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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE DOENÇAS INFECCIOSAS E TROPICAIS
INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE ALPHAVIRUS EM
PACIENTES FEBRIS DURANTE EPIDEMIA DE DENGUE EM
MATO GROSSO, BRASIL
NAYARA ZUCHI
Cuiabá, MT, Brasil
2014
I
NAYARA ZUCHI
INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE ALFAVÍRUS EM PACIENTES
FEBRIS DURANTE EPIDEMIA DE DENGUE EM MATO GROSSO,
BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Universidade
Federal de Mato Grosso, Campus Cuiabá, para obtenção do
Título de Mestre em Ciências da Saúde, área de Doenças
Infecciosas e Tropicais.
Orientadora: Renata Dezengrini Slhessarenko
Cuiabá, MT, Brasil
2014
II
Ficha catalográfica
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
Z94c Zuchi, Nayara.
CIRCULAÇÃO DO VÍRUS MAYARO DURANTE EPIDEMIA DE DENGUE EM MATO GROSSO, BRASIL / Nayara Zuchi. -- 2014
xii, 68 f. ; 30 cm.
Orientadora: Renata Dezengrini Slhessarenko.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Cuiabá, 2014.
Inclui bibliografia.
1. Arbovírus. 2. Alphavirus. 3. MAYV. 4. Saúde Pública.
5. Investigação Epidemiológica. I. Título.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
III
DEDICATÓRIA
Aos meus pais,
que inúmeras vezes abdicaram da própria felicidade pela minha, que não mediram
esforços para que eu pudesse alcançar todos os meus sonhos, que me ensinaram que
honestidade e integridade de caráter são as principais qualidades de um ser humano, e
que as conquistas da vida se realizam na proporção do esforço dedicado.
A vocês dedico a minha vida!
IV
AGRADECIMENTOS
A Deus Pai, pela vida, compaixão, graça e bondade, pelo amor e amparo nos
momentos de pouca fé, por ser a força que dá vida à minha alma.
Agradeço a minha orientadora, Renata Dezengrini Slhessarenko, por me mostrar
o caminho da ciência, pelos ensinamentos, disponibilidade, colaboração e confiança.
Expresso minha gratidão à minha família: Nelson, Angela e “Nerso”, e ao meu
namorado Guilherme, por acreditarem em mim quando eu mesma não acreditava, pelo
apoio incondicional, compreensão, força, incentivo e suporte financeiro.
Agradeço imensamente às companheiras de jornada Letícia, Belgath e Otacília,
aos amigos bolsistas de iniciação científica Fernanda e Breno, ao colega Fábio, e aos
fiéis amigos Thamires, Josiane, Heron, Lucas e Ruberlei, pelo auxílio nos experimentos,
nas escritas, pelo companheirismo, suporte emocional, por todos os momentos vividos.
A bióloga Liliana V.A. Correia, pelo acolhimento, prontidão e disposição em
nos auxiliar e ao colega Ricardo Heinen pela colaboração com a plotagem dos mapas.
Aos professores Dr. Francisco J.D. Souto, Cór Jésus F. Fontes, Rosane C. Hahn,
Bianca B. Galera, Amilcar S. Damazo, Domingos T.O. Martins e demais professores do
PPGCS pelo auxílio imprescindível à realização deste estudo.
Ao Prof. MSc. Marcelo A. dos Santos, Sumako K. Ueda e equipe do MT-
Laboratório pelas amostras biológicas e acolhimento durante o estágio, em especial a
Ana Elisa Vininski pelos ensinamentos, paciência e disponibilidade.
À Universidade Federal do Mato Grosso e ao Programa de Pós Graduação em
Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina pela formação acadêmica e científica.
Aos Professores Dr. Nikolaos Vasilakis, Maurício L. Nogueira e equipe do
Laboratório de Pesquisas em Virologia da FAMERP São José do Rio Preto, Felipe G.
Naveca e equipe do Instituto Leônidas e Maria Deane (Fiocruz Amazônia), Valéria
Dutra, Luciano Nakazato e equipe do Laboratório de Biologia Molecular da Faculdade
de Medicina Veterinária da UFMT pela colaboração fundamental ao estudo.
À Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT) pela
concessão da bolsa de mestrado e ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio
financeiro.
V
RESUMO
Dissertação de Mestrado
INVESTIGAÇÃO MOLECULAR DE ALFAVÍRUS EM PACIENTES FEBRIS
DURANTE EPIDEMIA DE DENGUE EM MATO GROSSO, BRASIL
AUTORA: NAYARA ZUCHI
ORIENTADORA: RENATA DEZENGRINI SLHESSARENKO
Introdução: O gênero Alphavirus, família Togaviridae, alberga arbovírus de
importância médica relatados em áreas tropicais mundialmente. Nas Américas, os
alfavírus de maior importância compreendem os das encefalites equinas e o vírus
Mayaro (MAYV). No Brasil, o MAYV tem sido relatado em epidemias de doença febril
principalmente no norte do país. O principal objetivo deste estudo foi investigar a
situação epidemiológica de alfavírus em pacientes febris durante epidemia de dengue
em Mato Grosso (MT).
Material e Métodos: Entre 2011 e 2012, 604 amostras de soro de pacientes com
doença febril aguda suspeita de dengue durante epidemia em MT foram submetidas a
Duplex-RT-PCR seguida de Multiplex-semi-nested-PCR para pesquisa dos alfavírus
MAYV, vírus Aura e os vírus das encefalites equinas do Leste, Oeste e Venezuelana.
Amostras positivas foram confirmadas em dois testes independentes e os produtos de
PCR submetidos a sequenciamento nucleotídico. Amostras positivas foram submetidas
a RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) e isolamento viral em cultura de células. Todas as
amostras foram também investigadas para flavivirus em um estudo paralelo.
Resultados: Foram encontrados 15/604 (2,5 %) pacientes positivos para o MAYV em
Cuiabá (9), Várzea Grande (3), Nossa Senhora do Livramento (1) e Sorriso (2). Destes,
12 (80,0 %) apresentaram co-infecções com DENV-4 e 3 (20,0 %) infecções únicas
pelo MAYV. Dentre 13 amostras submetidas a RT-qPCR, 10 (76,9 %) apresentaram
carga viral entre log 0,965-3,321 cópias/µL.
Discussão: Casos esporádicos de infecção pelo MAYV foram identificados durante
uma grande epidemia de dengue no MT em residentes de áreas urbanas, sem histórico
recente de viagem ou visita a áreas rurais e/ou silvestres. A ocorrência do MAYV em
estados adjacentes, em cidades afetadas pela rodovia Cuiabá-Santarém e
soroprevalência em índios Xavantes no estado corroboram a evidência da circulação de
MAYV no MT. Apesar do MAYV ser transmitido principalmente por Haemagogus
janthinomys em áreas silvestres, as evidências encontradas no presente estudo sugerem
a circulação de MAYV em área urbana de MT. Contudo, o ciclo de transmissão do vírus
no estado não foi elucidado. A evidência de circulação do MAYV em indivíduos febris
durante epidemia de dengue em área urbana deve ser motivo de atenção das autoridades
locais de saúde pública para a eventual circulação silenciosa de outros arbovírus no
estado.
Palavras-chave: Arbovírus, alfavírus, MAYV, Saúde Pública, Investigação
Epidemiológica, RT-PCR.
VI
ABSTRACT
Master Thesis
MOLECULAR INVESTIGATION OF ALFAVIRUS IN FEBRILE PATIENTS
DURING A DENGUE OUTBREAK IN MATO GROSSO, BRAZIL
AUTHOR: NAYARA ZUCHI
ADVISOR: RENATA DEZENGRINI SLHESSARENKO
Introduction: The Alphavirus genus, Togaviridae family, comprises arboviruses of
medical importance reported in tropical areas worldwide. In the Americas, the most
important alfaviruses are the equine encephalitis group and Mayaro virus (MAYV). In
Brazil, MAYV has been reported in outbreaks of febrile illness mainly in the North
region of the country. The aim of this study was to investigate the epidemiological
situation of alfaviruses in febrile patients during a dengue outbreak in Mato Grosso
(MT).
Material and methods: Between 2011 and 2012 in MT, 604 serum samples collected
from patients suspected of acute febrile illness were submitted to Duplex-RT-PCR
followed by Multiplex-semi-nested-PCR for MAYV, Aura virus and East, West and
Venezuelan equine encephalitis viruses. Positive samples were confirmed twice in
independent tests and, PCR products were submitted to nucleotide sequencing. Positive
samples were also submitted to Real time RT-PCR (RT-qPCR) and inoculation in cell
culture. The samples were also investigated for flaviviruses in a parallel study.
Amostras positivas foram submetidas a RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) e
isolamento viral em cultura de células. Todas as amostras foram também investigadas
para flavivirus em um estudo paralelo.
Results: 15/604 (2.5 %) patients from Cuiabá (9), Várzea Grande (3), Nossa Senhora
do Livramento (1) and Sorriso (2) were positive for MAYV; 12 (80 %) are co-infected
with DENV-4 and 3 (20 %) are single infections with MAYV. Co-infected patients
presented a wider variety of clinical manifestations. Among 13 samples tested by RT-
qPCR, 10 (76.9 %) presented viral load ranging from log 0,965-3,321 copies/µL.
Discussion: Sporadic infections with MAYV were identified during a massive Dengue
outbreak in MT in residents of urban areas without recent history of travel or visit to
rural or sylvatic areas. The occurrence of MAYV infections in neighboring states,
including cities affected by the Cuiabá-Santarém highway and seroprevalence in
Xavante Indians from MT, corroborate the evidence of MAYV circulation in MT.
Despite MAYV is transmitted mainly by Haemagogus janthinomys in sylvatic areas, the
evidence found in this study suggests the circulation of MAYV in urban areas of MT.
However, the transmission cycle of MAYV in MT remains to be determined. The
evidence of MAYV circulation in febrile individuals during a dengue outbreak in urban
areas should cause concerns in the local public health authorities about the eventual
silent circulation of arboviruses in the state.
Keywords: Arbovírus, Alphavirus, MAYV, Public Health, Epidemiological
Investigation, RT-PCR.
VII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Espécies virais pertencentes ao gênero Alphavirus e seus respectivos
hospedeiros, reservatórios, vetores e área de ocorrência.................................................16
Tabela 2. Iniciadores empregados para detecção de alfavírus no soro de pacientes com
doença febril aguda suspeita de dengue em Mato Grosso, 2011 e 2012.........................38
Tabela 3. Características demográficas e epidemiológicas de pacientes com doença
febril aguda suspeita de dengue que demandaram os serviços de saúde do Mato Grosso
de outubro de 2011 a julho de 2012...........,....................................................................45
Tabela 4. Dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais de 15 pacientes com doença
febril aguda, positivos para os vírus Mayaro e/ou Dengue-4 em Mato Grosso, 2012....49
Tabela 5. Sinais e sintomas mais frequentes entre os pacientes com infecção única pelo
vírus Mayaro ou co-infectados com o vírus da Dengue-4 em Mato Grosso, Brasil........50
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Árvore filogenética do gênero Alphavirus, obtida a partir de sequências
parciais do gene da glicoproteína de envelope E1, demonstrando os complexos
antigênicos e as divergências entre as espécies...............................................................15
Figura 2. Diagrama esquemático do genoma (a) e partícula vírica dos alfavírus (b) com
os genes, proteínas e suas funções indicadas...................................................................18
Figura 3. Expressão gênica dos alfavírus.......................................................................22
Figura 4. Ciclo replicativo intracelular dos alfavírus.....................................................22
Figura 5. Patogenia da infecção por alfavírus em hospedeiros vertebrados...................24
Figura 6. Ciclos de transmissão em área silvestre, rural e urbana do vírus Mayaro e seus
respectivos hospedeiros e vetores na América Latina.....................................................28
Figura 7. Ciclos de transmissão dos vírus das encefalites equinas nas Américas..........30
Figura 8. Fluxograma de atividades para análise de 604 amostras de pacientes com
doença febril aguda suspeita de dengue do estado de Mato Grosso................................35
Figura 9. Distribuição da amostragem de pacientes com doença febril aguda suspeita de
dengue por cidade de Mato Grosso para a investigação de alfavírus..............................43
Figura 10. Pacientes positivos por semi-nested RT-PCR para o vírus Mayaro.............47
Figura 11. Distribuição por município dos pacientes positivos para o vírus Mayaro de
acordo com a cidade de residência em Mato Grosso, Brasil...........................................50
Figura 12. Valores do ciclo limiar da TaqMan RT-PCR em tempo real para o vírus
Mayaro nas amostras de soro de pacientes com doença febril aguda.............................51
IX
LISTA DE ANEXOS
Anexo I. Carta de anuência de participação na pesquisa................................................70
Anexo II. Modelo de ficha de investigação de dengue do Sistema de Informação de
Agravos de Notificação...................................................................................................72
Anexo III. Termo de aprovação ética de projeto de pesquisa........................................75
X
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
µL Microlitro
A Anos
Ae. Aedes
AURAV Vírus Aura
BFV Vírus Barmah Forest
C Proteína de capsídeo
cDNA DNA complementar
CHIKV Vírus Chikungunya
cm³ centímetro³
Cx. Culex
DENV Vírus da Dengue
DEPC Dimetil Pirocarbonato
DNA Ácido Desoxirribonucléico
dNTP Deoxinucleotídeo Trifosfato
DTT Dithiothreitol
E/E1/E2 Proteína do envelope viral (1 e 2)
ECP Efeito Citopático
EDTA Ácido etileno-diamino tetracético
EEEV Vírus da Encefalite Equina do Leste
ELISA Ensaio Imunoenzimático
EUA Estados Unidos da América
EVEV Vírus Everglades
FM Faculdade de Medicina
g Gramas
HCl Ácido Clorídrico
ICC Inoculação em Cultivo Celular
IFI Imunofluorescência Indireta
IFN Interferon
IgA/IgG/IgM Imunoglobulinas A, G e M
IL Interleucina
KCl Cloreto de Potássio
KDa Kilodalton
LB/LT Linfócitos B/ Linfócitos T
M Molar
MAYV Vírus Mayaro
MDPV Vírus Mosso das Pedras
MgCl2 Cloreto de Magnésio
MHC Complexo Maior de Histocompatibilidade
MIDV Vírus Milddelburg
Min Minutos
mL Mililitro
XI
mM milimolar
mRNA RNA mensageiro
MS Mato Grosso do Sul
MT Mato Grosso
MUCV Vírus Mucambo
NDUV Vírus Ndumu
Ng Nanograma
Nm Nanômetros
nsP Proteína não estrutural
ONNV Vírus O’ nyong-nyong
OROV Vírus Oropouche
Pb Pares de Base
pH Potencial Hidrogênico
PIXV Vírus Pixuna
PRNT Teste de Neutralização por Redução de Placas
RNA Ácido Ribonucléico
RNV Vírus Rio Negro
ROCV Vírus Rocio
RRV Vírus Ross River
RT-PCR Transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase
RT-qPCR RT-PCR em tempo real
seg Segundos
SEMA Secretaria de Meio Ambiente
SES Secretaria Estadual de Saúde
SFV Vírus Semliki Forest
SNC Sistema nervoso central
SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificações
SINV Vírus Sindbis
SLEV Vírus da Encefalite de Saint Louis
SP São Paulo
TAE Tris-Acetato-EDTA
TROV Vírus Trocara
U Unidade
UFMT Universidade Federal do Mato Grosso
UNAV Vírus Uma
VEEV Vírus da Encefalite Equina Venezuelana
WEEV Vírus da Encefalite Equina do Oeste
YFV Vírus da Febre Amarela
XII
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................12
1.1Considerações Gerais...........................................................................................12
1.2 Família Togaviridae............................................................................................13
1.2.1 Taxonomia e filogenia dos alfavírus..........................................................13
1.2.2 Estrutura das partículas víricas e do genoma dos alfavírus........................17
1.2.3 Ciclo replicativo viral intracelular dos alfavírus.........................................18
1.2.4 Patogenia das infecções por Alphavirus em humanos................................22
1.2.5 Epidemiologia dos principais alfavírus relatados no Brasil........................25
1.2.6 Métodos laboratoriais empregados no diagnóstico de alfavírus.................31
2. JUSTIFICATIVA......................................................................................................33
3. OBJETIVOS..............................................................................................................34
2.1 Objetivo geral.....................................................................................................34
2.2 Objetivos específicos..........................................................................................34
4. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................35
4.1 Caracterização do local de amostragem.............................................................35
4.2 Tipo de estudo, amostragem e procedimentos éticos.........................................36
4.3 Extração de RNA viral a partir de amostras de soro..........................................36
4.4 Iniciadores..........................................................................................................36
4.5 Controles positivos.............................................................................................38
4.6 Duplex RT-PCR para região dos genes nsP1 de alfavírus e NS5 de flavivírus.38
4.7 Multiplex Semi Nested PCR para região do gene da nsP1 de espécies de
alfavírus....................................................................................................................38
4.8 Semi-Nested PCR single para região do gene da nsP1 do MAYV....................39
4.9 Sequenciamento nucleotídico.............................................................................39
4.10 TaqMan RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) para o MAYV..........................40
4.11 Inoculação em cultivo celular...........................................................................41
4.12 Análise de dados...............................................................................................41
5. RESULTADOS...........................................................................................................42
5.1 Caracterização da amostragem...........................................................................42
5.2 Caracterização dos casos positivos para alfavírus..............................................45
6. DISCUSSÃO...............................................................................................................52
7. CONCLUSÕES...........................................................................................................56
8. REFERÊNCIAS..........................................................................................................57
9. ANEXOS.....................................................................................................................69
13
1. INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Gerais
Os arbovírus (arthropod-borne virus) são em sua maioria zoonóticos, com genoma
RNA, transmitidos por artrópodes hematófagos, classificados principalmente nas famílias
Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Arenaviridae e Rhabdoviridae. Esses
vírus são relatados em áreas tropicais, subtropicais e/ou temperadas do planeta, onde há
circulação de vetores, constituindo-se em importante problema de saúde pública
(FORSHEY et al., 2010; MOURÃO et al., 2012; MORELI & COSTA, 2013).
