UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

MARCELO LEITE VIEIRA COSTA

DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO EXPERIMENTAL DE

ESTEATOHEPATITE INDUZIDA PELO ANTINEOPLÁSICO

IRINOTECANO

FORTALEZA-CE

2012

MARCELO LEITE VIEIRA COSTA

DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO EXPERIMENTAL DE

ESTEATOHEPATITE INDUZIDA PELO ANTINEOPLÁSICO

IRINOTECANO

Tese apresentada ao programa de Pós-

Graduação em Farmacologia da Universidade

Federal do Ceará como requisito parcial para

obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Área de concentração: Inflamação e Toxidade

de Antineoplásicos.

Orientador (a):

Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro

FORTALEZA-CE

2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

C874d Costa, Marcelo Leite Vieira.

Desenvolvimento de um modelo experimental de esteatohepatite induzida pelo antineoplásico irinotecano. / Marcelo Leite Vieira Costa. – 2012.

111, f. : il. color., enc. ; 30 cm. Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências da Saúde,

Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia, Doutorado em Farmacologia, Fortaleza, 2012. Área de Concentração: Inflamação e Toxicidade de Antineoplásicos. Orientação: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro. 1. Fígado Gorduroso. 2. Quimioterapia. 3. Citocinas. 4. Translocação Bacteriana I.

Título.

CDD 616.3623

MARCELO LEITE VIEIRA COSTA

DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO EXPERIMENTAL DE

ESTEATOHEPATITE INDUZIDA PELO ANTINEOPLÁSICO

IRINOTECANO

Aprovada em : 20/12/2012

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro

Universidade Federal do Ceará

(Orientador)

Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP

Prof. Dr. José Milton de Castro Lima

Universidade Federal do Ceará

Prof. Dr. Markus Andret Cavalcante Gifoni

Instituto do Câncer do Ceará – ICC

Prof. Dr. Thiago Mattar Cunha

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP

Dedico este trabalho à minha esposa Lara

e aos meus filhos Victor e Davi com quem

compartilho todas as minhas conquistas

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, pela confiança e amizade que foram fundamentais para a realização desse trabalho. Ao meus co-orientadores Prof. Roberto César Pereira Lima Júnior e Dra Karoline Sabóia Aragão pelo companherismo, competência e pela ajuda preciosa em todas as fases deste projeto. Ao Prof. Paulo Roberto, pela disponibilidade, presteza e pelas indispensáveis análises histopatológicas realizadas nesse trabalho. À Profa Gerly Brito, pela colaboração nas análises histológicas Ao amigo e colega Caio Abner, pela ajuda fundamental na formatação e ilustração deste trabalho À minha querida irmã Ana Carolina Leite Vieira Costa pela cumplicidade e companherismo. Aos meus pais, pelo amor, pelo esforço para minha educação e por seus exemplos de dedicação e trabalho que me servem de referência para alcançar meus objetivos. Aos meus irmãos pela verdadeira amizade e por estarem sempre presentes na minha vida. Aos alunos de iniciação científica, Leandro Linhares, Lorena Nunes, Raphael Marques, Raul Medeiros, Cayo Goes e Lucas Grassi pela amizade, pela colaboração e interesse científico. Aos técnicos Socorro França (morfologia) e Vandinha França Pinheiro (LAFICA) pela competência, organização e pelos excelentes profissionais que são. À secretária Aura Rhanes Yida e Márcia Borges pela atenção e gentileza com que sempre me atenderam junto à pós-graduação. Aos funcionários do Departamento de Fisologia e Farmacologia: Haroldo, Fernando, Joana, Alana, pela indispensável ajuda na manutenção das atividades do departamento. À CAPES, CNPq e FUNCAP pelo apoio financeiro.

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.” (Albert Einstein)

RESUMO

Introdução: A esteatohepatite não alcoólica (NASH) é um evento adverso do quimioterápico irinotecano extremamente relevante, pois associa-se a uma maior mortalidade após ressecções hepáticas. Até o momento não há na literatura um modelo experimental bem estabelecido de NASH induzido por irinotecano. Objetivo: Estabelecer um modelo experimental de NASH induzida pelo irinotecano em camundongos que simule os aspectos histopatológicos encontrados na clínica. Estudar os mecanismos e mediadores envolvidos na sua fisiopatologia incluindo citocinas inflamatórias, estresse oxidativo e participação da translocação bacteriana intestinal. Métodos: Camundongos machos do tipo Swiss, pesando entre 25 a 30g,foram divididos em grupos experimentais (n=8-10) e foram injetados com solução salina (5 mL/kg, i.p.) ou Irinotecano nas doses 25, 50, 75 or 100 mg/kg, i.p, três vezes por semana em dias alternados. Os animais foram então pesados e sacrificados ao fim das semanas 1, 3, 5, 7 e 9. No sangue foram dosados os níveis de ALT e AST, leucograma, proteínas totais e realizada hemocultura da veia porta e do plexo ocular. Nas amostras do tecido hepático, avaliaram-se os níveis de lipídeos totais, mieloperoxidase, malonaldeído e glutationa (GSNP) seguida da análise histopatológica realizada após preparação da lâmina pelos métodos HE e Masson para avaliar e graduar os critérios histológicos da NASH. As amostras de duodeno foram examinadas histologicamente (HE) para graduar a mucosite. Imunohistoquímica para IL-1, IL-18, NOSi, TNFα e TLR-4 foi realizada tanto nas amostras hepáticas como duodenais. A análise estatística foi realizada empregando o teste t de Student para variáveis não pareadas ou o teste Mann-Whitney quando indicado. Resultados: A dose de 50mg/kg de irinotecano três vezes por semana i.p. (IRI 50) se associou com perda de peso, leucopenia, hepatomegalia, diminuição das proteínas plasmáticas e aumento das enzimas hepáticas (ALT e AST). IRI 50 alterou os parâmetros de estresse oxidativo, elevando a expressão de malonaldeído e diminuindo GSNP com início na primeira semana do experimento. IRI 50 também se associou a todas as alterações histológicas da NASH (esteatose, infiltração neutrofílica e tumefação celular e fibrose) analisadas na sétima semana quando comparado com controle salina. Nas amostras duodenais, observamos alterações histológicas de mucosite severa a partir da terceira semana. Houve também em IRI 50 aumento da imunoexpressão de IL-1, NOSi e TLR-4 tanto nas amostras do fígado como nas do duodeno na semana 7. Nas hemoculturas de sangue portal e orbitário identificou-se o crescimento de enterobactérias gram-negativas desda a primeira semana do experimento. Conclusão: A administração de irinotecano 50mg/kg i.p. três vezes por semana por sete semanas consecutivas é um modelo experimental que reproduz todas as alterações histopatológicas da NASH induzida por irinotecano observadas na clínica. Existem evidências da participação concomitante das citocinas inflamatórias e do estresse oxidativo na patogênese da NASH em nosso modelo. A translocação bacteriana intestinal com bacteremia portal por gram-negativos pode ser o insulto primeiro e o elo de conexão comum entre os diversos fatores fisiopatológicos. Palavras-chave: irinotecano, esteatohepatite, translocação bacteriana, citocinas, óxido nítrico.

ABSTRACT

Introduction: The nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is a relevant adverse effect of the chemotherapy with irinotecan, since it has been associated with increased surgical mortality after hepatic resections. So far there are no reports in the literature of a well established experimental irinotecan-induced NASH model. Aim: Develop an experimental model of irinotecan-induced NASH in mice that simulate the full histological alterations found in the clinical practice. Study the possible mechanisms and mediators involved into its pathophysiology including inflammatory cytokines, oxidative stress and the participation of intestinal bacterial translocation. Methods: Male swiss mice weighting between 35 and 30g were divided into experimental groups (n=8-10) and were injected with saline (5 mL/kg, i.p.) or irinotecan in the following dosages: 25, 50, 75 or 100 mg/kg, i.p, three times a week every other day. Mice were weighted and killed at the end of the weeks 1, 3, 5, 7 and 9. Measurements of ALT and AST, leukocytes, total proteins were performed in blood samples as well as cultures of portal vein and ocular plexus blood. In the hepatic tissue samples, total lipids, myeloperoxidase, malonaldehyde and nonproteic sulfidryl groups (NPSH) levels were analyzed, followed by histological evaluation, after slide preparation through HE and Masson methods. Duodenal samples were examined histologically for mucositis grading. Immunohistochemistry analysis for IL-1, IL-18, NOSi, TNFα e TLR-4 were performed in both hepatic and duodenal tissue samples. Statistical analysis was carried out through Student’s t test or Mann-Whitney test, as indicated. Results: The dose of 50mg/kg of irinotecan three times a week i.p. (IRI 50) associated to weight loss, low white cell count, hepatomegaly, decreased total plasma proteins and elevated hepatic enzymes (AST and ALT). IRI 50 altered oxidative stress parameters, elevating elevating malonaldehyde and decreasing NSPG levels at hepatic tissue starting at week 1. IRI 50 also was associated to the full histological changes found in NASH (steatosis, neutrophilic infiltration and hepatocyte balloning) when analyzed at the seventh week and compared to saline group. The duodenal samples showed severe mucositis changes starting at week three. It was also demonstrated elevated immunostaining for IL-1, iNOS and TLR-4 in both liver and duodenal samples at week seven. The cultures were positive for gram negative intestinal bacteria in portal and orbital blood since the first experimental week. Conclusion: The administration of the irinotecan 50mg/kg i.p. three times a week for seven consecutive weeks is an experimental model that reproduces all the histological changes found in the irinotecan-associated NASH found in clinical practice. Concomitant participation of inflammatory cytokines and oxidative stress were found to play a role in NASH pathogenesis in this model. Intestinal gram-negative bacterial translocation leading to portal bacteremia may represent the very first hepatic insult and the connection between the pathogenic factors. Keyworks: Irinotecan, steatohepatitis, bacterial translocation, cytokines, nitric oxide.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Metabolismo do Irinotecano 23

Figura 2 Segmentação hepática 25

Figura 3 Lóbulo hepático 27

Figura 4 Espaço de Disse 28

Figura 5 Metabolismo dos lipídeos no fígado 33

Figura 6 Regulação das vias de sinalização de citocinas da família da interleucina-1 (IL-1)

41

Figura 7 Esquema de injeção do Irinotecano e sacrifício dos animais

48

Figura 8 Irinotecano induziu uma mortalidade animal dose dependente

56

Figura 9 Tratamento com Irinotecano induz alteração do peso corporal e do peso hepático líquido em camundongos

58

Figura 10 Concentrações plamáticas de ALT e AST nos grupos de animais tratados com irinotecano e no grupo controle

60

Figura 11 Aspecto macroscópico do fígado 61

Figura 12 Fotomicrografias do fígado 62

Figura 13 Irinotecano induz fibrose hepática tardia 65

Figura 14 Atividade de MPO e Infiltrado lobular 66

Figura 15 Dosagem de lipídeos no tecido hepático e proteínas totais séricas

68

Figura 16 Dosagem de malonaldeído (MDA) e glutationa (NPSH) no tecido hepático

69

Figura 17 Contagem de leucócitos totais no sangue 70

Figura 18 Irinotecano aumenta a imunoexpressão de IL-1β no tecido hepático

73

Figura 19 Irinotecano aumenta a imunoexpressão de iNOS no tecido hepático

74

Figura 20 Irinotecano aumenta a imunoexpressão de TLR4 no tecido hepático

75

Figura 21 Fotomicrografias do duodeno de camundongos que receberam injeção de salina ou irinotecano

77

Figura 22 Irinotecano aumenta a imunoexpressão de TLR4 no tecido duodenal

80

Figura 23 Irinotecano aumenta a imunoexpressão de iNOS no tecido duodenal

81

Figura 24 Irinotecano aumenta a imunoexpressão de IL-1β no tecido duodenal

82

Figura 25 Plaqueamento em meio de cultura MaConkey, bacterioscopia pelo Gram e prova bioquímica do kit Probac de microorganismos em hemocultura

85

Figura 26A Modelo hipotético proposto para o papel da IL-1, NOSi, TLR-4 e da translocação bacteriana na patogênese da NASH induzida pelo irinotecano

100

Figura 26B Modelo hipotético proposto para o papel da IL-1, NOSi, TLR-4 e da translocação bacteriana na patogênese da NASH induzida pelo irinotecano

101

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Escores de Kleiner 63

Tabela 2 Irinotecano determina aumento do infiltrado portal e do escore de fibrose

64

Tabela 3 Irinotecano promove aumento da imunoexpressão de IL-1β, iNOS e TLR4 no tecido hepático, e não promove alteração da expressão de TNF e IL-18

72

Tabela 4 Graus de mucosite conforme Woo da primeira a sétima semana

76

Tabela 5

Irinotecano promove aumento da imunoexpressão de iNOS, TLR4 no epitélio da mucosa duodenal e aumento da imunoexpressão de IL-1β, iNOS e TLR4 nos macrófagos da submucosa duodenal

79

Tabela 6 Cultura de amostras de sangue portal (Pta) e do plexo retrorbital (Px) de camundongos em meio seletivo para bactérias gram negativas (MaConkey)

84

LISTA DE ABREVIATURAS

ALT Alanina aminotransferase

APC 7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentanóico)-1-piperidino]-

carboniloxicamptotecina

AST Aspartato aminotransferase

BHI Meio Brain Heart Infusion

CCR Câncer coloretal

CPT-11 Irinotecano

DAMP padrão molecular associado ao perigo

FFA Ácidos graxos livres

FOLFIRI 5-fluorouracil, leucovorin e irinotecano

FOLFOX 5-fluorouracil, leucovorin e oxaliplatina

FOLFOXIRI 5-fluorouracil, leucovorin, oxaliplatina e irinotecano

GSH glutationa reduzida

H2O2 peróxido de hidrogênio

H2S Sulfeto de hidrogênio

HTAB Tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio

i.p. Intraperitoneal

IFN- Interferon -

IL-1 Interleucina-1

IL-1 Interleucina-1

IL-18 Interleucina-18

iNOS Óxido nítrico sintase indutível

IRI Irinotecano

JNK Quinase do N- terminal de C-Jun (família da MAPK)

LHS Lipase hormônio sensível

LPS Lipopolissacarídeos

M Molar

MDA Malonaldeído

mg Miligrama

mL Mililitro

mM Milimolar

MPO Mieloperoxidase

NAFLD Doença gordurosa não alcoólica do fígado

NAS Escore de atividade da NASH

NASH Esteatohepatite não alcoólica

NF-B Fator de transcrição nuclear kappa B

NIH National Institute of Health

NK Células Natural Killer

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

NPC 7-etil-10-[4-amino-1-piperidino]-carboniloxicamptotecina

PAMP padrão estrutural altamente conservado associado a patógenos

PBS Tampão fosfato-salino

ROS Espécies reativas de oxigênio

s.c. Subcutânea

SH-NP grupos sulfidrílicos não-protéicos

SN-38 7-etil-10-hidroxicamptotencina (metabólito do Irinotecano)

TCA ácido tricloroacético

TG Triglicerídeos

TLR-4 Receptores Toll-like 4

TNF- Fator de necrose tumoral-alfa

TRAF Fator Associado ao Receptor de TNF

UGT1A1 uridina 5’-difosfato-glicuronosil-transferase

VLDL lipoproteínas de muito baixa densidade

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 18

1.1 CANCER COLORRETAL METASTÁTICO ............................................ 18

1.2 IRINOTECANO ...................................................................................... 21

1.3 FÍGADO: FUNDAMENTOS DA MORFOLOGIA E FISIOLOGIA ........... 24

1.3.1 Anatomia ................................................................................................ 24

1.3.2 Histologia ............................................................................................... 26

1.3.3 Fisiologia ................................................................................................ 29

1.4

ESTEATOHEPATITE NÃO ALCOÓLICA (NASH): DEFINIÇÃO, DIAGNÓSTICO E CLASSIFICAÇÃO...................................................... 29

1.5 ESTEATOHEPATITE NÃO ALCOÓLICA (NASH): PATOGÊNESE ...... 31

1.5.1 Estresse Oxidativo ................................................................................. 34

1.5.2 LPS e Receptores Toll-Like 4 (Tlr-4) …………………………………....... 34

1.5.3 Mediadores Pró-Inflamatórias ................................................................ 36

1.5.3.1 Interleucina-1 ......................................................................................... 36

1.5.3.2 Fator de necrose tumoral (TNF) ............................................................. 38

1.5.3.3 Interleucina-18 ....................................................................................... 39

1.5.3.4 Óxido nítrico ........................................................................................... 39

1.6 JUSTIFICATIVA ..................................................................................... 43

2 OBJETIVOS ........................................................................................... 44

2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................ 44

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................. 44

3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 45

3.1 MATERIAL UTILIZADO ......................................................................... 45

3.1.1 Soluções, Reagentes e Fármacos ......................................................... 45

3.1.2 Equipamentos ........................................................................................ 46

3.2 ANIMAIS ................................................................................................ 46

3.3 PADRONIZAÇÃO DA ESTEATO-HEPATITE......................................... 47

3.3.1

Dosagens das Concentrações Plasmáticas de Proteínas Totais, Alanina e Aspartato Aminotransferases (ALT e AST) ............................ 49

3.3.2 Avaliação Histopatológica do Fígado ..................................................... 49

3.3.3 Ensaio de Mieloperoxidase (MPO) ........................................................ 50

3.3.4 Ensaio para Dosagem de Malonaldeído (MDA) .................................... 50

3.3.5 Determinação dos Grupos Sulfidrílicos Não-Protéicos (SH-NP) ........... 51

3.3.6 Determinação de Lipídeos no Tecido Hepático ..................................... 51

3.3.7

Reação Imunohistoquímica para iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-18 e TLR-4 ..................................................................................................... 51

3.4

ANÁLISE DE BACTEREMIA E TRANSLOCAÇÃO PARA ÓRGÃOS ALVO ...................................................................................................... 52

3.5 PARÂMETROS AVALIADOS NA MUCOSITE INTESTINAL ................. 53

3.5.1 Avaliação Histopatológica do Duodeno ................................................. 53

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................ 53

4 RESULTADOS ...................................................................................... 55

4.1 PADRONIZAÇÃO DA ESTEATO-HEPATITE ........................................ 55

4.1.1 Curva de Sobrevida ............................................................................... 55

4.1.2 Curva de Peso Corporal e Hepático ...................................................... 57

4.1.3

Dosagens das Concentrações Plasmáticas de Proteínas Totais, Alanina e Aspartato Aminotransferases (ALT e AST) ............................ 59

4.1.4 Avaliação Macroscópica e Histopatológica ............................................ 61

4.1.5 Avaliação do Infiltrado Inflamatório Hepático ......................................... 66

4.1.6 Dosagem de Lipídeos no Fígado e Proteínas Plasmáticas ................... 67

4.1.7 Avaliação do Estresse Oxidativo no Fígado .......................................... 69

4.1.8 Leucograma ........................................................................................... 70

4.1.9

Reação Imunohistoquímica para iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-18 e TLR-4 no Fígado .................................................................................... 71

4.1.10 Avaliação da Mucosite Intestinal ............................................................ 76

4.1.11

Reação Imunohistoquímica para iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-18 e TLR-4 no Intestino .................................................................................. 78

4.1.12 Avaliação da Translocação Bacteriana .................................................. 83

5 DISCUSSÃO .......................................................................................... 86

6 CONCLUSÃO...................................................................................... 99

REFERÊNCIAS ..................................................................................... 102

18

1. INTRODUÇÃO

O número de agentes antineoplásicos tem crescido exponencialmente e

contribuído para o aumento da sobrevida de pacientes oncológicos. Entretanto,

efeitos adversos relacionados à quimioterapia do cancer como náuseas,

neutropenia, mucosite gastrointestinal, neurotoxicidade, cardiotoxicidade e

hepatotoxicidade representam um claro fator limitante do seu benefício. Além do

potencial prejuizo à qualidade de vida dos pacientes, a toxicidade dos

quimioterápicos pode levar a alterações de intensidade de dose e comprometimento

da eficácia do tratamento (SONIS et al., 2004). Portanto, tão importante quanto o

desenvolvimento de novas drogas é o entendimento e o manejo adequado das

toxicidades dos agentes já disponíveis, levando à possibilidade de pleno

aproveitamento dos seus potenciais terapêuticos.

