MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO … · Farmacognosia (UFRN), Laboratório de Biotecnologia de polímeros naturais (UFRN), Laboratório de Pesquisa em Petróleo

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, CITOTOXICIDADE E AÇÃO ANTIMICROBIANA

DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE

MICRO-ORGANISMOS SUPERINFECTANTES DO MEIO AMBIENTE BUCAL

MARIA REGINA MACEDO COSTA

NATAL/RN

2016

Maria Regina Macedo Costa




Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde

Orientador: Kenio Costa de Lima

NATAL/RN

2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Costa, Maria Regina Macedo.

Caracterização química, citotoxicidade e ação antimicrobiana de extratos vegetais sobre micro-organismos superinfectantes do

meio ambiente bucal / Maria Regina Macedo Costa. - 2016.

153f.: il.

Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de

Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2016.

Orientador: Prof. Dr. Kenio Costa de Lima.

1. Microbiologia - Tese. 2. Fitoterapia - Tese. 3.

Cromatografia em Camada Delgada - Tese. 4. Toxicidade - Tese. I.

Lima, Kenio Costa de. II. Título.

RN/UF/BSCCS CDU 615.011

iii ii

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde:

Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito

iii

Maria Regina Macedo Costa




Aprovada em: __/__/____

Banca examinadora:

Presidente da Banca: Prof. Dr. Kenio Costa de Lima

Membros da Banca:

________________________________________

Prof. Dr. Kenio Costa de Lima

________________________________________

Profa. Dra. Aurigena Antunes de Araújo

________________________________________

Profa. Dra. Ruthineia Diógenes Alves Uchoa Lins

________________________________________

Profa. Dra. Jozinete Vieira Pereira

________________________________________

Profa. Dra. Edja Maria Melo de Brito Costa

MEMBROS SUPLENTES

________________________________________

Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves

________________________________________

Prof. Dr. Fábio Roberto Dametto

________________________________________

Profa. Dra. Ana Carolina Lyra de Albuquerque

________________________________________

Profa. Dra. Francinalva Dantas de Medeiros

iv

http://www.escavador.com/sobre/461988/francinalva-dantas-de-medeiros

DEDICATÓRIA

A Deus, Senhor e Salvador da minha vida,

que conhece cada um dos meus sonhos

Quer deitada ou quer andando

Sabe todos os meus passos

E antes que haja em mim palavras

em tudo me conhece

“Porque Dele por Ele e para Ele são todas as coisas. Glória, pois, a Ele

eternamente” Romanos 11:36

Aos meus pais, José Macêdo Costa e Rejane Costa Macêdo,

graduados em paciência, especialistas em amor incondicional,

mestres em doação e doutores na arte de encurtar a distância entre o

sonho e a vida sonhada. Não há vida de fé que não te coloque em provas

durante a jornada...mas não há provas que não nos tenhamos vestidos

da Graça.

VOCÊS SÃO O MELHOR DE DEUS PARA MIM

Eduardo Roberto de Lucena...

Deus mudou o teu caminho até juntares ao meu

e guardou tua vida, separando-a para mim.

Para onde tu fores, irei; onde tu repousares,

repousarei...

v

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Kênio Costa de Lima, o orientador, amigo e anjo. Antes de

conhecê-lo eu achava que sabia que professora eu gostaria de ser...mas

através do seu exemplo e excelência pude compreender o educador que todo

aluno merece ter. E diariamente, nosso conviver, me faz convicta de que a

docência e a responsabilidade acadêmica dependem da aplicação dos nossos

dons... No tempo, no espaço, mas sobretudo no interior da alma...alheia. Que

Deus me permita sempre o honrar. Professor, depois de pai, é o nome mais

nobre e doce que um homem pode dar a outro. És único para mim.

Às Profa. Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira e Profa. Dra. Andressa

Feitosa Bezerra de Oliveira por me iniciarem no Programa Voluntário de

Iniciação Científica e Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica

desde o segundo período da minha graduação, me permitindo iniciar a

pesquisa e compartilhando o vasto conhecimento. Muito obrigada por sempre

enxergarem em mim uma docente em potencial, por inúmeras oportunidades,

amizade e imensa generosidade.

Ao Prof Dr. Fábio Correia Sampaio e Prof Dr. Franklin Delano Soares Forte

pelo aprendizado e incentivo, me permitindo através das monitorias e projetos

de extensão me dedicar, ao que eu já sabia... Era a melhor porção que Deus

tinha para mim (docência).

.À todos os professores e todos os funcionários do Departamento de

Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela

receptividade, pelo carinho, pelo favor, pelas experiências compartilhadas...por

tornar precioso e leve os quase 1500 trechos de estrada. Por permitirem que

essa seja a minha segunda casa e muito mais do que pedi ou jamais pensei.

Não estaria comemorando essa Graça sem a colaboração e apoio de cada um

deste departamento.

vi

Aos queridos e sempre presentes Ângela Maria de Medeiros, Jânio

Rodrigues Rêgo, Pedro Henrique Sette de Souza, Laércio Almeida de Melo,

Meily de Mello Sousa, Yan Nogueira Leite de Freitas, Victor de Farias, Valdison

Ribeiro... pelo carinho, dedicação, conforto em momentos dolorosos, por se

alegrarem com minhas vitórias, pelo oportunidade de aprender e pelo privilégio

da amizade.

À aluna Isabelle Helena Gurgel de Carvalho pela disponibilidade, pela

companhia nas noites de laboratório, pelas mãos estentidas, pela dedicação e

pela grata e feliz amizade. Através da sua vida agradeço a cada um

(graduação e pós graduação) que se apaixonou pela Microbiologia e

Fitoterapia, se doou aos experimentos, a pesquisa e muito também me

ensinaram.

À colaboração dos Laboratório de Microbiologia (DOD-UFRN), Laboratório de

Farmacognosia (UFRN), Laboratório de Biotecnologia de polímeros naturais

(UFRN), Laboratório de Pesquisa em Petróleo (UFRN), Laboratório de

Microbiologia Clínica (UFRN), Laboratório de Cultura de Células (UFRN),

Laboratório de Microbiologia (Universidade Estácio de Sá- Rio de Janeiro/RJ),

e Laboratório de Microbiologia (UFRN) e professores, alunos e funcionários

ligados aos mesmos.

À todos os membros da Primeira Igreja Batista de Intermares, por tantos

anos de convivência, pelos joelhos dobrados e pelo levantar em oração pela

minha vida. Quando o sonho é divino, o Rei manda a provisão. Amo vocês.

Às minhas “mães” Dilá e Lúcia (Dinda) e aos meus “pais” Jorge e Rogério

(Dindo), pelo profundo amor... em espírito e em oração estamos sempre

juntos.

À todos os meus alunos, aos que ainda virão... aos meus amados

afilhados (93, 100, 101)... Não houve obstáculos na minha graduação (sim, eu

já esperava por vocês) e na pós graduação que pudesse ser difícil a superar

quando eu sabia que teria brevemente pessoas a cuidar, ensinar, transformar

vii

e ser transformada. Vocês são resposta, promessa, saudade! Vocês são meus

sábios professores, meu conto de fadas, meu final feliz!

Aprendi com vocês que é possível amar a todos como se apenas UM

houvesse. Meu trabalho...Meu ministério.

À todos aqueles (incontáveis) que direta ou indiretamente contribuíram para a

realização deste trabalho e sobretudo para a minha formação pessoal e

acadêmica.

MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS

viii

“OS JOVENS SE CANSAM E SE FATIGAM, E OS MOÇOS DE EXAUSTOS

CAEM, MAS OS QUE ESPERAM NO SENHOR RENOVAM AS SUAS

FORÇAS, SOBEM COM ASAS COMO ÁGUIAS, CORREM E NÃO SE

CANSAM, CAMINHAM E NÃO SE FATIGAM...” (ISAÍAS,40:30-31)

POR ISSO MESMO, EMPENHEM-SE PARA ACRESCENTAR

À SUA FÉ A VIRTUDE;

À VIRTUDE O CONHECIMENTO;

AO CONHECIMENTO O DOMÍNIO PRÓPRIO;

AO DOMÍNIO PRÓPRIO A PERSEVERANÇA;

À PERSEVERANÇA A PIEDADE;

À PIEDADE A FRATERNIDADE;

E À FRATERNIDADE O AMOR...

