Métodos de separação e identificação de princípios ativos ... · universidade do vale do itajaÍ- univali cursos de farmÁcia e biomedicina/ccs nÚcleo de investigaÇÕes quÍmico-farmacÊuticas

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ- UNIVALI

CURSOs DE FARMÁCIA e BIOMEDICINA/CCS

NÚCLEO DE INVESTIGAÇÕES QUÍMICO-FARMACÊUTICAS – NIQFAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Métodos de separação e identificação de

princípios ativos naturais

Profs. Dr. Angela Malheiros e Rivaldo Niero

Ferramentas analíticas

Substancia de referênciapadronização

Plantas medicinais

fitocomplexo Isolamento de princípios

ativos

FitofármacosFitoterápicos

VIII Simpósio Iberoamericano de Plantas Medicinais – Itajaí – Out/2016

http://www.sciencedaily.com/images/2008/02/080227164125-large.jpg

PLANTA

TESTES

BIOLÓGICOS

EXTRATO

BRUTO

EXTRATOS

SEMIPUROS

TESTES

BIOLÓGICOS

PROCEDIMENTOS

CROMATOGRÁFICOS

ELUCIDAÇÃO

ESTRUTURAL

- FRAÇÕES

- COMPOSTOS PUROS

TESTES

BIOLÓGICOS

MODIFICAÇÃO

ESTRUTURAL

SÍNTESE DE

ANÁLOGOS

TESTES

BIOLÓGICOS

RELAÇÃO

ESTRUTURA - ATIVIDADE

TESTES

BIOLÓGICOS

ELUCIDAÇÃO

ESTRUTURAL

ELUCIDAÇÃO

ESTRUTURAL


http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Taxol.svg


Ferramentas analíticas

MÉTODOS FÍSICOS DE ANÁLISE

NÃO DESTRUTIVOS DESTRITIVOS

ESP. MASSAS

CHN

ULTRAVIOLETA-VISÍVEL (UV-VIS)

INFRAVERMELHO (IV)

RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

Tecnicas hifenadas

– CG, CLAE

MÉTODOS QUÍMICOS

REAÇÕES

RAIO X


http://i142.photobucket.com/albums/r111/pvaraujo/Papaver-somniferum-fruto.jpg


MÉTODOS QUÍMICOS


ABSORÇÃO DE RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA

EFEITOS ESPECÍFICOS

UVIVRMN

Transições

eletrônicas

Alterações

vibracionais

Inversão de

spin

• Ionização e fragmentação

• gráfico contendo as massas dos

fragmentos carregados positivamente

EM


AMOSTRA

Reações, UV, IV,

MS, RMN 1H, 13C

DEPT, HSQC,

HMQC, HETCOR

COSY TOCOSY

HOHAHA

HMBC

HETCORLR

Raio X

Conhecer antecedentes

número Insaturações,número anéis

Existência grupos funcionais

Esqueletos

Avaliação inequívoca C/H

Correlação entre os distintos

fragmentos mediante

conectividade homonucleares

Avaliação carbonos não

protonados, conectividade de

fragmentos moleculares através de

carbonos, Sequência C-C

Esterioquímica

absoluta

VIII Simpósio Iberoamericano de Plantas Medicinais –

Itajaí – Out/2016

http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Rutin.png

– Classificação botânica: Família, gênero, espécie

Investigação preliminar

AMOSTRA


* Auxílio profissionais Botânica

– Levantamento bibliográfico

Drimys brasiliensis

* Bases de dados para estabelecer possíveis antecedentes


-Levantamento bibliográfico:

* Principais classes de met. Secundários (Review dados espectroscópicos)

* Atividade biológica

Flavonoides

Antraquinonas

Saponinas

Alcalóides

Esteróides

Taninos

Terpenos

Hidrocarbonetos

Antocianidinas

Cumarinas

Base de dados: web of science, Science direct; pubmed, science finder; etc.