Muito tem se descoberto sobre os processos e mediadores envolvidos nos

efeitos colaterais da quimioterapia do câncer. No entanto, apesar dos avanços

esclarecedores no mecanismo de alguns efeitos adversos, outros ainda

permanecem pouco compreendidos. A toxicidade hepática relacionada ao uso de

quimioterapia só recentemente tem sido descrita, e sua fisiopatologia permanece

desconhecida.

1.1. Cancer colorretal metastático

O câncer coloretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o

mundo e uma das principais causas de óbito por câncer (KUVSHINOV e FONG,

2007). O fígado é o sítio mais freqüente de metástases no CCR. Ao diagnóstico do

tumor primário, 15 a 25% dos pacientes apresentam metástases hepáticas

(sincrônicas), 50% dos pacientes desenvolverão doença metastática no fígado

durante o curso de sua doença (metacrônica) (CHEN et al., 2011), e em cerca de

30% dos óbitos a doença está restrita ao fígado (KUVSHINOV e FONG, 2007).

Assim, as estratégias de tratamento das metástases hepáticas do CCR adquirem

grande importância no manejo dessa neoplasia (ALBERTS e POSTON, 2011).

Por um longo tempo, o CCR metastático foi considerado incurável e de

prognóstico sombrio. A quimioterapia acrescentava pouco, sequer algum benefício

para esses pacientes. Esse quadro vem mudando dramaticamente. No inicio dos

19

anos 2000, estudos clínicos com agentes quimioterápicos mais eficazes como

irinotecano e oxaliplatina evidenciaram benefício em qualidade de vida, taxa de

resposta e ganho expressivo na sobrevida global mediana, que passou de 6 a 12

meses nos pacientes sem tratamento (KUVSHINOV e FONG, 2007) para 20 a 22

meses nos pacientes expostos a estas drogas (RAMIA-ANGEL et al., 2011). Mais

recentemente, a incorporação de agentes biológicos ao arsenal terapêutico

proporcionou um benefício adicional ao tratamento quimioterápico padrão (VAN

CUTSEM et al., 2009; HURWITZ et al, 2004). Esses avanços, porém, não são

considerados suficientes porque conservam o intuito paliativo do tratamento: a

maioria dos pacientes morre em consequência do CCR.

A cura do CCR metastático, entretanto, parece ser um objetivo realista

quando a quimioterapia é combinada à cirurgia na abordagem dos pacientes com

metástases exclusivamente hepáticas. Desta forma, uma avaliação multidisciplinar,

incluindo o cirurgião oncológico abdominal e o oncologista clinico, é essencial para a

determinação da ressecabilidade das lesões hepáticas. Os critérios para determinar

a viabilidade da metastasectomia incluem a chance de resseccão de toda evidência

de doença com margens negativas e a manutenção de adequada reserva hepática.

Em 1952 foi realizada por Lortat-Jacob a primeira lobectomia hepática para

tratamento de CCR metastático. Com o tempo, as metástases hepáticas passaram a

ser a principal indicação de hepatectomias parciais. Inúmeras grandes séries de

casos foram publicadas com aceitáveis taxas de mortalidade (abaixo de 5%)

(KUVSHINOV e FONG, 2007; HOUSE et al., 2010) e resultados de sobrevida

animadores. Para metástases restritas ao fígado, a ressecção hepática sem doença

residual (R0) é capaz de promover taxas de sobrevida global em 5 anos variando

entre 30 a 60% (KUVSHINOV e FONG, 2007, WEI et al., 2006) enquanto poucos

pacientes não ressecados ultrapassam 3 anos de sobrevida em séries históricas

(ROUGIER et al., 1995).

Em pacientes candidatos à ressecção de metástases hepáticas de CCR, a

quimioterapia pré-operatoria tem sido utilizada em dois cenários clínicos distintos. O

primeiro envolve o uso de quimioterapia em lesões inicialmente ressecáveis,

presentes em 10% a 20% dos pacientes com CCR metastático (KUVSHINOV e

FONG, 2007). Esta estratégia apresenta vários objetivos: controlar a doença

micrometastática, avaliar a responsividade ao esquema a ser utilizado (que tem

valor prognóstico e influencia o planejamento terapêutico pós-operatório), e

20

selecionar os pacientes candidatos à cirurgia (RAMIA-ANGEL et al., 2011). Os

pacientes que têm progressão da doença na vigência do tratamento neoadjuvante

caracterizam um subgrupo de mau prognóstico, determinando uma contra-indicação

relativa às cirurgias hepáticas de grande porte (ADAM et al., 2004b).

O segundo cenário representa pacientes com metástases hepáticas

inicialmente irressecáveis que se submetem à chamada terapia de conversão, com

objetivo de tornar a doença ressecável. Com protocolos de poliquimioterapia

baseados em 5-fluorouracil, como FOLFOX (com oxaliplatina), FOLFIRI (com

irinotecano), ou FOLFOXIRI (com oxaliplatina e irinotecano), combinados ou não

com agentes biológicos, as respostas obtidas levam a ressecabilidade em até 40%

dos casos (BISMUTH et al., 1996; ADAM et al., 2004a; POZZO et al., 2004). Os

pacientes ressecados após a terapia de conversão apresentam sobrevidas

semelhantes aos pacientes inicialmente ressecáveis, demonstrando um benefício

real dessa abordagem e seu forte impacto terapêutico (ADAM et al., 2004a).

Por esses motivos, a quimioterapia pré-operatória é uma tendência universal

na moderna prática oncológica para o tratamento das metástases hepáticas do

CCR. A recomendação é de que a cirurgia seja realizada após 2 a 3 meses de

quimioterapia, e seguida de quimioterapia adjuvante por um total de 6 meses de

tratamento perioperatório. A tentativa de estabelecer um limite de exposição aos

agentes quimioterápicos no pré-operatório reflete a preocupação quanto aos efeitos

deletérios dessas drogas no parênquima hepático não tumoral. A oxaliplatina tem

sido relacionada a injúria sinusoidal hepática (RUBBIA-BRANDT, 2004) e o

irinotecano a esteatohepatite (VAUTHEY, 2006).

A realização de ressecções com um remanescente hepático patológico pode

limitar a capacidade de regeneração hepática, influenciando o resultado cirúrgico

(HAMMOND et al., 2011). Em condições normais, o fígado pode ser ressecado em

até aproximadamente 80% do seu volume total com segurança (KUVSHINOV e

FONG, 2007). Em um fígado doente, até mesmo pequenas ressecções podem ter

elevada morbidade, com o desenvolvimento de insuficiência hepática pós-operatória

(HAMMOND et al., 2011).

21

1.2. Irinotecano

O irinotecano é um derivado semi-sintético da camptotecina. Esta substância

foi inicialmente isolada por WALL em 1966 a partir de uma planta nativa da China e

do Tibet, a Camptotheca acuminata. O irinotecano e seu metabólito ativo, o SN-38,

exercem suas atividades antineoplásicas impedindo a duplicação da molécula de

DNA, através da inibição seletiva da topoisomerase I.

A topoisomerase I é uma enzima que atua sobre a dupla fita do DNA

relaxando a supertorção gerada durante a fase de transcrição e replicação do DNA

(WANG, 1996). Devido ao tamanho do cromossomo eucariótico, a remoção da

supertorção se faz necessária e é realizada através da introdução de quebras

transitórias em uma das cadeias de dupla fita do DNA, o que permite que a cadeia

que foi quebrada gire em torno da fita complementar intacta e a supertorção

conseqüentemente seja removida. Após o relaxamento, a ligação intermediária

covalente entre a topoisomerase I e o DNA se desfaz, sendo a fita de DNA religada

normalmente, permitindo a continuação da replicação (CHAMPOUX, 2001).

Contudo, uma variedade de drogas tem capacidade, tanto in vivo como in vitro, de

estabilização do intermediário covalente topoisomerase I-DNA, como, por exemplo,

o topotecano e o irinotecano. A topoisomerase I é, portanto, o alvo molecular da

ação desses agentes, sendo os efeitos citotóxicos, conseqüentemente, fase S

específicos (CHAMPOUX, 2001).

O irinotecano é uma droga antineoplásica ativa contra uma variedade de

tumores, sendo utilizado principalmente no tratamento do câncer coloretal (SALTZ et

al., 2000, CHESTER et al., 2003). É um precursor hidrossolúvel do metabólito

lipofílico SN-38 (figura 1). Os estudos bioquímicos e análises de citotoxicidade

realizados in vitro em células tumorais humanas e de roedores indicam, de forma

consistente, que o SN-38 é, pelo menos, 1000 vezes mais potente como um inibidor

de topoisomerase I do que o irinotecano (KOIZUMI et al., 2006), sendo este último,

por conseqüência, comumente descrito como sendo uma pró-droga. Os detalhes do

metabolismo e excreção do irinotecano estão ilustrados na Figura1.

Dentre os efeitos colaterais mais freqüentes do irinotecano destaca-se a

mucosite intestinal (IKUNO et al., 1995; FREITAS, 2007). A destruição celular

gastrointestinal observada na mucosite por uso de antineoplásicos é resultado de

hipoproliferação celular com atrofia das vilosidades e aprofundamento das criptas,

22

que resulta em disfunção absortiva e alteração na secreção de eletrólitos,

principalmente Na+ e K+, podendo acarretar diarréia (KEEFE, 2007). A presença de

um epitélio intestinal funcionalmente e estruturalmente danificado favorece a

translocação bacteriana, evento que parece desempenhar papel relevante na

toxicidade intestinal e extra-intestinal da quimioterapia (GIBSON et al, 2003;

MARTIN e WALLACE, 2006).

A esteatohepatite é outro evento adverso do irinotecano extremamente

relevante. O risco de desenvolver esteatohepatite é 3,45 vezes maior em pacientes

expostos ao irinotecano em relação aos pacientes virgens de quimioterapia (IC 95%

1,12-10,62; p=0,03) (ROBINSON et al., 2012). A mortalidade cirúrgica após

ressecções hepáticas demonstrou-se significativamente maior em pacientes com

esteatohepatite associada ao irinotecano (odds ratio 10,5; p=0,001), primordialmente

por insuficiência hepática (VAUTHEY et al., 2006). Os mecanismos patogênicos

deste efeito colateral são ainda desconhecidos.

23

Figura 1 – Metabolismo do Irinotecano. No fígado, a enzima CYP3A4 atua sobre o CPT-11 gerando dois compostos inativos, APC (7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentanóico)-1-piperidino]-carboniloxicamptotecina) e NPC (7-etil-10-[4-amino-1-piperidino]-carboniloxicamptotecina). O NPC pode ser metabolizado pela carboxiesterase (CE) em SN-38. A depuração do SN-38 é feita no fígado pelo polipeptídio A1 da família da uridina difosfato glicosiltransferase 1 (UGT1A1), gerando glicuronídios de SN-38 (SN-38G), que são desprovidos de atividade biológica. CPT-11, SN-38 e SN-38G são excretados na bile através das proteínas de transporte MDR1 (multidrug resistance protein 1) e MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2) e chegam ao intestino delgado. No intestino delgado, o CPT-11 pode ser clivado pela CE intestinal, formando mais SN-38. Além disso, o SN-38G pode ser desconjugado pela ação de bactérias

intestinais produtoras de -glicuronidase, transformando-se novamente em SN-38. Este, por sua vez, é reabsorvido iniciando um processo de recirculação êntero-hepática (TAKASUNA et al., 1996; CHESTER et al., 2003; TALLMAN, 2005).

24

1.3. Fígado: Fundamentos da morfologia e fisiologia

1.3.1. Anatomia

Um bom conhecimento da morfologia do fígado é fundamental para o

entendimento de suas principais patologias. O fígado é o maior órgão sólido do

organismo pesando de 1200 a 1600 gramas e ocupa grande parte do quadrante

superior direito do abdome (TOWNSEND, 2012). O fígado apresenta duplo

suprimento vascular. A artéria hepática é responsável pela vascularização sistêmica

que corresponde a cerca de 25% do fluxo sanguíneo hepático. A veia porta leva

sangue com baixa oxigenação, originário dos capilares intestinais e representa 75%

do fluxo hepático. O sangue é drenado do fígado através de três veias hepáticas

principais (direita, média e esquerda) que drenam diretamente para a veia cava

inferior (TORTORA, 2002). A bile produzida no fígado é drenada por ductos biliares

intra-hepáticos terminais que progressivamente se unem para formar os ductos

hepáticos maiores direito e esquerdo. Os ductos direito e esquerdo por sua vez, se

unem no hilo hepático para formar o ducto hepático principal que desemboca na

segunda porção duodenal através da papila de Vater (TOWNSEND, 2012).

O conceito anatômico moderno do fígado baseia-se em sua segmentação

funcional e compreende 8 segmentos. Cada segmento hepático apresenta seu

suprimento vascular e drenagem biliar próprios, através dos seus pedículos

correspondentes. Cada pedículo é composto pela chamada tríade portal que

compreende um ramo da artéria hepática, da veia porta e do ducto biliar (MARTINS,

2008; CLAVIEN, 2010) (Figura 2).

25

Figura 2. Segmentação hepática. Cada segmento hepático recebe suprimento de sua própria tríade portal (veia porta, artéria hepática e ducto biliar). As veias hepáticas direita, média e esquerda desembocam na veia cava inferior e dividem o fígado em 4 setores. O lobo direito é composto pelos segmentos V, VI, VII e VIII; o lobo esquerdo é composto pelos segmentos II, III e IV. O segmento I é o lobo caudado. (Fonte: BLUMGART LH, FONG Y. Surgery of the Liver and Biliary Tract. Londres, WB Saunders, pp3-34, 2000).

26

1.3.2. Histologia

O parênquima hepático é organizado em unidades funcionais denominadas

ácinos ou lóbulos. O lóbulo é formado por um ramo venoso terminal cercado por

quatro a seis ramos da tríade portal (artéria hepática, veia porta e ducto biliar)

gerando uma unidade poligonal (hexagonal ou quadrangular). Entre as tríades

portais e a veia central (centro-lobular), os hepatócitos são dispostos em múltiplas

placas de monocamadas envoltas de cada lado por espaços revestidos por endotélio

repletos de sangue chamados sinusóides (MATSUMOTO e KAWAKAMI, 1982).

O sangue flui de maneira centrípeta, saindo das tríades portais terminais em

direção a veia cento-lobular. Esse sangue flui nos sinusóides entre as placas de

hepatócitos sofrendo extensa modificação química antes de drenar para as veias

hepáticas. Observam-se grandes lacunas entre as células endoteliais dos sinusóides

e o plasma encontra-se em íntimo contato com os hepatócitos. O espaço

extravascular compreendido entre os sinusóides e os hepatócitos é denominado de

espaço de Disse onde encontram-se as células estelares ou de Ito. Essas células de

alto conteúdo lipídico armazenam vitamina A e podem adquirir um fenótipo

semelhante ao miofibroblasto ativado durante o processo fibrogênico (FRIEDMAN et

al. 1985; LIMA, 2010). Existem também numerosos macrófagos ancorados ao

endotélio dos sinusóides que são denominados de células de Kupffer (GANONG,

2007).

A bile segue o caminho oposto ao do sangue, sendo formada nos hepatócitos

e coletada em pequenos dúctulos biliares que coalescem em direção a tríade portal.

Essa unidade funcional representa uma base estrutural para as várias funções

secretórias e metabólicas do fígado (TOWNSEND, 2012).

Entre as tríades portais e a veia centro-lobular existem três zonas que diferem

em seus arsenais enzimáticos bem como ao grau de exposição aos nutrientes e ao

sangue oxigenado. A zona 1 tem localização próxima a tríade portal e

consequentemente melhor oxigenada; a zona 2 é intermediária e possui oxigenação

moderada; a zona 3 é perivenular e bem menos oxigenada e propensa a lesões por

hipóxia (LAMERS, 1989).

27

Figura 3. Lóbulo hepático. Unidade funcional do fígado, o lóbulo hepático é composto da veia centrolobular cercada por coluna de hepatócitos e pelos sinusóides. Na periferia do lóbulo encontram-se os espaços porta compostos pelas tríades portais (ramo arterial, venoso portal e biliar).

