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1. INTRODUÇÃO
A hipertensão arterial é conceituada como uma síndrome, caracterizada por
valores elevados das pressões sistólica e diastólica, associados a alterações
metabólicas, hormonais e a fenômenos como hipertrofia cardíaca e vascular. A
prevalência da hipertensão arterial no Brasil é elevada, estimando-se que cerca de
30% da população brasileira adulta possa ser rotulada como hipertensa (VI Diretrizes
Brasileiras de Hipertensão Arterial, 2010).
Apesar da mortalidade por doenças circulatórias ter apresentado uma queda
no período entre 1979 a 1996, atualmente ela é causa primária de morte no Brasil
(MANSUR, FAVARATO, SOUZA, AVAKIAN, ALDRIGHI, CESAR, RAMIRES, 2001).
Estudos em países mais desenvolvidos demonstram que a incidência de doenças
cardiovasculares está diretamente relacionada à alta prevalência de hipertensão
arterial (STEGMAYR, VINOGRADOVA, MALYUTINA, PELTONEN, NIKITIN,
ASPLUND, 2000).
Além de ser um importante fator de risco de morbidade e mortalidade
cardiovascular, a hipertensão tem alto custo socioeconômico, sendo responsável
pela maior parte dos casos de aposentadoria precoce e de absenteísmo no trabalho,
decorrentes de complicações associadas como: doença cerebrovascular, doença
arterial coronariana, insuficiência cardíaca, insuficiência renal crônica e doença
vascular periférica (KANNEL, GORDON, SCHWARTZ, 1971; SCHMIDT, ALP, 2007).
Sabe-se que esta síndrome esta diretamente relacionada à disfunção
endotelial, a qual é caracterizada pela diminuição na biodisponibilidade de fatores
vasodilatadores como: o óxido nítrico e prostaciclinas, e aumento de fatores
vasoconstritores como: superóxido e endotelina, todos estes produzidos e liberados
pelo endotélio (GONGORA, QIN, LAUDE, KIM, MCCANN, FOLZ, DIKALOV, FUKAI,
HARRISON, 2006; GALILI, VERSARI, SATTLER, OLSON, MANNHEIM,
MCCONNELL, CHADE, LERMAN, LERMAN, 2007).
Tem sido caracterizado na hipertensão experimental que a excessiva
produção vascular de espécies reativas de oxigênio (EROs), específicamente o
superóxido, resulta em menor biodisponibilidade de óxido nítrico (NO), decorrente do
aumento da sua reação com superóxido. Esta reação é capaz de formar outra ERO
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(peróxido de nitrito), a qual não têm função vasodilatadora e pode danificar a célula
endotelial. Estes fatores estão associados à disfunção endotelial vasomotora, com
prejuízos à vasodilatação e exarcebação da vasoconstrição, entre outras alterações
maléficas ao funcionamento e estrutura vascular (GRAHAM, RUSH, 2004;
GONGORA et al., 2006; GALILI et al., 2007).
Devido ao crescente papel do estresse oxidativo na hipertensão, diferentes
estratégias terapêuticas estão sendo investigadas com o objetivo de minimizá-lo. Em
modelos animais, o tratamento com antioxidantes, embora estes não atuem
diretamente nas vias de produção de EROs, melhoram a função vascular e reduzem
a pressão arterial por diminuírem a ação das EROs nos vasos (CHEN, TOUYZ,
PARK, SCHIFFRIN, 2001).
Grande esforço também tem sido feito para atenuar a produção vascular de
EROs. Dentre estes esforços estão, o bloqueio do receptor de angiotensina II (AT1) e
inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA), bem como inibição direta da
NAD(P)H oxidase pela apocinina, os quais estão diretamente ligados a produção das
EROs no vaso (GHIADONI, MAGAGNA, VERSARI, KARDASZ, HUANG, TADDEI,
SALVETTI, 2003; UNGER, PATIL, 2009). Além disso, estudos com antioxidantes não
enzimáticos também têm sido usados, com o mesmo propósito (MULLAN, YOUNG,
FEE, MCCANCE, 2002).
Entretanto, o tratamento com antioxidantes ainda é muito controverso, pois
alguns estudos clínicos têm mostrado a ineficácia deste tratamento em diminuir a
mortalidade por doenças cardiovasculares e incidência de eventos cardiovasculares
(VIVEKANANTHAN, PENN, SAPP, HSU, TOPOL, 2003). Do mesmo modo, as
estratégias para diminuição da produção de EROs, apesar de exercerem impacto
positivo nesta patologia, por outro lado , não parece ser a melhor forma de
tratamento, pois sua importância na regulação biológica não só do vaso, como
também em outros sistemas do organismo, pode interferir negativamente quando
manipulada (HAMILTON, MILLER, AL-BENNA, BROSNAN, DRUMMOND,
MCBRIDE, DOMINICZAK, 2004).
Devido à complexidade e magnitude do problema tem sido constante a
preocupação científica mundial em ampliar e aperfeiçoar os métodos para
diagnóstico e tratamento da hipertensão arterial. Assim, diante dos recentes avanços
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científicos e tecnológicos, surgem conceitos novos sobre a etiologia, fisiopatologia e
tratamento da doença.
O treinamento físico aeróbio é amplamente indicado no tratamento não
farmacológico da hipertensão (SCHMIDT, ALP, 2007). É evidenciado em animais,
que o treinamento físico (TF) diminui o estresse oxidativo vascular, promove melhora
da vasodilatação e, consequentemente, diminui a pressão arterial (GRAHAM, RUSH,
2004; HARRISON, WIDDER, GRUMBACH, CHEN, WEBER, SEARLES, 2006).
No entanto, apesar de estar bem definido que a atividade física pode trazer
benefícios à saúde e minimizar a progressão de doenças crônico-degenerativas,
dentre elas a hipertensão, os mecanismos pelos quais o TF modula os processos
celulares e fisiológicos, não são completamente conhecidos. Assim, é importante
salientar que a compreensão destes mecanismos pode ajudar na atuação direta no
foco do problema, aumentando a expectativa de vida dos indivíduos que possuem
esta patologia ou seus fatores de risco.
Apesar disso, aspectos éticos e metodológicos dificultam o avanço do
conhecimento desses mecanismos em humanos, justificando a realização de estudo
com animais de experimentação para uma melhor compreensão dos efeitos do TF na
hipertensão. Desta forma, utilizaremos um modelo experimental de hipertensão
arterial em ratos espontaneamente hipertensos (SHR), para investigar os
mecanismos envolvidos na melhora da função endotelial (resposta vasodilatadora)
decorrentes do TF aeróbio.
A hipótese principal deste estudo é que o TF aeróbio irá atenuar o estresse
oxidativo vascular e aumentar a biodisponibilidade de NO, por diminuir a produção de
EROs pela NAD(P)H oxidase e aumentar a atividade antioxidante.
2. OBJETIVO PRINCIPAL
O presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos do treinamento físico
aeróbico (natação) sobre a resposta vasomotora (dilatação) em aorta de ratos SHR,
destacando-se o papel da biodisponibilidade de EROs e de NO nestas respostas.
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3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar, em aorta isolada de ratos SHR, os efeitos do treinamento físico da
natação sobre:
A resposta vasodilatadora endotélio-dependente: agonista acetilcolina (ACh)
A resposta vasodilatadora endotélio-independente: agonista nitropussiato de
sódio (NPS);
O envolvimento da sintase de NO na resposta vasodilatadora endotélio-
dependente: pré-incubação com inibidor da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS)
com L-NAME e agonista ACh;
O índice de biodisponibilidade de EROs (superóxido);
A expressão protéica da enzima eNOS;
A expressão protéica de subunidades NOX1 e NOX4 do complexo enzimático
NAD(P)H oxidase;
O índice de biodisponibilidade de NO: concentração de nitrato e nitrito.
4. REVISÃO DE LITERATURA
4.1. Hipertensão arterial
De acordo com a medida casual da pressão arterial no consultório médico
são considerados hipertensos indivíduos com valores ≥ 140 mmHg para pressão
arterial sistólica (PAS) e ≥ 90 mmHg para a pressão arterial diastólica (PAD) em
adultos maiores de 18 anos segundo a V diretrizes Brasileiras de Hipertensão
Arterial. Entretanto, o VII Join National Committe (JNC 7), em 2003, começou a
considerar pré-hipertensão valores ≥ 120 mmHg (PAS) e ≥ 80 mmHg (PAD) , pois
valores ligeiramente alterados estão sendo também acompanhados à incidência de
doença cardiovascular (DCV) em populações distintas (KOKUBO, KAMIDE,
OKAMURA, WATANABE, HIGASHIYAMA, KAWANISHI, OKAYAMA, KAWANO,
2008; KOKUBO, KAMIDE, 2009).
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A hipertensão arterial é uma síndrome multifatorial e apesar da maioria dos
seus casos ser de origem idiopática essa patologia pode ser desenvolvida a partir de
etiologias diferentes, como, insuficiência renal, doença vascular aterosclerótica,
obesidade, induzida por medicamentos ou drogas, síndrome da apnéia obstrutiva do
sono, dentre outras causas (SCHMIDT, ALP, 2007).
Além de suas múltiplas origens vários são os fatores de risco para o
desenvolvimento de hipertensão, como: diabetes, alcoolismo, idade, etnia, sexo,
sedentarismo, obesidade e fatores sócios econômicos, que associada à estes fatores
ou a outra patologia pode ser considerada como hipertensão secundária. Todos
estes fatores contribuem, por mecanismos diferentes, para elevação da pressão
arterial, e evidentemente a soma destes fatores classificam o grau da doença
(CHOBANIAN, BAKRIS, BLACK, CUSHMAN, GREEN, IZZO, JONES, MATERSON,
OPARIL, WRIGHT, ROCCELLA, 2003; SCHMIDT, ALP, 2007).
Estudos tanto clínicos, quanto experimentais têm mostrado, em várias
etiologias da hipertensão, a distinção dos mecanismos envolvidos em cada causa,
onde, além de dados clínicos com humanos, modelos com animais de
experimentação que desenvolvem hipertensão espontânea ou induzida são
estudados a fim de mimetizar o desenvolvimento da hipertensão arterial essencial,
objetivando a compreensão das vias que desencadeiam essa patologia (OKAMOTO,
AOKI, 1963; FROHLICH, 2009).
Porém, umas das alterações metabólicas que parece estar envolvida na
maioria dos casos é o controle redox, ou seja, o equilíbrio entre a produção e
remoção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERNs). Esta regulação da
biodisponibilidade das EROs e ERNs é de extrema importância para a manutenção
da homeostase do organismo humano, onde seu estado de desequilíbrio parece
desencadear alterações fisiológicas e funcionais importantes para o controle do
sistema vascular, no caso da hipertensão (STOJILJKOVIC, LOPES, ZHANG,
MORROW, GOODFRIEND, EGAN, 2002; SEKIGUCHI, YANAMOTO, SUNANO,
2004; TOUYZ, SCHIFFRIN, 2004).
Indivíduos hipertensos exibem aumento das EROs no vaso associado a
prejuízos na vasodilatação e aumento na vasoconstrição (TOUYZ, SCHIFFRIN,
2004; YAMANARI, NAKAMURA, MIURA, YAMANARI, OHE, 2009). Além de estudos
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clínicos, este fato ocorre nos vários tipos de hipertensão experimental como: as
induzidas por alterações no padrão de dietas (aumento de sal ou gordura) (TOJO,
ONOZATO, KOBAYASHI, GOTO, MATSUOKA, FUJITA, 2002; GALILI et al., 2007),
hipertensão induzida por Angiotensina II (VIRDIS, NEVES, AMIRI, VIEL, TOUYZ,
SCHIFFRIN, 2002), por mineralocorticóides (SCHAFER, WALLERATH, CLOSS,
SCHMIDT, SCHWARZ, FORSTERMANN, LEHR, 2005), associado a outras
patologias (diabetes, obesidade etc), pós-menopausal (FORTEPIANI, ZHANG,
RACUSEN, ROBERTS, RECKELHOFF, 2003), hipertensão de origem genética
(SHR), dentre outras.
O modelo SHR, por desenvolverem hipertensão de origem genética no inicio
da propagação da síndrome (a partir de aproximadamente 8 semanas de vida), dá-se
grande relevância ao estudo deste modelo, pois o aumento da pressão arterial é a
primeira e principal alteração funcional envolvida. Outro fator importante é devido ao
aumento da pressão arterial estar isolada de outras alterações metabólicas ou
funcionais no inicio do desenvolvimento da síndrome mimetizando a hipertensão
arterial essencial desenvolvida em humanos (OKAMOTO, AOKI, 1963). É importante
salientar que as principais alterações desta patologia são na estrutura e função das
artérias, onde é de grande importância o estudo dessas alterações, porém não se
descartam alterações secundárias a órgãos alvo que ocorrem em fases mais
avançadas da doença (CORDELLINI, NOVO, LANZA JUNIOR, 2006; LOCH, CHAN,
HOEY, BROWN, 2009).
Entretanto, as alterações vasculares deste modelo ainda não são consenso
na literatura, parecem que dependem da idade, tipo de leito vascular e metodologias
utilizadas para acessá-lo, e todos esses aspectos podem resultar em respostas
vasculares diferentes as quais serão discutidas nos próximos tópicos (BERNATOVA,
CONDE, KOPINCOVA, GONZALEZ, PUZSEROVA, ARRIBAS, 2009).
