ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO INTRATÍPICA DE CÊPAS DEPOLIOVIRUS ASSOCIADAS COM A ADMINISTRAÇÃO

DE VACINA SABIN (1)

José Alberto Neves CANDEIAS

CANDEIAS, J. A. N. — Isolamento e identificação intratípica de cêpas de polio-virus associadas com a administração de vacina Sabin. Rev. Saúde públ.,S. Paulo, 3 (2): 183-201, dez. 1969.RESUMO — Estudou-se a taxa de excreção de enterovírus em dois grupos

de crianças de l a 4 anos de idade, que receberam várias doses de vacina Sabin.No primeiro grupo a colheita de fezes foi feita 60 dias após a administraçãoda última dose de vacina e no segundo grupo, passados somente 15 dias. Noprimeiro grupo as porcentagens de isolamento de poliovírus e outros entero-vírus foram, respectivamente, de 12,12% e 13,63%. já no segundo, estas por-centagens foram de 37,61% e 9,17%. Em ambos os grupos foram isolados ostrês tipos sorológicos de poliovírus. As taxas de isolamentos de poliovírus eoutros enterovírus não se mostraram estatìsticamente diferentes, em ambosos grupos, quando relacionadas com o número de doses de vacina recebidas— duas ou menos doses e três ou mais doses. A identificação intratípica dascêpas de poliovirus isoladas foi feita pelos "marcadores" RCT40 e ds. Das 8cêpas isoladas do primeiro grupo, 6 foram identificadas como intermediáriase 2 como cêpas naturais. Estas 2 cêpas foram isoladas das duas únicascrianças que não tinham sido vacinadas contra a poliomielite. Das 41 cêpasisoladas do segundo grupo, 8 foram caracterizadas como intermediárias e 33como ceêpas tipicamente vacinais.

Recebido para publicação em 1-9-1969.(1) Resumo da Tese de docência-livre apresentada à Faculdade de Higiene e Saúde Pública

da USP, em 1969. Da Cadeira de Microbiologia e Imunologia Aplicadas da Faculdadede Higiene e Saúde Pública da USP, São Paulo — Brasil.

I N T R O D U Ç Ã O

Os trabalhos de ARMSTRONG1 (1939),sobre a transmissão experimental da po-liomielite a roedores, abriram caminho pa-ra KOPROWSKI et al.31 (1952) isolaremuma cêpa atenuada de vírus de poliomie-lite do tipo II e para a possibilidade deutilização da mesma, numa tentativa deimunização, por via oral, de um grupo decrianças não protegidas contra a poliomie-lite.

Com a descoberta de ENDERS et al.15

(1949) sôbre a possibilidade de multipli-cação do vírus da poliomielite em cultu-ras celulares, KOPROWSKI et al.30 (1954)viram facilitada sua tarefa de obter umacêpa atenuada de vírus de poliomielite dotipo I, experimentando-a também na imu-nização oral de crianças não imunizadase demonstrando, mais uma vez, sua ino-cuidade e capacidade de desencadear a

formação de anticorpos protetores. Simul-taneamente, investigadores como ROCA--GARCIA et al.45 (1952), ROCA-GARCIA &JERVIS4 4 (1955). ROCA-GARCIA et al.46

(1956); PLOTKIN et al.39 (1959); LI &ScHAEFER3 2 (1954); SABIN4 8 (1955) eCABASSO et al.5 (1960) chegaram a idên-ticos resultados, evidenciando o desenvol-vimento da infecção intestinal capaz delevar à formação de anticorpos séricos.

Também os trabalhos de DULBECCO& Voei14 (1954) e de HSIUNG & MEL-NICK 28 (1955) contribuiram de maneirasaliente para facilitar o estudo de cêpasatenuadas de poliovirus, tanto em têrmosde purificação, como de seleção. Mas, al-guns problemas continuaram exigindo es-tudos cuidadosos, dentre os quais se sa-lientavam os relacionados com o fenôme-no da interferência 4, 39, 42 e com a insta-bilidade genética das cêpas atenuadas dotipo III, com tendência à reversão no sen-tido das cêpas naturais virulentas, apóspassagem pelo intestino 3, 36, 40, 56. Foramestes últimos que começaram a concederaos "marcadores" genéticos uma importân-cia particular.

De acôrdo com um critério estabelecidopor PLOTKIN41 (1962) é possível distri-buir os "marcadores" genéticos em trêsgrandes grupos, conforme o mecanismo im-plicado na sua identificação: no primeiroestão agrupados os "marcadores" eviden-ciáveis por mecanismos ligados à relaçãovírus-célula; no segundo grupo os "mar-cadores" identificáveis pela presença dedeterminada substância no meio nutritivo;finalmente, no terceiro grupo encontram--se os "marcadores" que podem eviden-ciar-se em conseqüência de certas pro-priedades físicas peculiares da partículaviral.

Pertencem ao primeiro grupo os "mar-cadores" representados pelas siglas "S"(plaque size), "RCT" (reproductive ca-pacity temperature), "MS" (designaçãode uma linhagem de culturas de célulasde rim de macaco), "H" (human) e "O"(oxygenation) ; ao segundo grupo os "mar-cadores" representados pelas siglas "m"

(minute), "cr" (cystine response), "d"(delayed), "G" (Guanidine), "HBB" (hy-droxybenzyl-benzimidazole), "Ho" (hor-se), "Bo" (bovine), "1ST" (intra-typicsorodifferentation test) e "ds" (dextranesulfate inhibition) ; no terceiro grupo dePlotkin encontram-se os "marcadores" T(thermo-resistance), E (elution), Al(oH)3 , Aa (adsorption to aluminum pre-cipitates) e A (aluminum chloride).

Os "marcadores" genéticos dos poliovi-rus. pelo menos alguns déles ("d"."RCT40", "1ST" e "A") estão definitiva-mente implantados no arsenal a que é ne-cessário recorrer, não só durante o pro-cesso de produção da vacina atenuada,mas também no processo de avaliação desua inocuidade e nos estudos da estabili-dades das cêpas excretadas por individuosvacinados.

Em relação ao primeiro e segundo as-pectos, estão aqueles ''marcadores" longede corresponder às exigências práticas,uma vez que sua correlação com a neu-rovirulência nem sempre é das melho-res 33, 59.

Já nos trabalhos sôbre a estabilidade ge-nética das cêpas vacinais dos tipos I, IIe III2 0 , 38, 58, excretadas pelos indivíduosvacinados e seus contatos e nas tentativasde esclarecimento da etiologia dos quadrosde poliomielite em crianças vacinadas, al-guns "marcadores" genéticos têm-se mos-trado de certa utilidade.