28

Figura 4. Espaço de Disse. Entre as camadas de hepatócitos e os sinusóides encontra-se o espaço de Disse. Nele estão presentes as células esteladas que exercem importante papel na fibrogênese hepática. Na luz dos sinusóides, aderidos ao endotélio encontram-se as células de Kupffer, que são semelhantes aos macrófagos.

29

1.3.3. Fisiologia

O fígado desempenha múltiplas funções fisiológicas, sendo o órgão central na

homeostase metabólica. Como glândula, secreta a bile, que é importante na

digestão e absorção de gorduras e de substâncias liposolúveis ingeridas pela dieta

(GANONG, 2007). O fígado tem papel central na regulação do metabolismo

energético coordenando a captação, o processamento e a distribuição de nutrientes

e seus produtos energéticos subseqüentes. O fígado também sintetiza um grande

número de proteínas, enzimas e vitaminas que participam de uma extensa variedade

de processos orgânicos vitais. Importante também é o seu papel de detoxificação e

eliminação de um vasto número de substâncias exógenas e endógenas servindo

como um verdadeiro filtro para o corpo humano (TOWNSEND, 2012).

Uma das principais características fisiológicas do fígado é a sua elevada

capacidade de regeneração. Essa capacidade de ajustar seu volume conforme as

necessidades corporais pode ser observada na clínica após ressecções hepáticas

ou hepatopatias agudas. A regeneração hepática é uma resposta de hiperplasia

proporcional de todos os tipos celulares de forma que a anatomia microscópica final

se mantém funcional. Doenças hepáticas crônicas podem determinar variados

graus de comprometimento da capacidade regenerativa do fígado (HAMMOND et

al., 2011).

1.4. Esteatohepatite não alcoólica (NASH): Definição, diagnóstico e

classificação

A esteatohepatite não alcoólica (NASH) é uma entidade clínica que foi

descrita pela primeira vez em um estudo da Mayo Clinic (LUDWIG et al., 1980) e

desde então tem sido reconhecida com freqüência crescente na prática clínica. A

NASH é um componente da Doença Gordurosa não alcoólica do fígado (NAFLD).

Essa síndrome é definida como um espectro que varia desde a esteatose simples,

achado muito prevalente e com poucas repercussões clínicas, até diferentes graus

de lesão inflamatória hepática que pode determinar deterioração da função hepática

com um risco potencial de evolução para cirrose (MULHALL et al., 2002). Assim,

para se definir NASH é necessária a presença de esteatose associada a lesões

necro-inflamatórias características como tumefação hepatocítica, inflamação e

30

fibrose (BRUNT et al. 1999). Uma combinação desses achados histológicos

representa uma forma mais severa da doença e com o potencial risco de progressão

silenciosa para a cirrose hepática que pode ocorrer em até 24% dos casos

(MATTEONI et al. 1999). A necessidade de uma estratificação prognóstica baseada

nos achados histológicos se tornou evidente.

Um sistema de avaliação semiquantitativa foi desenvolvido por BRUNT et al.

(1999), através de um estudo retrospectivo de 51 biópsias hepáticas. Um total de

dez achados histológicos estudados sabidamente associados a NASH foram

categorizados em graus de severidade. O autor determinou que, dentre as variáveis

estudadas, a combinação de esteatose, tumefação hepatocítica e infiltrado

inflamatório lobular se constituiu na base para o diagnóstico. O sistema proposto se

baseia no conceito de que o diagnóstico histológico da NASH é definido por um

conjunto de fatores e não por um achado histológico isolado. Esses três achados em

conjunto apresentam, segundo o autor, uma maior acurácia em refletir a severidade

do dano hepático.

Mais recentemente um escore quantitativo e de maior aplicabilidade prática foi

desenvolvido utilizando os mesmos parâmetros histológicos descritos por Brunt

(KLEINER et al. 2005). O autor incluiu 50 espécimes de biópsias hepáticas e os

casos foram cegamente avaliados, por duas vezes e de forma independente por

nove patologistas. Os avaliadores foram orientados, baseados na observação de 14

achados histológicos previamente definidos e categorizados, a classificar as biópsias

como NASH improvável, NASH marginal ou NASH. Após a comparação das

avaliações intra e inter patologistas, foram selecionadas 3 das variáveis histológicas

com base no grau de concordância entre as avaliações e nas suas capacidades

preditivas para o diagnóstico de NASH. O Escore de atividade da NASH (NAS)

quantifica cada um das três variáveis histológicas através da gradação da

severidade dos achados: esteatose (0 a 3); inflamação lobular (0 a 3); vacuolização

(0 a 2). O escore final gerado varia de 0 a 8 e indica a presença e a severidade da

NASH. Assim, escores < 3 indicam NASH pouco provável, escores 3 e 4 indicam

NASH marginal e escores > 5 são diagnósticos de NASH (KLEINER et al., 2005).

Outros achados histológicos que classicamente também se associam com

NASH como infiltração inflamatória portal, presença de corpos hialinos de Mallory ou

megamitocôndrias não tiveram associação forte ou estatisticamente independente

com a esteatohepatite. O achado de fibrose se correlacionou fortemente com o

31

diagnóstico de NASH, porém apresentou-se pouco específica e com baixa

capacidade preditiva negativa. A fibrose foi considerada pelo autor como menos

reversível e como consequência da atividade da doença não sendo, portanto,

incluída como componente do escore. Apesar de não fazer parte dos critérios

diagnósticos, a presença de fibrose é muito importante e deve ser sempre avaliada,

pois tem correlação prognóstica. Uma classificação específica para a NASH tem sido

utilizada que categoriza a fibrose em graus crescentes de severidade: grau 0 –

ausência; grau 1 – perisinusoidal ou periportal; grau 2 – perisinusoidal e periportal;

grau 3 – fibrose em ponte; grau 4 – cirrose (KLEINER et al., 2005). A associação de

NASH e fibrose caracteriza um subgrupo de pacientes com particular risco de

progredir para a cirrose, com taxas de progressão de até 24% (MATTEONI et al.,

1999).

O NAS proposto é simples de aplicar e requer apenas colorações

histológicas de rotina (hematoxilina-eosina) e tricrômico de Masson para avaliação

da fibrose, sendo portanto de fácil reprodutibilidade. O NAS foi também ao mesmo

tempo validado, na medida em que demonstrou elevada concordância entre o grupo

de avaliadores do estudo composto de nove experientes hepatopatologistas

(KLEINER et al., 2005).

1.5. Esteatohepatite não alcoólica (NASH): Patogênese

A compreensão dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento da

NASH é de suma importância, pois poderá permitir estratégias mais eficazes para

sua prevenção e tratamento. Baseado em dados clínicos e experimentais, o modelo

chamado de “two hits” (duas etapas) ainda é o mais utilizado para a explicação da

NASH. Nesse modelo, o desenvolvimento da esteatose corresponde à primeira

etapa e tornaria o fígado mais susceptível para danos subseqüentes (segunda

etapa) que finalmente levariam ao dano hepatocelular, inflamação e fibrose que

caracterizam a NASH (DAY e JAMES, 1998).

A primeira etapa envolve os mecanismos que culminam com o acúmulo de

gordura, sob a forma de triglicerídeos, no fígado. Nesta fase, a resistência insulínica

parece ser o principal fator envolvido, definida por uma menor sensibilidade dos

tecidos à ação da insulina. A forte associação de esteatose e patologias como

diabetes mellitus, obesidade visceral e a condição chamada de síndrome metabólica

32

é explicada pela resistência insulínica, condição comum a todas essas patologias

(CHITTURI e FARRELL, 2001; LIMA, 2010).

A resistência periférica à insulina determina um aumento da lipólise no tecido

adiposo, causada pela perda da inibição, mediada pela insulina, da enzima lipase

hormônio sensível (LHS). No tecido adiposo, a maior atividade da enzima LHS

aumenta a hidrólise do triacilglicerol e diminui a esterificação dos ácidos graxos

livres, aumentando sua liberação para o plasma e com um conseqüente aumento do

influxo de ácidos graxos para o fígado (CHITTURI e FARRELL, 2001; LIMA, 2010).

Ocorre também uma hiperinsulinemia compensatória secundária à diminuição da

sensibilidade à insulina no tecido periférico (TILG e MOSCHEN, 2010). No fígado, os

elevados níveis de insulina promovem lipogênese e inibição da degradação de

ácidos graxos através da β-oxidação mitocondrial (CHITTURI e FARRELL, 2001). O

resultado final é o progressivo acúmulo de lipídeos nos hepatócitos,

predominantemente sob a forma de triglicerídeos, promovendo a esteatose (TILG e

MOSCHEN, 2010). A esteatose macrovesicular é a conseqüência de longo prazo

desse distúrbio crônico do metabolismo lipidico hepático e tem, na maior parte das

vezes, evolução benigna (DAY e JAMES, 1998). A esteatose isolada pode ser,

portanto, mais um fenômeno paralelo aos mecanismos de lesão do que

verdadeiramente responsável pela hepatotoxicidade na NASH (CORTEZ-PINTO et

al., 2006).

A segunda etapa envolve um novo mecanismo de lesão hepática que pode

ser potencializado quando ocorre em um fígado esteatótico (DAY e JAMES, 1998).

Os melhores candidatos a fatores promotores da lesão nessa segunda etapa são o

estresse oxidativo, com a peroxidacao lipídica, e a exposição do fígado ao

lipopolissacarideo (LPS) bacteriano, com a ativação de citocinas pró-inflamatórias

(CORTEZ-PINTO et al., 2006).

33

Figura 5. Metabolismo dos lipídeos no fígado. Os ácidos graxos livres (FFA) chegam ao fígado através da veia porta , absorvidos na dieta ou pela lipólise periférica. No fígado podem ser oxidados a acetil coenzima A pela β oxidação mitoconfrial ou pelas oxidases citoplasmáticas que podem gerar espécies reativas de oxigênio. Os ácidos graxos livres também podem ser exportados através da síntese de lipoproteínas de muito baixa densidade VLDL) ou armazenados no fígado sob a forma de triglicerídeos (TG).

34

1.5.1. Estresse oxidativo

A peroxidação lipídica mediada por espécies reativas de oxigênio (ROS) tem

sido considerada como um potencial mecanismo de lesão na patogênese da NASH

(PESSAYRE e FROMENTY, 2005). O aumento de ácidos graxos livres no hepatócito

pode saturar a β- oxidação mitocondrial, que é a via preferencial de degradação dos

ácidos graxos e que gera acetil coenzima A. Assim, com a saturação da via

mitocondrial, a β- oxidação alternativa (peroxisomal) sofre um acréscimo,

aumentando a geração de peróxido de hidrogênio, que é seu produto final. O

peróxido de hidrogênio formado é convertido em outros ROS e amplifica a cascata

do estresse oxidativo (DAY e JAMES, 1998).

O estresse oxidativo pode explicar a ocorrência de vários achados

histológicos da NASH. A peroxidação de membranas plasmáticas e mitocondriais

pode causar diretamente dano celular, induzindo necrose e apoptose como também

a formação de megamitocôndrias (CORTEZ-PINTO et al., 2006). A peroxidação

lipídica tem como produto final a formação de compostos aldeído, notadamente

malonaldeído (MDA). O MDA pode induzir uma resposta inflamatória, pois se liga

covalentemente a proteínas hepáticas, gerando produtos que são capazes de

estimular uma resposta imunológica (ALBANO et al., 2005). MDA pode também

estimular a síntese de matriz extracelular pelas células esteladas e promover a

quimiotaxia de neutrófilos (ZAMARA et al., 2004). Finalmente, os produtos da

peroxidação lipídica podem iniciar a cascata de ativação do fator de transcrição NF-

κB, que leva o aumento da transcrição de várias citocinas inflamatórias (RIBEIRO et

al., 2004).

1.5.2. LPS e Receptores Toll-like 4 (TLR-4)

A maior exposição do fígado ao lipopolissacarídeo (LPS) ou endotoxina

bacteriana é um mecanismo capaz de elevar os níveis hepáticos de citocinas pró-

inflamatórias (DAY e JAMES, 1998). Desde que o sangue que deixa o intestino

drena diretamente para a veia porta, o fígado é particularmente exposto a uma maior

sobrecarga de endotoxina intestinal.

O papel do LPS na patogênese da NASH passou a ser investigado após a

demonstração do aumento da incidência de NASH e cirrose em pacientes

35

submetidos a cirurgia de derivação jejunoileal para obesidade (HAINES et al., 1981).

A cirurgia leva a supercrescimento bacteriano e endotoxemia portal (HAINES et al.,

1981) e o risco de NASH no pós- operatório é reduzido pelo uso de antibióticos

(DRENICK et. al., 1982). Esses achados clínicos foram reproduzidos em um modelo

experimental murino de derivação jejuno-ileal onde a lesão hepática e a esteatose

resultantes foram minimizadas com terapia antimicrobiana (VANDERHOOF et al.,

1980).

O supercrescimento bacteriano não é o único mecanismo de extravazamento

de LPS para o sangue portal. O LPS também pode chegar ao fígado pela quebra da

barreira intestinal, gerando translocação de bactérias gram negativas e com

conseqüente insulto séptico ao fígado (DAY e JAMES, 1998). O epitélio intestinal

íntegro é uma importante barreira contra infecções, pois além de representar um

obstáculo físico aos microorganismos, também produz substâncias antimicrobianas

e abriga linfócitos intra-epiteliais de defesa (ABBAS, 2008). Em um estudo

experimental com ratos obesos geneticamente modificados, observou-se uma

diminuição da barreira intestinal causada pela distribuição anormal das proteínas de

adesão do epitelio. O aumento da permeabilidade intestinal resultante gerou um

aumento da endotoxemia portal causando um severo dano inflamatório hepático

(BRUN et al., 2006). A mucosite intestinal induzida pelo irinotecano pode, da mesma

forma, determinar uma falha nos mecanismos de defesa do epitélio, favorecendo a

translocação bacteriana.

A via pela qual o LPS chega ao fígado e gera inflamação hepática envolve

sua ligação com os receptores conhecidos como TOLL-like 4 (TLR-4). Os receptores

TOLL sao proteínas transmembrana evolutivamente conservadas entre insetos e

humanos que fazem parte da imunidade inata (RIVERA et al., 2007; ABBAS, 2008).

Esses receptores foram inicialmente identificados em moscas Drosophila

melanogaster, nas quais tem um papel na embriogênese e na imunidade contra

infecções fúngicas. O primeiro relato de receptores semelhantes a TOLL (TOLL like

receptors, TLR) em humanos foi em 1994 por NOMURA et al. Atualmente, esta

familia tem 10 componentes descritos (TLR 1-10), com homologia estrutural com

TOLL e com o receptor de interleucina-1. Esses membros da família de TLR são

expressos de forma diferenciada entre as células imunes e parecem responder a

estímulos diferentes. Em geral, reconhecem padrões moleculares associados ao

perigo (DAMPs), que são moléculas endógenas liberadas nos processos de morte

36

celular ou necrose, e padrões estruturais altamente conservados associados a

patógenos (PAMPs), como flagelina, DNA bacteriano, peptidoglicano, RNA viral ou

LPS (ABBAS, 2008).

O TLR4, componente mais extensivamente estudado da família, é o principal

receptor do LPS. Após a ligação do LPS e dos cofatores MD2 e CD14, medeia a

ativação nuclear do fator nuclear KappaB e a síntese de citocinas pró-inflamatorias,

notadamente IL-1 e TNF. Além do seu papel no controle de infecções, o TLR4 tem

também participação na NASH. A expressão reduzida de TLR4 em modelos de

camundongos mutantes teve ação protetora contra o desenvolvimento de NASH

(IGOLNIKOV, 2002). No modelo experimental de colite, camundongos alimentados

com dieta rica em gordura apresentaram, além da elevação do nível de LPS portal e

da inflamação hepática severa, um aumento na expressão de TLR4 em relação ao

grupo controle (GABELLE, 2011). Assim, o TLR4 parece ser a conexão crucial no

eixo microbiota intestinal-figado relacionado a progressão da NASH.

1.5.3. Mediadores pró-inflamatórias

As citocinas são fortes candidatas a exercer papel central na patogênese da

NASH por serem capazes de induzir todas as alterações patológicas que

caracterizam a síndrome (CORTEZ-PINTO et al., 2006). A presença do insulto

inflamatório ao fígado é reconhecida como condição essencial para a progressão da

NASH e, na realidade, representa o evento limite entre a esteatose simples e a

esteatohepatite (TILG e MOSCHEN, 2010).

1.5.3.1. Interleucina-1

A IL-1 e uma citocina produzida por fagócitos mononucleares ativados e tem

papel fundamental na inflamação local e sistêmica e em uma lista crescente de

doenças.

Existem dois genes relacionados de IL-1, IL1A e IL1B, que codificam

respectivamente IL-1 e IL-1. Cada isoforma se liga ao mesmo receptor de

superfície, chamado IL-1 tipo 1 (IL-1RI), presente em quase todas as células. Uma

vez ligada ao receptor, a IL-1 induz uma cascata de mediadores inflamatórios,

quimiocinas e outras citocinas (DINARELLO, 2012).

37

O precursor de IL-1 é constitutivamente presente no citoplasma dos

queratinócitos da pele, plaquetas, células epiteliais de membranas mucosas do

corpo, em todo o endotélio e em células de órgãos como fígado, pulmão e rim. Em

condições patológicas, IL-1 move-se para a membrana celular de onde pode ativar

células adjacentes portadoras do receptor de IL-1, iniciando o processo de

inflamação estéril. Desta forma, IL-1 é tida como alarmina, não necessitando de

tempo para sua síntese e estando pronta para sua função logo que liberada, nas

primeiras horas após injúria ou isquemia.

Em contraste com a IL-1, IL-1 não está presente em células saudáveis e

requer uma série de eventos intracelulares antes de iniciar sua participação no

processo inflamatório. A IL-1 é produzida por monócitos, macrófagos teciduais e

células dendríticas por estímulo de produtos bacterianos, fator de necrose tumoral

(TNF), IL-18, IL-1 e pela própria IL-1. O passo limitante na velocidade de sua

produção é a transcrição. O produto da transcrição é ainda um precursor inativo que

após clivagem intracelular pela caspase 1, uma cisteína protease, é finalmente

convertido a IL-1.