Taninos hidrolisáveis

Alcalóides indólicos

e isoquinolínicos

Condensação

Polissacarídeos

Heterosídeos

Triptofano

Fenilalanina

Tirosina

Ác. gálicoCiclo do

Ác. cítrico

Via

Mevalonato

Ornitina

Lisina

Isoprenóides

Ác. cinâmico

Fenilpropanóides

Ácido chiquímico Acetil-CoA

Ligninas

Lignanas

CumarinasAlcalóides pirrolidínicos,

tropânicos e quizinolínicos

Terpenóides

Esteróis

Antraquinonas,

Flavonóides e

Taninos condensados

Protoalcalóides,

Alcalóides isoquinolínicos

e benzilisoquinolínicos

GLICOSE

Ác. graxo

- Rota biossintética


- Polaridade solventes extração


AU

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

Minutes

20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00 42,00 44,00 46,00 48,00 50,00

CCD CLAE

- Cromatografia

CCD – utilização de reveladores seletivos

CLAE – Detector UV – perfil absorção

AU

0,20

0,40

0,60

nm

200,00 250,00 300,00 350,00

204,4

256,1355,9


Informações preliminares

• O composto DW-1 foi isolado da fração de clorofórmio

• Sólido branco, solúvel em CHCl3, CH2Cl2, Me2CO e EtOH,

com ponto de fusão 47-480C.

• Classificação botânica

Família: Winteraceae

Gênero: Drimys

Espécies: angustifolia

brasiliensis

• Levantamento bibiográfico Sesquiterpenos drimanos

flavonoides

FM: hexano:AcOEt 7:3

Anisaldeído sulfúrico



Extrato clorofórmico das cascas de Drimys brasiliensis

H-C=O

H aromáticos e

H olefínicos

H-C-O

H alifáticos

AMOSTRA

UV, IV, MS,

RMN 1H, 13C

DEPT, HETCOR

HSQC, HMQC

COSY

TOCOSY

HOHAHA

HETCORLR,

HMBC

INADEQUATE


número Insaturações,número anéis

Existência grupos funcionais

Esqueletos

Avaliação inequívoca C/H

Correlação entre os

distintos fragmentos

mediante conectividade

homonucleares

Avaliação carbonos não

protonados, conectividade

de fragmentos moleculares

através de carbonos

Sequência C-C

ES

TA

BE

LE

CIM

EN

TO

ES

TR

UT

UR

A M

OL

EC

LA

R


ETAPAS PARA ESTABELECIMENTO DA ESTRUTURA MOLECULAR

1 – FÓRMULA MOLECULAR

2 – CONSTITUIÇÃO MOLECULAR

3 – ESTEREOQUÍMICA MOLECULAR

O HO

H

O HO

H

H

C15H22O2

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3

Análise elementar

EMAR

RMN

RMN

bidimensionais

RMN

Constantes de acoplamento (J)

NOESY, ROESY


1 – FÓRMULA MOLECULAR

- Espectro de massas de alta resolução

- Espectro de massas de baixa resolução

-RMN13C / DEPT

- IV OH, CO, COOH

O HO

H

H

M+ = 234

3C + 5CH + 4CH2 + 3CH3 = C15H22 = 202

234 – 202 = 32 2 O C15H22O2


M+ = 234

2 – CONSTITUIÇÃO MOLECULAR

- Esqueleto + localização das funções

-ESQUELETO CARBONADO

DIRETAMENTE: INADEQUATE, 2D-INADEQUATE

Experimentos de RMN que permitem estabelecer diretamente as conectiviade carbono-carbono

INDIRETAMENTE: Correlações bidimensionais heteronucleares H-C (uma ligação ou várias ligações) ou Correlações homonucleares H-H

Espectros que permitem estabelecer, respectivamente, conectividades de carbonos com hidrogênios e outros carbonos próximos.

LOCALIZAÇÃO DAS FUNÇÕES

IV, RMN, UV, etc


3 – ESTEREOQUÍMICA MOLECULAR

-ESTEREOQUÍMICA RELATIVA

DETERMIAÇÃO DE EFEITOS NOE HOMO E HETERONUCLEARES

Localização de átomos espacialmente próximos

ANÁLISES DE ACOPLAMENTO A TRÊS LIGAÇÕES

Dterminação de ângulos diedro H/H e ou H/C

ESTEREOQUÍMICA ABSOLUTA

Correlação química com substâncias conhecidas

Aplicação de métodos espectro-ópticos (DC)

Difração de raio X


ETAPAS DE DESIGNAÇÃO INEQUÍVOCA

(INTERPRETAÇÃO) DE ESPECTROS DE RMN

Numerar os sinais do espectro de carbono-13 diferenciando claramente os que correspondem metilas, metilenos, metinos e carbonos quaternários.

