Maior aumento do índice de ômega-3 em resposta à

suplementação de ácidos graxos n-3 em longo prazo

a partir de triacilglicerídeos versus ésteres etílicos

J Neubronner1, JP Schuchardt1, G Kressel1, M Merkel2,

C von Schacky3, e A Hahn1

1Instituto de Ciência da Alimentação e Nutrição Humana, Leibniz Universita''t Hannover, Am Kleinen Felde 30, Hannover, Alemanha; 2Asklepios Klinik St. Georg, 1. Medizinische Abteilung, Haus O, Lohmu ̈hlenstra e 5, Hamburgo, Alemanha;

3Preventive Cardiology, Medizinische Klinik und Poliklinik Innenstadt, Ludwig Maximilians University, Munique, Ziemssenstr. 1, München, AlemanhaEuropean Journal of Clinical Nutrition (2011) 65, 247–254

Antecedentes: Atualmente, há um debate sobre se diferentes formas químicas do ácido eicosapenta-enoico (EPA) e ácido docosahexaenoico (DHA) são absorvidas de maneira idêntica. O objetivo deste es-tudo foi investigar a resposta do índice de ômega-3, a porcentagem de EPA + DHA nas membranas de glóbulos vermelhos, em suplementação com duas formulações diferentes de ácidos graxos ômega-3 (n-3) em humanos.

Design: O estudo foi conduzido como um ensaio du-plo-cego controlado por placebo. Um total de 150 vo-luntários foi distribuído aleatoriamente para um dos três grupos: (1) concentrado de óleo de peixe com EPA+DHA (1.01g+0.67g) administrado como triacilgli-cerídeos resterificados (grupo rTAG); (2) óleo de milho (grupo placebo); ou (3) concentrado de óleo de peixe com EPA + DHA (1,01g + 0,67g) na forma de éster etílico (grupo EE). Os voluntários consumiram quatro cápsulas revestidas com gelatina diariamente, durante um período de seis meses. O índice de ômega-3 foi determinado na linha de base (t0), após três meses (t3), e no final do período de intervenção (t6).

Resultados: O índice de ômega-3 aumentou signifi-cativamente em ambos os grupos tratados com n-3 desde a linha de base até t3 e t6 (P<0.001). O índice de ômega-3 aumentou em maior parte no grupo rTAG do que no grupo EE [t3: 186 versus 161% (P<0.001); t6: 197 versus 171% (P<0.01)].

Conclusão: A suplementação de seis meses de do-ses idênticas de EPA + DHA levou a um aumento mais rápido e maior no índice de ômega-3 quando consumido como triacilglicerídeos do que quando consumido como ésteres etílicos.

European Journal of Clinical Nutrition (2011) 65, 247-254; doi:10.1038/ejcn.2010.239; publicado on-line em 10 de novembro de 2010.

Palavras-chave: ácidos graxos n-3; triacilgliceríde-os; ésteres etílicos; índice de ômega-3; ácido eicosa-pentaenoico; ácido docosahexaenoico.

Introdução

As sociedades cardíacas recomendam um aumento da ingestão de ácidos graxos ômega-3 de cadeia lon-ga (n-3), ácido eicosapentaenoico (EPA) e ácido do-cosahexaenoico (DHA), especialmente para pacien-tes com doença cardiovascular conhecida ou para indivíduos com alto risco de doença cardiovascular (Smith et al., 2006; Graham et al., 2007; Fruchart et al., 2008). Embora a maioria dos grandes estudos de intervenção em que essas recomendações se baseiam foram conduzidos com EPA + DHA ésteres etílicos (EEs), as sociedades de nutrição e cardíacas recomendam aumentar a ingestão de n-3 com o consumo de pelo menos duas porções de peixe (de preferência oleoso) por semana, fornecendo 400-500mg por dia de EPA + DHA, principalmente este-rificados como triacilglicerídeos (TAGs), mas também como fosfolipídeos (PLs). Para a porção da população relutante em comer peixe, as sociedades recomen-dam preparações concentradas de óleo de peixe, que normalmente contêm EPA e DHA como TAGs ou EEs. Essas recomendações presumem que diferen-tes formas químicas de EPA+DHA têm uma eficácia idêntica.

A maioria dos estudos anteriores que compararam a biodisponibilidade de EPA + DHA de TAGs ou tria-

cilglicerídeos resterificados (rTAGs) versus EEs (El Boustani et al., 1987; Lawson e Hughes, 1988a, b; Beckermann et al., 1990; Luley et al., 1990, Nordøy et al., 1991; Krokan et al., 1993; Dyerberg et al., 2010) foram de curto prazo com um máximo de duração de sete semanas. Os pontos finais focados nesses en-saios – composição de n-3 no PLs plasmático, TAGs, chilomicron TAGs ou PLs sérico – similarmente refle-tem o consumo de curto prazo em vez de longo prazo (Katan et al., 1997; Cao et al., 2006). Além disso, do-ses maiores (42g por dia de EPA e DHA) foram utiliza-das em muitos desses estudos, o que contrasta com as recomendações das sociedades mencionadas.