4.2. Alterações no endotélio vascular
O vaso sanguíneo é constituído por três camadas, seguindo da parte externa
para a luz do vaso, a primeira é a camada adventícia, composta principalmente de
tecido conjuntivo, a segunda camada refere-se à camada motora do vaso, altamente
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especializada na contração e relaxamento, a qual consiste no tecido muscular liso, e
por fim, a camada íntima chamada de endotélio vascular (MCALLISTER, 1995).
Sabe-se desde 1980 que o endotélio é uma camada vascular unicelular que
recobre a luz de todos os vasos. E devido a sua localização estratégica, entre o
sangue circulante e o músculo liso, tem alta atividade metabólica e controla
ativamente a homeostase cardiovascular, exercendo importante influência autócrina,
parácrina e endócrina, atuando em células musculares lisas, plaquetas e leucócitos
(FURCHGOTT, ZAWADZKI, 1980; GALLEY, WEBSTER, 2004).
Dentre as funções do endotélio estão, o controle da trombolise, da aderência
plaquetária , do tônus vascular e consequentemente do fluxo sanguíneo, sendo
assim indispensável para a homeostase de todo o organismo. Além dessas funções
descritas acima, ele é uma importante barreira de passagem livre de moléculas e
células, do sangue para o interstício até às células, e também uma barreira seletiva
para o egresso de moléculas para a circulação (GALLEY, WEBSTER, 2004). Por
exemplo, já foi descrito que as células endoteliais possuem transportadores de
glicose (GLUT-1) e de aminoácidos, possuem também caveolas, as quais são
invaginações da membrana responsáveis pelo transporte transcelular e regulação da
atividade de uma proteína importante para o mecanismo de vasodilatação, a óxido
nítrico sintáse (eNOS) (MANN, YUDILEVICH, SOBREVIA, 2003; GRATTON,
BERNATCHEZ, SESSA, 2004). E, por último, possuem junções intracelulares
importantes para o transporte paracelular, onde fazem a interligação das células
endoteliais entre si. Todas estas funções são essenciais para a permeabilidade
endotelial, auxiliando na regulação do fluxo, viscosidade do sangue, e nos processos
inflamatórios (DOMEIER, SEGAL, 2007).
Devido o objetivo do presente estudo ter grande relação com a função de
controle do tônus vascular, este tema será abordado com maior ênfase. Porém, não
se descarta a importância e a relevância das outras funções, onde somente
associadas podem manter a homeostase dos sistemas em geral.
O tônus vascular é controlado pelo endotélio por meio de estímulos químicos
(acetilcolína, insulina, bradicinina), físicos (estresse de cisalhamento do sangue na
parede do vaso ou estresse de estiramento do vaso) e neurais (atividade nervosa
simpática), liberando substâncias vasoativas, como óxido nítrico, endotelina e
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prostaciclinas, onde, por meio desses é capaz de modular de maneira importante o
fluxo sangüíneo, a coagulação e a angiogênese. Essas substâncias vasoativas
denominam-se como fatores relaxantes (FRDE), constritores (FCDE) e
hiperpolarizantes (FHDE) derivados do endotélio (FURCHGOTT, ZAWADZKI, 1980;
FURCHGOTT, VANHOUTTE, 1989; MOMBOULI, VANHOUTTE, 1999).
Dentre os FRDE, o óxido nítrico (NO) e as prostaciclinas são liberados
principalmente por estímulo da acetilcolina e bradicinina, quando liberados pelo
endotélio têm ações aditivas, porém o NO tem maior representação no mecanismo
de vasodilatação (MORO, RUSSEL, CELLEK, LIZASOAIN, SU, DARLEY-USMAR,
RADOMSKI, MONCADA, 1996). Os FCDE são representados sobretudo pela
endotelina, e espécies reativas de oxigênio em destaque, o superóxido, e são
produzidas principalmente pelo estímulo da angiotensina-II aos receptores ATI no
endotélio. Já os FHDE são considerados também FRDE, pois promovem a
vasodilatação pelo resultado da abertura dos canais de potássio e o fechamento dos
canais de cálcio (FURCHGOTT, VANHOUTTE, 1989; TOUYZ, SCHIFFRIN, 2004).
Outros estímulos como insulina, serotonina, substância P, histamina, também
podem agir como vasodilatadores dependentes do endotélio e, além da angiotensina
II, a noradrenalina também pode estimular a produção de endotelina, dentre outros
(TOUYZ, SCHIFFRIN, 2004). O estresse de cisalhamento e de estiramento na
parede do vaso também parecem favorecer a vasodilatação, porém ainda é
controverso e serão discutidos posteriormente (HARRISON et al., 2006; LAUGHLIN,
NEWCOMER, BENDER, 2008).
Todas estas interações entre estímulo e produção de FRDE e FCDE citadas
acima estão relacionadas ao endotélio íntegro. Por outro lado, quando ocorre
disfunção, as células endoteliais começam exercer efeitos diferentes ou até mesmo
opostos aos de natureza fisiológica (GALLEY, WEBSTER, 2004).
O organismo depende do suprimento de oxigênio e energético para seu
funcionamento, bem como do endotélio vascular íntegro para que esta oferta seja
adequada. Porém, parece que alterações no seu funcionamento estão associadas a
patologias em geral, mas principalmente ás que se referem a função vascular e
cardíaca (MOMBOULI, VANHOUTTE, 1999).
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Essas alterações estão ligadas diretamente às funções desempenhadas pelo
endotélio, como o desequilíbrio entre a produção de substâncias vasodilatadoras e
vasoconstritoras, onde componentes vasoconstritores estão aumentados em relação
aos vasodilatadores, caracterizando a disfunção endotelial. Deste modo, fatores que
estão envolvidos na vasodilatação, como o óxido nítrico, parece ter a sua
biodisponibilidade prejudicada (LESNIEWSKI, DONATO, BEHNKE, WOODMAN,
LAUGHLIN, RAY, DELP, 2008).
Humanos com hipertensão essencial (HIGASHI, SASAKI, KURISU,
YOSHIMIZU, SASAKI, MATSUURA, KAJIYAMA, OSHIMA, 1999) e ratos
espontaneamente hipertensos (SHR) (GRAHAM, RUSH, 2004; SEKIGUCHI,
YANAMOTO, SUNANO, 2004) exibem prejuízos na vasodilatação dependente do
endotélio comparados com controles normais. Essa menor vasodilatação parece ser
devido, em partes, a uma disfunção endotelial, a qual esta associada em maior grau
à menor biodisponibilidade de NO (GONZALES, CARTER, KANAGY, 2000). Porém,
o comprometimento da função vasomotora mediada pelo endotélio pode ser
resultado de uma ou três maiores determinantes da biodisponibilidade de NO como:
a produção endotelial pela enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (SCHMIDT,
ALP, 2007), a sensibilidade do músculo liso ao NO (GERASSIMOU, KOTANIDOU,
ZHOU, SIMOES, ROUSSOS, PAPAPETROPOULOS, 2007) e/ou desativação do NO
pela interação com as espécies reativas de oxigênio (GONGORA et al., 2006).
Desde a descoberta do NO como um importante FRDE, este tem sido alvo de
grande interesse da literatura, pois parece estar envolvido em muitas patologias e
desordens metabólicas, demonstrando assim um papel central no controle da
homeostase vascular (PALMER, FERRIGE, MONCADA, 1987; YETIK-ANACAK,
CATRAVAS, 2006). Não só como modulador do tônus vasomotor, mas também na
inibição da agregação plaquetária, função imune, crescimento celular,
neurotrasmissão, regulação metabólica e acoplamento exitação-contração. Todas
estas funções são de grande importância, entretanto destaca-se na literatura sua
função vasomotora, pela sua ligação com a maioria das patologias cardiovasculares
(BREDT, 1999).
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4.3. Oxido nítrico sintases
Três isoformas distintas desta enzima têm sido identificadas, produtos de três
genes diferentes, com diferente localização, regulação, propriedade catalítica e
sensibilidade a inibidores. São nomeadas como: nNOS (também conhecida por tipo I,
NOS-I e NOS 1) predominante em tecido neuronal; iNOS (tipo II, NOS-II, NOS-2) é
induzível em várias células e tecidos tais como: macrófagos, leucócitos
polimorfonucleares, endotélio, músculo liso vascular, fígado e baço; e eNOS, (tipo III,
NOS-III, NOS-3), a qual foi descoberta na célula endotelial. As nNOS e eNOS são
expressas de maneira constitutivas e são dependentes de cálcio (Ca2+) e a iNOS é
induzível e independente de cálcio (ALDERTON, COOPER, KNOWLES, 2001).
Em humanos, além da expressão da eNOS nas células endoteliais, ela é
descrita também nas células musculares lisas e músculo cardíaco, trato reprodutivo e
cérebro , enquanto a nNOs é expressa em cérebro, medula espinhal, gânglios
simpáticos, nervos periféricos, pâncreas e células epiteliais, mostrando sua
importância pela vasta gama de funções e localizações (ALDERTON, COOPER,
KNOWLES, 2001; HARRISON et al., 2006). A eNOS por ser expressa em maior
quantidade nas células endoteliais será estudada com mais ênfase.
A eNOS está situada principalmente na região das cavéolas da célula
endotelial, como já dito anteriormente, representando o estado inativo quando ligada
à proteína calveolina, principalmente a calveolina-1, quando ocorre aumento na
concentração de cálcio intracelular estimula a ligação cálcio/calmodulina e favorece a
dissociação da eNOS com a calvelina e subseqüente produção de NO (GRATTON,
BERNATCHEZ, SESSA, 2004).
Seguido o estímulo e a dissociação da eNOS com a calveolina, a síntese de
NO se deve a partir do aminoácido L-Arginina e pode ser divida em duas etapas. Na
primeira fase ocorre a hidroxilação da L-Arginina, formando N-Hidróxi-L-Arginina
através da utilização de uma molécula de oxigênio e duas de NADPH.
Posteriormente, com um elétron proveniente do NADPH e outro da molécula de
oxigênio, a N-Hidróxi-L-Arginina é convertida a citrulina e NO (ROUSSEAU, LI,
COUTURE, YEH, 2005). Desta forma, o NO se difunde facilmente para o músculo
liso vascular estimulando a guanilato ciclase solúvel (GCs) que por sua vez, catalisa
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a saída de dois fosfatos da guanosina trifosfato (GTP), aumentando os níveis de
guanosina monofosfato cíclico (GMP cíclico). A ativação de proteínas quinases
dependentes de GMP cíclico acarretam em redução na concentração de Ca2+
intracelular através da saída de Ca2+ da célula (sequestro para o retículo
sarcoplasmático), diminuição na entrada do Ca2+ e até mesmo redução na
sensibilidade de proteínas contráteis ao Ca2+. Representando o conjunto de fatores
que promovem o relaxamento dos vasos sanguíneos por mecanismos relacionados à
via NO-GMP cíclico (WALSH, KARGACIN, KENDRICK-JONES, LINCOLN, 1995).
Vários estímulos contribuem para a produção de óxido nítrico no vaso, dentre
eles forças hemodinâmicas podem contribuir para a produção basal de NO pela
ativação da eNOS, como o shear stress (estresse de cisalhamento do sangue na
parede do vaso) e o estresse circunferencial na parede do vaso, frequentemente
chamado de stretch, ou seja, o efeito da pressão na parede arterial. Ainda não se
sabe quais mecanismos que envolvem a produção de NO a partir destes estímulos,
entretanto especula-se que seja via aumento do cálcio intracelular (FALCONE, KUO,
MEININGER, 1993; AYAJIKI, KINDERMANN, HECKER, FLEMING, BUSSE, 1996;
TRONC, WASSEF, ESPOSITO, HENRION, GLAGOV, TEDGUI, 1996).
A ativação da eNOS e produção de NO pelo shear stress (laminar) pode
ocorrer, com o aumento agudo do shear stress, o qual a eNOS é ativada e produz
NO agudamente por um aumento transiente da concentração de Ca2+ intracelular e
fosforilação da eNOS, com estímulos constantes esta produção ainda é continuada
mesmo quando os níveis de Ca2+ nas células endoteliais retornam ao basal. Esta
ativação da eNOS independente de cálcio pelo shear stress laminar parece ser
resultado da fosforilação de sítios específicos da enzima durante um shear stress
prolongado, aumentando a expressão protéica e RNAm da eNOS e
consequentemente a produção basal de NO (HARRISON et al., 2006).
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FIGURA 1 – Efeito do Shear Stress unidirecional e laminar na síntese de óxido nítrico endotelial. eNOS; óxido nítrico síntase endotelial, NO; óxido nítrico, mRNA; ácido ribonucléico mensageiro.(Adaptado de Harrison, Widder et al., 2006).
Uma outra forma de estimular a eNOS no vaso e muito usada em protocolos
da reatividade vascular in vitro para testar a integridade do endotélio é a acetilcolina,
pois é um vasodilatador dependente do endotélio e estimula a eNOS pelo aumento
da concentração de cálcio também, e desencadeia a sequência de mecanismos
descritos acima, os quais caracterizam a função da eNOS em células endoteliais
íntegras (FURCHGOTT, ZAWADZKI, 1980; GONZALES, CARTER, KANAGY, 2000).
