsonian Institute). Esta espécie apresenta dorsalmente,

coloração de fundo preta com pontilhado branco esverdeado muito pequeno;

ventralmente, coloração escura com pontilhado bem definido; possui

nadadeira dorsal transparente (membranas hialinas) com pontilhados sobre

os raios (Figura 1H).

13

Ancistrus. sp.8 “Balbina”: 12 exemplares (6 ♂ e 6 ♀) foram

coletados no igarapé Barretinho, município de Balbina à 180 km ao norte de

Manaus, (S01º58’20”, W059º29’48”). Esta espécie possui dorsalmente,

coloração de fundo marrom com pintas grandes, maiores que a pupila, de

coloração olivácea; ventralmente, coloração escura com pintas grandes e

bem definidas; a nadadeira dorsal possui coloração com faixas pretas e

brancas alternadas (Figura 1I).

Ancistrus. sp.9 “Trombetas”: 1 exemplar (1 ♂) foi coletado no rio

Trombetas estado do Pará. Esta espécie apresenta dorsalmente, coloração de

fundo cinza escuro com pintas brancas menores que a pupila; ventralmente,

coloração escura com pontilhado bem definido coloração da nadadeira

dorsal marrom/acinzentada (Figura 1J).

Algumas medidas morfométricas podem ser observadas na tabela 2.

14

Tabela 2. Alguns dados morfométricos das espécies de Ancistrus do presente estudo. Nº. Reg.= número do registro no Laboratório de Genética de Peixes do INPA; N.R.D.= número de raios da nadadeira dorsal; N.P.L.= número de placas da linha lateral; D.O/I.O.= diâmetro do olho/interorbital; C.C.= comprimento da cabeça; C.P.= comprimento padrão (mm).

Espécie Nº. Reg. N.R.D. N.P.L. D.O/I.O. C.C. C.P. Número INPA

Ancistrus ranunculus 7236 6744 6748

I+7 26 0,23 0,34 0,40

38,7 19,8 17,4

90,8 50,7 45,5

25624

Ancistrus sp.1 “Purus” 6649 6662 6658

I+7 24 0,38 0,39 0,37

19,2 19,9 18,8

59,9 64

60,9 25625

Ancistrus sp.2 “Catalão” 6940 6922 6937

I+7 23-25 0,31 0,35 0,34

27,2 31,6 26,9

89 95,2 88,8

25626

Ancistrus sp.3 “Barcelos” 7254 7248 7247

I+8 a I+9 22-23

0,35 0,47 0,48

35 26,9 25,4

101 82,5 81,2

25627

Ancistrus sp.4 “Vermelho” 7241 7265 7266

I+7 23 0,36 0,39 0,41

35,9 33,8 28,7

111,3 107 87

25628

Ancistrus sp.5 “Rio Branco” 7407 7262 7409

I+8 23-24 0,36 0,34 0,38

41,4 44,9 33

135,2 134,7 105,5

25629

15

Cont. tabela 2

Ancistrus sp.6 “Piagaçu” 6745 6737 6738

I+8 23 0,35 0,39 0,49

44,7 26,7 17,9

125,5 80

53,2 25630

Ancistrus sp.7 “Dimona” 7373 7374 7376

I+7 24 0,40 0,40 0,40

23 17,3 14,3

82,6 64,7 57,8

25631

Ancistrus sp.8 “Balbina” 7380 7448 7449

I+7 23-24 0,39 0,41 0,44

27,2 25,9 19,9

90,3 86,9 71,4

25632

Ancistrus sp.10 “Trombetas” 7406 I+7 23 0,46 13,46 37,12 25633

16

Figura 1. Espécies estudadas (Nome e valores de comprimento total). A)

Ancistrus ranunculus (11 cm), B) Ancistrus sp.1 “Purus” (9 cm), C) Ancistrus sp.2 “Catalão” (13 cm), D) Ancistrus sp.3 “Barcelos” (11 cm), E) Ancistrus sp.4 “Vermelho” (14 cm), F) Ancistrus sp.5 “Rio branco”(17 cm), G) Ancistrus sp.6 “Piagaçu”(7 cm), H) Ancistrus sp.7 “Dimona” (10,5 cm), I) Ancistrus sp.8 “Balbina” (9,5 cm), J) Ancistrus sp.9 “Trombetas” (5,3 cm).

17

Figura 2: Mapa da Amazônia brasileira, em destaque os locais de coleta.

1= Rio Xingu; 2= Rio Purus; 3= Área do Catalão; 4= Rio Demeni; 5= Igarapé

Macoari; 6= Lago Aiapuá; 7= Igarapé Dimona; 8= Igarapé Barretinho; 9= Rio

Trombetas.

18

2.2. Métodos

2.2.1. Indução de mitoses

Para indução à formação de um número de metáfases satisfatório por

indivíduo preparado, foi aplicada uma solução de fermento biológico na

proporção de 1ml para cada 100g de peso vivo, conforme metodologia

descrita por Oliveira (1987).

2.2.2. Obtenção de cromossomos mitóticos Os exemplares foram sacrificados e retirou-se o rim, que é o órgão

hematopoiético em peixes. Para obtenção de cromossomos mitóticos,

aplicou-se a técnica de suspensão celular por “air drying”, adaptada para

peixes por Bertollo et al. (1978), com as seguintes modificações:

Injetou-se, na região intraperitonial, colchicina a 0,0125% na

proporção de 1ml para cada 100g de peso vivo. Após isso, o peixe foi

deixado em um aquário bem aerado por um período de 45 a 50 minutos.

Para a análise do material, pingou-se duas a três gotas da suspensão

obtida em uma lâmina limpa, aquecida a 60ºC, em banho-maria. A mesma

foi corada com Giemsa a 5% em solução tampão fosfato (pH=6,8), durante

10 minutos. Em seguida, lavou-se a lâmina em água corrente, deixando-se

secar ao ar.

2.2.3. Obtenção de cromossomos meióticos de machos Para o estudo dos cromossomos meióticos foram utilizadas células

gonadais masculinas, empregando-se a técnica descrita por Kligerman &

19

Bloom (1977) adaptada para peixes por Bertollo et al. (1978), com as

seguintes modificações:

O modo de aplicação da colchicina e o intervalo para o sacrifício do peixe são

os mesmos da técnica usada para obtenção de cromossomos mitóticos. Após o sacrifício

do peixe, os testículos foram seccionados em fragmentos bem pequenos e colocados em

solução hipotônica de KCl a 0,075M por 30 minutos. Logo após, o material foi

transferido para uma cubeta contendo fixador Carnoy (metanol 3: 1 ácido acético)

recém-preparado, por 20 minutos. O processo de fixação foi repetido por mais duas

vezes. Em seguida, o material foi guardado em refrigerador a 4º C, em tubos tipo

“eppendorf”, com fixador Carnoy. Para continuação da técnica, os fragmentos foram

retirados do fixador e secos em papel de filtro. Em seguida, este foi colocado sobre uma

lâmina limpa e macerado em 1ml de ácido acético 50%, com o auxílio de um bastão de

vidro. A lâmina foi levada a uma placa aquecedora a 40º C, até secar. Posteriormente,

esta foi corada com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8 por 10 minutos,

sendo em seguida lavada em água corrente e seca diretamente ao ar.

Para interpretação da meiose foram consideradas as seguintes fases:

leptóteno/zigóteno, paquíteno, diplóteno, diacinese, metáfase I e metáfase

II, dando maior ênfase ao diplóteno, diacinese, metáfase I e metáfase II, as

quais são, em geral, mais elucidativas na determinação de rearranjos

cromossômicos (John, 1990).