Comparamos a biodisponibilidade de uma dose mo-derada de n-3 TAG versus n-3 EEs em comparação com um placebo como parte de um estudo contro-lado aleatorizado de seis meses, onde também ava-liamos os efeitos das duas formulações de n-3 sobre o perfil lipídico em indivíduos hiperlipidêmicos. O ín-dice de ômega-3, a porcentagem de EPA+DHA nas membranas de glóbulos vermelhos (red blood cell: RBC), reflete a ingestão de longo prazo e o status de n-3 de um indivíduo (Harris e von Schacky, 2004; Harris, 2007, 2008; Sun et al., 2007).

Participantes e métodos

ParticipantesUm total de 150 indivíduos entre 30 e 75 anos fo-ram recrutados através de anúncios de jornais em quatro cidades alemãs (Munique, Hamburgo, Hanno-ver e Goslar) entre abril e outubro de 2008. Como o estudo foi realizado para avaliar os efeitos dos duas formulações de óleo de peixe no perfil lipídico em indivíduos hiperlipidêmicos, o critério de inclusão foi a hiperlipidemia exclusivamente tratada com inibido-res de HMG-CoA-redutase (estatinas). Os critérios de exclusão foram doença grave (diabetes tipo 1, cân-cer, doença arterial coronariana, distúrbios hemor-rágicos), índice de massa corporal >35 kg m-2, dis-túrbios gastrointestinais, medicamentos que afetam o metabolismo lipídico, consumo diário de peixe ou ingestão dietética de n-3, e suplementos de esterol vegetal. O consentimento por escrito foi obtido de to-dos os participantes. O julgamento foi realizado com respeito às diretrizes da Boa Prática Clínica (Good Clinical Practice: GCP) e o protocolo foi aprovado por uma comissão de ética.

Design de estudoOs participantes qualificados foram distribuídos alea-toriamente para um dos três grupos de forma dupla--mascarada. A randomização foi realizada usando-se um esquema de randomização gerado por computa-dor. Os códigos foram mantidos em um local seguro e remoto por um serviço de terceirização independente. Todos os participantes, bem como a equipe de ensaios médicos, laboratoriais e clínicos e os investigadores que avaliaram os pontos finais, foram mantidos às cegas sobre a aleatorização até que todos os dados do estudo tenham sido coletados e verificados. Cada um dos produtos do estudo recebeu dois códigos para facilitar ainda mais o mascaramento das cápsulas. As cápsulas foram fornecidas em recipientes numerados.

Os três tipos diferentes de cápsulas macias revestidas com gelatina continham (1) n-3 rTAGs (grupo rTAG; n = 52); (2) óleo de milho (grupo placebo; n = 49); ou (3) n-3 EEs (grupo EE; n = 49), fornecidos por Dr. Loges and Co. GmbH

Tabela 1 Composição dos dois suplementos por cáp-sula e consumo diário total (quatro cápsulas)

n-3 como TAGs ou EEs

Nutriente Por cápsula Por dia (quatro cápsulas)

Total n-3 504 mg 2016 mg

20:5n-3 (EPA) 252 mg 1008 mg

22:6n-3 (DHA) 168 mg 672 mg

a-Tocopherol 6 mg 24 mg

Abreviações: DHA, ácido docosahexaenoico; EEs, ésteres etílicos; EPA, ácido eicosapentenoico; n-3, ácidos graxos ômega-3; TAGs, triacilgli-cerídeos.

(Winsen, Alemanha), uma empresa farmacêutica. As rTAGs são feitas a partir do óleo do corpo de peixe para concentrar os ácidos graxos específicos nos produtos resultantes. Portanto, os ácidos graxos dos TAGs naturais são transferidos para etanol, formando EEs. Após a remoção dos ácidos graxos indesejáveis, os EEs são enzimáticamente reconvertidos em TAGs, agora chamados rTAGs. A composição dos ácidos graxos dos dois suplementos foi idêntica (Tabela 1). A ingestão diária de EPA e DHA nos dois grupos n-3 foi de 1.008 e 672mg, respectivamente. As cápsulas de placebo continham óleo de milho e eram exter-namente idênticas às cápsulas de n-3 em todos os aspectos.

Os participantes foram instruídos a ingerir quatro cápsulas de seu suplemento de estudo designado diariamente, juntamente com alimentos, duas de manhã e duas à noite, e manter o seu exercício ha-bitual e hábitos alimentares ao longo do tempo de intervenção de seis meses.

A altura e o peso dos indivíduos foram medidos e as amostras de sangue em jejum foram coletadas por punção venosa em tubos de K-EDTA na linha de base (t0), após três meses (t3) e no final do período de in-

tervenção (t6). Os participantes adicionalmente com-pletaram um questionário para obter informações so-bre seus hábitos de vida (por exemplo, ingestão usual de peixe, atividade física), bem como a tolerabilidade das duas diferentes formulações n-3.

A conformidade dos voluntários foi avaliada pelo nú-mero de cápsulas que sobraram entre as três datas de investigação.

