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1
JAQUELINE FERREIRA SILVA
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA E PÓS-ACIDIFICAÇÃO DE
LEITES FERMENTADOS COMERCIALIZADOS EM BARRA DO GARÇAS-MT
BARRA DO GARÇAS – MT
2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CÂMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
2
JAQUELINE FERREIRA SILVA
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA E PÓS-ACIDIFICAÇÃO DE
LEITES FERMENTADOS COMERCIALIZADOS EM BARRA DO GARÇAS-MT
Monografia apresentada à banca examinadora
do Curso de Engenharia de Alimentos do Campus
Universitário do Araguaia – UFMT, como requisito
para obtenção do título de Bacharel em Engenharia de
Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Keily Alves Moura de
Oliveira
BARRA DO GARÇAS – MT
2019
3
F383c Ferreira Silva, Jaqueline.
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA E PÓS-ACIDIFICAÇÃO DE LEITES FERMENTADOS COMERCIALIZADOS EM BARRA DO GARÇAS-MT / Jaqueline Ferreira Silva. -- 2019
35 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientadora: Keily Alves de Moura Oliveira. TCC (graduação em Engenharia de Alimentos) - Universidade Federal de Mato
Grosso, Instituto de Ciências Exatas e da Terra, Barra do Garças, 2019. Inclui bibliografia.
1. Leite fermentado. 2. Viabilidade de bactérias láticas. 3. qualidade. I. Título.
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos
pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
4
JAQUELINE FERREIRA SILVA
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA E PÓS-ACIDIFICAÇÃO DE
LEITES FERMENTADOS COMERCIALIZADOS EM BARRA DO GARÇAS-MT
Monografia julgada e aprovada,
como requisito parcial para a
obtenção do título de Bacharel em
Engenharia de Alimentos no
Campus Universitário do Araguaia –
UFMT.
Barra do Garças – MT
2019
5
AGRADECIMENTOS
Meus agradecimentos:
Primeiramente agradeço a Deus por ter me guiado e protegido neste período da
minha vida que sonhei desde criança, me dando força e sabedoria à cada dia.
Aos meus pais, meu pai Miguel Ferreira pelo apoio e sempre sonhar um futuro que
ele não teve a oportunidade de ter e com isso fez o possível para que eu tivesse e minha
mãe Geni Luiz que sempre foi um incentivo e pelas orações para a conclusão desta
caminhada.
A minha irmã Pauliana Ferreira que sempre foi aquela amiga companheira que me
apoiou e esteve do meu lado durante está jornada. E meu namorado Marcos Vinicius pelo
amor, carinho e ombro disponíveis para amparo durante os momentos de dificuldades.
À minha orientadora Prof. Dra. Keily Alves de Moura Oliveira pela confiança e
atenção durante o período de pesquisa e nos momentos de dúvida disponibilizando o
tempo necessário para esclarecer as mesmas. Obrigada pela chance de trabalhar com você
que é um exemplo de profissional e pelos ensinamentos que levarei para a vida toda.
Aos professores Dr. Glauco Vieira de Oliveira e Dra. Karina da Silva Chaves pela
contribuição para realização deste trabalho.
Aos alunos Júlia, Marcel, Keila, Sabrina, Ladislayne e a técnica Vanessa pelos
auxílios durante o processo experimental.
À minhas amigas Keyle, Carmem, Daniele, Caroline, Gabriele, Ilma, Bruna,
Nágella pela amizade, companheirismo e paciência com a minha ansiedade. Que sempre
quando precisei de um direcionamento ou apenas um “CALMA JAQUE!” estiveram do
meu lado dando o apoio que precisei. Especialmente a Keyle, Daniele e Caroline que
durante o período mais difícil da minha vida estenderam as mãos e me ajudaram a não
desistir dos meus sonhos.
E a todos que torceram e oraram pelo meu sucesso que não citei, meus sinceros
agradecimentos.
6
RESUMO
Os probióticos são amplamente empregados na indústria de laticínios por estar
relacionados à reestruturação e à manutenção da microbiota intestinal e na prevenção de
doenças. Os leites fermentados são produtos resultantes da fermentação do leite
pasteurizado ou esterilizado, por fermentos láticos próprios, mediante ação de cultivos de
micro-organismos específicos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar as
características físico-químicas e microbiológicas de leites fermentados adquiridos em
supermercados da cidade de Barra do Garças-MT. Para tanto foram realizados análises
físico-químicas de pH e acidez titulável, e análises microbiológicas para coliformes a
30ºC e coliformes termotolerantes (NMP) e contagem total de fungos e leveduras e
bactérias láticas e detecção de Salmonella sp. Todas as marcas apresentaram valores de
acidez dentro do preconizado pela legislação vigente. Quanto à contagem de bactérias
láticas totais, somente umas das amostras não atendeu ao padrão recomendado durante o
período de estocagem avaliado. Os leites fermentados atenderam os requisitos
estabelecidos pela legislação, nos parâmetros físico-químicos e microbiológicos do ponto
de vista de segurança dos alimentos. Na enumeração de bactérias láticas, o número de
células viáveis apresentou-se dentro dos requisitos estabelecidos ao final da vida de
prateleira do produto, exceto para a marcas C. Nota-se a necessicadade de uma maior
fiscalização por parte dos responsáveis para que o consumidor não seja enganado ao
comprar produtos fora dos padrões estabelecidos por legislação.
Palavra-chave: Leite fermentado, viabilidade de bactérias láticas, qualidade.
