Embed Size (px)
Citation preview
MARCOS OSORIO ROCCA DOS REIS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS DE
Persea gratissima Gaertn – ABACATEIRO – (Lauraceae)
Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência para a obtenção do título de Mestre em Promoção de Saúde. Orientador: Prof. Dr. Márcio Luis de Andrade e Silva
FRANCA
2006
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
MARCOS OSORIO ROCCA DOS REIS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS DE Persea gratissima Gaertn – ABACATEIRO –
(Lauraceae)
Presidente: __________________________________________
Prof. Dr. Márcio Luís Andrade e Silva Universidade de Franca Titular 1: __________________________________________
Profa. Dra. Raquel Regina Duarte Moreira UNESP Júlio de Mesquita Filho – Araraquara
Titular 2: ___________________________________________
Prof. Dr. Carlos Henrique Gomes Martins Universidade de Franca
Franca, 29 / 06 / 06.
DEDICO à minha querida esposa Luzia Ap. Oliva dos Reis, minha fonte inspiradora, que tanto me apoiou nas horas difíceis desta jornada, me incentivando sempre; aos meus amados filhos Victor e Thais pelo apoio, e por terem permanecido ao meu lado. Obrigado pela compreensão nos momentos em que estive ausente.
AGRADEÇO a Deus, minha fonte de forças; ao meu Orientador Prof. Dr. Márcio Luis de Andrade e Silva que, com rigor e dedicação, conduziu-me brilhantemente no percurso deste trabalho; ao Prof. Dr. Carlos Henrique Gomes Martins e à Profa. Dra. Niege Araçari Jacometti Cardoso Furtado pelo carinho com que colaboraram com este projeto, com suas valiosas sugestões por ocasião do Exame de Qualificação; aos amigos Guilherme Ferreira de Oliveira, Sandra Christina Orlando e Icaro Eduardo Fuchs da Silva, por trabalharmos juntos e terem me apoiado neste projeto; à Maira Daniela dos Santos e à Diolinda Júlia Nascimento Aquino, por tudo que passamos juntos durante este período de nossas vidas; a todos os professores do curso de Pós-Graduação em Promoção de Saúde e também à Ana Maria Martinez e Maria José de Faria Tsuchiya.
Um agradecimento especial à minha mãe Maria T. Rocca dos Reis e ao meu pai Reynaldo F. T. dos Reis (in memorian), e a toda minha família.
RESUMO
REIS, Marcos Osorio Rocca dos. Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro do extrato hidroalcoólico de folhas da Persea gratissima Gaertn –Abacateiro- (Lauraceae). 2006. 76 f. Dissertação (Mestrado em Promoção de Saúde) – Universidade de Franca, Franca. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do extrato hidroalcoólico obtido através das folhas de Persea gratissima Gaertn – Abacateiro – (Lauraceae), e assim sendo, o extrato foi obtido pelo processo de maceração, rotoevaporado e após, foram verificadas sua atividade antimicrobiana, frente a um painel de microrganismos, incluindo bactérias Gram positivas e negativas e fungos (leveduras), utilizando o método de difusão em Agar, pelas técnicas do Disco conforme descrição de Bauer et al. (1966) e do Poço em camada dupla, descrito por Grove e Randall (1955). Sabendo que as técnicas acima são qualitativas, optou-se então por determinar a Concentração Inibitória Mínima, pela técnica de diluição em caldo (microtécnica) descrita por Andrews com adaptações. Com os resultados obtidos pelo método de Difusão em Agar, podemos concluir que, embora halos de inibição tenham sido observados para alguns microrganismos pela técnica do disco, na análise da variância observou-se que somente para K. rhizophila ATCC#9341 apresentou diferença significativa entre as concentrações, o mesmo ocorrendo pela técnica do poço, onde K. rhizophila ATCC#9341, P. aeruginosa ATCC# 27853 e K. pneumoniae c/c 46, apresentaram diferenças significativas entre as concentrações. Comparando-se os resultados das técnicas do Poço e do Disco, houve discordância quanto aos resultados obtidos para os microrganismos testados, porém fazendo a Análise de Variâncias para a comparação entre as duas técnicas apenas para os microrganismos S. aureus c/c e K. rhizophila ATCC#9341, houve diferença significativa. Sabendo que o método de difusão em Agar pelas duas técnicas, Poço e Disco, pode sofrer interferências, e por serem estes testes qualitativos, realizou-se com o mesmo extrato e com os mesmos organismos testados, a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) onde os resultados apresentaram inibição do crescimento bacteriano com todos os inóculos, mostrando ser mais eficiente para C. krusei ATCC 6258.
Palavras-chave: Persea gratissima Gaertn; abacateiro; atividade antimicrobiana; extrato hidroalcoólico; Lauraceae
ABSTRACT
REIS, Marcos Osorio Rocca dos. Evaluation of the antimicrobial activity in vitro of the hydroalcoholic extracts of Persea gratissima Gaertn – Avocado tree – leaves (Lauraceae). 2006. 76 f. Dissertation (Master’s Degree in Health Promotion) – University of Franca, Franca-SP. The aim of this research was to evaluate the antimicrobial activity in vitro of the hydroalcoholic extracts of Persea gratissima Gaertn – Avocado tree – (Lauraceae), thus, the extract was obtained by the maceration process, rotoevaporate and after we verified the antimicrobial activity, front of a microorganism panel, including Gram-positive and Gram-negative bacteria, and fungus (leavens), using the Agar diffusion method, by the disk technique according to Bauer et al. (1966) description, and double layer water, described by Grove and Randall (1955). On learning that the techniques mentioned are qualitative, we opted then to determine the Minimum Inhibitory Concentration, by the broth dilution technique (microtechnique) described by Andrews with adaptations. We concluded that, the results obtained by the Agar diffusion method, although inhibition halos have been observed for some microorganism by the disk technique, in the analysis of the variance were observed that only K. rhizophila ATCC#9341 presented significant difference between the concentrations, as well occurring by the water technique, where K rhizophila ATCC#9341, P. aeruginosa ATCC#27835, and K. pneumoniae c/c 46, presented significant difference between the concentrations. Comparing the results of the water and disk techniques, there was discordance according to the results obtained for the microorganisms tested, however thru the analysis of the variance for comparison between both techniques, only for the S. Aureus c/c and the K. rhizophila ATCC#9341, it had significant difference. On learning that the Agar diffusion method by both qualitative techniques, water and disk, can suffer interferences, it was realized with the same extract and with the same tested organism, the determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) where the results presented inhibition of the bacterial growth with all the inoculants, showing to be more efficient for C. krusei ATCC#6258. Key words: Persea gratissima Gaertn ; Avocado tree; antimicrobial activity; hydroalcoholic extracts; Lauraceae.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores das médias dos halos de inibição do crescimento microbiano em mm pelo método de difusão em Agar – técnica do disco
53
Tabela 2. Valores das médias dos halos de inibição do crescimento microbiano em mm pelo método de difusão em Agar – técnica do poço em camada dupla
53
Tabela 3. Comparação entre as técnicas do Poço e do Disco
54
Tabela 4. Concentração Inibitória Mínima (CIM) do abacateiro, executada pela microdiluição em caldo
55
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Origem e principais características biológicas das cepas de microrganismos testados
34
Quadro 2. Resultados do teste piloto da preparação dos discos contendo as soluções de antibiótico (gentamicina)
50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Persea gratissima Gaertn 25
Figura 2. Representação fotográfica da realização da técnica do Poço
35
Figura 3. Preparo do inóculo 36
Figura 4. Comparação do inóculo com a escala de Mac Farland
36
Figura 5. Fluxograma do método de avaliação da atividade antimicrobiana pelo método da difusão em Agar – técnica do poço
38
Figura 6. Fluxograma do método de determinação da atividade antimicrobiana pelo método da difusão em Agar – técnica do disco de papel
44
Figura 7. Microplaca contendo inóculo, caldo TSB e amostra das soluções preparadas
47
Figura 8. Ilustração da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) pelo método de microdiluição em caldo
49
Figura 9. Representação fotográfica da ação antimicrobiana sobre cepas de alguns microorganismos testados
51
Figura 10. Representação fotográfica da ação antimicrobiana sobre cepas de alguns microorganismos testados
52
Figura 11. Representação fotográfica da ação antimicrobiana sobre cepas de alguns microorganismos testados
52
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................................ 13
1.2. FITOTERAPIA ....................................................................................................... 14
1.3. PRINCÍPIOS ATIVOS NATURAIS ..................................................................... 14
1.4. AGENTES ANTIMICROBIANOS ....................................................................... 17
1.4.1. Antibióticos: definição e características ................................................................ 19
1.4.2. Seleção do agente antimicrobiano.......................................................................... 20
1.4.3. Antimicrobianos de origem vegetal ....................................................................... 22
2. Persea gratissima Gaertn (ABACATEIRO, ABACATE, LOURO-ABACATE,
PÊRA-ABACATE) – (Lauraceae) ......................................................................... 25
2.1. NOME BOTÂNICO................................................................................................ 26
2.2. FAMÍLIA ................................................................................................................. 26
2.3. PARTE UTILIZADA.............................................................................................. 27
2.4. CONSTITUINTES QUÍMICOS............................................................................ 27
2.5. PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS ........................................................... 27
2.6. ETNOFARMACOLOGIA ..................................................................................... 28
3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 29
4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 30
4.1. OBTENÇÃO DO VEGETAL E DO EXTRATO ................................................. 30
4.1.1. Obtenção do vegetal ................................................................................................ 30
4.1.2. Obtenção do extrato ................................................................................................ 32
4.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES DO EXTRATO PARA A REALIZAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ..................................................................... 33
4.2.1. Soluções para método de difusão em Agar, técnicas do poço e disco ................ 33
4.2.2. Solução para determinação da Concentração Inibitória Mínima ..................... 33
4.3. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ..................................................................... 33
4.3.1. Microorganismos utilizados................................................................................... 33
4.3.2. Método da difusão em Agar – técnica do poço .................................................... 35
4.3.2.1. Preparo do meio de cultura .................................................................................... 35
4.3.2.2 . Preparo do inóculo microbiano.............................................................................. 36
4.3.2.3. Procedimentos.......................................................................................................... 37
4.3.2.4. Controles utilizados................................................................................................. 39
4.3.3. Método de difusão em Agar – técnica do disco..................................................... 39
4.3.3.1. Preparo das placas de Agar.................................................................................... 40
4.3.3.2. Teste Piloto para padronização dos discos............................................................ 40
4.3.3.3. Preparo dos discos de papel absorvente ................................................................ 41
4.3.3.4. Procedimentos.......................................................................................................... 42
4.3.3.5. Controles utilizados................................................................................................. 43
4.3.3.6. Particularidades do antibiograma para Neisseria gonorrhoeae.......................... 45
4.4. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA – CIM. 45
4.4.1. Preparo das soluções ............................................................................................... 45
4.4.2. Preparo dos controles positivos.............................................................................. 46
4.4.3. Preparo do inóculo .................................................................................................. 46
4.4.4. Procedimentos.......................................................................................................... 47
4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 48
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 50
5.1. LEITURA E MENSURAÇÃO DOS RESULTADOS.......................................... 50
5.2. MÉTODO DE DIFUSÃO EM AGAR – TÉCNICA DO DISCO........................ 51
5.3. MÉTODO DE DIFUSÃO EM AGAR – TÉCNICA DO POÇO......................... 52
5.4. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA............. 55
CONCLUSÕES...................................................................................................................... 59
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 60
ANEXOS ................................................................................................................................ 69
13
1. INTRODUÇÃO
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
A época áurea da terapia antimicrobiana teve início em 1941. Desde então
muitos pacientes foram curados de infecções potencialmente fatais usando-se um ou mais
esquemas terapêuticos com antibióticos. Porém, a utilização indiscriminada de tais fármacos
resultou no aparecimento de inúmeros microrganismos resistentes, o que tornou necessário o
emprego, cada vez maior, de novos quimioterápicos. Daí a importância de se pesquisar novas
substâncias com ação bactericida ou bacteriostática (GOODMAN; GILMAN, 1990).
Segundo Conserva (1985) e Lehir (1985), as evidências do uso de plantas com
fins terapêuticos datam de 460 a.C. No entanto, as primeiras informações sobre o uso de
plantas com fins terapêuticos datam da idade Antiga, através do sistema de medicina daquela
época, possivelmente do Ayurveda (Ciência da Vida) (OLIVEIRA, 1986).
As pessoas utilizam plantas na preparação de remédios há tempos, pois elas,
com os princípios ativos, tinham poder terapêutico e eram consideradas plantas medicinais
(NOVAES et al., 2003).
Um dos primeiros esforços do homem para entender e utilizar a natureza pode-
se dizer que vem da utilização de certos vegetais com poder curativo. O uso destas plantas no
combate das doenças é tão antigo quanto a humanidade (OLIVEIRA; AKISUE, 1998).
A utilização de muitas plantas, ao longo do tempo, se deve graças a
informações provindas da tradição e de culturas centenárias e milenares. Os indígenas do
Brasil ou da América, no decorrer da história desenvolveram sua sabedoria e conhecimento,
assim como os chineses o fizeram ao longo de toda sua existência (NOVAES et al., 2003).
É admirável que todo esse conjunto de conhecimento tenha subsistido por
milênios.
14
1.2. FITOTERAPIA
A história da fitoterapia confunde-se com a história da farmácia, pois até o
século passado, os medicamentos utilizados eram basicamente à base de plantas medicinais.