4.4. Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs)
O organismo sofre ação constante de EROs e ERNs geradas em processos
inflamatórios, por alguma disfunção biológica ou provenientes da alimentação, agindo
na manutenção dos sistemas em geral. São caracterizadas geralmente como radicais
livres por sua alta reatividade biológica, pois algumas delas apresentam um ou mais
elétrons não pareados no último orbital atômico ou molecular, entretanto, nem todas
tem esta característica onde as tornam mais estáveis, e menos prejudiciais ao
organismo (FERREIRA, MATSUBARA, 1997).
As principais EROs produzidas no vaso são : superóxido (O2·_), peróxido de
hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (OH.) e as consideradas também ERNs,
peróxniitrito (ONOO-), NO, nitritos (NO2-) e nitratos (NO3
-) (TOUYZ, SCHIFFRIN,
2004).
Tradicionalmente, as EROs são consideradas maléficas ao organismo, por
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provocarem danos oxidativos irreversíveis aos lipídios, proteínas e DNA. No entanto,
atualmente, existem evidências de que as EROs não são apenas lesivas às células
mas que apresentam papel na função celular normal, por meio da regulação de vias
de sinalização que regulam a expressão gênica e a síntese protéica, entre outras
funções (GRIENDLING, SORESCU, LASSEGUE, USHIO-FUKAI, 2000).
Em condições normais, as EROs produzidas não se acumulam nas células,
pois são continuamente eliminadas pela ação de antioxidantes enzimáticos, como a
superóxido desmutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) e não
enzimáticos como vitaminas C e E e peptídeos. No entanto, quando ocorre um
desbalanço entre as taxas de produção e de eliminação de EROs, pode ocorrer um
acúmulo de EROs nas células, o que resulta no estado de estresse oxidativo (LI,
SHAH, 2004).
Por serem subprodutos do metabolismo do O2 estão envolvidas em todo
sistema biológico, tendo sua formação por meio da mitocôndria e/ou por fontes
enzimáticas como: NAD(P)H oxidases, xantina oxidases, lipogenases e oxido nítrico
sintases e são formadas em um processo de oxiredução com a redução univalente
do oxigênio na presença de um elétron livre (e-), como um dos produtos primários, o
superóxido (O2-). Este radical é capaz de reagir com outros e desencadear uma série
de reações, em uma delas ele é oxidado quando interage com o óxido nítrico
produzindo ONOO-, o qual é altamente reativo e danoso quando em alta
concentrações. Quando ocorre esta reação, a função vasodilatadora do NO é
prejudica (LI, SHAH, 2004; GONGORA et al., 2006).
O superóxido também pode ser reduzido formando o peróxido de hidrogênio
(H2O2) por meio da ação da superóxido dismutase (SOD) e por sua vez o H2O2 pode
reagir com outras moléculas ou ser disputado pela catalase ou glutationa peroxidase
formando aguá - estas últimas enzimas citadas também fazem parte do sistema
antioxidante, além da SOD (LI, SHAH, 2004).
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4.5. Síntese e biodisponibilidade de NO na hipertensão arterial
Como dito anteriormente, o shear stress laminar atua no aumento da
atividade e expressão da eNOS, pois é uma força de arraste unidirecional comum em
vasos saudáveis. Por outro lado, vasos com a função vasomotora comprometida
sendo modulado por um shear stress oscilatório, ou seja, turbilhonado, provoca
efeitos deletérios ao vaso, porém estes efeitos e mecanismos de sinalização ainda
não estão bem definidos na literatura e serão discutidos a seguir (LAURINDO,
PEDRO MDE, BARBEIRO, PILEGGI, CARVALHO, AUGUSTO, DA LUZ, 1994; DE
KEULENAER, CHAPPELL, ISHIZAKA, NEREM, ALEXANDER, GRIENDLING, 1998).
Alguns estudos mostram que há um aumento na atividade e expressão da
eNOS em vasos de ratos espontaneamente hipertensos e na hipertensão induzida ,
onde estes também demonstram aumento das espécies reativas de oxigênio no vaso
. Entretanto, este fato não coincide com a biodisponibilidade aumentada de NO
(DOBRIAN, DAVIES, SCHRIVER, LAUTERIO, PREWITT, 2001; GRAHAM, RUSH,
2004).
Sabe-se que a biodisponibilidade de NO não depende somente de sua
produção e que depende também de sua desativação pelas EROs, especificamente
o superóxido (O-2) que, no caso, parece ter uma produção aumentada nesta
patologia (ZALBA, BEAUMONT, SAN JOSE, FORTUNO, FORTUNO, ETAYO, DIEZ,
2000).
O peróxido de hidrogênio (H2O2) pode explicar em partes o aumento da
expressão da eNOS na hipertensão, pois é um importante intermediário na produção
de NO em resposta ao shear stress, onde agudamente o aumento de H2O2 parece
estar associado a maior atividade da eNOS (CAI, LI, DAVIS, KANNER, HARRISON,
DUDLEY, 2003). Este fato talvez seja uma forma de sinalização celular co o intuito
de adaptar o fluxo às condições de equilíbrio (HARRISON et al., 2006).
Outro fato importante que também se refere à eNOS com maior atividade na
hipertensão é o desacoplamento desta enzima. A falta do cofator tetrahidrobiopterina
(BH4), torna a eNOS desacoplada, a qual produz superóxido ao invés de NO,
contribuindo para o aumento do stress oxidativo no vaso e menor biodisponibilidade
de óxido nítrico por interação com o superóxido, desta forma, mesmo que a eNOS
15
esteja com a sua atividade ou expressão aumentada não terá o óxido nítrico como
produto final (MITCHELL, DORRANCE, WEBB, 2003; ZHENG, YANG,
LOOKINGLAND, FINK, HESSLINGER, KAPATOS, KOVESDI, CHEN, 2003;
SCHMIDT, ALP, 2007).
Por outro lado, há trabalhos que encontram a expressão ou atividade da
eNOS diminuída ou sem alterações na hipertensão, alguns estudos mostram que
este mecanismo de adaptação à patologia parece também estar associado ao
aumento do estresse oxidativo no vaso, porém o exato mecanismo ainda não é claro,
o que se sabe é que esta ligado diretamente à síntese do NO pela interrupção de
sinais de transdução de receptores endoteliais, como a defosforilação ou fosforilação
de sítios específicos da enzima, responsáveis pela produção de NO , sendo que
estes fatores podem também depender do estágio da doença (NEWAZ,
YOUSEFIPOUR, NAWAL, ADEEB, 2003; GONGORA et al., 2006).
Pesquisas realizadas com inibidores da eNOS como L-NAME, L-NMMA, L-
NA, L-NAA , 7-NI e NIO, onde participam como análogos à L-arginina, competindo
com o substrato na produção de NO, demonstram que a administração aguda destes
inibidores causam aumento da pressão arterial de longa duração, mostrando mais
uma vez a importância desta enzima e a produção de NO na hipertensão
(ALDERTON, COOPER, KNOWLES, 2001).
Entretanto ainda há conflitos se ocorre, o aumento ou diminuição da
expressão da eNOS , que também esta relacionado a diferentes estágios da
hipertensão arterial , tipo de vaso investigado, etiologia da hipertensão e metodologia
utilizada. Sabe-se que a maioria dos estudos mostram, que em SHRs com estágios
iniciais de hipertensão, não apresentarem disfunção endotelial e alterações na
síntese de NO. Em estágios mais avançados da patologia é onde parece desenvolver
alterações mais expressivas no vaso. Contudo, dúvidas á respeito destes
mecanismos ainda estão presentes no meio científico, onde são necessários mais
investigações a respeito (CHOU, YEN, LI, DING, 1998; BERNATOVA et al., 2009)
16
4.6. Produção das EROs no vaso
Dentre as fontes capazes de produzir EROs no vaso, estudos mostram que o
complexo enzimático NAD(P)H oxidase é predominante e esta presente nas células
endoteliais, adventícias e célula muscular lisa. A NAD(P)H oxidase é originalmente
descrita em fagócitos, mas está claramente estabelecido que também é importante
funcionalmente em não fagócitos (BABIOR, LAMBETH, NAUSEEF, 2002; LYLE,
GRIENDLING, 2006).
Ela é composta por 5 subunidades, onde originalmente tem 2 subunidades
localizadas na membrana plasmática (gp91phox, subunidade catalítica, e p22phox)
e 3 subunidades citosólicas (p47phox, p67phox e p40phox), que em situações basais
não interagem com as subunidades de membrana. Além destas, um componente
adicional, a Rac, uma proteína de pequeno peso molecular. Na estimulação de um
agonista, a p47phox é fosforilada, a qual interage com a p22phox facilitando a
translocação da membrana, levando à atividade catalítica. (LEUSEN, VERHOEVEN,
ROOS, 1996; BABIOR, LAMBETH, NAUSEEF, 2002).
Foi recentemente descoberto que a subunidade catalítica, gp91phox é mais
um membro de uma família de homólogos denominados NOX. Deste modo, também
são expressas nas células vasculares, NOX1, NOX4 e NOX5, além da gp91phox,
conhecida como NOX2 (BANFI, MATURANA, JACONI, ARNAUDEAU, LAFORGE,
SINHA, LIGETI, DEMAUREX, KRAUSE, 2000).
A NOX1 é expressa em baixos níveis nas células vasculares, e pelo
contrário, a NOX4 é altamente expressa, Já a NOX5 é encontrada somente nas
células vasculares de humanos. É importante ressaltar que a expressão de múltiplos
homólogos desta subunidade com diferentes regulações e localizações sugerem que
estas oxidases têm distintas funções (LYLE, GRIENDLING, 2006).
Como uma multisubunidade enzimática a NAD(P)H oxidase catalisa a
produção de O2- por um elétron de oxigênio reduzido usando o substrato NAD(P)H
como doador do elétron: 2 O2 + NAD(P)H 2 O2- + NAD(P)H + H+ (TOUYZ,
SCHIFFRIN, 2004).
Os estímulos para a produção de O2- no vaso pela NAD(P)H oxidase podem
ser fatores de crescimento, citosinas inflamatórias, agentes vasoativos e/ou shear
17
stress, onde a tornam uma enzima constantemente ativa, produzindo superóxido
intracelular em baixas e sustentáveis concentrações (DE KEULENAER et al., 1998;
LI, SHAH, 2004; LI, WHEATCROFT, FAN, KEARNEY, SHAH, 2004).
FIGURA 2 – Produção de espécies reativas de oxigênio em células vasculares. H2O: água; O2: oxigênio; H2O2: peróxido de hidrogênio; ONOO-: peroxinitrito; Fe: Ferro; OH. : radical hidroxila; SOD: superóxido desmutase.(Adaptado de Touyz e Schiffrin, 2004)
4.7. Produção das EROs na hipertensão
Grande corpo de evidências na literatura demontram que a NAD(P)H oxidase
está com a sua atividade aumentada em hipertensos, contribuindo para ambos,
elevação da pressão arterial e disfunção endotelial sugerindo que as EROs têm um
papel fisipatológico importante no desenvolvimento da hipertensão (CHEN et al.,
2001; LI et al., 2004). Não só a atividade da NAD(P)H oxidase como também a
expressão de suas subunidades é aumentada em ratos hipertensos, demonstrando
que há um efeito crônico da hipertensão nesta enzima (ULKER, MCKEOWN,
BAYRAKTUTAN, 2003).
Xantina oxidase
Ciclooxigenase
eNOS desacoplada
Mitocondria
Fatores de crescimento
Citocinas
Agentes vasoativos
Shear stress
Catalase
Glutationa peroxidase
Oxidação
18
Envolvendo condições patológicas, o aumento da produção das EROs pela
NAD(P)H oxidase leva à disfunção endotelial, crescimento e apoptose da célula
muscular lisa, migração de monócitos e peroxidação lipídica, onde todos esses
processos contribuem para o prejuízo vascular na hipertensão (TOUYZ, SCHIFFRIN,
2004).
Além da NAD(P)H oxidase, existem outras fontes de espécies reativas de
oxigênio como, mitocondia, a qual libera as EROs como escape no metabilismo
oxidadtivo e xantina oxidase , onde é ativada pelo processo de isquemia/reperfusão
dentre outras fontes. Apesar de ocorrer produção de EROs na célula endotelial por
estas fontes também a mais abundante produção no vaso é a partir da NAD(P)H
oxidase (LI, SHAH, 2004)
Um dos radicais mais envolvidos na patogênese da hipertensão é o anion
superóxido por estar diretamente ligado aos mecanismos de vasodilatação e
vasoconstrição ao destivar o NO tirando sua ação vasodilatadora e diminuindo sua
biodisponibilidade (SEKIGUCHI, YANAMOTO, SUNANO, 2004).
Estudos mostram que o ãnion superóxido esta associado a prejuízos na
vasodilatação via óxido nítrico, porém a diversidade entre metodologias dificulta o
entendimento de como O-2 esta atuando na hipertensão (ULKER, MCMASTER,
MCKEOWN, BAYRAKTUTAN, 2003; SEKIGUCHI, YANAMOTO, SUNANO, 2004).