7
ABSTRACT
Probiotics are widely used in the dairy industry as they are related to the restructuring and
maintenance of intestinal microflora and disease prevention. Fermented milks are
products resulting from the fermentation of pasteurized or sterilized milk by specific
lactic fermentations, through the action of specific microorganisms. The present work had
the objective evaluating the physical-chemical and microbiological characteristics of
fermented milks acquired in supermarkets of Barra do Garças-MT city. Physical and
chemical analyzes of pH and titratable acidity and microbiological analyzes were
performed for coliforms at 30ºC and thermotolerant coliforms (MPN) and total counts of
fungi and yeasts and lactic bacteria and detection of Salmonella sp. All the brands
presented values of acidity in the one recommended by the current legislation. Regarding
the total lactic acid bacteria count, only one of the samples did not meet the
recommended standard during the evaluated storage period. The fermented milks met the
requirements established by the legislation, in the physical-chemical and microbiological
parameters from the point of view of food safety. In the lactic bacteria enumeration, the
number of viable cells was within the requirements established for the end of shelf life of
the product, except for the C marks. Note the need for greater supervision by those
responsible so that the consumer is not deceived when buying products outside the
standards established by legislation.
Keyword: Fermented milk, viability of lactic bacteria, quality.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Imagem ilustrativa das reações ocorrentes na fermetação lática, onde A
representa a homofermentação e B representa a
heterofermentação…......................................................................................................…14
Figura 2. Fluxograma de produção de leite fermentado…………..………….………….19
Figura 3. Produtos que apresentaram precipitação durante o período de validade...……27
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Padrão estabelecido pela instrução normativa nº 46, para micro-organismos…….20
Tabela 2. Avaliação microbiológica de leites fermentados comercializados em
supermercados de Barra do Garças-MT……………………..………………………….......25
Tabela 3. Caracterização físico-química de leites fermentados comercializados em
supermercados de Barra do Garças-MT……………………………………………………26
Tabela 4. Viabilidade das bactérias láticas encontradas nos leites fermentados durante a vida
de prateleira………….…...................................................………………………..………..28
10
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………………………...….....………………………………..11
2. OBJETIVOS……..…………………...………….…………..……….……......12
2.1 Objetivos gerais…………...……….……….......……...……..………...…12
2.2 Objetivos específicos……...……………....………...…………………....12
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.……………………………………….…...…13
3.1 Histórico………………….....……………..…………………...…..…...13
3.1.1. Fermentação…............……………………………………....…….…13
3.1.2. Tecnologia de produção…….................................………..…………14
3.1.3.Segurança sanitárias dos alimentos…….............……………………...15
3.2 Leites fermentados………………….......…….………...………..…........16
3.2.1. Histórico………………………...........………………..…………….17
3.2.2. Alegação funcional……............……...…………………………..….17
3.2.3. Caracterização química, nutricional e microbiológica ….....................18
3.2.5. Contaminantes…………..………............………………………...…20
4. MATERIAIS E MÉTODOS.……………………………….....……..……21
4.1 Análise físico-química….....……….....……………………..………....21
4.1.1. pH………………...……..........…………………………….……….21
4.1.2. Acidez titulável……............…………………………….…………..21
4.2 Análises microbiológicas……...…………………….....………..…….....22
4.2.1. Diluições seriadas decimais……..........................…………..……....22
4.2.1.1 Coliformes a 30ºC e termotolerantes…............……………..22
4.2.1.2 Detecção de Salmonella sp…….......................…………...…22
4.2.1.3 Contagem total de fungos e leveduras…..............…..............23
4.2.1.4 Contagem de bactérias láticas…….............…………............23
4.3 Análise estatística...........……………………............………….……....24
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES..…………………………………..…..25
6. CONCLUSÃO………………….………………...…………………….....30
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS….………..……………..……..………..31
11
1. INTRODUÇÃO
Com o avanço da ciência e acesso a informação a população têm apresentado
novos hábitos alimentares, visando uma melhoria da saúde e com isso buscam por
alimentos que contribuem para uma melhor qualidade de vida e mais saudável (REIS,
2014). Atualmente os consumidores não avaliam só as características de sabor, aroma,
aparência e padronização do alimento, mas também a preocupação em adquirir alimentos
que não causem efeitos nocivos à saúde (VIEIRA, 2008).
Com isso, os alimentos funcionais foram introduzidos primeiramente no Japão na
década de 80. Desde então se percebe um crescente interesse pelos consumidores em
alimentos que apresentam componentes ou substâncias funcionais, ou seja, aqueles que
ajudam ou modulam o sistema fisiológico do organismo de modo a promover a saúde
(GALLINA et al., 2011).
Devido a busca por esse tipo de alimento como os probióticos e prebióticos
promove o bem-estar, a saúde e a redução do risco de doenças. Aumentando para mais de
500 novos produtos com esta aplicação sendo introduzidos no mercado (ASHRAF E
SHAH, 2011). Mani-López et. al (2014) relataram em seu trabalho que os produtos
lácteos são o grupo mais importante de alimentos que transportam probióticos, nos quais
o leite é o grupo mais tradicional nesta categoria. Para obter benefícios para a saúde,
recomenda-se que um produto contenha pelo menos 106 Unidades formadoras de
colônias (UFC) por grama de leite fermentado no momento do consumo (BRASIL,
2007).