Durante a revolução industrial e com o aumento da produção dos compostos terapêuticos
sintéticos mais puros, houve um aumento na preferência pelos medicamentos industrializados,
agravados pelo difícil controle de qualidade dos extratos vegetais (TOLEDO, 2002). Porém,
com o crescente interesse pelas terapias alternativas, as plantas medicinais voltaram a serem
estudadas (RIBEIRO; LEITE; DANTAS-BARROS, 2005).
No Brasil, assim como em outros países latino-americanos, a fitoterapia
tornou-se uma alternativa terapêutica econômica em relação aos medicamentos alopáticos,
caracterizando-se pela utilização direta de planta no tratamento das doenças (LEHIR, 1985;
DI STASI et al., 1994).
A Biodiversidade brasileira é uma das mais ricas do planeta, com milhares de
exemplares em sua flora, estando o Brasil entre os sete países considerados
“megadiversidades” com cerca de 50% das espécies vegetais do mundo (NODARI;
GUERRA, 2000).
Segundo Rodrigues e Carlini (2002), estando o Brasil entre as sete
“megadiversidades”, pois nele ocorrem os cinco principais biomas – floresta amazônica;
cerrado; mata atlântica; pantanal e caatinga –, deveria ser o foco prioritário de investigações
farmacológicas de novas drogas. Porém, com a velocidade com que ocorre a extinção de
espécies vegetais (GARCIA et al., 1996), um número muito grande de plantas com
propriedades medicinais correm um enorme risco de desaparecerem, mesmo antes de seu
valor fitoterápico ser conhecido, tornando-se urgente aumentar as pesquisas e os
investimentos nesta área.
1.3. PRINCÍPIOS ATIVOS NATURAIS
Princípios ativos são substâncias sintetizadas pelas plantas e armazenadas
durante seu crescimento, porém, nem tudo que é sintetizado possui valor nutricional. Em
todas as espécies existem ao mesmo tempo princípios ativos e substâncias inertes. Os
15
princípios ativos concentram-se preferencialmente nas flores, raízes ou folhas, e, às vezes, nos
frutos e na casca. Outra característica dos vegetais é que não apresentam concentrações
uniformes de princípios ativos durante o seu ciclo de vida, variando com seu habitat, a
colheita e a preparação (TESKE; TRENTINI, 1997).
Segundo Ferreira (2003), várias são as formas de avaliar a autenticidade de um
extrato vegetal, entre elas, os testes fitoquímicos, que buscam tal confirmação. Considerando
alguns grupos químicos encontrados nos vegetais, os seguintes compostos fazem parte de um
vegetal: Flavonóides, que são compostos que ocorrem em plantas superiores, responsáveis
pela coloração das flores. Possuem atividades farmacológicas como antifator de agregação
plaquetária, antiespasmódico, entre outras; Cumarinas, amplamente distribuídas no reino
vegetal, representam a classe das lactonas, é antipirético, inibidor de carcinogênese,
hipotensora, entre outras; Heterosidios fenólicos simples pertencem a uma classe de
compostos que envolvem uma grande diversidade de estruturas, simples e complexas,
possuem atividades analgésicas, anti-séptica urinária entre outras; Saponinas são glicosídeos
de esteróides ou de terpenos policíclicos, cujo interesse farmacológico é devido tanto à sua
utilização como adjuvante em formulações, componentes ativos em drogas vegetais, com ação
expectorante e diurética; Heterosídeos cardioativos são caracterizados pela sua alta
especificidade e poderosa ação no músculo cardíaco, sendo utilizados também como
diurético, tônico, cardíaco e emético; Antracênicos são caracterizados pela sua ação laxativa;
Taninos são responsáveis pela adstringência de alguns produtos vegetais e também utilizados
industrialmente na manufatura do couro; Alcalóides são encontrados em todos os grupos de
vegetais e possuem ações farmacológicas como citotóxicas, hipotensores, antibacterianos,
entre outras.
Nos dias de hoje, o estudo das plantas está muito difundido principalmente nas
Faculdades de Farmácia, e a cada dia apresentam-se trabalhos científicos sobre as plantas e a
sua ação terapêutica, bem como a melhor forma galênica de apresentação e utilização.
Algumas dessas plantas passaram e/ou vem passando por estudos científicos, a
fim de se conhecer e validar suas verdadeiras ações terapêuticas, na tentativa de se evitar o
charlatanismo, problemas com intoxicação, dentre outros que podem surgir devido à má
utilização de uma espécie conhecida ou não. Após esses estudos os medicamentos à base de
plantas que têm suas atividades comprovadas e não possuem toxidade são chamados
Fitoterápicos que, segundo Rodrigues e Carlini (2002), pode ser definido como “Todo o
medicamento obtido e elaborado, empregando-se, exclusivamente, matérias-primas ativas de
vegetais com finalidades profiláticas, curativas ou para fins de diagnóstico, com benefício
16
para o usuário. É caracterizada pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso [...]”.
Possivelmente há muitas plantas que não foram devidamente estudadas ou
mesmo desconhecidas que possuam substâncias que podem ser úteis no tratamento de muitas
patologias, e muitas dessas plantas são encontradas somente nas florestas tropicais, pois estas
são possuidoras da maior biodiversidades do planeta. Tendo em vista esse fato, muitos
laboratórios estrangeiros iniciaram uma verdadeira corrida às florestas, tornando como prática
a biopirataria, ou seja, contrabando de espécies vegetais e animais no intuito de extrair
princípios ativos que serão possivelmente utilizados na produção de remédios no exterior sem
que os países de origem ganhem absolutamente nada com isso, pelo contrário, correm o risco
de espécies desaparecerem devido à extração predatória (RODRIGUES; CARLINI, 2002) ou
ainda, as grandes indústrias notando a tendência dos fitoterápicos, estão lançando seus
produtos adquirindo pequenas indústrias ou investindo em pesquisas com fitoterápicos
(MARQUES, 1999). Daí, a necessidade de uma legislação regulamentando o comércio dessa
natureza, problema este que vem sendo apontado há muito tempo (STELLFELD, 1995).
Farmacêuticos, químicos e médicos lembram que um medicamento ofertado
diretamente pela natureza pode ser a solução eficaz e mais barata para os problemas do corpo,
além do que, vários medicamentos de grande utilização foram sintetizados a partir de
protótipos isolados de vegetais (anestésicos locais) (REBBERRS; SPEEDIE; TYLER, 1997).
As plantas produzem os metabólitos secundários com diversas funções
específicas tais como: repelentes e antialimentares de insetos, atraentes de polinização,
agentes defensores contra herbívoras, feromônios, hormônios de crescimento, aleloquímicos,
fitoalexinas etc. (CARVALHO, 2004). Uma característica básica dos produtos fitoterápicos, é
que sua ação farmacológica, normalmente não é imediata e forte, sendo mais aplicadas a
doenças crônicas (CALIXTO, 2000).
Carvalho (2004) define alguns conceitos para o estudo da Fitoterapia: Planta
Medicinal é a planta selecionada e utilizada popularmente como remédio no tratamento de
doenças. Segundo a OMS (1978) “[...] é toda e qualquer planta que quando aplicada sob
determinada forma, e por alguma via ao homem, é capaz de provocar um efeito
farmacológico”. Produto fitoterápico é o medicamento obtido e elaborado, usando
exclusivamente matérias-primas vegetais para fins profiláticos, curativos ou de diagnósticos.
É o produto acabado, embalado, rotulado e isento de substâncias ativas de outras origens.
Matéria prima vegetal é a planta fresca ou o preparado utilizado na fabricação do fitoterápico.
Droga vegetal é a planta ou suas partes que após a coleta, estabilização, secagem e
conservação, são empregadas na preparação de medicamentos. Princípio ativo é uma
17
substância ou grupo delas, cuja ação farmacológica é conhecida, sendo responsável pelos
efeitos terapêuticos do produto final. Fármaco é uma substância química, droga, insumo
farmacêutico ou matéria prima empregada para modificar sistemas fisiológicos dos estados
patológicos em benefício de um indivíduo. Produto Natural é toda ou qualquer substância
produzida pelo vegetal durante o seu metabolismo secundário – lignina, ácidos graxos,
cumarinas, lignanas etc. (CARVALHO, 2004).
A legislação em vigor no pais define como conceito de fitoterápico: “ [...]
aquele medicamento obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais. É
caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos do seu uso, assim como pela
reprodutibilidade e constancia de sua qualidade. Sua eficácia e segurança são validadas
através de levantamentos etnofarmacológicos de utilização, documentações técnico-científicas
em publicações ou ensaios clínicos de fase 3” (BRASIL,2004a).
A idéia de que as plantas medicinais não apresentam efeitos colaterais, sendo
seguras, é falsa, existem testes que comprovam estes efeitos (CALIXTO, 2000). Para serem
comercializados, é necessário que os fitoterápicos tenham seus registros no Ministério da
Saúde (LAPA et al., 2000).
O problema dos medicamentos fitoterápicos não está relacionado apenas na
produção e no registro de novos produtos farmacologicamente ativos, mas relaciona-se
também, com as soluções de problemas da população, devido ao alto custo dos medicamentos
e pela deficiência da rede pública de saúde, em que grande parte da população não tem acesso
aos medicamentos essenciais (RODRIGUES, 2005), sendo notória a necessidade de ações
voltadas para a Promoção de Saúde, através de programas utilizando conjuntamente equipes
interdisciplinares em nível Federal, Estadual e Municipal (DI STASI, 1996).
1.4. AGENTES ANTIMICROBIANOS
O conceito de que substâncias derivadas de um organismo vivo podem
exterminar outros (antibiose) é quase tão antigo quanto a ciência da microbiologia. Na
verdade, a aplicação da antibioticoterapia, sem que fosse reconhecida como tal, é
consideravelmente antiga. Há mais de 2.500 anos, os chineses tinham conhecimento das
propriedades terapêuticas da papa mofada do feijão-soja, empregada em antrazes, furúnculo e
infecções semelhantes, e usavam-na como tratamento de rotina nestas infecções. Durante
18
muitos séculos a literatura médica registrou descrições dos efeitos benéficos resultantes da
aplicação, em certas infecções, de terra e várias plantas, muitas das quais eram provavelmente
fontes de fungos e bactérias produtores de antibióticos (GILMAN; GOODMAN; GILMAN,
1983).
O bolor do pão também era utilizado para o tratamento de ferimentos pelos
antigos egípcios, porém, ainda não existia nenhum conhecimento sobre o que estes fungos
continham (BLACK, 2002).
Alexander Fleming percebeu a capacidade do bolor Penicillium notatum em
inibir o crescimento bacteriano de Staphylococcus. Selman Wasman, em 1944, descobriu a
estreptomicina a partir de bactérias do gênero Streptomyces e introduziu o termo antibiótico
como sendo uma substância química produzida por bactérias ou fungos, com a capacidade de
inibir o crescimento ou destruir bactérias. A “sulfa” foi um marco para a medicina, apesar da
sua utilização ser limitada. Após estas descobertas, outros agentes antibacterianos como os
aminoglicosídeos, cefalosporinas entre outras foram desenvolvidos (BLACK, 2002).
O uso indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos sem
prescrição médica adequada, tem levado à seleção de microrganismos patogênicos mutantes
resistentes a esses compostos, tornando o uso de antimicrobianos de origem natural uma
alternativa eficaz e econômica (CRISAN et al., 1995). O problema da resistência microbiana é
crescente e a perspectiva de uso de drogas antimicrobianas no futuro é incerta. Portanto,
atitudes devem ser tomadas para que possam reduzir este problema, como, por exemplo,
controlar o uso indiscriminado de antibióticos, desenvolver pesquisas para melhor
compreensão dos mecanismos genéticos de resistência e continuar o estudo de
desenvolvimento de novas drogas, tanto sintéticas como naturais (NASCIMENTO et al.,
2000).
O aparecimento de cepas microbianas com altos níveis de resistência aos
antimicrobianos usuais, tem sido objeto de preocupação no mundo todo. Entre as causas
apontadas para o fenômeno, está o uso abusivo e indiscriminado destas drogas
antimicrobianas sem os devidos cuidados. O uso de medicamentos é influenciado por vários
fatores: segundo Britten (1995), as expectativas dos próprios pacientes quando procuram
assistência; Lefévre (1983) cita o imaginário popular, no qual os medicamentos constituem-se
em meios eficazes de aquisição de saúde; as grandes indústrias farmacêuticas, que possuem
estratégias eficazes de persuasão no que se refere à necessidade do uso de seus produtos, junto
não só à população, quanto aos próprios médicos (CHEN; LANDEFELD, 1994), e, por fim, a
automedicação, outro hábito brasileiro comum, estimulado pela facilidade de aquisição das
19
drogas sem a exigência de prescrição médica e também os lucros almejados pelos
proprietários de estabelecimentos de saúde (VILARINO, 1998). Tudo isso, contribui de
alguma forma, para o uso inadequado de antimicrobianos.
1.4.1. Antibióticos: definição e características
Os antibióticos são substâncias químicas produzidas por várias espécies de
microrganismo (bactérias, fungos) que suprimem o crescimento de outros microorganismos e
podem eventualmente matá-los. Os antibióticos diferem bastante em suas propriedades
físicas, químicas e farmacológicas, espectro antimicrobiano e mecanismo de ação. Muitos
foram identificados quimicamente e outros foram sintetizados, aumentando muito o arsenal
terapêutico (GILMAN; GOODMAN; GILMAN, 1983).
O termo quimioterapia era utilizado para descrever substâncias químicas
capazes de destruir microorganismos patogênicos sem causar danos aos seus hospedeiros.