4.8. Remoção das EROs no vaso (papel dos sistemas antioxidantes na HA)
As células estão constantemente produzindo EROs como parte de processos
metabólicos, sendo neutralizadas por sistemas antioxidantes que são constituídos
por enzimas como: catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa
peroxidase (GPx) e numerosos antioxidantes não enzimáticos, incluindo vitaminas C,
A e E , glutationa, ubiquinone e flavonóides. Para que não haja um desequilíbrio
redox no vaso é importante o equilíbrio entre a produção e a remoção das EROs,
com auxílio dos sistemas antioxidantes (URSO, CLARKSON, 2003).
A glutationa está presente na maioria das células podendo ser considerada
um dos agentes mais importantes do sistema de defesa antioxidante não enzimático
da célula. Pode ser reciclada do estado oxidado (GSSG) para o estado reduzido
19
(GSH) por meio da enzima glutationa peroxidase, onde a relação GSSG/GSH se
torna também um marcador de estresse oxidativo muito usado (LI, SHAH, 2004).
Já foi demonstrado que a depleção de glutationa no vaso prejudica a
vasodilatação induzida por acetilcolina, parecendo estar relacionada com a
biodisponibilidade de NO (FORD, GRAHAM, DENNISS, QUADRILATERO, RUSH,
2006). Por outro lado Ulker et. al. (2003), observou um aumento nos níveis de
mRNA da GPx sem aumento da sua atividade em ratos SHR associado à diminuição
da vasodilatação.
Uma outra enzima participativa nos sistemas antioxidativos por eliminar H2O2
é a catalase, pois parece não estar alterada em ratos SHR, pois quando incubada
antes da infusão de doses crescentes de ACh parece melhorar o relaxamento neste
modelo, demonstrando que o prejuízo na vasodilatação pode ser de alguma forma
associado ao H2O2 também (ULKER et al., 2003).
Apesar de esses antioxidantes fazerem parte do processo oxidativo do vaso,
a enzima que está mais diretamente ligada a função motora do vaso é a SOD. A
SOD é responsável pela desativação do superóxido, formando H2O2 que por sua vez
é parcialmente eliminado pela catalase e glutationa peroxidase (LI, SHAH, 2004).
A SOD corresponde a uma família de enzimas com diferentes grupos
protéicos em sua composição. Nos sistemas eucariontes existem três formas de
SOD. A forma SOD cobre-zinco (Cu/ZnSOD) é predominante no citoplasma das
células endotéliais e é regulada principalmente pelo shear stress (INOUE,
RAMASAMY, FUKAI, NEREM, HARRISON, 1996). A SOD manganês (MnSOD) é
mitocondrial, pode ser induzida por fatores de crescimento e a ecSOD que
representa 30% a 50% do total de SOD no tecido vascular, pois é a isoforma que
regula a bioatividade extracelular do NO (DIDION, RYAN, DIDION, FEGAN,
SIGMUND, FARACI, 2002; LI, SHAH, 2004).
Camundongos deficientes de ecSOD têm maior indução de hipertensão por
angiotensina II do que camundongos normais demonstrando o envolvimento desta
enzima na função vascular (GONGORA et al., 2006).
Em ratos espontaneamente hipertensos as duas isoformas Cu/ZnSOD e
MnSOD parecem estar aumentadas e ao incubar aortas de SHR pré relaxamento
induzido por ACh, não altera a sua resposta prejudicada. Desta forma, demostra que
20
a disfunção endotelial é provocada pelo aumento do superóxido neste estudo e não
pelo prejuízo na defesa antioxodante (ULKER et al., 2003). Em contrapartida
humanos com hipertensão essencial, apresentem menor capacidade antioxidante em
relação aos indivíduos normotensos (RUSSO, OLIVIERI, GIRELLI, FACCINI,
ZENARI, LOMBARDI, CORROCHER, 1998). Entretanto, metodologias distintas,
dificultam o entendimento dos mecanismos envolvidos.
Alguns estudos mostram haver eficácia no tratamento com antioxidantes,
porém existem ainda muitas controversas de como e qual realmente é a regulação
antioxidante no vaso de hipertensos e consequentemente qual o melhor tratamento.
A atividade e expressão destas enzimas parecem depender da idade e níveis de
hipertensão, gênero, entre outras variáveis como forma de tratamento e tipos de
hipertensão, todavia o sistema antioxidante não é composto somente de enzimas e
também de antioxidantes não enzimaticos, em que estes parecem ter eficácia no
tratamento, da disfunção endotelial (ULKER, MCKEOWN, BAYRAKTUTAN, 2003).
Contudo a regulação da atividade antioxidante depende do estado redox do
vaso na hipertensão e qual mecanismo leva a estas alterações. Cada etiologia da
doença tem características e mecanismos moleculares diferentes que causam
adaptações distintas. A suplementação com antioxidante não enzimático, mesmo
com demonstração de eficácia, ainda não é recomendada para prevenção ou
tratamento da hipertensão, pois foi demonstrado em uma triagem feita com o
consumo de frutas e vegetais de hipertensos que a alimentação consegue suprir
estas deficiência com redução da pressão arterial (JOHN, ZIEBLAND, YUDKIN,
ROE, NEIL, 2002; TOUYZ, 2004).
No caso das pesquisas experimentais, mais investigações ainda precisam
ser feitas para elucidar quais são as reais alterações de cada modelo,
proporcionando a descoberta de intervenções terapêuticas mais adequadas e
individualizadas.
21
4.9. Exercício físico aeróbio na hipertensão
Muitas formas de tratamento estão sendo estudadas a fim de minimizar ou
retardar os efeitos deletérios da hipertensão arterial, mas ainda não é bem
estabelecido qual realmente seria o melhor tratamento (GHIADONI et al., 2003).
Para isso, é necessário um melhor entendimento dos mecanismos e alterações
causados por tratamentos e situações diferenciados.
Dentre os diferentes tratamentos, o treinamento físico aeróbio parece ter
efeitos positivos, onde estudos clínicos já têm mostrado esta resposta positiva do
exercício não só em hipertensos, mas também envolvendo outras patologias que
trazem prejuízos ao sistema cardiovascular, como diabetes e hipercolesterolemia
(JEN, CHAN, CHEN, 2002b; GREEN, MAIORANA, O'DRISCOLL, TAYLOR, 2004).
Em humanos a resposta pressórica após uma sessão de exercício é
diminuída em relação pressão arterial basal de indivíduos saudáveis, caracterizando
a hipotensão pós-exercício (FORJAZ, MATSUDAIRA, RODRIGUES, NUNES,
NEGRAO, 1998). O mesmo acontece em hipertensos, sendo de grande importância
para estes indivíduos, pois sabe-se que este fato traz menor sobrecarga cardíaca e
renal, já que estes indivíduos podem desenvolver patologias decorrente das
sobrecargas de pressão e metabólica constantes à estes órgãos (FORJAZ,
TINUCCI, ORTEGA, SANTAELLA, MION, NEGRAO, 2000)
Talvez esta resposta pressórica diminuída seja decorrente de mecanismos
como maior sensibilidade aos estímulos vasodilatadores após uma sessão de
exercício (JEN, CHAN, CHEN, 2002a). Parece que uma única sessão de exercício
aeróbio pode aumentar a vasodilatação possivelmente por aumentar a liberação de
NO em aorta de ratos saudáveis, além de atenuar a vasoconstrição (BECHARA,
TANAKA, SANTOS, JORDAO, SOUSA, BARTHOLOMEU, RAMIRES, 2008).
Uma das possíveis respostas a esta melhora no controle vascular pelo
endotélio parece ser via cálcio dependente, onde há um aumento do influxo de
cálcio na célula endotelial que estimula a eNOS a produzir NO nos ratos que
realizam a sessão de exercício (JEN, CHAN, CHEN, 2002a).
22
Entretanto há dúvidas se essa melhora é devido há produção aumentada de
NO pela maior atividade da eNOS ou por outros mecanismos intrínsecos do vaso,
como sensibillidade ao NO ou até mesmo ação de outras vias que participam da
vasodilatação (GREEN et al., 2004). Sabe-se que o estresse de cisalhamento agudo
na parede do vaso pode causar aumento das EROs no vaso e no exercício agudo
ocorre aumento do estresse de cilhamento pelo aumento da demanda energética, a
qual necessita de aumento do debito cardíaco , desta forma podemos descartar a
possíbilidade da diminuição da interação do superóxido com o óxido nítrico após
uma sessão aguda de exercício. (LAURINDO et al., 1994).
A resposta aguda ao exercício aeróbio na hipertensão tem grande
importancia, porém não tem implicações diretas ao tratamento, por apresentar
alterações transitórias. Por outro lado, parece que a soma de várias sessões de
exercício e estímulos subseqüentes, onde caracteriza o treinamento físico, causam
adaptações mais duradouras e diferenciadas, diminuindo ainda mais a sobrecarga
aos órgãos alvo (DELP, LAUGHLIN, 1997; LEE, KIM, KIM, CHO, JOO, LEE, LEE,
PARK, JEON, 2009).
Desta forma, após um período de treinamento físico aeróbio de intensidade
moderada em humanos, ocorre melhora na vasodilatação em sujeitos saudáveis e
individuos com hipertensão essencial, onde essa resposta em hipertensos é
associada à queda dos níveis de pressão arterial (HIGASHI et al., 1999). Também
parece melhorar o relaxamento vascular induzido por ACh em ratos hipertensos e
paralelamente aumentar a biodisponibilidade de óxido nítrico (GRAHAM, RUSH,
2004).
Pórém, o treinamento físico causa adaptações estruturais além de funcionais
e moleculares, assim melhoras na biodisponibilidade de NO e na resposta
vasodilatadora à ACh não é encontrada após períodos longos de treinamento
demostrando que a influencia da duração têm grande importância nos resultados
encontrados na literatura (GREEN et al., 2004; JASPERSE, LAUGHLIN, 2006). Em
SHRs as alterações estruturais parecem ocorrer após 20 semanas de treinamento
físico e mudanças moleculares e funcionais são transitórias (DELP, LAUGHLIN,
1997; HORTA, DE CARVALHO, MANDARIM-DE-LACERDA, 2005).
23
Um dos motivos pelo qual o exercício aumenta a vasodilatação na
hipertensão é o estímulo do shear stress (HARTMANNSGRUBER, HEYKEN,
KACIK, KAISTHA, GRGIC, HARTENECK, LIEDTKE, HOYER, KOHLER, 2007). Pelo
aumento da necessidade energética durante o exercício, há um aumento do fluxo
sanguíneo e conseqüentemente do débito cardíaco fazendo com que este aumento
do fluxo ative receptores endoteliais na parede do vaso aumentando a concentração
de cálcio, assim proporcionando síntese de óxido nítrico pela ação da eNOS via
cálcio dependente, como já citado (JEN, CHAN, CHEN, 2002a).
Por outro lado, já foi demonstrado que o aumento do fluxo, ou seja, o
aumento do shear stress também aumenta a produção de espécies reativas de
oxigênio pela ativação da NAD(P)H oxidase no vaso como já citado, mas parece que
a soma de varias sessões agudas provocam adaptações como, aumento nos fatores
de transcrição e expressão das eNOS, promovendo equilíbrio do estado redox do
vaso do rato hipertenso, como forma de regulação deste meio (LAURINDO et al.,
1994; DE KEULENAER et al., 1998).
Outro fator importante a respeito do shear stress é de qual é a sua natureza,
se oscilatório ou laminar, podendo causar adaptações diferentes. O estímulo do
shear stress laminar, ocorre no momento do exercício com períodos de recuperação
proporcionando a adaptação do vaso após a sessão, contraditório é o shear stress
oscilatório que é constante em hipertensos, pois parece ocorrer pela obstrução do
vaso causada por aumento na vasoconstrição, sem períodos de adaptação, desta
forma causando efeitos deletérios (HARRISON et al., 2006).
As adaptações que causam a diminuição da pressão arterial em resposta ao
treinamento físico em hipetensos podem estar relacionadas não só com os controle
das células endoteliais quando se observa os seus mecanismos de controle nos
sistemas orgânicos em geral. Pesquisas desenvolvidas com humanos desmontram
que o sistema nervoso simpático também é responsável por esta queda na pressõ
arterial (RONDON, LATERZA, DE MATOS, TROMBETTA, BRAGA, ROVEDA,
ALVES, KRIEGER, NEGRAO, 2006). Porém ao se tratar de um estudo in vitro com
vasos isolados, não podemos descartar estas outras evidências.
Diante dessas observações e citações surgem dúvidas sobre quais
mecanismos intrínsecos do vaso estão envolvidos nessas respostas, se ocorre
24
realmente o aumento da biodisponibilidade de óxido nítrico com o treinamento físico
e se esse aumento é devido a maior produção de NO. melhor capacidade
antioxidante ou menor produção de EROs no vaso. Entretanto, estas resposta são
influenciadas e podem variar com o período de treinamento e intensidade do
exercício.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Amostragem
Foram estudados 20 ratos machos Wistar (WKY) e 20 ratos
espontaneamente hipertensos (SHR), um modelo genético caracterizado por altos
valores de pressão arterial (OKAMOTO, AOKI, 1963). Os ratos foram mantidos em
caixas plásticas (3 ratos por caixa) em uma sala com temperatura controlada (22°C),
com ciclo claro/escuro invertido de 12:12h. O peso inicial dos ratos foi de 250 a 300
g.