O emprego de bactérias probióticas em produtos lácteos fermentados tem sido
amplamente estudado devido às dificuldades de manutenção da viabilidade destes micro-
organismos ao longo da estocagem refrigerada. Fatores como acidez e oxigênio
dissolvido e interações entre espécies, práticas de inoculação e condições de estocagem
podem influenciar na sobrevivência da microbiota probiótica em produtos lácteos
fermentados (GALLINA et al., 2011).
12
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar as características microbiológicas e pós-acidificação d diferentes marcas de
leites fermentados comercializadas na cidade de Barra do Garças – MT durante sua vida
de prateleira.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar as características físico-químicas dos leites fermentados: quantificação
de pH e acidez titulável.
Avaliar a qualidade microbiológica dos leites fermentados quanto à presença de
Salmonella sp, contagem de Coliformes à 30°C e Termotolerantes, fungos e leveduras e
bactérias láticas.
Avaliar pós-acidificação nos leites fermentados durante o período de estocagem:
valores de pH e acidez titulável durante o armazenamento.
Avaliar a viabilidade das bactérias láticas totais durante o armazenamento.
13
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. HISTÓRICO DOS ALIMENTOS FERMENTADOS
A África tem uma história antiga da produção de alimentos fermentados
tradicionais e talvez seja o continente com a mais rica variedade de alimentos
fermentados com ácido lático. Estes alimentos têm um grande impacto na nutrição, saúde
e socioeconomia dos povos do continente, frequentemente atormentados pela guerra,
seca, fome e doença. A África Subsariana é a região do mundo com a maior porcentagem
de pessoas cronicamente desnutridas e alta mortalidade infantil (FRANZ et al., 2014).
Tamang e Samuel, (2010) relatam que os alimentos tradicionais fermentados ainda
desempenham um papel importante na dieta de numerosas sociedades no mundo todo. O
caráter dietético africano inclui produtos fermentados e não fermentados de sorgo, milho,
painço e mandioca, leguminosas silvestres, sementes e tubérculos, mas também carne,
produtos lácteos e bebidas alcoólicas. Com importância para todas as sociedades rurais
pelo fato de serem procedimentos de processamento de alimentos de baixo custo e, na
maioria das vezes, “de baixa tecnologia” tornando assim acessível também pelas pessoas
com uma renda familiar menor.
Atualmente, os leites fermentados são considerados um produto com elevado
potencial para o desenvolvimento de novos produtos, principalmente por estarem
associados à saúde, o que vem sendo explorado pelas indústrias de laticínios. Este fator
está relacionado com três características: (1) as propriedades tecnológicas da matriz
láctea, que permiti a viabilidade funcional de ingredientes adicionados ao produto; (2) a
elevada praticidade dos derivados lácteos; (3) e a relação que os consumidores fazem dos
produtos lácteos com o aspecto de saudabilidade (DA COSTA et al., 2013).
3.1.1. FERMENTAÇÃO
A fermentação é um método de preservação largamente utilizado desde os
primórdios da civilização, pela ausência de métodos de refrigeração ou pasteurização. Há
tempos, o processo de fermentação envolvia a coagulação do leite por micro-organismos
presentes no meio, obtendo-se um produto final com características e propriedades físico-
químicas diferentes da matéria-prima (ALM, 1991). Atualmente este processo ocorre
com a adição dos micro-organismos fermentadores específicos para a obtenção de
melhores características sensoriais.
14
As bactérias láticas são micro-organismos que caracterizam-se pela capacidade de
produzir ácido lático a partir do processo de fermentação da lactose como visualizado na
figura 1. Podem ser classificadas como homofermentativas, quando produzem ácido
lático como principal ou único produto resultante da fermentação, ou ainda
heterofermentativas, quando produzem, além do ácido lático, outros compostos que
podem contribuir para as características de sabor e aroma de produtos lácteos
fermentados (JAY, 2005).
Fonte: JAY, 2005.
Figura 1. Imagem ilustrativa das reações ocorrentes na fermentação lática, onde A
representa a homofermentação e B representa a heterofermentação.
3.1.2. TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO
De acordo com a Codex standard for fermented milks (CODEX STAN 243-2003)
os ingredientes permitidos para produtos fermentados, são:
Culturas iniciadoras de micro-organismos inofensivos;
Outros micro-organismos adequados e inofensivos;
Cloreto de sódio;
Ingredientes não lácteos (Leites Fermentados com Sabor);
Água potável;
Leite e produtos lácteos;
Gelatina e amido em:
15
Leites fermentados tratados termicamente após a fermentação;
Leite fermentado com sabor;
Bebidas à base de leite fermentado; e
Leites fermentados simples, se permitido pela legislação
nacional do país de venda para o consumidor final;
desde que sejam adicionados apenas em quantidades funcionalmente necessárias,
conforme as boas práticas de fabricação, levando em conta qualquer uso dos
estabilizadores /espessantes.
A Instrução Normativa n° 46 (BRASIL, 2007), estabelece como ingredientes
obrigatórios os leite e/ou leite reconstituído padronizado em seu conteúdo de gordura.