Atualmente esta definição foi substituída pelo termo agente antimicrobiano, sendo que o
termo quimioterapia é utilizado para qualquer substância química utilizada na prática médica
(BLACK, 2002).
Segundo Murray et al. (1999), existem algumas propriedades que devem ser
específicos aos antimicrobianos:
a) toxicidade seletiva, devendo agir nas bactérias sem causar danos ao
hospedeiro;
b) espectro de ação, agir em maior número de microrganismos;
c) mecanismo de ação, atuando de maneira diferente na célula alvo, podendo
ser em nível de inibição da síntese da parede celular ou na destruição da
função da membrana citoplasmática pela inibição da síntese de proteínas ou
ainda por agirem como antimetabólito;
d) poucos efeitos colaterais;
e) resistência bacteriana, não deixar de fazer efeito sobre um microorganismo
que antes era susceptível.
Na área farmacêutica a ação antimicrobiana é de grande interesse por vários
motivos. Destacam-se as numerosas doenças causadas por bactérias e a resistência que as
mesmas adquirem frente às drogas empregadas rotineiramente e de forma errônea, além do
20
fato de 30% dos pacientes internados em hospitais necessitarem de medicamentos com ação
antimicrobiana (CHAMBERS; SANDE, 1996).
As terapias antimicrobianas modernas além de reduzirem a taxa de morbidade
e mortalidade das infecções, também evitaram as ocorrências de doenças e contribuíram para
a cirurgia moderna, a terapia do traumatismo e dos transplantes de órgãos (KARCHMED,
2001).
1.4.2. Seleção do agente antimicrobiano
A seleção perfeita dos agentes antimicrobianos para a terapia das doenças
infecciosas é um procedimento complexo que exige julgamento clínico e conhecimento
detalhado dos fatores farmacológicos e microbiológicos. Infelizmente, a decisão de usar
antibióticos, é freqüentemente tomada de forma despreocupada, sem levar em conta o
potencial do microrganismo infectante ou o aspecto farmacológico da substância. Quando se
indica um agente antimicrobiano, o objetivo é escolher uma substância que seja seletiva para
o microrganismo infectante e com o menor potencial tóxico ou alérgico para o indivíduo a ser
tratado (GILMAN; GOODMAN; GILMAN, 1983).
A diminuição na produção de novos antibacterianos, e o aumento de cepas
multiresistentes tornaram-se, atualmente, uma ameaça à saúde pública (MIMS et al., 1999).
A eficácia de muitos medicamentos pode ser perdida, e o principal motivo é a
resistência bacteriana, que pode ser transmitida de geração para geração (BLACK, 2000).
Esta resistência bacteriana tem se tornado uma ameaça aos tratamentos das
doenças infecciosas, onde já foram encontrados casos de patógenos resistentes a quase todos
os antibacterianos existentes no mercado, aumentando com isso a taxa de mortalidade e dos
custos dos serviços de saúde (VIKSVEEN, 2003).
O crescente aumento de cepas microbianas com variáveis níveis de resistência
aos antimicrobianos tem sido objeto de preocupação (KUNIN, 1993). Algumas pesquisas têm
sido realizadas com a intenção de caracterizar a resistência e estabelecer fatores de risco para
que isso ocorra (ARNOLD, 1996). Este fenômeno é complexo e tem múltiplas causas,
algumas já esclarecidas, outras ainda a esclarecer (SHLAES, 1995). Entre estes fenômenos,
que estão definitivamente vinculados ao crescimento da resistência está o uso abusivo de
drogas antimicrobianas (ARNOLD, 1996).
21
Outros fatores que corroboram para este aumento incluem as características
próprias dos microrganismos, a pressão seletiva pelo uso abusivo dos antibacterianos e o
aumento da transmissão de patógenos multiresistentes pelas mudanças sociais e tecnológicas
(COHEN, 1992).
Hoje, um terço das prescrições médicas, são de drogas antimicrobianas; das
prescrições de antimicrobianos em pediatria, dois terços restringem-se a cinco afecções do
trato respiratório – otites, sinusites, faringoamidalites, bronquites e pneumonias
(GERSHMAN, 1997). Apesar de inúmeros trabalhos terem demonstrado o pouco ou nenhum
benefício do uso de antimicrobianos, para muitas dessas morbidades, essa prática continua
sendo a mais comum nas diversas modalidades de atendimento ambulatorial (MAC
FARLAND, 1993 apud MURRAY et al., 1999).
Nos ambientes hospitalares, o fenômeno da resistência bacteriana é bem
conhecido; entretanto, os microrganismos responsáveis por infecções na comunidade,
começaram a mostrar níveis crescentes de resistência: gonococos resistentes à ampicilina e
Shigella e Salmonella, também resistentes a ampicilina e cloranfenicol, já foram detectados,
desde o início da década de oitenta, em estudos realizados em países do terceiro mundo
(KUNIN, 1993).
A Organização Mundial da Saúde (WHO/OMS) no seu encontro em 1983
mostrou sua preocupação com o tema, em seu relatório do grupo de trabalho sobre a
resistência antimicrobiana. Desde então, várias iniciativas têm surgido com o intuito de
avaliar e controlar o crescimento de cepas com resistência antimicrobianas em todo o mundo
(KUNIN, 1993).
Segundo Norrby e Nord (2005), paralelamente ao aumento da resistência
bacteriana, houve uma diminuição no desenvolvimento de novos fármacos, onde é pequeno o
retorno sobre os investimentos e os elevados custos para o desenvolvimento de novas drogas
são razões pelas quais as industrias reduziram as pesquisas com drogas antimicrobianas.
Entre as estratégias utilizadas para o manejo desse grave problema de saúde
pública, três formas de atuação têm sido propostas: a caracterização das práticas atuais,
através de estudos junto aos prestadores de cuidados, em relação aos seus hábitos de
prescrição; a criação de guias e protocolos para o uso racional dos antimicrobianos; e,
finalmente mo desenvolvimento de materiais e estratégias educacionais (para médicos e
usuários), visando alterar hábitos e comportamentos (AVORN; HARVEY, 1987;
VIKSVEEN, 2003).
Segundo o NCCLS (2003), os testes de sensibilidade a antimicrobianos são
22
indicados para qualquer organismo que cause um processo infeccioso que exija uma terapia
antimicrobiana quando for impossível predizer a sensibilidade desse organismo, mesmo
conhecendo a sua identificação. Estes testes são indicados quando se acredita que o
microrganismo causador pertença a uma espécie capaz de produzir resistência aos agentes
antimicrobianos normalmente usados.
Ainda segundo o NCCLS (2003), estes métodos podem ser usados para
verificar a sensibilidade in vitro dos microrganismos frente aos agentes antimicrobianos,
utilizando o método de disco difusão em Agar, para testar os diferentes patógenos.
Novaes et al. (2003) cita que os vegetais são excelente fonte de novas drogas,
uma vez que a diversidade molecular dos produtos naturais soa muito superiores às derivadas
dos processos de síntese química, porém, recentemente, as plantas se tornaram objetos de
pesquisas científicas no que diz respeito às suas propriedades, incluindo suas atividades
antimicrobianas.
Sabemos que as plantas medicinais quase não são exploradas na produção de
quimioterápicos. No Brasil, assim como em outros países latino-americanos, os fitoterápicos
constituem-se em uma alternativa terapêutica econômica em relação aos medicamentos
alopáticos industrializados, uma vez que, são utilizados diretamente no tratamento das
doenças (CARVALHO et al., 2002).
Com isso, numerosas pesquisas científicas vêm comprovando cientificamente,
a eficácia de algumas plantas, como alternativa terapêutica para certas patologias (BRAKUNI
et al., 1974).
1.4.3. Antimicrobianos de origem vegetal
Com o aumento de microrganismos resistentes às drogas antimicrobianas já
conhecidas, vários extratos de plantas medicinais já foram testados, com a finalidade de se
procurar novas drogas com atividades antimicrobianas reconhecidas. Os vegetais ricos em
taninos, flavonóides e polifenóis estão entre os extratos e óleos essenciais mais testados para
esta atividade.
Os extratos aquosos e acetônico de Syzygium jambos possuem atividade
antibacteriana que parece estar relacionada ao seu teor de tanino (77% no extrato aquoso e
83% no acetônico) sendo superior ao de outras plantas (26-46% de tanino) (DJIPA et al.,
23
2000).
Rauha et al. (2000) obtiveram resultados efetivos tanto para bactérias Gram-
positivas, Gram-negativas e fungos, quando avaliaram pelo método de difusão em Agar,
alguns extratos ricos em flavonóides e outros compostos fenólicos.
Ao avaliarem a atividade antimicrobiana de 13 plantas medicinais brasileiras,
frente a bactérias gram-positivas e negativas e leveduras, Holetz et al. (2002) obtiveram
resultados variados em 10 dos extratos testados.
O extrato hidroalcoólico das folhas e do caule de Psidium guajava L
(Goiabeira vermelha), quando testados contra Escherichia coli, Shigella sp, Klebsiella sp,
Salmonella sp e Proteus sp, pelo método de difusão em Agar e pela determinação da MIC
apenas não apresentaram atividade frente Klebsiella sp (CARVALHO et al., 2002).
Lopes et al. (2003) obtiveram resultados inibitórios para Staphylococcus
aureus e Bacillus subtilis, porém não para Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, ao
testarem extratos acetônicos e purificados de Stryphnodendron polyphylum Mart.
Com o objetivo de validar o uso de Bryophyllum pinnatum (Folha-da-fortuna)
Schmitt et al. (2003) demonstraram que esta planta tem ação anti-bacteriana sobre Gram-
positivas (Staphylococcus aureus e epidermidis), mas não frente a Gram-negativas
(Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa).
Quando testaram 137 extratos de espécies nativas do semi-árido brasileiro,
Novaes et al. (2003) obtiveram eficácia com sete extratos pertencentes às Famílias
Leguminoseae e Rutaceae, contra Staphylococcus aureus e nenhuma atividade de todos os
extratos ao testarem com Escherichia coli.
O extrato alcoólico da própolis a 50% foi testado por Vargas et al. (2004),
frente a 161 cepas de bactérias, sendo 81 Gram-positivas e 80 Gram-negativas, obtendo
atividade in vitro em 67,7% das amostras, sendo mais efetivo nas Gram-positivas do que em
Gram-negativas.
Avaliando a atividade antibacteriana de óleos essenciais de três espécies de
ervas medicinais (Ocimum gratissimum l, Cybopogum citratus (DC) Stapf e Salvia officinalis
l.) frente a 100 cepas bacterianas isoladas de infecções urinárias, Pereira et al. (2004)
observaram ação inibitória satisfatória, sendo que com a Salvia officinalis foi a mais eficiente.
Nakamura et al. (1999) demonstrara a atividade do óleo essencial do Ocimun gratissimun
frente a cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
mirabilis, Shigella flexineri, Klebsiella sp e Salmonella enteritidis.
Em 2005, Loguercio et al., testando folhas de Syzyzium cumini (Jambolão),
24
inibiram com o extrato hidroalcoólico a 10% destas folhas, o crescimento de todas as
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas testadas.
Utilizando o método de difusão em Agar com disco de papel, Andrade et al.
(2005) demonstraram a atividade antibacteriana dos extratos etanólicos e fração de acetato de
etila de Acácia podalyriiflolia A. Cunn. frente a Staphylococcus aureus e S. epidermidis,
porém não foi eficaz contra Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.
A ação antibacteriana de extratos etanólicos de várias plantas indianas
medicinais ricas em flavonóides e taninos, testadas contra bactérias multiresistentes, foi
comprovada em estudos realizados por Ahmad e Beg (2005).
25
2. Persea gratissima Gaertn (ABACATEIRO, ABACATE, LOURO-ABACATE, PÊRA- ABACATE) –(Lauraceae)
Originária da América Central, esta planta é cultivada em quase todas as
regiões tropicais e subtropicais, particularmente no México, partes da América do Sul, nas
Índias Ocidentais, África do Sul, Israel e no Havaí (MEDINA et al., 1978). No Brasil é
cultivada principalmente nos estados do Norte. Prefere os solos sílico-argilosos, férteis e
profundos, sendo que a baixa umidade do ar lhe é prejudicial. É cultivada tanto pelo sabor de
seus frutos, bem como pela planta ornamental, que pode atingir até 15 m de altura (TESKE;
TRENTINI, 1997).
Trata-se de uma planta frutífera das mais produtivas por unidade de área
cultivada (TANGO; TURATTI, 1992).
Árvore de copa arredondada e densa, atingindo até 12 m de altura, apresenta
folhas simples de 7-16 cm de comprimento, flores pequenas e perfumadas, de cor verde-
amarelada, frutos ovalados ou globosos, dependendo da variedade da planta, com polpa
carnosa e comestível (ALBULQUERQUE, 1989).
Figura 1. Persea gratissima Gaertn
Um número muito grande de variedades de abacate é encontrado nas diversas
regiões do país, cujas composições químicas dos frutos são muito variáveis. Algumas
variedades cultivadas no Estado de São Paulo e já estudadas anteriormente demonstraram
grandes variações quanto aos teores de lipídeos na polpa dos frutos (TANGO et al., 1972).
Muitos países das Antilhas e do Oriente, consomem o abacate sob forma de
26
salada com cebola e queijo ou de sopa com sal e pimenta do reino. No Brasil é mais apreciado
como fruta madura. A expansão do consumo desta fruta deve-se a suas qualidades
organolépticas, ao seu valor nutritivo e à riqueza em vitaminas (MARANCA, 1978).
Chitarra e Chitarra (1994) classificam o abacate como um fruto climatérico.