PORQUE, SE ESSAS QUALIDADES EXISTIREM

E ESTIVEREM CRESCENDO EM SUAS VIDAS,

ELAS IMPEDIRÃO QUE VOCÊS,

NO PLENO CONHECIMENTO DE NOSSO SENHOR

JESUS CRISTO, SEJAM INOPERANTES E IMPRODUTIVOS. (2 PEDRO 1:5-8)

ix ix

https://www.bibliaonline.com.br/nvi/2pe/1/5-8

RESUMO

A presente pesquisa teve como objetivo avaliar in vitro a ação antimicrobiana dos extratos da raiz de Solanum paniculatum (jurubeba), da folha de Spondias mombin (cajá) e do fruto de Lycium barbarum (gojiberry) sobre micro-organimos superinfectantes do meio ambiente bucal, bem como analisar fitoquimicamente os materiais vegetais e seus potenciais efeitos citotóxicos. O screening fitoquímico dos extratos foi investigado por reações químicas e Cromatografia em Camada Delgada (CCD). Nas análises por CCD foram utilizadas placas de sílica gel 60; AcOEt:Ácido fórmico:MeOH:Água (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH:Ácido fórmico:Água (3:1:1, v/v/v), Clorofórmio:MeOH (8:2, v/v), tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (5:2,5:0,25, v/v/v), acetato de etila:n-propanol:ácido acético: água (4:2:2:0,6, v/v/v/v), como fases móveis; e para detecção dos metabólitos secundários, usou-se vanilina sulfúrica, solução FeCl3 1 %, Reagente Natural A 0,5%, Reagente Natural A 0,2%/UV 365 nm, KOH a 5%(v/v), e Dragendorff. Posteriormente, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima, Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) Cinética bactericida (CF) e fungicida (CF) dos extratos sobre Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans (cepas ATCC e isolados clínicos). Ao nível de 5% de significância aplicou-se o teste t-Student ou de Mann-Whitney (p<0,05). Cada ensaio foi realizado em duplicata e utilizou-se como controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12% e nistatina 100.000 U.I. O potencial citotóxico dos extratos foi avaliado através da viabilidade celular de fibroblastos da linhagem 3T3. As análises por CCD sugeriram a presença de ácidos fenólicos, taninos, saponinas, alcaloides, flavonoides, ácido elágico, quercetina, canferol, cumarinas e carboidratos. Todos os extratos apresentaram ação bacteriostática e fungistática. S. paniculatum apresentou desempenho médio superior ao controle positivo e estatisticamente significativo até a diluição 1:16 (31,25 mg/mL) sobre P. aeruginosa ATCC. S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina e estatisticamente significativo até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. Lycium barbarum apresentou desempenho médio superior ao controle positivo e estatisticamente significativo até a diluição 1:4 (125 mg/mL) e 1:16 (31,25 mg/mL) sobre Enterococcus faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. S. paniculatum apresentou ação bactericida e fungicida sobre E. faecalis (ATCC e AB) e C. albicans (ATCC e AB) e efeito antiaderente sobre todos os micro-organismos testados até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL), exceto para S. aureus ATCC (1:8) e P. aeruginosa ATCC (1:2). S. mombin apresentou ação bactericida sobre E. faecalis (ATCC e AB), fungicida sobre C. albicans (ATCC e AB) e ação antiaderente sobre todas as bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis (ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL). Lycium barbarum não apresentou ação bactericida e fungicida, entretanto apresentou efeito antiaderente até a diluição 1:32 (15,65 mg/mL) sobre P. aeruginosa ATCC. Os extratos apresentaram citotoxicidade em cultura de células nas concentrações testadas (100 mg/ mL, 31,25 mg/mL, 15,65 mg/mL, 7,81 mg/mL, 6,67 mg/mL, 1,95 mg/mL e 0,97 mg/mL) suscitando a necessidade de testes que indiquem quantas vezes os produtos são mais eficazes frente a determinados alvos do

x

que sobre células humanas. Conclui-se que S. paniculatum, Spondias mombin e Lycium barbarum apresentaram significativa ação antimicrobiana, justificada pelos achados farmacológicos, estimulando a pesquisa de substâncias naturais bioativas, alvo-específicas, para tratamento de infecções bucais persistentes ou refratárias.

Palavras-chave: Microbiologia; Fitoterapia; Cromatografia em camada delgada; Toxicidade

xi xi

ABSTRACT

This study aimed to evaluate the in vitro antimicrobial activity of the root extract of Solanum paniculatum (jurubeba), the leaf of Spondias mombin (hog or java plum) and the fruit of Lycium barbarum (gojiberry) on superinfecting micro-organisms in the oral environment, as well as phytochemically analyze plant material and potential cytotoxic effects. The phytochemical screening of the extracts was carried out by chemical reactions and Thin Layer Chromatography (TLC). In the analysis by TLC silica gel 60 plates were used; EtOAc: formic acid: MeOH: Water (10: 0.5: 0.6: 0.2 v / v / v / v), BuOH: formic acid: water (3: 1: 1, v / v / v ) Chloroform: MeOH (8: 2, v / v) toluene: ethyl acetate: formic acid (5: 2.5: 0.25 v / v / v) and ethyl acetate: n-propanol: acid acetic acid: water (4: 2: 2: 0.6 v / v / v / v) as mobile phase; and for detection of secondary metabolites the following were used: vanillin sulfuric acid, FeCl 3 solution of 1%, 0.5% Natural Reagent A, Reagent A 0.2% Natural UV / 365 nm KOH 5% (v / v) and Dragendorff . Subsequently, the minimum inhibitory concentration, Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA) Bactericidal Kinetics (BK) and fungicidal (FC) were determined from the extracts of Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans (ATCC and clinical isolates). The t-Student test or Mann-Whitney test was applied with 5% significance (p <0.05). Each assay was performed in duplicate and chlorhexidine digluconate at 0.12% and nystatin 100,000 I.U. were used as positive controls. The cytotoxic potential of the extracts was assessed by cell viability from fibroblasts from the 3T3 cell line. Analysis by TLC suggested the presence of phenolic acids, tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, ellagic acid, quercetin, kaempferol, coumarins and carbohydrates. All extracts showed bacteriostatic and fungistatic action. S. paniculatum demonstrated a higher mean performance than the positive control and was statistically significant up till the dilution 1:16 (31.25 mg / mL) of P. aeruginosa ATCC. S. mombin had a mean performance superior to chlorhexidine and was statistically significant at the dilutions 1: 512 (0.97 mg / mL) and 1: 256 (1.95 mg / mL) of E. faecalis ATCC and P. aeruginosa ATCC, respectively. Lycium barbarum showed a mean performance higher than the positive control and was statistically significant at the 1:4 dilution (125 mg / mL) and 1:16 (31.25 mg/mL) of Enterococcus faecalis ATCC and P. aeruginosa ATCC, respectively. S. paniculatum presented bactericidal and fungicidal action on E. faecalis (ATCC and OE) and C. albicans (ATCC and OE) and non-stick effect on all microorganisms tested until the dilution 1: 512 (0.97 mg/mL), except for S. aureus ATCC (1:8) and P. aeruginosa ATCC (1: 2). S. mombin showed bactericidal action against E. faecalis (ATCC and OE) and C. albicans (ATCC and OE) and non-stick action on all tested bacteria, especially P. aeruginosa ATCC and E. faecalis (ATTC and OE) until the dilution 1: 512 (0.97 mg/mL). Lycium barbarum showed no bactericidal and fungicidal action, but showed non-stick effect until the 1:32 dilution (15.65 mg/mL) of P. aeruginosa ATCC. The extracts showed cytotoxicity in cell culture at the concentrations tested (100 mg / mL, 31.25 mg / mL, 15.65 mg / mL, 7.81 mg / mL, 6.67 mg / mL, 1.95 mg / mL and 0.97 mg / mL) indicating the need for tests that indicate how much more the tested products are effective against the determined targets than the human cell. It can be concluded that S. paniculatum, Spondias mombin and Lycium barbarum showed significant antimicrobial action,

xii

justified by the pharmacological findings, thus stimulating the need for further research of target-specific, bioactive natural substances in the treatment of persistent or refractory oral infections.