2.2.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) Para a observação das RONs foi utilizada a metodologia de

impregnação com nitrato de prata (AgNO3) em metáfases fixadas, descrita

por Howell & Black (1980), com as seguintes adaptações:

20

Foi suprimido o tratamento da lâmina em HCl a 1 N a 60°C em

banho-maria, por 4 minutos; e após pingar sobre uma lâmina, preparada

conforme a técnica adotada para cromossomos mitóticos, três gotas de

solução aqüosa de gelatina a 2%, acrescida de ácido fórmico (1:100ml) e

adicionar três gotas de solução aqüosa de nitrato de prata a 50%, foram

acrescentadas três gotas de água destilada.

2.2.5. Detecção da heterocromatina constitutiva (HC) Para análise da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica

descrita por Sumner (1972), com as seguintes adaptações:

A lâmina foi tratada com ácido clorídrico (HCl) 0,2N por 2 minutos,

em banho-maria a 47ºC. Em seguida, incubou-se a lâmina em solução

2XSSC (Cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 7,0), a 60ºC,

por 10 minutos. Posteriormente, tratou-se a lâmina em solução de hidróxido

de bário (5%), recém preparada e filtrada, a 47ºC, durante 25 segundos, e

lavou-se a lâmina, rapidamente, em HCl (0,2N).

Para finalizar, incubou-se a lâmina novamente em solução 2XSSC a

60ºC, durante 20 minutos e corou-se com solução de Giemsa a 5% em

solução tampão fosfato pH 6,8 durante 10 minutos. É importante salientar

que, após cada tratamento, a lâmina foi lavada em água destilada e deixada

ao ar livre, até secar totalmente.

2.2.6. Análise cariotípica As preparações cromossômicas foram analisadas em microscópio

óptico, e, após a contagem dos cromossomos em cerca de 30 metáfases por

indivíduo, foi estabelecido o valor modal do número diplóide para cada

21

espécie. Para saber a localização dos blocos de heterocromatina constitutiva

foi feito banda C seqüencial em todas as espécies.

As melhores metáfases, isto é, aquelas que apresentaram um bom

espalhamento e morfologia mais nítida dos cromossomos, foram

fotografadas em microscópio Olympus BH-2 com adaptação do sistema PM-

6 para fotografia e com objetiva de imersão. Os negativos foram obtidos em

filmes KODAK IMAGELINK – HQ e AGFA, regulados para asa 25, com

revelação processada em revelador Dektol Kodak. Os negativos

selecionados foram copiados em papel Kodabrome Print RC F3.

Os cromossomos foram recortados, medidos utilizando-se o software

ImageJ (Rasband, 1997), e em seguida, emparelhados. Para a classificação

dos cromossomos foram medidas ambas as cromátides e determinado o

comprimento médio do braço maior (BM), do braço menor (Bm) e o

comprimento médio total (Ct) de cada cromossomo. A relação de braços

(RB) foi calculada dividindo-se o comprimento médio do braço maior pelo

comprimento médio do braço menor (RB=BM/Bm).

Os cromossomos homólogos foram emparelhados em ordem

decrescente de tamanho e separados em grupos de acordo com a

nomenclatura proposta por Levan et al. (1964) em metacêntricos (RB de 1,0

a 1,70), submetacêntricos (RB de 1,71 a 3,0), subtelocêntricos (RB de 3,01

a 7,0) e acrocêntricos (RB > 7,0). Para se determinar o número fundamental

(NF), que é o número de braços cromossômicos do cariótipo, foram

considerados os cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e

subtelocêntricos como tendo dois braços e acrocêntricos como tendo um só

braço.

22

3. RESULTADOS 3.1. Ancistrus ranunculus

Esta espécie apresentou número modal de 2n=48 cromossomos e

número fundamental igual a 82, para ambos os sexos. Entretanto, a fórmula

cariotípica foi divergente entre machos e fêmeas, sendo

20M+8SM+6ST+14A e 19M+9SM+6ST+14A, respectivamente. Com base

no heteromorfismo do cariótipo feminino, sugere-se um mecanismo de

cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW, onde o cromossomo Z é representado

por um pequeno metacêntrico (10° par do complemento) e o W por um

submetacêntrico médio (Figura 3).

As RONs estão localizadas na região proximal dos braços longos do

16° par, sendo coincidentes com blocos de heterocromatina e portanto,

banda C positivas. Foi observado heteromorfismo no tamanho das RONs

entre os homólogos (Figura 3).

Foram observados blocos de heterocromatina conspícuos na região

distal dos pares 18°, 20°, 21° e 24°, na região proximal do 16° par e um

pequeno bloco pericentromérico no 9° par. Um padrão interessante foi

detectado no cromossomo W, que além de possuir pequenos blocos

pericentroméricos, também observados em Z, apresentou uma considerável

porção de heterocromatina no braço longo (Figuras 4A e B).

23

Figura 3. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus ranunculus, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciando (caixas) os cromossomos sexuais e

os portadores de RONs impregnadas com nitrato de prata.

M= metacêntrico; SM= submetacêntrico; ST= subtelocêntrico; A= acrocêntrico.

24

Figura 4. A e B- Metáfases de Ancistrus ranunculus preparadas para

observação de bandas C; C- Idiograma mostrando a distribuição da

heterocromatina constitutiva nesta espécie.


Setas indicam os cromossomos portadores das RONs banda C positiva e os sexuais.

25

3.2. Ancistrus sp.1 “Purus”


número fundamental igual a 68, para ambos os sexos. Entretanto, a fórmula

cariotípica foi divergente entre machos e fêmeas, sendo 21M+11SM+2ST e

20M+12SM+2ST, respectivamente. Com base no heteromorfismo do

cariótipo masculino, sugere-se um mecanismo de cromossomos sexuais do

tipo XX/XY, onde o cromossomo X é representado por um submetacêntrico

grande (11° par do complemento) e o Y por um metacêntrico pequeno

(Figura 5).

As RONs estão localizadas na região distal dos braços curtos do 4°

par (Figura 5), sendo coincidentes com blocos de heterocromatina e,

portanto, banda C positivas.

Detectaram-se blocos heterocromáticos pericentroméricos nos pares

1, 2 e 3, blocos distais nos braços curtos dos pares 4 e 12, um bloco

proximal nos braços curtos do par 8, e um pequeno bloco intersticial nos

braços curtos do 2° par (Figuras 6 A, B e C).

26

Figura 5. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.1 “Purus”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciando (caixas) os cromossomos sexuais e os

portadores de RONs impregnadas com nitrato de prata.

M= metacêntrico; SM= submetacêntrico; ST= subtelocêntrico.

27

Figura 6. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.1 “Purus” preparadas para

observação de bandas C; C- Idiograma mostrando a distribuição

da heterocromatina constitutiva nesta espécie.


Setas indicam os cromossomos portadores das RONs banda C positivas.

28

3.3. Ancistrus sp.2 “Catalão”


número fundamental igual a 68 para ambos os sexos. A fórmula cariotípica

foi 22M+8SM+4ST para machos e fêmeas. Contudo, foi detectado um

heteromorfismo no tamanho entre os homólogos do 5° par do complemento

no cariótipo masculino, evidenciando um mecanismo de cromossomos

sexuais do tipo XX/XY, sendo o cromossomo X representado por um

metacêntrico de tamanho médio (5° par do complemento) e o Y por um

pequeno metacêntrico (Figura 7).