Sua textura está relacionada com a solubilização de substâncias pécticas. Na sua maturação a
pectina insolúvel se converte em solúvel, amolecendo e diminuindo a resistências dos frutos.
2.1. NOME BOTÂNICO
Persea americana Mill, syn. Laurus persea L., syn. Persea gratisima Gaertn.
2.2. FAMÍLIA
Lauraceae
As espécies de Lauraceae são conhecidas pelo acúmulo de derivados
fenilpropanólico, sendo as lignanas e as neolignanas seus principais marcadores químicos
(GOULIEH; YOSHIDA, 1989).
Encontram-se plantas desta família nas florestas tropicais e equatoriais; na
Mata Atlântica são conhecidas popularmente como canela (PEDRALLI, 1982).
Na região de Cunha, Estado de São Paulo, onde se encontra uma Mata
Atlântica de altitude bastante preservada, e dentre as inúmeras famílias de Angiospermae,
destacam-se várias espécies da família Lauraceae, sem nenhum estudo biológico e ou químico
(CARBONEZI; LOPES; SILVA, 2004).
Os inventários botânicos revelam que a Família Lauraceae esta entre as
famílias mais importantes, porém, infelizmente as identificações das espécies é uma tarefa das
mais árduas (BAITELLO, 2001).
27
2.3. PARTE UTILIZADA
São utilizados os frutos, as sementes, os óleos, as folhas e os botões florais.
Das folhas se obtém um extrato usado no combate a doenças dos rins, bexigas e desinterias,
além de evitar gazes intestinais, dores de cabeça, febres e reumatismos. Devem ser utilizadas
secas porque as verdes podem levar a palpitações cardíacas. Os frutos contêm de 20 a 25% de
óleo, além de ácidos graxos, hidratos de carbono, substâncias minerais, proteínas, ácido
acético, ácido málico, carboidratos, dopamina, esparagina, metil-eugenol, d-perseitol, taninos
e vitamina E (TESKE; TRENTINI,1997).
2.4. CONSTITUINTES QUÍMICOS
Possui quantidades variáveis de matéria insaponificável (máx. 2%), consistindo
de hidrocarbonetos, ácidos voláteis, esteróis (sistosterol, campesterol), aminoácidos,
vitaminas (A, B, D e E) e lecitina. É rico em potássio, cálcio, fósforo e ferro. Seu princípio
ativo amorfo é a abacatina. Contém flavonóides, quercetina, B-sitosterol, hepta álcool
denominado perseitol (D-perseitol é o constituinte ativo), óleo essencial (0,3 % do peso seco
das folhas) – estragol e anetol. Sua ação mais conhecida é devida à presença do D-Perseitol
(TESKE; TRENTINI,1997).
2.5. PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS
O abacate tem ação diurética, emenagoga, colagoga, carminativa, balsâmica e
expectorante. O óleo é anti-raquítico, emoliente, calmante e suavizante da pele. (TESKE;
TRENTINI, 1997).
Sua propriedade diurética é comparável à da teobromina, aumentando a
produção de urina, com ação direta sobre o túbulo renal, contudo, com a vantagem de ser
destituída de efeitos tóxicos (TESKE; TRENTINI, 1997)
O constituinte ativo, D-perseitol, encontrado em toda a planta, inclusive nas
28
folhas, demonstrou aumentar a diurese em estudos realizados em cães. Como revelou ser um
diurético direto, não manifesta atividade cardíaca nem sobre a pressão arterial. Atua nas
deficiências de secreção biliar, aumentando a secreção de bile pelo fígado, além de evitar a
formação de gases intestinais e estomacais. Estimula o fluxo menstrual, ação atribuída aos
flavonóides que o constituem. Relaxa a musculatura lisa brônquica (TESKE; TRENTINI,
1997).
O óleo, em virtude da riqueza de vitaminas, apresenta grande utilidade
terapêutica, principalmente como anti-raquítico. É considerado um óleo não secativo
(TESKE; TRENTINI, 1997).
2.6. ETNOFARMACOLOGIA
Segundo Braga (1960), há varias informações etnofarmacológicas sobre o
abacateiro, que lhe atribuem numerosas e variadas propriedades medicinais, talvez pelo
grande valor nutritivo de seus frutos que superam qualquer outro em proteínas, sais minerais e
vitaminas, sendo, no entanto deficiente em açúcar e vitamina C.
Ele é indicado nas afecções hepáticas, doenças renais e vias urinárias, cistites,
uretrites, diarréias e disenterias, gases intestinais e estomacais. Usa-se como infuso extrato
fluido, extrato seco, decocto e óleo (TESKE; TRENTINI, 1997).
Na literatura não existem referências sobre contra-indicações e nem sobre seu
uso durante a gestação e lactação, porém, por ser muito calórico e gorduroso, ele não é
indicado para quem faz regime ou para a manutenção de peso. Desde que utilizado na
dosagem correta não apresenta efeitos colaterais (TESKE; TRENTINI, 1997). Também não
são descritas nas literaturas consultadas qualquer interação alimentar ou medicamentosa.
29
3. OBJETIVOS
O presente estudo tem como objetivo:
● obter o extrato hidroalcoólico das folhas da Persea gratissima Gaertn –
Abacateiro – ( Lauraceae);
● avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do extrato hidroalcoólico das
folhas do abacateiro (Persea gratissima Gaertn - Lauraceae) frente a
bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos utilizando o método de
Difusão em Agar pelas técnicas do Poço e do Disco;
● comparar os métodos de difusão pelas duas técnicas (disco e do poço);
● determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), do extrato para
diferentes microrganismos, incluindo fungos (leveduras), bactérias Gram
positivas e Gram negativas.
30
4. MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia descrita foi delineada com a finalidade de atender os objetivos
do estudo: avaliar a atividade antimicrobiana do extrato da Persea gratissima Gaertn e
determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM).
4.1. OBTENÇÃO DO VEGETAL E DO EXTRATO
4.1.1. Obtenção do vegetal
As folhas de Persea gratissima Gaertn foram adquiridas na YOD Comércio de
Produtos Naturais Ltda (CNPJ: 01.343.767 / 0001-86 e inscrição estadual: 244.574.227.117),
localizado a Rua Dr. Elton Cesar, 74, Chácara Campo dos Amarais, Campinas, Estado de São
Paulo, CEP: 13.082-490, fone: 0-XX-19- 3746-3300.
Laudo Técnico:
Data da colheita (mês/ano): 03/03
Data da validade (mês/ano): 03/06
Número do lote: 038
Número de Análise: 1793
Número do pedido: 154.046
Características da planta:
Nomenclatura Tradicional: Abacateiro
Nomenclatura Botânica Oficinal: Persea gratissima Gaertn
Família: Lauraceae
Procedência: Brasil
Região de origem: Sul
Parte utilizada: Folhas
Modo de secagem: Natural (ao sol)
Teste de Autenticidade:
31
Granulometria: 3,00
Características Físico/químicas:
Identificação/reação química: reação para: Positiva
Metais Pesados (Pb): < 1 ppm
Metais Pesados (Ab. Atômica): Pb: 0,0064 Sb: 0,0083 Cu: 0,0046
Cd, As, hg: Não detectável
Doseamentos (ativos): Óleo essencial: 0,33%
Elementos estranhos: Não encontrados
pH: 5,53
Umidade: 7,90
Cinzas Totais: 7,36%
Cinzas Insolúveis (Ácido): 1,65
Cor: Castanho esverdeado
Odor: característico
Sabor: Característico
Identificação Macroscópica: Folhas simples, oblongas, quando frescas são de
cor verde escura na parte superior e verde mais clara, fosca e áspera na inferior, quando seca a
cor pode passar a castanho clara ou amarronzada.
Identificação Microscópica: A epiderme superior é formada por células
poligonais, a inferior por estomas envolvidos por 4 a 5 células não diferenciadas, ambas
contém alguns pêlos tectores, unicelulares. (F.B.).
Características Microbiológicas:
Contagem Total de Bactérias: 4,0 x 10 ufc/g
Contagem de Leveduras e bolores: 1,0 x 10 ufc/g
Escherichia coli: Ausentes
Staphylococcus aureus: Ausentes
Pseudomonas aeruginosa: Ausentes
Salmonella sp: Ausentes
Outras Bactérias: Ausentes
Farmacêutica Responsável: Dra. Fernanda C. Sassi CRF-SP: 12.115
Os resultados das análises microbiológicas foram aprovados segundo os limites
da OMS e podem ser verificados de acordo com os Anexos A e B.
32
4.1.2. Obtenção do extrato
a) As folhas secas do vegetal (Persea gratissima Gaertn), totalizando 1 kg,
foram trituradas em Moinho de Facas (Marconi equipamentos para
Laboratório LTDA, MA - 680) (Anexo C) obtendo 977 gramas de um pó
fino e esverdeado (Anexo D), que foi pesado na Balança Semi-analítica
Digital (Gehaka, BG-8000).
b) Iniciando o processo de maceração, todo o pó da planta foi colocado em um
garrafão de vidro de 20 litros e adicionado 3 litros de solução
hidroalcoólica 96,4%, nas semanas seguintes foram acrescentados mais 2
litros de álcool.
c) O preparado permaneceu em repouso, homogeneizando periodicamente
durante sete dias.
d) O sobrenadante foi filtrado, obtendo-se um extrato hidroalcoólico límpido
de cor esverdeada (Anexo E).
e) O procedimento de remaceração foi realizado durante cinco semanas
consecutivas, sendo que, cada nova fração do extrato, era adicionada à
anterior, em um único frasco, resultando em um extrato bruto e viscoso.
f) O filtrado foi levado ao evaporador rotativo (MA 120, Marconi) com
temperatura de 45ºC para evaporação do solvente (Anexo F), e
devidamente identificado.
g) Após as cinco semanas todo o extrato obtido foi levado para estufa de ar
circulante a 40º C, (Marconi, MA 035/1) (Anexo G) para processo de
secagem. Na conclusão da etapa de secagem, obteve-se o extrato bruto de
coloração esverdeada.
33
4.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES DO EXTRATO PARA A REALIZAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
4.2.1. Soluções para método de difusão em Agar, técnicas do poço e disco (GROOVE; RANDALL, 1955; BAUER et al., 1966; NCCLS, 1997, 2000, 2002)
Foram preparadas soluções em três concentrações diferentes do extrato de
Persea gratissima Gaertn, 100, 200 e 300 mg/mL
4.2.2. Solução para determinação da Concentração Inibitória Mínima
Foi realizado utilizando o método de microdiluição em caldo (ANDREWS,
2001).
Utilizando-se a solução inicial da diluição de concentração igual a 1 mg/mL.
4.3. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
4.3.1. Microrganismos utilizados
Foram utilizadas cepas padrão, de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e
leveduras adquiridas na American Type Culture Collection (ATCC) e isolados bacterianos
multiresistentes (Quadro 1).
34
Quadro 1. Origem e principais características biológicas das cepas de microrganismos testados
Cepas Origem Aplicação/ propriedades biológicas
Enterococcus faecalis- ATCC#19433 Escherichia coli -ATCC#14948 Kocuria rhizophila- ATCC#9341 -Anteriormente denominado Micrococcus luteus. Neisseria gonorrhoeae- ATCC# 49226 Pseudomonas aeruginosa-ATCC#27853 Shigella flexneri - ATCC#12022 Staphylococcus aureus -ATCC#25923
Cepa Padrão* Avaliação da qualidade de meios de culturas. Controle de qualidade de identificação desta espécie. Avaliação de testes de susceptibilidade a antimicrobianos. Controle de qualidade de testes de sensibilidade a antimicrobianos (discos).
Candida albicans - ATCC#10231
Candida krusei - ATCC#6258
Cepa Padrão* Avaliação de testes de susceptibilidade a antifúngicos. Controle de qualidade de meios de cultura. Testes de esterilidade. Controle de qualidade de identificação desta espécie.
Klebsiella pneumoniae-(46)
Isolado de paciente Hospitalar: urocultura***
Multi-resistente; sensível apenas a Aztreonam, Cefepime, Imipenem, Meronem e Piperacilina/Tazobactam.
Pseudomonas aeruginosa (52)
Isolado de paciente Hospitalar: Urocultura***
Multi-resistente; sensível apenas a Polimixina B.
Staphylococcus aureus (50)
Isolado de paciente Hospitalar: hemocultura***
Multi – resistente (MRSA); sensível apenas á Vancomicina e Teicoplanina.
Legenda: * Coleção de microorganismos da pós-graduação da Universidade de Franca / SP. ** Coleção de Microorganismos do Instituto Adolfo Lutz. *** Coleção de bactérias da disciplina de Microbiologia do curso de Biomedicina da
Universidade de Uberaba / MG.
35
4.3.2. Método da difusão em Agar – técnica do poço
O teste para determinação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão
em Agar foi realizado com base na técnica do poço (Figura 2) em camada dupla, conforme
descrito por Groove e Randall (1955), em triplicada.
Figura 2. Representação fotográfica da realização da técnica do Poço.