A habilidade dos arbovírus em causar doenças em humanos depende de fatores
ambientais, inerentes ao vírus, aos hospedeiros, bem como do ciclo epidemiológico. As
mudanças climáticas e antropogênicas mundiais, tais como aumento da densidade
demográfica e migração, além de condições de saneamento precárias, adaptação do vírus
ao vetor e aos hospedeiros por variabilidade genômica e antigênica, têm favorecido a
disseminação e o surgimento de novos isolados, permitindo a dispersão desses agentes na
população. A competência vetorial, melhorada a partir de adaptações genéticas, também
pode expandir as taxas de transmissão, criando novos nichos e expandindo os já existentes
(WEAVER & REISEN, 2010).
A transmissão e manutenção das arboviroses envolvem ciclos zoonóticos silvestres
e urbanos, onde hospedeiros vertebrados que desenvolvem viremia com títulos
suficientemente elevados e/ou reservatórios que amplificam o agente em altos títulos por
longos períodos servem de fonte de vírus para vetores, favorecendo sua manutenção na
natureza. Animais que não desenvolvem viremia em títulos suficientemente elevados para
transmitir a vetores são considerados hospedeiros finais (FIGUEIREDO, 2007;
NATHANSON, 2007; MUÑOZ & NAVARRO, 2012). Em ambos os ciclos, há espécies
de artrópodes hematófagos, vetores biológicos, que se infectam durante o repasto em
animais virêmicos e o transmitem para novos hospedeiros susceptíveis após um período de
incubação extrínseco, compreendido entre a infecção do mosquito e a detecção do agente
em sua glândula salivar (NATHANSON, 2007; DEARDORFF & WEAVER, 2010;
BATISTA et al., 2012). Alguns arbovírus podem ser mantidos na natureza em condições
adversas por transmissão transovariana em mosquitos (PESSANHA et al., 2011).
No Brasil, 95% das espécies de arbovírus que circulam de forma esporádica,
endêmica e/ou epidêmica, como os sorotipos do vírus da Dengue (DENV-1 a 4), o vírus da
14
Febre Amarela (YFV), da Encefalite de Saint Louis, Rocio, Mayaro (MAYV), das
Encefalites Equinas Leste, Oeste e Venezuelana (EEEV, WEEV e VEEV) e Oropouche,
são classificadas em três famílias virais: Flaviviridae (gênero Flavivirus), Bunyaviridae
(gênero Orthobunyavirus) e Togaviridae (gênero Alphavirus) (FIGUEIREDO, 2007;
TERZIAN et al., 2009).
1.2 Família Togaviridae
1.2.1 Taxonomia e filogenia dos alfavírus
Os primeiros registros de doenças por alfavírus datam dos séculos XVIII e XIX no
nordeste dos estados Unidos (EUA) e sudeste da Ásia, quando surtos de encefalite e artrite
acometeram equinos. Em 1831, em Massachusetts, houveram 75 óbitos de equinos, sendo
este o primeiro relato de epizootia por alfavírus (HANSON, 1957; TESH, 1982;
SABATTINI et al., 1985). Na Tabela 1, são apresentadas as principais espécies de vírus
classificadas neste gênero, transmitidas por artrópodes hematófagos que acometem
humanos (Tabela 1).
A taxonomia do gênero Alphavirus era originalmente organizada de acordo com
relações antigênicas determinadas em ensaios sorológicos, suplantados por análises
filogenéticas, resultando na identificação de três clades (Semliki Forest, Sindbis-
Encefalites Equinas e dos vírus aquáticos) e pelo menos 30 espécies classificadas em 10
complexos antigênicos ou sorogrupos: EEE, WEE, VEE, Semliki Forest, Barmah Forest,
Milddelburg, Ndumu, Trocara, dos alfavírus aquáticos e de plantas (POWERS et al., 2001;
ICTV, 2012; NASAR et al., 2012). Espécies de vírus classificadas nos complexos VEEV e
EEEV são monofiléticas, enquanto que grande parte dos vírus que ocorrem no Novo
Mundo pertencentes ao complexo WEEV são descendentes de um ancestral que resultou
em recombinação entre os genes das proteínas de envelope E1 e E2 do Sindbis-like vírus e
os genes restantes do ancestral EEEV-like. De acordo com a distribuição mundial, três
topologias indicam a origem dos alfavírus no Velho e no Novo Mundo, e pelo menos duas
introduções transoceânicas (POWERS et al., 2001; HU et al., 2012; MUÑOZ &
NAVARRO, 2012; NASAR et al., 2012).
Estudos filogenéticos permitem a diferenciação e classificação de arbovírus e de
genótipos existentes. O critério para análise e demarcação de espécies envolve informações
antigênicas, genéticas e ecológicas dos vírus. A construção da árvore filogenética do
gênero Alphavirus (Figura 1) baseia-se na comparação de divergências em sequências
15
parciais ou completas do gene da proteína de envelope E1, responsável pela penetração nas
células hospedeiras. A proteína estrutural mais conservada é a do capsídeo e E1, enquanto
que a E2, responsável pela adsorção, é a mais divergente. As espécies do gênero
Alphavirus apresentam cerca de 60 % de similaridade entre as sequencias de proteínas não-
estruturais e 45 % entre estruturais. Análises de máxima verossimilhança demonstram que
a taxa de substituição de nucleotídeos no genoma varia consideravelmente, não sendo
possível estimar o tempo de geração da diversidade genômica dentre os membros deste
gênero (POWERS et al., 2001; MUÑOZ & NAVARRO, 2012; NASAR et al., 2012).
Figura 1. Árvore filogenética do gênero Alphavirus, com sequências parciais do gene da
glicoproteína de envelope E1, demonstrando os complexos antigênicos e as divergências
entre as espécies. Fonte: POWERS et al., 2001.
16
Tabela 1. Espécies virais pertencentes ao gênero Alphavirus e seus respectivos hospedeiros, reservatórios, vetores e área de ocorrência.
Espécie* Principais hospedeiros
vertebrados
Vetores Doença em humanos Distribuição
AURAV16
Desconhecido Ae. serratus, Cx. (melanoconion) spp.1,4
Não relatada17
América do Sul (Brasil e
Argentina)9
BFV16
Humanos, gambás, cangurus
e outros marsupiais3
Ae. spp. e Cx. spp.18
Doença febril, artrite e
exantema15
Austrália9
CHIKV16
Humanos e primatas9,14
Ae. aegypti, Ae. albopictus14
Doença febril, artralgia,
exantema15
África, Sudeste da Ásia, Filipinas,
Índia e Indonésia9
EEEV16
Aves, roedores silvestres9,
humanos e equinos12
Culiseta melanura, Ae. spp. 9 Doença febril e encefalite
15 Costa Leste dos EUA, Golfo do
México, América Central, Caribe,
costa Norte da América do Sul10
EVEV16
Humanos, cães, roedores 15
Cx. cedecei, Cx. melanoconion10
Doença febril e encefalite15
Flórida10
MAYV16
Humanos, primatas e aves
silvestres2
Haemagogus. jantinomis, Ae. aegypti9 Doença febril, artralgia,
exantema15
América do Sul, Trinidad &
Tobago 9
MDPV16
Morcego16
Artrópodes16
Não reconhecida17
América do Norte, Central e Sul17
MUCV16
Macacos, camundongos16
Artrópodes16
Doença febril, encefalite15
América do Sul, Caribe9
ONNV 16
Humanos7 e primatas
15 **Anopheles gambiae
8 Doença febril, artrite e
exantema15
Leste da África9
PIXV 16
Humanos, roedores, equinos
e outros ungulados15
**Orchlerostatus hastatus oligopistus13
Doença febril, mialgia17
Brasil19
17
RNV ¹6 Humanos
15 Vetor: Cx. (Mel) delpontei. Esp. inf.: Ae.
scapullaris e Cx. mollis16
Doença febril, mialgia17
Argentina9
RRV 16 Humanos e mamíferos
silvestres15
Cx. spp., Ae. vigilax, Ae. normanensis,
Mansonia uniformis, Anopheles amictus 11
Doença febril, artralgia e
exantema15
Austrália e Pacífico Sul9
SFV 16
Humanos, pássaros, equinos
e aves15
Cx. tritaeniorhynchus4
Doença febril e encefalite15
África9
SINV16
Humanos e aves15
Cx. univitattus, Cx. modestus, Culiseta
spp., Mansonia africana4
Doença febril, artralgia,
exantema15
Austrália, África, Norte da Europa,
Oriente Médio e Ilhas do Pacífico9
TROV 16
Não relatado Ae. serratus5
Não relatada América do Sul9
UNAV 16
Humanos, pássaros e
equinos16
Psorophora ferox6
Não reconhecida17
América do Sul, Trinidad &
Tobago9
VEEV16
Humanos, equinos e
Roedores silvestres12
Cx. spp. 12
Doença febril e encefalite14
América do Sul e América do
Norte15
WEEV16
Humanos, aves epequenos
mamíferos12,15
Cx. tarsalis, Ae. melanimon e Ae.
dorsalis9
Doença febril e encefalite15
América do Norte e América do
Sul 9,15
*Abreviaturas: Ae: Aedes, Cx: Culex, AURAV: Vírus Aura, BFV: Vírus Barmah Forest, CHIKV: Vírus Chikungunya, EEEV: Vírus da Encefalite Equina do Leste,
EVEV: Vírus Everglades, MAYV: Vírus Mayaro, MDPV: Vírus Mosso das Pedras, MUCV: Vírus Mucambo, ONNV: Vírus O’nyong-nyong, PIXV: Vírus Pixuna,
RNV: Vírus Rio Negro, RRV: Vírus Ross River, SFV: Vírus Semliki Forest, SINV: Vírus Sindbis, TROV: Vírus Trocara, UNAV: Vírus Una, VEEV: Vírus da Encefalite
Equina Venezuelana e WEEV: Vírus da Encefalite Equina do Oeste. **Infecção natural. Referências: ¹RÜMENAPF et al., 1995; ²VASCONCELOS et al., 1998; ³BOYD
et al., 2001; 4POWERS et al., 2001;
5TRAVASSOS DA ROSA et al., 2001;
6DIAZ et al., 2003;
7PASTORINO et al., 2005;
8VANLANDINGHAM et al., 2006;
9GRIFFIN, 2007;
10WILLIAMS & SAVAGE, 2009;
11CDC, 2010;
12PFEFFER & DOBLER, 2010;
13PISANO et al., 2010;
14BOURJOT et al., 2012;
15FLORES, 2012;
16ICTV , 2012;
17WEAVER et al., 2012;
18NAISH et al., 2013;
19PETTERSON et al., 2013.