5.2. Desenho experimental
Inicialmente, todos os ratos foram submetidos individualmente ao teste de
esforço máximo em esteira rolante para determinação do consumo de oxigênio pico
(VO2pico) e tolerância ao esforço. Em dias separados foi determinada a pressão
arterial diastólica (PAD), sistólica (PAS) e média (PAM) e freqüência cardíaca (FC)
de repouso, pelo método de pletismografia da artéria caudal.
Em seguida, os ratos controle (Wistar Kyoto) foram distribuídos
aleatoriamente em dois subgrupos experimentais: grupo sedentário (WKYsd, N=10) e
treinado (WKYtr, N=10), o mesmo procedimento foi feito com os ratos SHR,
sedentário (SHRsd, N=10) e grupo SHR treinado (SHRtr, N=10). O grupo WKYtr e
SHRtr foram submetidos ao protocolo de treinamento físico aeróbico de natação de
10 semanas que será descrito na próxima sessão. Os demais grupos (WKYsd e
SHRsd) permaneceram sedentários nas caixas plásticas com água e ração a
vontade.
25
Após o período de treinamento físico (TF) foi realizado novamente o teste de
esforço máximo, a determinação da pressão arterial (PAD, PAS e PAM) e freqüência
cardíaca de repouso.
Após 48hs da última sessão de treino, os ratos foram sacrificados para
retirada dos tecidos, onde dois anéis da aorta torácica de cada rato foram utilizados
imediatamente para o protocolo de reatividade vascular e os anéis restantes
congelados para posteriores análises bioquímicas. O esquema experimental esta
representado na figura abaixo.
5.3. Sequência experimental
A Figura 3 ilustra a sequência dos procedimentos experimentais.
FIGURA 3 - Esquema experimental. PA: pressão arterial; FC: freqüência cardíaca.
1ª 2ª 10ª 11ª
Semanas
Natação (10 semanas) ou sedentarismo
Teste Máximo
Medida de PA e FC
Sacrifício
Adaptação ao meio aquático
Teste Máximo
Medida de PA e FC
26
5.4. Protocolos experimentais
5.4.1. Determinação do consumo de oxigênio de pico (VO2pico)
Todos os ratos foram submetidos a um teste de esforço máximo em esteira
rolante, utilizando-se um protocolo com incremento progressivo de carga de 3m/min
a cada 3 min, até a exaustão, adaptado de Brooks e White (1978), para a
determinação das variáveis: VO2pico, velocidade máxima e tempo e distância
percorrida.
No protocolo de consumo de oxigênio, os ratos correram na esteira dentro de
uma caixa metabólica, que serve como câmara de mistura dos gases expirados. O
fluxo de ar dentro da caixa é unidirecional e mantido em 3.500 mL/min por bomba de
vácuo. Amostras de ar foram retiradas e analisadas para determinação das frações
de O2 e CO2.
Os valores de VO2 e VCO2 foram calculados pela fórmula (BROOKS, WHITE,
1978):
Onde:
VO2 = ml.g-¹.min-1
Fluxo de ar = 3.500 mL/min
FiO2 = fração de oxigênio inspirada (ar ambiente)
FeO2 = fração de oxigênio expirada (caixa de mistura)
Peso corporal = g
VO2 = fluxo de ar X (FiO2-FeO2)/ peso corporal
27
5.4.2. Protocolo de medida da pressão arterial caudal
A pressão arterial foi aferida pelo método não invasivo de pletismografia da
artéria caudal (registro indireto da pressão), onde os ratos foram colocados
individualmente em caixa de acrílico e mantidos sob restrição de movimentos, a
temperatura dentro da caixa de acrílico foi aumentada com o intuito de aumentar a
temperatura corporal do animal e promover vasodilatação da artéria caudal. O
registro da pressão arterial de cauda foi realizado por meio da colocação de
manguito de borracha na região proximal da cauda e ligado ao esfigmomanômetro
para insuflar e desinsuflar gradualmente o manguito entre 0 e 250/300 mmHg.
Numa porção mais distal da cauda foi acoplado um transdutor pneumático
para detecção dos sinais de passagem da onda de pulso de pressão arterial e
registrado no sistema AT/CODAS (DataQ Instruments, Inc., Ohio, USA), com
freqüência de amostragem de 1000 Hz.
A pressão arterial de cauda equivale à pressão do manguito em que o pulso
de pressão desaparece ou reaparece, quando a pressão exercida sobre a cauda
tornar-se ligeiramente menor que o valor da pressão intra-arterial, desobstruindo o
fluxo sangüíneo na artéria caudal é permitido a detecção do pulso da pressão arterial
sistólica . A pressão arterial diastólica foi considerada o menor valor do pulso de PA
detectado. A freqüência cardíaca foi calculada a partir do intervalo de tempo de cada
pulso de pressão arterial detectado pelo transdutor sem a oclusão da passagem do
fluxo sangüíneo na cauda. Foram realizadas, para cada animal, cinco medidas de
pressão arterial de cauda e freqüência cardíaca em repouso, sendo desprezadas a
primeira e a última medidas e calculada a média aritmética entre os valores
restantes.
5.4.3. Protocolo de treinamento físico aeróbico
O protocolo de treinamento de natação foi realizado durante 10 semanas, 5
vezes por semana e duração de 60 minutos/sessão, o qual foi desenvolvido em uma
piscina adaptada para ratos, com subdivisões individuais e temperatura da água
controlada em 30oC. Este protocolo foi adaptado e previamente caracterizado como
28
aeróbico moderado (MEDEIROS, OLIVEIRA, GIANOLLA, CASARINI, NEGRAO,
BRUM, 2004).
Inicialmente, todos os ratos foram adaptados ao ambiente aquático, 5 vezes
por uma semana sem carga acoplada à cauda, onde a duração das sessões foram
de 30, 40, 50, 60 e 60 respectivamente, desta forma já caracterizando o início do
treinamento. Em seguida, foi iniciado o incremento de carga progressivo até 3% do
peso corporal amarrada à cauda do animal. Os ratos foram pesados semanalmente
para o ajuste da carga de treino.
5.4.4. Remoção e preparação da aorta
Após um período de 48 h da última sessão de treino, ou sedentarismo, os
ratos foram sacrificados com alta dose de anestésico (pentobarbital). Com intuito de
minimizar fatores de influência externos, foram sacrificados um rato de cada grupo no
mesmo dia de experimento.
A aorta torácica foi imediatamente retirada e dissecada em uma placa de
petri contendo tampão Krebs-Henseleit (em mM: NaCl=115; KCl=4,7; MgSO4=1,2;
KH2PO4=1,5; NaHCO3=25; CaCl2 =2,5; glicose=11,1 e pH=7,4) para a remoção dos
tecidos conectivo e adiposo, e cortada em 6 segmentos de 5 mm de comprimento.
Os anéis foram distribuídos da seguinte maneira: 2 aneis foram
imediatamente utilizados para análise da reatividade vascular in vitro, 1 anel foi
congelado (-80°C) para posterior quantificação de nitrato e nitrito, 1 anel foi
emblocado em gel de congelamento e isopentano para posterior análise de EROs e
os outros 2 anéis foram congelado (-80°C) para posterior determinação da
expressão da eNOS e subunidades da NAD(P)H oxidase.
29
5.4.5. Estudo da reatividade vascular
Com a finalidade de se mensurar in vitro as respostas de tensão isométrica
desenvolvida pelos anéis aórticos frente aos agonistas utilizados no protocolo, estes
foram suspensos, através de um par de ganchos de aço inoxidável, em uma cuba de
vidro para órgão isolado contendo 14 ml de solução Krebs-Henseleit (descrito
anteriormente), mantidos a 37ºC e aerados com uma mistura gasosa de 95% O2 e
5% CO2 (carbogênio).
Um gancho foi fixado na parte inferior da cuba enquanto o outro gancho foi
conectado a um transdutor de sinal isométrico (BIOPAC, EUA), acoplado a um
computador para o registro da tensão isométrica desenvolvida pelo vaso.
Os anéis aórticos foram submetidos a uma tensão de repouso inicial de 2
gramas, e mantidos nesta tensão durante 70 minutos para que ocorra a estabilização
decorrente do manuseio. Durante o período de estabilização foi feita a troca da
solução Krebs 3 vezes . A 1ª e a 2ª a cada 20 minutos, com a finalidade de remover
eventuais metabólitos liberados no meio, após 40 minutos de estabilização, na 3ª
troca da solução de Krebs, um anel de cada rato foi pré-incubado com N-nitro-L-
arginina metil-éster (L-NAME, 10-4M), um análogo ao substrato da eNOS, a L-
arginina, durante 30 minutos.
Após período de incubação de 30 minutos foram realizadas as curvas
concentração-efeito cumulativas ao agente vasodilatador dependente do endotélio,
acetilcolina (ACh; 10-10 a 10-4 M) tanto nos anéis com L-NAME quanto nos anéis sem
o inibidor, sendo pareados.
Em seguida foi realizada novamente a troca da solução Krebs e 5 lavagens
foram feitas de 5 em 5 minutos a fim de limpar as cubas do agente vasodilatador
(ACh) para realização das curvas concentração-efeito cumulativas ao agente
vasodilatador independente do endotélio, nitropussito de sódio (NPS; 10-11 a 10-4 M),
porém sem incubação com L-NAME (GONZALES, CARTER, KANAGY, 2000).
30
5.4.6. Variáveis avaliadas na reatividade vascular
Para cada curva concentração-efeito foi avaliado, através da análise de
regressão não-linear para curvas sigmóides (GraphPad Prism Software, San Diego,
CA), o efeito máximo (Emax) frente aos agonistas vasodilatadores (responsividade),
bem como a concentração molar dos agonistas que gera um efeito igual a 50% da
resposta máxima vasodilatadora (EC50) (sensibilidade).
5.4.7. Homogeneização e concentração de proteína
Os anéis aórticos congelados para análises bioquímicas foram inicialmente
incubados em tampão e diluição específicos para cada experimento descrito abaixo;
temperatura 4ºC; pH 7,4, e então homogeneizado com pestilo sobre nitrogênio
líquido. O homogenato foi centrifugado a 12.000 G em temperatura de 4ºC, durante
15 minutos. Uma parte do sobrenadante foi separada para a análise da concentração
de proteína pela técnica “Bradford”, utilizando-se a albumina bovina como padrão
(BRADFORD, 1976).
5.4.8. Quantificação de nitrato e nitrito vascular
Para verificar a biodisponibilidade vascular de óxido nítrico, primeiramente as
aortas foram homogeneizadas em tampão fosfato salino (PBS), em seguida, as
concentrações de nitrato e nitrito, produtos do metabolismo do NO, nos homogenatos
das artérias conforme descrito em (LEITE, DANILOVIC, MORIEL, DANTAS,
MARKLUND, DANTAS, LAURINDO, 2003) foram analisadas por
quimioluminescência no analisador de NO (Sievers, modelo NOA 280, EUA). Este
método requer a redução de nitrato e nitrito para óxido nítrico por meio da reação do
cloreto de vanádio (VnCl4) em ácido clorídrico a 95ºC. O óxido nítrico gerado é
carregado por N2, um gás inerte, a uma câmara de geração de ozônio. A reação
entre NO e ozônio gera luz, quantificada por fotomultiplicadoras. As curvas de
calibração em níveis múltiplos foram realizadas com padrão externo (nitrato de sódio-
Aldrich), utilizando-se um programa específico (Sievers versão 2.2, EUA). Amostras
31
de homogenatos totais de artérias (10 ul) foram analisadas. Os valores medidos de
nitrato e nitrato foram corrigidos pela quantidade total de proteínas dos homogenatos
(método Bradford).
5.4.9. Expressão da enzima óxido nítrico sintase endotelial e subunidades da
NADPH oxidase (Western Blotting)
As aortas dos ratos foram inicialmente homogeneizadas em tampão RIPA
contendo Tris-Base (20 mM), NaCl (137mM), NP-40 (1%) e Glicerol (10%). O
homogenato foi centrifugado por 10 minutos à 4°C com 12000 rpm. Alíquotas do
homogeneizado, de 30 g de proteína, foram diluídas em tampão de amostra
contendo Tris-HCL ph 6.8 240mM, azul de bromofenol 0,02%, glicerol 40%,
βmercaptoetanol 200mM e SDS 0,8%. As amostras e um padrão de bandas de
pesos moleculares conhecidos (Kaleidoscope, Bio-Rad, EUA) foram aplicadas ao gel
de eletroforese de poliacrilamida com SDS-PAGE 12% (Dodecilsulfato de Sódio) e
submetidas à corrente elétrica contínua por 120 minutos para separação
eletroforética das proteínas, o qual consiste na migração de moléculas com carga,
numa solução, decorrente da aplicação de um campo elétrico no aparelho para
minigel (Mini Protean).