4.3.2.1. Preparo do meio de cultura
a) Preparou-se 500 mL de Agar Mueller Hinton desidratado (Difco, Michigan,
USA) na proporção 19 g do Agar em 500 mL de água destilada, conforme
especificação do fabricante, e deixado em repouso na temperatura ambiente
para hidratar.
b) Submeteu-se à esterilização por calor úmido, em autoclave à 122ºC por 20
min.
c) Deixou-se resfriar após a autoclavação, até a temperatura de 45-50ºC.
d) Dispensaram em placas de petri de 150 x 10 mm, 25 mL do Agar Mueller-
Hinton, com uma pipeta de vidro graduada esterilizada, em capela de fluxo
Laminar (Quimis, Q216F2, Diadema).
e) Prepararam 48 tubos de ensaio (20 x 200 mm) com tampa rosqueada,
contendo 12,5 mL de Agar Mueller Hinton, deixado resfriar até a
temperatura de 50ºC. Em seguida foram acondicionados em Banho Maria,
36
na temperatura de 50ºC (FANEM, 102) para manter-se líquido até a hora
do procedimento.
f) Foram preparados 36 tubos de ensaio medindo 10 x 100 mm contendo 2,5
mL de Caldo Mueller Hinton (DIFCO, Michigan, USA), na proporção de
21 g do Agar desidratado em 1000 mL de água destilada conforme
especificação do fabricante, sendo esterilizado em autoclave a 122ºC,
durante 20 min.
4.3.2.2. Preparo do inóculo microbiano
a) Com o auxílio de um alça de platina esterilizada, os microrganismos
testados, foram inoculados em tubos de ensaios medindo 15 x 100 mm,
contendo 2,5 mL de caldo Mueller Hinton (Figura 3). Partiu-se de culturas
recentes (24 horas), até atingir a turbidez de 0,5 da escala de Mac Farland
(a), para bactérias e de 1,0 da escala de Mac Farland para leveduras
(MURRAY et al., 1999).
Figura 3. Preparo do inóculo Figura 4. Comparação do inóculo com a escala de Mac Farland
37
4.3.2.3. Procedimentos
a) Misturou-se o inóculo no tubo de ensaio medindo 20 x 200 mm, contendo
12,5 mL de Agar, imediatamente após a mistura, foi vertido sobre a placa
de Petri já com a camada de Agar base, deixado em temperatura ambiente
para solidificar.
b) Fez-se pocinhos com um canudo de plástico de 6 mm, descartável (Figura
2).
c) Dispensaram em cada poço devidamente identificado, 40,0 µL dos controles
positivo e negativo, assim como de cada concentração do extrato (100, 200
e 300 mg/mL), utilizando-se uma pipeta automática.
d) Colocou-se papel de filtro entre a placa de Petri e a tampa, para evitar a
formação de água na tampa e como conseqüência no meio de cultura.
e) Permaneceu em temperatura ambiente durante 2 horas para a solução ser
difundida pelo Agar, antes do crescimento microbiano como preconizado
por Möller (1966).
f) Foi incubado em estufa a 35oC por 24 horas.
g) Mediu-se em milímetros o halo de inibição do crescimento, utilizando régua
milimetrada (Figura 5).
38
Figura 5. Fluxograma do método de avaliação da atividade antimicrobiana pelo método da difusão em Agar – técnica do poço
39
4.3.2.4. Controles utilizados
a) Controle Negativo: poço inoculado com DMSO puro.
b) Controle Positivo: soluções de antimicrobianos específicos para cada grupo
de microorganismo.
- Penicilina G para bactérias Gram-positivas.
- Estreptomicina para bactérias Gram-negativas.
- Miconazol para leveduras.
- Polimixina B para Pseudomonas aeruginosa de campo multi-resistente.
- Tetraciclina para Neisseria gonorrhoeae.
Preparo das soluções dos controles:
- Penicilina G Benzatina Hidratada (Sigma-Aldrich, Stenheim/Alemanha),
1mg da penicilina (Balança Analítica – Bel Engering, UMARK 1.000) e
adicionou 100 mL de tampão fosfato a 1,0%, pH 6,0 (0,2% de fosfato
dibásico de potássio e 0,8% de fosfato monobásico de potássio em água
destilada).
- Nitrato de Miconazol (Sigma-Aldrich, Stenheim /Alemanha), 4 mg da
Miconazol e adicionou 1 mL de DMSO.
- Streptomicina (Sigma-Aldrich, Stenheim/Alemanha): 10 mg da
Estreptomicina e adicionou em 100 mL de tampão fosfato na concentração
de 0,1 M – pH 7,9 (1,67% de fosfato dibásico de potássio e 0,052% de
fosfato monobásico de potássio).
- Sulfato de Polimixina B (Sigma-Aldrich, Stenheim /Alemanha): 0,4 mg em
20 mL de água destilada esterilizada.
- Cloridrato de tetraciclina (Sigma-Aldrich, Stenheim/Alemanha): 1 mg em
100 mL de água destilada esterilizada.
4.3.3. Método de difusão em Agar – técnica do disco
O teste para determinação da atividade antimicrobiana foi realizado através do
40
método de difusão em Agar, utilizando discos contendo os extratos nas diferentes
concentrações (100, 200 e 300 mg/mL), conforme descrição original de Bauer et al. (1966) e
atualizações do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997a,
1997b, 2000, 2002) em triplicata.
4.3.3.1.Preparo das placas de Agar
a) Preparou-se Agar Mueller Hinton desidratado (DIFCO, Michigan, USA),
reconstituído utilizando água deionizada como solvente.
b) Após foi levado à autoclave durante 20 minutos a 122oC para esterilização,
depois da autoclavação, esperou-se resfriar até à temperatura de 50ºC.
c) Transferiu-se o volume de 50 mL do meio liquefeito para placas de Petri
esterilizadas de 150 x 10 mm, atingindo uma espessura de 4 mm.
d) Deixou-o para resfriar em temperatura ambiente, dentro da capela de fluxo
laminar (Quimis, modelo Q216F2).
e) Uma placa foi colocada em estufa à 36ºC para controle de esterilidade
(observar a ausência de crescimento bacteriano) e as demais armazenadas
em geladeira (2–8ºC), até o momento do uso.
4.3.3.2. Teste Piloto para padronização dos discos
O teste piloto foi realizado para padronizar o volume do extrato que deveria ser
colocado nos discos e decidir se a sua preparação poderia ser realizada no dia anterior ou no
momento do procedimento:
a) Utilizaram-se discos de papel secos, esterilizados por radiação gama, sem
impregnação, medindo 6 mm de diâmetro (Diagnósticos Microbiológicos
Especializados DME – Araçatuba-SP) e sulfato de gentamicina na
concentração de 20 mg/mL injetável em água destilada esterilizada.
b) Em uma Capela de Fluxo Laminar, foram distribuídos 10 discos em cada
41
placa de Petri estéril já identificada, na 1ª placa os discos foram
impregnados com 16 µl da gentamicina, na 2ª placa com 17 µl e na 3ª
placa com 18 µl, e foram deixadas na capela de fluxo até os discos secarem
e depois vedadas com fita crepe e armazenadas em geladeira.
c) 24 horas após, antes do procedimento, foi preparada a mesma quantidade
de discos, utilizando-se os mesmos procedimentos.
d) Foram utilizadas 6 placas 150 mm x 10 mm com Agar Mueller Hinton para
antibiograma preparadas anteriormente, e 5 bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas, isoladas no Laboratório de Análises Clínicas da
Universidade de Uberaba (UNIUBE) .
e) Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, inoculou-se colônias
dessas bactérias de culturas de 24 horas, para tubo de ensaio com 4 mL de
solução salina esterilizada, comparando-se a turvação com o tubo 0,5 da
escala de Mac Farland (Figura 6).
f) Com um swab esterilizado, o inóculo bacteriano foi distribuído
uniformemente sobre a superfície do Agar, e deixadas em repouso na
temperatura ambiente, por aproximadamente 3 min.
g) Utilizando-se uma pinça esterilizada, os discos impregnados no dia anterior
e os preparados na hora do procedimento foram distribuídos
uniformemente sobre a superfície do Agar, já identificados, com um
intervalo mínimo de 24 mm de distância entre os discos, e incubadas em
estufa a 37oC por 24 horas.
h) O halo de inibição foi medido em milímetros, utilizando-se régua
milimetrada (Quadro 2).
Os resultados mostraram que não existe diferença na variação dos volumes
utilizados e que os discos poderiam ser preparados tanto no dia anterior como na hora do
procedimento, pois não houve diferença no valor do halo em mm para cada bactéria.
4.3.3.3. Preparo dos discos de papel absorvente
O preparo dos discos de papel contendo soluções antimicrobianas seguiu a
42
técnica descrita na Farmacopéia Brasileira (1988).
a) Utilizaram-se discos de papel secos, esterilizados por radiação gama, sem
impregnação, medindo 6 mm de diâmetro (Diagnósticos Microbiológicos
Especializados DME – Araçatuba-SP).
b) Em Capela de Fluxo Laminar (Quimis, Q216F2), foram distribuídos 36
discos em cada placa de Petri esterilizada já identificada, sendo uma placa
para cada concentração testada, uma para o controle positivo e outra para o
controle negativo.
c) As amostras foram homogeneizadas em um Vortex (Phoenix, mod. AP- 56),
e com uma pipeta de volume regulável entre 5–50 µl (Lab’s Pet, São
Paulo), foi transferido 16µL das soluções a serem testadas em cada disco de
papel, nas suas respectivas placas.
d) Os discos foram preparados no momento de sua utilização.
4.3.3.4. Procedimentos
a) As placas contendo Agar Mueller-Hinton preparadas antecipadamente
foram retiradas da geladeira até atingir a temperatura ambiente.
b) Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, inoculou-se colônias dos
microorganismos de culturas de 24 horas, para tubo de ATB Médium
(BioMerieux, Rio de Janeiro), contendo 7 mL de meio para ATB
(BioMerieux, Rio de Janeiro), até 0,5 da escala de Mac Farland para
bactérias que corresponde a 1-2 x 108 UFC/mL e até 1,0 da escala de Mac
Farland para leveduras, utilizando um densitômetro (Biomerieux®
ATB1550).
c) Com um swab estéril, o inóculo bacteriano foi distribuído uniformemente
sobre a superfície do Agar, e deixadas em repouso em temperatura
ambiente por 3 minutos.
d) Utilizando-se uma pinça esterilizada, os discos previamente impregnados
com as soluções e os controles, foram distribuídos uniformemente sobre a
superfície do Agar, com um intervalo mínimo de 24 mm de distância entre
os discos.
43
e) Incubado em estufa a 35±1oC por 24 horas.
f) O halo de inibição do crescimento foi medido em milímetros, utilizando-se
régua milimetrada (Figura 6).
4.3.3.5. Controles utilizados
a) Controle Negativo: discos impregnados apenas com solução de DMSO.
b) Controle Positivo: discos contendo antimicrobianos manufaturados (Cecon,
São Paulo).
- Penicilina G para bactérias Gram-positivas.
- Amicacina para bactérias Gram-negativas.
- Miconazol para leveduras.
- Para as amostras de Pseudomonas aeruginosa (52) e que apresentava
múltipla resistência aos antimicrobianos e a ATCC, foram utilizados
discos de Polimixina B (Cecon, São Paulo).
44
Figura 6. Fluxograma do método de determinação da atividade antimicrobiana pelo método da difusão em Agar – técnica do disco de papel
45
4.3.3.6. Particularidades do antibiograma para Neisseria gonorrhoeae
A técnica de difusão em Agar para a amostra de Neisseria gonorrhoeae foi
realizada segundo a padronização do National Committee for Clinical Laboratory Standards-
NCCLS (2000).
a) O meio de cultura utilizado pelo método do disco e do poço para a avaliação
da atividade antimicrobiana da Neisseria, foi o Agar Bacto GC Médium
Base (Difco, Michigan-USA), na seguinte proporção: 36 g de meio para 500
mL de água destilada, colocado em microondas até dissolver
completamente.
b) Autoclavar durante 15 minutos a 121ºC para esterilização.
c) Adicionar o suplemento VX (Laborclin – Pinhais) e homogeneizar bem.
d) Os restantes dos procedimentos foram realizados conforme descrito acima
para os outros microorganismos.
4.4. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA – CIM
A determinação da concentração inibitória mínima das soluções do extrato
hidroalcoólico de Persea gratissima Gaertn foi realizada segundo a técnica de diluição em
caldo (microtécnica) (ANDREWS, 2001).
4.4.1. Preparo das soluções
Para determinação da concentração inibitória mínima, foram preparadas
soluções do extrato da planta contendo 1 mg/mL em dimetil sulfóxido (DMSO). Em seguida,
prepararam-se as seguintes soluções:
Solução mãe 1: foram transferidos 500 µL de cada uma das soluções dos
extratos anteriormente citados para tubos de ensaio contendo 500 µL do caldo Triptona Soja
(TSB – Merck-Alemanha).
Solução mãe 2: foram transferidos 500 µL de cada uma das soluções dos
46
extratos preparadas anteriormente para tubos de ensaio contendo 2.500 µL do TSB.
Solução mãe 3: foram transferidos 500 µL de cada uma das soluções dos
extratos preparadas anteriormente para tubos de ensaio contendo 4.500 µL do TSB.
4.4.2. Preparo dos controles positivos
- Penicilina G (1215 U/mg – Sigma): foi preparado em tampão fosfato a 1,0%,
pH 6,0 (0,2% de fosfato dibásico de potássio e 0,8% de fosfato monobásico
de potássio em água destilada), obtendo-se uma solução final contendo 20
µg/mL de penicilina.
- Nitrato de miconazol (Sigma): foi preparada em dimetil sulfóxido, foram
feitas diluições sucessivas e por fim em TSB de modo a fornecer uma
solução de 800 µg/mL de miconazol.
- Cloridrato de vancomicina (1.000 µg/mg -Sigma): foi preparado em água
destilada esterilizada, obtendo-se uma solução final contendo 20 µg/mL
- Imipenen (1.000 µg/mg -Sigma): foi preparado em água destilada
esterilizada, obtendo-se uma solução final contendo 20 µg/mL
- Cloridrato de tetraciclina (Sigma): foi preparada uma solução de tetraciclina
em água destilada esterilizada, e, por fim, foram feitas diluições sucessivas,
em caldo TSB de modo a fornecer uma solução de 20 µg/mL.