As RONs estão localizadas na região distal dos braços curtos do 4°

par (Figura 7), sendo coincidentes com blocos de heterocromatina e,


Foram observados pequenos blocos pericentroméricos de

heterocromatina nos pares 1 e 3, um bloco proximal no par 9, blocos

intersticiais pequenos nos braços curtos dos pares 2, 6 e 7 e um bloco mais

conspícuo na região distal dos braços curtos do 4º par (Figuras 8A, B e C).

29

Figura 7. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.2 “Catalão”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciando (caixas) os cromossomos sexuais e os



30

Figura 8. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.2 “Catalão” preparadas para





31

3.4. Ancistrus sp.3 “Barcelos”


número fundamental igual a 78 para machos e 77 para as fêmeas. A fórmula

cariotípica foi 12M+12SM+4ST+24A para machos e 11M+12SM+4ST+25A

para fêmeas. Com base no heteromorfismo do cariótipo feminino, sugere-se

um mecanismo de cromossomos sexuais do tipo Z1Z1Z2Z2/Z1Z2W1W2. O

cromossomo Z1 é um pequeno metacêntrico (5° par do complemento), o

cromossomo Z2 é o maior submetacêntrico do complemento (7° par), o W1 é

um acrocêntrico pequeno e o W2 é um submetacêntrico médio (Figura 9).

As RONs foram localizadas nos braços curtos do 23° par (Figura 9),

sendo coincidentes com blocos de heterocromatina e, portanto, banda C

positivas.

Pequenos blocos pericentroméricos de heterocromatina foram

observados nos pares 15, 16 e 17, blocos conspícuos foram localizados nos

braços curtos dos pares 14 e 23, e em posição intersticial nos braços longos

dos pares 1 e 11 e nos braços curtos do 2º par. Não foram encontrados

blocos de heterocromatina nos cromossomos sexuais. (Figuras 10A, B e C).

32

Figura 9. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.3 “Barcelos”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciando (caixas) cromossomos sexuais e os



33

Figura 10. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.3 “Barcelos” preparadas para




Setas indicam os cromossomos portadores das RONs banda C positiva.

34

3.5. Ancistrus sp.4 “Vermelho”

Desta espécie foram analisados apenas machos e o número modal

observado foi de 2n=42 cromossomos, número fundamental igual a 78 e

fórmula cariotípica 26M+6SM+4ST+6A (Figura 11).

As RONs foram localizadas na região terminal dos braços longos do

20° par (Figura 11), sendo coincidentes com blocos de heterocromatina e,


Detectou-se blocos intersticiais de heterocromatina nos braços

curtos dos pares 2, 3, 6, 14 e 15 e nos braços longos dos pares 3, 4, 5 e 8.

Blocos distais foram localizados nos braços curtos do par 7 e nos braços

longos dos pares 14 e 20. Foram observados dois blocos proximais nos

pares 17 e 19 e dois pequenos blocos pericentroméricos nos pares 4 e 15

(Figuras 12A e B).

35

Figura 11. Cariótipo de macho de Ancistrus sp.4 “Vermelho”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciando (caixas) os cromossomos



36

Figura 12. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.4 “Vermelho” preparadas para





37

3.6. Ancistrus sp.5 “Rio Branco”


número fundamental igual 81 para machos e 82 para fêmeas. A fórmula

cariotípica foi 18M+11SM+6ST+11A para machos e 18M+12SM+6ST+10A

para fêmeas. Com base no heteromorfismo do cariótipo masculino, sugere-

se um mecanismo de cromossomos sexuais do tipo XX/XY. Os

cromossomos X são pequenos submetacêntricos (15° par do complemento) e

o cromossomo Y é um acrocêntrico médio (Figura 13).

As análises da meiose evidenciaram no paquíteno a presença de

cromossomos sexuais com heteropicnose positiva. No diplóteno e diacinese

foram visualizados 22 bivalentes autossômicos e o bivalente sexual com

heteropicnose negativa. Na metáfase I os bivalentes mostraram-se dispostos

no equador da célula, com o bivalente sexual com heteropicnose negativa

(Figura 15A-E).

As RONs foram localizadas na região distal dos braços curtos do

19° par (Figura 13), sendo coincidentes com blocos de heterocromatina e,


Foram observados blocos intersticiais de heterocromatina nos

braços longos dos pares 2, 19 e 21. Blocos distais conspícuos localizaram-

se nos braços curtos dos pares 17 e 19 e nos braços longos do 20º par, e um

pequeno bloco distal foi localizado nos braços curtos do 2º par. Um bloco

pericentromérico foi observado no 20º par (Figuras 14A-C).

38

Figura 13. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.5 “Rio Branco”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciando (caixa) os cromossomos sexuais e os



39

Figura 14. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.5 “Rio Branco” preparadas para





40

Figura 15. Células meióticas de Ancistrus sp.5 “Rio Branco” observadas em

coloração convencional: A- paquíteno evidenciando cromossomos

sexuais com heteropicnose positiva (seta); B e C- célula

diplotênica evidenciando 22 bivalentes autossômicos e o

bivalente sexual com heteropicnose negativa (seta); D- diacinese

22 bivalentes + sexuais em heteropicnose negativa (seta); E-

metáfase I evidenciando os bivalentes dispostos na placa

equatorial e o sexual com heteropicnose negativa (seta).

41

3.7. Ancistrus sp. 6 “Piagaçú”

Esta espécie apresentou número modal de 2n= 52 cromossomos e número

fundamental igual a 78 para os machos e 79 para as fêmeas. A fórmula cariotípica foi

16M+8SM+2ST+26A e 16M+9SM+2ST+25A, para machos e fêmeas, respectivamente.

Com base no heteromorfismo do cariótipo feminino, sugere-se um mecanismo de

cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW, sendo os cromossomos Z representados por

acrocêntricos grandes (16° par do complemento) e o W por um submetacêntrico

pequeno (Figura 16).

As RONs foram localizadas nos braços curtos do 26° par (Figura 16), sendo

coincidentes com grandes blocos de heterocromatina e, portanto, banda C positivas.

Foram observados pequenos blocos pericentroméricos de heterocromatina nos

pares 1, 9, 14, 15, 17, 22, 23, 24 e 25, blocos intersticiais nos braços longos dos pares 2

e 4 e nos braços curtos do par 2, um bloco distal pequeno nos braços curtos do 2° par e

um bloco distal bem conspícuo nos braços curtos do 26° par (Figuras 17A-C).

42

Figura 16. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.6 “Piagaçu”, com coloração




43

Figura 17. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.6 “Piagaçu” preparadas para





44

3.8. Ancistrus sp.7 “Dimona”

Esta espécie apresentou número modal de 2n=52 cromossomos e número

fundamental igual a 78. A fórmula cariotípica foi 16M+8SM+2ST+26A, para machos e

fêmeas. Não foram encontradas diferenças cromossômicas relacionadas ao sexo. (Figura

18).

As RONs foram localizadas na região intersticial dos braços longos do 13° par

(Figura 18), sendo coincidentes com blocos de heterocromatina e, portanto, banda C

positivas.

Foram observados blocos de heterocromatina intersticial nos braços longos dos

pares 1 e 13 e blocos pericentroméricos nos pares 2, 4 e 21 e em um dos homólogos dos

pares 1 e 13 (Figuras 19A-C).

45

Figura 18. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.7 “Dimona”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciando (caixa) os cromossomos portadores

de RONs impregnadas com nitrato de prata.