18
1.2.2 Estrutura das partículas virais e do genoma dos alfavírus
Os vírus do gênero Alphavirus, antigamente denominados arbovírus do grupo A,
apresentam uma fita simples de RNA (Figura 2a) polaridade positiva com 11,8 Kb. O
genoma apresenta CAP 5’ e poli(A) 3’, regiões não traduzidas nas extremidades e oito
genes, que codificam quatro proteínas não-estruturais traduzidas diretamente da ORF
(Open Reading Frame), ocupando dois terços da região próxima à extremidade 5’ do RNA
genômico (42S). O genoma apresenta também cinco proteínas estruturais próximas à
extremidade 3’, expressas a partir RNA mensageiro (RNAm) subgenômico (26S) (KUHN,
2007; HU et al., 2012; VANEY et al., 2013).
O genoma é envolto por um capsídeo de simetria icosaédrica T=4, formado por 240
unidades da proteína C, e envolto pelo envelope lipídico, derivado da membrana
plasmática da célula hospedeira, onde estão inseridos 80 peplômeros formados por três
heterodímeros das glicoproteínas E1 e E2, além da glicoproteína E3 e da proteína
transmembrana 6K (Figura 2b). As partículas virais têm 60 – 70 nm de diâmetro,
densidade de 1.22 g/cm³ e massa molecular de 52 x 106 (KUHN, 2007; FLORES, 2012;
MUÑOZ & NAVARRO, 2012).
Figura 2. Diagrama esquemático do genoma (a) e partícula vírica dos alfavírus (b)
com os genes, proteínas e suas funções indicadas. Fonte: Adaptado de WEAVER &
BARRETT, 2004.
Para o MAYV, dois genótipos têm sido identificados, o L e o D. O genótipo L é
encontrado exclusivamente no Brasil (Pará) com divergência entre estirpes de 0,1 a 0,3 %.
O genótipo D circula na Pan-Amazônia, representado por estirpes isoladas em Trinidad &
Tobago, Peru, Guiana Francesa, Suriname, Brasil e Bolívia, possuindo diversidade entre
19
0,05 a 9 %. (POWERS et al., 2001; MUÑOZ & NAVARRO, 2012).
Para o VEEV, existem seis subtipos: I, II, III, IV, V, VI e diversas variantes de
subtipos A, B, C, D, E e F, agrupados no complexo VEEV. O subtipo I possui as variantes
A, B e C, responsáveis por epidemias e epizootias envolvendo humanos e equinos. Os
subtipos II a VI e subtipo I das variantes D, E e F são enzoóticos, neurovirulentos para
equinos e capazes de causar encefalites fatais em humanos apesar da incapacidade de gerar
títulos virêmicos suficientes para infectar vetores (JOHNSON et al., 1968; DEARDORFF
& WEAVER, 2010; KENNEY et al., 2012; RÜLKER et al., 2012). Quanto à
epidemiologia, o subtipo IAB ocorre nas Américas, o IC na América do Sul, o ID nas
Américas Central e do Sul e o subtipo IF no Brasil. O subtipo II circula no Sul da Flórida e
o III na América do Norte e Sul. Os subtipos IV, V e VI circulam no Brasil, Guiana
Francesa e Argentina respectivamente (OBERSTE et al., 1998; AGUILAR et al., 2004;
KENNEY et al., 2012; RÜLKER et al., 2012).
O EEEV é também classificado no grupo dos vírus das encefalites equinas, possui
variantes antigênicas da América do Norte e Sul, sendo relacionado, ao VEEV e WEEV.
Para o EEEV são descritas as linhagens I, II, III e IV. O subtipo I (AN EEEV) compreende
as estirpes circulantes na América do Norte e Caribe, capazes de causar doenças em
humanos, equinos e outros animais como cães e suínos, estes últimos, considerados
hospedeiros finais. As linhagens II a IV (AS EEEV) ocorrem na América do Sul
associadas a doença em equinos (DE SOUZA LOPES & SACCHETTA, 1974; DIETZ et
al., 1980; ARRIGO et al., 2010; ENCHENG et al., 2013).
O WEEV, outro membro do grupo dos vírus das encefalites equinas, possui 84 %
de homologia com o EEEV, é classificado no complexo antigênico do vírus Sindbis
(SINV) e apresenta variantes antigênicas distribuídas na América do Sul, Caribe e América
do Norte (CALISHER et al., 1988; WEAVER et al., 1997; FLORES, 2012).
1.2.3 Ciclo replicativo viral intracelular dos alfavírus
Os alfavírus infectam uma ampla gama de hospedeiros, além de diversos tipos
celulares in vitro e in vivo. Isso se deve às proteínas de ligação virais (VAPS), que
possuem sítios para adsorção à diferentes receptores celulares, ou ainda utilizam apenas
um receptor conservado entre as espécies infectadas. Alternativamente, é possível que os
alfavírus se associem não especificamente à co-receptores antes da ligação específica ao
receptor, utilizando combinações de receptores e co-receptores para definir o tropismo e a
20
gama de hospedeiros (KONONCHIK et al., 2011; FLORES, 2012; SNYDER et al., 2013;
VANEY et al., 2013).
Dentre os receptores utilizados pelos alfavírus estão as moléculas do complexo
maior de histocompatibilidade I (MHC-I), o receptor de alta afinidade da laminina, sulfato
de heparina, receptores α1β1 de integrina e colágeno (VLA-1, CD49a/CD29), lecitinas
tipo-C, proteínas de resistência natural do macrófago Heat Shock 70 e uma proteína não
identificada associada à células nervosas de 110 KDa (KONONCHIK et al., 2011;
GARDNER et al., 2011; GAY et al., 2012; TANG, 2012). Os vírus Semliki Forest (SFV),
SINV, EEEV, VEEV e WEEV infectam células de Langerhans, dendríticas, linfóides,
macrófagos, musculares esqueléticas, possuindo maior importância em neurônios e células
da glia (FAZAKERLEY et al., 2006; TANG, 2012; LONG et al., 2013). Os vírus
O’nyong-nyong (ONNV), Chikungunya (CHIKV), Ross River (RRV), MAYV e SINV
possuem tropismo por células epiteliais, dendríticas, Langerhans, linfóides, macrófagos,
musculares esqueléticas, além de ósseas e sinoviais, causando artrite e artralgia
(MORRISON et al., 2006; HERRERO et al., 2011). In vitro, membros deste gênero
infectam células de Aedes albopictus C6/36, BHK-21 (baby hamster kidney cells), Vero
(African green monkey kidney), HeLa (câncer cervical humano) e cultivos primários de
embriões de galinhas (HERRERO et al., 2011; KONONCHIK et al., 2011; GAY et al.,
2012; TANG, 2012).
A glicoproteína E2 é responsável pela adsorção ao receptor e a E1 pela fusão com a
membrana. Após a ligação, ocorre penetração na célula por três mecanismos: fusão na
superfície celular, introdução do genoma viral por poros na membrana e, a forma mais
frequente, endocitose mediada por clatrina, processo pH dependente que desencadeia
alterações conformacionais em E1-E2, dissociando-as e expondo o domínio de fusão distal
da E1, promovendo a fusão entre o envelope e a membrana da vesícula endocítica, e a
consequente liberação do nucleocapsídeo no citoplasma da célula hospedeira
(SCHLESINGER & SCHLESINGER, 2007; KUHN, 2007; SHERMAN & WEAVER,
2010; KONONCHIK et al., 2011; MUÑOZ & NAVARRO, 2012; VANEY et al., 2013).
Em células de insetos, o desnudamento viral ocorre por mecanismo independente de pH
(FLORES, 2012).
Após o desnudamento, inicia a expressão gênica, pelo reconhecimento do CAP e do
códon iniciador 5’-AUG por ribossomos celulares, culminando com a tradução de dois
terços proximais da extremidade 5’ do RNA genômico, formando a poliproteína não-
21
estrutural (nsP-1 nsP-2, nsP-3 e nsP-4), responsáveis pela replicação e transcrição do RNA
(SCHLESINGER & SCHLESINGER, 2007; MUÑOZ & NAVARRO, 2012; FOY et al.,
2013). A associação da nsP123 com a nsP4, que possui atividade de RNA polimerase
dependente de RNA (RNApoldepRNA), origina o complexo replicase. Alternativamente,
uma poliproteína completa P1234 pode ser produzida e clivada pela protease nsP2,
gerando o complexo P123 + nsP4, seguido do processamento em nsP1, nsP23 e nsP4, e por
fim nas quatro nsPs individualizadas. O complexo replicase possui, tardiamente, função de
transcriptase, produzindo um RNA mensageiro subgenômico (mRNAsg) além de RNA
genômico a partir do RNA antigenomico (SCHLESINGER & SCHLESINGER, 2007;
LULLA et al., 2012; SREEJITH et al., 2012; FOY et al., 2013).
A nsP1 possui função de metiltransferase e guaniltransferase, catalizando a reação
de formação do Cap na extremidade 5’ do RNA viral, necessário para a síntese de fitas de
RNA antigênomicas (-RNA), e modular a atividade da protease nsP2 (STRAUSS &
STRAUSS, 1994; KUHN, 2007; LULLA et al., 2012; FOY et al., 2013). A nsP2 também
exerce funções de NTPase, RTPase, helicase, proteinase e atua na iniciação da transcrição
do segmento 26S do mRNA subgenômico (STRAUSS & STRAUSS, 1994; SREEJITH et
al., 2012; FOY et al., 2013). A função da nsP3 ainda não é completamente elucidada,
porém, sabe-se que esta possui dois domínios (N e C terminal) com funções distintas na
síntese de RNA (STRAUSS & STRAUSS, 1994; LULLA et al., 2012; SREEJITH et al.,
2012; FOY et al., 2013).
Os genes que codificam as proteínas estruturais são expressos a partir da tradução
do mRNAsg derivado do terço proximal da extremidade 3’ do RNA antigenômico,
resultando em uma poliproteína que é clivada em cinco proteínas estruturais: C – PE2 (E3
+ E2) – 6K – E1 (Figura 3) (SCHLESINGER & SCHLESINGER, 2007; FLORES, 2012;
MUÑOZ & NAVARRO, 2012; FOY et al., 2013).
A proteína C é liberada por autoproteólise, pela formação de uma estrutura
secundária (hairpin) na sua porção C-terminal (SCHLESINGER & SCHLESINGER,
2007; KUHN, 2007; SNYDER et al., 2013; VANEY et al., 2013). O domínio situado na
porção N-terminal da proteína C do RNA genômico, possui o sinal de empacotamento
(SCHLESINGER & SCHLESINGER, 2007; VANEY et al., 2013). A proteína E3
desempenha função de peptídeo guia, fornecendo sequencias sinais para que a
glicoproteína E2 seja clivada no complexo de Golgi. Da mesma maneira, o polipeptídeo
6K possui função guia, fornecendo sequências sinais para E1, facilitando o brotamento das
22
partículas virais e a infectividade (POWERS et al., 2001; KUHN, 2007; NASAR et al.,
2012; ENCHENG et al., 2013). O egresso das novas partículas brota na membrana
plasmática, após interações entre o nucleocapsídeo pré-formado (porção hidrofóbica das
120 subunidades da proteína C) e uma porção citoplasmática C–terminal conservada (Tyr–
Ala–Leu) das glicoproteínas E2 ancoradas na membrana plasmática, levando à liberação da
partícula viral para o meio extracelular (Figura 4) (KUHN, 2007; MOURÃO et al., 2012;
SNYDER et al., 2013).
Figura 3. Expressão gênica dos alfavírus. Fonte: FLORES, 2012.
Figura 4. Ciclo replicativo intracelular dos alfavírus. 1. adsorção; 2. endocitose
mediada por clatrina e desnudamento; 3. tradução e processamento da poliproteína não-
23
estrutural; 4. transcrição de RNAm subgenômico e replicação do RNA; 5. maturação das
proteínas estruturais no complexo de Golgi e retículo endoplasmático, formação do
nucleocapsídeo; 6. brotamento das partículas virais. Fonte: adaptado de KUHN, 2007.
1.2.4 Patogenia das infecções por alfavírus em humanos
A infecção por alfavírus em vertebrados acontece durante o repasto sanguíneo de
vetores infectados, através da inoculação de saliva contendo partículas virais durante a
hematofagia. Após a inoculação viral no meio extracelular, o sítio inicial de replicação
viral são as células dendríticas e de Langerhans, que transportam as partículas virais aos
linfonodos regionais, de onde estas se disseminam via circulação sanguínea a outros órgãos
e tecidos (Figura 5) (TESH et al., 1999; GRIFFIN, 2007; MUÑOZ & NAVARRO, 2012;
LONG et al., 2013). Após a infecção viral, fatores como a susceptibilidade do hospedeiro,
replicação eficiente nos sítios primários, disseminação e imunidade determinam a
intensidade da viremia e a gravidade da doença. Além destes, a habilidade de atingir os
órgãos-alvo depende da duração da infecção, dos títulos virêmicos e da invasivisidade e
virulência do isolado (MORRISON et al., 2006; GRIFFIN, 2007; MUÑOZ & NAVARRO,
2012).
Os sinais clínicos e sintomas das doenças por alfavírus são semelhantes às demais
arboviroses, consistindo em hipertermia, calafrios, mal estar, mialgia, exantemas e artralgia
para o MAYV, CHIKV, SINV, ONNV e o vírus Barmah Forest (BFV), podendo evoluir
para encefalite com cefaleia grave, êmese, irritabilidade, tremor, confusão mental,
fotofobia, inquietação, convulsões, coma e com frequência entre 0,5 % e 35 %, sinais de
meningite como rigidez de nuca e paralisia de nervos craniais nas infecções por EEEV,
VEEV e WEEV. (SCHMALJOHN & MCCLAIN, 1996; MUÑOZ & NAVARRO, 2012;
PERNG & CHEN, 2013). Para os sobreviventes, as sequelas da encefalite podem ser
progressivas e perdurar por toda a vida, decorrentes de meningoencefalite difusa, vasculite
e degeneração neuronal. Células inflamatórias são frequentemente encontradas depositadas
nos neurônios infectados (SCHMALJOHN & MCCLAIN, 1996; GRIFFIN, 2007;
BOURJOT et al., 2012; PERNG & CHEN, 2013).
A febre causada pelo MAYV é uma doença aguda auto-limitante (3-5 dias),
caracterizada por dor epigástrica, êmese, diarreia, cefaleia frontal, artralgia intensa,
mialgia, calafrios, exantema máculo-papular, náuseas, vertigens e fotofobia. A artralgia é o
sintoma clínico mais marcante nas infecções por alfavírus, pode permanecer por semanas e
24
afeta grandes e pequenas articulações (TESH et al., 1999; ABAD-FRANCH et al., 2012;
MOURÃO et al., 2012; MUÑOZ & NAVARRO, 2012). Apesar da viremia do MAYV ser
geralmente transiente e em títulos menores em relação ao DENV, é comum a confusão da
forma febril entre essas arboviroses (TESH et al., 1999; COIMBRA et al., 2007;
WEAVER & REISEN, 2010; MUÑOZ & NAVARRO, 2012).