4.4.3. Preparo do inóculo
Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, foram transferidas culturas
de 24 horas dos microorganismos, desenvolvidas no meio Agar triptona de soja, para tubos
contendo caldo Triptona Soja.
Padronizou-se o inóculo fazendo a comparação deste com o tubo 0,5 da escala
MacFarland equivalente a 1,5 x 108 UFC/mL para bactérias e de 1,0 na escala de Mac Farland
equivalente a 3,0 x 108 UFC/mL para leveduras (Figura 6).
47
4.4.4. Procedimentos
Todo procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar. As vidrarias,
ponteiras e os meios de cultura foram previamente esterilizados. Utilizaram-se microplacas
esterilizadas com 96 orifícios, cada orifício recebendo inóculo, TSB e amostra das soluções
dos extratos brutos preparada de tal maneira que o volume final em cada orifício foi de 100
µL (Figura 7).
Figura 7. Microplaca contendo inóculo, caldo TSB e amostra das soluções preparadas
Avaliaram-se as amostras das soluções em diversas concentrações que
variaram de 0,078 µg/mL a 300 µg/mL de TSB. Determinou-se, então, a menor concentração
de cada amostra capaz de inibir o crescimento dos microorganismos indicadores.
Para os controles positivos as concentrações avaliadas variaram de 0,0115
µg/mL a 5,9 µg/mL de caldo TSB. Também foram realizados os seguintes controles: controle
de esterilidade do caldo (TSB); controle das culturas (que devem apresentar crescimento
microbiano devido à ausência de agentes antimicrobianos); controle da esterilidade do
antibiótico e controle de esterilidade das amostras.
As microplacas foram seladas com parafilme e incubadas a 37oC por 24-48
horas. Após o período de incubação, foram adicionados em cada orifício 30 µL de resazurina
(Sigma) preparado em solução aquosa (0,01%) para as bactérias. Este sistema revelador
permite a observação imediata, sendo que a cor azul representa ausência de crescimento e a
cor vermelha sua presença. As leveduras C. albicans e C. krusei foram reveladas pelo cloreto
trifeniltetrazólio (Merck) preparado em solução aquosa (0,7%). As microplacas foram
48
reincubadas por 30 minutos. Após a este período as microplacas foram observadas e
analisadas. A ausência de cor nos orifícios foi interpretada como ausência de crescimento
microbiano (microorganismo sensível ao extrato testado) (Figura 8).
4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A comparação entre as concentrações de cada técnica, foi determinada
através da ANOVA One Way e as médias entre as concentrações pelo teste de Tukey, sempre
considerando o nível de significância de 5% (ZAR, 1998).
Para a comparação entre as técnicas do poço e disco foi utilizado ANOVA
Two Way, ao nível de significância de 5%, sendo o método fator principal e a concentração
fator secundário (ZAR, 1998).
49
Figura 8. Ilustração da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) pelo método de microdiluição em caldo
50
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. LEITURA E MENSURAÇÃO DOS RESULTADOS
Com o objetivo de padronizar o volume do extrato que deveria ser transferido
para cada disco de papel e se sua preparação poderia ser realizada no dia anterior ou no
momento da execução do procedimento, obtivemos os seguintes resultados. (Quadro 2),
mostrando que não existe diferença entre os diferentes volumes utilizados e que os discos
poderiam ser preparados no momento de seu uso.
Quadro 2. Resultados do teste piloto da preparação dos discos contendo as soluções de antibiótico (gentamicina)
Discos impregnados no dia anterior
Discos impregnados na hora do procedimento
Bactérias
16 µL 17 µL 18 µL 16 µL 17 µL 18 µL Escherichia coli 32 32 32 32 32 32 Proteus sp 32 32 32 32 32 32 Staphylococcus aureus 30 30 30 30 30 30 Pseudomonas sp 35 35 35 35 35 35 Salmonella 18 18 18 18 18 18
Após o tempo de incubação realizaram-se as leituras de todas as placas e os halos
de inibições foram mensurados. Convém relatar que a experimentação foi realizada em
triplicata, para que a fidedignidade fosse mantida e evitar interferências ou manipulação dos
resultados.
Os resultados obtidos sobre a atividade antimicrobiana in vitro do extrato
hidroalcoólico das folhas da Persea gratissima Gaertn seguem abaixo relatados.
Os testes foram realizados pelos métodos da Difusão em Agar pelas técnicas
do Disco e do Poço já relatados, com as concentrações de 100, 200 e 300 mg/mL do extrato
do abacateiro.
Após a mensuração dos halos de inibição, selecionaram-se algumas placas
para documentação fotográfica. Para melhor compreensão segue algumas placas que
51
representam a atividade antimicrobiana frente ao extrato testado.
5.2. MÉTODO DE DIFUSÃO EM AGAR – TÉCNICA DO DISCO
Figura 9. Representação fotográfica da ação antimicrobiana sobre cepas de alguns microorganismos testados
S. aureus ATCC-25923
k. rhizophila ATCC- 9341
C. krusei ATCC-6258
52
5.3. MÉTODO DE DIFUSÃO EM AGAR – TÉCNICA DO POÇO
Figura 10 . Representação fotográfica da ação antimicrobiana sobre cepas de alguns microorganismos testados
Figura 11. Representação fotográfica da ação antimicrobiana sobre cepas de alguns microorganismos testados
Após a mensuração, os resultados obtidos pelos Métodos de Difusão em Agar,
técnicas do Disco e do Poço foram transcritos para as tabelas abaixo relacionadas.
S. aureus C/C - 50
k. rhizophila ATCC- 9341
C. albicans ATCC - 10231
53
Tabela 1. Valores das médias dos halos de inibição do crescimento microbiano em mm pelo método de difusão em Agar – técnica do disco
Média* ± DPM do halo de inibição (mm)
Concentração do extrato Microrganismos Controle Positivo 100 mg/mL 200 mg/mL 300 mg/mL p***
C. albicans ATCC#10231 20,0±0,8 0,0 ±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS
C. krusei ATCC#6258 27,7± 0,5 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS E. coli ATCC#14948 27,3±0,5 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS E. faecalis ATCC#19433 19,7±2,1 0,0 ±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS K. pneumoniae ( 46)** 18,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS K. rhizophila ATCC#9341 34,3±0,5 8,3 ±0,6 9,0±0,0 11,0±1,0 0,007 N. gonorrhoeae ATCC#49226 40,3±0,3 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS P. aeruginosa ATCC#27853 18,3±0,5 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS P. aeruginosa (52)** 18,3±0,3 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS S. aureus ATCC#25923 49,0±0,0 7,7±0,6 7,7±0,6 8,7±0,6 NS S. aureus (50)** 15,0±0,8 8,0±0,0 8,0±0,0 9,0±0,0 NS S. flexneri ATCC#12022 22,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS
(**)- Isoladas de amostras hospitalares. (***)- ANOVA (NS )- Não significativo
Análise da Variância: Por esta técnica apenas a K. rhizophila ATCC#9341
apresentou diferença entre as concentrações(ANOVA, p<0,05) sendo a concentração de
300mg/mL significativamente maior que 200 e 100mg/mL (Tukey, p<0,05)
Tabela 2. Valores das médias dos halos de inibição do crescimento microbiano em mm pelo método de difusão em Agar – técnica do poço em camada dupla Média* ± DPM do halo de inibição (mm)
Microrganismos Controle Concentração do extrato
Positivo 100 mg/mL 200 mg/mL 300 mg/mL p***
C. albicans ATCC#10231 13,0±0,8 14,7±0,6 14,7±1,0 15,0±1,0 NS C. krusei ATCC#6258 26,0±0,8 13,0±1,0 13,0±1,0 13,0±1,0 NS E. coli ATCC#14948 18,0±0,8 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS E. faecalis ATCC#19433 14,0±0,0 10,0±0,0 12,0±0,0 12,0±0,0 NS K. pneumoniae ( 46)** 14,7±0,5 14,0±0,1 16,0±0,0 16,3±0,0 0,010 K. rhizophila ATCC#9341 49,7±0,5 9,0±0,0 11,7±0,6 13,0±0,0 0,000 N. gonorrhoeae ATCC#49226 41,0±0,6 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS P. aeruginosa ATCC#27853 12,0±0,0 9,3±0,6 11,7±0,6 12,3±0,6 0,002 P. aeruginosa (52)** 14,7±0,3 9,0±0,0 9,0±0,0 9,0±0,0 NS S. aureus ATCC#25923 32,0±0,8 7,7±0,6 7,7±0,6 8,7±0,6 NS S. aureus (50)** 10,3±0,5 11,3±0,6 11,3±0,6 11,3±0,6 NS S. flexneri ATCC#12022 12,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 NS
(**)- Isoladas de amostras hospitalares; (***)- ANOVA; (NS)- Não significativo
54
Análise de Variância: Pela técnica do Poço K. rhizophila ATCC#9341, K.
pneumoniae (46)** e P. aeruginosa ATCC#27853 apresentaram diferenças significativas
(ANOVA, p<0,05), sendo que as concentrações de 300mg/mL significativamente maior que
200 e 100 mg/mL (Tukey, p,0,05) para K. rhizophila ATCC#9341 e K. pneumoniae ( 46)**,
e as concentrações de 300 e 200mg/mL sgnificativamente maiores que 100 (Tukey, p,0,05),
para P. aeruginosa ATCC#27853.
Tabela 3. Comparação entre as técnicas do Poço e do Disco
Microrganismo p-level C. albicans ATCC#10231 NS C. krusei ATCC#6258 NS E. coli ATCC#14948 NS E. faecalis ATCC#19433 NS K. pneumoniae ( 46)** NS K. rhizophila ATCC#9341 0,000 N. gonorrhoeae ATCC#49226 NS P. aeruginosa ATCC#27853 NS P. aeruginosa (52)** NS S. aureus ATCC#25923 NS S. aureus (50)** 0,000 S. flexneri ATCC#12022 NS
(**) - Isoladas de amostras hospitalares; (NS) - Não significativo
Fazendo a Análise de Variâncias entre as técnicas do poço e disco, houve
diferença significativa apenas para S. aureus c/c e K. rhizophila, com p<0,05
Os controles que foram utilizados para a validação das técnicas foram:
Controle Positivo, comerciais de referência, respeitando a sensibilidade de cada grupo e/ou
individualidade dos microrganismos:
- C. albicans e C. krusei: Miconazol
- E. faecalis,,K. pneumoniae e K. rhizophila e S. aureus ATCC: Penicilina G
10 UI
- E. coli e S. flexineri: Estreptomicina
- N. gonorrhoeaes: Tetraciclina
- P. aeruginosas: Polimixina
- S. aureus c/c: Vancomicina
55
Os métodos de difusão em Agar, técnicas do Poço e do disco são testes
qualitativos, então se optou em utilizar a técnica de microdiluição para determinação da CIM,
por se tratar de um teste quantitativo.
5.4. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
As pesquisas e estudos das avaliações das atividades antimicrobianas, a fim de
atender a finalidade a que se propõem, devem considerar o estabelecimento de uma
concentração adequada, uma vez que, caso seja utilizada uma concentração inferior,
possivelmente não apresentará a atividade antimicrobiana desejável, podendo tornar
resistentes cepas de microorganismos sensíveis ao produto analisado.
Realizada a leitura das placas da CIM, considera-se como Concentração
Inibitória Mínima, a menor concentração que inibiu completamente o crescimento das cepas
testadas.
Tabela 4. Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extratoetanólico da Persea gratissima Gaertn, determinada pelo método da microdiluição em caldo Microrganismos CIM Controles ATM
Cândida albicans ATCC#10231 90,0µg/mL > 5,90 µg/mL MIC
Cândida krusei ATCC#6258 70,0µg/mL 2,95 µg/mL MIC
Enterococcus faecalis ATCC#19433 100,0µg/mL 0,37 µg/mL VAN
Escherichia coli ATCC#14948 200,0µg/mL 1,48 µg/mL IMI
Klebsiella pneumoniae c/c (46) 200,0µg/mL 5,90 µg/mL IMI
Kocuria rhizophila ATCC#9341 100,0µg/mL 0,02 µg/mL PEN
Neisseria gonorrhoeae ATCC#49226 90,0µg/mL 0,74 µg/mL TET
Pseudomonas aeruginosa ATCC#27853 90,0µg/mL 5,90 µg/mL IMI
Pseudomonas aeruginosa c/c (52) 80,0µg/mL > 5,90 µg/mL IMI
Shigella flexneri ATCC#12022 200,0µg/mL 2,95 µg/mL IMI
Staphylococcus aureus c/c (50) 200,0µg/mL 1,48 µg/mL VAN
Staphylococcus aureus ATCC#25923 200,0µg/mL 0,18 µg/mL PEN
ATM = Antimicrobiano; IMI=Imipenem; MIC = Miconazol; PEN = Penicilina G; TET = Tetraciclina;
56
Há muito tempo países como Estados Unidos, Japão e outros já utilizavam
plantas exóticas em sua medicina popular. Após pesquisa e identificação de inúmeros
produtos fitoterápicos, estes começam a serem mais difundidos no Brasil. A introdução de
novos produtos no mercado deve-se às inúmeras pesquisas, consideradas uma promissora
fonte de descoberta de novos fármacos. Convém lembrar também o aparecimento de novas
cepas bacterianas resistentes aos produtos existentes, tudo isso decorrente do uso
indiscriminado destes produtos, crescendo também o aparecimento de fungos e vírus
resistentes aos produtos químicos disponíveis, tudo isso levando ao uso de terapias
prolongadas e onerosas (PERIN, 2001).