Após a separação, as proteínas foram transferidas para a membrana de
nitrocelulose (Amersham Biosciences, Piscataway) com corrente elétrica contínua
por 60 minutos (Semiphor, Hoefer-Pharmacia, Suécia). A membrana de nitrocelulose
foi então corada com solução de Ponceau para visualização da correta transferência
de proteínas das amostras e do padrão de pesos moleculares. A membrana foi
bloqueada através da incubação TBS-T 0,1% - 5% leite durante duas horas com o
objetivo de minimizar a ligação inespecífica dos anticorpos. Os anticorpos primários
anti eNOS (Rabbit polyclonal, Cell Signaling, 1:1000), NOX1(Goat polyclonal, Santa
Cruz Biotechnology, 1:1000) e NOX4 (Rabbit polyclonal, Santa Cruz Biotechnology,
1:1000) , foram incubados durante toda a noite sob agitação a 4ºC. Após a lavagem
com TBS-T 0,1% (3 vezes por dez minutos cada) a membrana foi incubada por uma
hora e trinta minutos à temperatura ambiente com os anticorpos secundários
32
específicos para reconhecer os anticorpos primários, sendo os mesmos conjugados
com peroxidase. Após novas lavagens, a membrana foi então revelada por método
quimioluminescente, (peroxidase-H2O2-luminol), utilizando-se para tal fim o kit ECL
(Amersham-Pharmacia, Grã-Bretanha). Após 1 minuto de reação, em seguida a
membrana foi exposta ao filme radiográfico e revelada manualmente. A expressão
protéica foi determinada densitometricamente através de um software de imagem
(Scion Image), pelo número de pixels de cada imagem. O mesmo procedimento foi
feito simultaneamente com o anti GAPDH (Mouse polyclonal Santa Cruz
Biotechnology, 1:1000) para verificar a expressão da mesma, como proteína controle,
não modificável com treinamento físico e tipo de patologia estudada.
5.4.10. Medidas de espécies reativas de oxigênio - Dihidroetídio (DHE)
Primeiramente, um anel aórtico de cada animal foi emblocado em gel de
congelamento (OCT) e isopentano para, posteriormente, realizar cortes (6 a 8 cortes)
de 30 µm em criostato.
Após os cortes, as lâminas foram lavadas cuidadosamente com PBS e
incubadas com dihidroetídeo (DHE , 3 µM) por 20 minutos a 37 ºC em ambiente
úmido e protegido de luminosidade. Após o período de incubação, as lâminas foram
lavadas com PBS pH 7,4 novamente e a análise foi feita em microscópio de
fluorescência confocal (modelo Axiovert 200M, Zeiss, Alemanha) com objetiva de 10x
, conforme método adaptado (MILLER, GUTTERMAN, RIOS, HEISTAD, DAVIDSON,
1998).
Os derivados de oxidação da DHE geram uma coloração avermelhada,
sendo proporcional à produção de espécies reativas de oxigênio, especificamente o
superóxido.
Como controle negativo bem como, a especificação da espécie reativa
analisada, algumas lâminas foram previamente incubadas por 30 minutos a 37 ºC
com a SOD conjugada com polietilenoglicol (peg-SOD), um mimético da SOD que é
capaz de atravessar a membrana da célula inibindo reação do superóxido com o
substrato (DHE).
33
A analise quantitativa das imagens foi feita por meio do programa Leica Qwin
Plus, por meio da média da fluorecência emitida (µm2) de 4 a 5 aneis de cada animal.
6. ANALISES ESTATÍSTICAS
Os dados foram submetidos à análise estatística utilizando-se o programa
GraphPad Prism (v. 4.00, San Diego, CA). As variáveis dependentes: massa
corporal, pressão arterial (PAD, PAS e PAM) e frequencia cardíaca, VO2pico, tempo
de tolerância ao esforço, distancia percorrida, velocidade máximar e respostas
vasomotoras (Emax e EC50), dados bioquímicos aórticos (expressões enzimáticas,
concentrações de nitrato e nitrito e de EROs) foram submetidas a ANOVA 2
caminhos (sd x tr) e (WISTAR X SHR) e Post Hoc de Duncan. O nível crítico de
significância estatística será de 5% (P<0,05). Os dados fora apresentados como
média e erro padrão da média.
7. RESULTADOS
Inicialmente, serão apresentadas as características dos grupos constituídos
na fase pré-treinamento físico: pressão arterial e freqüência cardíaca em repouso,
massa corporal, capacidade aeróbica e tolerância ao esforço. Em seguida, serão
apresentados os efeitos do protocolo de 10 semanas de treinamento físico aeróbio
em natação sobre estas características, bem como sobre as respostas vasomotoras
in vitro e os parâmetros bioquímicos em aorta torácica dos ratos SHR e WKY.
7.1. Características pré-treinamento físico aeróbio em natação
7.1.1. Pressão arterial e freqüência cardíaca de repouso
Na fase pré-treinamento físico, ambos os grupos SHRsd e SHRtr
apresentaram maior PAS, PAD e PAM de repouso comparados aos grupos WKYsd e
WKYtr, respectivamente (Figura 4). No entanto, a FC de repouso foi semelhante
entre os grupos estudados (Figura 5).
34
PAS PAD PAM0
50
100
150
200WKYsd
WKYtr
SHRsd
SHRtr
**
*
#
##P
A (
mm
Hg
)
FIGURA 4 - Pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e
pressão arterial média (PAM) dos grupos SHR sedentário (SHRsd, n=7), SHR treinado (SHRtr, n=7), WKY sedentário (WKYsd, n=7) e WKY treinado (WKYtr, n=6) na fase pré-treinamento físico. Valores expressos como média ± erro padrão. *p< 0,001 SHR vs WKY.
WKYsd WKYtr SHRsd SHRtr0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
FC
(b
at/
min
)
FIGURA 5 - Frequência cardíaca dos grupos SHR sedentário (SHRsd, n=7), SHR
treinado (SHRtr, n=7), WKY sedentário (WKYsd, n=7) e WKY treinado (WKYtr, n=6) na fase pré-treinamento físico. Valores expressos como média ± erro padrão.
35
7.1.2 Massa Corporal, capacidade aeróbica e tolerância ao esforço
Na fase pré-treinamento, a massa corporal, a velocidade máxima, a distância
total e o VO2 pico foram semelhantes entre os grupos estudados (Tabela 1).
TABELA 1 - Massa corporal, distância total e VO2pico dos grupos SHR sedentário
(SHRsd, n=7), SHR treinado (SHRtr, n=7), WKY sedentário (WKYsd, n=7)
e WKY treinado (WKYtr, n=6) na fase pré-treinamento físico. Valores
expressos como média ± erro padrão.
7.2. Características pós-treinamento físico aeróbio de natação
7.2.1 Massa corporal e gordura intraperitonial
Como visto anteriormente, todos os grupos iniciaram o protocolo com a
massa corporal semelhante (Tabela 1). No entanto, a massa corporal aumentou
gradativamente nos grupos sedentários e, no final dos experimentos, foi
significativamente maior em ambos os SHRsd e WKYsd comparados com seus
respectivos grupos na fase pré-TF. Por outro lado, o protocolo de TF de natação
diminuiu significativamente a massa corporal dos ratos. A partir da 7ª semana de TF,
a massa corporal dos grupos SHRtr e WKYtr foi significativamente menor
comparados aos grupos SHRsd e WKYsd, respectivamente (Figura 6).
Em relação à gordura intraperitonial dos ratos após o período de treinamento
físico, pode-se observar menor conteúdo (corrigido pela massa corporal dos ratos)
nos ratos dos grupos SHRtr e WKYtr em relação aos seus respectivos sedentários.
WKYsd WKYtr SHRsd SHRtr
Massa corporal (g)
50,88±4,85 250,73±5,03 271.45±4,86 273,91±3,79
Distância total (m)
475.45±17,40 467.30±22,08 508.02±27,79 478.43±10,35
VO2 pico (ml.kg-1./min-1)
68.87±3,45 69.09±2,44 71,93±1,99 73,33±2,98
36
Além disso, os ratos SHR apresentaram menor conteúdo de gordura intraperitoneal
em relação aos WKY (Figura 7).
0 2 4 6 8 10 12
200
300
WKYsd
WKYtr
SHRsd
SHRtr
*
* **#
#
Semanas
Massa c
orp
ora
l (g
)
FIGURA 6 - Evolução da massa corporal durante 10 semanas de treinamento físico em natação dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6). *p<0,005 tr vs. sd e #p<0,05 pré-TF vs. pós-TF. Dados expressos como média ± erro padrão
WKY SHR0
10
20sd
tr
**
#
Go
rdu
ra I
ntr
ap
eri
ton
ial
(mg
/g)
FIGURA 7 - Conteúdo de gordura intraperitonial (mg/g massa corporal) dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão.*p< 0,001 tr vs sd e #p<0,001 SHR vs WKY.
37
7.2.2. Freqüência cardíaca e pressão arterial de repouso
A freqüência cardíaca de repouso foi semelhante entre os grupos SHRsd e
WKYsd. O treinamento físico de natação diminuiu significativamente a freqüência
cardíaca em ambos os grupos WKYtr e SHRtr em relação aos grupos WKYsd e
SHRsd (Figura 8).
O treinamento físico de natação diminuiu significativamente a PAS, PAD e
PAM no grupo SHRtr comparado ao grupo SHRsd. Entretanto, apenas a PAD do
grupo SHRtr diminuiu foi normalizada (valores do WKY). Deste modo, a PAS e PAD
do grupo SHRtr permaneceram significativamente maiores comparado aos grupos
WKYsd e WKYtr. Além disso, o TF não modificou a PAS, PAD e PAM do grupo
WKYtr comparado ao grupo WKYsd (Figura 9).
WKYsd WKYtr SHRsd SHRtr0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
# #
FC
(b
at/
min
)
FIGURA 8 - Freqüência cardíaca dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão , #p<0,05 tr vs sd
38
PAS PAD PAM0
50
100
150
200WKYsd
WKYtr
SHRsd
SHRtr
**
*
#
##P
A (
mm
Hg
)
FIGURA 9 - Pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) e média (PAM) dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão, *p<0,05 SHR vs WKY , #p<0,05 tr vs sd.
7.2.3. Capacidade funcional e tolerância ao esforço no teste em esteira rolante
Na fase pré-TF, o VO2 pico (teste em esteira) foi semelhante entre os grupos
estudados. No entanto, na fase pós-TF, o VO2 pico diminuiu significativamente em
ambos os grupos sedentários (SHRsd e WKYsd) comparados com os grupos SHRsd
e WKYsd, respectivamente, na fase pré-TF. Por outro lado, o treinamento físico de
natação aumentou significativamente o VO2 pico no grupo SHRtr comparado ao
grupo SHRtr na fase pré-TF. (Figura 10).
Na fase pré-TF, distância percorrida no teste em esteira (Figura 11) foi
semelhante entre os grupos estudados. No entanto, na fase pós-TF, essa variável
diminuíu significativamente em ambos os grupos sedentários (SHRsd e WKYsd)
comparados com os grupos SHRsd e WKYsd, respectivamente, na fase pré-TF. Por
outro lado, o treinamento físico de natação aumentou significativamente a distância
percorrida no grupo SHRtr comparado ao grupo SHRtr na fase pré-TF (Figura 11).
39
WKYsd WKYtr SHRsd SHRtr40
50
60
70
80
90PréTF
PósTF
*
* *
#
#
VO
2p
ico
(m
L.k
g.-1
min
-1)
FIGURA 10 - Consumo de oxigênio pico (VO2 pico) pré e pós o período de 10 semanas de treinamento físico dos ratos SHRsd , SHRtr , WKYsd e WKYtr. Dados expressos como média ± erro padrão *p< 0,05 vs. pré-TF e #p< 0,05 vs.sd.
WKYsd WKYtr SHRsd SHRtr0
500
1000
1500PréTF
PósTF
*
*
*
*#
#$
Dis
tân
cia
Perc
orr
ida (
m)
FIGURA 11 - Distância percorrida dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão *p<0,05 vs. pré-TF, #p<0,05 vs. sd e $p<0,05 vs. WKYtr.
7.3 Reatividade Vascular
Na fase pós-TF, o percentual de relaxamento máximo à ACh (vasodilatador
dependente do endotélio) foi significativamente menor no grupo SHRsd comparado
ao grupo WKYsd. Além disso, o treinamento físico não modificou o relaxamento
40
máximo no grupo WKYtr comparado ao grupo WKYsd. Por outro lado, o treinamento
físico de natação aumentou significativamente o relaxamento máximo à ACh no
grupo SHRtr comparado ao grupo SHRsd. Deste modo, a relaxamento máximo à
ACh não foi significativamente diferente entre o grupo SHRtr comparado aos grupos
WKYsd e WKYtr (figura 12).
A figura 13 demonstra a curva concentração-efeito à dose crescente de ACh.
Assim, pode-se observar que, em doses elevadas de ACh, o grupo SHRsd
apresentou um resposta paradoxal de vasoconstrição à ACh e, portanto, em altas
doses, obteve uma menor resposta vasodilatadora comparado aos grupos SHRtr,
WKYsd e WKYtr. Cabe destacar, que o treinamento fisico foi eficiente em
proporcionar um relaxamento à ACh significativamente maior em aortas do grupo
SHRtr comparado ao grupo SHRsd.
A figura 14 demonstra a curva concentração-efeito à doses crescentes de
ACh, em anéis aórticos previamente incubados com L-NAME (inibidor da eNOS).
Pode-se observar, que não houve diferença na resposta vasodilatadora entre os
grupos em relação à resposta máxima de relaxamento. Entretanto, a diferença no
relaxamento em doses altas de ACh permaneceu no grupo SHRsd vs SHRtr, WKYsd
e WKYtr. O SHRtr esta igual ao WKYtr e WKYsd após a incubação com L-NAME.