Cultivos de bactérias lácticas e/ou cultivos de bactérias lácticas específicas, segundo
corresponda às definições estabelecidas em iogurte, leite fermentado, leite acidófilo,
kefir, kumys e coalhada. E como ingredientes opcionais: leite concentrado, creme,
manteiga, gordura anidra de leite ou butter oil, leite em pó, caseinatos alimentícios,
proteínas lácteas, outros sólidos de origem láctea, soros lácteos, concentrados de soros
lácteos. Frutas em forma de pedaços, polpa(s), suco(s) e outros preparados à base de
frutas. Maltodextrinas. Outras substâncias alimentícias tais como: mel, coco, cereais,
vegetais, frutas secas, chocolate, especiarias, café, outras, sós ou combinadas. Açúcares
e/ou glicídios (exceto polialcoóis e polissacarídeos). Cultivos de bactérias lácticas
subsidiárias. Amidos ou amidos modificados em uma proporção máxima de 1% (m/m) do
produto final. Onde estes ingredientes opcionais não-lácteos, sós ou combinados deverão
estar presentes em uma proporção máxima de 30% (m/m) do produto final.
3.1.3. SEGURANÇA SANITÁRIA DOS ALIMENTOS
As primeiras “normas” sanitárias com o objetivo de evitar doenças alimentares
eram de cunho místico. Várias religiões antigas já estabeleciam regras para sacrifícios de
animais. De fato, essa era uma função sacerdotal no antigo Egito, onde os médicos eram
responsáveis por inspecionar a carne dos animais sacrificados em rituais, bem como a
saúde de quem fazia o sacrifício (SANTANA e FAGNANI, 2014)
De acordo com a resolução RDC nº 12 (BRASIL, 2001), são descritos a tolerância
máxima e padrões mínimos para os diferentes grupos de produtos alimentícios para
caracterizá-lo e assim ser possível seu registro e fiscalização. Estes limites e critérios
podem ser complementados com o estabelecimento de programas de vigilância e
16
rastreamento de micro-organismos patogênicos e de qualidade higiênica e sanitária de
produtos.
Pela Instrução Normativa nº 46, (BRASIL, 2007), as práticas de higiene para
elaboração do produto fermentados deverão estar de acordo com o Regulamento Técnico
sobre as Condições Higiênico-Sanitárias e de Boas Práticas de Fabricação para
Estabelecimentos Elaboradores/Industrializadores de Alimentos, aprovado pela Portaria
368/97 – MA, de 4 de setembro de 1997 (BRASIL, 1997)
Para a portaria nº 326, (BRASIL, 2018), o alimento apto para o consumo humano é
considerado como aquele que atende ao padrão de identidade e qualidade pré-
estabelecido, nos aspectos higiênico-sanitários e nutricionais. O armazenamento é
considerado o conjunto de atividades e requisitos para se obter uma correta conservação
de matéria-prima, insumos e produtos acabados. O armazenamento juntamente com as
Boas Práticas de Fabricação são processos necessários para garantir a qualidade sanitária
dos alimentos. Além disso, eliminar ou diminuir as contaminações que pode estar
associada à presença de substâncias ou agentes estranhos, de origem biológica, química
ou física considerados nocivos ou não para a saúde humana.
Para o cumprimento dos requisitos higiênicos e de Boa Prática de Fabricação o leite
a ser utilizado deverá ser higienizado por meios mecânicos adequados e submetido à
pasteurização, ou tratamento térmico equivalente, para assegurar fosfatase residual
negativa (A.O.A.C.15ª Ed. 1990, 979.13, p.823 2005) combinado ou não com outros
processos físicos ou biológicos que garantam a inocuidade do produto (BRASIL, 2007).
3.1 LEITES FERMENTADOS
3.2.1. HISTÓRICO
Leite fermentado obtido a partir da fermentação microbiana espontânea tem sido
tradicionalmente usado por populações nômades da península arábica, Cáucaso e
Anatólia, que basearam sua nutrição no leite e produtos à base de leite (OBERMAN;
LIBUDZISZ, 1998).
Na Europa, os maiores segmentos dos mercados de alimentos funcionais são
representados por alimentos preparados com probióticos, prebióticos ou simbióticos (uma
combinação de probióticos e prebióticos). O mercado de probióticos, especialmente
direcionados para iogurtes e leites fermentados, tem experimentado rápido crescimento
no ano de dois mil e onze. Os mercados mais desenvolvidos para tais produtos estão
17
situados nos países do norte da Europa e da Escandinávia, onde os consumidores têm
longa tradição de consumo de láticos fermentados (BHADORIA E MAHAPATRA,
2011).
De acordo com Khani et al. (2012) o leite fermentado é amplamente utilizado para
transportar cepas probióticas porque as bactérias são mantidas vivas, e sua ingestão diária
é recomendada.
De acordo com a Instrução Normativa nº 46, (BRASIL, 2007), entende-se por leites
fermentados os produtos adicionados ou não de outras substâncias alimentícias, obtidas
por coagulação e diminuição do pH do leite, ou reconstituído, adicionado ou não de
outros produtos lácteos, por fermentação lática mediante ação de cultivos de micro-
organismos específicos. A fermentação citada se realiza com um ou vários dos seguintes
cultivos: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei. Bifidobacterium sp.
Streptococus salivarius subsp thermophilus e/ou outras bactérias ácido lácticas que por
sua atividade contribuem para a determinação das características do produto final. Estes
micro-organismos específicos devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto final
durante o prazo de validade (BRASIL, 2007).
3.2.2. ALEGAÇÃO FUNCIONAL
A palavra "alimento funcional" foi empregada pela primeira vez no Japão, nos anos
80, para alimentos e bebidas que apresentam constituintes especiais e que ao serem
consumidos na alimentação diária causam efeitos benéficos sobre o organismo humano
(MORAES e COLA, 2006).