Keywords: Microbiology; Phytotherapy; Thin layer chromatography; Toxicity

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AB: Ambiente Bucal

ATCC: American Type Culture Collection

BHI: Brain Heart Infusion

C. albicans: Candida albicans

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

CB: Cinética Bactericida

CIM: Concentração Inibitória Mínima

CIMA: Concentração Inibitória Mínima de Aderência

E. faecalis: Enterococcus faecalis

OMS: Organização Mundial de Saúde

PPGCSa: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa

SUS: Sistema Único de Saúde

S. aureus: Staphylococcus aureus

UFC: Unidade Formadora de Colônia

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

UFRJ: Universidade Federal do Rio de Janeiro

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da

atividade antimicrobiana dos extratos sobre cada amostra ensaiada 27


Cinética Bactericida e Fungicida dos extratos testados para cada amostra

ensaiada

29


Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos extratos sobre cada amostra

ensaiada

31

Figura 1 (Artigo 5.1): TLC of ethanolic extract of S. paniculatum roots. 57

Figura 1 (Artigo 5.3): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da

fase móvel A 92


fase móvel B 92


fase móvel A 110


fase móvel B 110

xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Preliminary phytochemical screening of S. paniculatum roots

57

xvi

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 19

2 JUSTIFICATIVA 22

3. OBJETIVOS 23

3.1 OBJETIVO GERAL 23

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 23

4 MÉTODOS 24

4.1 PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE SOLANUM PANICULATUM LINN

(JURUBEBA), SPONDIAS MOMBIN (CAJÁ) E LYCIUM BARBARUM

LINN (GOJIBERRY)

24

4.1.1 Local de execução e Obtenção do material

24

4.1.2 Obtenção dos extratos da raiz de Solanum paniculatum e folhas de

Spondias mombin e frutos de Lycium barbarum e determinação de

sua concentração

24

4.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA 25

4.2.1 Triagem Fitoquímica 25

4.2.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 25

4.3 ENSAIOS IN VITRO DOS EXTRATOS DE SOLANUM PANICULATUM

LINN., SPONDIAS MOMBIN E LYCIUM BARBARUM

26

4.3.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima dos extratos de

Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum

26

4.3.2 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida do extrato de


28

4.3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos

extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin

e Lycium barbarum

30

4.3.4 Avaliação do potencial citotóxico dos extratos de Solanum

paniculatum, Spondias mombin e Lycium barbarum sobre

fibroblastos da linhagem 3T3

32

4.3.5 Análise Estatística 33

5 ARTIGOS PRODUZIDOS 34

6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES 111

7 REFERÊNCIAS 114

8 APÊNDICE 117

9 ANEXO 150

xviii

19

1 INTRODUÇÃO

No cenário atual, deparamo-nos com informações diárias que refletem a

necessidade de continuar a busca por inovações terapêuticas para o cuidado

em saúde. Veem-se rotineiramente infecções nosocomiais causadas por

superbactérias, com consequências catastróficas. Em acréscimo, a indústria

farmacêutica mundial tem diminuído o seu investimento na descoberta de

novas drogas antimicrobianas ou para doenças negligenciáveis, acarretando a

falta de inovação terapêutica neste seguimento, o que poderá levar a uma

dificuldade no tratamento das afecções em médio e longo prazo1.

Nesse sentido, a humanidade tem continuadamente se beneficiado de

produtos de origem natural, ou derivados, para a prevenção e/ou tratamento de

um amplo espectro de doenças que afetam os seres humanos. A descoberta

de metabólitos secundários de plantas, produtos de algas marinhas, peptídeos

antimicrobianos produzidos por fungos, e tantas outras fontes, serve de base

para o desenvolvimento da indústria farmacêutica e, consequentemente, cria

novas modalidades e alternativas terapêuticas, sobretudo para a Odontologia.

No que diz respeito ao ambiente bucal, trata-se de um reservatório que

pode abrigar uma composição heterogênea de micro-organismos, inclusive, os

considerados superinfectantes desse ambiente, comumente associados a

infecções oportunistas e persistentes, tais como: micro-organismos entéricos,

pseudomonados, do gênero estafilococos e leveduras.

Enterococcus faecalis é uma bactéria gram-positiva que faz parte da

microbiota do trato gastrointestinal e urinário2 . E. faecalis é responsável por

mais de 90% dos casos de infecções causadas por bactérias do gênero

Enterococcus3, incluindo endocardite bacteriana, infecções no trato urinário4,

além de infecções endodônticas5,6,7, podendo estar associada à cárie e a

doença periodontal2,7,8.

Os microrganismos do gênero estafilococos não são considerados parte

da microbiota residente bucal humana, mas podem atuar como agentes

patogênicos oportunistas em pacientes submetidos a tratamento sistêmico

prolongado com agentes antimicrobianos ou imunossupressores9,10.

Candida spp. podem ser consideradas leveduras comensais do

ambiente bucal. C. albicans é a espécie predominante, representando 60 a

20

70% de todos os isolamentos11,12,13 em boca. As razões para o estabelecimento

de infecções causadas por esse micro-organismo têm sido associadas à

imunossupressão, lesões nas mucosas, má higiene bucal e tratamento a longo

prazo com antibióticos ou corticóides14,15.

Pseudomonas aeruginosa trata-se de um bacilo gram negativo,

responsável por 70% das infecções por pseudomonas no ser humano; a

exemplo do S. aureus, é uma bactéria oportunista e possui diversos fatores de

patogenicidade, tais como: capacidade de se organizar em biofilme, produção

de enzimas extracelulares e toxinas, mecanismos de quorum sensing e

resistência a muitos antimicrobianos16,17 .

Consi*derando o aumento da ocorrência de infecções bucais

persistentes ou refratárias relacionadas com micro-organismos

superinfectantes do meio ambiente bucal, é requerido o desenvolvimento de

soluções naturais alternativas e economicamente viáveis, substituindo

antimicrobianos usualmente utilizados.

No Brasil, existem várias espécies de plantas nativas potencialmente

medicinais, tais como Solanum paniculatum Linn. Essa espécie é conhecida

popularmente por “jurubeba” e está listada na Farmacopeia Brasileira18 e

pertence a "Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema

Único de Saúde (Renisus)”19 por apresentar potencial em gerar produtos de

interesse do Ministério da Saúde. A raiz de jurubeba é considerada a parte

mais ativa da planta. No que se refere a aspectos científicos, são constatadas

ação antibacteriana, antifúngica, antiviral, moluscicida, anticancerígena, anti-

inflamatória, antioxidante, diurética, antidiarreica, hepatoprotetora,

gastroprotetora e antiulcerogênica20-25 .

Spondias mombin, popularmente conhecida como “cajá”, é amplamente

utilizada na medicina popular por apresentar componentes com atividade anti-

inflamatória26, embora também seja utilizada no tratamento da diarreia aguda,

do diabetes mellitus e da anemia27.

Os frutos de Lycium barbarum Linn, também chamado de “gojiberry” ou

“wolfberry”, é um tradicional fitoterápico de origem chinesa que tem sido

utilizado por mais de 2300 anos na Ásia Oriental28 No que se refere a

evidências científicas, possui relatos de ação antioxidante, imunomodulador,

https://translate.googleusercontent.com/translate_f

21

antitumoral, neuroprotetor, radioprotetor29,30, antidiabetes, anti-osteoporose,

antifatiga28 e antifúngica e antibacteriana31.

Nesse sentido, torna-se de grande valia a realização deste estudo, para

a determinação da ação antimicrobiana, antiaderente, bactericida e fungicida

dos extratos de Solanum paniculatum Linn (jurubeba), Spondias mombin (cajá)

e Lycium barbarum Linn (gojiberry). Ademais, é de fundamental importância a

investigação dos seus perfis fitoquímicos e citotoxicidade, favorecendo a

aplicação segura de substâncias naturais bioativas sobre micro-organismos

associados com infecções persistentes ou refratárias.