46

Figura 19. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.7 “Dimona” preparadas para





47

3.9. Ancistrus sp.8 “Balbina”

Esta espécie apresentou número modal de 2n=39 cromossomos, número

fundamental igual a 78 e fórmula cariotípica 27M+10SM+2ST para machos e número

modal de 2n=38 cromossomos, número fundamental igual a 76 e fórmula cariotípica

26M+10SM+2ST para fêmeas. Com base na diferença numérica encontrada no

cariótipo masculino, em relação ao feminino, sugere-se um mecanismo de cromossomos

sexuais do tipo XX/XY1Y2, sendo os cromossomos X representados por metacêntricos

grandes (2° par do complemento) e os cromossomos Y por pequenos metacêntricos (14°

par do complemento masculino) (Figura 20).

As RONs foram localizadas na região terminal dos braços longos do 12° par

(Figura 20), sendo coincidentes com blocos de heterocromatina e, portanto, banda C

positivas.

Foram observados blocos intersticiais de heterocromatina nos braços curtos

dos pares 3, 4 e 14 e nos braços longos do par 6, blocos pericentroméricos nos pares 8 e

9, blocos distais nos braços longos do par 12 e blocos proximais nos braços longos do

19° par (Figuras 21A-C).

48

Figura 20. Cariótipo de macho e fêmea de Ancistrus sp.8 “Balbina”, com coloração




49

Figura 21. A e B- Metáfases de Ancistrus sp.8 “Balbina” preparadas para





50

3.10. Ancistrus sp.9 “Trombetas”

Desta espécie foi analisado apenas um macho e o número modal observado foi

de 2n=38 cromossomos, número fundamental igual a 73 e fórmula cariotípica

22M+8SM+5ST+3A. Não foi possível emparelhar dois cromossomos do complemento,

o que sugere um mecanismo de cromossomos sexuais do tipo XX/XY. No entanto, este

heteromorfismo só poderá ser confirmado quando for analisado o cariótipo feminino

(Figura 22).

As RONs foram localizadas na região pericentromérica do 5° par (Figura 22).

51

Figura 22. Cariótipo de macho de Ancistrus sp.9 “Trombetas”, com coloração

convencional em Giemsa, evidenciando (caixa) os portadores de RONs

impregnadas com nitrato de prata.


52

Tabela 3. Síntese das características cariotípicas das dez espécies de Ancistrus analisadas no presente estudo. (2n=número diplóide; NF=número fundamental; M=metacêntrico; SM=submetacêntrico; ST=subtelocêntrico; A=acrocêntrico; RON=regiões organizadora de nucléolo; p=braço curto; q=braço longo; ?=provável XX/XY).

Espécie Nº de individuos 2n NF Localização da

RON Formula Cariotípica Mecanismo Par sexual Local de coleta

♂ ♀

A. ranunculus 3 2 48 82 16ºSTq, intersticial

♂ 20M+8SM+6ST+14A ♀ 19M+9SM+6ST+14A ZZ/ZW 10ºM Rio Xingu/ PA

Ancistrus sp 1 5 7 34 68 4ºMp, terminal ♂ 21M+11SM+2ST ♂ 20M+12SM+2ST XX/XY 11ºSM Rio Purus/ AM

Ancistrus sp 2 6 6 34 68 4ºMp, terminal ♂ 21M+9SM+4ST ♀ 22M+8SM+4ST XX/XY 5ºM Lago Catalão/ AM

Ancistrus sp3 7 4 52 ♂ 78♀ 77 23ºAp, terminal ♂ 12M+12SM+2ST+26A

♀ 11M+11SM+3ST+27A Z1Z1Z2Z2/ Z1Z2W1W2

5ºM, 7ºSM Rio Demeni/ AM

Ancistrus sp 4 5 - 42 ♂ 78 20ºAq, terminal ♂ 26M+6SM+4ST+6A -------- ---------- Rio Demeni/ AM

Ancistrus n. sp 5 5 6 46 ♂ 81♀ 82 19ºAp, terminal ♂ 18M+11SM+6ST+11A

♀ 18M+12SM+6ST+10A XX/XY 15ºSM Rio Branco/ RR

Ancistrus sp 6 3 4 52 ♂ 78♀ 79 26ºAp, terminal ♂ 14M+10SM+2ST+26A

♀ 14M+11SM+2ST+25A ZZ/ZW 16ºA Lago Aiapuá/ AM

Ancistrus sp 7 6 2 52 78 13ºSTq, intersticial

♂ 16M+8SM+2ST+26A ♀ 16M+8SM+2ST+26A -------- ---------- Igarapé Dimona/ AM

Ancistrus sp 8 6 6 ♂ 39♀ 38

♂ 78♀ 76 12ºMq, terminal ♂ 27M+10SM+2ST

♀ 26M+10SM+2ST XX/XY1Y2 2ºM Igarapé Barretinho/ AM

Ancistrus sp 9 1 - 38 ♂ 73 5°M, pericentromérica ♂ 22M+8SM+5ST+3A ? 17°ST Rio Trombetas/ PA

53

4. DISCUSSÃO

4.1. Diversidade cariotípica e mecanismos de evolução cromossômica no gênero

Ancistrus

Estudos citogenéticos conduzidos na família Loricariidae indicam que o

número diplóide de 54 cromossomos, predominantemente dos tipos meta e

submetacêntrico, representa a condição plesiomórfica para este grupo de peixes (Artoni,

1996; Artoni & Bertollo, 2001; Kavalco et al., 2005). Em Hypoptopomatinae, salvo

Otocinclus aff. vestitus (Andreata et al., 1994) com 2n= 72, todas as espécies estudadas

apresentam 2n=54 cromossomos. Em Loricariinae, o número diplóide basal é

encontrado nas espécies do gênero Loricariichthys (Scavone & Julio Jr., 1995). Em

Neoplecostominae, todas as espécies estudadas possuem número diplóide de 54

cromossomos (Alves et al., 2005; Kavalco et al., 2005). Em Hypostominae, esta

característica também foi observada em Hypostomus plecostomus (Muramoto et al.,

1968), Rhinelepis aspera e Pogonopoma wertheimeri (Artoni & Bertollo, 2001). A

hipótese de que o número diplóide de 54 cromossomos representa uma condição basal

entre os loricariídeos é corroborada pela ocorrência deste número diplóide em grupos

próximos a Loricariidae, tais como, Tricomycteridae (Torres et al., 1998; Sato et al.,

2004) e Callichthyidae (Porto & Feldberg, 1993).

Embora os dados citogenéticos disponíveis para Ancistrini ainda sejam

escassos em vista da quantidade de espécies que compõe esta tribo, há indícios de que

este grupo apresente como número diplóide ancestral 52 cromossomos (Artoni &

Bertollo, 2001; Alves et al., 2003), principalmente dos tipos meta e submetacêntricos

(Tabela 1), uma sinapomorfia em relação aos outros grupos de Loricariidae. Dentre os

gêneros pertencentes à Ancistrini com número diplóide conhecido, somente Ancistrus

54

apresenta registros de números diplóides diferentes do considerado ancestral, possuindo

uma grande diversidade cariotípica, onde o número diplóide varia de 34 a 52

cromossomos (incluindo dados do presente estudo). Isto demonstra que intensos

processos de rearranjos cromossômicos podem estar associados à evolução cariotípica

de Ancistrus, os quais indicam uma tendência evolutiva para a redução do número

diplóide neste táxon.