A curva de relaxamento ao vasodilatador independente do endotélio, NPS,
não apresentou diferença entre os grupos (Figura 15).
A figura 16 (a e b) demonstram o relaxamento máximo e a curva de
relaxamento à ACh dos grupos WKYsd e SHRsd com e sem incubação do L-NAME,
com intuito de visualizar melhor essa resposta.
41
Emax
WKY SHR0
25
50
75
100
125sd
Tr
*
% (
pré
-co
ntr
ação
)
FIGURA 12 - Resposta vasodilatadora máxima à acetilcolina em anéis aóticos (pré-contração com NE 10-7) dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6) pós-treinamento físico. Dados expressos com média ± erro padrão, *p<0,05 vs. WKY.
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -40
25
50
75
100
WKY sd
WKY tr
SHR sd
SHR tr
* * **
(-)L-NAME
Log M [ACh]
% (
pré
-co
ntr
ação
)
FIGURA 13 - Curva concentração-efeito à acetilcolina (ACh, 10-10 á 10-4 M) em anéis aórticos dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão *p<0,05 SHRsd vs. SHRtr , WKYsd e WKYtr.
42
FIGURA 14 - Curva concentração-efeito à acetilcolina (ACh, 10-10 á 10-4 M) em anéis aórticos pré-incubados (30 min) com L-NAME dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6) pós-treinamento físico. Dados expressos com média ± erro padrão , *p<0,05 vs.WKY.
-12.5 -10.0 -7.5 -5.0 -2.5-25
0
25
50
75
100
125WKY sd
WKY tr
SHR sd
SHR tr
NPS (Emax)
NPS(LogM)
% (
pré
-co
ntr
ação
)
FIGURA 15 - Curva concentração-efeito ao nitropussiato de sódio (NPS, 10-11 á 10-4
M) em anéis aórticos em anéis aórticos dos grupos SHRsd (n=7), SHRtr (n=7), WKYsd (n=7) e WKYtr (n=6) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão.
-10.5 -8.0 -5.5-10
15
40
65
90
WKY sd
WKY tr
SHR sd
SHR tr
* *
(+) L-NAME
Log M [Ach]
% (
pré
-co
ntr
ação
)
43
EMAX
c/L-N
AM
E
s/L-N
AM
E0
25
50
75
100
WKY
WKY SHR
SHR
*
(a)
% (
pré
-co
ntr
aç
ão
)
Curva de Relaxamento
-10 -8 -6 -4
0
50
100
150
WKYsd
SHRsd
}
}
*
* com L-NAME
sem L-NAME
(b)
Log M [ACh]
% (
pré
-co
ntr
ação
)
FIGURA 16 - Resposta vasodilatadora máxima à acetilcolina (a) e curva de relaxamento á ACh (b) em anéis aóticos pré-contraídos com noradrenalina (NE 10-7) , SHRsd (n=7) e WKYsd (n=7) com e sem pré-incubação de L-NAME. Dados expressos como média ± erro padrão, *p<0,05 vs. WKYsd sem L-NAME.
7.4 Expressões protéicas da eNOS, NOX1 e NOX4
O conteúdo protéico da enzima eNOS foi significativamente maior no grupo
SHRsd comparado aos grupos WKYsd e WKYtr . O treinamento físico de natação
diminuiu significativamente a conteúdo de eNOS no grupo SHRtr comparado aos
grupos SHRsd, embora este conteúdo ainda permaneceu maior comparado ao grupo
WKY sd e WKYtr (Figura 17).
A expressão protéica da subunidade da NAD(P)Hoxidase, NOX1 (Figura
18a), não apresentou diferença significante entre os grupos SHR e WKY, tanto
sedentários como treinados. No entanto, a expressão da NOX4, a outra subunidade
estudada, (Figura18b) está significativamente aumentada nos grupos SHRsd e SHRtr
comprados aos grupos WKY. Por outro, o treinamento físico de natação diminuiu
significativamente a expressão protéica da NOX-4 no grupo SHRtr comparado ao
grupo SHRsd.
44
WKY SHR0
100
200
300sd
tr
*E
xp
res
são
Pro
téic
a e
NO
S-A
ort
a(%
do
co
ntr
ole
)
FIGURA 17 - Expressão protéica da óxido nítrico sintáse endotelial (eNOS) em aorta dos grupos SHRsd (n=4), SHRtr (n=4), WKYsd (n=4) e WKYtr (n=4) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão, porcentagem do grupo controle (WKYsd). *p<0,05 vs.WKYsd, WKYtr.
WKY SHR0
50
100
150
200SD
TR
(a)NOX1
Exp
ressão
Pro
téic
a N
OX
1-A
ort
a
(% d
o c
on
tro
le)
WKY SHR0
100
200
300
400SD
TR
*
#
NOX4
Exp
ressão
Pro
téic
a N
OX
4-A
ort
a
(% d
o c
on
tro
le)
(b)
FIGURA 18 - Expressão protéica das NOX1 (a) e NOX4 (b), subunidades da NAD(P)Hoxidase em aorta dos grupos SHRsd (n=4), SHRtr (n=4), WKYsd (n=4) e WKYtr (n=4) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão, porcentagem do grupo controle (WKYsd). *p<0,05 vs.WKYsd, WKYtr e SHRtr e #p<0,05 vs.WKYsd, WKYtr e SHRsd.
45
7.5 Biodisponibilidade de Óxido Nítrico.
A concentração de nitrito (NO-2), esta menor no SHRsd em relação aos
outros grupos WKYsd, WKYtr e SHRtr (Figura 19b). Já o nitrato (NO-3) não
apresentou diferença estatística entre os grupos (Figura 19a).
Nitrato
WKY SHR0
20
40
60
80
100sd
tr
(a)
uM
/ug
de p
rote
ina
Nitrito
WKY SHR0
1
2
3
4sd
tr
*
#
(b)
uM
/ug
de p
rote
ina
FIGURA 19 - Concentração de nitrato (a) e nitrito (b) em aorta, produtos do metabolismo do NO dos grupos SHRsd (n=4), SHRtr (n=4), WKYsd (n=4) e WKYtr (n=4) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão, µM dividido por µg de proteína. *p<0,05 vs.WKYsd, WKYtr e SHRtr, #p<0,05 SHRsd.
7.6 Anion superóxido
A quantificação da fluorescência dada pela interação do DHE com o
superóxido (µm2) representada em porcentagem do grupo controle (WKYsd) no
grupo SHRsd esta maior em relação aos outros grupos (Figura 21).
A abaixo estão representadas as imagens feitas com microscópio confocal dos
quatros grupos WKYsd, WKY tr, SHRsd e SHRtr (Figura 20 a,b,c e d
respectivamente)
46
(a) (b)
(c) (d)
FIGURA 20 - As figuras representam o superóxido vascular mensurado por fluorescência de DHE em aorta de ratos, por microscopia confocal (40x) dos grupos WKYsd (a), WKYtr (b), SHRsd (c) e SHRtr (d).
WKY SHR0
100
200
300sd
tr
*
#
An
ion
Su
peró
xid
o
(% d
o c
on
tro
le)
FIGURA 21 - Conteúdo de superóxido (µm2) em aorta dos grupos SHRsd (n=4), SHRtr (n=4), WKYsd (n=4) e WKYtr (n=4) pós-treinamento físico. Dados expressos como média ± erro padrão, porcentagem do controle. *p<0,05 vs.WKYsd, WKYtr e SHRtr, #p<0,05 SHRsd.
8. DISCUSSÃO
Nossos resultados demonstram que, na oitava semana de vida (fase pré-
treinamento), os ratos SHR apresentaram valores de PAS, PAD e PAM
47
significativamente maiores do que os ratos WKY. No entanto, a massa corporal, a FC
de repouso e o VO2 pico foram semelhantes entre os grupos. Quanto à função
vasomotora aórtica, os ratos apresentaram menor resposta vasodilatadora à ACh,
bem como resposta contrátil em concentrações elevadas de ACh. Além disso, os
ratos SHR apresentaram um estado de estresse oxidativo vascular, evidenciado pelo
índice de produção de superóxido aumentado, associado à maior expressão protéica
da NOX4 e menor biodisponibilidade de NO, embora a expressão protéica da eNOS
esteja aumentada. O programa de treinamento físico de natação foi eficiente em
promover bradicardia de repouso, aumentar significativamente o VO2pico e diminuir
as PAS, PAD e PAM no grupo SHRtr comparado ao grupo SHRsd. Além disso, o
treinamento físico modificou sobremaneira a função vasomotora e a bioquímica da
aorta torácica, destacando-se uma melhorar na resposta vasodilatadora à ACh,
associada à diminuição do índice de produção de superóxido e expressão da NOX4,
bem como aumento na biodisponibilidade de NO vascular.
Sabe-se que os modelos SHR apresentam aumento da pressão arterial, a
partir aproximadamente 5-6 semanas de vida (HORTA, DE CARVALHO,
MANDARIM-DE-LACERDA, 2005). De fato em nosso trabalho, onde foi realizado
com ratos que apresentavam 8 semanas de idade no inicio do protocolo, o grupo
SHR tinha esta mesma resposta de aumento em relação aos controles WKY. Já nas
outras variáveis como freqüência cardíaca e as observadas no teste de esforço
(Tabela 1) parecem não ter alterações em SHR com 8 semanas de idade, isto
também já observado em outros trabalhos (AZEVEDO, BRUM, MATTOS,
JUNQUEIRA, RONDON, BARRETTO, NEGRAO, 2003; GRAHAM, RUSH, 2004;
REN, 2007). Estas observações demosntram, no presente estudo, que o aumento da
pressão arterial, provavelmente, é a primeira alteração cardiovascular em SHR, visto
que a freqüência cardíaca e VO2 pico não estão diferentes dos controles, onde esta
última variável é a resposta da capacidade funcional destes ratos.
Em relação à massa corporal em nossos ratos não tem diferença entre os
grupos, e esta resposta parece ser característico da faixa etária dos ratos
hipertensos (GRAHAM, RUSH, 2004). Entrentanto, Jun Ren, 2007 demontrou que
SHRs com 12 meses de idade apresentavam menor peso corporal em relação aos
48
seus controles , provavelmente devido à característica do desenvolvimento desta
patologia (REN, 2007).
Após o período de treinamento físico, os ratos SHRtr apresentaram menor
pressão arterial (sistólica, diastólica e média) em relação aos SHRsd, mas ainda a
PAS e a PAM permaneceram diferentes dos WKYsd e WKYtr. O mesmo foi
observado em outro estudo (HORTA, DE CARVALHO, MANDARIM-DE-LACERDA,
2005) onde o grupo que realizou treinamento físico aeróbio (55% do VO2max.), neste
caso em esteira rolante, apresentou menor pressão arterial sistólica em relação aos
seus respectivos que permaneceram sedentários, e só se igualaram ao grupo dos
WKY na décima terceira semana de treinamento físico aproximadamente. O presente
estudo, foi realizado com 10 semanas de treinamento físico, onde restaurou
parcialmente a PAM e PAS destes ratos, talvez seria necessário um período maior
de treinamento para que as alterações se tornem mais expressivas.
Em relação á PAD, a qual foi normalizada, sabe-se que esta diretamente
relacionada à resistência vascular periférica (RVP), desta forma, de acordo com a Lei
de Poiseuille referente à dinamica dos fluidos, um fator de grande importância que
determina a resistência vascular é o raio do tubo condutor, no caso, o raio do vaso, o
qual é elevado à quarta potência (Gradiente de pressão x Raio do vaso4 /
comprimento do vaso x viscosidade do líquido). Deste modo, pequenas alterações
no raio do vaso, como aumento da resposta vasodilatadora à Ach, causam grandes
mudanças na RVP (WILLIAN D. MCARDLE, 2008). Entretanto, os resultados obtidos
na reatividade vascular serão discutidos posteriormente, e por se tratar de um
experimento in vitro, os dados não podem ser extrapolados para os resultados in
vivo somente relacinados de forma sucinta.
Se as características de freqüência cardíaca e relacionadas ao teste máximo
anteriores ao período de treinamento físico não apresentaram diferenças entres os
grupos, por outro lado, no presente estudo o exercício teve influência significativa
nestas variáveis.
Já foi bem demonstrado que o treinamento de natação tem predominância
oxidativa, e que em ratos normotensos a partir da sexta semana de treino
apresentam bradicardia de repouso com o treinamento de natação (MEDEIROS et
al., 2004). Este fato em nosso trabalho foi observado, tanto na bradicardia de
49
repouso quanto na melhora no VO2pico, dos ratos que realizaram o treinamento
(WKYtr e SHRtr). Além disso, os mesmos ratos melhoram a tolerãncia ao esforço,
este fato demonstrado da distancia percorrida no teste de esforço máximo. Estas
respostas demonstram a efetividade do treinamento físico de natação realizado, em
melhorar a capacidade física funcional destes ratos.
Outro fato, o qual é plausível de ser mensionado é a queda do VO2 pico e
nas variáveis de tolerância ao esforço após o período de sedentarismo dos WKYsd e
SHRsd. Baseado nestas respostas pode-se relatar que o treinamento físico, além de
previnir a queda também melhora a capacidade funcional destes ratos.
Os resultados discutidos até o momento estão relacionados á variáveis que
caracterizam os grupos, quanto à hipertensão e ao treinamento físico. A seguir, os
resultados que serão discutidos já se relacionam aos objetivos do estudo.