22

2 JUSTIFICATIVA

A utilização de plantas na prevenção e tratamento de doenças

infecciosas bucais e como agente antibiofilme, continua a ser valorizada em

muitas partes do mundo, é recomendado pela Organização Mundial de Saúde

(OMS) (1987), e em nosso país muitos estudos têm sido desenvolvidos visando

avaliar o uso popular de plantas na Odontologia, tornando possível a

identificação de espécies vegetais com potencial atividade biológica.

Pesquisas sobre novos agentes antimicrobianos são o resultado da

colaboração interdisciplinar baseada no conhecimento empírico oriundo de

“raizeiros”, “mateiros”, “rezadeiras”, erveiros, curandeiros, pajés e outros; aliada

à etnofarmacologia, botânica, química dos compostos naturais, Microbiologia,

Farmacologia e clínica. Muitos extratos e seus compostos fitoquímicos, exibem

in vitro e in vivo propriedades antimicrobianas estimulando a pesquisa de

substâncias naturais bioativas para tratamento de infecções bucais associadas

a micro-organismos endógenos e superinfectantes do ambiente bucal.

Além disso, tomando como base o conceito de Atenção Primária de

Saúde, a Fitoterapia se configura como uma ótima alternativa terapêutica e de

grande aceitação social, estando, portanto, este recurso em consonância com

os pressupostos do Sistema Único de Saúde.

A utilização das plantas medicinais, nos Programas de Atenção Básica,

só viria a melhorar a assistência à saúde, sobretudo em Odontologia na medida

em que tal uso é acorde com os princípios da Estratégia de Saúde da Família,

visando à integralidade das ações e a utilização de uma tecnologia prática e

acessível a todas as famílias e comunidades, com um custo reduzido, não

levando a descontinuidade das ações.

Logo, justifica-se a realização do presente estudo e o investimento no

desenvolvimento de soluções naturais alternativas e economicamente viáveis,

inclusive, para o tratamento de infecções bucais persistentes ou refratárias.

Além disso, vislumbra-se a possibilidade concreta de inserção da prática de

uso de fitoterápicos e das plantas medicinais como recurso terapêutico nas

Unidades Básicas de Saúde ofertada pelo Sistema Único de Saúde (SUS),

mormente representada pela Estratégia de Saúde da Família.

23

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

A presente pesquisa teve como objetivo avaliar a ação antimicrobiana,

bactericida, fungicida e antiaderente, dos extratos vegetais de Solanum

paniculatum Linn (jurubeba), Spondias mombin (cajá) e Lycium barbarum Linn

(gojiberry) sobre micro-organismos superinfectantes do meio ambiente bucal,

bem como investigar os seus perfis químicos e citotoxicidade.

3.2 Objetivos Específicos

3.2.1 Realizar um screening fitoquímico dos extratos de Solanum

paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn através de

reações químicas e Cromatografia em Camada Delgada (CCD).

3.2.2 Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), Cinética

Bactericida (CB) e Fungicida (CF) dos extratos de Solanum paniculatum Linn,

Spondias mombin e Lycium barbarum Linn frente Enterococcus faecalis,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, ATCC e

isolados do ambiente bucal.

3.2.3 Determinar a Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)

dos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium

barbarum Linn frente Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, ATCC e isolados do ambiente

bucal.

3.2.4 Avaliar o potencial citotóxico dos extratos de Solanum paniculatum

Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn sobre fibroblastos da linhagem

3T3.

24

4 MÉTODO

4.1 PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE SOLANUM PANICULATUM LINN

(JURUBEBA), SPONDIAS MOMBIN (CAJÁ) E LYCIUM BARBARUM LINN

(GOJIBERRY)

4.1.1 Local de execução e Obtenção do material

As raizes de Solanum paniculatum foram coletadas na cidade do Natal –

RN (Tabua- RN S 5º 51’ 30” W 5º 51’ 30”). A preparação do extrato de S.

paniculatum Linn. foi conduzida no Laboratório de Farmacognosia,

Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, UFRN.

As folhas de Spondias mombin foram coletadas em uma fazenda

particular na região de Tábua em Dom Marcolino Dantas/ RN (Tabua- RN S S°

28’ 14’’ W 35° 27’ 37’’). A preparação do extrato de Spondias mombin foi

conduzida no Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia,

Centro de Ciências da Saúde, UFRN.

Os frutos secos de Lycium barbarum foram obtidos em loja

especializada na cidade do Rio de Janeiro-RJ. A preparação do extrato de

Lycium barbarum Linn foi conduzida no Laboratório de Farmacognosia,

Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, UFRN.

4.1.2 Obtenção dos extratos da raiz de Solanum paniculatum Linn, folhas

de Spondias mombin e frutos de Lycium barbarum Linn, e determinação

de sua concentração

As raízes secas de Solanum paniculatum foram submetidas à

maceração (1:2 p/ v, planta / etanol) durante 72 h à temperatura ambiente para

se obter o extrato etanólico de S. paniculatum. O macerado foi filtrado a vácuo,

obtendo-se o extrato etanólico (EE) das raízes de S. paniculatum e seco sob

pressão reduzida, com auxílio do Rotaevaporador (Buchi R-210 Rotavapor®,

Nova Castel, DE). Para os testes biológicos o EE foi liofilizado.

As folhas de S. mombin foram submetidas à secagem na sombra, sob

temperatura ambiente durante duas semanas. Após secas, foram trituradas em

25

um moinho de facas. O extrato foi preparado por maceração utilizando etanol:

H2O (70:30), durante um período de sete dias, obtendo-se assim o extrato

hidroetanólico das folhas (EH). O extrato foi filtrado e eliminado todo solvente

orgânico com auxílio de um rotaevaporador (Buchi R-210 Rotavapor®, Nova

Castel, DE) à temperatura de 45° C. Para os testes biológicos o EH foi

liofilizado.

O extrato dos frutos secos de Lycium barbarum foi preparado por

maceração por 7 dias com álcool etílico 70 %, na proporção 1:5 (droga vegetal:

solvente, p/v). O macerado foi filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato

hidroetanólico (EH) dos frutos de L. barbarum. O EH foi seco sob pressão

reduzida com auxílio de um evaporador rotatório (Buchi R-210 Rotavapor®,

Nova Castel, DE) a temperatura não superior a 45º C, obtendo-se o extrato

seco de L. barbarum. Para os testes biológicos o EH foi liofilizado.

4.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA

4.2.1 Triagem Fitoquímica

As reações de identificação dos grupos fitoquímicos foram realizadas por

métodos clássicos, descritos por Carvalho, Gosmann e Schenkel (2007);

Zuanazzi e Montanha, (2007); Santos e Mello (2007). Os resultados foram

observados por meio do desenvolvimento de coloração e formação de

precipitado. Os metabólitos secundários investigados foram: compostos

fenólicos (reação de cloreto férrico); flavonoides (reação de Schinoda ou

cianida), taninos (reação de gelatina) e alcaloides (reações de precipitação com

os reagentes Mayer, Bertrand, Wagner e Dragendorff). O procedimento foi

realizado conforme Langassner e Giordani (2013).

4.2.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

As condições cromatográficas utilizadas na análise por CCD foram:: i.

adsorvente: cromatoplacas de alumínio de gel de sílica 60 F254; ii: fase móvel:

foram escolhidos sistemas eluentes específicos, de acordo com os metabólitos

secundários de interesse e otimizados de acordo com o resultado obtido e iii:

26

reveladores: vanilina sulfúrica (como revelador universal); cloreto férrico

(detecção de compostos fenólicos); Reagente Natural A 0,5 %

(difenilboriloxietilamina), (detecção específica de flavonoides)/seguido de

observação sob luz ultravioleta em 365 nm; e Reagente de Drangendorf

(detecção de alcaloides) (Wagner; Bladt, 2001).