No mundo todo, por milhares de anos, muitos produtos naturais são utilizados
com a finalidade medicinal, e muitos têm apresentado atividades antiinflamatórias e
antimicrobianas dentre outras, o que justifica a procura desses produtos que apresentem essas
atividades (KOO, 2000).
Auricchio e Bacchi (2003) relatam que quando comparamos estudos de
plantas medicinais, é nítida a dificuldade de se avaliar os resultados, pois as variáveis vão
desde os aspectos climáticos influindo na composição química, a coleta, a parte estudada da
planta e a maneira de preparar o material, indo até ao experimento, propriamente dito.
Não foram encontrados relatos na literatura quanto a uma possível atividade
antimicrobiana em relação ao extrato bruto aqui testado, o que torna difícil comparar os
resultados com outro trabalho.
Os halos de inibição observados não foram comparados quantitativamente
com os padrões quimioterápicos conhecidos; levou-se em consideração a inibição ou não do
crescimento dos microrganismos testados.
Pelos métodos de difusão em Agar, técnicas do Disco e do Poço, observou-se
que o extrato estudado, não apresentou atividade antibacteriana em nenhum dos métodos
contra as cepas de E. coli ATCC 14948 e S. flexneri ATCC 12022 e N. gonorroheae, porém
pela determinação da CIM, com uma concentração de 200 µg/mL houve inibição do
crescimento bacteriano para as cepas de E.Coli e S. flexineri e com uma CIM de 90 µg/mL
para a N. gonorrhoeae.
O extrato do abacateiro nas concentrações de 100, 200 e 300 mg/mL nas duas
técnicas de Difusão apresentou halos de inibições para as 2 cepas de S. Aureus e para a cepa
de K. rhizophila e uma CIM de 200 mg/mL e 100mg/mL para as cepas de S. Aureus tanto a
c/c 50 e ATCC 25923 e M. luteus ATCC 9341 respectivamente, inibindo o crescimento das
mesmas.
57
Resultados controversos foram obtidos para as cepas de E. faecalis, K.
pneumoniae, P. aeruginosa, C. albicans, C. krusei e P. aeruginosa c/c onde houve halos de
inibição dos crescimentos no Método do Poço, porém, não houve atividade no Método de
Difusão em disco de papel. Com relação às CIM dos microorganismos aqui citados, a menor
concentração obteve-se com a cepa de C. krusei, com 70 µg/mL seguido da C. albicans com
90 µg/mL e uma CIM de 80 µg/mL para P. aeruginosa c/c.
Nota-se que algumas bactérias não apresentaram atividade pelo método de
Difusão, porém seus crescimentos foram inibidos quando se determinou a CIM. Bandeira et
al. (1998), também relatam esta falta de atividade bacteriana pelo método de Difusão e a
relaciona com a dificuldade de difusão destas substâncias. Relatam ainda que o teste de
difusão em Agar tem mais eficiência para substâncias que são solúveis em água,
possibilitando a difusão destas através do meio de cultura. O peso molecular também pode
dificultar a difusão no meio de cultura.
O teste de difusão em Agar não oferece condições de igualdade para se
comparar substâncias com solubilidade e difusibilidade distintas (ESTRELA, 2000).
Analisando medicações com diferentes capacidades de difusão e dissociação, empregando
modelos experimentais utilizando meios de culturas líquido, este pesquisador relata que estes
testes parecem serem melhores que os testes de difusão em Agar, devido ao fato de algumas
substâncias apresentarem dificuldades de difusão e dissociação em Agar. Ribeiro e Soares
(2000) afirmam que diversos fatores influenciam nesta técnica como a presença de enzimas
bacterianas, a composição do meio, a difusão do medicamento no meio, a densidade do
inóculo, o período de incubação, a temperatura e a estabilidade do medicamento em uso.
Uma vez sabendo que a técnica da difusão em Agar pode sofrer interferências,
realizou-se com o mesmo extrato e com os mesmos organismos testados o teste da
Concentração Inibitória Mínima (CIM), onde os resultados obtidos por esta técnica
apresentaram uma inibição do crescimento bacteriano com todos os inóculos, com valores
para CIM inferiores a 200 µg/mL do extrato de Abacateiro, e em alguns casos atingindo
concentrações de 90, 80 e até 70 µg/mL
A inibição ocasionada pelo extrato da Persea gratissima Gaertn nas
concentrações testadas frente aos microorganismos, mostra a importância da fundamentação
científica, ainda que este experimento, neste momento, não venha buscar correlações entre os
resultados aqui obtidos e o uso in vivo para este fim, necessitando ainda estabelecer um
parâmetro entre os resultados microbiológicos da CIM com os resultados dos métodos de
difusão em disco e em poço, onde se faz necessário à realização de novos estudos para
58
elucidação dos questionamentos e das lacunas do conhecimento. Convém lembrar que o
mecanismo de ação deste extrato pode ser influenciado pela presença de vários componentes
ativos, que podem ou não apresentar atividades físico-químicas que aumentam ou reduzem a
atividade antimicrobiana.
59
CONCLUSÕES
Considerando os resultados obtidos com base nas condições experimentais
pode-se concluir:
● Na avaliação da atividade antimicrobiana, através do método de difusão em
Agar pela técnica do disco, obteve-se atividade deste extrato apenas para
três bactérias, K. rhizophila ATCC-9341, S. aureus ATCC-25923 e S.
aureus c/c 50, nas três concentrações testadas.
● Pelos métodos de difusão em Agar, técnica do Poço, apenas não foi
observada atividade antimicrobiana apenas para E. coli ATCC-14948, N.
gonorrhoeae ATCC-49226 e S. flexineri ATCC-12022.
• Analisando a variância observou-se que para a técnica do disco somente K.
rhizophila ATCC#9341 apresentou diferença significativa entre as
concentrações de acordo com ANOVA, (p<0,05) , pela técnica do poço K.
rhizophila ATCC#9341, P. aeruginosa ATCC# 27853 e K. pneumoniae
c/c 46, apresentaram diferenças significativas entre as concentrações ( de
acordo com ANOVA, p<0,05).
● Comparando-se os resultados das técnicas do Poço e do Disco, houve
discordância quanto aos resultados obtidos para os microrganismos
testados. Fazendo a Análise de Variâncias para a comparação entre as duas
técnicas apenas para os microrganismos S. aureus c/c e K. rhizophila
ATCC#9341, houve diferença significativa com p<0,05 (S. aureus c/c
poço> disco e K. rhizophila ATCC#9341 poço > disco)
Uma vez sabendo que o método de difusão em Agar pelas duas técnicas, Poço
e Disco, pode sofrer interferências, realizou-se com o mesmo extrato e com os mesmos
organismos testados, a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) através do
método de microdiluição. Os resultados obtidos apresentaram:
● Inibição do crescimento bacteriano com todos os microrganismos em
diferentes concentrações, mostrando ser mais eficiente para C. krusei
ATCC 6258.
60
REFERÊNCIAS
ALBUQUERQUE, J. M. Plantas medicinais de uso popular. Brasília: ABEAS, 1989. 100 p. AHMAD, I.; BEG, A. Z. Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian medicinal plants against multi-grugs resistant human pathogens. J Ethnoph., Limerick, v. 74, p. 113-123, 2005. ANDRADE, C. A.; PEITZ, C.; CÚNICO, M.; CARVALHO, J. L. S.; ABRAHÃO, W. M.; MIGUEL, O. G.; MIGUEL, M. D.; KERBER, V. A. Avaliação da atividade antibacteriana e triagem fitoquímica das flores de Acácia podalyriiflolia A. Cunm. Ex G. Dom. Leguminosae-Mimosoidea.. Rev Bras Farmacog., São Paulo, v. 15, n. 1, p. 13-15, jan./mar. 2005. ANDREWS, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy, London, v. 48, n. 1, p. 5-16, 2001. ARNOLD, K. Risk factors for carriage of drug-ressistant Streptococcus pneumoniae amog childrem in Menphis, Tennessee. J Pediatr., v. 128, p. 757-764, 1996. AURICCHIO, M. T.; BACCHI, E. M. Folhas de Eugenia uniflora L. (pitanga): propriedades farmacobotânicas, químicas e farmacológicas. Rev Inst Adolfo Lutz, São Paulo, v. 62, n. 1, p. 55-61, 2003. AVORN, J.; HARVEY, K. Information and education as determinats of antibiotic use: report of task force 5. Rev Infect Dis., v. 9, Suppl 3, p. S286-296, 1987. BAITELLO, J. B. Novas espécies de Lauraceae para a flora brasileira. Acta Bot. Bras., v. 15, n. 3, p. 445-450, 2001. BANDEIRA, M. F. C, OLIVEIRA, M. R. B.; PIZZOLITO, A. C.; BENATTI, N. C. T. J Bras Clín Estética Odontol., v. 3, n. 17, p. 47, 1998. BAUER, A.; KIRB, W. M. M.; SHEVIS, J. C.; TURCK, M. Antibiotic susceptibility testing by standardized single disk methodol. Amer J. Clin. Pathol., v. 45, p. 493-496, 1966.
61
BLACK, J. G. Microbiologia: fundamentos e perspectivas. Traduzido por Eiler Fritsch Toros. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. cap. 13, p.316-347. Titulo do original: Microbiology. BRAGA, R. A. Plantas do Nordeste, especialmente do Ceará. 2. ed. Fortaleza: Impr. Oficial de Fortaleza, 1960. 540 p. BRAKUNI, D. S.; BITTNER, C. M.; MARTICORENA, M.; SILVA, E.; WELDT, M. E. M.; ZEMELMAN, R. J. Nat. Prod., v. 37, p. 621-632, 1974. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RDC no. 48 de 16 de março de 2004. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Diário Oficial da União, Brasília, 18 de mar. 2004 a. BRITTEN, N. Patients demands for prescriptions in primary care. Brit Med J., v. 310, p. 1084-1085, 1995. CALIXTO, J. B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (phytoterapeutic agents). Braz J Med Biol Res., Ribeirão Preto, v. 33, n. 2, p. 179-189, 2000. CARBONEZZI, C. A.; LOPES M. N.; SILVA D. H. S. et al. Derivado cinamolítico com atividade no reparo de DNA e outras substâncias de Cinnamomum australe (Lauraceae). Quim. Nova, v. 27, n. 2, p. 196-198, mar./abr. 2004. CARVALHO, A. A. T.; SAMPAIO, M. C. C.; SAMPAIO, F. C.; MELO, A. F. M.; SENA, K. X. F. R.; CHIAPPETA, A. A.; HIGINO, J. S. Atividade Antimicrobiana in vitro de extratos hidroalcoólicos de Pisidium guajava L sobre Bactérias Gram-Negativas. Acta Farm. Bonaerense, v. 21, n. 4, p. 255-258, 2002. CARVALHO, J. C. T. Fitoterápicos anti-inflamatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. São Paulo: Tecmed, 2004. CHAMBERS, H. F.; SANDE, M. A. Fármacos antimicrobianos. In: GILMAN, A. G.; RALL, T. W.; NIES, A. S.; TAYLOR, A. (Eds.) As bases da farmacologia terapêutica. 9. ed. Rio de Janeiro, 1996. cap. 43, p. 757-776. CHEN, M.; LANDEFELD, S. Physicians behavior and their interactions with drug companies (a controlled study of physicians who requested additions to hospital drug formulary). JAMA, n. 271, p. 684-689, 1994.