Análise de ácidos graxos da membrana dos glóbulos vermelhos (RBC)A composição de ácidos graxos da membrana de RBC foi analisada de acordo com a metodologia de índice de ômega-3 como descrito anteriormente (Harris e von Schacky, 2004). Os ésteres metílicos dos ácidos gra-xos foram gerados a partir de glóbulos vermelhos por transesterificação ácida e analisados por cromatogra-fia gasosa usando um cromatógrafo de gás GC2010 (Shimadzu, Duisburg, Alemanha) equipado com uma coluna SP2560, 100m (Supelco, Bellefonte, PA, EUA), usando-se hidrogênio como gás transportador. Os áci-dos graxos foram identificados por comparação com uma característica de mistura padrão de ácido graxo para RBCs. Os resultados para o índice de ômega-3 são dados como EPA + DHA expresso como uma por-centagem do total identificado de ácidos graxos após a correção do fator de resposta. O coeficiente de varia-ção para EPA + DHA foi de 5%. A qualidade foi assegu-rada de acordo com DIN ISO 15189.

EstatisticasSPSS 17 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para análise estatística. Os resultados são apresen-tados como média ± s.d. O tamanho da amostra (n = 50 por grupo) foi calculado para as diferenças nos níveis séricos de TAG (ponto final primário) para ser suficiente para provar uma superioridade um pou-co mais do que média (diferença padronizada dos meios (m1-m2) / s = 0.566) do verdadeiro sobre o placebo com um nível de significância de 5% e po-tência de 80%. Se o teste de diferença de todos os três grupos resultasse em significância, os testes de três pares poderiam ser feitos sem ajuste do nível

de significância seguinte ao procedimento de teste fechado. O aumento do índice de ômega-3 era um ponto final secundário; portanto, P<0.05 foi conside-rado muito significativo. As comparações estatísticas foram baseadas em população protocolar, definida como os indivíduos que completam todas as visitas, não desenvolvendo nenhum dos critérios de exclu-são durante o período de intervenção. Uma intenção de tratar a análise seria incluir os participantes não conformes de ambos os grupos, e teria obscurecido em vez de esclarecer os efeitos de tratamento com ácido graxos n-3. O teste de normalidade (teste KS) revelou uma distribuição normal para o ácido araqui-dônico (AA), EPA, DHA e índice de ômega-3 na linha de base em cada grupo de intervenção. Os marcadores de linha de base foram comparados entre os grupos usando-se a análise de variância de maneira única. Testes Scheffe de contraste foram realizados quando apropriado. Mudanças nos valores da variáveis dife-rentes observadas na linha de base, e t3 ou t6 foram avaliadas em grupos pelo teste Student’s t-test para amostras dependentes (Tabela 2). Para comparar as diferenças de ácidos graxos da membrana de RBC entre os grupos, os valores basais correspondentes foram utilizados como covariáveis para diminuir os possíveis efeitos causados por diversos valores de t0.

ResultadosDos 150 indivíduos elegíveis que iniciaram o estudo, 21 foram excluídos das análises estatísticas subse-quentes. O número de indivíduos perdidos durante o estudo e o número disponível para a análise estão resumidos na Figura 1. Cinco indivíduos falharam em um ou mais dos critérios de inclusão na visita inicial. Mais quatro indivíduos decidiram interromper a parti-cipação antes da visita t3 e três antes da visita t6. Três indivíduos não participaram da visita t3 devido a moti-vo de doença, não relacionada ao produto do estudo, e dois indivíduos adicionais apresentaram alterações relevantes no metabolismo lipídico que afetam a me-dicação (tratamento médico da disfunção tireoidiana). Mais quatro participantes foram excluídos da análise estatística subsequente devido à falta de conformida-de. Assim, 129 participantes completaram o protocolo do estudo e foram incluídos na análise.

Características dos indivíduosOs três grupos foram normalmente distribuídos em relação à idade, gênero, peso corporal e índice de massa corpo-ral, e não ocorreu diferenças entre os grupos (Tabela 3).

Tabela 2 Membrana RBC da composição dos ácidos graxos (porcentagem total dos ácidos graxos) na linha de base (t0), três (t3), e 6 meses (t6)

a.