Alves et al. (2003) acreditam que rearranjos cromossômicos do tipo fusões

cêntricas tenha predominado na evolução cariotípica de Ancistrus. Deste modo, a

presença de 2n=34 cromossomos em Ancistrus sp.1 “Purus” e Ancistrus sp.2 “Catalão”,

menor número diplóide já registrado para Ancistrini e para Loricariidae, corroboram

esta hipótese. Contudo, inversões pericêntricas e translocações também devem ter

ocorrido na diversificação cariotípica deste gênero. Tais mecanismos explicariam a

presença de cromossomos acrocêntricos, principalmente nas espécies que apresentam

número diplóide igual a 52 cromossomos, onde a maior parte do complemento é

constituída por cromossomos deste tipo. Além disso, tais mecanismos também

explicariam a grande diversidade no número fundamental, que variou de 68 em

Ancistrus sp.1 “Purus” e Ancistrus sp.2 “Catalão a 82 em Ancistrus ranunculus e

Ancistrus sp.5 ”Rio Branco” (Tabelas 1 e 3).

Eventos de fusões cêntricas não são ocorrências comuns na evolução

cariotípica de Loricariidae, sendo, até o momento, registrados apenas na subfamília

Loricariinae, em populações de Rineloricaria latirostris com 2n variando de 36 a 48

cromossomos (Giuliano-Caetano, 1998). Para outros loricariídeos (e.g.,

Hypoptopomatinae e Neoplecostominae), a evolução por meio de inversões

pericêntricas e paracêntricas parece ser a explicação mais aceitável para a manutenção

do número diplóide constante. Em Upsilodinae e em alguns grupos de Hypostominae,

55

(principalmente no gênero Hypostomus), o aumento do número diplóide e de

cromossomos do tipo acrocêntrico indica que eventos de fissões cêntricas foram os

mecanismos mais importantes na evolução cromossômica destes grupos (Artoni &

Bertollo, 1996; Kavalco et al., 2005). Em espécies de Ancistrini, a manutenção do

número diplóide de 52 cromossomos parece ter ocorrido por meio de rearranjos não

Robertsonianos, principalmente inversões pericêntricas e paracêntricas. Assim, pode-se

sugerir que as espécies do gênero Ancistrus apresentam uma evolução cariotípica

divergente, e que contrasta tanto com a evolução conservativa das demais espécies de

Ancistrini, quanto com os outros mecanismos encontrados nos demais grupos de

Loricariidae.

Artoni (1996) propôs que sítios ribossomais em posição terminal no braço

longo de um par de cromossomos metacêntricos grandes seja o fenótipo de regiões

organizadoras de nucléolo ancestral para Loricariidae. Entretanto, fenótipos variados de

RONs são encontrados com freqüência entre as espécies desta família, sendo essa

divergência observada tanto no tamanho dos cromossomos nucleolares, como na

posição destes sítios (Artoni & Bertollo, 1996; Mariotto et al., 2004; Alves et al., 2005;

Kavalco et al., 2005).

As RONs em Ancistrus apresentaram uma grande diversidade, tanto em relação

à sua localização no cromossomo quanto à sua posição no cariótipo. Entretanto, uma

grande similaridade foi observada entre Ancistrus sp.1 “Purus” e Ancistrus sp.2

“Catalão”, que apresentaram sítios ribossomais na região distal do braço curto do 4º par

do complemento, e entre Ancistrus sp.9 “Trombetas” e Ancistrus n. sp.1 (Alves et al.,

2003), que apresentaram as RONs em posições semelhantes no 5º par do complemento.

É possível que estas similaridades sejam homologias e que ocorram devido à

56

conservação da macroestrutura cariotípica numérica e estrutural, em espécies com

fenótipos de RONs semelhantes.

Similaridades menores foram observadas entre as espécies Ancistrus sp.3

“Barcelos”, Ancistrus sp.5 “Rio Branco” e Ancistrus sp.6 “Piagaçu”, onde as RONs

ocupam posição terminal no braço curto de cromossomos acrocêntricos coincidentes

com as constrições secundárias; contudo, os cromossomos portadores dos sítios

ribossomais são muito diferentes quanto ao tamanho. Ancistrus ranunculus e Ancistrus

sp.7 “Dimona” também possuem os sítios ribossomais em posições semelhantes em

cromossomos do tipo subtelocêntrico. Contudo, estas semelhanças não devem

representar a conservação desse caráter, mas sim eventos ocasionais gerados pelos

intensos rearranjos cromossômicos que ocorreram na evolução cariotípica destas

espécies, envolvendo também os organizadores nucleolares. Entretanto, seria necessário

comparar tais resultados com uma proposta de arranjo filogenético para as espécies do

gênero, de forma a testar estas hipóteses.

Segundo Almeida-Toledo (1998) e Feldberg et al. (1999; 2003), o número, a

posição e a morfologia das RONs permite fazer inferências sobre suas tendências

evolutivas para alguns grupos de peixes. Além de ser uma importante ferramenta para

distinguir espécies. Contudo, pode-se dizer que, embora permita identificar cada espécie

a RON não é um bom marcador para ser usado na construção de inferências

filogenéticas para espécies de Ancistrus, que mostram grande diversidade em relação a

esse caráter, tornando difícil a detecção de um padrão e consequentemente a sua

polarização.

Embora não observado em todas as células analisadas, um heteromorfismo no

tamanho das RONs foi registrado entre os homólogos de quase todas as espécies

analisadas no presente estudo, com exceção de Ancistrus sp.1 “Purus”, Ancistrus sp.6

57

“Piagaçu” e Ancistrus sp.8 “Balbina”. Esta diferença pode ser resultado da duplicação

gênica “em tandem” das seqüências de DNAr em um dos homólogos (Gold, 1984).

Outra explicação é que a presença de heterocromatina constitutiva entre os genes

ribossomais pode possibilitar permutas desiguais entre as cromátides, causando este

polimorfismo em relação ao tamanho (Sola et al., 1988), tal situação pode ter ocorrido

entre as espécies analisadas no presente trabalho, já que todas apresentaram RONs

positivas para banda C.

A relação entre a heterocromatina constitutiva e a RON é muito discutida e

muitas vezes gerou opiniões controversas. Alguns pesquisadores sugerem que a

heterocromatina teria a função de proteger o DNAr, não permitindo que mutações ou

permutas alterassem os cístrons ribossomais 18S e 28S (King, 1980; Schmid, 1982). Por

outro lado, há os que admitem que a presença da heterocromatina adjacente ou

coincidente com as RONs facilite a ocorrência de rearranjos envolvendo essas regiões,

propiciando uma diversificação cariotípica deste caráter (Moreira-Filho et al., 1984).

Análises da heterocromatina constitutiva são ainda escassas entre os

Siluriformes, apesar do fato de sua distribuição e composição serem importantes para a

compreensão da evolução cariotípica deste grupo (Kavalco et al., 2004). Segundo Gold

et al. (1990), uma pequena quantidade de heterocromatina constituindo o genoma é o

padrão observado para muitos teleósteos, incluindo os Siluriformes. Nas espécies de

Ancistrus nem todos os cromossomos apresentaram heterocromatina constitutiva, a qual

foi distribuída em blocos discretos dispostos em posições centromérica, telomérica ou

intersticial e que muitas vezes apresentaram-se pálidos. Os blocos mais conspícuos

foram aqueles em associação com as RONs.