A evidência da participação de ambas as isoformas de IL-1 em diversas

patologias vem da análise de sua imunoexpressão nos tecidos acometidos e de

estudos com inibidores específicos desta citocina. A avaliação do nível sérico de IL-1

não determina causalidade ou severidade do insulto inflamatório. Mesmo em

doenças inflamatórias mediadas por IL-1, os níveis séricos de IL-1 sofrem apenas

modestas elevações e os níveis de IL-1 permanecem indetectáveis (DINARELLO,

2012). O reconhecimento do papel da IL-1 na fisiopatologia de doenças como artrite

reumatóide, espondilite anquilosante, doença de Behcet, psoríase, gota, diabetes

tipo 2 e insuficiência cardíaca teve impacto clinico, com a incorporação de inibidores

de IL-1 aos seus arsenais terapêuticos.

No contexto da toxicidade relacionada ao tratamento do câncer, modelos

experimentais demonstraram a participação de IL-1 em condições como cistite

hemorrágica induzida por ifosfamida (RIBEIRO et al., 2002), cardiotoxicidade por

doxorrubicina (ZHU et al., 2011), mucosite oral secundária à radiação (SONIS, 2000)

e mucosite intestinal induzida por 5-fluorouracil (WU et al., 2011) e por irinotecano

(MELO et al., 2008). O papel da IL-1 na esteatohepatite induzida por irinotecano

ainda não foi estudado.

38

1.5.3.2. Fator de Necrose Tumoral (TNF)

Há quase um século, William Coley descreveu a ocorrência de febre e

regressão tumoral em alguns pacientes tratados com filtrado bacteriano (NAUTS,

1953). Em 1975, o TNF foi isolado como componente ativo do filtrado de Coley no

soro de camundongos expostos a endotoxina bacteriana e foi capaz de induzir

necrose hemorrágica nos tumores desses animais (CARSWELL, 1975; OLD, 1985).

Décadas de pesquisa levaram ao atual entendimento do TNF como uma citocina

multifuncional que tem papel chave na apoptose e sobrevivência celular, assim

como na inflamação e imunidade.

O TNF é produzido por macrófagos e também por uma variedade de outras

células incluindo linfócitos, mastócitos, células endoteliais, fibroblastos e neurônios.

Em resposta ao LPS e a outros produtos bacterianos, uma grande quantidade de

TNF é gerada. Esta citocina exerce suas funções biológicas via interação com os

receptores TNF-R1 e TNF-R2. Após a ligação do TNF, o receptor sofre uma

mudança conformacional que permite o inicio da sinalização intracelular, levando a

respostas que incluem morte ou sobrevivência celular, diferenciação, proliferação e

migração (WAJANT et al., 2003).

Apesar de nomeado por suas propriedades anti-tumorais, o TNF tem sido

identificado na patogênese de uma variedade de outras condições. Por este

mediador comum, patologias como artrite reumatóide, psoríase e doença de Crohn

compartilham mais características do que se reconhecia anteriormente (TRACEY et

al., 2008), e atualmente têm os inibidores de TNF como ferramentas terapêuticas

comuns.

A produção de TNF é um dos eventos mais precoces em vários tipos de

injuria hepática, induzindo a produção de outras citocinas que, em conjunto,

recrutam células inflamatórias, levam a morte de hepatócitos e iniciam o processo de

fibrogênese (TILG e DIEHL, 2000). Estudos clínicos e experimentais revelam o papel

do TNF entre as citocinas inflamatórias envolvidas na patogênese da NASH, tanto

nas fases iniciais como nos estágios mais avançados de lesão hepática (MANCO et

al., 2007; DING e YIN, 2004; CRESPO et al., 2001). Não há dados na literatura

sobre a participação do TNF na NASH secundária ao irinotecano.

39

1.5.3.3. Interleucina-18

A interleucina-18 (IL-18), um membro da superfamília da citocina IL-1, foi

originalmente descrita em 1995 por OKAMURA et al. como fator indutor de

interferon-gama (IFN-gama). É atualmente reconhecida como uma importante

reguladora das respostas imunes inatas e adquiridas.

A IL-18 é produzida constitutivamente em vários tipos celulares, incluindo

macrófagos, células endoteliais, células dendriticas, células de Kupffer,

queratinocitos, células intestinais e osteoblastos. Também é produzida em resposta

a estímulos como o LPS (DINARELLO, 2002). Assim, como a IL-1b, com quem

divide homologia estrutural, a IL-18 é gerada como um precursor, o pré-IL18, que

permanece inativo até sua clivagem pela enzima caspase-1. A IL-18 exerce suas

funções através da formação de um complexo de alta afinidade com o seu receptor,

o IL-18R. A subsequente cascata de sinalização intracelular é semelhante a de

outros membros da família IL-1. (NAKANISHI et al., 2001).

O papel efetor da IL-18 está rapidamente se expandindo. Esta citocina

aumenta a maturação de células T e células natural killer (NK), bem como a

produção de quimiocinas, moléculas de adesão e citocinas pró-inflamatórias como

IFN-gama, TNF-alfa, IL-1 beta e IL-8. Suas atividades biológicas são reguladas

negativamente pela proteína ligante de IL-18, garantindo a proteção do dano tecidual

secundário à atividade inflamatória descontrolada (NOVICK et al., 1999).

A expressao de IL-18 tem sido descrita em doenças inflamatórias de um

amplo espectro de tecidos. Artrite reumática, artrite psoriática, diabetes insulino-

dependente, esclerose múltipla, asma, doença inflamatória intestinal e hepatite

crônica são exemplos de condições onde esta citocina pode exercer um papel

relevante. A IL-18 tambem tem sido relacionada à obesidade e síndrome metabólica

(TROSEID et al., 2010), fatores fortemente relacionados a NASH. Sua relevância

direta na patogênese da NASH secundária ou não ao irinotecano ainda é

desconhecida.

1.5.3.4. Óxido nítrico

O oxido nítrico (NO) foi descoberto por Furchgott e Kawadzki (1980) como

uma substância vasodilatadora derivada do endotélio. Em seguida foi reconhecido

40

estruturalmente como molécula de óxido nítrico por Ignarro et al. (1987) e Palmer et

al. (1987). O NO tem um complexo e amplo espectro de ações e uma variedade de

efeitos biológicos apenas recentemente descritos.

O NO é sintetizado pela óxido nítrico sintase (NOS), uma enzima da família

das oxidoredutases. Três isoformas de NOS foram clonadas e caracterizadas. Todas

elas geram NO através da conversão de L-arginina a L-citrulina por processo de

oxidação. Duas das isoformas, expressas constitutivamente em neurônios (NOS1) e

em células endoteliais (NOS3), respondem a agonistas que elevam a concentração

de cálcio intracelular, como a trombina, a bradicinina, a adenosina difosfato e o

stress vascular, e produzem NO em baixos níveis (concentrações picomolares). Em

contraste a essas isoformas, a NOS2 (NOSi) tem sua expressão induzida por

citocinas em macrófagos e outras células, e independente das alterações da

concentração de cálcio intracelular. A NOSi tem atividade enzimática

consideravelmente maior que as outras isoformas, levando a concentrações

micromolares de NO (MURAD et al., 2006).

O NO produzido nas células endoteliais da microvasculatura é o principal

determinante do tônus vascular em repouso. Também regula o fluxo regional, a

ativação de células endoteliais e inibe a adesão, ativação e agregação plaquetária

no endotélio vascular (RADOMSKI et al., 1987). Desta forma, o NO está envolvido

no mecanismo de aterosclerose, hipertensão pulmonar e outras doenças

cardiovasculares. O papel do NO também tem sido reconhecido em um número

crescente de outros contextos clínicos. Assim, há evidências de que o NO oriundo

da atividade da NOSi participa da fisiopatologia de doenças como enterocolite

necrotizante, cistite hemorrágica (SOUZA-FILHO et al., 1997; RIBEIRO et al., 2002),

pancreatite (GOMES-CAMBRONERO et al., 2000) e mucosite oral (LEITAO et al.,

2007). O NO parece participar centralmente do mecanismo de algumas lesões

hepáticas. Estudos demonstraram que os hepatócitos produzem NO após exposição

a citocinas como TNF, IL-1, IL-18, em resposta a LPS e durante a inflamação

hepática crônica (KIRKALI et al., 2000). Em modelos experimentais de NASH

induzida por dieta, tem sido observado aumento da expressão hepática de NOSi (HA

et al., 2010). Por fim, o NO parece estar envolvido nos processos de inflamação e

fibrose hepáticas, que são alguns dos aspectos característicos da NASH (FUJITA et

al., 2010).

41

Figura 6 – Regulação das vias de sinalização de citocinas da família da interleucina-1 (IL-1). As citocinas da família IL-1 ativam alvos celulares através de receptores estruturalmente relacionados (família IL-1R/ Receptores Toll-like (TLR)) e

vias de sinalização intracelular comuns, culminando com ativação de NF-B. Em mamíferos não está claro se o LPS é um ligante direto de TLR-4 (ou CD14 em um complexo com MD2), ou se ele ativa uma cascata de proteases via PRR que por sua vez levaria à ativação de um ligante para TLR-4. Há grande similaridade de seqüência de ativação desde MyD88, IRAK4 e TRAF-6. Ligantes de citocinas e desses receptores atuam como reguladores endógenos sobre a ativação dessas

Núcleo

42

vias (por exemplo, IL-1Ra e IL-18bp). Outras vias de ativação em mamíferos envolvem a ativação de quinases de p38. Abreviações: MyD88: proteína de diferenciação mielóide 88; IRAK1/4: quinase 1/4 ativadora de IL-1R; TRAF6: fator 6 associado ao receptor de fator de necrose tumoral (TNF); TAK1: quinase 1

associada ao fator de crescimento transformador (TGF-); NEMO: modulador

essencial do fator nuclear B (NF-B); IkB: inibidor do NF-B; IKK1/2: quinase 1/2 do IkB; MAPKK: quinase da proteína quinase ativada por mitógeno; JNK: quinase do n-terminal do c-jun (adaptado de HARBSKY et al., 2007).

43

1.6. JUSTIFICATIVA

O avanço na eficácia dos agentes antineoplásicos tem contribuído para o

aumento da sobrevida de pacientes oncológicos. Entretanto, seus efeitos adversos

podem representar uma limitação a este benefício.

O câncer coloretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o

mundo e o fígado é o seu sítio mais freqüente de metástases. O tratamento curativo

da metástase hepática envolve uma abordagem multidisciplinar que inclui

quimioterapia e cirurgia. A quimioterapia utilizada antes do procedimento cirúrgico

melhora as taxas de ressecção e de sobrevida.

O irinotecano é um dos agentes antineoplásicos mais ativos no tratamento do

câncer coloretal. No entanto, o seu uso está associado a uma condição chamada

esteatohepatite não alcoólica (NASH). A incidência dessa condição na clínica varia

de 8 a10% nos pacientes expostos ao irinotecano. Pacientes com NASH induzida

por irinotecano apresentam maior morbidade e mortalidade secundárias ao

procedimento cirúrgico de ressecção hepática.

Não há, na literatura médica, nenhum modelo experimental de NASH induzida

por irinotecano que mimetize as alterações encontradas na clínica. Igualmente não

há nenhuma proposta de tratamento ou prevenção dessa condição em grande parte

pela falta de conhecimento de sua patogênese.

Propomos desenvolver um modelo inédito de NASH induzida pelo irinotecano

em camundongos que se aproxime ao máximo da síndrome descrita na prática

clínica, bem como avaliar aspectos relevantes de sua patogênese.

44

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Estabelecer um modelo experimental de esteatohepatite induzida pelo

quimioterápico irinotecano em camundongos.

2.2. Objetivos específicos

- Padronizar o modelo de esteatohepatite induzida por irinotecano em

camundongos Swiss que apresente os parâmetros histopatológicos (através de

escores microscópicos) e bioquímicos necessários para o diagnóstico na clínica;

- Avaliar a participação de alguns mediadores inflamatórios como citocinas

(TNF, IL-1 e IL-18) e óxido nítrico assim como dos receptores Toll-like tipo 4, na

patogênese da esteatohepatite experimental induzida por irinotecano.

- Avaliar a participação da translocação bacteriana intestinal e a bacteremia

portal como indutora do insulto inflamatório hepático no modelo de esteatohepatite

padronizado.

45

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Material utilizado:

3.1.1. Soluções, reagentes e fármacos

Cloridrato de irinotecano (Evoterin®, Evolabis, São Paulo, Brasil, ampola

de 100 mg).

Solução salina: cloreto de NaCl a 0,9% (15M): frasco de 500mL (Tayuyna)

Álcool etílico 70% (Reagen)

Formaldeído 40% (Reagen)

Hematoxilina (Reagen)

Eosina (Merck)

Hematoxilina de Mayer (Reagen)

Vectastatin – kit ABC (Vector)

Anticorpo primário policlonal de carneiro anti-TNF-α (Santa Cruz

Biotechnology, CA, U.S.A.)

Anticorpo primário policlonal de coelho anti-IL-1β (Santa Cruz

Biotechnology, CA, U.S.A.)

Anticorpo primário policlonal de coelho anti-TLR-4 (Santa Cruz

Biotechnology, CA, U.S.A.).

Anticorpo primário policlonal de coelho anti-iNOS (Santa Cruz

Biotechnology, CA, U.S.A.)

Anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de carneiro (Santa Cruz

Biotechnology, CA, U.S.A.)

Anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de coelho (Santa Cruz

Biotechnology, CA, U.S.A.)

Tampão fosfato de potássio: solução A – 988mL + solução B – 12mL

o Solução A:

KH2PO4 (Synth)............................................... 6,8 g

Água destilada ........................................q.s.p. 1 L

o Solução B:

KH2PO4 (Synth)............................................... 8,7g

46

Água destilada ........................................q.s.p. 1L

Tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB)

o HTAB (Sigma)............................................................. 5g

o Tampão fosfato de potássio........................................ 1L

Peróxido de hidrogênio (0,1%)

o Peróxido de hidrogênio 30% (Vetec).......................... 1 mL

o Água destilada...................................................q.s.p. 30 mL

Solução de o-dianisidina

o O-dianisidina (Sigma) ...................................... 16,7 mL

o Tampão fosfato de potássio....................................... 10 mL

o H2O2.......................................................................... 50 µL

o Água destilada........................................................... 90 mL

3.1.2. Equipamentos

Centrífuga Eppendorf – 5804R – Hamburgo – Alemanha

Sonicador de amostras – Thornton – São Paulo - Brasil

Homogenizador de amostras – Polytron PT10-35 – Kinematica – Suiça

Vortex – Phoenix – Araraquara – São Paulo – Brasil

Microscópico óptico – Olympus BX41TF – Olympus Optical CO – Japão

Autoclave modelo digital horizontal – Stermax – Paraná – Brasil

Balança analítica – Sartorius BL 210S

Balança digital modelo MF6/ 1- Filizola – São Paulo – Brasil

PHmetro modelo MR 10 – Denver instrument – EUA

Deionizador de água – Milipore – São Paulo – Brasil

Máquina de gelo – Everest – Rio de Janeiro – Brasil

Freezer a -700C Revco Elite Plus – Thermoscientific – EUA

Leitor de placas modelo ELX 800 – Bio Tek instruments – EUA

3.2. Animais

Foram utilizados camundongos machos do tipo Swiss, pesando entre 25 a

30g, obtidos junto ao biotério da Faculdade de Medicina/ Universidade Federal do

47

Ceará. Os animais foram divididos em grupos experimentais (n=8-10) e mantidos

todos em um recinto com controle de temperatura ambiente, com acesso livre à

alimentação e água e submetidos aos ciclos de claro-escuro. O protocolo

experimental segue estritamente as regras do NIH para o cuidado e uso de animais

em laboratório e foi completamente submetido e aprovado pelo Comitê de Ética para

Experimentação Animal local (número de protocolo 21/12).

3.3. Padronização da esteato-hepatite

Como não havia parâmetros prévios na literatura médica sobre

hepatotoxicidade induzida por irinotecano em animais, nós tomamos como base,

para a definição da estratégia inicial de administração do irinotecano, a faixa de

doses normalmente utilizadas no modelo experimental em camundongos para

indução da mucosite intestinal (MELO et al., 2008). Os animais foram injetados com

solução salina (5 mL/kg, i.p.) ou Irinotecano (IRI, 25, 50, 75 or 100 mg/kg, i.p, três

vezes por semana em dias alternados) e tiveram suas sobrevidas monitorizadas.

Seguiu-se então outro experimento, onde os camundongos foram novamente

tratados com os regimes de administração do irinotecano que permitissem uma

sobrevida suficiente para prolongar o tratamento por algumas semanas, a fim de que

as alterações patológicas esperadas pudessem se estabelecer. Os animais foram

então pesados e sacrificados ao fim das semanas 1, 3, 5, 7 e 9 para a análise de

parâmetros bioquímicos e inflamatórios no sangue e no tecido hepático como

demonstrado abaixo (Figura 7).

48

Figura 7 – Esquema de injeção do Irinotecano e sacrifício dos animais. O irinotecano foi administrado na dose de 50 mg/Kg 3 vezes por semana por nove semanas consecutivas. O sacrifício foi realizado ao final das semanas 1, 3, 5, 7 e 9.

Sacrifício

Tempo (Semanas)

Irinotecano (3x/semana)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

49

3.3.1. Dosagens das concentrações plasmáticas de proteínas totais, alanina e

aspartato aminotransferases (ALT eAST)

Os camundongos foram sedados semanalmente com solução de

trimomoetanol a 2.5% (10 mL/kg, i.p.) e tiveram sangue colhido pelo plexo orbital.

Após centrifugação do sangue a 100 x g/10 min, o plasma foi obtido para análise

bioquímica de proteínas totais, alanina e aspartato aminotransferases (ALT eAST).

Para a mensuração, utilizou-se um espectrofotômetro em um nível de absorbância

de 365 ou 545 nm como apropriado, de acordo com o recomendado pelo kit do

fabricante (Labtest Diagnostica, Minas Gerais, Brasil).