Nosso objetivo é conhecer, no grupo decrianças estudado, as variações ocorridasnas taxas de eliminação de poliovirus e"oulros enterovirus" e suas relações comos períodos de vacinação; é igualmenteobjetivo conhecer o grau de estabilidadegenética dos poliovirus isolados, atravésdos "marcadores" RCT e ds.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem — Em junho de 1968 foifeito um levantamento do fichário indivi-

dual do Serviço Especial de Saúde deAraraquara (SESA), no sentido de veri-ficar, do total de crianças inscritas, asque, naquela data, tinham idades com-preendidas entre l e 4 anos, inclusive.Deste total foi sorteada, casualmente, urnaamostra, cujo tamanho, por grupo etário,figura na Tabela l. Sempre que eramsorteados um ou mais irmãos de umacriança já escolhida, aquêles eram elimi-nados, decisão tomada deliberadamente,para não se criarem condições que obri-gassem à análise de uma situação parti-cular que diz respeito à disseminação in-tra-familiar de poliovirus excretados porcrianças vacinadas.

ministrada em princípios de dezembro domesmo ano. No ano de 1968, a campa-nha de vacinação processou-se nos mesesde abril, setembro e dezembro. Formamosassim dois grupos de crianças, que desig-namos por grupo A, com 66 indivíduos egrupo B, com 109 indivíduos, com as ca-racterísticas referidas e cuja distribuição,por grupo etário, figura na Tabela 2. Aescolha das crianças que deveriam per-tencer ao grupo A foi feita por sorteio;as crianças não sorteadas ficaram perten-cendo ao grupo B.

Na Tabela 3 foi feita a distribuiçãodas crianças sorteadas de acôrdo com onúmero de doses de vacina recebidas.

Do total de 175 crianças sorteadas fo-ram colhidas amostras de fezes em doismomentos: de 66 crianças, depois de de-corridos, aproximadamente, 60 dias, apósa última dose de vacina, que tinha sidoadministrada em setembro de 1968 e antesda vacinação de dezembro; de 109, depoisde decorridos cêrca de 15 dias após a úl-tima dose de vacina, que tinha sido ad-

Preparação das amostras de fezes —As amostras de fezes, colhidas em peque-nas latas esterilizadas, foram remetidasde Araraquara para São Paulo e, umavez chegadas ao laboratório, congeladasa —20°C para ulterior exame. De cadacriança foi colhida uma só amostra defezes. Depois de descongeladas à tempe-ratura ambiente, foram preparadas de mo-

do a obter-se uma suspensão a 20%, emsolução salina de Hanks contendo 2.000unidades de penicilina sódica e 2 mg deestreptomicina, por ml, 0,01 ml de umasolução de fungizona e 0,01 ml de umasolução de polimixina. Esta suspensão foi

centrifugada a 3.000 r. p. m., em ambien-te refrigerado durante 10 minutos; o so-brenadante foi submetido, novamente, auma centrifugação a 3.000 r.p.m., emambiente refrigerado, durante 20 minu-tos.

Isolamento de vírus — Fêz-se o isola-mento das cêpas de poliovirus e outrosenterovirus, inoculando 0,2 ml de cadasuspensão de fezes em cada um de 2 tu-bos de culturas primárias de células derim de macaco rhesus, de culturas pri-rárias de âmnio humano e de célulasHeLa 54. Estas culturas foram incubadasem quarto estufa, cuja temperatura varia-va entre 36°C e 37°C, durante 15 dias.Os tubos inoculados foram observados ca-da dois dias e o conteúdo daqueles emque se notava efeito citopático, para cadasuspensão de fezes, era misturado e conge-lado a —20°C, para futuras passagens,a fim de se obterem títulos suficiente-mente elevados. Só foram identificadasas amostras de poliovirus; outros entero-virus isolados, não neutralizados pelos so-ros anti-poliovirus, foram agrupados soba designação de "outros enterovirus".

A inoculação das suspensões de fezesnos três tipos de células referidos permiteter uma orientação, quanto à identidadeda cêpa de vírus isolada. Na Tabela 4apresentamos os resultados possíveis.

Identificação de vírus — A tipagemdas cêpas de poliovirus isoladas foi feitapor reações de neutralização segundo téc-nica referida por HAMBLING et al.24

(1963).Os sôros padrões utilizados foram for-

necidos pelo Virus Reference Laboratory,Central Public Health Laboratory, Colin--dale, Londres, com os seguintes títulos:soro anti-poliovirus do tipo I, 1.280; sôroanti-poliovirus do tipo II, 10.000; sôroanti-poliovirus do tipo III, 2.560. Parauso, os sôros eram diluídos em soluçãosalina de Earle, de modo a que em 0,1ml da mistura dos três sôros, existissem50 unidades de cada um dêles. Esta mis-tura mantém-se a —20°C sem alteraçãodo título, durante longos períodos de tem-po. Depois de descongelada e conservadaa 4°C o título não sofre alteração até 3meses.

Caracterização do "marcador" RCT40 —Esta técnica permite avaliar a capacidadedas cêpas de poliovirus se multiplicarema temperaturas acima da chamada tempe-

ratura normal de 37,0°C. As temperatu-ras acima do normal, devem ser para ostipos I e II, 39,8°C e 39,2°C, porque exis-tem algumas cêpas naturais virulentas quenão crescem à temperatura convencionalde 39,8°C, mas fazem-no a 39,2°C; parao tipo III usa-se a temperatura 40,3°C. Aestas temperaturas a multiplicação das cê-pas naturais virulentas não é afetada, aopasso que as cêpas vacinais são quase to-talmente inibidas.

Para a incubação das culturas inocula-das a temperaturas elevadas usamos umbanho-maria aquecido com a unidade"Techne-tempunit", com uma sensibilida-de de ± 0,05°C. Os tubos de culturaeram simplesmente mergulhados no refe-rido banho, depois de colocados em estan-tes de metal e arrolhados conveniente-mente.

Para a execução da prova usamos ascêpas protótipos fornecidas pelo CentralPublic Health Laboratory, Colindale, Lon-dres.

Cada suspensão de vírus foi diluída emmeio 199 desde 10-1 até 10 -8, inoculan-do-se dois tubos de culturas de células derim de macaco rhesus, por diluição. Aofim de quatro dias foi feita a leitura, de-terminando-se a queda do título. Nemsempre é de fácil observação o efeito ci-topático a temperaturas elevadas, mas deum modo geral, êste aparece sob a formade células arredondadas, refringentes, comuma distribuição não focal.

A interpretação dos resultados pode seraceita quando a redução do título do pro-tótipo natural é inferior a 102TCD50/0,1ml e a redução do título da cêpa protó-tipo vacinal é superior a 10ÕTCD50/0,1ml. As leituras podem dar os seguintesresultados: redução do título à tempera-tura elevada (Iog10 < 2) : cêpa natural;redução do título à temperatura elevada(log,o 2-log10 5) : cêpa "intermediária";redução do título à temperatura elevada(logio > 5) : cêpa vacinai.

Caracterização do "marcador" ds — Osulfato de dextrano inibe o crescimento

das cêpas vacinais de poliovirus do tipoI, enquanto a cêpa Mahoney não é afe-tada, chegando, algumas vêzes, a ser esti-mulada discretamente. Os tipos II e IIIcomportam-se de modo irregular, não per-mitindo a utilização desta técnica na suaidentificação intratípica9. Para a exe-cução da prova comparam-se os títulos a37,0°C, em culturas primárias de célulasde rim de macaco rhesus mantidas emmeio 199, com os títulos, à mesma tem-peratura, em iguais culturas mantidas emmeio 199 adicionado de 0,05% de sul-fato de dextrano (1) (P.M. 2 X 106).