C14:0

t0 0.53±0.58 0.45±0.16 0.44±0.22

t3 0.43±0.16 0.41±0.13 0.42±0.15

t6 0.35±0.15 0.42±0.21 0.31±0.11d

C16:0

t0 21.44±2.54 21.56±1.75 21.36±1.72

t3 21.69±1.33 21.33±1.51 21.44±1.76

t6 20.72±1.33e 9.99±1.45d 20.34±1.37d

C16:1n-7t

t0 0.90±2.28 0.57±1.61 0.55±1.62

t3 0.21±0.13 0.22±0.16 0.21±0.09

t6 0.15±0.14b 0.15±0.12 0.12±0.09

C16:1n-7

t0 0.65±0.32 0.75±0.33 0.58±0.28

t3 0.60±0.31 0.72±0.27 0.56±0.31

t6 0.45±0.22d,e 0.60±0.28d 0.42±0.19d,e

C18:0

t0 15.76±1.80 15.01±1.85 15.49±1.78

t3 14.99±2.26b 15.06±1.69 14.97±2.10

t6 14.72±1.81c 14.08±2.05b 14.61±1.42c

C18:1t

t0 0.54±0.30 0.51±0.25 0.49±0.12

t3 0.49±0.16e 0.57±0.25 0.55±0.28

t6 0.35±0.16d 0.41±0.36 0.32±0.17d

C18:1n-9

t0 15.53±1.38 15.62±1.35 15.61±1.14

t3 14.62±1.23d,e 15.40±1.57 14.73±1.15d,e

t6 14.96±1.16b,e 15.56±1.49 15.39±1.17

C18:2n-6tt

t0 0.26±0.22 0.23±0.13 0.24±0.12

t3 0.22±0.09 0.19±0.07 0.24±0.09e

t6 0.19±0.08 0.18±0.09 0.20±0.11

C18:2n-6ct

t0 0.17±0.32 0.19±0.35 0.15±0.21

t3 0.11±0.13 0.07±0.07b 0.07±0.08b

t6 0.04±0.03b 0.05±0.05c 0.04±0.09c

C18:2n-6tc

t0 0.26±0.34 0.22±0.32 0.21±0.28

t3 0.19±0.11 0.19±0.09 0.24±0.28

t6 0.14±0.07b 0.18±0.32 0.11±0.04c

C18:2n-6

t0 11.69±1.62 12.23±2.20 12.41±1.98

t3 10.95±1.65b,e 12.74±1.75 11.58±1.83c,e

t6 10.90±1.66c,e 12.96±2.36b 11.86±1.98b,e

C18:3n-6

t0 0.20±0.11 0.20±0.10 0.18±0.07

t3 0.12±0.05d,e 0.16±0.06b 0.12±0.09d,e

t6 0.09±0.04d 0.13±0.06d 0.09±0.04d

C20:1n-9

t0 0.24±0.08 0.24±0.08 0.24±0.06

t3 0.22±0.06 0.22±0.04 0.24±0.09

t6 0.19±0.05b 0.25±0.15 0.21±0.06c

C18:3n-3

t0 0.26±0.27 0.22±0.15 0.25±0.20

t3 0.22±0.09 0.21±0.07 0.22±0.08

at6 0.20±0.08 0.22±0.08 0.25±0.13

C20:2n-6

t0 0.27±0.16 0.25±0.14 0.27±0.12

t3 0.20±0.06b,e 0.23±0.05 0.24±0.13

t6 0.20±0.05c 0.25±0.10 0.20±0.06d

C20:3n-6

t0 1.62±0.32 1.66±0.34 1.64±0.32

t3 1.62±0.97 1.87±0.53c 1.40±0.36d,e

t6 2.22±1.45b 2.63±1.25d 2.17±1.48b

rTAG group (n = 41)

rTAG group (n = 41)

Placebo group (n = 43)

Placebo group (n = 43)

EE group n = 45)

EE group n = 45)

LA

ALA

C20:4n-6

t0 15.40±1.92 16.00±1.95 15.39±1.66

t3 13.62±1.74d,e 16.1 9±1.82 14.14±1.52d,e

t6 13.20±1.99d,e 16.89±2.16b 13.56±1.68d,e

C24:0

t0 0.81±0.86 0.62±0.51 0.64±0.50

t3 0.51±0.22b 0.56±0.30 0.49±0.23

t6 0.80±0.38 0.70±0.34 0.72±0.35

C20:5n-3

t0 1.34±0.63 1.45±0.50 1.45±0.57

t3 4.36±1.13d,e,f 1.20±0.33d 3.88±0.98d,e,f

t6 4.52±1.26d,e,f 1.29±0.55b 4.10±1.30d,e,f

C24:1n-9

t0 0.66±0.29 0.54±0.22 0.65±0.37

t3 0.55±0.25 0.62±0.31 0.57±0.29

t6 0.96±0.34d 0.91±0.35d 0.89±0.42b

C22:4n-6

t0 2.62±0.66 2.42±0.57 2.52±0.56

t3 1.82±0.50d,e 2.59±0.53b 1.92±0.46d,e

t6 1.59±0.47d,e 2.66±0.64b 1.75±0.52d,e

C22:5n-6

t0 0.49±0.17 0.47±0.17 0.44±0.13

t3 0.33±0.11d,e 0.52±0.15b 0.39±0.27e

t6 0.31±0.10d,e 0.54±0.17c 0.34±0.16c,e

C22:5n-3

t0 2.71±0.38 2.79±0.41 2.82±0.47

t3 3.85±0.44d,e 2.87±0.39 3.80±0.37d,e

t6 4.04±0.57d,e 2.78±0.45 3.86±0.50d,e

C22:6n-3

t0 5.67±1.34 5.79±1.09 5.97±1.28

t3 8.08±1.04d,e,f 5.87±1.05 7.58±0.94d,e,f

t6 8.73±1.32d,e,f 6.16±1.13c 8.14±1.27d,e,f

Omega-3 index

t0 7.00±1.90 7.24±1.44 7.42±1.76

t3 12.44±1.98d,e,f 7.06±1.29 11.46±1.74d,e,f

t6 13.25±2.36d,e,f 7.45±1.57 12.24±2.33d,e,f

rTAG group (n = 41)

Placebo group (n = 43)

EE group n = 45)

AA

EPA

DHA

Abreviações:AA, ácido araquidônico; ALA, ácido a-linolênico; DHA, ácido docosahe-xanoinoico; Grupo EE, grupo de intervenção que consumiu ácidos gra-xos ômega-3 como ésteres etílicos; EPA, ácido eicosapentaenoico; FA, ácido graxo; LA, ácido linoleico; índice de ômega-3, EPA+DHA; RBC, glóbulos vermelhos; grupo rTAG, grupo de intervenção que consumiu ácidos graxos ômega-3 como triacilglicerídeos resterificados. aMédia ± s.d.bAlterações significativas entre a linha de base e o mês três ou a linha de base e o mês seis; P<0.05.cAlterações significativas entre a linha de base e o mês três ou a linha de base e o mês seis; P<0.01.dMudanças significativas entre a linha de base e o mês três ou a linha de base e o mês seis; P<0.001.b,c,dCálculo em grupos pelo teste Student’s t para amostras dependen-tes. eValores são significativamente diferentes entre o grupo rTAG ou EE, respectivamente, e o grupo Placebo; P<0.05.fOs valores são significativamente diferentes entre o grupo rTAG e o grupo EE; P<0.05.e,fCalculado por análise de covariância com valor basal correspondente como covariável.

Não houve alterações significativas no índice de mas-sa corporal durante o ensaio (dados não apresenta-dos). Um total de 19 voluntários relataram efeitos colaterais ocorridos durante o tempo de intervenção. Embora oito indivíduos de ambos os grupos de trata-mento ativo relatassem eructação, três indivíduos do grupo EE relataram flatulência.

Ácidos graxos de membrana RBCOs ácidos graxos das membranas RBC para t0/t3/t6 são mostrados na Tabela 2. Os valores basais de AA, EPA e DHA não diferiram entre os grupos.

Entre t0, t3 e t6, houve alterações significativas nos ácidos graxos da membrana de RBC em ambos os grupos tratados com ácidos graxos n-3 para AA, EPA e DHA: AA diminuiu, enquanto o EPA e o DHA aumen-taram (P<0.001). Alterações significativas também foram observadas no grupo placebo, mostrando um aumento de AA e DHA entre t0 e t6, e uma diminuição no EPA entre t0 e t3 (P<0.001), bem como entre t0 e t6 (P<0.05) (Tabela 2).

Três meses de tratamento de ácido graxo n-3 resul-taram em aumentos significativos do teor de EPA, ácido docosapentaenoico e DHA em membranas de

Índice de ômega-3:superioridade dos ácidos graxos n-3 triacilglicerídeos versus ésteres etílicosJ Neubronner et al.

Pacientes randomizadosn=150

Cápsulas placebon=49

Exclusão antes da visita t6n=1

- 1 não compareceu à t6

Completaram o ensaio semnenhuma exclusão de critério

n=43

Exclusão antes da visita t3n=5

- 2 falharam no critério de inclusão

- 2 não compareceram à t3- 1 adoeceu, sem relação

com a intervenção

Cápsulas EE n-3n=49

Exclusão antes da visita t6n=2

- 1 mudança drástica da medicação

- 1 não compareceu à t6

Exclusão depois da visita t6n=1

- 1 falta de conformidade

Completaram o ensaio semnenhuma exclusão de critério

n=45

Exclusão antes da visita t3

n=1- 1 não compareceu à t3

Cápsulas TAG n-3n=52

Exclusão antes da visita t6n=2

- 1 mudança drástica da medicação

- 1 não compareceu à t6

Exclusão depois da visita t6n=3

- 3 faltas de conformidade

Completaram o ensaio semnenhuma exclusão de critério

n=41

Exclusão antes da visita t3n=6

- 3 falharam no critério de inclusão

- 1 não compareceu à t3- 2 adoeceram, sem relação

com a intervenção

Figura 1 Fluxograma para inscrição e progresso durante o ensaio randomizado.

Tabela 3Características dos 129 participantes inclusos por grupo de protocoloa

Gênero (masculino/feminino) 23/18 16/27 25/20

Idade, anos (média ± s.d., variação) 61.2±9.8 (33-75) 61.7±7.9 (34-73) 59.9 ±9.0 (34-72)

Peso corporal (média ± s.d., variação) 73.3±11.9 (51.0-103.0) 76.1±14.2 (55.0-111.5) 77.2±12.9 (53.0-102.0)

IMC, kg m-2 (média ± s.d., variação) 25.6±2.8 (20.0-30.2) 26.1± (19.9-34.4) 25.8±2.9 (19.0-32.2)

Grupo rTAG Grupo Placebo EE Grupo

Abreviações: IMC, índice de massa corporal; grupo EE, grupo de intervenção que consumiu ômega-3 sob a forma de ésteres etílicos; grupo rTAG, grupo de intervenção que consumiu ômega-3 sob a forma de triacilglicerídeos; s.d., desvio padrão. a Média ± s.d.

RBC em comparação com o grupo placebo, enquan-to que os conteúdos de AA diminuíram significativa-mente (P<0.001). De forma semelhante, as tendên-cias observadas foram constantes entre t3 e t6 com um aumento leve, embora não significativo, de EPA e DHA. A diminuição entre t3 e t6 para AA foi significan-te em ambos os grupos n-3 em comparação com o grupo placebo (grupo rTAG, 0,43%; grupo EE, 0,58%; P<0,001).

O aumento no índice de ômega-3 foi significativa-mente maior no grupo rTAG em comparação com o grupo EE: a realização de uma análise de covari-ância para comparar valores absolutos do índice de ômega-3 entre os três grupos revelou que o índice de ômega-3 foi significativamente maior após três e seis meses em ambos os grupos tratados com n-3, em comparação com o grupo placebo (Dt3_t0: P<0.001; Dt6_t0: P<0.001). Da mesma forma, o índi-ce de ômega-3 foi significativamente maior após três e seis meses no grupo rTAG em comparação com o grupo EE (Dt3_t0: P<0.001; Dt6_t0: P<0.01) (Figura 2).

DiscussãoPara o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo randomizado de longa duração que compara EPA + DHA rTAGs com EEs, em relação à sua incorporação em membranas de RBC, ou seja, o índice de ômega-3 em humanos. EPA + DHA consumido como rTAGs re-sultou em um maior aumento do índice de ômega-3

do que quando consumido como EE em um período de seis meses.

Estudos anteriores, que compararam os efeitos da administração de ácidos graxos n-3 na forma de TAGs ou rTAGs versus EEs na incorporação de EPA e DHA em lipídios plasmáticos (por exemplo, TAGs, TAGs de quilomicron, PLs), revelaram resultados he-terogêneos (El Boustani et al., 1987, Lawson e Hu-ghes, 1988a, b, Beckermann et al., 1990; Luley et al., 1990; Reis et al., 1990; Nordøy et al., 1991; Han-sen et al., 1993; Krokan et al., 1993, Dyerberg et al., 2010). Embora a maioria dos ensaios tenha relatado uma biodisponibilidade relativa média mais rápida e alta de DHA e EPA a partir de TAG ou rTAGs em com-paração com EEs (El Boustani et al., 1987; Lawson e Hughes, 1988a, b, Beckermann et al., 1990; Dyerberg et al., 2010), outros achados sugerem uma biodispo-nibilidade comparável (Luley et al. , 1990; Nordøy et al., 1991; Krokan et al., 1993) ou foram heterogêneos nos seus resultados (Reis et al., 1990; Hansen et al., 1993). Em sua publicação recente, Dyerberg et al. (2010) demonstraram claramente em um estudo de curto prazo durante duas semanas que o EPA + DHA em forma rTAG mostra uma biodisponibilidade su-perior em comparação com EEs. Harris et al. (1988) compararam as diferenças da incorporação de EPA + DHA em plasma PLs entre n-3 TAG e ésteres de metilo, que se supõe serem equivalentes a EE. Em-bora não foi detectado diferenças na incorporação de

EPA entre ésteres metílicos e TAG, a incorporação de DHA foi ligeiramente elevada após a administração de éster metílico.

No entanto, a biodisponibilidade em curto prazo – como medida pelos níveis plasmáticos – não reflete necessariamente a incorporação nos tecidos. Esco-lhemos o índice de ômega-3 (membranas de RBC EPA + DHA) como ponto final porque reflete a incor-poração de EPA e DHA em tecidos, incluindo o teci-do cardíaco (Harris et al., 2004; Metcalf et al., 2007; Harris, 2008) e, portanto, é um reflexo razoável do status de uma pessoa de EPA + DHA. Após seis me-ses, mas não após sete semanas, de suplementação, um estado estacionário é alcançado em membranas de RBC (Arterburn et al., 2006). A nossa abordagem contrasta com estudos prévios mencionados na in-trodução, que tiveram uma duração máxima de sete semanas, e analisaram os compartimentos da áci-dos graxos, refletindo em curto prazo e não em longo prazo.

O aumento do índice de ômega-3 foi significativa-mente maior após o consumo de n-3 na forma de rTAGs do que EEs. Os mecanismos que explicam esta observação não estão claros no momento. Portanto, discutimos as seguintes explicações possíveis:

• Diferenças na quantidade de medicação do es-tudo ingerida: as contagens de cápsulas não revelaram diferenças relevantes entre os dois grupos (a porcentagem de cápsulas ingeridas foi de 95% no grupo rTAG versus 96% no grupo EE).

• Idade: Em um estudo anterior, os indivíduos mais velhos apresentaram uma resposta mais forte à suplementação de DHA do que os indiví-duos mais jovens (Vandal et al., 2008). No pre-sente estudo, no entanto, não houve diferença de idade entre os grupos.

• Efeitos da matriz: existem resultados contra-ditórios na composição da ácidos graxos da membrana de RBC após a administração de n-3 EEs em cápsulas ou n-3 TAGs como peixes. Embora Visioli et al. (2003) observaram uma maior absorção de ácidos graxos n-3 no grupo de farinha de peixe do que no grupo da cápsu-la, Harris et al. (2007) encontraram elevações

semelhantes no índice de ômega-3 produzido por ambos os produtos. No entanto, o estudo realizado por Visioli et al. foi um pequeno es-tudo piloto, incluindo apenas 4-8 voluntários. Além disso, seu estudo foi retrospectivo, não randomizado e, além disso, o consumo de n-3 das duas fontes não foi combinado. No entan-to, a absorção de n-3 sob forma EE foi três ve-zes maior na presença de uma refeição rica em gordura em comparação com uma refeição com baixo teor de gordura, mas ainda não tão alta como a partir de n-3 sob forma TAGs (Law-son e Hughes, 1988a, b). Em outro estudo, não foram observadas diferenças na absorção de n-3 rTAG e EE após as suas administrações em refeições com conteúdo de gordura semelhan-te (Nordøy et al., 1991). No entanto, o estudo foi conduzido com doses muito elevadas de EPA + DHA (22-24 g) e com cinco voluntários, um número de casos comparativamente baixo. Em relação aos resultados de Visioli et al. (2003) e Lawson e Hughes (1988a, b), os efeitos da matriz e diferentes padrões nutricionais podem ser responsabilizados por diferentes achados.

• Diferenças na digestão: os ácidos graxos n-3 TAG, mas não n-3 EEs, têm um esqueleto de glicerol (Carlier et al., 1991). No intestino del-gado, a lipase pancreática hidrolisa os ácidos graxos a partir da espinha dorsal do álcool e ácidos graxos livres, e monoacilgliceróis são absorvidos por enterócitos. Estudos in vitro realizados por Yang et al. (1990a) mostraram que a ligação ácidos graxos-etanol é hidroli-sada 10-50 vezes mais lentamente pela lipase pancreática em comparação com a hidrólise de TAGs. Isso pode resultar em um atraso, ou mesmo em menos, ácido graxo n-3 entrando no enterócito quando EPA + DHA são consu-midos na forma EEs. No entanto, tais experi-ências in vitro não podem imitar a situação in vivo; por exemplo, o excesso extremo de lipase pancreática versus substrato no intestino nor-mal não é considerado.

• Diferenças na absorção: ácidos graxos livres devem ser reconvertidos no enterócito para TAGs para transporte adicional. São necessá-

rias moléculas de glicerol ou 2-monoacilgli-ceróis para isso. Ácidos graxos n-3 TAG, mas não n-3 EE, têm seu próprio substrato de gli-cerol ou monoacilglicerol em armazenamento. Yang et al. (1990b) sugeriu que a absorção mais lenta de ácidos graxos observada em ra-tos alimentados com EEs pode ser atribuída a uma menor eficiência da via do ácido fosfatídi-co, o que é necessário na ausência de 2-mo-noacilgliceróis dietéticos.

• Especificidade estér: conforme relatado por Vi-sioli et al. (2003), EPA e DHA são esterificados principalmente na posição sn-2 em moléculas TAG, e esta posição é, em grande medida, im-pedida de hidrólise durante a digestão e absor-ção, o que pode facilitar a digestão e absorção de TAGs. Contudo, pesquisas recentes de Dyer-berg et al. (2010) mostraram que a estereo-química dos ácidos graxos em acilgliceróis não influenciou a biodisponibilidade da EPA e DHA.

Em conjunto, embora não possamos delinear um mecanismo específico, propomos que as diferenças na digestão e na absorção entre EEs e TAGs, que po-dem depender em parte da matriz nutricional, são os mecanismos mais prováveis para explicar nossos achados.

De acordo com as publicações anteriores (Belluzzi et al., 1994; Katan et al., 1997; Harris et al., 2007; Bar-celo-Coblijn et al., 2008), os níveis basais da EPA ba-sal da RBC foram inferiores aos níveis basais de DHA. Ambos aumentaram após a suplementação, com o aumento de EPA sendo mais pronunciado, corres-pondendo à maior quantidade de EPA do que o DHA nas cápsulas. Conforme observado anteriormente (Krokan et al., 1993; Belluzzi et al., 1994; Arterburn et al., 2006), a maioria dos ácidos graxos de omega-6 foram significativamente reduzidos em t3 e t6.

Os aumentos relativos no teor de EPA na membrana RBC entre t0 e t6 foram 286% para o grupo rTAG e 215% para o grupo EE. Essas observações estão de acordo com os achados de Katan et al. (1997), apre-sentando uma mudança de cerca de 260% para o conteúdo da membrana EPA RBC em consequência

de 1g de EPA por dia na forma TAGs após seis meses e do mesmo modo, doze meses. Referindo-se a es-ses achados, pode-se concluir que os valores de EPA não aumentariam muito mais no grupo rTAG do pre-sente estudo se a suplementação fosse continuada.