No gênero Hypostomus, Artoni & Bertollo (1999) observaram dois padrões de

distribuição da heterocromatina constitutiva. Um deles apresenta pouca heterocromatina

58

localizada nas regiões teloméricas e/ou centroméricas; enquanto o outro tem um número

maior dessas regiões, distribuídas também em posição intersticial de diversos

cromossomos acrocêntricos. Esses autores associaram tais padrões com o número

diplóide das espécies, sendo o primeiro padrão presente em espécies com número

diplóide baixo, e o segundo naquelas com número diplóide alto. Assim, sugeriu-se a

existência de um relacionamento entre número diplóide e conteúdo de heterocromatina,

e que mudanças na heterocromatina poderiam ocorrer paralelamente às fissões

cêntricas, provavelmente devido ao aumento do DNA repetitivo.

O gênero Ancistrus apresentou uma grande diversidade nos padrões de

heterocromatina, tanto na distribuição como no tamanho dos blocos, sendo, portanto,

distinto para cada espécie, e constituindo um importante marcador citogenético para

este grupo. Uma possível homologia foi a presença de um bloco intersticial no braço

curto de um par de cromossomos metacêntricos de tamanho médio, que pode estar

localizado do segundo ao quarto par do complemento, em seis das 10 espécies

estudadas (Figuras 6,8,10,12,17 e 21). Entretanto, como ocorre com o marcador RON, o

padrão de heterocromatina também não permite inferir sobre as tendências evolutivas

neste grupo.

A espécie Ancistrus sp.7 “Dimona” manteve o padrão heterocromático

observado nas demais espécies analisadas no presente estudo, com poucos blocos de

heterocromatina distribuídos no complemento cromossômico. No entanto, foi verificada

a presença de um bloco pericentromérico de tamanho médio, localizado em somente um

dos homólogos do primeiro par metacêntrico e primeiro par subtelocêntrico (Figura 19).

A explicação para este fato é que tenha ocorrido um rearranjo do tipo translocação entre

estes cromossomos, com a migração do bloco de heterocromatina do homólogo

59

metacêntrico para o subtelocêntrico, uma vez que blocos pericentroméricos no primeiro

par metacêntrico foram observados em algumas espécies deste trabalho.

No gênero Pimelodus (Siluriformes: Pimelodidae), as espécies analisadas

apresentam diferentes números diplóides, mas com cariótipos bem semelhantes,

constituídos de um mesmo número de cromossomos metacêntricos de tamanhos

similares e RONs localizadas em posição terminal no braço longo do 20º par do

complemento cromossômico (Garcia & Moreira-Filho, 2005). Tal conservação não foi

observada entre as espécies que compõem o gênero Ancistrus. Apesar de terem sido

detectados sistemas de RONs simples em todas as espécies, não foi observado fenótipo

semelhante ao considerado ancestral. A grande diversidade cariotípica dificultou a

determinação de padrões gerais na evolução da localização das RONs e distribuição da

heterocromatina constitutiva.

Entretanto, é importante ressaltar que ainda se faz necessário ampliar a

investigação citogenética para mais espécies de Ancistrus, associada a investigações

morfológica, ecológica e molecular bem como a comparação com propostas

filogenéticas para esse grupo, para que se possa elucidar os caminhos evolutivos

trilhados por esses peixes.

4.1.1. Mecanismos de cromossomos sexuais

De acordo com Centofante et al. (2002), 55 ocorrências de cromossomos

sexuais heteromórficos haviam sido registradas para a ictiofauna Neotropical, das quais

64% referiam-se a machos heterogaméticos e 36% a fêmeas heterogaméticas. Embora o

número de espécies de peixes Neotropicais com registro citológico de cromossomos

sexuais diferenciados seja pequeno, vários casos de diferenciação têm sido observados

desde as primeiras descrições em peixes Characiformes dos gêneros Hoplias (Bertollo

60

et al., 1978), Apareiodon (Moreira-Filho et al., 1980) e Leporinus (Galetti Jr. et al.,

1981) e em Gymnotiformes do gênero Eigenmannia (Almeida-Toledo, 1978).

Segundo Moreira-Filho et al. (1993), cinco sistemas de cromossomos sexuais

já foram descritos em peixes Neotropicais: ZZ/ZW, XX/XY, X1X1X2X2/X1X2Y,

XX/XY1Y2 e ZZ/ZW1W2. Em 2001, Valentim observou mais um sistema, sendo este do

tipo XX/XO em Potamotrygon sp. (Chondrichthyes: Rajiformes: Potamotrygonidae).

Na família Loricariidae, a presença de sistemas de cromossomos sexuais tem

sido considerada uma situação atípica, visto que a grande maioria das espécies não

possui tais mecanismos (Artoni & Bertollo, 2001; Alves et al., 2003; Alves et al., 2005;

Kavalco et al., 2005). Entretanto, diferentes sistemas já foram encontrados em algumas

espécies. Estes são mecanismos de cromossomos sexuais simples dos tipos ZZ/ZW e

XX/XY, observados em Hypostomus macrops (Michelle et al., 1977), Hypostomus sp.

G (Artoni et al, 1998), Pseudocinclus tietensis (Andreata et al., 1992),

Microlepidogaster leucofrenatus (Andreata et al., 1993; 1994), Loricariichthys

platymetopom (Scavone & Júlio Jr., 1995) e Hemiancistrus spilomma (de Oliveira et al.,

no prelo). No presente estudo, sete das 10 espécies apresentaram cromossomos sexuais

que somado às duas ocorrências de heteromorfismo sexual já descritas para este grupo,

faz um total de 56% das espécies analisadas, um número alto se comparado com as

demais subfamílias de Loricariidae.

No gênero Ancistrus, sistema simples de determinação do sexo do tipo ZZ/ZW

foi observado em três espécies. Em Ancistrus cf. dubius do Pantanal de Mato Grosso

(Mariotto et al., 2004), onde o cromossomo Z é facilmente identificado por um grande

bloco de heterocromatina no braço longo, o W é o menor cromossomo acrocêntrico do

complemento e não possui blocos heterocromáticos. Em Ancistrus ranunculus (presente

trabalho) o cromossomo Z é um metacêntrico pequeno e possui um pequeno bloco de

61

heterocromatina em posição centromérica, enquanto o W é um submetacêntrico médio,

quase todo heterocromático (Figura 3 e 4). Entretanto, Souza (2003) não detectou

cromossomos sexuais nesta espécie (Tabela 1). Já, em Ancistrus sp.6 “Piagaçu”

(presente trabalho) o cromossomo W é um submetacêntrico pequeno, enquanto o

cromossomo Z é um acrocêntrico grande. No entanto, nesta espécie não foi observado

nenhum bloco de heterocromatina nos cromossomos sexuais (Figura 16 e 17).

Mecanismo do tipo XX/XY havia sido descrito para uma população de

Ancistrus cf. dubius do pantanal de Mato Grosso (Mariotto, 2003). No presente

trabalho, três novos registros são apresentados: Ancistrus sp.1 “Purus”, Ancistrus sp.2

“Catalão” e Ancistrus sp.5 “Rio Branco”. Nestas espécies, os cromossomos sexuais são

bem caracterizados morfologicamente, não deixando dúvidas quanto ao

heteromorfismo, embora não apresentem nenhum bloco de heterocromatina (Figuras 6,

8 e 14, respectivamente).