Figura 5. Patogenia da infecção por alfavírus após inoculação durante o repasto sanguíneo
do vetor em hospedeiro vertebrado, órgãos que podem ser acometidos e doenças passíveis
de serem desenvolvidas. Fonte: adaptado de GRIFFIN, 2007.
O VEEV é um dos mais frequentes causadores de encefalite dentre os Alphavirus,
produzindo doença febril aguda acompanhada de hipertermia, calafrios, mal estar, diarreia,
cefaleia intensa e, em casos mais graves, encefalite após período de incubação de dois a
seis dias em humanos e equinos (SCHMALJOHN & MCCLAIN, 1996; AGUILAR et al.,
2004; FOY et al., 2013). Os sintomas da encefalite incluem letargia, sonolência, rigidez de
nuca, confusão mental, convulsões, ataxia, paralisia e coma, geralmente sem sequelas entre
os sobreviventes. Pouco mais de 4 % das crianças e 0,5 a 3 % dos adultos infectados
desenvolvem encefalite, com taxa de mortalidade que pode ser superior a 35 % em
crianças e 10 % em adultos dependendo do subtipo (SCHMALJOHN & MCCLAIN, 1996;
CFSPH, 2008; KENNEY et al., 2012; FOY et al., 2013). Nas últimas décadas,
epizootias/epidemias associadas ao VEEV têm vitimado milhares de equinos e humanos
nas Américas, em contraste com o EEEV e WEEV, que possuem importância
predominantemente nos EUA (CFSPH, 2008; FORSHEY et al., 2010; RÜLKER et al.,
2012; ENCHENG et al., 2013).
A infecção pelo EEEV em humanos é frequentemente grave e resulta em viremia,
25
sinais e sintomas que persistem por três a 15 dias, caracterizados por hipertermia, êmese,
cefaleia severa, letargia e mal estar. As células mais acometidas são os neurônios,
produzindo encefalite com grau de morbimortalidade em equinos e humanos de 30-70 %,
devido à necrose neuronal, infiltração das meninges, neuronofagia e hemorragia cerebral.
Os sintomas são caracterizados por depressão ou hiperexcitabilidade, paralisia progressiva,
hipertermia severa, coma, podendo evoluir para morte em cinco a 15 dias após a infecção.
Crianças e idosos são mais susceptíveis e, sequelas neurológicas debilitantes ocorrem em
50 % dos sobreviventes (SILVA et al., 2011; ARMSTRONG & ANDREADIS, 2013;
ENCHENG et al., 2013).
A incidência do WEEV é variável. Após período de incubação de três a cinco dias,
observa-se sinais e sintomas como hipertermia, náuseas, cefaleia, inquietação, tremores,
irritabilidade e, nos casos de encefalite, rigidez de nuca, fotofobia, convulsões, confusão
mental, coma e óbito. A taxa de mortalidade da encefalite em adultos é de 3 %, 10 % em
idosos e, sintomatologia é mais grave em crianças, bem como as sequelas são frequentes
(GRIFFIN, 2007; CFSPH, 2008; SHERMAN & WEAVER, 2010; MOSSEL et al., 2013).
Durante a fase aguda das infecções por alfavírus, há a indução de citocinas como
Interferon tipo I (IFN-α e IFN-β), Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α) e Interleucinas 1 e
6 (IL-1 e IL-6), de acordo com o nível da replicação viral. O IFN limita a replicação viral
na fase aguda, aumentando a taxa de sobrevivência neuronal em encefalites (GRIFFIN,
2007; RODRIGUEZ-ANDRES et al., 2012; FARMER et al., 2013).
Após a infecção das células de Langerhans, há um aumento na expressão de
complexo maior de histocompatibilidade (MHC-II) e moléculas co-estimulatórias, que
levam à ativação de células T-naive. Linfocitos T CD8+ diminuem os níveis de RNA viral
no Sistema Nervoso Central (SNC), depurando macrófagos infectados. Nas encefalites, o
processo inflamatório mononuclear é caracterizado pela infiltração de células NK,
linfócitos T CD4+, T CD8+, B e macrófagos (ELVIN et al., 2002; GRIFFIN, 2007;
METCALF & GRIFFIN, 2011; RAINEY-BARGER et al., 2013). Epítopos das
glicoproteínas E1 e E2 constituem-se nos principais indutores da secreção de IgM e IgA.
IgM pode ser detectada três a cinco dias após a infecção, IgG sete a 14 dias após e se
mantém por anos. O desenvolvimento de imunidade adquirida coincide com o término da
viremia quando o sistema complemento e os anticorpos neutralizantes que neutralizam as
partículas virais, diminuem a replicação viral intracelular levando a depuração de
imunocomplexos no sistema reticuloendotelial (GRIFFIN, 2007; METCALF & GRIFFIN,
26
2011; FLORES, 2012). A depuração viral no SNC é mediada por imunoglobulinas, uma
vez que a expressão limitada de moléculas MHC-I restringe a ação de linfócitos T CD8+
(GRIFFIN, 2007; METCALF & GRIFFIN, 2011; FARMER et al., 2013; RAINEY-
BARGER et al., 2013).
1.2.5 Epidemiologia dos principais alfavírus relatados no Brasil
Os mosquitos se infectam com os alfavírus durante o repasto sanguíneo em
hospedeiros com viremia suficientemente elevada para infectar os vetores. As partículas
virais infectam células epiteliais do intestino médio do mosquito, atravessam a lâmina
basal, alcançam a hemolinfa e, desta, as glândulas salivares, estabelecendo infecção
persistente. Após período de incubação extrínseco, os mosquitos secretam as partículas
virais juntamente com a saliva na circulação sanguínea dos hospedeiros susceptíveis
(OVIEDO et al., 2011; MUÑOZ & NAVARRO, 2012; LE COUPANEC et al., 2013).
O principal vetor do MAYV em meio silvestre é o Haemagogus janthinomys,
mantendo o ciclo enzoótico em períodos interepidêmicos (Figura 6). Esse vírus também
pode infectar naturalmente espécies de Psorophora e Mansonia, porém sua competência
vetorial não é comprovada, podendo ser transmitido por Cx. e Ae. spp. experimentalmente
(AITKEN et al., 1960; AITKEN et al., 1969; GALINDO et al., 1966; GALINDO &
SRIHONGSE, 1967; MITCHELL, 1991; SMITH & FRANCY, 1991; ABAD-FRANCH et
al., 2012). Primatas e aves silvestres se constituem em hospedeiros amplificadores primário
e secundário, respectivamente. Acredita-se que o homem pode desenvolver viremia
suficientemente elevada para servir de fonte de infecção a Ae. aegypti, Ae. albopictus e Ae.
scapularis (Figura 6) (VASCONCELOS et al., 1998; FORSHEY et al., 2010; LONG et al.,
2011; MOURÃO et al., 2012; MUÑOZ & NAVARRO, 2012). Aves silvestres migratórias
desempenham papel importante na dispersão do MAYV por percorrer longas distâncias em
curto período de tempo (VASCONCELOS et al., 1998).
O MAYV foi isolado pela primeira vez em 1954 no sangue de cinco trabalhadores
rurais em Trinidad & Tobago (ANDERSON et al., 1957). Soroprevalência tem sido
relatada em países da América Central como Panamá, Guatemala e Costa Rica e em
epidemias na América do Sul (ANDERSON et al., 1957; KARABATSOS, 1985;
METSELAAR, 1966; PINHEIRO et al., 1981; TALARMIN et al., 1998; COIMBRA et al.,
2007; MOURÃO et al., 2012; MUÑOZ & NAVARRO, 2012). Este vírus já foi isolado de
27
humanos, animais silvestres e mosquitos e há relatos de doença febril aguda com sorologia
positiva na América do Sul na Colômbia, Venezuela, Suriname, Peru, Guiana Francesa,
Brasil, Equador, Paraguai e Bolívia, sendo observados surtos esporádicos na Pan
Amazônia desde a sua descoberta, contudo dados disponíveis são escassos (TALARMIN et
al., 1998; TESH et al., 1999; TORRES et al., 2004; FORSHEY et al., 2010; MUÑOZ &
NAVARRO, 2012).
No Brasil, o MAYV é endêmico nos estados do Norte e Centro Oeste
principalmente região Amazônica, com soroprevalência de 2-40,9 % (CAUSEY et al.,
1958; COIMBRA et al., 2007; ABAD-FRANCH et al., 2012; MOURÃO et al., 2012;
MUÑOZ & NAVARRO, 2012). A primeira epidemia no Brasil ocorreu em 1955 no Pará
em cerca de 100 trabalhadores de uma pedreira próxima ao rio Guamá. Outras três
epidemias, em comunidade rural de Belterra em 1978 e nas cidades de Conceição do
Araguaia em 1981 e Benevides em 1991 ocorreram também no Pará, além de Itaruma em
Goiás em 1987 com soroprevalência de 16 % em 1991 e em Peixe no Tocantins
(PINHEIRO et al., 1981; VASCONCELOS et al., 1998; TESH et al., 1999). No Mato
Grosso (MT) foi relatada a detecção de anticorpos para MAYV em índios Xavantes em
1968 (NEEL et al., 1968). Ainda na região Centro Oeste, três homens residentes em São
Paulo se infectaram por MAYV em Camapuã, Mato Grosso do Sul (MS) (COIMBRA et
al., 2007). Um caso alóctone foi reportado na França em paciente com histórico de viagem
recente à Amazônia brasileira (RECEVEUR et al., 2010). Anticorpos neutralizantes para
MAYV foram detectados em equinos no Pantanal do MS (PAUVOLID-CORRÊA et al.,
2013b). Evidências epidemiológicas sugerem que a soroprevalência é maior em moradores
de áreas rurais e/ou silvestres, onde ocorre o ciclo silvestre (TALARMIN et al., 1998;
ABAD-FRANCH et al., 2012; MUÑOZ & NAVARRO, 2012). No entanto, casos de
doença febril por MAYV têm sido relatados em residentes de áreas urbanas de Manaus
(ABAD-FRANCH et al., 2012; MOURÃO et al., 2012). Apesar de relatos de elevada
soroprevalência no Brasil, o isolamento do vírus é dificultado pela viremia transiente em
baixos títulos (COIMBRA et al., 2007; MUÑOZ & NAVARRO, 2012).
28
Figura 6. Ciclos de transmissão em área silvestre, rural e urbana do vírus Mayaro e seus
respectivos hospedeiros e vetores na América Latina. Fonte: MUÑOZ & NAVARRO,
2012.
Estirpes silvestres do VEEV circulam entre vetores Cx. (melanoconion) spp., e
roedores silvestres (Oryzomys, Proechimys, Sigmodon, Peromyscus, Heteromys,
Zygodntomys) nas Américas. A maioria das epidemias e epizootias ocorre esporadicamente
quando os subtipos IAB e IC são transmitidos à humanos e equinos por vetores
secundários competentes Ae. spp., Psorophora spp., Anopheles spp., Cx. spp. e
Orchlerotatus taeniorhynchus, que possuem hábitos peridomésticos e agrícolas (Figura 7).
Os subtipos enzoóticos ID e IE são menos frequentes, causando viremia e doença branda
em equinos. No entanto uma única mutação no aminoácido 213 da glicoproteína E2
(T213R) permite que estirpes destes subtipos produzam viremia suficientemente elevada
em equinos para que vetores secundários se contaminem e o transmitam à hospedeiros
susceptíveis. Os meios rurais e silvestres são áreas de risco e, a proximidade de humanos
susceptíveis a equinos infectados pode acarretar epidemias (ANISHCHENKO et al., 2006;
CFSPH, 2008; DEARDORFF & WEAVER, 2010; PFEFFER & DOBLER, 2010;
KENNEY et al., 2012; RÜLKER et al., 2012).
O VEEV afeta humanos e equinos na América Latina desde 1920 (VELASQUEZ,
1939; CASALS et al., 1943). A primeira grande epidemia/epizootia documentada ocorreu
na Colômbia e na região Guajira, Venezuela em 1936 e, a partir de então, surtos ocorreram
periodicamente até 1973 (BECK & WYCKOFF, 1938; VELASQUEZ, 1939; WEAVER et
al., 1996). No final da década de 60, o VEEV causou epizootias equinas e epidemias ao
longo da costa do oceano Pacifico, Colômbia, Venezuela, Peru, Trinidad & Tobago,
29
Equador e em países da América Central, disseminando-se pelo México até o Texas
(KUBES & RÍOS, 1939; LORD, 1974; WEAVER et al., 1996). Nesta mesma época, o
subtipo I, variedade ID do VEEV foi isolado em mosquitos e hamsters sentinelas em
Iquitos, Peru, detectando-se sorologia em humanos e equinos em Pucallpa, Iquitos e
Yurimaguas, Peru (MADALENGOITIA et al., 1973; SCHERER et al., 1975; SCHERER
et al., 1979). O subtipo IE foi isolado em Veracruz, México, em 1963, em hamsters
sentinelas e pool de mosquitos e o subtipo ID foi associado com doença febril aguda em
militares em Pantoja, Peru (OBERSTE et al., 1998; WATTS et al., 1998). Esse vírus é
endêmico na Colômbia e Venezuela, onde em 1995 foi relatada uma das maiores
epidemias com mais de 100 mil casos e aproximadamente 300 casos fatais (WEAVER et
al., 1996). No Brasil, em 1982, a variante IF foi isolada no Vale do Ribeira, São Paulo em
Cx. Melanoconion e em morcegos Carollia perspicilatta (CALISHER et al., 1982). Na
Amazônia brasileira, os subtipos III e IV foram isolados de macacos Cebus e Anopheles
ninbus (VASCONCELOS et al., 1991). Há relatos de evidências sorológicas em humanos
em Iguape, São Paulo e no Paraná (RICHARTZ, 1994; VASCONCELOS et al., 1998;
PFEFFER & DOBLER, 2010) e em cavalos do Pantanal de MT e MS (PAUVOLID-
CORRÊA et al., 2013c; MELO et al., 2012).