4.3 ENSAIOS IN VITRO DOS EXTRATOS DE SOLANUM PANICULATUM

LINN, SPONDIAS MOMBIN E LYCIUM BARBARUM LINN

4.3.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima dos extratos de

Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn

A atividade antimicrobiana em placas foi realizada segundo a

metodologia adaptada de Bauer e colaboradores (1966) para a determinação

da Concentração Inibitória Mínima (CIM). As linhagens microbianas foram

cultivadas em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan,

Estados Unidos) e incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de petri

contendo Agar Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi

introduzida solução salina inoculada com cada crescimento microbiano e foram

confeccionados cinco orifícios padronizados de aproximadamente seis mm de

diâmetro em cada placa. Foram introduzidos 50µL da substância teste (EB até

a diluição em água destilada 1:512) nos orifícios, e as placas foram incubadas

a 37°C por 24 horas. Cada ensaio foi realizado em triplicata sobre cada

linhagem. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo, o

digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company,

Nova York, EUA) e nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São

Paulo, Brasil).

Foi considerada CIM, a menor concentração dos extratos capaz de inibir

o crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição,

aferido em mm com auxílio do paquímetro (Digimess®, São Paulo, Brasil).

27

Figura 1 - Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da atividade antimicrobiana dos extratos sobre cada amostra ensaiada.

28

4.3.2 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida do extrato de


A curva microbiana frente aos extratos de Solanum paniculatum Linn,

Spondias mombin e Lycium barbarum foi avaliada pelo método de Peyret et al.

(1990). As amostras foram inoculadas em caldo nutritivo (BHI- DIFCO®,

Michigan, Estados Unidos), incubadas a 37º C por 18 a 20 horas e

subcultivadas em Caldo Mueller Hinton – (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos)

por 1 hora, obtendo-se um inoculo de 106 UFC/mL. A 9mL da cultura

microbiana, foi adicionado 1mL de cada extrato (bruto e na CIM), e ao tubo

controle foi adicionado 1mL de água destilada e esterilizada. Os tubos foram

mantidos na estufa a 37º C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4,

6, 8, 10 e 24 horas de incubação e semeadas em placas com Agar Mueller

Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Cada ensaio foi realizado em

duplicata.

A leitura das placas foi efetuada após incubação por 48 horas a 37ºC,

pelo método padrão de contagem de unidades formadoras de colônias

(UFC/mL) placas, observando o potencial bactericida e fungcida dos extratos

por um determinado tempo. O tempo de morte de bactérias e levedura foi

expresso em Log10.

29

Figura 2: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Cinética

Bacteriana e Fungicida dos extratos testados para cada amostra ensaiada.

1mL de extrato +

9mL do subcultivo

1mL de água

destilada + 9mL do

subcultivo

Plaqueamento em Agar Mueller

Hinton Plaqueamento em Agar

Mueller Hinton

Plaqueamento em Agar Mueller Hinton

2, 4, 6 e 24 h 2, 4, 6 e 24 h

18-20 h

48 h

30

4.3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos

extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium

barbarum Linn

A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) das bactérias e

leveduras ao vidro, foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer

(1996).

A partir dos crescimentos bacterianos e fúngicos, as linhagens foram

sub-cultivadas a 37ºC em caldo Mueller-Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados

Unidos), obtendo-se um inoculo de 106 UFC/mL. Foram distribuídos 1,8 mL dos

subcultivos em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,2mL da

soluções correspondentes às escalas (diluições) dos extratos. A incubação foi

feita a 37°C por 24 horas, com os tubos inclinados a 30°. A leitura foi realizada

através da observação visual da aderência das bactérias e leveduras às

paredes do tubo, após agitação do mesmo. Cada ensaio foi realizado em

duplicata frente a cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi

utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12%

(Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e nistatina

100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).

A CIMA foi definida como a menor concentração do agente que impediu

a aderência ao tubo de vidro.

31

Figura 3: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Concentração

Inibitória Mínima de Aderência dos extratos sobre cada amostra ensaiada.

Overnight em caldo BHI

Estufa (37ºC)

24h

Caldo Mueller-

Hinton

1,8 mL da

cultura

0,2 mL do

extrato

CONTROLE

NEGATIVO

Incubação

CONTROLE

POSITIVO

32

4.3.4 Avaliação do potencial citotóxico dos extratos de Solanum

paniculatum, Spondias mombin e Lycium barbarum sobre fibroblastos da

linhagem 3T3

Foram utilizadas fibroblastos da linhagem 3T3 cedidas pelo Laboratório

de Biotecnologia de polímeros naturais (BIOPOL, Departamento de Bioquímica,

UFRN). Nesse teste foi analisada a capacidade de celulas tratadas com os

extratos em reduzir o composto MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difenil tetrazolio) a sais de formazam.

Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com

7 mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em

4 grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado em

meio básico; (ii) grupo Solanum paniculatum: cultivado em meio básico

adicionado do extrato em concentração avaliada pelos testes supracitados; (iii)

grupo Spondias mombin: cultivado em meio básico adicionado do extrato em

concentração avaliada pelos testes supracitados; (iv) grupo Lycium barbarum:

cultivado em meio básico adicionado do extrato em concentração avaliada

pelos testes supracitados.

A citotoxicidade dos extratos foi analisada nos intervalos de 24h e 48 h

depois do cultivo celular através do ensaio do MTT (avaliação da atividade

mitocondrial por redução do MTT). O MTT avalia a atividade metabólica das

células quantificando a redução do MTT por desidrogenases associadas ao

NADPH e NADH, resultando na produção de cristais de formazam. Para isso,

as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de

5 × 103 células/poço. Decorrido o tempo experimental, as células foram

incubadas com 100 μL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4

horas e, em seguida, o produto colorimétrico (formazam) foi solubilizado com

100 μL de álcool etílico absoluto. A leitura da placa foi realizada em um leitor de

ELISA em um comprimento de onda de 570 nm (μQuan Biotek®, Instruments,

USA).

33

4.3.5 Análise Estatística

Os resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima

(difusão em ágar) foram coletados, organizados e apresentados em forma de

tabelas com os seus respectivos valores das médias dos halos, indicando a

inibição do crescimento microbiano. Posteriormente, foram transferidos para

um banco de dados informatizado e calculados os parâmetros estatísticos que

incluiram valores das respectivas medidas descritivas: mínimo, máximo, média

e desvio padrão. O nível de confiança utilizado para a obtenção dos intervalos

foi de 95%. Ao nível de 5% de significância foi utilizado o teste t-Student ou de

Mann-Whitney na comparação da inibição microbiana mínima dos extratos em

relação aos controles positivos.

Para a Cinética Bactericida e Fungicida e a Concentração Inibitória

Mínima de Aderência a análise foi descritiva, através do método padrão de

contagem de UFC/mL e através da observação visual da aderência dos

microrganismos às paredes do tubo de vidro, respectivamente.

Na avaliação do potencial citotóxico, a reducao do composto MTT a

formazana foi verificada por espectrofotometria e foi considerada diretamente

proporcional a atividade mitocondrial e viabilidade celular.

Os dados foram analisados mediante o emprego do programa SPSS

(Statistical Package for Social Sciences), versão 22.0.

34

5 ARTIGOS PRODUZIDOS

5.1 O artigo “Phytochemical screening and antimicrobial effect of Solanum

paniculatum L. on superinfecting microorganisms from an oral environment” foi

enviado para o periódico “Complementary Therapies in Medicine” e

encaminhado pela revista para o periódico “Journal of Ethnopharmacology”,

que possui fator de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina

II.

35

Phytochemical screening and antimicrobial effect of Solanum

paniculatum L. on superinfecting microorganisms from an oral

environment

Maria Regina Macêdo-Costaa*, Julia Morais Fernandesb, Silvana Maria

Zucolotto Langassnerb, Kenio Costa de Limaa

a Department of Dentistry of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av.

Salgado Filho, 59056-000 - Natal, RN – Brasil.

b Department of Pharmacy of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, R.

Gen. Gustavo Cordeiro de Farias, 59012- Natal, RN – Brasil.