Preparamos a solução de sulfato de dex-trano pesando quantidades de 0,5 g, quedistribuímos em pequenos frascos esté-reis. Êste composto mantém-se sem alte-ração à temperatura ambiente e não ne-cessita ser esterilizado. Sempre que eranecessário dissolvíamos aquela quantidadeem 10 ml de meio 199, a 37,0°C, de queusávamos l ml para cada 100 ml de meio199 contendo 3,5 ml de solução de bicar-bonato de sódio a 4,4%. Êste era omeio de dextrano que, um dia antes daexecução da prova, substituía o meio199 em que eram mantidas as culturas.

Para a execução da prova, incluíamosos protótipos Sabin I e Mahoney, de que,juntamente com as amostras a testar, sefaziam diluições de 10-1 a 10-8 em meio199. Um volume de 0,1 ml de cadaamostra era inoculado em dois tubos decultura de células de rim de macaco rhe-sus, mantidas em meio 199 e meio dedextrano a 37,0°C, durante 4 dias. Oresultado da prova é aceitável quando acepa Mahoney apresenta, no meio de dex-trano, um título de ± 100,5TCD50/0,l mlem relação ao título no meio 199; a cêpaSabin I deve ter o título reduzido de101,5TCD50/0,1 ml ou mais.

R E S U L T A D O S

Eliminação de poliovirus e "outros en-terovirus" — Na Tabela 5 apresentamos

(1) Adquirido de Pharmacia, Upsala, Suécia.

a distribuição dos enterovirus isolados dascrianças examinadas e agrupadas no Gru-po A, segundo a idade. Pode verificar-seque 17 amostras de fezes de 66 indivi-duos deram resultado positivo para ente-rovirus em geral, o que corresponde a

uma taxa de 25,75%; 12,12% corres-ponde a poliovirus e 13,63% a "outrosenterovirus". As porcentagens de isola-mento de poliovirus foram, respectiva-mente, de 15,39%; 11,76%; 12,50% e10,00%, nos grupos de 1, 2, 3 e 4 anos.

Para "outros enterovirus" as taxas de iso-lamento foram, respectivamente, 7,69%;5,88%; 25,00% e 15,00%. Aplicándoloteste de Goodman, ao nível de 5%, nãosão significativas as diferenças entre asporcentagens de isolamento de polioviruse "outros enterovirus", em cada grupoetário.

Na Tabela 6 passamos a especificar adistribuição das cêpas de poliovirus iso-ladas das crianças do chamado Grupo A,segundo os tipos sorológicos e as idades.De um total de 8 cêpas isoladas, 4 perten-ciam ao tipo I, uma ao tipo II e 3 aotipo III.

Uma análise semelhante à apresentadaanteriormente figura, para as crianças deGrupo B, nas Tabelas 7 e 8. Pela Tabela7 pode ter-se uma idéia da distribuiçãodos enterovirus isolados e da taxa de iso-lamento, que é da ordem de 46,78% edas taxas de 37,61:% para poliovirus e9,17% para "outros enterovirus". A dis-tribuição pelos grupos de l, 2, 3 e 4 anosno caso dos poliovirus, corresponde res-

pectivamente às taxas de 42,31%, 32,35%,30,76% e 47,82%; no caso de "outrosenterovirus" as porcentagens respectivassão de 7,69%, 2,94%, 11,54% e 17,39%.O teste de Goodman mostra não seremsignificativas estas diferenças, por grupoetário, ao nível de 5%, tanto para polio-virus como para outros enterovirus.

Na Tabela 8 apresentamos a distribui-ção das cêpas de poliovirus, por tipossorológicos e por grupo etário. De umtotal de 109 crianças, com 41 examespositivos, isolaram-se 7 cêpas de polio-virus do tipo I, 10 do tipo II e 24 dotipo III o que corresponde às seguintestaxas de isolamento: 6,42%, 9,17% e22,02%.

Reportando-nos aos dados da Tabela 3 econsiderando como "não vacinadas" ascrianças que receberam duas doses ou me-nos de vacina, comparamos os resultadosdos isolamentos de enterovirus nos gruposA e B, em crianças "não vacinadas" e va-cinadas, sendo estas últimas as que rece-beram três ou mais doses (Tabela 9).

No Grupo A, das 17 crianças, conside-radas como "não vacinadas" isolaram-sepoliovirus em 23,52% de casos e "outrosenterovirus" em 11,76% daquele total; jánas 49 crianças vacinadas, isto é, que re-ceberam três ou mais doses de vacina Sa-bin, aquelas taxas foram, respectivamen-te, 8,16% e 14,28%. Comparando as por-centagens de isolamento de poliovirus e"outros enterovirus" nas chamadas crian-ças "não vacinadas" e nas crianças vaci-nadas, não foram encontradas diferençassignificativas.

No Grupo A, das 8 cêpas de poliovirusisoladas, 2 apresentavam-se com caracte-rísticas de cêpas naturais e as 6 restan-tes com características próprias das cha-madas cêpas "intermediárias"; não se iso-laram cêpas vacinais.

Já no Grupo B, considerando que o nú-mero total de cêpas de poliovirus é maiselevado, tem sentido calcular as taxas decaracterização que são, respectivamente,de 19,51% para as cêpas "intermediárias"e 80,49% para as cêpas vacinais; não seisolaram cêpas naturais.

No Grupo B, as referidas porcentagensforam, nas chamadas "não vacinadas",34,78% e 17,39% e nas vacinadas,38,37% e 6,97%, taxas estas, cujas dife-renças não são significativas.

Diferenciação intratípica — Na Tabe-la 10 englobamos os resultados obtidoscom o emprêgo dos "marcadores" RCT40

e ds. Como já dissemos, os sinais con-vencionais de caracterização das cêpas depoliovirus são (+ ) para as cêpas natu-rais virulentas, (—) para as cêpas vaci-nais e (±) para as cêpas chamadas de"intermediárias".

D I S C U S S Ã O

Eliminação de enterovirus — Os resul-tados apresentados nas Tabelas 5 e 7 dãouma idéia da distribuição dos polioviruse "outros enterovirus" isolados, no con-junto de crianças examinadas, tanto porgrupo etário, como em relação ao momen-to em que foi administrada a última dosede vacina. Em termos globais, enquantono Grupo A a taxa de todos os enterovi-rus foi de 25,75%, no Grupo B foi de46,78%, diferenças que são estatistica-mente significativas. Uma vez que as cri-anças do Grupo B receberam a última

dose de vacina 15 dias antes da colheitade fezes e que, para o Grupo A, êstelapso de tempo foi da ordem de 60 dias,natural seria esperar esta diferença, paraa qual contribuem as cêpas de poliovirusvacinais que estão, neste período, sendoeliminadas 19, 50.