A RCD n° 241 (BRASIL, 2018) define como probiótico os micro-organismo vivo
que, quando administrado em quantidades adequadas, confere um benefício à saúde do
indivíduo, como linhagem as subpopulação de células de uma mesma espécie que
apresentam as mesmas características e são identificadas por números, letras ou nomes
que seguem o epíteto específico. Onde o uso de probióticos em alimentos requer a
comprovação da sua segurança e benefícios à saúde.
Para Wendling e Weschenfelder (2013) os alimentos funcionais são aqueles que
fornecem uma nutrição básica e satisfatoriamente geram benefícios à saúde e neles se
enquadram os probióticos, que são micro-organismos vivos que conferem benefícios à
saúde humana, pelos vários benefícios são atribuídos ao consumo de alimentos e
18
suplementos contendo micro-organismos probióticos, como na prevenção do câncer de
cólon, intolerância a lactose, atividade antimicrobiana.
Os probióticos são amplamente empregados na indústria de laticínios por estarem
relacionados à reestruturação e à manutenção da microbiota intestinal e na prevenção de
doenças. São administrados para manter o equilíbrio da microbiota intestinal, sob a forma
de suplementos dietéticos ou formas farmacológicas (OLIVEIRA; ALMEIDA;
BOMFIM, 2017).
3.2.3. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, NUTRICIONAL E
MICROBIOLÓGICA
A fermentação lática de produtos alimentícios é uma alternativa interessante e
bastante aplicada para a obtenção de produtos diferenciados, como produtos acidificados
com texturas diferentes a partir do leite e derivados; nesse processo, a lactose é
fermentada pelas bactérias do ácido lático. O processo de fermentação do leite resulta na
diminuição do teor de lactose e na acidificação do meio e formação de metabólitos
secundários conferindo ao produto características diferenciadas, maior vida útil além de
um reduzido teor de lactose (MALDONADO et al., 2015). O processo de produção do
leite fermentado é apresentado na figura 2, mostrando como este produto é obtido.
19
Fonte: CUNHA et al. 2008
Figura 2. Fluxograma de produção de leite fermentado.
Os leites fermentados são produtos da fermentação de um ou vários dos seguintes
cultivos: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium sp.,
Streptococus salivarius subsp thermophilus e/ou outras bactérias acidolácticas que
contribuem para a caracterização do produto, podendo ter de 0,6 a 2,0% de ácido lático e,
no mínimo, 106UFC/g de bactérias láticas totais (BRASIL, 2007).
A viabilidade de cepas probióticas adicionado a produtos alimentícios,
especialmente a um leite fermentado, é afetado por vários fatores, como sensibilidade aos
fatores de processo (pH baixo, oxigênio, temperatura de fermentação), composição da
20
matriz alimentar (atividade de água, pH, presença de antimicrobianos naturais,
disponibilidade de nutrientes) e condições de embalagem e armazenamento. Além disso,
as condições do trato gastrointestinal podem afetar viabilidade das bactérias probióticas
durante a passagem (BARBOSA E TEIXEIRA, 2017).
3.2.4. CONTAMINANTES
Contaminação é a presença de substâncias ou agentes estranhos, de origem
biológica, química ou física que sejam considerados nocivos ou não para a saúde humana
(BRASIL, 2007).
A Instrução Normativa nº 46, (BRASIL, 2007) determina padrões de aceitação para
quantidade de micro-organismos presentes em produtos fermentados como é descrito na
tabela 1.
Tabela 1. Padrão estabelecido pela Instrução Normativa nº 46, para micro-organismos.
Micro-organismo Critério de
aceitação
Situação Norma
Coliformes/g
(30°C)
n=5
c=2
m=10
M=100
4 FIL3A:1985
Coliformes/g
(45°C)
n=5
c=2
m<3
M=10
4 APHA
1992c.24(1)
Bolores e leveduras/g n=5
c=2
m=50
M=200
2 FIL94B:1990
(1) Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 3rd. Ed., Edited by Carl
Vanderzant and Don F. Splittstoesser (APHA).
21
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Foram coletadas amostras de leite fermentado de três marcas denominadas como A,
B e C comerciais em supermercados da cidade de Barra do Garças-MT (latitude:15º 53'
24" S e longitude 52º 15' 24" W ). O critério de seleção utilizado foi as marcas com maior
predominância na região sendo que de cada marca, três lotes diferentes foram
amostrados. Nos supermercados avaliados, constatou-se que os leites fermentados foram
disponibilizados para comercialização com aproximadamente 14 a 16 dias após a data de
fabricação. Assim todas as amostras adquiridas apresentavam 15 dias de fabricação,
sendo este considerado o tempo zero. As amostras foram enviadas para o Laboratório de
Microbiologia de Alimentos do Campus Universitário do Araguaia da Universidade
Federal de Mato Grosso, onde permaneceram acondicionadas em refrigerador na
temperatura indicada pelo fabricante até o momento das análises.
4.1 Análises físico-químicas
Foram realizadas análises físico-química de pH e acidez titulável em ácido lático
nas amostras de leite fermentado segundo recomendações do Instituto Adolfo Lutz
(2008).
4.1.1. pH
O pH foi determinado introduzindo-se o eletrodo diretamente na amostra (pH meter
DMPH-2-Digimed, São Paulo, SP, Brasil) previamente calibrado com soluções tampão
pH 4,0 e 7,0.