No mecanismo XX/XY, como no ZZ/ZW, também foi observado uma variação

no tamanho dos cromossomos sexuais: em Ancistrus sp.1 “Purus” e Ancistrus sp.2

“Catalão” o cromossomo X é muito maior do que o Y, em Ancistrus sp.5 “Rio Branco”

o cromossomo X é um submetacêntrico pequeno, ao passo que o Y é um acrocêntrico de

tamanho médio e maior que o X. Segundo (Galetti & Foresti, 1986), no gênero

Leporinus os cromossomos Z e W apresentam forma e tamanho similar em todas as

espécies em que ocorrem, o que pode indicar que o sistema ZZ/ZW provavelmente

envolva o mesmo par cromossômico nas diferentes espécies. Por outro lado, no gênero

Ancistrus, a evolução dos cromossomos sexuais deve ter ocorrido como eventos

independentes envolvendo diferentes pares de cromossomos.

Dois caminhos básicos têm sido postulados para a origem e desenvolvimento

dos cromossomos sexuais em vertebrados. No primeiro, a diferenciação destes

62

cromossomos estaria relacionada a rearranjos estruturais, resultando em um processo de

prevenção das recombinações meióticas (Beçak & Beçak, 1969). No segundo caso, a

diferenciação entre os cromossomos sexuais seria a partir de um processo de

heterocromatinização (Singh et al., 1980).

Em peixes Neotropicais, a hipótese mais aceita para explicar a diferenciação de

cromossomos sexuais é o acúmulo de heterocromatina constitutiva, seguido de outros

rearranjos estruturais (e.g., Galetti & Foresti, 1986; Almeida-Toledo & Foresti, 2001;

Centofante et al., 2002; Venere et al., 2004). Contudo, no gênero Ancistrus o processo

de heterocromatinização está envolvido somente na diferenciação sexual de A.

ranunculus (presente trabalho) e de Ancistrus cf. dubius (Mariotto et al., 2004). Assim,

pode-se sugerir que rearranjos estruturais tenha sido a primeira etapa na diferenciação

dos cromossomos sexuais de várias espécies deste gênero. Esta hipótese é corroborada

pela ausência de heterocromatina constitutiva nos cromossomos sexuais de seis das oito

espécies que apresentam mecanismos de diferenciação, bem como pela ocorrência de

numerosos rearranjos cromossômicos na história evolutiva deste grupo. Cromossomos

sexuais originados a partir de rearranjos estruturais em peixes já foram registrados em

Eigenmania sp. (Almeida-Toledo et al., 1984) e em algumas populações de Hoplias

malabaricus (Bertollo et al., 1997) e é fortemente postulado como principal evento na

formação de sistemas múltiplos (Moreira-Filho et al., 1980)

Segundo Ohno (1967), o primeiro passo para a diferenciação dos cromossomos

sexuais é o aparecimento de um mecanismo que impeça o crossing-over entre os

homólogos. Contudo, a evolução de cromossomos sexuais heteromórficos, a partir de

um par originalmente homomórfico, não seria o resultado de uma única mudança

estrutural, mas do desenvolvimento de vários passos seqüenciais. Desta forma, apesar

63

da heterocromatinização dos cromossomos sexuais ser um evento raro em Ancistrus,

isso não descarta a possibilidade de que tenha ocorrido nas espécies deste gênero.

No presente trabalho, também foram evidenciados dois tipos de sistemas

múltiplos de cromossomos sexuais. Em Ancistrus sp.8 “Balbina” foi observado o

mecanismo do tipo XX/XY1Y2, (Figura 20) já descrito em Hoplias malabaricus

(Bertollo & Mestriner, 1998). Moreira-Filho et al. (1980) observaram em Apareiodon

affinis (Characiformes: Parodontidae) um mecanismo do tipo ZZ/ZW1W2. Embora,

neste sistema as fêmeas é que constituem o sexo heterogamético, a explicação para a

origem deste sistema, seria análoga para o mecanismo observado em Ancistrus sp.8

“Balbina”. Acredita-se que um processo de fissão cêntrica, envolvendo um dos

cromossomos metacêntricos do segundo par do cariótipo masculino, tenha originado um

par de acrocêntricos, que após sofrerem outros rearranjos cromossômicos (como por

exemplo, inversões pericêntricas), originaram um par de pequenos metacêntricos, o que

explicaria a ocorrência de um cromossomo adicional nos machos desta espécie.

O segundo mecanismo de cromossomos sexuais múltiplos proposto é do tipo

Z1Z1Z2Z2/Z1Z2W1W2 observado em Ancistrus sp.3 “Barcelos” e constitui o primeiro

registro de um sistema deste tipo em peixes (Figura 9). Mecanismo semelhante somente

havia sido registrado para uma espécie de pulga (Nosopsyllus fasciatus; Aphaniptera),

contudo o sexo heterogamético era o masculino (Bayreuther, 1969).

De acordo com Guerra (1988), os sistemas de cromossomos sexuais múltiplos

se originam a partir de sistemas simples pré-existentes no grupo. Tais sistemas

múltiplos surgem, principalmente, como resultado de rearranjos do tipo translocação

recíproca (troca de segmentos cromossômicos entre cromossomos não-homólogos)

envolvendo cromossomos sexuais e autossomos. A ausência do processo de

64

heterocromatinização tanto na diferenciação dos sistemas simples como nos sistemas

múltiplos nas espécies de Ancistrus, parece corroborar esta afirmativa.

Em Ancistrus sp.5 “Rio Branco”, a presença dos cromossomos sexuais também

foi evidenciada pelas análises meióticas onde os cromossomos sexuais apresentaram-se

heteropicnóticos (Figura 15). Essa condensação precoce do par sexual evita que durante

o crossing-over, este faça trocas genéticas com os pares heteromórficos (John, 1990). A

análise meiótica pode ser uma prática importante para detecção de cromossomos

sexuais em Ancistrus, uma vez que a ausência de heterocromatina no par sexual, na

maioria das espécies, impossibilita o uso da técnica de bandamento C como ferramenta

para melhor caracterização desses mecanismos.

Cromossomos sexuais diferenciados apresentam uma distribuição muito

peculiar entre os peixes. O mesmo sistema pode ser encontrado em todas as espécies de

um grupo, como ZZ/ZW em Triportheus (Falcão, 1988; Bertollo & Cavallaro, 1992) ou

em grande parte de um grupo, como ZZ/ZW em Leporinus (Galetti & Foresti, 1986;

Venere et al., 2004). Entretanto, um mesmo sistema pode ser encontrado entre famílias

e gêneros diferentes, geralmente sem relações filogenéticas próximas. Sempre que há

espécies com sistemas de cromossomos sexuais diferenciados, frequentemente há outras

proximamente relacionadas com cromossomos homomórficos. Assim, o surgimento de

cromossomos sexuais parece ocorrer diversas vezes e de forma independente entre os

peixes (Solari, 1994). Diante disto, a presença ou ausência de mecanismo de

cromossomos sexuais em Ancistrus não pode ser interpretada, a priori, como uma

proximidade filogenética entre as espécies.

Segundo Almeida-Toledo & Foresti (2001), grupos de peixes com diferentes

sistemas de cromossomos sexuais, tais como: machos e fêmeas heterogaméticos,

sistemas múltiplos e simples, em espécies do mesmo gênero ou diferentes populações

65

de uma mesma espécie, tal como, em Hoplias malabaricus e Eigenmannia virescens,

caracterizam-se por estágios recentes ou por estratégias particulares de diferenciação

dos cromossomos sexuais. A presença de diferentes sistemas de cromossomos sexuais,

inclusive em populações de uma mesma espécie (Ancistrus cf. dubius, Mariotto, 2003),

pode estar indicando que Ancistrus também represente um grupo cuja diferenciação dos

cromossomos sexuais é ainda evolutivamente recente.