3.3.2. Avaliação histopatológica do fígado

As amostras do fígado foram fixadas em solução de formalina tamponada a

10%, desidratadas e emblocadas em parafina. Cortes de 5 µm de espessura foram

obtidos e depois corados pela técnica de hematoxilina-eosina (H&E) ou tricrômico de

Masson, e em seguida examinados por microscopia óptica (x100). As lâminas foram

analizadas por um patologista experiente que não possuia informações sobre o

tratamento ou da divisão entre os grupos. O diagnostico e a graduação da NASH

foram avaliados conforme o Escore de Atividade da NASH (NAS) proposto por

KLEINER et al. (2005) como segue: esteatose (menos que 5% = grau 0; 5-33% =

grau 1; 33-66% = grau 2; >66% = grau 3); inflamação lobular (ausência de infiltrados

por campo de 200 x = grau 0; até 2 infiltrados por campo de 200 X = grau 1; 2 a 4

infiltrados por campo de 200 X = grade 2; > 4 infiltrados por campo de 200 X =

grade 3) e tumefação hepatocítica (Escore 0 = ausência; escore 1 = leve; escore 2 =

severa). A presence concomitante desses três parâmetros histológicos fora

necessária para definir NASH.

Apesar de que os graus de inflamação portal e fibrose não façam parte dos

critérios de Kleiner, esses parâmetros também foram avaliados pelo estudo por

estarem frequentemente associados com a NASH.

A inflamação portal foi categorizada em: Grau 0 = Ausente ou mínimo; Grau 1

= Maior que mínimo.

50

A fibrose foi asvaliada em graus crescentes de gravidade: grau 0 – ausência;

grau 1 – perisinusoidal ou periportal; grau 2 – perisinusoidal e periportal; grau 3 –

fibrose em ponte; grau 4 – cirrose (KLEINER, 2005)

3.3.3. Ensaio de mieloperoxidase (MPO)

A atividade de MPO, uma enzima encontrada nos grânulos azurófilos de

neutrófilos, é utilizada como marcador da presença de neutrófilos no tecido

inflamado, cuja presença foi determinada por método colorimétrico e a leitura final

realizada em leitor de placas. Uma porção de fígado foi coletada e incubada em

solução de HTAB 0,5% (Brometo de hexadeciltrimetilamonio), na proporção de

50mg de tecido por mL, e homogeneizada e centrifugada (1500 g/15 min a 4oC). O

sobrenadante foi transferido para um epperdorf e novamente centrifugado (10min)

para melhor remoção de contaminantes. Após plaqueamento de 7µL do

sobrenadante (placas de 96 wells), 200 µL da solução de leitura (5 mg O-dianisidine;

15 µL H2O2 1%; 3 mL tampão fosfato; 27 mL H2O) foram adicionados e lidos a

460nm (to=0 min e t1=1 min). A mudança na absorbância foi obtida, plotada em curva

padrão de mieloperoxidase e expressa em termos de atividade de MPO (U/mg de

tecido) (BRADLEY et al., 1982).

3.3.4. Ensaio para dosagem de malonaldeído (MDA)

Amostras de fígado foram homogeneizados em 100mg/1mL de KCl 1,15%

(homogenato 10%). Um alíquota de 500 µL do homogenato foi transferida para um

tubo de ensaio e adicionados 3 mL de H3PO4 1% e 1 mL de ácido tiobarbitúrico

0,6% (TBA). Essa mistura foi fervida em banho-maria por 45 min e, em seguida,

resfriada em água gelada, adicionados 4 mL de n-butanol, agitada em vortex por 1

min e centrifugada a 1200 g/15min. Utilizou-se a fase butanólica para leitura em

espectrofotômetro a 520 e 535nm. A diferença obtida entre as duas leituras foi

utilizada para calcular o MDA, baseada no coeficiente de extinção molar de

13700M/cm (UCHIYAMA e MIHARA, 1978).

51

3.3.5. Determinação dos grupos sulfidrílicos não-protéicos (SH-NP)

Amostras de fígado foram homogeneizados em 100 mg/1 mL de EDTA sódico

0,02M gelado. Alíquotas de 400 µL do homogenato foram adicionadas a 320 µL de

água destilada, 80µL de ácido tricloroacético (TCA) a 50%. Após contrifugação, 200

µL do sobrenadante foram coletados e, em seguida, 400 µL de tampão Tris 0,4M

(pH 8,9) e 10µL de DTNB 0,01M foram acrescidos para determinação da

absorbância dentro de 5min a 412nm. O branco não continha homogenato. A

concentração de SH-NP foi calculada através da equação da reta de regressão

obtida de uma curva de calibração de glutationa reduzida (GSH) e expressa em µg

de SH-NP/500mg de tecido (BOYD et al., 1979).

3.3.6. Determinação de lipídeos no tecido hepático

As amostras do fígado foram analizadas para determinação da quantidade de

lipídeos de acordo com o método proposto por BLIGH e DYER (1959).

Concisamente, as amostras foram homogenizadas em uma solução de 1:2 entre

clorofórmio/metanol seguindo a proporção de 100 mg de tecido/1.9 mL da solução e

agitadas. Em seguida, clorofórmio foi adicionado (0.63 mL) e a solução novamente

agitada. Finalmente, 0.63 ml de água destilada foi adicionada atingindo a proporção

final (2:2:1 clorofórmio:metanol:água). O sistema foi centrifugado na temperatura

ambiente a 200 X g/2 min dando origem a um sistema com duas fases (aquosa em

cima, orgânica em baixo). A fase inferior foi recuperada e o total de lipídeos foi

calculado (g de lipídeos/100 g amostra) após total evaporação da amostra (100 oC).

3.3.7. Reação Imunohistoquímica para iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-18 e TLR-4

A partir das amostras de fígado e do duodeno dos animais submetidos à

esteato-hepatite induzida por irinotecano foi realizada uma análise

imunohistoquímica para iNOS, TNF-α, IL-1, IL-18 e TLR4, conforme descrito a

seguir: As peças histológicas foram desparafinizadas e em seguida hidratadas. Após

a hidratação, promoveu-se uma recuperação antigênica com tampão citrato 0,1 M

(pH 6.0) aquecido a 100 oC durante 15 min. Após o resfriamento em temperatura

ambiente durante 20 min, as lâminas foram lavadas em PBS. Em seguida, realizou-

52

se o bloqueio da peroxidase endógena com solução peróxido de hidrogênio 3% v/v

durante 15 min e lavagem com PBS. Procedeu-se a incubação, por 12 h, com

anticorpo primário rabbit anti-iNOS, anti-TNF-α, anti-IL-1, anti IL-18 ou TLR4 (Santa

Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) diluídos em PBS – BSA 5% na proporção de

1:400. Em seguida as lâminas foram lavadas com PBS e incubadas (30 min) com o

anticorpo secundário biotinilado (anti-rabbit IgG) diluído em PBS-BSA 5% na

proporção de 1:200. Após a remoção do anticorpo biotinilado, com lavagem em PBS

as lâminas foram incubadas por 30 min com o complexo ABC (Horseradish

Peroxidase Standard). Após lavagem com PBS e incubação com DAB/peróxido (2

min) para dar a cor da reação, as lâminas foram lavadas com H2O destilada e

desidratadas com uma série graduada de álcool e xilol. Finalmente, realizou-se a

contra-coloração com hematoxilina de Harry´s e posterior desidratação e montagem

das lâminas. Uma análise quantitativa da reação seguiu os parâmetros descritos por

YEOH et al. (2005). A cloração foi observada sob microscopia óptica por um

patologista que desconhecia os tratamentos e graduada como a seguir: 0, sem

imunomarcação; 1, fraca imunomarcação; 2, moderada imunomarcação; 3,

moderada a intensa imunomarcação; e4, intensa imunomarcação.

3.4. Análise de bacteremia e translocação para órgãos alvo

Para determinar a influência do Irinotecano sobre a possível translocação

bacteriana a partir da microbiota intestinal dos animais, amostras de sangue portal,

do plexo orbital foram coletadas em condições estéreis. Os meios usados para

incubação das amostras incluíram meio Brain Heart Infusion (BHI, meio não seletivo)

seguido da inoculação em MacConkey (seletivo para bactérias Gram-negativas) a

partir do meio BHI. Utilizou-se uma haste de inoculação estéril para semear as

amostras nos meios, os quais foram incubados a 37 oC por 24 a 48h. O nível de

crescimento bacteriano sanguíneo foi observado e graduado de acordo com a

presença ou ausência de crescimento. Amostras das colônias bacterianas obtidas a

partir do meio MacConkey foram submetidas à Coloração de Gram e a ensaios

bioquímicos (kit Enterokit B, Probac do Brasil®, São Paulo, Brasil) de identificação

de enterobactérias (produção de gás, H2S, urease, citrato, L-triptofano desaminase,

motilidade, indol, lisina descarboxilase, fermentação da lactose) (STRINGER et al.,

2007).

53

3.5. Parâmetros avaliados na mucosite intestinal

Ao final da 1ª, 3ª, 5ª e 7ª semanas após início da injeção com Irinotecano, a

diarréia foi avaliada segundo escores pré-estabelecidos. Em seguida, os animais

foram sacrificados por deslocamento cervical. Amostras do duodeno foram

coletadas, imersa em formol a 10% e, após 24 horas, transferida para álcool 70%

para realização de analise microscópica. Por fim, realizou-se o estudo de

imunohistoquímica para iNOS, TNF-α, IL-1, IL-18 e TLR4 como descrito

anteriormente.

3.5.1. Análise histopatológica do duodeno

Após o sacrifício dos animais, foi removido um segmento de 0,5 cm do

duodeno proximal do camundongo. A seguir, essas amostras foram fixadas em

formol tamponado 10% e processadas para coloração pelo método HE

(hematoxilina-eosina) para exame em microscopia óptica 100x (Microscópio Nikon

com objetiva 10x e lente ocular micrométrica Leitz Wetzlar 10x).

A análise histopatológica envolveu a observação do aspecto de vilos e criptas,

bem como presença e intensidade do infiltrado inflamatório. O grau e a severidade

da mucosite foi determinado de acordo com o sistema de escores proposto por

WOO et. al. (2000) e descritos a seguir: 0 = ausência de lesão; 1 = menos de 10%

das criptas contêm células necróticas; 2 = mais de 10% das criptas contêm células

necróticas, mas a arquitetura permanece intacta; 3 = mais de 10% das criptas

contêm células necróticas com perda da arquitetura das criptas (<20%), os vilos

encontram-se encurtados e ocorre variável hipertrofia e hiperbasofilia nas criptas

remanescentes; 4 = semelhante à 3, entretanto, é mais extensa com perda da

arquitetura das criptas e encurtamento dos vilos.

3.6. Análise estatística

A análise estatística, realizada com o software GraphPad Prism®, versão 5.0,

foi realizada empregando o teste t de Student para variáveis não pareadas ou o

teste Mann-Whitney, conforme propriedade, respectivamente para dados

paramétricos e não-paramétricos. Os resultados foram expressos como média ±

54

E.P.M (variáveis com distribuição normal) ou pela mediana (mínimo-máximo)

(variáveis sem distribuição normal), sendo as diferenças consideradas

estatisticamente significativas quando p<0,05. A curva de sobrevida foi expressa em

termos de percentagem de animais vivos, realizando-se o teste de Mantel-Cox log

rank para determinar a diferença entre as curvas. Utilizou-se também o Mantel-

Haenzel exact test para análise da bacteremia. Um valor de p<0,05 foi aceito como

significante.

55

4. RESULTADOS

4.1. Padronização da esteato-hepatite

4.1.1. Curva de sobrevida

A Figura 8 demonstra a curva de sobevida dos animais tratados com

irinotecano e do grupo controle. Os animais dos grupos experimentais apresentaram

sobrevidas significativamente inferiores quando comparados ao grupo controle (p<

0,05). As doses mais elevadas (IRI 75 e100 mg/kg ip 3 vezes/semana) não foram

toleradas, induziram uma elevada mortalidade e nenhum animal sobreviveu após a

terceira semana de tratamento. As doses moderadas (25 e 50 mg/kg ip 3

vezes/semana) permitiram o tratamento por um tempo mais prolongado.

56

Figura 8. Irinotecano induziu uma mortalidade animal dose dependente. Os animais foram tratados com solução salina (5 mL/kg, i.p.) ou Irinotecano (IRI, 25-100 mg/kg três vezes por semana por sete semanas consecutivas, i.p) e tiveram suas curvas de sobrevida avaliadas (%). Os animais tratados com irinotecano apresentaram uma significativa menor sobrevida quando comparadas com o grupo controle. (Log rank test, n=10). *p<0.05 versus salina.

0 2 4 6 80

25

50

75

100

IRI 50

IRI 25

IRI 75

Salina

IRI 100

Tempo (semanas)

**

*

So

bre

vid

a (

%)

57

4.1.2. Curva de peso corporal e hepático

Os animais tratados com irinotecano nas doses de 25 e 50 mg/kg (ip 3

vezes/semana) apresentaram, ao longo das semanas, uma perda de peso

significativa quando comparados ao grupo controle (p<0.05). Os grupos tratados

com irinotecano também apresentaram hepatomegalia progressiva e dose-

dependente. Observou-se um aumento significativo no peso líquido do fígado dos

animais tratados comparados ao controle sendo esse aumento ainda

significativamente maior na dose de 50mg/kg (p<0.05) (Figura 9).

58

Figura 9. Tratamento com Irinotecano induz alteração do peso corporal e do peso hepático líquido em camundongos. Os animais foram tratados com solução salina (5 mL/kg, i.p.) ou Irinotecano (IRI, 25 or 50 mg/kg, três vezes por semana durante sete semanas, i.p). Os animais foram pesados semanalmente para determinar a variação da massa corpórea. Ao fim da sétima semana, os animais foram sacrificados e tiveram seus fígados coletados para avaliar seus pesos líquidos (peso do fígado líquido/30g animal). Camundongos tratados com irinotecano demonstraram uma perda de peso e um aumento do peso hepático líquido significativos em comparação ao controle. Os dados estão demonstrados como valores da média ± E.P.M. (Erro padrão da média) e foram analizados utilizando o teste-t não pareado (n=8). *p<0.05 e***p<0.001 vs salina.

0 1 2 3 4 5 6 7 8

21

24

27

30

Salina IRI 50 mg/kgIRI 25 mg/kg

* *

** *

A

Tempo (semanas)

Vari

ação

do

peso

co

rpo

ral

(g)

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

Salina

Irinotecano

25 50 mg/kg

*

***

B

Peso

hep

áti

co

líq

uid

o

(mg

/30g

an

imal)

59

4.1.3. Dosagens das concentrações plasmáticas de proteínas totais, alanina e

aspartato aminotransferases (ALT eAST)

Em seguida, os níveis plasmáticos de alanina e aspartato aminotransferases

(ALT e AST) foram monitorizados semanalmente. Apenas o grupo tratado com a

dose de 50 mg/kg (ip 3 vezes/semana) de irinotecano e não o grupo de 25 mg/kg (ip

3 vezes/semana) apresentou um aumento significativo (p<0.05) nos níveis

plasmáticos de tanto ALT como de AST quando comparados ao grupo controle. O

aumento descrito pode ser verificado a partir da segunda semana e permaneceu até

o fim do experimento (Figura 10). Assim, definimos o modelo ideal como 50mg/kg

de irinotecano ip durante sete semanas consecutivas.

60

0 1 2 3 4 5 6 7 80

30

60

90

120

150

180

*

**

*

* *

Salina IRI 50 mg/kgIRI 25 mg/kgA

Tempo (semanas)

AL

T (

U/L

)

0 1 2 3 4 5 6 7 80

50

100

150

200

250

*

** *

**

B

Tempo (semanas)

AS

T (

U/L

)

Figura 10. Concentrações plamáticas de ALT e AST nos grupos de animais tratados com irinotecano e no grupo controle. Os animais foram tratados com solução salina (5 mL/kg, i.p.) ou Irinotecano (IRI, 25 or 50 mg/kg, três vezes por semana durante sete semanas, i.p). Amostras de sangue foram coletadas semanalmente do plexo orbitário para as dosagens de alanina e aspartato aminotransferases (ALT eAST). O grupo tratado com irinotecano (50 mg/kg) apresentou um aumento significativo dos níveis plasmáticos de tanto ALT (A) como também de AST (B) quando comparado ao grupo controle. Os dados estão expressos como médias ± E.P.M. (Erro padrão da média) e foram analizados utilizando o teste t não pareado (n=8). *p<0.05 vs salina.

61

4.1.4. Avaliação macroscópica e histopatológica

A Figura 11 ilustra a clássica alteração macroscópica da esteatohepatite

(fígado amarelo) (Quadro B) que foi observada raramente nos animais desse modelo

experimental. Demonstram-se na Figura 12 todas as alterações histopatológicas

mandatórias para o diagnóstico da NASH: infiltrado neutrofílico portal (quadro B),

esteatose em microgotas (quadro C), infiltrado neutrofílico lobular (quadro D) e

tumefação hepatocelular (quadro E). Todos estes achados foram observados em

fígados coletados de animais na sétima semana de injeção de irinotecano (50

mg/kg). As amostras de fígado do grupo controle injetados com solução salina

apresentaram aspecto macroscópico (Figura 11A) e histologia normais (Figura 12A).

Figura 11. Aspecto macroscópico do fígado. (A) Fígado normal. (B) Fígado amarelo que é descrição tradicional da esteatohepatite foi observado em poucos casos no nosso modelo experimental.

A B

62

Figura 12. Fotomicrografias do fígado. Tecido hepático dos camundongos tratados com solução salina apresentando histologia normal (A). Camundongos tratados com irinotecano (B-E). Alterações histológicas características de esteatohepatite: Infiltrado portal neutrofílico (B), Esteatose microvesicular (C), Infiltrado lobular neutrofílico (D) e Tumefação celular (E). Setas identificam, nas figuras, cada um dos eventos patológicos descritos. Coloração pelo H&E (Magnificação 400x, black scale bars).