4.1.2. Acidez titulável
A acidez titulável foi determinada de acordo com o método descrito pelo Instituto
Adolfo Lutz (2008). Mediu-se 10 mL de amostra e realizou-se a diluição em 10 mL de
água livre de CO2, titulou-se a solução com hidróxido de sódio (NaOH) 0,01N até
detenção de uma coloração roséa. A determinação de acidez titulável foi determinada
pela Equação 1.
Acidez( g de ácido lático por cento) = 𝐺×𝐵×𝐶
𝑉 Equação 1.
Sendo:
22
V= volume de NaOH 0,01N utilizado na bureta (mL);
B = fator de correção do NaOH( 1,001);
C= fator de correção do ácido lático (0,9);
V = volume de amostra (mL).
4.2 Análises microbiológicas
As análises microbiológicas no tempo 0 foram realizadas empregando-se a técnica
do número mais provável (NMP) para a contagem de coliformes a 30°C e coliformes
termotolerantes, plaqueamento para detecção de Salmonella sp., contagem total de
fungos, leveduras e bactérias láticas. As análises microbiológicas foram realizadas de
acordo com as recomendações das legislações brasileiras (BRASIL, 2001) e
metodologias recomendadas pela American Public Health Association (APHA, 2001).
4.2.1. Diluições seriadas decimais
De cada amostra foram pesadas, assepticamente, 25 mL do produto e adicionados
225 ml de água peptonada com 0,1% (p/v) de peptona, a fim de obter-se a diluição inicial
(10-1). Posteriormente, 1 mL desta diluição foi colocada em tubo contendo 9 mL de água
peptonada tamponada, obtendo-se a diluição 10-2 repetindo-se os procedimentos para as
demais diluições.
4.2.1.1. Coliformes a 30ºC e termotolerantes
Para a contagem estimada de coliformes a 30°C, de cada diluição do alimento em
estudo, foram tomadas três porções de 1 mL e inoculadas, respectivamente, em tubos
contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) e tubos de Durham, obtendo-se três séries
de três tubos. Os subcultivos positivos foram semeados em tubos contendo Caldo Verde
Brilhante Bile 2% com tubo de Durham, incubando-os a 35 - 37º C, durante 24 a 48 h,
sendo que a prova foi considerada positiva somente quando verificou-se turvação do
meio e produção de gás nos tubos de Durham. A determinação quantitativa foi realizada
de acordo com a técnica do Número Mais Provável (NMP), recomendada pela American
Public Health Association (HITCHINS, HARTMAN e TODD, 2001).
Para a contagem estimada de coliformes termotolerantes, uma alçada de cada
cultura dos tubos positivos de LST foi transferida para tubos de Caldo E. coli (EC),
contendo tubos de Durham, e incubados a 45ºC. Após a incubação, por 24 h, foi realizado
23
a leitura e os tubos que apresentarem turvação do meio e produção de gás foram
considerados positivos para bactérias do grupo coliforme termotolerante. Para cada
diluição, o número de tubos positivos foi anotado e quantificado através da tabela de
NMP determinando, assim, o NMP de bactérias coliformes termotolerantes por grama de
produto analisado (HITCHINS, HARTMAN e TODD, 2001).
4.2.1.2. Detecção de Salmonella sp.
A pesquisa de Salmonella foi realizada segundo metodologia recomendada pela
APHA (2001). No pré-enriquecimento, um volume de 25 mL das amostras foram
adicionados a 225 mL de caldo lactosado. Esses homogenatos foram incubados a 37°C,
por 24 h. Desses caldos de pré-enriquecimento, transferiu-se alíquotas de 1 mL para
tubos contendo 10 mL de caldo Selenito Cistina (SC) e alíquotas de 0,1 mL para tubos
contendo 10 mL de caldo Rapapport-Vassiilidis (RV). O caldo Selenito Cistina foi
incubado a 35ºC por 24 h e o caldo Rapapport- Vassiilidis incubado a 42ºC por 24 h. A
partir dos tubos inoculados, foram feitas estrias compostas, em placas contendo Ágar
Verde Brilhante (VB) e Bismuto Sulfito (BS). As placas foram incubadas a 35ºC, por 24
h, para isolamento de colônias suspeitas de Salmonella sp. Após este período, as colônias
suspeitas foram transferidas para tubos contendo Ágar Tríplice Açúcar e Ferro (TSI), e
Ágar Lisina Ferro (LIA). Os tubos foram incubados a 35ºC e após 24 h foi realizada a
leitura.
4.2.1.3 Contagem total de fungos e leveduras
Na análise de fungos e leveduras 0,1 mL de cada diluição inicial foi depositada
sobre a superfície de placas contendo Agar Batata Dextrose Acidificado (PDA-AC) que
foram incubadas a 25ºC, por 5 dias, determinando-se assim o número de unidades
formadoras de colônias (UFC), segundo a metodologia recomendada pela APHA (2001).
4.2.1.4 Contagem de bactérias láticas
A contagem de bactérias láticas foi enumerada por meio de plaqueamento em
profundidade em ágar MRS e incubada em anaerobiose a 37 ºC por 72 h (APHA, 2001).
24
4.3 Análise estatística
Os dados das análises físico-químicas dos leites fermentados foram submetidos à
análise de variância univariada (ANOVA) e teste de Tukey para comparação entre as
médias, adotando-se nível de significância de 5% de probabilidade. O efeito do tempo de
armazenamento sobre os indicadores de qualidade medidos foi analisado por meio de
regressão, através do programa computacional Sisvar 5.3
25
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A Tabela 2 apresenta avaliação microbiológica de leites fermentados
comercializados na cidade de Barra do Garças-MT.