Desde já dois fatos prendem a nossaatenção, o primeiro dos quais diz respeitoà circunstância de, em nenhuma amostrade fezes, ter sido possível identificar maisdo que uma cêpa de vírus: poliovirus ou"outros enterovirus". Frente à infecçãosimultânea do tubo digestivo por duas oumais amostras de vírus, ou ocorre a du-pla infecção, ou, por interferência, umadas amostras exclui as outras. Seria assimde esperar que dentre algumas amostrasde fezes analisadas se levantasse o pro-blema da dupla infecção, o que não ocor-reu, como dissemos. Trata-se de um pro-blema de difícil solução, principalmente,se uma das amostras de vírus não temparticular afinidade para a cultura de cé-lulas onde é feito o isolamento, ou se pos-sui a capacidade de desencadear um efei-to citopático rápido e precoce, impedindoo crescimento da outra amostra. Não obs-tante sempre nos foi possível neutralizaro efeito citopático, das cêpas de poliovirusisoladas; em relação a "outros enterovi-rus", uma vez que não foi feita a tipa-gem não nos é possível garantir que nãoestivessem presentes dois ou mais agentes:o que podemos afirmar é que nenhumacepa de poliovirus estava misturada com"outros enterovirus". A técnica de ino-culação simultânea de cultura de célulasHeLa, células de rim de macaco rhesuse células amnióticas humanas permite, co-mo já dissemos, dar uma orientação a ti-pagem do vírus isolado (Tabela 4).

Parece, então, natural pensarmos no en-contro do fenômeno da interferência, cujaocorrência depende, em parte, da inten-sidade de circulação de enterovirus nacomunidade considerada 43. Os resultadosda presente investigação evidenciam umaelevada taxa de isolamento de enterovirus,em geral, bem como de poliovirus e "outros

enterovirus". Se considerarmos as crian-ças do Grupo A como representando umaamostra da população infantil não sujeitaàs variáveis resultantes de vacinação re-cente, vamos encontrar além da taxa ge-ral de isolamento de enterovirus de25,75%, uma porcentagem de isolamentode poliovirus de 12,12% e de "outros en-terovirus" de 13,63%, cuja análise cons-titui o segundo fato para o qual foi cha-mada nossa atenção. As porcentagens deisolamento de poliovirus de 15,39%,11,76%, 12,50% e 10,00%, bem comoas de "outros enterovirus", da ordem de7,69%, 5,88%, 25,00% e 15,00%, en-contradas, respectivamente, em criançasde l, 2, 3 e 4 anos não diferem estatisti-camente entre si. Se nos reportarmos aosresultados do Grupo B (Tabela 7), emque a colheita de fezes foi feita 15 diasapós receberem a última dose de vacina,repetimos, vamos encontrar uma taxa deisolamento de poliovirus mais elevada, daordem de 37,61% mas também e êste fatoassume, em nosso entender, certa impor-tância, uma taxa de isolamento de "outrosenterovirus" de 9,17% que não difere daencontrada nas crianças do Grupo A. NoGrupo B, as taxas de isolamento, por gru-po etário, de poliovirus da ordem de42,31%, 32,35%, 30,76% e 47,82%, domesmo modo que de "outros enterovirus",da ordem de 7,69%, 2,94%, 11,54% e17,39% não diferem entre si. A dimi-nuição do número de excretores de polio-virus no Grupo A, apesar de não ser sig-nificativa a diferença, pode refletir a exis-tência de um certo grau de imunidadeintestinal: verifica-se que, enquanto nas17 crianças que receberam duas ou me-nos doses de vacina a taxa de isolamentode poliovirus é de 23,52%, nas 49 crian-ças que receberam três ou mais doses estataxa baixou para 8,16% (Tabela 9).MELNICK3 7 (1960) e SABIN50 (1956) re-ferem-se a observações desta natureza.

Estamos, assim, frente a dois grupos decrianças com características diferentes, emtermos do processo vacinai, nas quais,por êste fato, se evidenciam diferentes ta-

xas de isolamento de poliovirus, mas que,em relação a "outros enterovirus" parecemcomportar-se de modo semelhante: ambospatenteiam uma elevada taxa de circula-ção de "outros enterovirus" na comunida-de a que pertencem. No que respeita aospoliovirus não poderia esperar-se diferen-te resultado, em virtude dos momentos emque foi administrada a última dose devacina e feita a colheita de fezes, mas aconstatação da taxa de isolamento elevadade "outros enterovirus", em ambos osgrupos obriga-nos, repetimos, a levantara suspeita de que semelhante situação po-derá interferir com o processo da vaci-nação. Os resultados apresentados na Ta-bela 9, que configuram a experiência fei-ta no sentido de elucidar se o número dedoses de vacina poderia, de algum modo,alterar as taxas de isolamento de polio-virus e "outros enterovirus", amparamtais considerações. No Grupo A não sãoestatisticamente diferentes, como dissemos,as porcentagens de isolamento de polio-virus em crianças que receberam duas do-ses de vacina, ou menos e três ou maisdoses, o mesmo ocorrendo para "outrosenterovirus". No Grupo B não se pode-riam esperar diferenças, pelas razoes ex-postas anteriormente, nos isolamentos depoliovirus, mas no caso de "outros ente-rovirus", também não se observam dife-renças.

As pesquisas quantitativas de elimina-ção de enterovirus só podem ser sólida-mente discutidas, quando se processam es-tudos sorológicos para a determinação donível de anticorpos neutralizantes e es-tudos sôbre o isolamento de enterovirus,o que não nos foi possível respeitar, pordificuldades de ordem técnica. Assim éque sempre poderá argumentar-se que assemelhantes porcentagens de isolamento depoliovirus encontradas, no Grupo A, sedevem a um estado geral de imunizaçãodeficiente de tôdas as crianças, quer te-nham recebido menos de duas doses, duasdoses ou três ou mais doses, o que po-deria evidenciar-se frente à determinaçãodos níveis de anticorpos 25, 36. Mesmo as-

sim, surge a questão de saber quais asrazões que levaram àquele estado de imu-nização deficiente e, dentre a multiplici-dade das mesmas, voltam a salientar-seas ligadas ao fenômeno da interferência.Não devemos esquecer as observações deHALE et al.22 (1959), sôbre a utilizaçãode uma vacina atenuada monovalente dotipo II, que, em certa medida pôde con-trolar uma epidemia do tipo l. Comodevem estar presentes as observações deSABIN49 (1955), segundo as quais a ate-nuação da neurovirulência diminui a ca-pacidade de invasão do aparelho digesti-vo, com o que se criam, em comunidadesde amplas circulações de enterovirus, con-dições que dificultam a fixação das cêpasvacinais.

Numerosos enterovirus são capazes departicipar no fenômeno da interferência2,

4, 1 2 , 18, 23, 26, 43 e é lícito supor que sua

capacidade de ocasionar infecções no ho-mem é variável entre os tipos e cêpas. Aindividualidade das várias espécies de en-terovirus com diferentes capacidades demultiplicação, mais ou menos intensa eduradoura, no tubo digestivo 11, 12, 13,16,

27, 29, deve ter papel importante na seqüên-cia da infecção. O trabalho de GELFANDet al.21 (1960) fornece alguns dados ex-perimentais a respeito daquela caracterís-tica intrínseca. HENRY et al.25 (1966)sugerem que também deve ser importan-te o título do vírus nas fezes, sendo natu-ral imaginar que uma elevada dose infe-tante tenha mais facilidade em vencer umasituação de interferência 42, 51.