A B

C D

E

63

Quando o Escore de Atividade da NASH (Kleiner) foi aplicado nas amostras

de fígado, as alterações histopatológicas foram progressivamente surgindo e se

intensificando a partir da terceira semana e atingindo o ápice na sétima semana do

experimento. Uma incidência estatisticamente significativa de esteatohepatite, de

acordo com o escore proposto por Kleiner, definido pela ocorrência simultânea de

esteatose, infiltrado neutrofílico lobular e tumefação hepatocítica, foi encontrada na

sétima semana do experimento (p<0.05) quando comparada com o grupo controle.

(Tabela 1).

Tabela 1 – Escores de Kleiner. Os escores de severidade foram aplicados ao final

das semanas 1, 3, 5 e 7 do experimento. Os dados foram analisados através do

teste de Mann-Whitney. Os valores estão expressos como mediana (mínimo-

máximo). *p<0.05, **p<0.01 e ***p<0.001 versus salina.

Semanas dos sacrifícios dos

animais (n=5)

Parâmetros histológicos Escore Final

(Kleiner) (0-8)

Inflamação lobular

(0-3)

Grau de esteatose

(0-3)

Tumefação celular

(0-2)

Salina 0 (0 - 1) 0 (0 - 1) 0 (0 - 1) 1 (0 - 1)

Semana 1 (IRI, 3 x 50 mg/kg)

0 (0 – 1) 0 (0 - 1) 0 (0 - 1) 1 (0 - 2)

Semana 3 (IRI, 9 x 50 mg/kg)

1 (1 – 1) 0 (0 - 1) 0 (0 - 1) 1 (1 - 2) *

Semana 5 (IRI, 15 x 50 mg/kg)

3 (2 – 3) *** 0 (0 - 1) 0 (0 - 1) 3 (2 - 5) **

Semana 7 (IRI, 21 x 50 mg/kg) 3 (1 – 3) *** 1 (1 - 2) ** 2 (0 - 2) * 4 (4 - 7) ***

64

Infiltrado inflamatório portal (Figura 12B) e fibrose perisinusoidal,

predominantemente localizada na zona 3 do lóbulo hepático, (Tabela 2 e Figura

13B) foram alterações histopatológicas adicionais encontradas nos animais injetados

com irinotecano comparados com o controle (P<0.05). A fibrose foi identificada mais

tardiamente, somente na nona semana do experimento (setas na Figura 13B),

enquanto o infiltrado portal pode ser observado a partir da semana 5 (Tabela 2). Da

mesma forma, notou-se um aumento progressivo do infiltrado inflamatório lobular

começando na semana 3 e que tornou-se significativo (P<0.05) quando comparado

ao grupo controle a partir da semana 5. (Figura 12B, Tabela 1).

Tabela 2 – Irinotecano determina aumento do infiltrado portal e do escore de fibrose. Avaliação histológica realizada ao final das semanas 1, 3, 5, 7 e 9. Os dados foram analisados através do teste de Mann-Whitney. Os valores estão expressos como mediana (mínimo-máximo). *p<0.05, **p<0.01 e ***p<0.001 versus salina.

Semanas dos sacrifícios dos animais

(n=5)

Parâmetros histológicos

Inflamação portal (0-2)

Fibrose (0-4)

Salina 0 (0 - 0) 0 (0-0)

Semana 1 (IRI, 3 x 50 mg/kg)

0 (0 - 0) 0 (0-0)

Semana 3 (IRI, 9 x 50 mg/kg)

0 (0 - 1) 0 (0-0)

Semana 5 (IRI, 15 x 50 mg/kg)

1 (1 - 2) ** 0 (0-0)

Semana 7 (IRI, 21 x 50 mg/kg)

1,5 (1 - 2) *** 0 (0-1)

Semana 9 (IRI, 27 x 50 mg/kg)

1(1-2) ** 1 (0-1) *

65

Figura 13. Irinotecano induz fibrose hepática tardia. Camundongos foram tratados com solução salina (5 mL/kg, i.p.) ou Irinotecano (IRI, 50 mg/kg, três vezes por semana por nove semanas consecutivas, i.p), sacrificados ao final da nona semana para investigação do grau de fibrose hepática. Camundongos tratados com IRI apresentaram um processo de fibrogênese perisinusoidal significativo (setas pretas, B) quando comparados com o grupo controle tratado com solução salina (A). Coloração de Masson. Magnificação 400x.

A

B

66

4.1.5. Avaliação do infiltrado inflamatório hepático

A análise bioquímica do tecido hepático demonstrou um pico de

mieloperoxidase durante a sétima semana de injeção do irinotecano (IRI 50 mg/kg,

ip 3 vezes/semana) comparado ao controle (Figura 14A).

Figura 14. Atividade de MPO e Infiltrado lobular. A atividade de MPO e a contagem de infiltrados neutrofílicos lobulares foram avaliadas em amostras do tecido hepático ao final das semanas 1, 3, 5 e 7 e comparadas com o controle. Os dados estão expressos como médias ± E.P.M. (Erro padrão da média) e foram analizados utilizando o teste t não pareado (n=8). *p<0.05 vs salina.

0

1

2

3

Salina 3 7

IRI 50 mg/kg

***

1 5 semanas

A

Ati

vid

ad

e d

e M

PO

(U/m

g t

ecid

o)

0

2

4

6

8

Salina 3 7

IRI 50 mg/kg

*

1 5 semanas

*

B

Infi

ltra

do

in

flam

ató

rio

lo

bu

lar

(nú

mero

po

r cam

po

200x)

67

4.1.6. Dosagem de lipídeos no fígado e proteínas plasmáticas

A dosagem de lipídios totais no fígado também sofreu elevação significativa

na semana 7 (P<0.05) no grupo do irinotecano, o que caracteriza esteatose (Figura

15A). Por outro lado, a concentração de proteínas plasmáticas totais sofreu

decréscimo gradual a partir da semana 3 e atingiu o nível mais baixo na semana 7

nos animais injetados com irinotecano em comparação com o grupo controle (Figura

15B) (P<0.05).

68

Figura 15. Dosagem de lipídeos no tecido hepático e proteínas totais séricas. Nas semanas 1, 3, 5 e 7, amostras do tecido hepático foram coletadas para avaliação do conteúdo lipídico, e sangue foi colhido para dosagem de proteínas séricas. Os dados estão expressos como médias ± E.P.M. (Erro padrão da média) e foram analizados utilizando o teste t não pareado (n=8). *p<0.05 vs salina.

0.0

0.5

1.0

1.5

Salina 3 7

IRI 50 mg/kg

1 5 semanas

*

A

Lip

ídeo

s t

ota

is/1

00g

tecid

o

0

2

4

6

8

Salina 3 7

IRI 50 mg/kg

1 5 semanas

*

B

**

Pro

teín

as t

oais

(g

/dL

)

69

4.1.7. Avaliação do estresse oxidativo no fígado

Demonstrou-se elevação dos níveis, no tecido hepático, de malonaldeído na

primeira, quinta e sétima semana (Figura 16A), e paralelamente uma diminuição dos

níveis de glutationa na primeira e quinta semana em relação ao controle (Figura

16B).

Figura 16. Dosagem de malonaldeído (MDA) e glutationa (NPSH) no tecido hepático. O estresse oxidativo foi avaliado através da dosagem de malonaldeído e grupos sulfidrila não-protéicos em amostras do tecido hepático ao final das semanas 1, 3, 5 e 7 e comparadas com o controle. Os dados estão expressos como médias ± E.P.M. (Erro padrão da média) e foram analizados utilizando o teste t não pareado (n=8). *p<0.05 vs salina.

0

100

200

300

400

500

Salina 1 3 5 7 Semana

Irinotecano (50 mg/kg)

*

*

*

MD

A (

nm

ol/g

tecid

o)

A

0

400

800

*

Salina 1 3 5 7 Semana

Irinotecano (50 mg/kg)

*

B

NP

SH

(m

g/g

tecid

o)

70

4.1.8. Leucograma

A avaliação da contagem de leucócitos totais no sangue revelou uma

leucopenia significativa que ocorreu na primeira e sétimas semanas, intercalados por

um período de recuperação parcial do leucograma quando comparado ao controle.

Figura 17. Contagem de leucócitos totais no sangue. Foi coletado sangue para contagem total de leucócitos nas semanas 1, 3, 5 e 7. Os dados estão expressos como médias ± E.P.M. (Erro padrão da média) e foram analizados utilizando o teste t não pareado (n=8). *p<0.05 vs salina.

0

2000

4000

6000

Salina 3 7

IRI 50 mg/kg

1 5 semanas

**

Leu

có

cit

os

(x 1

03/m

L)

71

4.1.9. Reação Imunohistoquímica para iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-18 e TLR-4 no

fígado

A análise por imunohistoquímica do tecido hepático dos animais injetados

com irinotecano (50 mg/kg ip 3 vezes/semana) e sacrificados na sétima semana

revelou hiperexpressão de IL-1β, iNOS e TLR-4 comparado com o controle. Não

houve diferença na expressão imunohistoquímica, em relação ao controle, de TNF e

IL-18. A expressão de IL-1β concentrou-se, predominantemente, nos infiltrados

inflamatórios portais envolvendo células mononucleares, provavelmente macrófagos

como também em hepatócitos da zona acinar 3, com uma marcação tipicamente

perinuclear. (Tabela 3 e Figura 7, Panel B) (Tabela 3 e Figura 7, Panel A). A

imunomarcação por iNOS também obedeceu um padrão constante ao redor da veia

centrolobular (zona acinar 3) (seta preta, Figura 7, panel D)(Tabela 3 e Figura 7,

panel C). A imunoexpressão de TLR-4 foi intensa e predominante na zona acinar 1,

envolvendo hepatócitos e os infiltrados inflamatórios portais. Um controle negativo

foi incluído e representa uma amostra do fígado onde o anticorpo foi substituído por

PBS/BSA a 5% e onde nenhuma imunoexpressão foi detectada. (Figura 7, painel

E).

72

Tabela 3 – Irinotecano promove aumento da imunoexpressão de IL-1β, iNOS e TLR4 no tecido hepático, e não promove alteração da expressão de TNF e IL-18. Os dados foram através do teste de Mann-Whitney. Os valores estão expressos como mediana (mínimo-máximo). *p<0.05 e **p<0.01 versus salina.

Grupos experimentais

Escores imunohistoquímicos Semana 7

IL-1β (0-3) iNOS(0-3) TLR4 (0-3) TNF(0-3) IL-18(0-3)

Salina (n=5) 0 (0 - 1) 1 (1 - 2) 1 (1-2) 0 (0-0) 0 (0-0)

(IRI, 21 x 50 mg/kg)

2 (1 – 3) ** 2 (2 - 3) * 3 (1-3) ** 0 (0-0) 0 (0-0)

73

Figura 18 – Irinotecano aumenta a imunoexpressão de IL-1β no tecido hepático. Camundongos tratados com IRI apresentaram elevada imunoexpressão para IL-1β tanto na área periportal (Zone 1) como em hepatócitos da zona 3 (Quadro C) quando comparados com o grupo controle tratado com solução salina (Quadro B). O controle negativo corresponde a uma amostra do tecido hepático onde o anticorpo foi substituído por PBS/BSA e nenhuma imunoexpressão foi detectada (Quadro A). Magnificação 100x.

A B

C

74

Figura 19 – Irinotecano aumenta a imunoexpressão de iNOS no tecido hepático. Camundongos tratados com IRI apresentaram elevada imunoexpressão para iNOS na zona acinar 3, circunscrevendo a veia centrolobular (Quadro C) quando comparados com o grupo controle tratado com solução salina (Quadro B). O controle negativo corresponde a uma amostra do tecido hepático onde o anticorpo foi substituído por PBS/BSA e nenhuma imunoexpressão foi detectada (Quadro A). Magnificação 100x.

A B

C

75

Figura 20 – Irinotecano aumenta a imunoexpressão de TLR4 no tecido hepático. Camundongos tratados com IRI apresentaram elevada imunoexpressão para TLR4 tanto nos hepatócitos como nas células mononucleares dos inflitrados portais (Quadro C) quando comparados com o grupo controle tratado com solução salina (Quadro B). O controle negativo corresponde a uma amostra do tecido hepático onde o anticorpo foi substituído por PBS/BSA e nenhuma imunoexpressão foi detectada (Quadro A). Magnificação 100x.

A B

C

76

4.1.10. Avaliação da mucosite intestinal

A análise histopatológica de amostras do intestino dos animais injetados com

irinotecano (50mg/kg ip 3 vezes/semana) demonstrou alterações severas

compatíveis com mucosite e de forma significativa em relação ao controle (p< 0,01).

Os escores de gravidade propostos por Woo mostraram elevação a partir da terceira

semana extendendo-se até a sétima semana do experimento.

Tabela 4 – Graus de mucosite conforme Woo da primeira a sétima semana. Amostras do tecido duodenal foram coletadas e analisadas histologicamente para determinação do grau de mucosite em comparação ao controle. Os dados foram através do teste de Mann-Whitney. Os valores estão expressos como mediana (mínimo-máximo). **p<0.01, ***p<0,001 versus salina.

Semanas

Salina (n=5) Ironetecano (n=5)

Mucosite graus 0 a 4

1ª 0 (0-0) 0 (0-1)

3ª 0 (0-0) 4 (0-4)**

5ª 0 (0-0) 4 (3-4)***

7ª 0 (0-0) 4 (3-4)***

77

Figura 21 – Fotomicrografias do duodeno de camundongos que receberam injeção de salina (A) ou irinotecano (50 mg/Kg) (B). Na mucosa dos animais que receberam irinotecano os vilos estão encurtados e há erosões em sua superfície.

A

B

78

4.1.11. Reação Imunohistoquímica para iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-18 e TLR-4 no

intestino

O estudo imunohistoquímico do tecido entérico na sétima semana do

experimento revelou uma elevação significativa, em relação ao controle, da

expressão de TLR-4 (Figura 22) e iNOS (Figura 23) no epitélio da mucosa

duodenal (p<0,05) e elevação da expressão de TLR-4(Figura 22), iNOS (Figura 23)

e IL-1β (Figura 24) nos macrófagos do tecido submucoso duodenal (Tabela 5). A

hiperexpressão foi significativa tanto nas células do epitélio intestinal como nos

macrófagos do tecido conjuntivo submucoso.

79

Tabela 5 – Irinotecano promove aumento da imunoexpressão de iNOS, TLR4 no epitélio da mucosa duodenal e aumento da imunoexpressão de IL-1β, iNOS e TLR4 nos macrófagos da submucosa duodenal. Os dados foram através do teste de Mann-Whitney. Os valores estão expressos como mediana (mínimo-máximo). *p<0.05 versus salina.

Grupos experimentais

Escores imunohistoquímicos Semana 7

IL-1β (0-3) iNOS(0-3) TLR4 (0-3) TNF(0-3) IL-18(0-3)

Epitélio

Salina (n=5) 1 (1 - 2) 0 (0 - 1) 1 (0 - 3) 0 (0-1) 0 (0-0)

(IRI, 21 x 50 mg/kg)

2 (1 – 2) 1 (1 - 3) * 2 (1-3) * 0 (0-0) 0 (0-0)

Macrófagos (Submucosa)

Salina (n=5) 0 (0 - 1) 0 (0 - 1) 1 (0 - 2) 0 (0-0) 0 (0-0)

(IRI, 21 x 50 mg/kg)

1 (1 – 1) * 1 (1 - 3) * 2,5 (0-3) * 0 (0-0) 0 (0-0)

80

Figura 22 – Irinotecano aumenta a imunoexpressão de TLR4 no tecido duodenal. Camundongos injetados com IRI apresentaram elevada imunoexpressão para TLR4 tanto nas células epiteliais da mucosa como nas células mononucleares do tecido conjuntivo da submucosa (Quadro C) quando comparados com o grupo controle tratado com solução salina (Quadro B). O controle negativo corresponde a uma amostra do tecido duodenal onde o anticorpo foi substituído por PBS/BSA e nenhuma imunoexpressão foi detectada (Quadro A). Magnificação 100x.

A B

C

81

Figura 23 – Irinotecano aumenta a imunoexpressão de iNOS no tecido duodenal. Camundongos injetados com IRI apresentaram elevada imunoexpressão para iNOS tanto nas células epiteliais da mucosa como nas células mononucleares do tecido conjuntivo da submucosa (Quadro C) quando comparados com o grupo controle tratado com solução salina (Quadro B). O controle negativo corresponde a uma amostra do tecido duodenal onde o anticorpo foi substituído por PBS/BSA e nenhuma imunoexpressão foi detectada (Quadro A). Magnificação 100x.

A B

C

82

Figura 24 – Irinotecano aumenta a imunoexpressão de IL-1β no tecido duodenal. Camundongos injetados com IRI apresentaram elevada imunoexpressão para IL-1β nas células epiteliais da mucosa (Quadro C) quando comparados com o grupo controle tratado com solução salina (Quadro B). O controle negativo corresponde a uma amostra do tecido duodenal onde o anticorpo foi substituído por PBS/BSA e nenhuma imunoexpressão foi detectada (Quadro A). Magnificação 100x.

A

C

B

83

4.1.12. Avaliação da translocação bacteriana

As culturas do sangue portal foram positivas para bactérias gram negativas de

forma significativa durante todas as semanas do experimento. Na primeira e terceira

semanas obtiveram-se culturas portais positivas em todos os animais (100%)

injetados com irinotecano, reduzindo para 80% de positividade nas semanas

subsequentes (5 e 7). Não houve crescimento de bactérias gram negativas em

nenhuma cultura portal do grupo controle de animais injetados com solução salina.

As culturas do sangue sistêmico colhidas do plexo retro-ocular foram positivas, de

forma significativa, somente na primeira e na terceira semanas do experimento, com

crescimento de bactérias gram negativas em todas as amostras coletadas. Na

quinta e sétimas semanas, houve redução da positividade das culturas para 60% e

40%, respectivamente. Assim como observado nas culturas portais, nenhuma

cultura do sangue sistêmico foi positiva para bactérias gram negativas nos animais

do grupo controle, injetados com solução salina (Tabela 6). As bactérias que

creseceram no meio MaConkey foram caracterizadas na bacterioscopia como

bacilos gram negativos e na prova bioquímica com o kit Probac foi identificado o

padrão de enterobactérias da espécie Escherichia coli ( Figura 25).