Tabela 2. Avaliação microbiológica de leites fermentados comercializados em
supermercados de barra do Garças-MT
Micro-organismos Marca A Marca B Marca C
Coliformes a 30°C
(NMP.g-1) < 3,0 < 3,0 < 3,0
Coliformes termotolerantes
(NMP.g-1) < 3,0 < 3,0 < 3,0
Salmonella sp. (25g) Ausência Ausência Ausência
Fungos e leveduras
(UFC.g-1) <1,0x101 est <1,0x101 est <1,0x101 est
Um dos objetivos da contagem de micro-organismos mesófilos é para verificação
da contaminação geral de um alimento e assim tem sido usada como indicador da
qualidade higiênica dos alimentos e também pelo fornecimento da ideia sobre seu tempo
útil de conservação (FRANCO e LANDGRAF, 2003).
Observou-se que todas as amostras das três marcas avaliadas apresentaram
resultados dentro dos padrões estabelecidos pelas legislações vigentes com critério de
aceitação para coliformes à 30 °C de 1 × 101 à 1 × 102, para coliformes termotolerantes
3 × 100 à 1 × 101 e para fungos e leveduras 5 × 101 à 2 × 102 de UFC. g−1 (BRASIL,
2007; BRASIL, 2001). As baixas contagens de coliformes, fungos e leveduras e ausência
de Salmonella sp. nas amostras avaliadas indicam boas condições higiênico sanitárias
durante o processo de fabricação dos produtos. Além de ser primordial para minimizar os
riscos à saúde dos consumidores (FREITAS et. al, 2018).
O baixo pH que normalmente esses produtos apresentam, em função da produção
de ácido lático durante o processo de fermentação, atua eliminando ou inibindo micro-
organismos causadores de deterioração ou produtores de toxinas em alimentos, fenômeno
descrito como antagonismo lático (TORTORA, 2017).
26
Os resultados encontrados na caracterização físico-química, dos leites fermentados
encontram-se na Tabela 3.
Tabela 3. Caracterização físico-química de leites fermentados comercializados em
supermercados de Barra do Garças-MT.
Acidez (g de ácido lático por g de leite fermentado)
Tempo(dias)
Marca
0 (15 dias de
fabricação)
07 ( 22 dias de
fabricação)
14 (29 dias de
fabricação)
A 0,94 c B ±0,09 0,94 c B ±0,09 1,12 b A ±0,11
B 1,57 a A ±0,11 1,57 a A ±0,11 1,51 a A ±0,05
C 1,25 b A ±0,05 1,25 b A ±0,05 1,05 b B ±0,01
pH
Tempo( dias)
Marca
0 (15 dias de
fabricação)
07 (22 dias de
fabricação)
14 (29 dias de
fabricação)
A 3,78 a A ±0,08 3,86 abA ±0,06 3,82 a A ±0,07
B 3,59 b B ±0,01 3,75 b A ±0,06 3,57 b B ±0,01
C 3,74 a A ±0,00 3,89 a B ±0,06 3,76 a A ±0,03 Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna difere entre si pelo teste Tukey (P>0,05).
Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na linha difere entre si pelo teste Tukey (P>0,05)
Com relação as características físico-químicas dos produtos apresentados na tabela
3, todas as marcas atenderam os valores de acidez preconizado pela legislação vigente
que é mínima de 0,6g de ácido lático.100g−1 do produto e máxima de 2,0 g de ácido
lático. 100g−1 do produto (BRASIL, 2007). Quando comparadas entre si, a acidez das
marcas diferiu durante tempo de avaliação. Ao final do período de avaliação a marca B
apresentou maior acidez, diferindo das marcas A (55%) e C (31,35%) (Tabela 3). Já
quando comparada a acidez de cada marca durante os tempos de estocagem, observou-se
que a marca A apresentou um acréscimo de 19,14 % e C apresentou um decréscimo de 16
% na acidez na última avaliação (14 dias de estocagem) sendo que a marca B manteve o
seu valor inalterado estatisticamente ao longo do tempo (Tabela 3).
As variações no teor de acidez podem ser atribuídas a produção de ácido lático em
função do teor de carboidratos disponível para a conversão, concentração de culturas
láticas, tipos de culturas láticas, tempo e temperatura ideal de incubação (OLIVEIRA et
al., 2016).
Valores mais baixos de pH são característicos dos leites fermentados, uma vez que
os produtos apresentam acidez elevada devido ao processo de fermentação em que é
obtido o ácido lático como produto final ( OLIVEIRA, et al., 2019).
27
O pH da marca A manteve-se inalterado nas três avaliações, enquanto nas demais
marcas (B e C) houve uma pequena elevação no tempo 07, retomando o valor no tempo
14 igual ao tempo zero (Tabela 3). Apesar da legislação vigente não estabelecer valores
de pH para estes produtos, os resultados encontrados corroboram aos descritos por Farias
et al. (2012) que observaram valores de pH variando de 4,11 a 3,6 e por Oliveira et. al
(2017) que obtiveram uma variação de 3,69 a 3,78.
O acompanhamento do pH durante a estocagem do produto é um fator determinante
nas características sensoriais do produto e do seu estado de conservação e as variações
entre marcas de produtos fermentados podem estar relacionados ao tipo e porcentagem de
cultura lática, à atividade desta cultura, ao valor estabelecido para finalizar a fermentação,
à adição de diferentes ingredientes, assim como o tempo de armazenamento e, ainda, tem
sua importância relacionada com o aspecto visual do produto final durante a sua
conservação em temperaturas baixas (THAMER E PENNA, 2006).