As Tabelas 6 e 8 mostram a distribui-ção das cêpas de poliovirus isoladas decrianças dos Grupos A e B, segundo aidade. Nas 66 crianças do primeiro gru-po (Tabela 6) isolaram-se 8 cêpas de po-liovirus, 4 das quais foram Upadas comopertencentes ao tipo I, uma ao tipo II e3 ao tipo III: nota-se um predomínio dostipos I e III, situação já observada poroutros autores 6, 52, 53. Em trabalho rea-lizado anteriormente, CARVALHO 7 (1966)encontrou uma distribuição diferente, compredomínio dos tipos I e II, Ao tratar-

mos, na discussão dos resultados obtidoscom a diferenciação intratípica, de carac-terização das cêpas de poliovirus isoladasno Grupo A, teremos oportunidade de vol-tar ao assunto. No grupo B (Tabela 8)de 109 crianças isolaram-se 41 cêpas depoliovirus, das quais 7 do tipo I, 10 dotipo II e 24 do tipo III, o que correspon-de às porcentagens, já referidas de 6,42%,9,17% e 22,02%.

A análise destes resultados evidencia,em qualquer momento da colheita, 60 ou15 dias após a última dose de vacina, apersistência dos três tipos de poliovirus,sempre com uma predominância do tipoIII. Poderíamos dizer, de acôrdo com apresente observação, que no grupo infan-til examinado, não houve modificação nadifusão das cêpas de poliovirus, nos pe-ríodos intervacinal e de vacinação, mui-to embora, nas crianças do Grupo A, te-nha havido diferenças nas porcentagensde isolamento de poliovirus encontradasnas chamadas "crianças não vacinadas"e "crianças vacinadas", o que, como jádissemos, poderá indicar uma certa imu-nidade tissular local.

Diferenciação intratípica — As 11 cê-pas de poliovirus do tipo I, comparadascom os controles Mahoney e Sabin I, àstemperaturas de 39,8°C e 39,2°C (Tabe-la 10) mostraram-se predominantemente,com características vacinais e "interme-diárias" e, somente, uma cêpa veio aser caracterizada a 39,2°C, cêpa natural.Esta tinha-se mostrado, a 39,8°C, comcaracterísticas "intermediárias", o que de-monstra a necessidade de executar a pro-va do "marcador" RCT40 às duas tempe-raturas referidas, uma vez que algumascepas naturais dos tipos I e II não semultiplicaram à temperatura convencionalde 39,8°C, fazendo-o a 39,2°C10: a cêpa012-68 sofreu a 39,8°C uma redução notítulo (logio) de 2,5, enquanto a 39,2°Cdeu um título (Iog10) de 5,5, do que re-sultou uma redução (logio) de, sòmente,0,5.

O "marcador" ds confirmou o caráternatural da referida cêpa e os caracteresvacinais ou "intermediários" das demaiscepas isoladas, com exceção da cêpa 152--68, que foi caracterizada como "inter-mediária" com o "marcador" RCT40 e va-cinal com o "marcador" ds. COSSART 8

(1967), em trabalhos sobre a caracteri-zação intratípica de cêpas de poliovirus,refere-se à necessidade de utilização demúltiplos "marcadores" que permitam evi-denciar o maior número possível de pro-priedades da partícula viral, com o queserá possível uma melhor caracterização.Os resultados obtidos com a cêpa 152-68parecem exemplificar esta necessidade. Emrelação às chamadas cêpas "intermediá-rias", não existe, até o momento, nenhumteste que permita definir a sua origem,isto é, se se trata de cêpas provenientesda atenuação de cêpas naturais ou da rea-tivação de cêpas vacinais. Em virtudeda boa correlação que obtivemos entre osresultados conseguidos com os "marcado-res" RCT40 e ds, poderíamos suspeitar,então, frente ao resultado com o "marca-dor" RCT40, que se tratava de uma cêpa"intermediária" de origem vacinai.

As onze cêpas de poliovirus do tipo IIevidenciaram, sòmente, características decêpas vacinais e "intermediárias"; a in-cubação à temperatura de 39,2°C não al-terou o resultado, no sentido da evidencia-ção de cêpas naturais, muito embora te-nha conferido a um grande número decêpas com características vacinais a 39,8°C,a característica "intermediária": das 8cepas vacinais, sòmente 2 se mantiveramcomo tal a 39,2°C. Não existem elemen-tos para supor que esta observação possaindicar que as cêpas de caráter "inter-mediário" sejam cêpas vacinais em trans-formação no sentido natural.

Finalmente a caracterização das 27cepas de poliovirus do tipo III, mediantea utilização do "marcador" RCT40 a 40,3°Crevelou uma grande maioria de cêpas va-cinais, algumas cêpas "intermediárias" euma só cêpa natural.

A caracterização de todas as cêpas depoliovirus dos tipos I, II e III, englobadana Tabela 10, em relação aos Grupos A eB, fornece informações que nos pareceinteressante ressaltar. Em primeiro lugar,as 2 cêpas naturais identificadas comodos tipos I e III, só foram isoladas noGrupo A, isto é, no grupo de crianças,cujas fezes foram colhidas durante o pe-ríodo intervacinal e, dentre estas, dasduas únicas que não tinham sido vacina-das (Tabela 3). Em segundo lugar, nestemesmo grupo, não se isolaram cêpas comcaráter vacinal e puderam caracterizar--se 6 cêpas "intermediárias", de um totalde 8 cêpas. Evidenciou-se, assim, no gru-po que corresponde a um período inter-vacinal, a circulação de poliovirus natu-rais de dois tipos antigênicos e de cêpas"intermediárias", não sendo possível de-tectar a persistência de cêpas vacinais. Aidentificação de poliovirus naturais dostipos I e III autoriza-nos a considerar queas campanhas de vacinação a que estive-ram sujeitas as crianças do Grupo A,só parcialmente, conseguiram modificarcertas condições ecológicas que deveriamdificultar a circulação de cêpas naturais.ROMANO & ALBANESE 47 (1966) referem--se a situação semelhante.

Considerações da mesma ordem, exten-sivas ao Grupo B, mostram um panoramadiferente, com uma predominância nítidade cêpas vacinais, 33 cêpas, num total de41 exames positivos e, somente, 8 cepascom características "intermediárias". Nes-tas condições as cêpas naturais parecemter sido excluídas por interferência dascêpas vacinais ou "intermediárias" 17, 19.

Note-se, por outro lado, a diferençaacentuada na taxa de isolamento de cêpas"intermediárias" no Grupo A, da ordemde 75,00% e no Grupo B, da ordem de19,51%, o que poderia levantar suspeitas,se levarmos em consideração o momentoda colheita das amostras de fezes, sôbreuma possível reversão das cêpas vacinais 36.É, efetivamente, uma mera suspeita, umavez que não dispomos de elementos capa-zes de distinguir uma cêpa vacinal que

tenha sofrido alterações, após multipli-cação na mucosa do intestino, de umacêpa natural virulenta. Como, do mesmomodo, não é possível saber, em que me-dida, uma cêpa com características "in-termediárias", seja qual fôr a sua origem,manter-se-á estável, uma vez que desco-nhecemos quais os fatores ecológicos queintervém nas modificações da virulênciados poliovirus.