O EEEV produz distúrbios neurológicos em humanos e equinos nas Américas,
sendo mantido na natureza em ciclos silvestres envolvendo Culiseta melanura e aves como
hospedeiros primários, roedores secundários, que vivem principalmente em pântanos na
América do Norte. Espécies de Ae., Cx. e Coquilletidea perturbans são vetores
secundários, ampliando a gama de hospedeiros pelos hábitos de hematofagia promíscua
(Figura 7) (CFSPH, 2008; ARRIGO et al., 2010; ESTEP et al., 2013). Estudos recentes
indicam que répteis e anfíbios possam ser hospedeiros (GRAHAM et al., 2012).
O EEEV foi isolado em 1933 em encéfalo de equinos em New Jersey e Virginia,
EUA (TEM & MERRILL, 1933). Em 1938, foi relatado o primeiro surto em crianças com
encefalite com aproximadamente 30 óbitos, em área rural, seguidos de diversas epidemias
no país com casos fatais (WEBSTER & WRIGHT, 1938). O vírus distribui-se do Canadá
ao Norte da Argentina e, na América do Sul três linhagens (II, III e IV) têm sido descritas.
No Brasil, foi isolado em eqüinos em São Paulo, Rio de Janeiro, Bahia, Pernambuco e
Minas Gerais e em aves na Amazônia (BRUNO-LOBO et al., 1961; WIGG, 1977;
BRAULT et al., 1999; FIGUEIREDO, 2007; WEAVER et al., 2012; CAMPOS et al.,
2013). Sorologia positiva é relatada em humanos e aves no Vale do Ribeira, SP, em
30
equinos do Pantanal e de quatro cidades do Paraná e em aves na Mata Atlântica, SP
(BRUNO-LOBO et al., 1961; IVERSSON et al., 1981; IVERSSON et al., 1993;
FERNÁNDEZ et al., 2000; PAUVOLID-CORRÊA et al., 2010; MELO et al., 2012). Em
Itapetininga, SP, foi isolado de equinos e roedores Oryzomys spp. e sorologia foi detectada
em aves residentes e migratórias (VASCONCELOS et al., 1998). Surtos em equinos foram
relatados também em Pernambuco, Ceará e Paraíba em 2008 e 2009 com mortalidade de
72,9 % e na Ilha de Marajó, Pará (SILVA et al., 2011; CAMPOS et al., 2013). Não há
relatos de surtos em humanos no Brasil.
Com relação ao WEEV, o ciclo de transmissão envolve aves domésticas e
silvestres, que são hospedeiros amplificadores e Cx. tarsalis como vetores. Outros como
Ae. melanimon, Ae. dorsalis e Ae. campestris são vetores secundários e transmitem o
WEEV a humanos e equinos, que são hospedeiros finais (Figura 7). O WEEV também
circula entre mosquitos Ae. melanimon e coelhos Lepus califomicus. A transmissão vertical
em vetores pode ser responsável pela manutenção do vírus durante períodos
interepidêmicos (inverno) em regiões temperadas da América do Norte, onde a transmissão
horizontal é sazonal (FULHORST et al., 1994; CFSPH, 2008; MOSSEL et al., 2013;
PHILLIPS et al., 2013).
O primeiro alfavírus isolado foi o WEEV nos EUA em 1930, a partir do SNC de
dois equinos e, em 1938 de uma criança com encefalite fatal (MEYER et al., 1931).
Encontra-se disseminado nos EUA e Canadá, é descrito no México em epizootias em
equinos e em epidemias em humanos (KARABATSOS, 1978; WEAVER et al., 1997). Na
América do Sul, epizootias já foram descritas na Argentina, Equador, Uruguai e Brasil e,
inquéritos sorológicos demonstram baixa prevalência em humanos (PFEFFER &
DOBLER, 2010; ZACKS & PAESSLER, 2010). No Brasil, a circulação foi relatada em
1960 com evidência sorológica de 22,6 % de prevalência em humanos e 11,4 % em
equinos no RJ (BRUNO-LOBO et al., 1961). Evidências sorológicas já foram descritas em
equinos de diversas cidades do Paraná, na região da Nhecolândia no Pantanal do MS, em
espécies de aves na Amazônia brasileira e de Itapetininga, SP (VASCONCELOS et al.,
1991, 1998; IVERSSON et al., 1993; RICHARTZ, 1994; PAUVOLID-CORRÊA, 2008;
2010).
O vírus Aura (AURAV) foi isolado no Brasil em 1959 em mosquitos Cx. spp. nas
proximidades do rio Aura. Este vírus já foi isolado também em Ae. serratus no Brasil e
norte da Argentina. O AURAV é sorologicamente derivado da recombinação de SINV e
31
WEEV, ainda não há relatos em humanos (CAUSEY et al., 1963; RÜMENAPF et al.,
1995).
Figura 7. Ciclos de transmissão dos vírus das encefalites equinas do Leste (EEEV), Oeste
(WEEV) e Venezuelana (VEEV) e seus respectivos hospedeiros e vetores nas Américas.
Fonte: adaptado de PFEFFER & DOBLER, 2010.
1.2.6 Métodos laboratoriais empregados no diagnóstico de Alphavirus
O diagnóstico das infecções por alfavírus pode ser realizado por Inoculação em
Cultivo Celular (ICC), técnicas sorológicas como Imunofluorescência Indireta (IFI), ensaio
imunoenzimático (ELISA), neutralização por redução de placas (PRNT) e, técnicas
moleculares como reação em cadeia de polimerase (PCR), Loop Mediated Isothermal
Amplification (LAMP) e PCR em tempo real (BRONZONI et al., 2005; PAUVOLID-
CORRÊA et al., 2010; KANG et al., 2012). A ICC e a inoculação em animais são
considerados padrões de referência (DE PAULA & FONSECA, 2004; KENNEY et al.,
2012; KAUR et al., 2013).
A inoculação em camundongos recém-nascidos, hamsters e cobaias possui
desvantagens como custo elevado, baixa sensibilidade e tempo prolongado para isolamento
(DE PAULA & FONSECA, 2004; SANTOS & BENATI, 2008). Contudo, linhagens
celulares são mais práticas e com custo inferior. Células de rim de macaco Rhesus, LLC-
MK2; de Aedes pseudoscutellaris, AP61; BHK-21; Vero e C6/36 são as mais sensíveis aos
arbovírus, sendo as três últimas mais frequentemente utilizadas para diagnóstico de
alfavírus (DEARDORFF & WEAVER, 2010; SHERMAN & WEAVER, 2010; KENNEY
32
et al., 2012; KAUR et al., 2013). A multiplicação viral em células de cultivo pode ser
observada mediante a apresentação de efeito citopático (ECP), formação de placas em
meio semi-sólido e detecção de antígenos e ácidos nucleicos (DE PAULA & FONSECA,
2004; SANTOS & BENATI, 2008; FLORES, 2012). A IFI é amplamente utilizada com
anticorpos primários policlonais anti-alfavírus e/ou anticorpos monoclonais espécie-
específicos, seguidos de anticorpos secundários contra a imunoglobulina G conjugados
com fluoróforos (STORCH, 1994; SANTOS & BENATI, 2008; LUNDSTROM, 2012;
KAUR et al., 2013).
O ELISA permite a detecção de anticorpos e antígenos. Três variações são
utilizadas para arbovírus: ELISA indireto, ELISA-Array (multiplex-ELISA) e ELISA de
captura (MAC ELISA) em amostras de soro, cultura viral, secreções, líquor, leite, e outros.
Anticorpos monoclonais específicos contra os vírus são conjugados a enzimas (biotina-
NHS, peroxidase, catalase, fosfatase alcalina, etc) para que ocorra reação colorimétrica
frente à adição de substratos, na presença de antígenos virais. O ELISA indireto detecta
principalmente IgG. É utilizado em estudos de soroprevalência, uma vez que IgG torna-se
detectável no soro na fase tardia da doença e se mantém por pelo menos 15 meses após a
infecção. O ELISA-array permite a detecção simultânea de antígenos de diferentes
arbovírus do gênero Alphavirus (SILVA, 2010; KANG et al., 2012; REDDY et al., 2012).
O MAC-ELISA permite a detecção de IgM nas primeiras semanas, durante a fase aguda da
infecção (KANG et al., 2012; REDDY et al., 2012).
O Teste de Neutralização por Redução de Placas (PRNT) é considerado o método
de referência para análise de proteção após vacinação por detectar anticorpos
neutralizantes. Sensível e específico permite quantificar níveis de anticorpos circulantes
que neutralizam de forma específica a espécie viral, excluindo ambiguidades produzidas
por reações cruzadas, como para as variantes do VEEV (I a VI), EEEV (I a IV) e MAYV
(L e D) (NI et al., 2007; THOMAS et al., 2009; SIMÕES, 2011).
A reação da cadeia em polimerase (PCR) amplifica quantidades mínimas de
genoma viral em amostras clínicas (acima de 200 cópias para alfavírus) como sangue,
tecidos sólidos, saliva, leite, secreções, sêmen, urina e cultivos celulares previamente
inoculados (PARIDA et al., 2007; SANTOS & BENATI, 2008; PAUVOLID-CORRÊA et
al., 2010; SILVA et al., 2011). As técnicas Multiplex, Nested e Semi-Nested PCR foram
desenvolvidas objetivando otimizar o custo das reações, a sensibilidade, especificidade e
obtenção dos resultados, possibilitando a detecção de co-infecções. É possível utilizar
33
iniciadores universais (pan-Alphavirus) como cM3W e M2W e/ou espécie-específicos para
região conservada do gene da nsP1 e das glicoproteínas E1, E2 e E3 para transcrição
reversa seguida de PCR, estes últimos, frequentemente utilizados em análise filogenética e
genotipagem (BRONZONI et al., 2005; PAUVOLID-CORRÊA et al., 2010; SILVA et al.,
2011; MUÑOZ & NAVARRO, 2012).
O sequenciamento nucleotídico de primeira e última geração permite a confirmação
dos produtos amplificados na PCR e estudos filogenéticos e de genotipagem, bem como
comparação com variáveis biológicas inerentes ao vírus, podendo-se determinar
ancestralidade, origem, adaptação e evolução, relações e divergências entre os alfavírus e a
identificação de novas espécies (TERZIAN, 2008; WEAVER et al., 2012).
A RT-PCR em tempo real amplifica e quantifica material genético pela detecção de
um composto fluorescente intercalante (SYBR Green®, LCGreen® Plus e EvaGreen®) ou
sondas sequencia-específicas (molecular beacons, Scorpion, Sunrise e TaqMan®),
liberadas quando há inserção dos nucleotídeos nas cadeias nascentes ou por excitação da
sonda. Para alfavírus, as mais utilizadas são SYBR Green® e TaqMan® em regiões
conservadas da nsP1 e E1 para MAYV, nsP3, E1 e E2 para CHIKV e outros, em amostras
como sangue, leite, saliva, secreções, urina, sêmen, biópsias e cultivos celulares inoculados
(OLIVEIRA, 2010; REDDY et al., 2012; HUESTON et al., 2013).
O Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) amplifica exponencialmente
ácidos nucleicos sob condições isotermais em apenas uma etapa (one step). A reação é
rápida, eficiente, sensível e específica, devido ao reconhecimento da sequência alvo por
três pares de iniciadores que hibridizam a oito regiões distintas (NOTOMI et al., 2000;
PARIDA et al., 2007; REDDY et al., 2012). Este método pode ser empregado para a
detecção de 20 cópias ou mais de ácidos nucleicos de alfavírus presentes em amostras de
soro, sangue, líquor e secreções da fase aguda da doença e cultivos celulares com
iniciadores delineados para os genes da nsP1 ou E1 (NOTOMI et al., 2000; PARIDA et
al., 2007; REDDY et al., 2012).
34
2. JUSTIFICATIVA
O MT encontra-se em área tropical, possuindo ecossistema variado em seu
território: Amazônia ao Norte, Pantanal ao Sul e Cerrado no restante do estado, bem como
a região do Araguaia. Esse ecossistema diverso dispõe de condições ecológicas e
climáticas favoráveis à ocorrência das arboviroses, com grande diversidade de espécies de
vetores e animais silvestres que podem participar como hospedeiros amplificadores desses
agentes zoonóticos.
Arbovírus do gênero Alphavirus circulam em artrópodes, animais domésticos,
silvestres e humanos. Vetores infectados constituem fonte de infecção para humanos, que
podem desenvolver doença febril aguda com manifestações clínicas indistinguíveis. Logo,
a etiologia é diferenciada somente por técnicas laboratoriais, tais como o isolamento viral e
a imunofluorescência.
A frequência e circulação de outros arbovírus além do DENV e do YFV no MT são
pouco compreendidas devido à ausência de diagnóstico laboratorial diferencial de rotina e
de estudos com estes arbovírus. Existem relatos frequentes de evidência sorológica,
isolamento e identificação molecular de arbovírus zoonóticos em humanos e animais em
estados adjacentes e, em 1968, anticorpos anti-MAYV foram relatados em índios Xavantes
do MT (NEEL et al., 1968), sendo este o único relato de circulação de MAYV no estado.
Desta forma, considerando a localização geográfica e as características ecológicas do
estado, a circulação de outros arbovírus além do DENV em áreas urbanas e rurais do
estado deve ser investigada.
Anualmente, são relatados diversos casos de doença febril aguda atribuídos ao
dengue, com ou sem confirmação laboratorial no estado. Frequentemente, amostras desses
casos são negativas para os sorotipos do vírus da dengue ou febre amarela quando
submetidas a diagnóstico laboratorial. Neste sentido, a investigação de outros arbovírus
aliada a utilização de métodos moleculares, que apresentam maior sensibilidade, pode
elucidar a ocorrência de outros arbovírus em MT, bem como possibilitar a adequação de
estratégias de vigilância virológica e entomológica. Portanto, o presente estudo, contribui
para a compreensão da dispersão e circulação de alfavírus no estado, permitindo a adoção
de medidas adequadas de diagnóstico, tratamento e prevenção das arboviroses.
35
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
- Investigar através de técnicas moleculares a circulação de alfavírus em pacientes
febris durante epidemia de dengue em Mato Grosso, Brasil, entre 2011 e 2012.
3.2 Objetivos Específicos
- Detectar circulação a entre 2011 e 2012 de alfavírus em população humana em
MT;
- Detectar eventuais co-infecções com alfavírus em pacientes febris de MT;
- Realizar diagnóstico diferencial de pacientes com síndrome febril aguda suspeita
de dengue em MT;
- Identificar eventuais fatores de risco para a infecção por alfavírus em população
humana em MT.