62
CHITARRA, M. I. F.; CHITARRA, A. D. Pós-colheita de frutas e hortaliças: fisiologia e manuseio. Lavras: FAEPE, 1994. 293 p. COHEN, M. L. Epidemiology of drug resistance; implications for a post-antimicrobial era. Science, Washington, v. 257, n. 11, p. 1050-1055, 1992. CONSERVA, A. M. Constituintes químicos e ensaios farmacológicos de Aristochia Birastris Duchtre. 1985. 192 f. Dissertação (Mestrado em Produtos Naturais) - Universidade Federal da Paraíba, Centro de Ciências da Saúde, João Pessoa. CRISAN, I. et al. Natural propolis extract NIVCRISOL, in the treatment of acute and chronic rhinopharyngitis in children. Rom J Virol., Bucareste, v. 46. n. 3-4, p. 115-133, 1995. DI STASI, L. C.; HIRUMA, C.; GUIMARÃES, E.; SANTOS, C. Fitoterapia, v. 65, p. 529-540, 1994. DI STASI, L. C. Uma proposta de ação interdisciplinar na pesquisa de novos medicamentos a partir de plantas medicinais. In: ______. Plantas medicinais: arte e ciências. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo: Ed. da UNESP, 1996. 230 p. DJIPA, C.; DELMÉE, D.; QUETIN-LECLERQ, J. Antimicrobial actyvity of bark extracts of Syzygium jambos (L.). Alston (Myrtaceae). J Rthnoph., Limerick, v. 71, n. 1-2, p. 307-313, 2000. ESTRELA, C. R. A. Eficácia antimicrobiana de soluções irrigadoras de canais radiculares. 2000. 88 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) - Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e de Saúde Pública, Goiânia. FALCÃO, E. P. S.; SILVA, N. H.; GUSMÃO, N. B.; RIBEIRO, S. M.; HONDA, N. K.; PEREIRA, E. C. atividade antimicrobiana de compostos fenólicos do líquen Heterodérmia leucomela (L.)Poelt. Acta Farm. Bonaerense, v. 21, n. 1, p. 43-49, 2002. FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 1988. FERREIRA, A. Controle de qualidade: da matéria-prima ao fitoterápico. Rev Racine, ano 13, p. 68-78, jan./fev. 2003. GARCIA, E. S..; SILVA, A. C. P.; GILBERT, B.; CORRÊA, C. B.; CAVALHEIRO, M. V. S.; SANTOS, R. R.; TOMASSINI, T Fitoterápicos: biodiversidade: perspectivas e
63
oportunidades tecnológicas. Base de Dados Tropical 1996. Disponível em:<http://www.bdt.fat.org.br/publicacoes/padct/bio/cap10>. Acesso em: 26 maio 2004. GERSHMAN, K. The careful antibiotic use (C. A. USA). Newslleter, v. 1, Oct. 1997. Disponível em: <http//www.cdc.gov/ncidod/dbmd/cause>. Acesso em: 19 maio 2000. GILMAN, A. G.; GOODMAN, L. S.; GILMAN, A. As bases farmacológicas da terapêutica. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1983. GILMAN, A. G.; HARDAM, J. G.; LIMBIRD, L. E. The pharmacological basis of therapeutics. 9th ed. (International edition). New York: McGraw-Hill, 1996. GOODMAN, L. S.; GILMAN, A. G. The pharmacological basis of therapeutic. 8. ed. 1990. GOULIEH, O. R.; YOSHIDA, M. In: ROWED, J. W. Natural products of wood plants. Berlin: Springer-Verlag, 1989. p. 439-511. GROVE, D. C.; RANDALL, W. A. Assay metods of antibiotic: a laboratory manual. New York: Medical Encyclopedia, 1955. (Antibiotics Monographs, 2). HOLETS, F. B.; PESSINI, G. L.; SANCHES, N. R.; CORTEZ, D. A. G.; NAKAMURA, C. V.; DIAS, F., BENEDITO P.; Screening of some plants used in brazilian folk medicine for the tratament of infectious diseas. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 97 n. 7, p. 1027-1031, 2002. KARCHMED, A. W. Terapia antimicrobiana. In: GOLDMAN, I.; BENNET, J. Cecil – Tratado de medicina interna. 21. ed. Rio de Janeiro: Ganabara Koogan, 2001. v. 2. Parte 22, p. 1772-1881. KOO, H.; ROSALEN, P.L; CURY,J.A; PARK Y. K; IKEGAKI, M; SATTLER, A;: Effects of Apis mellifera propolis from two Brazilian regions on caries development in desalivated rats. Caries Res., Basel, v. 33, n. 2, p. 393-400, 2000. KUNIN, C. Resistance to antimicrobial drugs: a wordwide calamity. Ann Int Med., v. 118, p. 557-561, 1993. LAPA, A. J.; SOUCCAR, C.; LANDMAN, M. R. L.; GODINHO, R. O.; LIMA, T. C. M. Farmacologia e toxicologia de produtos naturais. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.;
64
GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto Alegre: Ed. Universidade UFRGS; Ed. UFSC, 2000. cap. 11, p. 181-196. LEFÉVRE, F. A função simbólica dos medicamentos. Rev Saúde Públ., v. 17, p. 500-503, 1983. LEHIR, A. Farmácia galenica. Manuales da Farmácia. São Paulo: Masson, 1985. LOPES, G. C.; NAKAMURA, C. V.; DIAS FILHO, B. P.; MELLO, J. C. P. Estudo fisicoquímico, químico e biológico de extrato das cascas de Stryphnodendron poyphyllum mart (Leguminoseae). Rev Bras Farmacog., São Paulo, v. 13, supl. 2, p. 24-27, 2003. LOGUERCIO, A. P.; BATTISTIN, A.; VARGAS, A. C.; HENZEL, A.; WITT, N. B. M. Atividade antibacteriana de extrato hidro-alcoólico de folhas de Jambolão (Syzygium cumini (L.) Skells). Ciência Rural, Santa Maria, v. 35, n. 2, p. 371-376, mar./abr. 2005. MARANCA, G. Fruticultura comercial: manga e abacate. 3. ed. São Paulo: Nobel, 1978. MARQUES, L. C. Legislação de fitoterápicos: para onde iremos? Rev Racine, ano 9, p. 46-51, maio/jun. 1999. MEDINA, J. C.; BLEINROTH, E.W.; TANGO, J. S.; CANTO, W. L. Abacate: da cultura ao processamento e comercialização. Campinas: ITAL, 1978. 212 p. MELLO, J. F. DE; MONACHE, F. D.; LIMA, O. G. DE; MARINI-BETTOLO, G. B.; MACIEL, G. M.; TUCCI, A. P.; ATAIDE, M.. Cumarinas de pilocarpus cf. Spicatus St Hill. Hortiolona, um novo antimicrobiano de plantas superiores. Rev. Inst. Antib. Univ. Fed de Pernambuco,p.19,1979.Disponívelem:<www.sbq.org.br/ranteriores/23/resumos/0319/index.html>. Acesso em: 23 jun. 2005. MIMS, C.; PLAYFAIR, J.; ROITT, I.; WAKELIN, D.; WILLIANS, R. Microbiologia médica. 2. ed. São Paulo: Manole, 1999. p. 411-440. MÖLLER, A. J. R. Microbiological examination of root canals and periapical tissues of human teeth. Metodological studies. Odont. Tidsk., v. 74, (suppl.), p. 1-380, 1966. MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S; KOBAYASHI, G. S; PFALLER, M.A; Microbiologia médica. Washington D.C.: American Society of Microbiology Press, 1999.
65
NASCIMENTO, G. G. F.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C. Antibacterial activity of plant extract and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Braz J. Microbiol., São Paulo, v. 31, no. 4, p. 247-256, out/dez 2000. NAKAMURA, C. V.; UEDA-NAKAMURA, T.; BANDO, E.; MELO, A. F. N.; CORTEZ D. A. G.; DIAS FILHO, B. P. Antibacterial activy of Ocimum, gratissimum essencial oil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 94, n. 5, p. 675-678, 1999. NCCLS. National Commitee for Clinical Laboratory Standarts. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacterias that grow aerobically Publication M7-A3. Vilanova-PA,1997a. ______. National Commitee for Clinical Laboratory Standarts. Performance standards for amtimicrobial disk susceptibility test: aproved standart. Publications M2-A5. Vilanova-PA, 1997b. ______. National Commitee for Clinical Laboratory Standarts. Suplemental Tables. Disk diffusion. MIC. Publication M100-S10 (M2), M100-S10 (M7) . Vilanova. PA, 2000. ______. National Commitee for Clinical Laboratory Standarts. Suplplemental Tables. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Twelfht Informational Supplement. Publication M100-s12, v. 22, n. 1, M2-A7 and M7-A5. Vilanova-PA, 2002. ______. National Commitee for Clinical Laboratory Standarts. Performance Standart for Antimicrobial Disk Susceptibility Test. Approved Standart – 8th ed. Document M2-A8, v. 23, n. 1, 2003. NODARI, R. O.; GUERRA, M. P. Biodiversidade: aspectos biológicos, geográficos legais e éticos. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto Alegre: Ed. Universidade UFRGS; Ed.UFSC, 2000. cap.1, p.11-24. NOVAES, T. S.; COSTA,J. F. O.; DAVID, J. P. L.; DAVID, J. M.; QUEIROZ, L. P.; FRANCA, F.;GIULIETTE, A. M.; SOARES, M; B. P.; SANTOS, R. R. . Atividade antimicrobiana em alguns extratos de vegetais de semi-árido brasileiro. Rev Bras Farmacog., São Paulo, v. 13, supl. 2, p. 5-7, 2003. NORRBY, S. R.; NORD, C. E. Lack of development of new antimicrobial drugs: a potential serious threat to public health. Lancet Infect Dis., Solna, v. 5, p. 115-119, fev. 2005.
66
OLIVEIRA, F.; AKISUE, G. Fundamentos da farmacobotânica. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 1998. 178 p. OLIVEIRA, R. A. G. Ação farmacológica sobre o sistema nervoso central da alcalóides da Solanum pseudo-quina St. Hil. 1986. 97 f. (Mestrado em Produtos Naturais) - Universidade Federal da Paraíba, Centro de Ciências da Saúde, João Pessoa. OMS. Basic document for the selection and characterization of medicaments plants – vegetable drugs. 1978. PALOMINO, J. C.; MARTIN, M.; GUERRA, H.; SWING, J.; PORTAELS, F. Resazurin microtiter assay plate; simple and inexpensive methoid os ndetection of drug resistence in Micobacterium tuberculosi. Antimic Ag Chemoth., v. 46, p. 2720-2722, 2002. PEDRALLI, G. A família Lauraceae Lindley no Rio Grande do Sul. 1982. 101 f. Dissertação (Mestrado em Botânica) - UNESP, Rio Claro-SP. PEREIRA, R. S.; SUMITA, T. C.; FURLAN, M. R.; JORGE, A. O. C.; UENO, M. Atividade antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de infecção urinária. Rev Saúde Públ., São Paulo, v. 35, n. 2, p. 326-328, 2004. PERIN, F. M. Avaliação in vitro do efeito bactericida promovido por diferentes métodos de desinfecção do canal radicular. 2001. 80 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - UNAERP, Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto. RAUHA, J. P.; REMES, S.; HEIMONEN, M.; HOPIA, A.; KÄHKÖNEN, M.; KUJAL, T.; PIHLAJA, K.; VUORELA, P. Antimicrobial efects of finnish plant extrats containing flavonoids and outhers phenolic compounds. Int J Food Microb., San Francisco, v. 56, p. 3-12, 2000. REBBERS, J. E.; SPPEDIE, M. K.; TYLER, V. E. Farmacognosia e farmacobiotecnologia. São Paulo: Premier, 1997. RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R. Bactérias e fungos. In: ______. Microbiologia prática: roteiro e manual. São Paulo: Atheneu, 2000. p. 73-74. RIBEIRO, A. Q.; LEITE, J. P. V.; DANTAS-BARROS, A. M. D. Perfil de utilização de fitoterápicos em farmácias comunitárias de Belo Horizonte sob a influência da legislação nacional. Rev Bras Farmacog., São Paulo, v. 15, n. 1, p. 65-70, 2005.
67
RODRIGUES, V. G. S. Cultivo e utilização de ervas medicinais – Embrapa. Disponível em: <http://www.cpafro.embrapa.br/embrapa/plantamed.PDF+PLANTA+MEDICINA+ SAUDE+ PUBLICA&HT=PT-brLR=LANG>. Acesso em: 14 mar. 2005. RODRIGUES, E.; CARLINI, E. L. A. Levantamentos etnofarmacológicos. Rev Racine, ano 12, p. 30, set./out. 2002. SCHIMITT, A. C.; ALMEIDA, A. B. P. F. de; SILVEIRA, T. A.; IWAKURA, C. T.; MENDES, K. F.; SILVA, M. C. Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro da planta Bryophyllum pinnatum Kurs (Folha-da-fortuna) colhida em Várzea Grande, Mato Grosso do Sul/Brasil. Acta Scient Vet., Porto Alegre, v. 31, n. 1, p. 55-58, 2003. SHLAES, D. Mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agents. In: MAYHALL, C. G. Hospital epidemiology and infection control. Baltimore: Williams & Wilkis, 1995. p. 965-980. STELLFELD, C. Da necessidade da regulamentação do comércio de plantas medicinais. Trib Farm., v. 23, n. 12, p. 185-189, 1995. TANGO, J. S.; TURATTI, J. M. Óleo de abacate. In: Abacate: cultura, matéria-prima, processamento e aspectos econômicos. Campinas: ITAL, 1992. p. 156-192. TANGO, J. S.; COSTA, S. L.; ANTUNES, A. J.; FIGUEIREDO, I. B. Composition du fruit et de l’ huile de differentes varieties d’avocats cultives dans I’etat de São Paulo. Fruits, Paris, v, 27, p. 143-146, 1972. TESKE, M.; TRENTINI, A. M. M. Compêndio de fitoterapia. 3. ed. Curitiba: Herbarium, 1997. TOLEDO, C. E. M. Estudos anatômicos, químicos e biológicos de casca e extrato de Barbatimão. 2002. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – UNESP, Araraquara-SP. VARGAS, A. C.; LOGUERCIO, A. P.; WITT, N. M.; COSTA, N. M.; SÁ E SILVA, M.; VIANA, L. R. Atividade antibacteriana in vitro de extrato alcoólico de própolis. Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n. 1, p. 159-163, 2004. VIKSVEEN, P. Antibiotics and the developement of resistant microorganisms. Can homeopathy be alternative? J Homeop., London, v. 92, p. 99-107, 2003.
68
VILARINO J. F., SOARES, I. C.; SILVEIRA, C. M. D.; RÖDEL, A. P. P.; BORTOLI, R; LEMOS, R. R. Perfil da automedicação em município do sul do Brasil. Rev Saúde Públ., v. 32, p. 43-49, 1998. ZAR, J. H. Biostatistical analysis. 4th ed. Upper Saddle River, NJ: Prentice-Hall, 1998. 931 p.
69
ANEXOS
70
ANEXO A – Certificado de qualidade do produto
71
ANEXO B – Certificado de qualidade do produto
72
ANEXO C – Foto do Moinho de Facas
73
ANEXO D – Foto da Balança Analítica
74
ANEXO E – Foto do processo de filtração do extrato
75
ANEXO F – Foto do processo de roto-evaporação
76
ANEXO G – Foto da estufa de ar circulante
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