Analisar a correlação direta H-C numerar correspondentemente todos os sinais de H, associando cada átomo de carbono com os seus hidrogênios.

Designar diretamente os sinais dos espectros monodimensionais de hidrogênio e de carbono que se considerem inequívocas, relacionando as correlações bidimensionais diretas de H-C

Analisar o espectro e correlação homonuclear H/H COSY tentando localizar sucessões de H interconectados vicinais. Designar os sinais correspondentes e transladar a informação obtida no espectro de carbono

Analisar a correlação indireta H/C (a duas ou mais ligações), determinando todas as conectividades observáveis para cada carbono e cada hidrogênio.

Efetuar a proposta de designação completa dos sinais (constituição molecular) e revisar até que todas as informações concordem.

CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

9--drim-7-en-11,12-dial (poligodial).


Espectro no IV (pastilha de KBr) de DW-1

2928 cm-1 metila.

2850 e 2726 cm-1 C-H aldeído

(ressonância de Fermi).

1722 e 1680 cm-1 C=O, 1642cm-1

C...C 1462 cm-1 C-O. O H

O

H

H


O espectro de massas de baixa resolução

picos em m/z 234 [M+], 219 [M+ - CH3],

206 [M+ - CO], 191 [206 – Me],

121 [C9H13 terpenos]

e pico base em m/z 109,

Espectro de massas (70 eV) do DW-1 C

C

H OH

O

C

C

H O

O

H

+

m/z 234

- CO

H

CO H

m/z 206

+.

H

CO H

H

CO H

+

CH3.

m/z 191

CHO

+

C

HO

m/z 122

- H

CO

+

m/z 121

-

m/z 136

CO H

m/z 110

+

- H

C O +

m/z 109

O HO

H

H


Espectro de RMN 1H (200 MHz, CDCl3/TMS) do DW-1

O HO

H

H

3C + 5CH + 4CH2 + 3CH3 = C15H22 = 202

234 – 202 = 32 2 O

Espectro de RMN 13C (50 MHz, CDCl3/TMS) do DW-1

Poligodial ?


CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

Espectro de NOESY (200 MHz, CDCl3) do DW-1

11 9

H

H

OH

O

15

1413

12

11

10

98

7

6

5

4

3

2

1

H

O

O

H

H15

1413

12

11

10

98

7

6

5

4

3

2

1

15


CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15

CHO

CHO

12

34

5

67

89

10

11

12

1314

15


Análise Raio X – Informação estrutural completa -

Estereoquímica absoluta

Rotação ótica e Dicroísmo circular – Quando aplicável fornecem

estereoquímica absoluta

Correlação química – A partir de um composto com a

estereoquímica absoluta conhecida, pode ser revelado a

estereoquímica de outra molécula.

Síntese – Suporte definitivo para a estrutura e estreoquímica




http://1.bp.blogspot.com/_QQMDOYiSM50/S_7k4zZlaRI/AAAAAAAAAJE/flq5nq0DjO0/s1600/diabetes_structure_large.jpg

DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL

Informação UV IV RMN RX EM

F. Molecular * ***

G. Funcional * *** *** *

Conectividade * * *** *** *

Geometria * * *** *** *

Estereoquímica * * *** ***

*** Excelente * Moderado





BASES DE DADOS

http://www.acdlabs.com/products/com_iden/elucidation/


http://www.acdlabs.com/products/com_iden/elucidation/

Naproc-13

http://c13.usal.es/c13/usuario/views/inicio.jsp?lang=es&country=ES



http://webbook.nist.gov/chemistry/


http://webbook.nist.gov/chemistry/

http://sdbs.db.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi


http://www.colby.edu/chemistry/cmp/cmp.html


http://www.univali.br/ensino/pos-graduacao/mestrado/programa-de-pos-graduacao-em-ciencias-farmaceuticas


http://www.univali.br/ensino/pos-graduacao/mestrado/programa-de-pos-graduacao-em-ciencias-farmaceuticas

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Editora univali

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E-mail: [email protected]


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Agradecimentos: UNIVALI – CYTED - CNPq


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