36
4. MATERIAL E MÉTODOS
Neste estudo, investigou-se a circulação de arbovírus do gênero Alphavirus, família
Togaviridae, em pacientes suspeitos de dengue atendidos e amostrados em serviços de
saúde do estado de MT, entre 2011 e 2012. Amostras de soro foram testadas para cinco
alfavírus MAYV, EEEV, WEEV, VEEV e AURAV, por multiplex semi-nested RT-PCR.
Amostras positivas para espécies de alfavírus foram submetidas ao sequenciamento
nucleotídico, TaqMan RT-qPCR e inoculação em cultivo celular. Os resultados foram
analisados junto a fatores de risco (figura 8).
Os resultados positivos para alfavírus foram confrontados com os resultados de um
estudo paralelo que pesquisou a circulação de 11 flavivírus (DENV-1, 2, 3 e 4, febre
amarela, encefalite de Saint Louis, Bussuquara, Ilhéus, Iguape e do Oeste do Nilo) por
Duplex-RT-PCR seguido de Multiplex semi-nested PCR (BRONZONI et al., 2005) e
sequenciamento nucleotídico no mesmo grupo de amostras analisadas no presente estudo.
Figura 8. Fluxograma de atividades para análise de 604 amostras de pacientes com
doença febril aguda suspeita de Dengue que demandaram os serviços de saúde do estado
de Mato Grosso, entre 2011 e 2012.
4.1 Caracterização do local de amostragem
O MT localiza-se na região Centro-Oeste do Brasil, representando 10% do território
nacional. Possui fronteira com o Amazonas e Pará ao Norte; Tocantins e Goiás a Leste;
MS ao Sul; Rondônia e Bolívia a Oeste. Seu território agrupa diferentes ecossistemas: o
37
Amazônico ao Norte é o mais abrangente, ocupando 53,6 % da área do MT, seguido do
Cerrado, com 39,6 % e o Pantaneiro ao Sul, com 6,8 %, reunindo formações florestais
variadas, dentre ombrófila, campinarana florestada, florestas estacionais, cerrado, campo
cerrado, campo limpo e campo de murunduns (SEMA, 2011). O clima é tropical, com duas
estações distintas, a seca e a chuvosa. As chuvas ocorrem entre outubro e abril, enquanto o
período seco prevalece de maio a setembro (EMBRAPA, 2006). Este ecossistema diverso
favorece a disponibilidade e dispersão de espécies de vetores, aves, animais silvestres e
domésticos, além de humanos em áreas rurais (552.321 habitantes) e urbanas (2.482.801
indivíduos) susceptíveis aos arbovírus (IBGE, 2010).
4.2 Tipo de estudo, amostragem e procedimentos éticos
O estudo caracterizou-se como observacional do tipo transversal. Analisou-se 604
amostras de soro de pacientes com doença febril aguda, até o quinto dia a partir do
aparecimento dos sintomas, provenientes de unidades básicas de saúde, prontos-socorros e
hospitais de municípios interligados à Secretaria Estadual de Saúde (SES) do MT entre
outubro de 2011 e julho de 2012, enviadas em nitrogênio líquido (-196oC), ao MT-
Laboratório para o diagnóstico laboratorial de DENV e YFV por ICC e IFI. Alíquotas das
amostras de soro foram separadas para o experimento durante a inoculação (Anexo I) e
transportadas em nitrogênio líquido ao Laboratório de Virologia (LV/FM/UFMT), onde
foram armazenadas a -80°C.
Juntamente com as amostras clínicas, foram adquiridos os registros do Sistema de
Informação de Agravos de Notificação (SINAN) (Anexo II). Os procedimentos que
envolvem pacientes e amostras clínicas foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa do Hospital Júlio Müller, FM/UFMT, protocolo 100 de 2011 (Anexo III).
4.3 Extração de RNA viral a partir das amostras de soro
A extração de RNA foi realizada em volume igual a 140 µL de soro com o QIAamp
Viral RNA mini Kit (QIAGEN) segundo especificações do fabricante.
4.4 Iniciadores
Os iniciadores usados nas reações de multiplex semi-nested RT-PCR hibridizam a
regiões conservadas do gene da proteína viral não-estrutural nsP1 dos alfavírus (Tabela 2).
38
Tabela 2. Iniciadores empregados para detecção de alfavírus no soro de pacientes com doença febril aguda suspeita de dengue em Mato
Grosso, 2011 e 2012.
Alvo Primer Sequência Posição no
genoma
Tamanho1 Fragmento
amplificado1
Referência
Gênero
Alphavirus
M2W (+) YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW2
164–186 23 433 (PFEFFER et al., 1997)
cM3W (-) ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC
568–597 30
Gênero FG1 (+) TCAAGGAACTCCACACATGAGATGTACT 8270–8297 27 958 (FULOP et al., 1993)
Flavivirus FG2 (-) GTGTCCCATCCTGCTGTGTCATCAGCATACA 9228–9258 30
Multiplex semi-nested RT-PCR para alfavírus
MAYV nMAY (+)3
GGAAGTTGGCCAAGGC 164-189 16 270 (BRONZONI et al., 2005)
VEEV nVEE (+) ACGGAGGTAGACCCATCCGA 199-218 20 400
EEEV nEEE (+) CCACGGTACCGTTGCC 469-484 16 124
WEEV nWEE (+) GGCGGCAGACCTGCTGGAA 363-381 19 208
AURAV nAURA (+) TCAATGCACCTTCGACCA 546-633 18 86
¹Em pares de base. ²Iniciador degenerado, Y = C or T; R = A or G; N = A, C, G, or T; W = A or T; V = A, C, or G. ³Iniciadores utilizados em multiplex semi-nested RT-
PCR com o reverso para alfavírus cM3W (-).
39
4.5 Controles Positivos
Para a padronização da RT-PCR e controle interno das reações, utilizou-se RNA da
estirpe BeAr 20290 do MAYV, cedido pela prof. Dra. Roberta Morais Bronzoni, UFMT
Sinop, e das estirpes do EEEV e Flórida do VEEV, cedidos pelo prof. Dr. Eduardo Furtado
Flores, UFSM, Santa Maria, RS.
4.6 Duplex RT-PCR para região dos genes nsP1 de alfavírus e NS5 de flavivírus
A transcrição reversa a DNA complementar (cDNA) foi realizada com 9,1 µL (~1
µg) de RNA extraído, 4 µL de tampão 5x (250 mM Tris-HCl [pH 8.3], 375 mM KCl, 15
mM MgCl2), 1,6 µL de deoxinucleotídeos trifosfatados (DNTPs) (2,5 mM), 1,4 µL de
dithiothreitol (DTT, 0,1 M), 1 µL de primer alfavírus-específico cM3W (-) a 100 µM, 1 µL
do primer para Flavivirus FG2 (-) a 15 µM, 20 U de inibidor de RNAse (RNAse OUT;
Invitrogen) e 100 U da transcriptase reversa (RT; Superscript III, Invitrogen) completando
20 µL, incubados por 50 min a 50 °C e 15 min a 70 °C.
Para a amplificação pela reação da polimerase em cadeia (PCR) da região de 433
pb do gene nsP1 dos alfavírus, e da região de de 958 pb do gene NS5 dos flavivírus,
utilizou-se 8 µL de cDNA, 5 µL de tampão de PCR 10x (200 mM Tris-HCl [pH 8.4], 500
mM KCl), 2 µL de MgCl2 (50 mM), 1 µL do primer M2W (+) a 50 µM, 1 µL do primer
FG1 (+) a 15 µM, 1 µL de DNTPs (10 mM), 1 U de DNA polimerase (Taq DNA
polimerase recombinante; Invitrogen) e água ultrapura para 50 µL. A reação foi submetida
a um ciclo de 94°C por 1 min, 30 ciclos de 94 °C por 1 min, 53 °C por 1 min e 72 °C por 2
min e extensão final de 72 °C por 5 min. Foram inclusos controles positivos e negativos.
4.7 Multiplex Semi-Nested PCR para região do gene da nsP1 de espécies de alfavírus
Utilizou-se 2 µL do produto da Duplex RT-PCR, 2,5 µL de tampão de PCR 10x
(200 mM Tris-HCl [pH 8.4], 500 mM KCl), 1 µL de MgCl2 (50 mM), 0,5 µL de dNTPs
(10 mM), 0,5 U de DNA polimerase (Platinum Taq DNA polimerase; Invitrogen), 0,5 µL
de primer reverso cM3W (100 µM), 0,5 µL dos iniciadores nMAY (30 µM), nVEE, nEEE,
nWEE e nAURA (15 µM) (Tabela 1) e água ultrapura para 25 µL, sob as mesmas
condições de ciclagem descritas no item anterior, incluindo controles positivos negativos.
Após a amplificação, 12 µL dos produtos foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose a 1,5% em tampão Tris-Acetato-EDTA 1 X (TAE; Tris base 2M, ácido acético
glacial, EDTA dissódico 0,5M, pH 8,3), corados com Blue Green Loading Dye (LGC
40
Biotechnology) e visualizados em fotodocumentador (Gel Doc XR+; Bio-Rad) pelo
programa ImageLab (Bio-Rad). Amostras positivas foram submetidas no mínimo a dois
testes independentes a partir do RNA viral, com primers para MAYV e DENV-4.
4.8 Semi-nested PCR single para região do gene da nsP1 do MAYV
Para confirmar a amplificação de vírus Mayaro (MAYV), amostras positivas nas
reações de multiplex foram testadas em reações single com os iniciadores cM3w e nMAY.
Para isso, utilizou-se 2 µL de cDNA, 2,5 µL de tampão de PCR 10x (200 mM Tris-HCl
[pH 8.4], 500 mM KCl), 1 µL de MgCl2 (50 mM), 0,5 µL de dNTPs (10 mM), 0,5 U de
Taq DNA polimerase (Platinum Taq DNA polimerase; Invitrogen), 0,5 µL de primer
reverso cM3W (100 µM), 0,5 µL de primer nMAY (30 µM) e água ultrapura em 25 µL de
volume, submetidos a mesma ciclagem descrita anteriormente. Amostras negativas foram
armazenadas em freezer -80 °C para estudos futuros.
4.9 Sequenciamento nucleotídico
Este foi gentilmente realizado no Laboratório de Biologia Molecular da Medicina
Veterinária, UFMT, Professores Dra. Valéria Dutra e Luciano Nakazato e no Instituto
Leônidas e Maria Deane (Fiocruz Amazônia), Prof. Dr. Felipe Gomes Naveca.
Os fragmentos obtidos na semi-nested RT-PCR single para região da nsP1 do
MAYV foram purificados com o kit Performa DTR Gel Filtration Cartridges (Edge
Biologicals), gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Nikolaos Vasilakis, segundo
especificações do fabricante e quantificados após eletroforese em gel de agarose a 1,5 %
em TAE em fotodocumentador Gel DOC XR+ (Bio-Rad) e ImageLab (Bio-Rad). Utilizou-
se o marcador molecular 1 Kb (Thermo Scientific) com bandas com concentração
conhecida de DNA para comparação de intensidade. Os valores foram expressos em
ng/µL.
Os fragmentos purificados e quantificados foram submetidos a PCR com
nucleotídeos marcados, utilizando-se 2 µL de ready reaction premix Big Dye 2,5X
(AmpliTaq DNA polimerase + Pirofosfatase termoestável; Applied Biosystems), 1 µL de
tampão Big Dye Sequencing buffer 5x, 10 µM de primer cM3w ou nMAY (10 µM) e DNA
purificado (~1 µg) para completar 10 µL. A reação foi incubada em termociclador a 96 °C
por 1 min, 40 ciclos de 96 °C por 15 seg, 50 °C por 15 seg, 60 °C por 4 min.
A precipitação do produto de PCR com Big Dye foi realizada pelo método
41
Etanol/EDTA/Acetato de Sódio. Adicionou-se 1 µL de EDTA (125 mM), 1 µL de Acetato
de Sódio (3 M) e 30 µL de etanol PA, incubou-se à TA (15–25°C) por 15 min e
centrifugou-se a 2.500 x g por 30 min a 15 °C. O sobrenadante foi descartado e as amostras
centrifugadas a 185 x g. Lavou-se o DNA marcado com 100 µL de etanol 70 % e
centrifugou-se a 20.000 x g. O sobrenadante foi descartado, centrifugou-se a 185 x g e
incubou-se a TA (15 – 25 °C). Adicionou-se 10 µL de formamida, centrifugou-se a 185 x g
e aplicou-se as amostras no sequenciador 3500 Genetic Analyser (Apllied Biosystems).
Utilizou-se os programas Geneious R7 (versão 7.0.4) e Molecular Evolutionary Genetics
Analysis MEGA (versão 5.05) para alinhamento e comparação das sequências obtidas pelo
Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn, genBank, pubmed).
4.10 TaqMan RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) para MAYV
Esta técnica, desenvolvida no Instituto Leônidas e Maria Deane (Fiocruz
Amazônia) juntamente à equipe coordenada pelo Prof. Dr. Felipe Gomes Naveca, foi
aplicada com o intuito de confirmar os dados obtidos e quantificar o material genético
presente nas amostras positivas para o MAYV. Para a transcrição reversa, utilizou-se 5,0
µL de RNA, 0,5 µL de iniciadores randômicos (125 ng), 1 µL de DNTPs (10 µM) e 6,5 µL
de água ultrapura. A reação foi incubada a 95 °C por 2 min e resfriada em gelo por 1 min.
Adicionou-se 4 µL de tampão 5x (250 mM Tris-HCl [pH 8.3], 375 mM KCl, 15 mM
MgCl2), 1 µL de DTT (0,1 M), 50 U (1 µL) de inibidor de RNAse (RNAse OUT;
Invitrogen) e 100 U da RT (Superscript III; Invitrogen). Incubou-se em termociclador por
5 min a 25 °C, 45 min a 50 °C e 15 min a 70 °C. Adicionou-se 1 µL de RNAse H (Life
Technologies), incubou-se por 20 min a 37 °C e 10 min a 95 °C.
A PCR em tempo real (qPCR) foi realizada em Step One Plus Real Time PCR
System (Applied Biosystems), com o TaqMan Advanced Universal Kit (Life Technologies),
segundo especificações do fabricante. Utilizou-se 2 µL de cDNA, 5 µL de 2X qPCR Mix
(Tris-EDTA [10 mM], 1 mM EDTA [pH 8.0], água ultrapura, AmpliTaq fast DNA
polimerase, enzima MMLV termoestável, DNTPs, RNAse out, ROX dye, 1,2 µL de primer
para o MAYV (300 µM), 0,2 µL de sonda MAYV-VIC (100 µM) e água ultrapura para 20
µL. A reação foi submetida a 95 °C por 5 min, 45 ciclos de 95 °C por 3 seg e 60 °C por 30
seg. Foi incluído controle negativo. A quantificação da carga viral equivalente das
amostras foi estimada através do software Prism 6 statistics, utilizando-se uma curva
padrão MAYV obtida em experimentos anteriores, com eficiência (E) da reação calculada
42
segundo a fórmula E=[10(-1/Slope da curva)
-1], resultando em 100 % e R2=1.
4.11 Inoculação em cultivo celular
Amostras positivas para alfavírus foram submetidas ICC em células C6/36 (ATCC
CRL 1660) e Vero (ATCC CCL 81). A linhagem C6/36 foi subcultivada em meio
Leibovitz (Triptose fosfato 2,95 %, aminoácidos não essenciais [10X], L-glutamina 2%,
penicilina [100 U/mL], estreptomicina [100 µg/mL], anfotericina B [5 µg/mL] adicionado
de 10 % de soro fetal bovino (SBF) em placas de poliestireno de 24 cavidades foi incubada
por 1 h a 28 oC com 200 µL das amostras de soro diluídas em meio L-15 a 1:20. Após este
período, o inóculo foi removido e 400 µL de meio de cultivo adicionado, mantendo-se as
placas por cinco dias a 28 oC. Observando-se diariamente para a apresentação de efeito
citopático (ECP) característico em microscópio invertido. Procedeu-se nova passagem, a
partir do inóculo diluído 1:20 em células C6/36.
Células Vero subcultivadas em Meio Essencial Mínimo com sais de Hank’s (MEM
Hank’s, anfotericina B [12 µL/mL], penicilina [2400 U/mL], estreptomicina [2,4 µg/mL])
e 5 % de SBF em placas de poliestireno com 24 poços receberam 200 µL das amostras de
soro diluídas a 1:20 em MEM Hank’s + SBF 2 % e centrifugadas por 30 min a 680 x g a
25 °C (Shell Vial culture), seguidas de 30 min de incubação a temperatura ambiente,
homogeneizando-se a cada 15 min. Após este período, o inóculo foi removido e 1 mL de
meio de cultivo adicionado. As placas foram incubadas por 7 dias a 37 °C, e observadas
diariamente para detecção de ECP.
4.12 Análise de dados
Os dados epidemiológicos obtidos a partir dos registros do SINAN foram digitados
em dupla entrada no Epidata Entry (versão 3.1) e analisados no Epidata Analisys (versão
2.2.2.178). As variáveis socioeconômicas dos indivíduos foram quantificadas e agrupadas
para melhor descrição.
Os dados dos mapas de distribuição amostral em MT foram plotados com auxílio
do programa ArcGIS (versão 9.3).
43
5. RESULTADOS
5.1 Caracterização da Amostragem
Neste estudo, foram analisadas 604 amostras de soro de pacientes com doença
febril aguda suspeita de dengue com menos de cinco dias do início dos sinais e sintomas,
provenientes de 20 municípios do estado de MT (Figura 9), incluindo dois viajantes
provenientes da Bahia e São Paulo que se encontravam em Cuiabá quando adoeceram.
Dentre os pacientes analisados, 538/604 (89,1 %) residiam na região da Baixada Cuiabana,
sendo a maioria 453/604 (75,0 %) procedentes de Cuiabá e 72/604 (11,9 %) de Várzea
Grande (Tabela 3). As cidades de origem dos enfermos foram distribuídas nos
ecossistemas (Amazônico, Cerrado e Pantanal), no entanto concentraram-se na região
central do estado, mais populosa e onde foi observada a maior casuística no período
amostrado é caracterizada pelo ecossistema Cerrado (Figura 9).
Muitos pacientes apresentavam informações incompletas nos registros do SINAN e
nem todos puderam ser incluídos nas análises demográficas e epidemiológicas. De acordo
com a análise dos dados disponíveis, há homogeneidade de distribuição em relação ao
gênero, sendo 300/604 (49,7 %) pertencentes ao sexo masculino e 304/604 (50,3 %) do
sexo feminino, dentre as quais 9/256 (3,5 %) estavam gestantes. Quanto à faixa etária,
278/602 (46,2 %) possuía idade entre 20 e 39 anos. Entre a população estudada com
registro de etnia, a maioria 314/472 (66,5 %) era de indivíduos pardos. Residentes em
áreas urbanas 583/595 (98,0 %), 379/426 (89,0 %) não relatavam visita a área
rural/silvestre próximo ao episódio febril e 309/426 (72,5 %) negaram histórico de doença
semelhante pregressa (Tabela 3). A variação no número de pacientes em cada característica
demográfica é devida a ausência de informações disponíveis nos registros do SINAN.
44
Figura 9. Distribuição da amostragem de pacientes com doença febril aguda suspeita de
dengue por cidade de Mato Grosso, Brasil, entre 2011-2012 para a investigação de
alfavírus por multiplex semi-nested RT-PCR.
Total de amostras por cidade do Estado de Mato Grosso:
A. Cuiabá (455) H. Acorizal (3) O. Cáceres (1)
B. Várzea Grande (72) I. Rondonópolis (3) P. Campo Novo do Parecis (1)
C. Sinop (19) J. Campinápolis (2) Q. Juína (1)
D. Pontes e Lacerda (15) K. Tapurah (2) R. Nobres (1)
E. Sorriso (10) L. Santa Carmem (2) S. Nova Olímpia (1)
F. Poconé (7) M. Nossa Senhora Livramento
(2)
T. Rosário Oeste (1)
G. Nova Mutum (4) N. Tangará da Serra (2)
Ecossistemas: Pantanal Cerrado Amazônia
45
Tabela 3. Características demográficas e epidemiológicas de pacientes com doença febril
aguda suspeita de dengue que demandaram os serviços de saúde de Mato Grosso de outubro de
2011 a julho de 2012.
Características
Total1 MAYV Positivos
N* % N* %
Sexo Masculino 300 49,7 8 53,3
Feminino 304 50,3 7 46,7
Gestante Sim 9 3,5 1 14,3
Não 247 96,5 6 85,7
Idade < 5 18 3,0 0 0,0
(anos) 5 ├┤ 9 40 6,6 0 0,0
10 ├┤ 14 63 10,5 1 6,7
15 ├┤ 19 70 11,6 5 33,3
20 ├┤ 39 278 46,2 5 33,3
40 ├┤59 112 18,6 4 26,7
> 59 21 3,5 0 0,0
Etnia Branca 111 23,5 3 20,0
Parda 314 66,5 12 80,0
Negra 37 7,8 0 0,0
Amarela 5 1,1 0 0,0
Outras 5 1,0 0 0,0
Município de residência Cuiabá 453 75,0 9 60,0
Várzea Grande 72 11,9 3 20,0
Sinop 19 3,1 0 0,0
Pontes e Lacerda 15 2,5 0 0,0
Sorriso 10 1,7 2 13,3
Poconé 7 1,2 0 0,0
Nova Mutum 4 0,7 0 0,0
N. Sra. Livramento 2 0,3 1 6,7
Outros 22 3,6 0 0,0
Zona Urbana 583 98,0 15 100,0
Rural 12 2,0 0 0,0
Histórico de doença pregressa
semelhante
Sim 117 27,5 1 6,7
Não 309 72,5 14 93,3
Histórico de visita à área rural Sim 47 11,0 0 0,0
Não 379 89,0 15 100,0
*Abreviaturas: MAYV: vírus Mayaro, N. Sra. Livamento: Nossa Senhora do Livramento. 1Total: 604 pacientes
testados para alfavírus *6A variação do número total de pacientes em cada característica se deve à ausência de
informações nos registros do SINAN ou à não aplicabilidade de alguns pacientes a determinadas variáveis.
46
5.2 Caracterização dos casos positivos para alfavírus
Após multiplex semi-nested RT-PCR para região da nsP1 dos alfavírus, obteve-se
amplificação em 15/604 (2,5 %) amostras de soro de pacientes com doença febril suspeita
de dengue para o MAYV (Figura 10), sendo 3/15 (20,0 %) positivas somente para o
MAYV e 12/15 (80,0 %) co-infecções com o DENV-4 (Tabela 4). Outros alfavírus
pesquisados, como EEEV, WEEV, VEEV e AURA, não foram detectadas. Amostras
negativas para alfavírus totalizaram 589/604 (97,5 %).
Dentre as 15 amostras positivas para o MAYV, nove (60,0 %) foram oriundas da
cidade de Cuiabá, três (20,0 %) de Várzea Grande, duas (13,3 %) de Sorriso e uma (6,6 %)
de Nossa Senhora do Livramento (Figura 11). A maior parcela dos pacientes positivos para
MAYV 10/15 (66,6 %) foi concentrada na faixa etária entre 15 e 39 anos, sendo ambos os
gêneros acometidos, 7/15 (46,7 %) do sexo feminino e 8/15 (53,3 %) masculino.
Etnicamente, 12/15 (80,0 %) foram classificados como pardos e, 3/15 (20,0 %) como
brancos (Tabela 3).
Os sinais e sintomas mais frequentes entre os pacientes positivos somente para o
MAYV (3/15) foram hipertermia e mialgia, seguidos por artralgia, dor retroorbital e, em
menor proporção, náusea e cefaleia. Pacientes co-infectados apresentaram uma gama maior
de sinais e sintomas, caracterizados principalmente por hipertermia, dor retroorbital e
cefaleia, além de mialgia e em menor proporção prostração, petéquias, êmese e inapetência
(Tabela 5). Não houve entre os positivos, relato de visita recente a áreas rurais e/ou
florestais, consideradas de risco para a infecção pelo MAYV e, somente um paciente relata
histórico de doença pregressa por dengue (Tabela 3).
As sequências da nsP1 obtidas nas reações de single semi-nested RT-PCR para as
amostras #09, 12, 20, 22, 127, 147, 220, 230, 246, 301, 305, 306, 308, 322, 618
apresentaram similaridade de 80-100 % com sequências de estirpes de referência do
MAYV (Genbank, pubmed; números de acesso AF237947.1, DQ138319.1, DQ138320.1 e
DQ138318.1; Tabela 4), confirmando a detecção deste agente pela RT-PCR convencional.
As amostras positivas para o MAYV que continham volume de RNA suficiente
para a realização do teste (13/15; 86,6 %), foram submetidas à RT-PCR em tempo real
para região da nsP1, confirmando os resultados obtidos na multiplex RT-PCR em 10/13
(76,9 %) amostras, com carga viral aproximada entre 100,965
e 103,321
(Tabela 4, Figura 12).
A ICC em células C6/36 e Vero não resultou em isolamento viral.
As 604 amostras foram previamente submetidas a ICC e IFI para pesquisa dos
47
quatro sorotipos do vírus da dengue e para o vírus da febre amarela no MT-Laboratório.
Dentre as amostras positivas para o MAYV, foi possível o isolamento do DENV-4 a partir
de 10 (#9, 12, 20, 127, 147, 220, 230, 305, 308, 322) (Tabela 4). Além disso, em estudo
paralelo onde pesquisou-se 11 espécies de flavivírus por multiplex semi-nested RT-PCR
nas mesmas amostras pesquisadas neste estudo, detectou-se 12 amostras infectadas pelo
MAYV positivas também para o DENV-4.
48
Figura 10. Pacientes positivos por semi-nested RT-PCR para o vírus Mayaro (MAYV) #9
a 618. Controles positivos: MAYV - BeAr 20290 (270 pb); VEEV - Flórida (398 pb);
EEEV - SPAn 14723 (124 pb); NT - controle negativo; M - marcador molecular (1 Kb).
49
Tabela 4. Dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais de 15 pacientes com doença febril aguda, positivos para o vírus Mayaro e/ou
Dengue-4 em Mato Grosso, 2012.
Paciente #
(idade)1
Sexo2
Ocupação Cidade de
origem
Sinais e sintomas clínicos, histórico de doença
pregressa similar
RT-PCR Similaridade com
sequências do MAYV (%)3
RT-qPCR
(log)4
ICC
DENV-4
9 (43) F Empregada
Doméstica
Cuiabá Hipertermia, mialgia, artralgia, náuseas,
petéquias, prurido, dor retroorbital
DENV4/MAYV Estirpe Brasil (97) NT +
12 (10) F Estudante Nossa Sra
Livramento
Hipertermia, mialgia, cefaleia, dor retroorbital DENV4/MAYV Estirpe Brasil (97) 0,965 +
20 (19) M Vendedor Várzea Grande Hipertermia, mialgia, cefaleia, prostração, êmese DENV4/MAYV Estirpe Brasil (97) NT +
22 (40) F Técnica em
Enfermagem
Várzea Grande Hipertermia, mialgia, prostração, dor retroorbital DENV4/MAYV BeAr505411 Pará (100) 3,206 -
127 (16) M Estudante Cuiabá Hipertermia, mialgia, cefaleia, dor retroorbital DENV4/MAYV Uruma Bolívia (85) 1,720 +
147 (48) F Costureira Várzea Grande Hipertermia, mialgia, artralgia, cefaleia, dor
retroorbital, petéquias
DENV4/MAYV Uruma Bolívia (96) 1,418 +
220 (17) M Vendedor Cuiabá Hipertermia, cefaleia, vertigem, náuseas DENV4/MAYV BeH343148 Pará (87) ND +
230 (20) M Pedreiro Cuiabá Hipertermia, mialgia, cefaleia, dor retroorbital,
êmese
DENV4/MAYV BeH343148 Pará (95) 1,880 +
246 (18) M Presidiário Sorriso Hipertermia, mialgia, artralgia, cefaleia, dor
retroorbital, náuseas
MAYV BeH343148 Pará (97) ND -
301 (42) M Comerciante Cuiabá Hipertermia, mialgia, artralgia, dor retroorbital MAYV BeH343148 Pará (95) 1,673 -
305 (20) M Motoboy Cuiabá Hipertermia, cefaleia, dor retroorbital DENV4/MAYV BeH343148 Pará (87) 1,770 +
306 (20) F Auxiliar de
contabilidade
Cuiabá Hipertermia, mialgia, histórico: Dengue MAYV BeAr505411 Pará (86) 1,497 -
308 (16) F Atendente de
Telemarketing
Cuiabá Hipertermia, cefaleia, prostração, dor retroorbital DENV4/MAYV Estirpe Brasil (95) 3,321 +
322 (21) F Atendente Cuiabá Hipertermia, cefaleia, prostração, dor retroorbital,
inapetência
DENV4/MAYV BeAr505411 Pará (90) ND +
618 (33) M Comerciante Sorriso Hipertermia, mialgia, cefaleia DENV4/MAYV BeAr505411 Pará (96) 1,702 -
*Abreviaturas: MAYV: vírus Mayaro, RT-PCR: transcrição reversa seguida de reação em cadeia polimerase, DENV-4: Dengue-4, ICC: inoculação em
cultivo celular, RT-qPCR: transcrição reversa seguida de reação em cadeia polimerase em tempo real, Log: logarítimo. #: número da amostra; idade
expressa em anos; 2M: masculino, F: feminino;
3sequências depositadas no genebank (pubmed), números de acesso: AF237947.1 (Estirpe Brasil genótipo
D), DQ138318.1 (Uruma genótipo D), DQ138320.1 (BeH343148 genótipo D), e DQ138319.1(BeAr505411 genótipo L); 2 Carga viral expressa em
cópias/µL, onde Log=10x; NT: não testada, ND: não detectada.
50
Tabela 5. Sinais e sintomas mais frequentes entre os pacientes com infecção única pelo
vírus Mayaro ou co-infectados com o vírus da Dengue-4 em Mato Grosso, Brasil.
*Abreviaturas: MAYV: vírus Mayaro, DENV-4: Dengue-4. 1N: número de pacientes.
Sinais e
Sintomas
Indivíduos positivos para
MAYV/DENV-4 (n=12)
Indivíduos positivos somente
para MAYV (n=3)
n1 % N %
Hipertermia 12 100 3 100
Cefaleia 10 83,3 1 33,3
Mialgia 8 66,6 3 100
Dor retroorbital 9 75,0 2 66,6
Prostração 4 33,3 0 0,0
Artralgia 2 16,6 2 66,6
Náuseas 2 16,6 1 33,3
Êmese 2 16,6 0 0,0
Petéquias 2 16,6 0 0,0
Inapetência 1 8,3 0 0,0
51
Figura 11. Distribuição por município dos 15 pacientes positivos para o vírus Mayaro
por multiplex semi-nested RT-PCR de acordo com a cidade de residência em Mato
Grosso, Brasil. A. Cuiabá (n= 9); B. Várzea Grande (n= 3); C. Sorriso (n= 2); D. Nossa
Senhora do Livramento (n= 1).
52
Figura 12. Valores do ciclo limiar (Threshold Cycle – CT) da TaqMan RT-PCR em
tempo real para o vírus Mayaro em pacientes com doença febril aguda do Mato Grosso
(2011-2012) em relação à quantificação da carga viral (log do número de cópias/µL),
comparados à curva padrão de controle positivo do MAYV com eficiência de 100 % e
R2 = 1.
53
6. DISCUSSÃO
Neste estudo, investigou-se a possível circulação de arbovírus do gênero
alfavírus em MT durante epidemia de dengue entre 2011-2012, época em que houve a
detecção da introdução do DENV-4 no estado. Em 2012, 44.814 casos foram
notificados em MT, sendo 96,2 % atribuídos ao DENV-4 e 3,8 % ao DENV-1
(CAPELASSI, 2013; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012). Cuiabá e Várzea Grande
contribuíram com o maior número de amostras, provavelmente pela facilidade de
transporte ao laboratório, maior densidade populacional e casuística nestas cidades em
2012, apresentando 31,7 % dos 43.158 casos de dengue relatados no estado (SES/MT,
2012).
Neste estudo foram encontrados 15/604 (2,5 %) pacientes positivos para MAYV
provenientes de Cuiabá, Várzea Grande, Sorriso e Nossa Senhora do Livramento
(Figura 10), demonstrando a circulação de MAYV em municípios de diferentes regiões
do MT, principalmente em áreas de Cerrado. Os casos ocorreram entre janeiro e maio,
período em que a pluviosidade é aumentada na região, propiciando ambiente favorável à
proliferação de mosquitos transmissores e, consequentemente, favorecendo a ocorrência
de arboviroses. É possível que a transmissão do MAYV ocorra de forma esporádica no
MT, uma vez que somente 2,5 % da população amostrada foi acometida e, entre os
casos, apenas um paciente tinha histórico de doença febril aguda suspeita de dengue.
A viremia pelo MAYV é transiente e a doença febril mais branda quando
comparadas à Dengue, sendo comum a confusão da forma febril dessas arboviroses
(VASCONCELOS et al., 1998; TESH et al., 1999; COIMBRA et al., 2007; WEAVER
& REISEN, 2010). Dentre os pacientes positivos, somente três (20,0%) foram positivos
apenas para MAYV e, sua identificação somente foi possível porque estes pacientes
apresentavam manifestações clínicas e procuraram por atendimento médico. A grande
maioria das amostras positivas para o MAYV, 12/15 (80,0%), foram de co-infecções
com o DENV-4, detectados por Multiplex semi-nested RT-PCR em estudo paralelo e,
dentre essas 12, 10 foram positivas em ICC em células C6/36 no MT-laboratório. É
possível que o número de infecções pelo MAYV seja maior, e que no entanto somente
uma pequena parcela desses pacientes, principalmente aqueles co-infectados com o
DENV, procuram por atendimento médico. O número relativamente pequeno de
amostras positivas para o MAYV dificulta a análise clara da diferença dos quadros
clínicos entre pacientes positivos para MAYV e co-infectados por MAYV/DENV-4. O
54
quadro clínico inespecífico apresentado pelos três pacientes positivos apenas para o
MAYV, caracterizados por hipertermia, cefaleia, náusea, dor retroorbital, mialgia e
artralgia, parece não ter sido muito diferente do quadro observado em pacientes co-
infectados com DENV-4 (Tabela 3). Entretanto, os pacientes positivos apenas para
MAYV apresentaram uma frequência relativamente maior de artralgia do que os
pacientes positivos para MAYV/DENV-4, enquanto os pacientes co-infectados
apresentaram uma maior prevalência de dor retroorbital. Estes achados vão ao encontro
ao descrito em literatura, que demonstra dor retroorbital como sintoma característico de
dengue e artralgia como característica da febre Mayaro (RIGAU-PÉREZ et al., 1997;
GIBBONS & VAUGHN, 2002; TAYLOR et al., 2005; MOURÃO et al., 2012;
MUÑOZ & NAVARRO, 2012).
A ausência de diferença de positividade estatisticamente significativa entre os
gêneros é um dado inesperado para a infecção por MAYV, que está relacionada a ciclos
de transmissão envolvendo primatas e vetores acrodendrofílicos como o Haemagogus
janthinomys em ambiente silvestre. Normalmente é referida como uma doença
ocupacional relacionada a homens adultos jovens que desempenham atividades em
áreas silvestres, como pescadores. Por esta razão, casos de febre do Mayaro são
comumente detectados durante epidemias de febre amarela.
No presente estudo, a ausência de diferença entre as prevalências de infecção
pelo MAYV entre homens e mulheres, aliada a ausência de histórico de visita recente a
áreas rurais e silvestres entre os pacientes, sugerem a transmissão em área urbana. A
maior prevalência de positivos para MAYV em área urbana é corroborada ainda pela
profissão tipicamente urbana dos pacientes. Vetores acrodendrofílicos envolvidos em
ciclos silvestres de transmissão do MAYV não são comumente relatados na área urbana
de Cuiabá (SERRA et al., 2013), onde nove (60,0 %) dos casos positivos foram
detectados.
Neste sentido, estudos envolvendo vigilância entomológica para o MAYV em
área urbana de Cuiabá poderiam contribuir para elucidação do ciclo de transmissão e,
consequentemente, dos achados relatados neste estudo. Espécies de Psorophora spp. e
Mansonia venezuelensis são naturalmente infectados, possuindo capacidade vetorial
sem competência vetorial comprovada, e espécies de Cx. (Melanoconion) e Ae.
albopictus transmitem experimentalmente o MAYV (AITKEN et al., 1960; AITKEN et
al., 1969; GALINDO et al., 1966; GALINDO & SRIHONGSE, 1967; MITCHELL,
1991; SMITH & FRANCY, 1991; ABAD-FRANCH et al., 2012). Neste sentido, este
55
agente que representava importante causa de morbidade em áreas rurais e florestais
(COIMBRA et al., 2007; MOURÃO et al., 2012), poderia estar expandindo seu espectro
geográfico, passando a causar infecções em áreas urbanas. A análise de fatores de risco
demonstra que ciclos diurnos selvagens e noturnos em ambiente
doméstico/peridoméstico estão relacionados a maior exposição de humanos em vilas e
assentamentos na Amazônia, sugerindo uma troca de vetores ou habitats e sua
consequente adaptação a áreas densamente populosas (ABAD-FRANCH et al., 2012).
Quanto à etnia, a maioria dos casos são classificados como pardos (Tabela 3),
provavelmente devido à constituição essencialmente parda da população,
principalmente em Cuiabá, que contribuiu para a maioria das amostras.
As sequencias de MAYV obtidas pelo sequenciamento nucleotídico
demonstraram divergência variável com as estirpes de referência oriundas do Brasil e
Bolívia (Tabela 4). Dentre as amostras confirmadas positivas para MAYV, somente três
foram descartadas no sequenciamento, pois apresentavam amplificação inespecífica
(dados não apresentados). Estes resultados indicam que o sequenciamento nucleotídico
é um método confiável para confirmação de amostras realmente positivas para o
MAYV. Dentre as 15 amostras confirmadas por sequenciamento, três resultaram
negativas na PCR em tempo real, e as demais apresentaram baixa carga viral (Tabela 4;
Figura 12) provavelmente pelo longo período de armazenamento e ciclos de
congelamento/descongelamento, ocasionando a degradação do RNA.
As tentativas de isolamento viral foram negativas, observando-se toxicidade do
inóculo para as monocamadas de C6/36 e, em células Vero, as amostras resultaram
negativas após 7-10 de incubação. É possível que ciclos de
congelamento/descongelamento, aliados ao longo período de armazenamento das
amostras de soro, bem como a sensibilidade reduzida desta técnica em relação à PCR e
aos baixos títulos de viremia apresentados pelos pacientes, possam ter contribuído para
a perda da viabilidade das partículas virais. Neste sentido, no Pará, Azevedo e cols
(2009) isolaram o MAYV em C6/36 a partir de duas amostras de soro dentre 36
pacientes positivos para IgM por ELISA, de um total de 105 amostras analisadas.
Mourão e Cols (2012), dentre 631 pacientes testados, obtiveram 33 positivos por ensaio
imunoenzimático (EIA-ICC) e um confirmado por RT-PCR. Estudos realizados por
Coimbra em 2007 e Talarmin e Cols. em 1998 também corroboram a dificuldade de
isolamento viral observados no presente estudo.
A circulação de outros arbovírus deste gênero não foi detectada. Contudo, em
56
estudo no Pará, em área de influência da Rodovia Cuiabá – Santarém foi relatada
sorologia positiva para EEEV e VEEV em humanos e aves, além do MAYV em
humanos (NUNES et al., 2009), bem como para o EEEV em equinos e para alfavírus
não determinado em jacarés na região da Nhecolândia do Pantanal MS. Neste mesmo
estado, anticorpos neutralizantes para MAYV foram detectados em equinos em 2009 e
2010 (PAUVOLID-CORRÊA et al., 2010; 2013a; 2013b). A ocorrência de alfavírus em
estados adjacentes, aliado ao ambiente favorável para a proliferação de vetores e
presença de população animal e humana susceptível, bem como aves que percorrem
longas distâncias em curto período de tempo e se constituem em hospedeiros
amplificadores para os vírus das encefalites equinas, pode favorecer a dispersão desses
agentes no território Mato-Grossense, enfatizando a importância de estratégias de
vigilância para estas arboviroses.
Este é o primeiro relato de infecção pelo MAYV em residentes de Cuiabá e
região. A detecção de pacientes febris com suspeita de dengue positivos para o MAYV
e negativos para sorotipos do DENV alerta para a importância da inclusão de outros
arbovírus como diagnóstico diferencial de dengue, principalmente durante as epidemias.
A circulação concomitante de DENV e um alfavírus gera preocupações sobre a possível
dispersão do CHIKV no Brasil na iminência de sua introdução. A infecção por CHIKV
apresenta manifestações clínicas indistinguíveis da febre do dengue e febre do mayaro
(STAPLES et al., 2009). Recentemente, o CHIKV foi introduzido no Caribe a partir da
Ásia, sendo este seu primeiro relato no continente Americano (CDC, 2014). A América
Central é considerada uma rota comum de introdução de sorotipos do DENV no Brasil
e, o CHIKV compartilha os mesmos hospedeiros e vetores do DENV.
É importante direcionar e incluir medidas de vigilância e diagnóstico diferencial
de arboviroses, além da dengue e febre amarela no estado, com o intuito de intervir de
forma rápida e efetiva para prevenir e controlar a ocorrência de surtos na população.
Estudos envolvendo vigilância epidemiológica, virológica e entomológica são
necessários para compreender os ciclos de transmissão e a dinâmica das infecções por
alfavírus em MT.
57
7. CONCLUSÕES
A ocorrência de MAYV em pacientes suspeitos de dengue no estado em MT foi
identificada entre residentes de áreas urbanas sem histórico de acesso a áreas
silvestres e rurais;
Evidências moleculares relatadas no presente estudo sugerem a circulação
recente de MAYV em pacientes febris suspeitos de dengue em MT entre 2011 e
2012;
A detecção de pacientes positivos para o MAYV residentes em áreas urbanas,
suas ocupações e a ausência de diferenças entre os sexos, bem como de histórico
de viagem à áreas rurais e silvestres sugerem a transmissão do MAYV em
ambiente urbano;
A detecção de pacientes positivos para MAYV e DENV-4 simultaneamente
sugere co-circulação destes dois arbovírus durante epidemia de dengue em MT;
A detecção de pacientes febris suspeitos de dengue positivos para MAYV e
negativos para DENV sugere a inclusão de MAYV como diagnóstico diferencial
para dengue em MT;
O baixo número de casos identificados neste estudo provavelmente foi
decorrente da viremia transiente em baixos títulos, aliados à sintomatologia
branda da febre do Mayaro, ocasionando menor procura por atendimento médico
pelos pacientes positivos;
Não foi possível identificar ocupação de risco, bem como relação por gênero ou
faixa etária neste estudo, provavelmente pelo pequeno número de pacientes
positivos em relação ao n amostral.
58
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXO I
ANEXO II
ANEXO III
