MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM DNA

Alberto José Prioli

Sônia Maria Alves Pinto Prioli

Nupélia - Universidade Estadual de Maringá

MARCADOR MOLECULAR (DNA)

Seqüência de bases com localização única no genoma e cujas variações podem ser rastreadas em famílias e populações.

Pode ou não ser parte de um gene.

DNAmitocondrial

Marcadores Moleculares

RAPDSPARAFLPMicrossatélitesRFLP

Marcadores Moleculares

RAPDSPAR

Microssatélites

DNA mitocondrial

NÃO exige conhecimento prévio do genoma

Exige um conhecimentoparcial do genoma

NÃO exige conhecimento prévio do genoma

Marcadores Moleculares

RAPDSPARAFLP

MicrossatélitesRFLP

DNA mitocondrial

? Custo Haplóide; Alto No CópiasHerança MaternaNão RecombinaEvolução Rápida

Simples,Baixo CustoImenso Número de LocosMas... Dominantes

TrabalhosoAlto CustoCo-Dominantes !

COMO OBTER

ESTES MARCADORES

MOLECULARES ?

DNA – Estrutura e Replicação

• A seqüência de bases codifica a informação genética.

• Com um molde e um primer a DNA polimerase sintetiza um novo polinucleotídeo.

• A necessidade de um primer per- mite a síntese in vitro (PCR) de fragmentos de interesse.

PCR – Reação da Polimerase em Cadeia

• Taq-polimerase• dNTP• Mg2+

• Tampão• Primers• DNA• Ciclos com mudanças de temperatura

A repetição d o ciclo amplifica o o número de cópias do segmento entre os sítios do par de primers.

O resultado é lido em gel.

Hot springs -Yellowstone National Park -USA

A “picture” of the bacteria

PCR (PCR (Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction))

• Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1985.• Eficiência na detecção de polimorfismo.• Síntese enzimática de milhões de cópias na presença da DNA pol.• Reação: anelamento e extensão com um par de primers sintetizados artificialmente.

CICLO

Desnaturação Anelamento Extensão

RAPDPolimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso

Técnica desenvolvida por Williams et al. (1990).

Primer curto e arbitrário. Não se sabe, antecipadamente, em em quais posições do genoma ocorrerão pareamentos.

A amplificação é garantida por sítios de iniciação próximos e em fitas opostas.

Cada fragmento amplificado é uma característica binária do indivíduo ou da população.

Vantagens principais: baixo custo, grande número de locos e não há necessidade de qualquer conhecimento prévio do genoma do organismo.

Loco RAPD é um segmento amplificável,incluindo os dois sítios de iniciação.

Cada loco pode ser tratado como um

sistema de DOIS ALELOS

A configuração do segmento que resulta em amplificação é o ALELO DOMINANTE

A configuração que não amplifica é o ALELO RECESSIVO (nulo)

A INFORMAÇÃO OCULTA PELA DOMINÂNCIA É PERDIDA:

não há como saber se a população está emequilíbrio de HW, pois os heterozigotos nãopodem ser identificados.

Marcadores RAPD

Exemplos:

Distâncias genéticas

Índice de fixação FST (diferenciação genética)

Número de migrantes (Nm)

...

Para amostras pequenas, a metodologia deLynch e Milligan (1994) miniminiza o erro introduzido pela suposição de equilíbrio.

Parâmetros desenvolvidos para marcadores co-dominantes podem ser estimados com RAPD,admitindo-se equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Nem sempre é necessária a suposição de equilíbrio.

Índices de similaridade (Jaccard ou outro)

Coordenadas principais

Componentes principais

Componentes de variância da AMOVA

Diversidade de Shannon

. . .

Estas análises não protegem contra a perda da informação oculta pela dominância.

O RAPD gera estimativas menosprecisas, mas é muito útil como ferramenta exploratória e em combinação com marcadores mais informativos.

Usar RAPD? Se para a espécie ainda não existem marcadores mais eficientes, decide-se diante da relevância e urgência.

Locos Microssatélites ou Simple Sequence Repeats (SSR)

Blocos de seqüências nucleotídicas de dois a seis pares de bases que se repetem em tandem de 20 a 100 vezes. O genoma humano contém cerca de 30.000 diferentes locos SSR.

Exemplo de um loco microssatélite:

Alelo (CAG)14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’

Alelo (CAG)17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’

Alelo (CAG)19 . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 . 5’...AATGACATAGA....CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG.....GTCAAGATC...3’ 3’...TTACTGTATCT....GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC.....CAGTTCTAG...5’

Alelo (CAG)n

Esta seqüência de pares de bases não ocorre em nenhum outro local do genoma.

Esta seqüência de pares de bases não ocorre em nenhum outro local do genoma.

AMPLIFICAÇÃO, VIA PCR, DE BLOCOS DE

MICROSSATÉLITES 5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’ 5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ CAGTTCTAG5’ 5’AATGACATAGA 3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’ 5’ ...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’

+ 5’ ...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’

AMPLIFICAÇÃO DIRETA A PARTIR DE MICROSSATÉLITES OU

Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) ou Single Primers Amplifications Reactions (SPAR)

O primer com três ou quatro unidades repetitivas. Amplificados segmentos localizados entre dois blocos de microssatélites com a mesma unidade repetitiva do primer.