1 Corresponding author:

Av. Oceano Atlântico 1041/ap 801, Ponta de Campina, Cabedelo, Paraíba, 58310-000, +55 83

99921-4856, E mail: [email protected]

36

E-mail addresses: [email protected] (Maria Regina Macêdo-Costa),

[email protected] (Julia Morais Fernandes), [email protected] (Silvana Maria

Zucolotto Langassner), [email protected] (Kenio Costa de Lima).

37

Abstract

Objectives: The aim of the study was to assess the antimicrobial effect of

Solanum paniculatum on Enterococcus faecalis and Candida albicans, as well

as to characterize its phytochemical profile. Method: The phytochemical

screening was investigated through chemical reactions and Thin Layer

Chromatography (TLC). During the TLC analysis were used the mobile phases:

AcOEt: formic acid: MeOH: water; (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v); BuOH: formic acid:

water (3:1:1, v/v/v) and chloroform: MeOH (8:2, v/v). Sulfuric vanillin, 1% FeCl3

solution, 0.5% natural reagent and Dragendorff reagent were used to detect

secondary metabolites. Subsequently, the Minimum Inhibitory Concentration

(MIC), Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA) and the

Bactericidal and fungicidal Kinetics of S. paniculatum were determined. The

student´s t-test was applied, with the level of significance set at p<0.05.

Chlorhexidine digluconate and Nystatin were used as the positive controls.

Results: The results were confirmed through chemical reactions: phenolic

compounds; flavonoids; tannins and alkaloids. The TLC analysis suggested that

flavonoids were the most common compounds. S. paniculatum exhibited a

bacteriostatic and fungistatic effect and there was a statistically significant

difference between the products in relation to the dilutions/concentrations: 1:64/

7.81 mg/mL (E. faecalis ATCC); 1:32/15.65 mg/mL (E. faecalis - isolated from

oral environment- OE); 1:128/ 3.90 mg/mL (C. albicans OE) and 1:64/3.90

mg/mL (C. albicans ATCC). S. paniculatum exhibited a greater anti-adherent

effect (1:512/ 0.97 mg/mL) than the controls and a bactericidal and fungicidal

effect when the crude extract was used. Conclusion: S. paniculatum exhibited a

significant antimicrobial effect, confirmed by the pharmacological findings, and

thus stimulates further research of bioactive natural substances for the

treatment of persistent or refractory oral infections.

38

Keywords: Solanum paniculatum; Microbiology; Phytotherapy; Thin layer

chromatography

39

1.Introduction

Health professionals often need to treat infections caused by specific

microorganisms that are usually not found in the site of interest, or by

microorganisms that colonize a site that is generally sterile. The mouth is a

natural microbiome that is essential to the normal physiological development of

the host1.

However, some microorganisms, such as Enterococcus faecalis and

Candida albicans, have become opportunistic pathogens and are now

considered the most resistant species in the mouth.2 They are also considered

as superinfecting microorganisms in persistent periodontal, endodontic and

peri-implant infections3-8.

Enterococci are natural inhabitants of the intestinal and genital microbiota

of humans. The odontological source of infection by enterococci is probably

exogenous, given that they are only transitory colonizers of the oral

environment and have the capacity to adhere and survive in dental biofilm. E.

faecalis is one of the most commonly isolated species of enterococci. This

species is a gram-positive anaerobic facultative coccus, which is often

correlated with hospital infections.6,7 It exhibits several different pathogenicity

factors, including: the capacity to survive long-term starvation; the ability to

adapt and persist in a variety of adverse environments, without the support of

other bacteria; the production of gelatinase, which provides thicker biofilm; the

capacity to grow in an alkaline pH and survive at temperatures of 60°C for 30

minutes; the ability to suppress the action of lymphocytes and stimulate an

inflammatory response, indirectly damaging tissues and generating a natural

resistance to several antimicrobial drugs.6,7

Candida albicans is the most commonly isolated fungus in the oral

environment. The prevalence of C. albicans ranges from 47% to 75% among

the yeast species isolated in the mouth. The back of the tongue is the main

habitat of yeasts, although these microorganisms can be found in the buccal

mucosa, palate, saliva and on dental surfaces. Its pathogenicity factors include

the following: the ability to adhere to hydroxyapatite coated with saliva; the

capacity to bind with native or denatured collagen; the capacity to degrade

40

dental collagen and induce inflammatory reactions; the ability to arrange itself

as biofilm on biotic and abiotic surfaces and survive as a monoinfection. 4, 6, 9

41

Due to the prevalence of these multi-resistant strains, the search for new

strategies to combat oral infections has been encouraged,2 particularly in terms

of strategies that involve the use of natural antimicrobials and phytochemicals.

10,11

In Brazil, several species of potentially medicinal native plants exist,

including Solanum paniculatum. This species is commonly known as “jurubeba”

and belongs to the Solanaceae family, which is found in several regions in

Brazil.12 Stehman It is widely used as a remedy for bronchitis, coughs, arthritis,

jaundice, hepatitis, fever and stomach problems. The plant is believed to

possess anti-viral, anti-cancer, anti-inflammatory, antioxidant, diuretic,

hepatoprotective and antimicrobial properties.13-17 The chemical constitution of

the species contains flavonoids, amides, steroids, lignans, steroidal saponins

and steroidal alkaloids.14-19 This species is listed in the Brazilian

Pharmacopoeia20 and the "National Report on Medicinal Plants of Interest to

the Single Health System (Renisus),” 21 due to its potential for use in products of

interest to the Brazilian Ministry of Health.

The aim of the present study was to phytochemically analyze and assess

in vitro the antimicrobial, anti-adherent, bactericidal and fungicidal effects of root

extract of Solanum paniculatum on Enterococcus faecalis and Candida

albicans, which were provided by the ATCC and isolated from an oral

environment (OE).

2.Materials and Methods

2.1 Preparation of the Solanum paniculatum extract

The roots of S. paniculatum were obtained in the Brazilian city of Natal-

RN, which has the following geographical coordinates: latitude 5º 51’ 30” S and

longitude 5º 51’ 30” W. The botanical identification was performed by Prof. Dr.

Maria Iracema Bezerra Loyola (Biology Department/UFRN). The voucher

specimen was deposited in the Herbarium of the Biosciences Center of the

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN 5468).

The dry roots were submitted to maceration (1:2 p/ v, plant / ethanol) for

72 h at room temperature to obtain the ethanolic extract of S. paniculatum

42

(yield: 1, 0.80% in relation to the dry plant). The macerate was vacuum filtered

to obtain the ethanolic extract (EE) of the roots of S. paniculatum and dried

under reduced pressure from a

43

Rota evaporator (Buchi R-210 Rotavapor®, Nova Castel, DE). The dry extract

was then placed in distilled water, prior to lyophilization.

2.2 Phytochemical screening of the roots of Solanum paniculatum

The identification reactions for the phytochemical screening were

performed using standard methods.22-24 The results were recorded based on

the development of coloration and precipitate formation. The following

secondary metabolites were investigated: phenolic compounds (reaction of

ferric chloride); flavonoids (reaction of Shinoda or cyanide), tannins (reaction of

gelatin) and alkaloids (precipitation reactions with Mayer, Bertrand, Wagner and

Dragendorff reagents).

2.3 Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis

The chromatographic conditions used in the TLC analysis were as

follows: i. adsorbent: F254 silica gel aluminum chromatoplates (Merck®,

Darmstadt, Germany); ii: mobile phase: AcOEt: formic acid: MeOH: water

(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH: formic acid: water (3:1:1, v/v/v) and chloroform:

MeOH (8:2, v/v) and iii: developers: vanillin sulfuric acid (bitter compounds,

saponins and essential oil compounds); ferric chloride (detection of phenolic

compounds); natural reagent A 0.5% (specific detection of flavonoids)/followed

by observation under ultraviolet light (365 nm); Dragendorff reagent (detection

of alkaloids). The retention factors (Rf), the color and the behavior of the points

were compared with the chromatographic profiles of reference substances in

the literature. 25

2.4 Microbial strains

Samples of Enterococcus faecalis (ATCC 292012) and Candida albicans

(ATCC 36802) were obtained from the culture collection of the Laboratory of the

Universidade Estácio de Sá (UNESA) and the Laboratory of Mycology of the

UFRJ (Rio de Janeiro/RJ). These samples were then reactivated in the

Laboratory of Microbiology in the Dentistry Department of the CCS/UFRN.