84

Tabela 6 – Cultura de amostras de sangue portal (Pta) e do plexo retrorbital (Px) de camundongos em meio seletivo para bactérias gram negativas (MaConkey). Camundongos injetados com IRI apresentaram crescimento de bactérias gram negativas em amostras de sangue portal e sistêmico, e, por outro lado, não houve crescimento bacteriano nas amostras obtidas dos animais que foram injetados com salina. *p<0,05.

Salina (n=4) Ironetecano (n=5)

Semanas Px 48h Pta 48h Px 48h Pta 48h

1ª 0/4 (0%) 0/4 (0%) 5/5 (100%)* 5/5 (100%)*

3ª 0/4 (0%) 0/4 (0%) 5/5 (100%)* 5/5 (100%)*

5ª 0/4 (0%) 0/4 (0%) 3/5 (60%) 4/5 (80%)*

7ª 0/4 (0%) 0/4 (0%) 2/5 (40%) 4/5 (80%)*

85

Figura 25 – Plaqueamento em meio de cultura MaConkey (A), bacterioscopia pelo Gram (B) e prova bioquímica do kit Probac (C) de microorganismos em hemocultura. Camundongos injetados com IRI apresentaram crescimento de bactérias gram negativas em amostras de sangue portal e sistêmico. A prova bioquímica demonstra a presença de Escherichia coli.

A

B

C

86

5. DISCUSSÃO

Neste trabalho, foi demonstrado o desenvolvimento de um modelo

experimental simples e reprodutível de esteatohepatite induzida pelo agente

antineoplásico irinotecano, assim como foram descritos alguns fatores envolvidos

em sua patogênese.

Modelos experimentais são importantes recursos científicos que permitem

esclarecer eventos biológicos, tornando possível o entendimento de suas

fisiopatologias e a consequente proposição de intervenções terapêuticas. Tais

modelos são utilizados para simular, da forma mais fidedigna possível, os problemas

encontrados na prática clínica permitindo um conhecimento mais profundo da

doença. A esteatohepatite não alcoólica (NASH) induzida pelo irinotecano é um

problema de extrema relevância médica e exerce um forte impacto no cotidiano da

prática oncológica atual. Não existe, na literatura médica, nenhum modelo

experimental de NASH induzida pelo irinotecano que mimetize todos os aspectos da

síndrome.

É bem verdade que algumas outras tentativas de desenvolver um modelo

experimental de NASH induzido por quimioterapia foram realizadas previamente

(KEIZMAN et al., 2010; MIKALAUSKAS et al., 2011). Em ambos os estudos,

algumas alterações hepáticas como elevação do conteúdo lipídico e esteatose ou

mesmo dano hepatocelular com alterações de enzimas hepáticas foram

demonstradas. No entanto, nenhum dos dois estudos demonstrou as alterações

inflamatórias que são mandatórias para o diagnóstico de NASH.

No estudo de Keizman et al. (2010), no modelo definido como NASH foi

verificada a indução apenas de esteatose que associou-se à oxaliplatina e não ao

irinotecano. A estratégia de administração de apenas três doses do irinotecano

utilizada no trabalho pode não ter sido suficiente para permitir que a síndrome se

manifestasse completamente. Além disso, a oxaliplatina, na prática clínica, é muito

mais comumente relacionada ao surgimento da Síndrome de Obstrução Sinusoidal,

mas não a NASH. No trabalho de Mikalauskas et al. (2011), somente uma única

dose elevada do irinotecano (180mg/m2) associada ao fluorouracil foi administrada e

os animais foram sacrificados apenas 30 horas após a infusão. O autor descreveu

um modelo de hepatopatia aguda com aumento de enzimas hepáticas (AST e ALT)

e algum grau de esteatose, mas não foram encontradas alterações inflamatórias

87

típicas da NASH. A presença de alterações histológicas isoladas pode refletir algum

grau de lesão hepática, mas não deve ser classificada como NASH (BRUNT et al.

1999 ; KLEINER et al. 2005).

Dessa forma, talvez em grande parte pela falta de conhecimento mais

acurado deste fenômeno, nenhum trabalho foi publicado com propostas consistentes

de medidas terapêuticas ou preventivas da esteatohepatite secundária ao

irinotecano. Na presente investigação está descrito, de fato, o primeiro modelo

experimental de NASH associada ao irinotecano onde todas as alterações

histológicas classicamente observadas na prática clínica foram demonstradas,

podendo se tornar uma ferramenta útil para o progresso do entendimento e de

futuras abordagens dessa condição.

Para a elaboração da curva dose-efeito, foi administrado irinotecano por via

intraperitoneal três vezes por semana nas doses de 25mg/Kg, 50mg/Kg, 75mg/Kg e

100mg/Kg. A atividade biológica do irinotecano administrado durante o experimento

foi confirmada pela ocorrência de toxicidade medular, traduzida por leucopenia

observada na primeira e sétima semanas.

A estratégia de administrar o irinotecano com a dose de 50mg/kg três vezes

por semana por sete semanas consecutivas permitiu o desenvolvimento da

síndrome por completo. Doses menores não foram capazes de induzir um dano

hepático efetivo visto que não foram associadas a elevações de enzimas hepáticas

(aminotransferases). Por outro lado, doses mais elevadas do irinotecano não se

tornaram viáveis por estarem associadas com uma mortalidade dos animais

excessivamente elevada, muito possivelmente conseqüente à mucosite

gastrointestinal.

Não era interesse do estudo utilizar doses subletais por curtos períodos

capazes de causar uma citotoxicidade hepatocítica direta. Fulco e colaboradores,

em um estudo in vitro, avaliaram a toxicidade primária a hepatócitos isolados quando

cultivados na presença de camptotecinas (irinotecano ou CPT-11, SN-38 e

topotecano) e evidenciaram o surgimento de uma citotoxicidade dose e composto-

dependente. De tal forma que topotecano e irinotecano provocaram menor

toxicidade quando comparados ao SN-38, seu metabólito mais ativo. Nessa

circunstância, tal citotoxicidade ocorreu somente durante um curto período de tempo

(3 horas). A exposição mais prolongada ao irinotecano e a seu metabólito ativo SN-

38, que é um conhecido fator de risco clínico para NASH, não gerou toxicidade

88

celular adicional (FULCO et al., 2000). Além disso, a maciça destruição de

hepatócitos não é um achado histológico associado a NASH, tornando esse

mecanismo de toxicidade direta exclusiva pouco provável como responsável pela

patogênese da síndrome.

A administração do irinotecano (50mg/kg três vezes por semana) causou um

dano hepático persistente que ficou demonstrado pela hepatomegalia dose

dependente e pela elevação das enzimas hepáticas observada durante todo o

experimento a partir da segunda semana. A estratégia de prolongar o período de

administração do irinotecano (50mg/Kg ip 3 vezes/semana) ao máximo resultou em

uma mortalidade significativa. Somente metade dos animais sobreviveu até o fim do

experimento na sétima semana, poucos animais sobreviveram até a nona semana e

nenhum deles sobreviveu até a décima. No entanto, acreditamos que esta

abordagem foi extremamente importante, pois simulou de forma mais próxima o que

acontece na prática clínica, que envolve tratamentos por longos períodos.

Adicionalmente, proporcionou o intervalo de tempo exato para que as alterações

histopatológicas pudessem paulatinamente se estabelecer.

No modelo ora apresentado, o grau de severidade da esteatohepatite foi

progressivo e proporcional às doses cumulativas administradas do irinotecano,

caracterizando uma relação de causa-efeito. Na prática clínica, embora exista

relação entre NASH e o tempo de exposição à droga, não é possível prever sua

ocorrência pelo cálculo da dose acumulada de irinotecano. O limiar para o

desenvolvimento desta síndrome é heterogêneo entre os pacientes e deve variar de

acordo com múltiplos fatores.

No estudo de Vauthey et al. (2006), o índice de massa corpórea foi

relacionado a uma maior ocorrência de esteatohepatite secundária ao irinotecano.

Pacientes com índice de massa corporal (IMC) acima de 25 tiveram duas vezes mais

NASH do que os pacientes com IMC menor que 25 (12,1% vs 25,6%). A importância

do cenário metabólico tem sido reportada nos casos de esteatohepatite induzida por

outras drogas, como o metotrexato (LANGMAN et al., 2001), e aspectos da

síndrome metabólica têm sido consistentemente relacionados à NASH

(HAMAGUSHI et al., 2005). Entretanto, estes e outros fatores como diabetes,

ingestão de álcool, hepatites crônicas e esteatose pré-quimioterapia ainda não foram

comparados em estudos clínicos entre pacientes expostos ao irinotecano que

desenvolvem ou não NASH secundária a este quimioterápico. Assim, não há

89

recomendações individualizadas na prática clínica para protocolos contendo

irinotecano nos subgrupos específicos de pacientes.

No presente estudo, nos animais sacrificados após sete semanas

consecutivas de exposição ao irinotecano na dose de 50mg/Kg (3 vezes/semana),

foram encontradas todas as três alterações histológicas necessárias para a

caracterização de esteatohepatite: tumefação hepatocítica, esteatose e inflamação

lobular.

A tumefação ou balonização hepatocítica foi a alteração histológica

manifestada com menor intensidade neste modelo e encontrada de forma

significativa somente na sétima semana do experimento. Embora seja considerada

um marcador fundamental de esteatohepatite, a definição de balonização ainda não

é precisa e baseia-se em critérios morfológicos como aumento do volume e edema

celular e aspecto reticular do citoplasma. Esta avaliação de caráter subjetivo pode

causar discordância entre patologistas, e gerar dificuldade na sua identificação em

sua fase inicial. No corrente estudo, a tumefação foi avaliada pelo método clássico

proposto pelo escore de Kleiner.

Recentemente, estudos sugerem que a perda da imunoexpressão das

ceratinas 8 e 18 dos filamentos intermediários do citoesqueleto (FI) parece ser um

marcador mais objetivo da balonização dos hepatócitos (LACKNER et al., 2008). As

ceratinas 8 e 18 são fundamentais para a estabilização e organização topográfica da

célula e de suas organelas. Dano ao FI do citoesqueleto foi demonstrado em

modelos experimentais de NASH em resposta ao estresse oxidativo tendo como

conseqüência a alteração citopática da tumefação (LACKNER et al., 2008).

O aspecto macroscópico do fígado não faz parte dos critérios comumente

utilizados para diagnóstico de NASH. Classicamente associada com esteatose, a

coloração amarelada do fígado é, de fato, pouco encontrada na prática clínica. No

estudo aqui apresentado, o chamado fígado amarelo foi, como na clínica, um

achado pouco prevalente, identificado apenas em alguns animais do grupo exposto

ao irinotecano, e teve pouca correlação com os achados histológicos da NASH.

No corrente estudo, a esteatose foi caracterizada tanto pelo método

bioquímico, com avaliação da quantidade de lipídeos totais no tecido hepático, como

pelo achado anatomopatológico. A distribuição dos lipídeos na célula hepática pode

ser macrovesicular, com hepatócitos distendidos por um vacúolo único que desloca

o núcleo para a periferia ou microvesicular, com numerosos e pequenos depósitos

90

lipídicos ao redor de um núcleo centralizado. A esteatose macrovesicular representa

mais um distúrbio crônico do metabolismo lipídico do fígado e tem comportamento

benigno (TILG e MOSCHEN, 2010). A esteatose microvesicular difusa, por outro

lado, é caracteristicamente uma condição aguda que revela uma disfunção

mitocondrial. Está associada a um pior prognóstico e ao desenvolvimento de

insuficiência hepática (DAY e JAMES,1998). Histologicamente, no presente estudo,

prevaleceu a esteatose com padrão microvesicular ou em microgotas. Demonstrou-

se também que a esteatose só se estabeleceu na sétima semana do experimento,

quando já havia evidências de dano inflamatório e de estresse oxidativo no tecido

hepático.

O acúmulo de lipídeos no parênquima hepático pode ocorrer por um dos três

mecanismos: aumento do aporte de ácidos graxos pela dieta ou pela quebra de

adipócitos da periferia; aumento da síntese endógena ou pela disfunção mitocondrial

resultando na diminuição da β oxidação lipídica (CHITTURI e FARRELL, 2001). Nas

amostras aqui apresentadas, não houve aporte dietético indutor de esteatose e nem

havia motivos para uma síntese aumentada de ácidos graxos nos grupos

experimentais em relação ao controle. Portanto, é provável que o mecanismo de

acúmulo de lipídeos no modelo ora mostrado deva-se à disfunção mitocondrial e à

conseqüente inibição da oxidação fisiológica dos ácidos graxos. Possíveis

mecanismos responsáveis pela falência da atividade mitocondrial na NASH parecem

envolver estresse oxidativo, peroxidação lipídica, LPS e citocinas inflamatórias

(PESSAYRE e FROMENTY, 2005). Assim, presume-se que a esteatose, no modelo

proposto, seja uma consequência dos mecanismos causadores da NASH, que

induziriam disfunção mitocondrial e não um componente central da sua patogênese.

A presença de inflamação é reconhecida como o evento chave na

diferenciação entre esteatose simples e esteatohepatite. A inflamação é um

marcador de severidade da NASH e um importante fator de risco para o

desenvolvimento de fibrose (TILG E MOSCHEN, 2010). No modelo proposto, a

inflamação desempenhou um papel importante na NASH induzida por irinotecano.

As alterações inflamatórias foram mais intensas que os outros achados histológicos

e tiveram início mais cedo. Os infiltrados inflamatórios neutrofílicos tiveram início na

terceira semana do experimento e foram identificados de forma consistente tanto no

lóbulo hepático como nos espaços porta. Demonstrou-se também uma elevação na

concentração de mieloperoxidase no tecido hepático, que é uma importante enzima

91

de degradação neutrofílica. Sua elevação indica a presença de um processo

inflamatório agudo e caracteriza a natureza funcionante dos infiltrados celulares

encontrados.

Segundo Kleiner e colaboradores, a fibrose é um achado histológico relevante

na NASH, mas não faz parte das suas alterações patológicas definidoras, pois

ocorre em uma fase mais tardia da síndrome (KLEINER et al., 2005). No entanto,

sua avaliação é de grande importância, pois apresenta estreita correlação

prognóstica. O padrão de fibrose na NASH é distinto e pode ser difícil de

diagnosticar. A fibrose pode começar como fibras delicadas de colágeno que isolam

um ou mais hepatócitos necessitando, para sua identificação, de uma boa técnica de

preparação de lâminas (tricrômico de Masson) e um patologista experiente

(KLEINER e BRUNT, 2012). O processo de fibrogênese é inicialmente discreto e

limita-se aos espaços de Disse, localizados entre os sinusóides e as colunas de

hepatócitos. No espaço de Disse encontram-se as células estelares, que quando

estimuladas por TGF-β podem sofrer mudanças estruturais transformando-se em

miofibroblastos ativados que dão início ao processo fibrogênico (FRIEDMAN et al.

1985; LIMA, 2010).

A presença de fibrose caracteriza uma condição ominosa, pouco reversível,

associada a graus diversos de insuficiência hepática e representa o principal fator de

risco para o desenvolvimento de cirrose (USLUSOY et al. 2011). Em um estudo

populacional, a presença de fibrose incipiente associada a NASH foi um preditor de

risco para progressão da fibrose. A identificação de estágios precoces de fibrose na

biópsia inicial representou um risco de progressão para graus mais severos de

fibrose, nas biópsias subseqüentes, de 37% (ADAMS et al., 2005). No corrente

estudo, a fibrose foi demonstrada apenas na nona semana do experimento e de

forma incipiente, obedecendo um padrão perisinusoidal (estágio I). Por ser o achado

patológico mais tardio, acredita-se que a fibrose ocorreu como conseqüência do

processo de dano hepático que se desenvolveu nas semanas anteriores. Matteoni e

colaboradores descreveram que as alterações necro-inflamatórias da NASH

representam um potencial de risco de progressão silenciosa para a cirrose hepática

de até 24% (MATTEONI et al., 1999). No presente estudo, poucos animais

sobreviveram até a nona semana, período onde se demonstra o processo

fibrogênico. No entanto, as evidências de disfunção hepática puderam ser

observadas desde a terceira semana, com redução progressiva da concentração de

92

proteínas plasmáticas, achado que pode refletir uma crescente diminuição na

capacidade funcional sintética do fígado.

Assim como a inflamação, o estresse oxidativo é considerado um evento

central na patogênese da NASH. No presente modelo, este evento foi estudado

através da dosagem de malonaldeído e glutationa. Foi evidenciada uma elevação

significativa de malonaldeído na primeira e na quinta semanas. Paralelamente,

conforme esperado, houve uma proporcional redução dos níveis de glutationa em

relação ao grupo controle. Estes achados confirmam a ocorrência do estresse

oxidativo nos animais submetidos ao irinotecano, tanto precocemente no

desenvolvimento da NASH quanto mais tardiamente, quando a síndrome completa

já se estabelecia.

O momento que acontece o estresse oxidativo na NASH, induzida ou não por

irinotecano, ainda não está claro na literatura. A teoria fisiopatológica da NASH

apresentada por Day e James sugere que são necessários insultos consecutivos

para o desenvolvimento da esteatohepatite. Um primeiro insulto, como a esteatose

hepática, levaria ao aumento da vulnerabilidade do fígado a um segundo insulto, que

apresenta como candidatos fatores como o estresse oxidativo, LPS e citocinas

inflamatórias (DAY e JAMES,1998). Portanto, segundo esta teoria, o estresse

oxidativo e o LPS concorrem de maneira excludente como mecanismo primário

único que deflagraria a cascata comum de lesão celular. No corrente modelo, ao

contrário do proposto por Day e James, acredita-se que os diversos eventos

capazes de induzir NASH aconteceram concomitantemente. Ademais, como os

animais foram submetidos aos efeitos do uso do irinotecano com fígado inicialmente

saudável, os achados inflamatórios e a evidência de estresse oxidativo precederam

a esteatose. A hipótese de múltiplos insultos paralelos já foi relatada anteriormente

por Tilg e Moschen (2010). Estes autores consideram que fatores diversos como

estresse oxidativo, LPS e citocinas podem, na verdade, atuar em paralelo,

contribuindo sinergicamente para o desenvolvimento da síndrome. Os autores

propõem também que a esteatose não seria uma pré-condição necessária para a

ocorrência da NASH e que a inflamação pode, na verdade preceder a esteatose,

determinando estresse oxidativo que levaria ao acúmulo de lipídeos

secundariamente. A esteatose simples pode representar apenas um epifenômeno,

apresentando patogênese distinta da NASH.