Foi possível observar que os lotes da marca A de dois supermercados( x e y)
sofreram separação de fases depois de 07 dias de armazenamento e para o supermercado
(w) esta precipitação aconteceu com o tempo de 14 dias. O que pode explicar o aumento
da acidez adquirida pela amostra A durante a estocagem (figura 3).
Figura 3. Produtos que apresentaram precipitação durante o período de
validade.
Esse processo de separação de fases pode estar associado a maiores teores de acidez
na marca A, levando a perda de estabilidade das proteínas. Resultados semelhantes foram
encontrados por Barros (2001) em seu trabalho onde o autor observou que a acidez
28
produz perda da estabilidade das proteínas do leite, podendo provocar a precipitação da
mesma.
Os resultados encontrados para a contagem de bactérias láticas para as amostras de
leites fermentados estão descritos na Tabela 4.
Os leites fermentados apresentaram contagens iniciais que variaram de 6,42 a 8,05
log UFC.g-1 (Tabela 4 ).
Tabela 4. Viabilidade das bactérias láticas encontradas nos leites fermentados durante a vida
de prateleira
Viabilidade (log UFC.g-1)
Tempo
(dias)
Marca
0 ( 15 dias de
fabricação)
07 ( 22 dias de
fabricação)
14 (29 dias de
fabricação)
A 8,05 ± 0,63 6,83 ± 0,76 6,81 ± 0,57
B 8,60 ± 0,19 8,35 ± 0,05 8,06 ± 0,03
C 6,42 ± 0,34 6,42 ± 0,24 5,81 ± 0,47
Observou-se que as marcas A, B e C ao longo da vida de prateleira apresentaram
uma redução de 1,24, 0,54 e 0,62 ciclos logarítmicos, respectivamente, onde mesmo com
as reduções de viabilidades dos bactérias láticas nas diferentes marcas, as marcas (A e B)
atenderam aos valores mínimos de contagens de bactérias láticas totais que é de 106
estabelecido pela legislação vigente (BRASIL, 2007). No entanto, a marca C, que desde o
inicio da avaliação apresentou uma menor viabilidade, não atendeu os requisitos, estando
não conforme com a legislação (Tabela 4).
Nota-se que a marca B apresentou maiores contagens de bactérias láticas e menor
redução de ciclos logarítmicos ao longo do tempo de estocagem, indicando boas
características da cultura lática usada, garantindo assim um produto de qualidade para o
consumidor, com todos seus efeitos benéficos. Contagens mais elevadas de micro-
organismos probióticos nos produtos finais são desejadas no intuito de garantir que
quantidades de bactérias viáveis sejam mantidas durante todo o tempo de estocagem
(MENDES, et al., 2014).
A marca C desde o início da vida de prateleira apresentava contagens de bactérias
láticas menores que as outras marcas, indicando que o produto já chegou ao mercado
varejista com as contagens de bactérias láticas no limite estabelecido pela legislação. A
viabilidade dos micro-organismos probióticos em leites fermentados pode ser afetada
29
durante as etapas de distribuição do produto, devido à exposição a diferentes fatores,
como presença/ausência de oxigênio (dependendo do tipo de micro-organismo), presença
de componentes antimicrobianos e temperatura de armazenamento. Além disso, os micro-
organismos probióticos são muito susceptíveis as condições do ambiente em que estão
crescendo, como acidez e altas temperaturas (VASILJEVIC; SHAH, 2008).
No trabalho realizado por Carvalho et al. (2015) a variação na contagem de
bactérias láticas foi de 106 − 108 UFC.mL−1, valores semelhantes aos encontrados neste
trabalho.
Para Forsythe (2013), a principal função das bactérias láticas nos alimentos é
promover a acidificação em pH próximo de 4,0, o que impediria o desenvolvimento de
bactérias indesejáveis pela produção de ácidos orgânicos, majoritariamente ácido lático.
A acidificação permite que o tempo de conservação dos produtos fermentados seja maior
que a dos produtos no qual a matéria prima não foi fermentada. Outra função é
desenvolver propriedades sensoriais características dos produtos fermentados.
6. CONCLUSÃO
As marcas de leites fermentados avaliadas atenderam os padrões físico-químicos e
microbiológicos de segurança dos alimentos estabelecidos pela legislação, indicando boas
práticas de fabricação dos produtos. Na enumeração de bactérias láticas, o número de
30
células viáveis apresentou-se dentro dos requisitos estabelecidos ao final da vida de
prateleira do produto, exceto para a marca C, indicando baixa estabilidade da cultura
lática em relação às características do produto ao longo do armazenamento ou falha no
processo de estocagem.
Conclui-se a necessicadade de uma maior fiscalização por parte dos responsáveis
para que o consumidor não seja enganado ao comprar produtos fora dos padrões
estabelecidos por legislação.
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TERMO DE CORREÇÃO DA MONOGRAFIA
35
Declaro que a acadêmica Jaqueline Ferreira Silva efetuou as correções necessárias no
trabalho de curso intitulado: Caracterização microbiológica e pós-acidificação de leites
fermentados comercializados em Barra do Garças-MT, no Campus Universitário do
Araguaia na Universidade Federal do Mato Grosso, como requisito parcial para obtenção
de grau de Bacharel em Engenharia de Alimentos em 08 de abril de 2019.
Data da entrega: 12 de abril de 2019.
ASSINATURAS:
