Comparação das atividades anticoagulante e antitrombótica de frações de heparinas suína e bovina Daiana Leila Drehmer PROBEM/UFPR Alexsandro Vinícius Nogueira; Ana Helena Pereira Gracher; Guilherme Lanzi Sassaki; Marcello Iacomini; Thales Ricardo Cipriani Introdução/Objetivos Método Resultados Referências Amostras Atividade (UI/mg) * Rendimento (%) US 171,78 - SS 100,54 10,53 PS 209,82 89,47 UB 142,26 - SB 64,09 9,93 PB 160,43 90,07 Clexane 14,64 - Fragmin 27,66 - Tabela 1 – Potência anticoagulante e rendimento das heparinas. Amostras α-trombina + AT α-trombina + HCII Fator Xa + AT US 0,000510 0,008400 0,000398 SS 0,000390 0,030600 0,000468 PS 0,000300 0,007700 0,000066 UB 0,001280 0,010100 0,002400 SB 0,000330 0,034700 0,000600 PB 0,000480 0,006700 0,003700 Clexane 0,000424 0,153800 0,002256 Fragmin 0,000243 0,041070 0,003212 Tabela 2 – Quantidade de heparina necessária, em UI/mL, para inibir enzimas da coagulação (IC 50 ). Figura 1 – Efeito antitrombótico venoso após a administração intravascular das heparinas em ratos. Conclusões Heparinas não fracionadas (1 g), bovina (UB) e suína (US), foram solubilizadas em 10 mL de água destilada e tratadas com 7,5 mL de etanol saturado com acetato de sódio, gerando as frações sobrenadante (SB e SS) e precipitado em etanol (PB e PS); O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) foi utilizado para determinar a potência das heparinas em unidades internacionais por miligrama (UI/mg); Os efeitos das heparinas sobre a atividade da - trombina e do fator Xa foram testados nas combinações trombina+AT, trombina+HCII e fator Xa+AT; Para avaliar a atividade antitrombótica das heparinas, a formação de trombo em ratos Wistar foi induzida por uma combinação de estase e hipercoagulabilidade. A heparina é um glicosaminoglicano altamente sulfatado e de massa molar variável, entre 3 a 30 kDa, com unidades alternadas de -D-glucosamina e ácido urônico. A atividade anticoagulante da heparina surge através da sua ligação à antitrombina (AT) e ao cofator II da heparina (HCII), causando nestes uma alteração conformacional que aumenta a afinidade de ligação a proteases da cascata de coagulação, inativando- as. A heparina encontra-se amplamente difundida na clínica e sua utilização pode gerar diversos efeitos adversos, que podem ser diminuídos com o fracionamento. O objetivo geral do trabalho é padronizar um método de fracionamento eficiente, com bom rendimento final, que gere frações de alta e baixa massa molar e que não cause alterações na estrutura química das heparinas bovina e suína. VOGEL, G.M.T., et al. Comparison of two experimental thrombosis models in rats effects of four glycosaminoglycans. Thrombosis Research, v. 54, p. 399-410, 1989. MAAS, N.C., et al. Sulfation pattern of citrus pectin and its carboxy-reduced derivatives: influence on anticoagulant and antithrombotic effects. Carbohydrate Polymers, v. 89, p. 1081- 1087, 2012. JONES, C.J., et al. Heparin Characterization: Challenges and Solutions. Annual Review of Analytical Chemistry, v. 4, p. 439- O fracionamento adotado no trabalho gerou frações de heparinas suína e bovina com diferentes potências anticoagulante e antitrombótica, e diferentes comportamentos em relação à inibição de enzimas da cascata de coagulação. A diferença de massa molecular e/ou as diferenças estruturais nativas inerentes às “famílias” de heparinas devem ser as responsáveis pelos resultados observados.

Introdução/Objetivos

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Resultados

Referências

Amostras Atividade (UI/mg) * Rendimento (%)

US 171,78 -SS 100,54 10,53PS 209,82 89,47UB 142,26 -SB 64,09 9,93PB 160,43 90,07

Clexane 14,64 -Fragmin 27,66 -

Tabela 1 – Potência anticoagulante e rendimento das heparinas.

Amostrasα-trombina

+ ATα-trombina

+ HCIIFator Xa

+ AT

US 0,000510 0,008400 0,000398SS 0,000390 0,030600 0,000468PS 0,000300 0,007700 0,000066UB 0,001280 0,010100 0,002400SB 0,000330 0,034700 0,000600PB 0,000480 0,006700 0,003700

Clexane 0,000424 0,153800 0,002256Fragmin 0,000243 0,041070 0,003212

Tabela 2 – Quantidade de heparina necessária, em UI/mL, para inibir enzimas da coagulação (IC50).

Figura 1 – Efeito antitrombótico venoso após a administração intravascular das heparinas em ratos.

Conclusões

Heparinas não fracionadas (1 g), bovina (UB) e suína (US), foram solubilizadas em 10 mL de água destilada e tratadas com 7,5 mL de etanol saturado com acetato de sódio, gerando as frações sobrenadante (SB e SS) e precipitado em etanol (PB e PS); O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) foi utilizado para determinar a potência das heparinas em unidades internacionais por miligrama (UI/mg); Os efeitos das heparinas sobre a atividade da -trombina e do fator Xa foram testados nas combinações trombina+AT, trombina+HCII e fator Xa+AT; Para avaliar a atividade antitrombótica das heparinas, a formação de trombo em ratos Wistar foi induzida por uma combinação de estase e hipercoagulabilidade.

A heparina é um glicosaminoglicano altamente sulfatado e de massa molar variável, entre 3 a 30 kDa, com unidades alternadas de -D-glucosamina e ácido urônico. A atividade anticoagulante da heparina surge através da sua ligação à antitrombina (AT) e ao cofator II da heparina (HCII), causando nestes uma alteração conformacional que aumenta a afinidade de ligação a proteases da cascata de coagulação, inativando-as. A heparina encontra-se amplamente difundida na clínica e sua utilização pode gerar diversos efeitos adversos, que podem ser diminuídos com o fracionamento. O objetivo geral do trabalho é padronizar um método de fracionamento eficiente, com bom rendimento final, que gere frações de alta e baixa massa molar e que não cause alterações na estrutura química das heparinas bovina e suína.

VOGEL, G.M.T., et al. Comparison of two experimental thrombosis models in rats effects of four glycosaminoglycans. Thrombosis Research, v. 54, p. 399-410, 1989. MAAS, N.C., et al. Sulfation pattern of citrus pectin and its carboxy-reduced derivatives: influence on anticoagulant and antithrombotic effects. Carbohydrate Polymers, v. 89, p. 1081-1087, 2012. JONES, C.J., et al. Heparin Characterization: Challenges and Solutions. Annual

Review of Analytical Chemistry, v. 4, p. 439-465, 2011.

O fracionamento adotado no trabalho gerou frações de heparinas suína e bovina com diferentes potências anticoagulante e antitrombótica, e diferentes comportamentos em relação à inibição de enzimas da cascata de coagulação. A diferença de massa molecular e/ou as diferenças estruturais nativas inerentes às “famílias” de heparinas devem ser as responsáveis pelos resultados observados.