Exemplo de um loco ISSR:

Loco ISSR 5’...CAGCAGCAGCAGCAGCAGAAGTCATGGTCACGTGGCTGATATGACTGACATAGCCTCGAGTCTAGATCTATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG..3’ 3’...GTCGTCGTCGTCGTCGTCTTCTGTACCAGTGCACCGACTATACTGACTGTATCGGAGCTCAGATCTAGATACGACGACGACGACGACGACGACGACGAC..5’

Primer único a ser utilizado: 5’CAGCAGCAG3’

Amplificação via PCR: 5’...CAGCAGCAGCAGCAGCAGAAGTCATGGTCACGTGGCTGATATGACTGACATAGCCTCGAGTCTAGATCTATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG..3’ GACGACGAC5’ 5’CAGCAGCAG 3’...GTCGTCGTCGTCGTCGTCTTCTGTACCAGTGCACCGACTATACTGACTGTATCGGAGCTCAGATCTAGATACGACGACGACGACGACGACGACGACGAC..5’

Blocos de microssatélites em posição cis e com as seqüências repetitivas em fitas opostas.

Marcadores Moleculares

RAPDSPARAFLP

MicrossatélitesRFLP

DNA mitocondrial

? Custo Haplóide; Alto No CópiasHerança MaternaNão RecombinaEvolução Rápida

Simples,Baixo CustoImenso Número de LocosMas... Dominantes

TrabalhosoAlto CustoCo-Dominantes !

Marcadores Moleculares Mitocondriais

Metodologia

• Escolha da Seqüência (Qual é o Objetivo?)

• DNA Total

• Amplificação via PCR• Clonagem do Fragmento• Seqüenciamento • Seqüência: Edição e Alinhamento

mtDNA

• Geralmente evolui 5-10 vezes mais rápido do que genes nucleares de cópia simples.

• Alta velocidade de evolução - No Transição > Transversão

• CO I, II, III e Citocromo b = Evolução + lenta (conservados)

• ND, ATPases = Evolução menos lenta (~menos conservados)

• tRNAs = Evolução lenta; pequenos (59-75 bp) (primers)

• rRNAs = Evolução lenta (interessantes p/ espécies distantes)

• D-Loop ou Região Controle = Mais variável do mtDNA.

FRAGMENTOS D-loop DE 450 pb de Astyanax (lambari)

600 pb

ELETROFEROGRAMA (EDIÇÃO NO COMPUTADOR)

Picos com as cores correspondentes a cada nucleotídeo.

OBTENÇÃO DE INFORMAÇÕES

ECOLÓGICAS COM MARCADORES MOLECULARES

Molecular Markers and Genetic Variability of Hoplias aff. malabaricus

Populations from the Floodplain of Upper Paraná River

PRIOLI1,2*, Alberto J.; LUCIO1, Léia C.; MANIGLIA1, Thiago C.; PRIOLI1,2, Sônia M. A. P.; JÚLIO Jr1,2, Horácio F.; PAZZA1, Rubens; PRIOLI1,3, Laudenir M.

1Nupélia – Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura; 2Depto. Biol. Celular e Genética; 3Depto. Biologia – Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá, PR, Brazil. *Autor para correspondência (Phone: 44-261-4750; Fax: 44-263-1424; e-mail: ajprioli@nupelia.uem.br)

R i o I v a i

3 0 ’ 30 ’

30 ’ 30 ’

30 ’ 30 ’

3 0 ’

24 º 24 º

23 º

5 4 º

5 4 º

25 º 25 º

3 0 ’

3 0 ’

11B R A S ILM AT O G R O S S O

D O S U L

PA R A N Á

F O Z D O IG U A Ç U

I TA IP U D A M

G U A Í R A

S A N TA H E L E N A

21 .4 km

S C A L E

P o r to R ic o

Planície de inundaçãodo alto rio Paraná

Reservatório de Itaipu

Base Nupelia-UEMem Porto Rico - PR

Foz do Iguaçu

Sete Quedas

R i o I v a i

3 0 ’ 30 ’

30 ’ 30 ’

30 ’ 30 ’

3 0 ’

24 º 24 º

23 º

5 4 º

5 4 º

25 º 25 º

3 0 ’

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11B R A S ILM AT O G R O S S O

D O S U L

PA R A N Á

F O Z D O IG U A Ç U

I TA IP U D A M

G U A Í R A

S A N TA H E L E N A

21 .4 km

S C A L E

P o r to R ic o

Reservatório de Itaipu

Sete Quedas

Foz do Iguaçu

Planície de inundaçãodo alto rio Paraná

Base Nupelia-UEMem Porto Rico - PR

Atualmente ocorrem três citótipos de Hoplias aff. malabaricus na planície alagável do alto rio Paraná:

A (42) C (40) D (39/40) macho/fêmea

O citótipo C invadiu a planície depois do barramento de Itaipu.

Figure 1 – DNA fragments amplified by PCR with SPAR primer (GGAC)3T, identifying Hoplias aff. malabaricus cytotypes A, C, and D from the floodplain of Upper Paraná River. (L) Molecular weight markers (Ladder 100 bp); (b) negative control without DNA.

Dados sobre Citótipo C na planície Conclusão

HPL4

HPL17

HPL20

HPL18

HPL21

HPL19

HPL6

HPL5

HPL7

HPL35

HPL16

HPL8

HPL36100

66

99

76

99

100

0.01

Figure 2. Neighbor-joining tree for mitochondrial control region sequences of Hoplias malabaricus specimens from the Upper Paraná River Foodplain. Genetic distance was computed by using Tamura and Nei (1993) method. Number on

each node indicates bootstrap probability based on 1000 replications.

O monitoramento com ISSR evidenciou que o grupo C é o mais freqüente na planície, nos ambientes lóticos, semi-lóticos e lênticos.