93

A observação de consistentes infiltrados inflamatórios ricos em neutrófilos

circunscrevendo os espaços porta, como vistos no modelo proposto, permite supor a

presença de algum estímulo aferente carreado pela tríade portal. Uma vez que este

infiltrado teve forte imunomarcação para TLR-4, como demonstrado no estudo, a

suspeita recai sobre o seu principal ligante, a endotoxina (LPS) das bactérias gram

negativas. O papel do LPS foi avaliado no corrente estudo através da cultura do

sangue sistêmico e portal e da análise da imunoexpressão de TLR4. As culturas do

sangue sistêmico e portal evidenciaram o crescimento de bacilos gram-negativos

entéricos (Escherichia coli) no grupo dos animais expostos ao irinotecano durante

todo o curso do experimento. O insulto séptico sistêmico e ao fígado (portal) foi um

evento precoce e sustentado. A bacteremia portal por enterobactérias gram-

negativas iniciou-se na primeira semana do experimento e permaneceu, de forma

significativa, até a última (semana 7). Na sétima semana, quando a NASH alcançou

todos os seus critérios definidores, a imunoexpressão de TLR4 foi também

estatisticamente superior nos tecidos hepáticos dos animais que receberam

irinotecano. Estes resultados em conjunto demonstraram que, nos animais expostos

ao irinotecano, há fortes evidências da exposição prolongada do fígado ao LPS.

Há evidências convincentes da participação do LPS e do seu receptor, TLR-4

na patogênese da NASH. Em um modelo experimental de NASH induzida por dieta

rica em lipídeos, observou-se um aumento dos níveis plasmáticos de LPS de duas a

três vezes em relação ao controle (KANI et al., 2007). Em um estudo clínico,

demonstrou-se que a concentração plasmática de endotoxina e a expressão de RNA

mensageiro de TLR-4 encontraram-se significativamente aumentadas em pacientes

obesos com NASH em relação ao grupo controle normal. Os autores também

demonstraram uma elevação no nível sérico da proteína ligadora do LPS em

pacientes obesos com NASH comparando com obesos portadores de esteatose

simples (RUIZ et al., 2007). CZAC e colaboradores descreveram de forma

convincente que o complexo LPS-TLR-4 exerce importante papel no processo de

inflamação, estresse oxidativo e fibrose da esteatohepatite induzida por dieta. Em

um modelo experimental de NASH induzida por dieta pobre em aminoácidos

(metionina e colina), os autores compararam os achados entre camundongos

geneticamente normais e camundongos geneticamente modificados (nocaute) que

não expressam os componentes do receptor de LPS (TLR-4 e MD-2). A deficiência

de TLR-4/MD-2 diminuiu significativamente a esteatose, avaliada histologicamente e

94

através da dosagem de triglicerídeos no parênquima hepático. Os autores

demonstraram igualmente uma diminuição no processo inflamatório mensurado

tanto pela redução da quantidade de infiltrados celulares como da expressão de

citocinas inflamatórias no tecido hepático. O estresse oxidativo foi minorado nos

animais nocaute para TLR-4 com menor expressão do complexo NADPH oxidase e

do ácido tiobarbitúrico (TBARS) no fígado. A ausência de TLR-4 foi também capaz

de impedir o aumento dos níveis de transcrição (RNA mensageiro) de genes

associados à fibrose (pro-colágeno-1, TGF-β e actina de músculo liso α) (CZAC et

al., 2011a).

A ação biológica do LPS via receptor TLR-4 pode estimular o processo

inflamatório através da síntese de citocinas. Atualmente sabemos que após a

ligação do LPS com TLR4, na presença dos cofatores CD14 ou MD-2 (fator de

diferenciação mielóide 2), é iniciada uma cascata de sinalização em duas vias que

resulta na ativação do NF-KB e na transcrição de genes de várias citocinas pró-

inflamatórias (ABBAS, 2008). Além disso, o LPS é capaz de ativar, após associar-se

ao TLR-4, um complexo multiprotéico denominado inflamassoma que está envolvido

na ativação de citocinas, principalmente IL-1β (CZAC et al., 2011b).

O inflamassoma foi primeiramente descrito em 2002 por Martinon e

colaboradores (2002) quando demonstraram que um tipo de polímero multiprotéico

intracelular era capaz de ativar a cascata enzimática da caspase-1 levando a

produção de citocinas inflamatórias, notadamente IL-1β a partir da clivagem

enzimática do seu precursor, a pró-IL-1β. Czac e colaboradores (2011b)

demonstraram um aumento da atividade do complexo do inflamassoma tanto em

modelo animal como em pacientes portadores de NASH. A exposição ao LPS no

modelo animal demonstrou que o aumento dos níveis circulantes de endotoxina

contribuiu para a ativação do inflamassoma e para a hiperexpressão de IL-1β no

tecido hepático. Os autores evidenciaram uma hiperatividade do inflamassoma em

camundongos durante a NASH, mas não durante a esteatose simples. Demonstrou-

se também, de forma pioneira, que tanto a ativação do inflamassoma quanto a

produção de IL-1β ocorre em hepatócitos isolados e não somente em macrófagos

durante modelo experimental de NASH (Czac et al., 2011b). Em concordância com

estes achados, foi encontrado, no modelo proposto, uma elevada imunoexpressão

de IL-1β tanto nos macrófagos do infiltrado inflamatório portal como nos hepatócitos.

95

IL-1β é um mediador importante do processo inflamatório atuando na

iniciação da cascata inflamatória que leva a lesão tecidual (DINARELLO, 2000). O

macrófago residente, representado pela célula de Kupffer no fígado, é a principal

célula apresentadora de antígeno e possui receptores TLR-4 na sua membrana. A

interação do LPS com o receptor TLR-4 estimula o macrófago a responder

imediatamente deflagrando as vias de sinais intracelulares que resultam na síntese

de citocinas inflamatórias como TNF e IL-1 (ABBAS, 2008). Ao contrário do TNF, a

IL-1 também é produzida por outros tipos celulares que não o macrófago, como por

exemplo o hepatócito (VALLES et al., 2003).

A IL-1 atua como um mediador da inflamação agindo na célula endotelial

para aumentar a expressão de moléculas de superfície que medeiam a adesão e a

migração de leucócitos, principalmente neutrófilos (ABBAS, 2008). Dessa forma, a

hiperexpressão de IL-1 pode explicar os consistentes infiltrados neutrofílicos, tanto

periportais como intralobulares, encontrados no tecido hepático dos animais

expostos ao irinotecano no modelo proposto. Existem dados que ratificam o

envolvimento da IL-1 na fisiopatologia da esteatohepatite. Em um estudo recente, os

níveis de RNA mensageiro (RNAm) para IL-1 e IL-1 se elevou 16 e 4,6 vezes,

respectivamente, em camundongos selvagens com esteatohepatite induzida por

dieta aterogênica. Nos animais deficientes em IL-1 ou IL-1, a transformação de

esteatose para esteatohepatite e fibrose hepática foi significativamente reduzida.

Esse efeito protetor da deficiência de IL-1 foi evidenciado apesar do aumento dos

níveis de colesterol hepático (KAMARI et al., 2011), suscitando a idéia de que houve

proteção do processo inflamatório, mas não do acúmulo lipídico.

Além de induzir inflamação por estímulo à produção de citocinas, o complexo

LPS-TLR4 pode também promover dano tissular por estresse oxidativo, através da

ativação de dois mecanismos distintos. A via da fagócito-oxidase e a via da NOSi

são mecanismos de produção de moléculas microbicidas presentes nos lisossomos

de células fagocitárias, principalmente macrófagos e neutrófilos. A fagócito-oxidase

é uma enzima que quando ativada converte o oxigênio molecular em derivados

reativos de oxigênio (ROS) tais como radicais superóxido. O superóxido é

enzimaticamente dismutado em peróxido de hidrogênio, que é o substrato da enzima

mieloperoxidase para produzir ácidos reativos que são tóxicos para as bactérias

(ABBAS, 2008). Os macrófagos também podem produzir intermediários reativos do

oxigênio pela ação da enzima NO sintase induzida (NOSi). Dentro do fagolisossomo,

96

o óxido nítrico pode se combinar com peróxido ou superóxido de hidrogênio,

gerados pela fagócito oxidase, para produzir radicais peroxinitrito altamente reativos

que podem eliminar microorganismos. Quando neutrófilos e macrófagos são

fortemente ativados por ligantes como o LPS, eles podem provocar a lesão por

estresse oxidativo de tecidos normais do hospedeiro por liberação de seus

conteúdos lisossômicos (ABBAS, 2008). No corrente estudo, foram encontradas

evidências de lesão hepática por estresse oxidativo pelos dois mecanismos citados,

através da elevação dos níveis de mieloperoxidase e imunoexpressão aumentada

da enzima NOSi em amostras do tecido hepático.

A liberação de espécies reativas de oxigênio geradas pela ativação das

células de Kupffer, quando estimuladas por LPS, pode promover um dano inicial na

mitocôndria dificultando a fosforilação oxidativa, que ocorre na sua membrana

interna. Quanto maior for a inibição da atividade do citocromo e da oxidase, maior

seria a produção de espécies reativas de oxigênio pela própria mitocôndria,

amplificando a cascata e gerando um ciclo vicioso de lesão celular e disfunção

mitocondrial (SATO, 2007).

A imunoexpressão da NOSi encontrada no modelo ora proposto foi

significativa e intensa nos hepatócitos circunscrevendo a veia centro lobular, na zona

acinar 3, que é a área mais isquêmica do lóbulo hepático. Nesse contexto, já havia

sido demonstrada a hiperexpressão de NOSi no tecido hepático em pacientes

obesos e resistentes à insulina portadores de NASH (GARCIA-MONZÓN et al.,

2000). Assim como no corrente estudo, HA e CHAE (2010) também encontraram,

em um modelo experimental de NASH induzida por dieta, uma imunoexpressão

aumentada de NOSi com aspecto caracteristicamente perivenular, envolvendo a

veia centrolobular. A expressão de NOSi no hepatócito pode estar sendo regulada

por citocinas como a IL-1 (GELLER et al., 1993). Assim, o microambiente

inflamatório pode contribuir para a hiperexpressão de NOSi na NASH. O óxido

nitrico, além de componente importante do processo inflamatório, é um vasodilatador

potente (TETSUKA et al., 1994). É possível que o aumento da atividade da NOSi na

zona acinar 3, menos oxigenada, esteja associado a mecanismos de elevação do

fluxo sanguíneo compensatório no fígado que são, em grande parte, mediados por

óxido nítrico.

A interação do LPS e TLR-4 também pode induzir o processo fibrogênico no

fígado. As células estelares localizam-se no espaço de Disse e são as principais

97

fontes de proteínas da matriz extracelular, como colágeno tipos I, III e IV, que são

abundantes na fibrose hepática (FRIEDMAN, 2008). Elas apresentam na superfície

todos os receptores do tipo Toll, inclusive o TLR-4 (YANG, 20012). Em resposta ao

LPS, as células estelares podem ser ativadas para um fenótipo pró-fibrogênico. A

interação entre o LPS e TLR4 exerce um efeito cruzado importante na via de

sinalização do TGF-β (SEKI et al.,2007). A célula estelar quiescente expressa níveis

elevados de um inibidor endógeno do receptor do TGF-β (Bambi) que inibe a

interação com o seu ligante, o TGF-β. No estado fibrogênico, a expressão deste

inibidor é rapidamente diminuída, sendo tal efeito mediado pelo TLR4. A diminuição

da ação do inibidor resulta na amplificação do sinal do TGF-β, que promove a

ativação da célula estelar (SEKI et al.,2007). A célula estelar ativada é o passo

crucial para a fibrose hepática, acionando a cascata que culmina com a deposição

de colágeno (YANG e SEKI, 2012). No estudo aqui demonstrado, identificou-se uma

fibrose incipiente num padrão perisinusoidal, que parece guardar estreita relação

topográfica com os espaços de Disse.

Nesse sentido, considerou-se que o LPS representou um componente central

na patogênese da NASH induzida pelo irinotecano no presente modelo. A ação

biológica do LPS via receptor TLR-4 pode concomitantemente determinar estresse

oxidativo, através da formação de intermediários reativos de oxigênio, estimular o

processo inflamatório através da síntese de citocinas e induzir fibrogênese pela via

do TGFβ.

Desde que a microflora intestinal é a fonte principal de LPS, e que a veia

porta é a principal via de drenagem da circulação entérica, a presença de bactérias

gram-negativas na circulação portal indica sua origem intestinal. A falha dos

mecanismos da barreira intestinal pode ser a causa primária da elevação dos níveis

de LPS no sangue portal (SU et al., 2012) e sugere a ocorrência de translocação

bacteriana. A perda da integridade epitelial da mucosa intestinal com alterações nas

proteínas de aderência intercelulares (tight junction) pode ser o mecanismo

patológico responsável pela translocação. Nos últimos anos, as evidências que

suportam o papel do eixo intestino-fígado na patogênese da NASH vêm se

acumulando.

Em um estudo experimental com camundongos obesos geneticamente

modificados, Brun e colaboradores demonstraram uma menor resistência intestinal

epitelial e maior permeabilidade da barreira mucosa quando comparados com

98

animais normais. A alteração da permeabilidade deveu-se a uma expressão anormal

das proteínas de adesão ocludina e zona ocludens que compõem o mecanismo de

barreira das tight junctions. Os autores demonstraram também que a perda da

barreira intestinal se associou a um aumento significativo da endotoxemia portal e à

ativação das células estelares (BRUN et al., 2007). Um estudo clínico comparou a

permeabilidade intestinal de pacientes com doença gordurosa hepática não alcoólica

com a de controles normais através de biópsias duodenais (MIELE et al., 2009). Os

autores encontraram um aumento da permeabilidade mucosa nos pacientes com

NASH avaliada pela menor expressão de proteínas como zona ocludens 1.

A perda da barreira entérica pode ser secundária à mucosite intestinal

induzida pelo irinotecano. No presente estudo, nos animais que receberam

irinotecano, evidenciaram-se danos estruturais severos à mucosa intestinal a partir

da terceira semana de exposição à droga. Além de alteração da razão vilo-cripta

com atrofia vilositária e mesmo de áreas desnudas de mucosa, encontrou-se

também uma imunoexpressão aumentada da citocina IL-1 em macrófagos da

submucosa e de NOSi tanto em macrófagos da submucosa como no epitélio. Essas

alterações confirmam o caráter predominantemente inflamatório da mucosite pelo

irinotecano. Observou-se também uma imunoexpressão de TLR4 no intestino

significativamente superior no grupo experimental quando comparada ao controle na

sétima semana, fortalecendo a hipótese de translocação bacteriana. Porém, a perda

da integridade funcional da barreira entérica pode ter ocorrido mesmo antes das

alterações histológicas. Observamos, no presente estudo, bacteremia portal e

sistêmica por enterobactérias gram-negativas desde a primeira semana de

exposição ao irinotecano. Esta foi a alteração mais precoce deste modelo

experimental e pode representar o elo de conexão comum entre os diversos fatores

envolvidos em sua patogênese.

Por fim, considerando que para cada achado patológico do presente modelo,

encontrou-se na literatura um papel correspondente na fisiopatologia da NASH por

outras causas (induzidas por dieta), supõe-se que o seu mecanismo deve ser

semelhante, independente da etiologia. Em síntese, o LPS proveniente das bactérias

intestinais, pela quebra da barreira intestinal, cai na circulação portal e exerce um

papel central, ativando no fígado o estresse oxidativo e a cascata inflamatória, com

envolvimento de citocinas como IL1 e NO. A NASH então se instala como

consequência de múltiplos insultos concomitantes.

99

6. CONCLUSÕES

Neste estudo foi desenvolvido um modelo experimental de esteatohepatite

induzida pelo antineoplásico irinotecano que apresenta os mesmos parâmetros

bioquímicos e histológicos utilizados na prática clínica. Adicionalmente, na

patogênese do modelo descrito, foi evidenciada a participação concomitante do

processo inflamatório, com marcante imunoexpressão de IL-1, NOSi e TLR-4 e do

estresse oxidativo. Tal processo parece ser causado por uma translocação

bacteriana secundária à mucosite intestinal induzida pelo irinotecano.

100

Figura 26A – Modelo hipotético proposto para o papel da IL-1, NOSi, TLR-4 e da translocação bacteriana na patogênese da NASH induzida pelo irinotecano. A presença do metabólito ativo SN-38 na mucosa intestinal determina uma lesão celular que debilita a barreira epitelial mucosa e permite a translocação de enterobactérias da luz intestinal. A presença destas bactérias gram-negativas na submucosa é reconhecida pela imunidade inata através dos receptores toll like 4 (TLR-4) amplificando a resposta inflamatória local e permitindo que alguns microorganismos alcancem vasos capilares intestinais levando a bacteremia portal.

101

Figura 26B– Modelo hipotético proposto para o papel da IL-1, NOSi, TLR-4 e da translocação bacteriana na patogênese da NASH induzida pelo irinotecano. As enterobactérias gram-negativas chegam ao fígado pelos ramos portais atingindo os sinusóides. A endotoxina bacteriana (LPS) é reconhecida pelos receptores TLR-4 presentes nos macrófagos locais (células de Kupffer) que se tornam ativados e passam a liberar citocinas inflamatórias como a IL-1 como também estimulam a síntese de óxido nítrico via NOSi. A IL-1 promove a atração e diapedese de leucócitos gerando infiltrados neutrofílicos portais e lobulares. O óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio geram estresse oxidativo causando lesão de membranas lipídicas e disfunção mitocondrial o que promove o surgimento de esteatose e tumefação dos hepatócitos. A célula estelar, também estimulada por LPS através de receptores TLR-4, assume um fenótipo fibrogênico e promove deposição de colágeno.

102

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