44

Enterococcus faecalis (OE 44) was obtained from the culture collection of

the Laboratory of Microbiology in the UNESA (Research Ethics Committee of

the Hospital Universitário Clementino Fraga Filho protocol no. 140/04). Samples

were collected from patients in endodontic clinics of the UFRJ and UNESA.

Filter paper cones were introduced in the root canals. The material was

transferred to Enterococcosel agar and incubated for 72 hours at 35°C.

Subsequently, they were introduced to blood agar plates and incubated at 35°C

for 72 hours. Pure colonies were submitted to tests to identify the enterococci

species (Gram-staining, morphology of the colony, catalase test, growth in NaCl

broth, arginine hydrolysis, use of pyruvate, motility, pigmentation production and

carbohydrate fermentation). The identification was conducted using the PCR

and specific E. faecalis primers.

Candida albicans (OE 100) was obtained from the culture collection of

the Laboratory of Microbiology in the Department of Clinical and Toxicological

Analysis of the UFRN (Research Ethics Committee of the Hospital Universitário

Onofre Lopes protocol no. 152/07). The clinical samples were collected from the

saliva of patients, which was seeded in Sabouraud-dextrose agar. They were

identified using germ tube evidence, hypertonic broth, tolerance to temperatures

of 42ºC, micro-cultivation, the assimilation of carbohydrates, sugar fermentation

and the PCR.

2.5 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Antimicrobial activity on the plates (to determine the MIC) was analyzed

in accordance with the adapted methodology of Bauer and collaborators.26 The

microbial strains Enterococcus faecalis (ATCC 292012), Enterococcus faecalis

(OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and Candida albicans (OE 100) were

cultured in a nutrient broth (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan,

USA) and then incubated at 37°C for 18-20 hours. Saline solution was

inoculated with each microbial growth and was then added to petri dishes

containing Mueller Hinton agar (DIFCO®, Michigan, USA). Five standardized

holes (approx. six mm in diameter) were created in each plate. In total, 50μL of

the test substance (crude extract up to a dilution of 1:512 in distilled water) was

added to the holes and the plates were incubated at 37°C for 24 hours. Each

45

trial was conducted in triplicate for each strain. The same procedure was used

for the positive control, chlorhexidine digluconate 0.12% (Periogard®, Colgate-

Palmolive

46

Company, New York, USA) and nystatin 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-

Myers, São Paulo, Brazil).

The MIC was considered the lowest concentration of the extract capable

of inhibiting microbial growth, represented by the presence of an inhibition halo,

which was measured using a caliper (Digimess®, São Paulo, Brazil).

Using these MIC results and a level of significance of 5%, the students t-

test was conducted (p<0.05) to compare the antimicrobial activity of the extract

and the positive controls.

2.6 Determination of Bactericidal and Fungicidal Kinetics

The bactericidal and fungicidal potential of the S. paniculatum extract

was assessed using an adapted version of the method described by Peyret and

collaborators.27 The samples of Enterococcus faecalis (ATCC 292012),

Enterococcus faecalis (OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and Candida

albicans (OE 100) were inoculated in a BHI nutrient broth (DIFCO®, Michigan,

USA), incubated at 37º C for 18 to 20 hours and sub-cultured in Mueller Hinton

agar (BROTH) (DIFCO®, Michigan, USA) for one hour. To the 9mL of each

microbial culture, we added 1mL of the extract (crude extract and the MIC).

Subsequently, 1mL of distilled and sterilized water was added to the control

tube. The tubes were stored at 37º C for 24 hours, with aliquots collected after

2, 4, 6 and 24 hours of incubation. These were then seeded in petri dished with

Mueller Hinton agar (DIFCO®, Michigan, USA). Each procedure was performed

in duplicate.

Readings were taken after incubation for 48 hours at 37ºC using the

standard method of counting colony forming units (CFU/mL) at specific times.

2.7 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence

(MICA)

47

The Minimum Inhibitory Concentration Adherence (MICA) of the S.

paniculatum extract was determined as described by Gerbara, Zardetto and

Mayer, 28 Enterococcus faecalis (OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and

Candida albicans (OE 100) strains were sub-cultured at 37ºC in Mueller-Hinton

agar (DIFCO®, Michigan, USA). Subsequently, 1.8 mL of the sub-culture was

placed in hemolysis tubes and then 0.2mL of the corresponding solution was

added to the extract dilutions. The readings were taken 24 hours later through

visual observations of the adherence of the microorganisms to the walls of the

tube (after shaking). Each trial was performed in duplicate against each strain

selected. The same procedure was used for the positive control, the

chlorhexidine digluconate 0.12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company,

New York, USA.) and nystatin 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São

Paulo, Brazil).

The MICA was defined as the lowest concentration of the agent that

impeded the adherence to the glass tube.

3.Results

3.1 Identification Reactions

Table 1 displays the results obtained in the preliminary phytochemical

screening performed with root extracts of S. paniculatum. The phytochemical

screening of the S. paniculatum extract confirmed the presence of phenolic

compounds, flavonoids, tannins and alkaloids.

.

3.2 Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis

The digital prints of the extract were obtained from the TLC. When the

mobile phase involved the use of AcOEt: formic acid: MeOH: water

(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v) and BuOH: formic acid: water (3:1:1, v/v/v), both of

which were developed with vanillin sulfuric acid + heating, yellow and violet

colored bands were observed, suggesting the presence of flavonoids and

saponins (steroids or terpenes), respectively. When the development was

performed with ferric chloride, brown colored bands were visualized, suggesting

48

the presence of phenolic compounds. Subsequently, natural reagent A (0.5%)

was used and the samples were studied under UV light (365 nm), which

confirmed the strong presence of bands characteristic of flavonoids in these

fractions (Figure 1). When chloroform: MeOH (8:2, v/v) was used as the mobile

phase and Dragendorff reagent was used for development, two orange-colored

bands were visualized, suggesting the presence of alkaloids (Figure 1).

3.3 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

The S. paniculatum extract had an effect on all of the microorganisms

tested, with inhibition halos ranging from 12 to 20 mm. The extract exhibited an

antibacterial affect up to the dilution of 1:64 (7.81 mg/mL) for E. faecalis ATCC

and an antifungal effect up to the dilution of 1:256 (1,95 mg/mL) for C. albicans

(OE), which was the most sensitive microorganism to the extract. The positive

controls were effective on all of the microorganisms and the inhibition halos

ranged from 10 to 24 mm. A statistically significant difference was found

between the products in relation to the dilutions/concentrations of 1:64/ 7.81

mg/mL (E. faecalis ATCC), 1:32/15.65 mg/mL (E. faecalis OE), 1:128/ 3.90

mg/mL (C. albicans OE) and 1:64/3.90 mg/mL (C. albicans ATCC).

3.4 Determination of Bactericidal and Fungicidal Kinetics

The bactericidal and fungicidal effect of the crude extract of S.

paniculatum was observed in the first two hours of contact between the extract

and the sample of C. albicans (OE) and in the first six hours of contact between

the extract and E. faecalis (ATCC and clinical isolate), as well as C. albicans

ATCC.

3.5. Determination of the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence

(MICA)

The S. paniculatum extract exhibited an anti-adherent effect on all of the

microorganisms tested up to the dilution of 1:512 (0.97 mg/mL). Chlorhexidine

49

exhibited an anti-adherent effect up to a dilution of 1:512, while nystatin´s effect

was recorded up to 1:4.

4. Discussion

Studies of new antimicrobial agents are the result of interdisciplinary

collaboration involving ethnopharmacological, botanical, chemical (natural

compounds) microbiological, pharmacological and clinical data, as well as input

from healers. Many extracts and their phytochemical compounds, particularly

secondary metabolites, exhibit in vitro and in vivo antimicrobial properties that

are recommended in the prevention and treatment of infectious diseases,

including those that involve superinfecting microorganisms. 29

Therefore, the present study sought to chemically characterize and

assess the bacteriostatic, fungistatic, anti-adherent, bactericidal and fungicidal

activity of an extract from the roots of S. paniculatum.