4.2. Relação entre a diversidade cariotípica e características da biologia e etologia

dos peixes do gênero Ancistrus

A enorme diversidade de espécies observadas entre os peixes indica que este

grupo provavelmente experimenta diferentes caminhos de evolução cromossômica. Há

grupos que mantiveram uma macroestrutura cariotípica muito similar, como no caso dos

Curimatidae (Venere & Galetti Jr., 1989; Feldbeg et al., 1992; 1993), Anostomidae

(Galetti Jr. & Foresti, 1986; 1987; Venere et al., 2004), Parodontidae (Moreira-Filho et

al., 1980; 1985; 1993; Centofante et al., 2002), ao passo que outros grupos apresentam

uma extensa diversidade cromossômica, tais como: Erythrinidae (Bertollo et al., 1978;

1997; 2004 ) Characidae (Falcão & Bertollo, 1985; Nakayama et al., 2002; Moreira-

Filho & Bertollo, 1991) Callichthyidae (Oliveira et al., 1993; Porto & Feldberg, 1993).

De acordo com King (1985), a conservação do cariótipo, isto é, a ausência de

uma associação entre mudanças cromossômicas e especiação em alguns organismos,

pode estar relacionada à impossibilidade de se formar populações isoladas, como

espécies migratórias ou altamente móveis. Em contraste, grupos com distribuição mais

limitada e exposta à grande heterogeneidade ambiental, podem apresentar diversidade

cromossômica mais extensa, incluindo diferenciação interpopulacional, ou seja,

66

pequenas populações facilitariam uma intensificação dos efeitos das trocas gênicas e a

fixação de rearranjos (Galleti Jr. et al., 2000).

A grande diversidade cariotípica encontrada entre as espécies do gênero

Ancistrus, como observado no presente estudo, pode estar relacionada às características

da biologia e etologia desses peixes, os quais apresentam preferências quanto ao uso de

microhábitats, permanecendo escondidos em troncos, fendas de pedras e outros abrigos,

onde estabelecem territórios e possuem pouca vagilidade (Power, 1984; 1990; Buck &

Sazima, 1995). Em relação à reprodução, possuem características muito peculiares: os

machos constroem ninhos dentro de abrigos e protegem seus ovos e filhotes de

predadores e machos rivais, mantendo o cuidado parental até 10 dias após a eclosão dos

ovos (Sabaj et al., 1999). Tais características poderiam ter favorecido o surgimento de

mecanismos de isolamento ou de barreiras ao fluxo gênico (Futuyma, 1997),

possibilitando a ocorrência de fixação de rearranjos cromossômicos e contribuindo para

o desenvolvimento de processos de especiação micro-alopátrica nesse gênero, assim

como nos ciclídeos dos grandes lagos Africanos (Lewis,1982; Lowe-McConnell, 1999).

Sabaj et al. (1999) acreditam que a presença de tentáculos cutâneos

muito desenvolvidos no focinho de machos de Ancistrus esteja relacionada

a uma estratégia reprodutiva de mimetismo de larvas. Estes autores

hipotetizam que as fêmeas de Ancistrus teriam preferência em acasalar-se

com machos que possuem larvas em seu ninho, pois isso demonstraria um

melhor cuidado parental despendido com a prole e maior sucesso

reprodutivo. Assim, os machos usariam seus tentáculos para simular a

presença de larvas e com isso atraírem mais fêmeas. Diante disso, machos

com mais tentáculos cutâneos e mais desenvolvidos teriam maiores chances

67

de reproduzir com mais fêmeas e, conseqüentemente, passarem seus genes

para um número maior de descendentes.

Foi observado em aquário, que um macho de Ancistrus pode

acasalar repetidamente com diversas fêmeas e cuidar de todos os ovos e

larvas simultaneamente (Sabaj et al., 1999). Comportamento similar foi

registrado durante as coletas de espécimes de Ancistrus sp.7 “Dimona” e

Ancistrus sp.8 “Balbina”, onde estes peixes apresentam distribuição

aparentemente agregada, formando pequenos grupos que contêm várias

fêmeas, alguns juvenis e geralmente, apenas um macho maduro. Embora

isso não tenha sido investigado para as demais espécies estudadas, é

provável que este comportamento se repita (J. Zuanon comunicação

pessoal). Assim, é possível que mutações cromossômicas ocorridas em

machos dominantes sejam fixadas mais rapidamente nas populações do que

em grupos de espécies que não apresentam este tipo de comportamento. Se

a diversidade cariotípica encontrada nas espécies de Ancistrus estiver

realmente associada às características mencionadas acima, estudos em

outros grupos que apresentem comportamentos similares tais como,

Cichlidae (principalmente em Apistogramma), Callichthyidae

(especialmente no gênero Corydoras), Trichomycteridae, Crenuchidae (em

Characidiinae) e Poeciliidae, poderiam ser especialmente elucidativos.

Além de contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos de

especiação e evolução cromossômica em peixes.

68

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

1) As espécies do gênero Ancistrus apresentaram grande diversidade cariotípica, com

número diplóide variando de 34 a 52 cromossomos. Isto demonstra que intensos

processos de rearranjos cromossômicos, principalmente fusões cêntricas, estão

associados à evolução cariotípica deste gênero, os quais indicam uma tendência

evolutiva para a redução do número diplóide neste táxon.

2) Inversões pericêntricas e translocações também ocorreram na diversificação

cariotípica deste gênero. Tais mecanismos explicariam a presença do grande número de

cromossomos acrocêntricos nas espécies que apresentaram número diplóide igual a 52

cromossomos. Além disso, tais mecanismos também explicam a grande diversidade no

número fundamental, que variou de 68 a 82.

3) Um par de cromossomos portadores de RONs e positivos para banda C, foi

observado em todas as espécies, porém este caráter apresentou uma grande diversidade,

tanto em relação à sua localização no cromossomo quanto à sua posição no cariótipo.

Portanto, não pôde ser evidenciado nenhum padrão geral quanto à localização deste

marcador nas espécies desse gênero, uma vez que este caráter foi espécie-específico.

4) Poucos cromossomos apresentaram heterocromatina constitutiva, a qual distribuiu-se

em blocos discretos dispostos em posição centromérica, terminal, intersticial ou

proximal, que muitas vezes apresentaram-se pálidos. Blocos mais conspícuos foram

evidenciados em associação com as RONs, em todas as espécies.

5) Sete das 10 espécies apresentaram cromossomos sexuais heteromórficos. Destas,

duas apresentaram mecanismos do tipo ZZ/ZW, três do tipo XX/XY e dois sistemas

69

múltiplos, XX/XY1Y2 e Z1Z1Z2Z2/Z1Z2W1W2, ainda não descritos para Loricariidae,

sendo que o último ainda não havia sido descrito para peixes.

6) A grande diversidade cariotípica encontrada entre as espécies de Ancistrus pode ter

relação com as características da biologia e etologia desses peixes. Tais características

poderiam ter favorecido o surgimento de mecanismos de isolamento ou de barreiras ao

fluxo gênico, possibilitando a ocorrência e fixação de rearranjos cromossômicos,

contribuindo assim para o desenvolvimento de processos de especiação micro-

alopátrica nesse gênero.

70

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA ...bdtd.inpa.gov.br/bitstream/tede/1442/1/Dissertacao_Renildo... · 2.1.ORIGEM E CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS ESPÉCIES