O objetivo do presente estudo foi de avaliar os efeitos do treinamento físico
aeróbico (natação) sobre a resposta vasomotora (dilatação) em aorta de ratos SHR,
destacando-se o papel da biodisponibilidade de EROs e de NO nestas respostas.
Entretanto para isto, primeiramente é necessário saber quais as alterações
encontradas no rato SHR.
O relaxamento induzido pelo NPS, vasodilatador independente do endotélio,
não alterou a magnetude do relaxamento nos anéis aorticos em ambos os grupos,
demonstrando integridade e funcionalidade da musculatura lisa vascular (ULKER et
al., 2003).
Neste estudo, ACh, vasodilatador dependente do endotélio, produziu
relaxamento em aneis aorticos de ratos WKY, onde foi dose-dependente.
Similarmente ACh produziu relaxamento em anéis aorticos de SHR em doses
menores e vasoconstrição em altas doses de ACh.
Deste modo, observamos que os ratos SHRsd apresentaram menor resposta
vasodilatadora máxima á acetilcolina (ACh 10-7) em relação aos ratos WKYsd,
apesar de apresentarem relaxamento nesta dose. Este fato, demostra claramente
que os ratos SHR apresentam disfunção endotelial (FURCHGOTT, ZAWADZKI,
1980; ULKER et al., 2003; GEROVA, KRISTEK, CACANYIOVA, CEBOVA, 2005).
Sabe-se que o grau de disfunção das células endoteliais é demonstrado, a
partir de um menor relaxamento á estímulos vasodilatadores e também resposta de
50
vasocontrição em doses altas de acetilcolina (FURCHGOTT, ZAWADZKI, 1980;
ULKER et al., 2003), pois com provável disfunção ou perda das células endoteliais a
acetilcolina começa a agir diretamente nos receptores muscarínicos no vaso, os
quais promovem vasoconstrição (LUDMER, SELWYN, SHOOK, WAYNE, MUDGE,
ALEXANDER, GANZ, 1986). Quando os mesmos vasos foram pré-incubados com o
inibidor da síntese de NO, L-NAME, os anéis dos SHRsd e WKYsd apresentaram
diminuição do relaxamento. Além disso, como os ratos SHRsd apresentaram
respostas vasoconstritoras em doses altas de ACh, continuam diferentes dos WKY ,
quanto somente a sua resposta em doses altas de ACh, demonstrando que a
produção de NO não é a somente a responsável por esta vasocontrição paradoxal
encontrada neste modelo de SHR.
Sabe-se que á acetilcolina, pode estimular outras vias também responsáveis
pela vasodilatação, com a das prostaciclinas agindo em sinergismo com o NO
(FELETOU, VANHOUTTE, 2006). Entretanto, esta via não foi estudada para
confirmar esta suposição.
Parece que o prejuizo na vasodilatação em SHRs e a atenuação do
relaxamento pelo L-NAME em ratos hipertensos e seus controles não é devido a
diminuição da expressão protéica da eNOS, pois esta encontra-se aumentada em
relação ao grupo controle WKYsd. Evidências na literatura podem confirmar este
resultado (ULKER et al., 2003; GRAHAM, RUSH, 2004). Mas ainda existem
controversas em relação à este fato, onde alguns trabalhos observam a diminuição
da expressão desta proteína em estágios mais avançados da hipertenção (CHOU et
al., 1998), demonstrando que esta resposta depende da idade do animais estudados,
que por outro lado nos estágios iniciais do desenvolvimento da patologia a eNOS
encontra-se aumentada (VAZIRI, NI, OVEISI, 1998).
Apesar deste fato, a expressão protéica não pode confirmar atividade desta
proteína e, além disso, espelha o conteúdo da eNOS em uma grande variedade de
células aorticas, onde estas mudanças observadas não podem sobretudo refletir
somente o conteúdo endotelial.
Embora a disfunção endotelial aparecer, não somente na hipertensão
genética, mas também em diferentes tipos de etiologias, o estresse oxidativo pode
ser identificado como um denominador comum observado através do aumento da
51
expressão das subunidades da NAD(P)H oxidase (FELETOU, VANHOUTTE, 2006).
A expressão da NOX4 em nossos ratos hipertensos esta aumentada em
relação aos controles WKYsd. Diferentemente da NOX1, que apesar de ter uma
tendência não mostrou diferença significante entre os grupos SHRsd e WKYsd.
Dentre os homólogos da gp91phox (NOX2) a NOX4 é a que apresenta o maior
quantidade na células vasculares (MILLER, DRUMMOND, SCHMIDT, SOBEY,
2005). Porém ainda não se descartar a função da NOX1 nestas células (WIND,
BEUERLEIN, ARMITAGE, TAYE, KUMAR, JANOWITZ, NEFF, SHAH, WINGLER,
SCHMIDT)
Observa-se em trabalhos que estudam SHR com mais idade que a
expressão de NOX4 não está aumentada ao contrario da expressão da NOX1 (WIND
et al.). Desta forma, as mudanças na expressão destas isoformas são depententes
também do estágio da patologia, onde a NOX1 é mais expressa em estágios mais
avançados, pois parece ser responsiva à estímulos como AngII (angiotensina II), a
qual encontra-se aumentada na hipertensão avançada (LASSEGUE, SORESCU,
SZOCS, YIN, AKERS, ZHANG, GRANT, LAMBETH, GRIENDLING, 2001;
WINGLER, WUNSCH, KREUTZ, ROTHERMUND, PAUL, SCHMIDT, 2001),
causando cronicamente aumento na expressão deste homólogo. A NOX4, por ser
mais expressa em células vasculares, suponha-se que ela tem um papel maior na
homeostase, a qual tem responsividade no inicio do desenvolvimento da hipertensão
com intuito de manter este equilíbrio orgânico, que esta sendo perdido pelo
desenvolvimento da hiperensão (WINGLER et al., 2001; LYLE, GRIENDLING, 2006).
Porém, mesmo diante destas especulações ainda não é claro na literatura qual o
papel de cada um destes homólogos.
Existe uma dificuldade no estudo das adaptações da NAD(P)H oxidase, pelo
fato de ela ser um complexo composto por multisubunidades enzimáticas. Desta
forma é possível uma resposta diferente de outros componentes que não foram
estudados. Entretanto, na ausência destes dados investigamos, a quantidade de
superóxido vascular em aorta de SHR, o qual é o componente produzido pela
interação das multisubunidades (citosólicas e ligadas à membrana) seguida do
estímulo a esta enzima. E, ao analisarmos por imunofluorescência o conteúdo aórtico
de superóxido encontramos aumentado no SHR em relação aos WKY demonstrando
52
um estado de estresse oxidativo na aorta destes ratos.
Quanto aos produtos do metabolismo do NO, onde demonstraram a sua
biodisponibilidade aortica, observamos nos SHRsd que o nitrato tem uma forte
tendência, mas não é confirmada estatísticamente seu menor conteúdo em relação
aos WKY e somente o nitrito esta diminuído.
Os vários tipos de metodologias utilizadas para esta análise prejudicam a
comparação desta resposta com a literatura, além de o NO ser uma molécula
altamente reagível, mas de fato, no presente estudo esta diminuição não tem relação
alguma com a produção de NO pela eNOS (CHOU et al., 1998; VAZIRI, NI, OVEISI,
1998).
Sabe-se que a biodisponibilidade de NO depende também da sua remoção, a
qual é feita pela sua interação com o superóxido, onde elimina sua função
vasodilatadora produzindo outra espécie reativa de oxigênio como o peróxido de
nitrito, altamente lesiva às funções celulares e que não tem função vasodilatadora
(SEKIGUCHI, YANAMOTO, SUNANO, 2004; FELETOU, VANHOUTTE, 2006).
Desta forma, o modelo estudado apresenta disfunção endotelial,
demosntrada pela diminuição do relaxamento, a qual provavelmente é decorrente da
diminuição da biodisponibilidade de NO pela sua interação com o O-2, devido ao
aumento da sua produção provavelmente pela NOX4 em aorta de ratos SHR.
Com o avanço do conhecimento esforços têm sido feitos a fim de encontrar o
tratamento ideal para patologia estudada. Sabe-se que o treinamento físico é capaz
de melhorar a capacidade funcional e restaurar parcialmente a pressão arterial
destes ratos, como também demonstrado em nossos resultados, mas se este fato
esta relacionado á melhora da função endotelial ou à alguma alteração intrínsceca do
vaso, ainda não se sabe definitivamente.
Em nosso trabalho demonstramos que a disfunção endotelial foi parcialmente
revertida pelo treinamento físico aeróbio, ao observarmos o relaxamento máximo, o
qual nos ratos SHRsd esta diferente dos SHRtr. Além disso, o grupo SHRtr não
apresenta diferença dos WKYsd e tr em doses altas de acetilcolina, desta forma a
vasoconstrição em doses altas de ACh é revertida com o treinamento físico.
É de extrema importância enfatizar que se a resposta máxima e a
vasoconstrição em doses altas de ACh nos ratos hipertensos caracterizam a
53
disfunção endotelial e neste estudo podemos demostrar que o treinamnto físico
aeróbio de natação pode reverte-la. Quando os mesmos vasos foram incubados com
L-NAME não observamos diferença entre os grupos SHRsd e SHRtr demonstrando
que a biodisponibilidade de NO tem relação com a melhora do relaxamento causada
pelo pelo treinamento físico realizado no presente estudo.
Para investigar este resultado a expressão da eNOS foi quantificado nos
ratos treinados e observamos que, ao passo que ela está aumentada em SHR, a fim
de restaurar a biodisponibilidade de NO, o treinamento físico pode diminui-la, pois
apesar de o grupo SHRtr não estar diferente do SHRsd , também não está diferente
dos WKYsd e tr.
Alguns trabalhos realizados com o objetivo de verificar o efeito do
treinamento físico aeróbio também observaram estas respostas. (GRAHAM, RUSH,
2004; JASPERSE, LAUGHLIN, 2006). Porém, ainda é difícil relacionar os trabalhos
encontrados na literatura, onde as intesidades e os tipos de exercícios estudos são
diferentes e, além disso, em relação ao treinamento de natação não encontramos
respaudo literário suficiente.
Existem várias evidências na literatura onde sugerem que o estresse
oxidativo em ratos SHR está elevado, e que isto poderia levar prejuízo da função
vasomotora dependente do endotélio, como já observado anteriormente (WIND et al.;
SEKIGUCHI, YANAMOTO, SUNANO, 2004; MIYAGAWA, OHASHI, YAMASHITA,
KOJIMA, SATO, UEDA, DOHI, 2007). O presente estudo mostrou que o aumento da
expressão dos homólogos da gp91phox (NOX4) causa desequilibriono estado redox,
pois leva ao aumento do superóxido, onde prejudica a biodosponibilifdade de NO.
Desta forma, o treinamento físico parece ser capaz de reverter parcialmente esta
alteração no estado redox, diminuindo a expressão da NOX4, porém ainda continuou
diferente dos grupos WKY.
Em relação á NOX1, como nesta fase da hipertensão ela parece não estar
alterada, no presente estudo, o treinamento físico não teve interferência neste
homólogo.
Para confirmar os resultados obtidos com expressão protéica o metabolitos
do NO e o conteúdo de superóxido vascular foram estudados também com o
treinamento físico aeróbio de natação, onde foi capaz de normaliza-los, igualando-se
54
aos WKYsd e tr .
Se o aumento da expressão da eNOS em SHR é necessário a fim de
restaurar o conteúdo de NO disponível no vaso, a influência do TF de natação em
diminuir a expressão da eNOS se deve ao fato deste conteúdo estar normalizado
após este período.
Em relação ao superóxido, sabe-se que a expressão protéica não reflete a
atividade enzimática, e sabe-se também, que existem outras fontes de superóxido
que podem ser responsáveis pela sua produção, as quais não foram investigadas.
Entretanto, pode-se supor que existe um grande relação entre, as respostas de
expressão proteica e o conteúdo final encontrado pela fosforilação e/ou ativação
destas enzimas.
9. CONCLUSÃO
O objetivo do presente estudo foi de investigar o efeito do treinamento físico
aeróbio de natação sobre a resposta vasomotora em aorta de ratos SHR,
destacando-se o papel da biodisponibilidade de EROs e de NO nestas respostas.
Baseado nas evidências encontradas no presente estudo pode-se concluir que o
ratos SHR tem função vasodilatadora dependente do endotélio prejudicada pela
diminuição da biodisponibilidade de NO, causada pelo aumento interação com
superóxido.
O aumento do nível de atividade físíca tem sido identificado como redutor de
morbidade e mortalidade (RODRIGUEZ, CURB, BURCHFIEL, ABBOTT,
PETROVITCH, MASAKI, CHIU, 1994) mais especificamente como redutor de
marcadores fisiológicos de doença cardiovascular como hirpertensão arterial,
disfunção endotelial e rigidez arterial. Em nosso estudo pode-se concluir que os
potenciais mecanismos, pelos quais o treinamento físico aeróbio de natação reduz os
marcadores de difunção endotelial parecem estar envolvidos com o aumento da
biodisponibiladade de óxido nítrico pela diminuição da sua degradação via
superóxido reestabelecendo o equilíbrio entre a produção e a remoção do NO.
55
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