Ao contrário do EPA, nossos dados mostram que o DHA ainda estava se acumulando em membranas RBC entre os meses três e seis no grupo rTAG (D-t6_t3: 19%) e o grupo EE (D-t6_t3: 21%). O DHA está localizado no folheto interno da bicamada PL e torna--se integrado nas membranas durante o desenvolvi-mento de RBC (von Schacky e Weber, 1985). Como o primeiro momento de investigação ocorre aos 90 dias após a linha de base e a vida útil de RBC é por volta de 120 dias (cerca de 4 meses), essa acumulação adicional de DHA não é surpreendente. O DHA atin-ge um estado estacionário em membranas de RBC após quatro e seis meses (Arterburn et al., 2006). Como também descrito por Marangoni et al. (1993), a acumulação de EPA em membranas de RBC é mais rápida em comparação com o DHA. Esta observação pode ser causada pela distribuição preferencial de EPA na camada externa de membranas de RBC, o que permite uma troca mais rápida com lipoproteí-nas plasmáticas (Popp-Snijders et al., 1984; Cartwri-ght et al., 1985). Em relação a achados anteriores (Tynan et al., 1995; Katan et al., 1997; Arterburn et al., 2006), podemos esperar que as diferenças no ín-dice de ômega-3 persistam após a intervenção de seis meses, desde que a dosagem de suplementação permanece estável.

Além disso, a ingestão diária de quatro cápsulas de ambos os suplementos de ácidos graxos n-3 do es-tudo por seis meses (1,01g EPA + 0.67g DHA por dia) provocou um aumento no índice médio de ôme-ga-3 até 13,2 e 12,2% para o grupo rTAG e grupo EE, respectivamente. Calculamos o número hipotético de cápsulas de ácidos graxos n-3 EE, que são neces-sárias para produzir o mesmo aumento no índice de ômega-3 obtido a partir da ingestão de quatro cáp-sulas rTAG. Assim, os participantes teriam que con-sumir pelo menos cinco cápsulas de EEs diariamente para obter o mesmo efeito no índice de ômega-3. No entanto, o objetivo do tratamento com EPA + DHA

– um índice de ômega-3 > 8% – é altamente exce-dido após o consumo de quatro ou cinco cápsulas da medicação do nosso estudo. Em qualquer caso, em relação à força de diferentes aumentos no índice de ômega-3 entre n-3 dado sob a forma rTAGs ou EEs, esperamos maiores aumentos no conteúdo de EPA + DHA da membrana de RBC, mesmo para doses mais baixas de nossas cápsulas rTAG testadas em compa-ração com as cápsulas EE.

Os níveis de base do índice de ômega-3 dos parti-cipantes do estudo foram ligeiramente superiores aos esperados (grupo rTAG: 7,00 ± 1,90%, grupo placebo: 7,24 ± 1,44%; grupo EE: 7,42 ± 1,76%). Anteriormente, na Alemanha, encontramos um índi-ce médio de ômega-3 6,14 ± 1,83% em 1000 não selecionados, não suplementados, enquanto que foi de 5,94 ± 1,41% em 190 indivíduos aterosenergi-zados (von Schacky, 2010). Os dados preliminares indicaram pequenas diferenças entre os centros par-ticipantes: Hannover, Hamburgo, Goslar e Munique (não mostrado). Isso deve ser avaliado de forma mais sistemática. No entanto, o nosso ensaio teve como objetivo comparar a magnitude da mudança no ín-dice de ômega-3 nos três grupos de estudo, não na medida dos níveis absolutos. Portanto, consideramos mais importante que os níveis de índice de ômega-3 de linha de base em nosso ensaio fossem compará-veis entre os três grupos.

Em conclusão, os nossos achados ressaltam que a ingestão de ambos os suplementos n-3 do estudo resultou em uma incorporação melhorada de EPA e DHA nos tecidos, como evidenciado por mudanças no conteúdo de ácidos graxos de membrana de RBC. Como o índice de ômega-3 resultante foi significati-vamente maior após a administração n-3 rTAG em comparação com n-3 EE, os resultados indicam que n-3 rTAG é superior a n-3 EE em vista da incorpora-ção nos tecidos de EPA + DHA após uma adminis-tração de longo prazo. No entanto, se esta diferença resultaria em diferenças nos resultados clínicos (isto é, redução nos níveis séricos de TAG, reduções nos eventos de doença arterial coronariana), isso não é

claro e precisa de investigações adicionais. Todavia, essas diferenças óbvias entre rTAGs e EEs devem ser consideradas nas recomendações de ingestão de ácidos graxos n-3.

Conflito de interessesC von Schacky recebeu honorários de palestrante da Solvay e concede apoio pela Sanofi-Aventis e Smar-tfish. Ele fundou a Omegametrix, uma empresa que oferece análises de ácidos graxos. A Hahn e JP Schu-chardt trabalharam como consultores para empresas que também produzem e comercializam suplemen-tos de ácidos graxos. Os autores são os únicos res-ponsáveis pela concepção e realização do estudo; coleta de dados, gestão, análise e interpretação dos dados; bem como a preparação do manuscrito.

ReconhecimentosO fornecimento gratuito dos suplementos de estu-do pela Dr Loges þ Co. GmbH, Winsen, Alemanha, é reconhecido com gratidão. Agradecemos especial-mente a Heike Kohrs por sua assistência técnica no laboratório.

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