O problema da reversão tem, realmente,um interesse mais de caráter teórico, doque prático, quando se considera a utili-zação da vacina atenuada em campa-nhas de âmbito não restrito, visto que oestabelecimento da imunidade se proces-sa mais rapidamente do que as possíveisalterações sofridas pelas cêpas vacinais 61.Por sua vez a imunidade humoral e aresistência local desenvolvida ao nível dasmucosas intestinal e faríngea, conduzemà restrição da circulação das cêpas de po-liovirus. O grau desta restrição vai de-pender da natureza e intensidade do con-tato, processando-se de modo diferente, noambiente familiar e extra-familiar 19, 34, 60.Nossos resultados não permitem estabele-cer a ocorrência do fenômeno da reversãonas cêpas isoladas, no grupo de criançasestudado, como, igualmente, não permi-tem avaliar a natureza e intensidade docontato, mas a elevada porcentagem decepas "intermediárias" e o isolamento deduas cêpas de poliovirus naturais, dos ti-pos I e III, levam a pensar na necessida-de de consideração de determinado aspec-to de vacinação. Trata-se da administra-ção, simultânea, da vacina a todos osmembros, não imunes, da família, inde-pendentemente, da idade, com a finali-dade de protegê-los do contágio por cêpasvacinais ou sua progenie 34, 55.

Mais importante do que a reversão daspropriedades patogênicas das cêpas vaci-nais é o fenômeno da interferência entreas cepas naturais de poliovirus e as cê-pas vacinais ou entre estas e outros entero-virus, assim como entre os três tipos de po-liovirus 57, 58. Após a administração da va-cina trivalente, podem isolar-se, passados

poucos dias, um ou dois tipos sorológicosde poliovirus; o terceiro tipo costumaaparecer passadas algumas semanas, o quepode corresponder a uma situação de la-tência ou a um processo infeccioso de mí-nima intensidade, ou, simplesmente, a umasituação de interferência. Nossos resul-tados são exemplo desta situação, pois decada criança examinada, tanto no GrupoA, como no Grupo B, só foi possível iso-lar um tipo de poliovirus. Em relaçãoao Grupo A, êste fato poderia ser expli-cado com a simples aceitação de que, emcada uma das crianças do grupo, só umdos três tipos sorológicos de poliovirus quecirculavam na comunidade teve oportuni-dade de colonizar as células de seu tubo di-gestivo. Já em relação ao Grupo B, dadoque as crianças tinham sido recentemen-te vacinadas, não são de fácil explicaçãonossas observações sôbre o isolamento deum ou outro dos três tipos de vírus exis-tentes na vacina tríplice. Poderá tratar--se, como dissemos, de latência, infecçãoem nível mínimo ou interferência o quenão nos parece possível esclarecer, dadoque nossos resultados se baseiam no examede material proveniente do intestino. Nãopodemos afirmar que, se tivéssemos colhidomaterial da orofaringe das crianças exami-nadas, não fôssemos encontrar um ou maistipos sorológicos diferentes do isolado12.Mesmo assim, a persistência de taxas eleva-das de "outros enterovirus", que observa-mos em ambos os grupos, apesar dascampanhas de vacinação a que estiveramsujeitas as crianças estudadas, contrària-mente ao descrito por SABIN et al.5l

(1960), obriga-nos a considerar que al-guns de nossos resultados podem seruma demonstração do interêsse práticoque o fenômeno da interferência podeter na vacinação com poliovirus atenua-dos.

C O N C L U S Õ E S

Em face da discussão dos resultadosobtidos, afigura-se-nos, como conclusãobásica de nosso trabalho, a observação

segundo a qual, os dois grupos de crian-ças estudados só se comportaram de mo-do diferente, quando comparados em têr-mos das taxas de isolamento de poliovi-rus e sua caracterização intratípica, comocepas naturais. Mais especìficamente:

1. A taxa de isolamento de polio-virus, no grupo de crianças cujas fezesforam colhidas no período intervacinal(12,12%), é estatìsticamente diferente daobservada no grupo de crianças cujas fe-zes foram colhidas 15 dias após a admi-nistração da última dose de vacina(37,61%).

2. A taxa de isolamento de "outrosenterovirus", no grupo de crianças cujasfezes foram colhidas no período interva-cinal (13,63;%), não difere estatìstica-mente da observada no grupo de criançascujas fezes foram colhidas 15 dias apósa administração da última dose de vaci-na (9,17%).

3. As taxas de isolamento de polio-virus, no grupo de crianças cujas fezesforam colhidas no período intervacinal,não diferem estatìsticamente, quando com-parados os resultados obtidos com as cha-madas "crianças não vacinadas" (8,16%)e as crianças vacinadas (23,52%).

4. As taxas de isolamento de "outrosenterovirus", no grupo de crianças cujasfezes foram colhidas no período intervaci-nal, não diferem estatìsticamente, quandocomparados os resultados obtidos com aschamadas "crianças não vacinadas"(11,76%) e as crianças vacinadas(14,28%).

5. As taxas de isolamento de poliovi-rus, no grupo de crianças cujas fezes fo-ram colhidas 15 dias após a administra-ção da última dose de vacina, não dife-rem estatisticamente, quando comparadosos resultados obtidos com as chamadas"crianças não vacinadas" (34,78%) e ascrianças vacinadas (38,37%).

6. As taxas de isolamento de "outrosenterovirus", no grupo de crianças cujasfezes colhidas 15 dias após a administra-ção da última dose de vacina, não dife-rem estatisticamente, quando comparadosos resultados obtidos com as chamadas"crianças não vacinadas" (17,39%) e ascrianças vacinadas (6,97%).

7. Isolaram-se os três tipos sorológi-cos de poliovirus em qualquer dos gruposestudados.

8. Do total de cêpas de poliovirus iso-ladas, sòmente duas foram caracterizadasintratipicamente, como cêpas naturais; seuisolamento foi feito a partir das fezes dasduas únicas crianças que não receberamdose alguma de vacina atenuada.

CANDEIAS, J. A. N. — Isolation andintratypical identification on poliovirusstrains following the administration ofSabin vaccine. Rev. Saúde públ., S.Paulo, 3(2) :183-201, dez. 1969.

SUMMARY — The author studied theincidence of enterovirus excretion in 2groups of children aged between 1 and4 years, who had been given varying dosesof Sabin polio vaccine. In the first groupfaeces were collected 60 days and in thesecond group 15 days after the last doseof vaccine had been given. In the firstgroup 12,12% yielded poliovirus and13,63% yielded "other enteroviruses"; inthe second group the percentages were37,61% and 9,17%. In both groups allthree serological types of poliovirus wereisolated. The previous vaccination statusof the children in both groups, whethervaccinated with two or less or three ormore doses, did not have a statisticallysignificant effect on the subsequent virusisolations. The strains of poliovirus isolat-ed were examined by the RTC40 and dex-tran markers. Of the 8 strains isolatedfrom the first group 6 were identified as

intermediate strains and 2 as wild strains.These 2 were isolated from the only 2children who had received no vaccine atall. Of the 41 strains isolated from thesecond group 8 were intermediate andthe rest were typical vaccine strains.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. ARMSTRONG, C. — The experimentaltransmission of poliomyelitis to theeastern cotton rat, Sigmond hispidus his-pidus. Publ. Hlth Rep., 54:1719-1721,Sept. 1939.

2. ARUMANAYAGAM, P. — Mass immuni-zation against poliomyelitis in Ceylonin 1962, using Sabin oral vaccine. J.trop. Med. Hyg., 68:105-109, May 1965.

3. BARON, S. et al. — Laboratory inves-tigations of the attenuated poliovirusvaccine strains. II. Tissue culture cha-racteristics before and after gastro-intes-tinal passage. In: INTERNATIONALConference on Live Poliovirus Vaccines.2nd, Washington, B.C., I960. Wash-ington, D.C., PAHO, 1960. p. 124-131.

4. BENYESH-MELNICK, M. et al. — Po-liomyelitis infection rate among Mexicanchildren fed attenuated poliovirus vac-cine. In: INTERNATIONAL Conferenceon Live Vaccines. 1st, Washington, D. C.,1959. Washington, D.C., PAHO, 1959.p. 272-285.

5. CABASSO, V. J. et al. — Cumulativetesting experience with consecutive lotsof oral poliomyelitis vaccine. Brit. Med.J., 1:373-387, Feb. 1960.

6. CANDEIAS, J. A. N. et al. — Pesquisade enterobacteriáceas e enterovirus emcrianças normais e com quadros diarréi-cos agudos. Rev. Saúde públ., S. Paulo,2:194-206, dez. 1968.

7. CARVALHO, R. P. S. — Contribuiçãopara o estudo dos enterovirus. Foliaclin, biol., S. Paulo, 35:1-47, jan./jun.1966.

8. COSSART, Y. E. — Genetic markerstudies of poliovirus. I. Natural vari-ation. II. Strains isolated from casesof poliomyelitis associated with theadministration of live attenuated vacci-ne. J. Hyg., Cambridge, 65:67-76, 77-84,Mar. 1967.

9. COSSART, Y. E. — Marker studies ofpoliovirus. Nature, 211:1432, Sept. 1966.

10. COSSART, Y. E. — Genetic markerstudies on poliovirus type I strains fromthe Blackburn poliomyelites outbreak in1965. J. Hyg., Cambridge, 66:513-518,Dec. 1968.

11. CRAIG, D. E. & BROWN, G. C. —The relationship between poliomyelitisantibody and virus excretion from thepharynx and anus of orally infectedmonkeys. Amer. J. Hyg., 96:1-2, Jan.1959.

12. DARDONI, L. et al. — Somministra-zione di virus polio I attenuate LSC diSabin a bambini viventi in comunitácon alta frequenza di infezioni entero-virali. Riv. 1st. sieroter. ital., 35:425--429, feb. 1960.

13. DOMOK, I. et al. — Virus excretion aftermass vaccination with attenuated polio-viruses in Hungary. Brit. Med. J., 1:1410-1417, May 1961.

14. DULBECCO, R. & VOGT, M. — Plaqueformation and isolation of pure lineswith poliomyelitis viruses. J. exp. Med.,99:167-182, Jan. 1954.

15. ENDERS, J. F. et al. — Cultivationof the Lasing strain of poliomyelitisvirus in cultures of various embryonictissues. Science, 109:85-87, Jan. 1949.

16. EVANS, C. A. — Factors influencingthe occurrence of illness during natu-rally acquired poliomyelitis virus infec-tions. Bact. Rev., 24:341-352, Dec. 1960.

17. FOX, J. P. — Epiodemiology of polio-myelitis in populations before and aftervaccination with inactivated viruses. In:INTERNATIONAL Poliomyelitis Confer-ence. 4th, Geneva, 1957. Philadelph'a,Lippincott, 1958. p. 136.

18. FOX, J. P. — Epidemiological aspectsof Coxsackie and ECHO virus infectionsin tropical areas. Amer. J. publ. Hlth,54:1134-1142, July 1964.

19. FOX, J. P. et al. — The spread ofvaccine strains of poliovirus in thehousehold and in the community in Sou-thern Louisiana. In: INTERNATIONALPoliomyelitis Conference. 5th, Copenha-gen, 1960. Philadelphia, Lippincott, 1961.p. 368-383.

20. FROESCHLE, J. E. et al. — A continu-ing surveillance of enterovirus infectionin healthy children in six United Statescities. II. Surveillance enterovirus iso-lates 1960-1963 and comparison withenterovirus isolates from cases of acutecentral nervous system disease. Amer.J. Epidem., 83:455-469, May 1966.

21. GELFAND, H. M. et al. — The sus-ceptibility of infants to infection withnatural ("wild") and attenuated (vac-cine) strains of polioviruses. In: INTER-NATIONAL Poliomyelitis Conference. 5th,Copenhagen, 1960. Philadelphia, Lippin-cott, 1961. p. 285-289.

22. HALE, J. H. et al. — Large-scale useof Sabin type I attenuated poliovirusvaccine in Singapore during a type Ipoliomyelitis epidemic. Brit. Med. J., 1:1541-1549, June 1959.

23. HALE, J. H. et al. — A study of inter-ference among enteroviruses during amass immunization campaign weithattenuated poliovirus type 2. In: INTER-NATIONAL Poliomyelitis Conference. 5th,Copenhagen, 1960. Philadelphia, Lippin-cott, 1961. p. 336-341.

24. HAMBLING, M. H. et al. — The typingof enteroviruses in tissue culture byneutralization with composite antiserumpools. J. Hyg., Cambridge, 61:479-484,July 1963.

25. HENRY, J. L. et al. — A study ofpoliovacination in infancy: excretionfollowing challenge with live virus bychildren given killed or living poliovac-cine. Ibdem, 64:105-120, Mar. 1966.

26. HINUMA, Y. et al. — Two outbreaksof ECHO 14 infection: a possible inter-ference with oral poliovirus vaccine anda problabe association with aseptic me-ningitis. Ibdem, 63:277-284, June 1965.

27. HOWE, H. A. & BODIAN, D. — Iso-lation of poliomyelitis virus from thethroats of symptomless children. Amer.J. Hyg., 45:219-222, Mar. 1947.

28. HSIUNG, G. D. & MELNICK, J. L. —Plaque formation with poliomyelitis,Coxsackie and Orphan (ECHO) virusesin bottle cultures of monkey epithelialcells. Virology, 1:533-535, Dec. 1955.

29. KOGON, A. et al. — The virus watchprogram: a continuing surveillance ofviral infections in Metropolitan NewYork families. VII. Observations on viral

excretion, seroimmunity, intrafamilialspread and illness association in Coxsa-ckie and ECHO infections. Amer. J.Epidem., 89:51-61, Jan. 1969.

30. KOPROWSKI, H. et al. — Adminis-tration of an attenuated type I polio-myelitis virus to human subjects. Proc.Soc. exp. Biol., New York, 86:244-250,June 1954.

31. KOPROWSKI, H. et al. — Immune res-ponse in human volunteers upon oraladministration of a rodent adapted strainof poliomyelitis virus. Amer. J. Hyg.,55:108-126, Jan. 1952.

32. LI, C. P. -& SCHAEFFER, M. — Iso-lation of a non-neurotropic variant oftype I poliomyelitis virus. Proc. Soc.exp. Biol,, New York, 87:148-153, Oct.1954.

33. LWOFF, A. — Mutations affecting neu-rovirulence. In: INTERNATIONAL Polio-myelitis Conference. 5th, Copenhagen,1960. Philadelphia, Lippincott, 1961. p.13-20.

34. MACDONALD, D. & DEIBEL, R. —Serodifferentiation of type 3 poliovirusstrains isolated 1960-1965 from patientsand healthy vaccines. Amer. J. Epidem.,87:396-410, Mar. 1968.

35. MARINE, W. M. et al. — Limitationof fecal and pharyngeal poliovirus ex-cretion in Salk-vaccinated children. Afamily study during a type I poliomyeli-tis epidemic. Amer. J. Hyg., 76:173-195,Nov. 1962.

36. MELNICK, J. L. & BENYESH-MELNICK,M. — Problems associated with live po-liovirus vaccine and its progeny aftermultiplication in man. In: INTERNA-TIONAL Conference on Live PoliovirusVaccines. 2nd, Washington, B.C., 1960.Washington, D.C., PAHO, 1960. p. 12--27.

37. MELNICK, J. L. — Problems associatedwith the use of live poliovirus vaccine.Amer. J. publ. Hlth., 50:1013-1031, July1960.

38. MELNICK, J. L. — Attenuated polio-virus vaccine: virus stability. In: IN-TERNATIONAL Poliomyelitis Conference.5th, Copenhagen, 1960. Philadelphia, Lip-pincott, 1961. p. 384-402.

39. PLOTKIN, S. A. et al. — Clinical trialsin infants orally administred attenuatedpoliomyelitis viruses. Pediatrics, 23:1041--1062, June 1959.

40. PLOTKIN, S. A. et al. — A type IIIattenuated poliovirus genetically stableafter human intestinal passage. Proc.Soc. exp. Biol., New York, 107:829-834,May/Sept. 1961.

41. PLOTKIN, S. A. et al. — The polio-viruses of man. Ann. N. Y. Acad. Sci-,101:357-389, Nov. 1962.

42. RAMOS ALVAREZ, M. et al. — Viraland serological studies in childrenimmunized with live poliovirus vaccine.Preliminary report of a large trial con-ducted in Mexico. In: INTERNATIONALConference on Live Poliiovirus Vaccines.1st, Washington, B.C., 1959. Wash-ington, B.C., PAHO, 1959. p. 483-496.

43. RAMOS ALVAREZ, M. & SANTOS, F.G. — Influence of interfering entero-viruses. Laboratory and field studiesin Mexico with Sabin's live poliovirusvaccine. In: INTERNATIONAL Polio-myelitis Conference. 5th, Copenhagen,1960. Philadelphia, Lippincott, 1961. p.322-335.

44. ROCA-GARCIA, M. & JERVIS, G. A. —Experimentally produced poliomyelitisvariant in chick embryo. Ann. N. Y.Acad. Sci., 61:911-922, Sept. 1955.

45. ROCA-GARCIA, M. et al. — Poliomye-litis. II. Propagation of MEF 1 strainof poliomyelitis virus in developing chickembryo by yolk sac inoculation. Proc.Soc. exp. Biol., New York, 81:519-525,Nov. 1952.

46. ROCA-GARCIA, M. et al. — Immuniza-tion of humans with a chick embryoadapted strain of MEF1 poliomyelitis vi-rus. J. Immunol., 77:123-131, Aug. 1956.

47. ROMANO, N. & ALBANESE, M. —Sull-isolamento di poliovirus selvaggi inpopolazioni estesamente vaccinate. G.Mai. infett., 18:575-578, set. 1966.

48. SABIN, A. B. — Characteristics of ge-netic pontencialities of experimentallyproduced and naturally occuring variantsof poliomyelitis virus. Ann. N. Y. Acad.Sci., 61:924-939, Sept. 1955.

49. SABIN, A. B. — Immunization of chim-panzees and human beings with avirulentstrains of poliomyelitis virus. Ann. N.Y. Acad. Sci., 61:1050-1056, Sept. 1955.

50. SABIN, A. B. — Present status ofattenuated live virus poliomyelitis vac-cine. J.A.M.A., 162:1589-1596, Dec.1956.

51. SABIN, A. B. et al. — Live orally givenpoliovirus vaccine. Effects of rapid massimunization on population under con-ditions of massive enteric infection withother viruses. J.A.M.A.. 173:1521-1526,Aug. 960.

52. SCHATZMAYR, H. G. & COSTA, L. T.— Isolamento do virus da poliomielitea partir de material de garganta emuma comunidade rural. Bol. Inst. Fuer.Univ. Brasil, 22:135-138, agô./dez. 1965.

53. SCHATZMAYR, H. G. ,& COSTA, L. T.Poliomielite. I. Aspectos virológicos deuma população infantil. Bol. Inst. Fuer.Univ. Brasil, 23:35-42, abr. 1966.

54. SHERER, W. F. et al. — Studies on thepropagation in vitro of poliomyelitis vi-ruses. V. Viral multiplication in a stablestrain of human malignante epithelialcells (strain HeLa) derived from an epi-dermoid carcinoma of the cervix. J. exp.Med., 97:695-710, May 1953.

55. SMORODINTSEV, A. A. et al. — Ma-terial on the immunological and epide-miological effectiveness of live polio-myelitis vaccine. In: INTERNATIONALConference on Live Poliovirus Vaccines.2nd, Washington, D.C. , 1960. Washing-ton, D.C., PAHO, 1960. p. 482-501.

56. VERLINDE, J. D. & WILTERDINCK,J. B. — Epidemiological and virologicalsurvey following oral administration oflive poliovirus vaccine. In: INTERNA-TIONAL Conference on Live PoliovirusVaccines. 2nd ed., Washington, D.C.,1960. Washington, B.C., PAHO, 1960.p. 134-142.

57. VOROSHILOVA, M. K. et al. — Viro-logic and serologic investigations of chil-dren immunized with trivalent live vac-cine from A. B. Sabin's strains. In:INTERNATIONAL Conference on LivePoliovirus Vaccines. 2nd, Washington,B.C., 1960. Washington, B.C., PAHO,1960. p. 240-269.

58. VONKA, V. et al. — A new type IIIattenuated poliovirus for possible use inoral poliovirus vaccine. Progr. med. Vi-rol., 9:204-255, 1967.

59. WALLIS, C. et al. — Bifferentation andseparation of attenuated and virulentpolioviruses by adsorption to aluminiumsalts. Amer. J. Hyg., 77:250-257, May1963.

60. ZÁBEK, K. et al. — Mass oral (Sabin)poliomyelitis vaccination. Virological andserological surveillance in Czechoslova-kia 1958-1959 and 1960. Brit. Med. J.,1:1091-1098, Apr. 1962.

61. ZHDANOV, V. M. et al. — Large-scalepractical trials and use of live polio-virus vaccine in the USSR. In: INTER-NATIONAL Conference on Live Poliovi-rus Vaccines. 2nd, Washington, B.C.,1960. Washington, B.C., PAHO, 1960.p. 576-588.