To do so, the S. paniculatum extract was analyzed through preliminary

phytochemical screening using TLC with different developers to identify the

classes of secondary metabolites. The results obtained corroborate previous

pharmacological studies. 15, 16,19

Allaker and Douglas (2009)30 described several plant constituents with

antimicrobial properties and highlighted the presence of phenolic compounds,

flavonoids and tannins. Recently, Xie et al. (2015)31, 32 reported that the

antimicrobial effect of flavonoids against a wide range of pathogenic

microorganisms could be due to the inhibition of the synthesis of nucleic acid,

the inhibition of the function of the cytoplasmic membrane and the inhibition of

the formation and fixation of biofilm. According to Silva et al (2005),33 flavonoids

are the most abundant active metabolites in the Solanum genus.

Concerning the active mechanism of tannins, Loguercio and

collaborators (2005) 34 suggested that they inhibit bacterial and fungal enzymes

and/or complex with the substrates of these enzymes. Tanins act on the cellular

mechanisms of microorganisms, modifying their metabolism, and may mix with

metal ions, decreasing the availability of the ions needed for the microbial

metabolism (Scalbert, 1991).35 Nordin et al. (2013)36 reported that the

50

adherence of Candida species was reduced by up to 80% after exposure to

phenolic compounds.

Saponins are polyphenolic compounds that were also found in the

present study. The biological activity exhibited by these compounds has been

widely described in the literature, leading to their use in the pharmaceutical

industry.16 Saponins were also identified in the roots of this species as

isojuripidine, isojurubidine, isopaniculidine and jurubidine.37-39 Recently, it has

also been confirmed that a polyphenol found in green tea inhibits bacterial

growth and the formation of the E. faecalis biofilm.40 Thus, the presence of

phenolic and polyphenolic compounds in plant extracts can affect the

organization of microbial biofilm. 2

Alkaloids are also an important class of secondary metabolites, and they

exhibit several pharmacological properties, including antimicrobial, 41,42, anti-

tumoral 43 and anti-herpes effects.44 Alkaloids are notable in the Solanaceae

family, particularly tropane alkaloids.45 Many alkaloids have been identified in

connection with the species S. paniculatum, including jurubeba, jurubebine,

jubebine, and solanine.46,47

Once the secondary metabolites with previously known and studied

antimicrobial activity had been identified, an in vitro assessment of antibacterial

and anti-fungal activity was conducted. ATCC strains are standard strains,

with well-known susceptibility profiles. However, in order to assess the

antimicrobial activity of a new product, it was necessary to include strains

with a clinical origin, as they exhibit different susceptibility profiles, thereby

ensuring greater accuracy in the assessment of the antimicrobial action of

the agents of interest.

The S. paniculatum extract had a bacteriostatic and fungistatic effect on

all of the strains tested. In the case of the Enterococcus faecalis isolated from

the oral environment (CIM= 15.65 mg/mL), chlorhexidine exhibited significantly

higher activity levels (p<0.05) in the dilution of 1:32. For the Enterococcus

faecalis ATCC (CIM=7.81 mg/mL), chlorhexidine exhibited significantly higher

activity levels (p<0.05) in the dilutions of 1:2 and 1:64. However, there were no

statistically significant differences (p>0.05) between the products for the

dilutions of 1:4 and 1:16, both of which produced the same effect. Note that for

both the extract and the control, the samples isolated from the oral environment

51

exhibited greater resistance to chemical agents, probably due to the fact that

they were in an oral environment and had been exposed to antimicrobials and

interacted with other species, thereby contributing to the increase in selective

pressure and the acquisition of resistance mechanisms.

Chlorhexidine digluconate (the gold standard) has been suggested for

the irrigation of root canals, as well as periodontal and peri-implant sites, due to

its wide spectrum of activity and substantiality. However, in the case of

persistent or refractory infections, in which Enterococcus faecalis is often

isolated and organized in biofilm, permanent infections can occur after

conventional antimicrobial procedures.7, 8 In addition, previous studies have

reported an increase in the resistance of strains to conventional synthetic

chemical agents and this, allied to the high cost, the potential side effects and

the limitations on use for prolonged periods, has led to the suggested use of

natural products.30,48 In the present study, both chemical agents had an

antimicrobial effect on Enterococcus faecalis in its planktonic form, although it

was also necessary to perform experiments on microorganisms growing in the

biofilm.

Concerning Candida albicans isolated from the oral environment

(MIC=1.95 mg/mL), nystatin exhibited significantly higher activity levels (p<0.05)

in the dilution of 1:128. In the dilution of 1:256 (corresponding to MIC), no

statistically significant difference was found between the products (p>0.05). For

the ATCC strain of Candida albicans (MIC =3.90 mg/mL), nystatin exhibited

significantly higher activity levels (p<0.05) up to a dilution of 1:64. In the dilution

of 1:128 (MIC), only the extract exhibited a fungistatic effect.

Nystatin and fluconazole are the most commonly used antifungals in

dental practice.49-51 However, the use of these agents can be limited, due to

microbial resistance to conventional synthetic agents, which leads to inefficient

therapy.50 Studies have also shown that a mature biofilm of C. albicans

increases the resistance of fungal cells when faced with antimicrobial agents.

The search for new antifungal agents and the characterization of new targets,

including resistant strains, has therefore been proposed. Antifungal agents

ideally should exhibit broad spectrum activity and no toxicity for the host. In the

present study, the fungistatic activity of the extract was higher when faced with

the most prevalent yeast in the oral environment. 4

52

The bactericidal and fungicidal kinetics of the crude extract were also

determined in relation to the MIC of S. paniculatum. The bactericidal/fungicidal

effect of the crude extract of S. paniculatum (no dilution) was observed in the

first two hours of contact with the C. albicans sample (isolated from the oral

environment) and in the first six hours of contact with E. faecalis (ATCC and

OE) and C. albicans ATCC. When the extract was diluted (MIC), it only had a

bactericidal effect on E. faecalis ATCC.

When determining the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence

(MICA), it was noted that the extract exhibited an anti-adherent effect,

represented by the absence of microbial adherence to the glass tube, which

simulated a surface of the oral environment. This was the case for all of the

samples tested. An anti-adherent effect was confirmed up to the dilution of

1:512 (MICA: 0.97 mg/mL), which was similar to that observed for chlorhexidine

against E. faecalis (ATCC and the clinical isolate) and higher than that recorded

for nystatin against Candida albicans (ATCC and the clinical isolate).

Macedo-Costa et al. (2014)24 also assessed the antibacterial effect of

root extracts of S. paniculatum, although they assessed the effect on

endogenous oral bacteria: Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguinis, S.

oralis, S. salivarius and Lactobacillus casei. The extract exhibited an MIC of

7.81 mg/mL and a MICA value of 62.5 mg/mL. It was bactericidal at a

concentration of 500 mg/mL in two hours of contact with S. mutans and in four

hours for the MIC. The phytochemical analysis confirmed the presence of sulfur

compounds, gums and lactones (alkaloids), with a notable presence of phenols

(flavonoids and tannins), both of which were also found in the present study.

In these experiments, S. paniculatum exhibited bacteriostatic,

fungistatic, anti-adherent, bactericidal and bacteriostatic activity in vitro on the

microbial suspension of the monoculture and confirmed the strong presence of

flavonoids, tannins, saponins and alkaloids, which provides a probable

explanation for the pharmacological activity of the extract. However, in order to

extrapolate these data for use in clinical dentistry against persistent infections,

further studies that consider the antimicrobial effects of S. paniculatum on

superinfecting microorganisms in monoculture biofilm and multi-species biofilm

are required.

53

Conflict of interests

The authors declare no conflicts of interests.

Acknowledgment

No financial support was received during the current study.

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http://www.scielo.br/aabc

57

Table

Figure

Figure 1 – TLC of ethanolic extract of S. paniculatum roots. A) Mobile phase: ethy acetate: formic acid: methanol: water (10:0.5:0.6:0.2, v/v/v/v). Adsorbent: sílica gel plates 60 F254. Spray reagent: sulfuric vanillin + heating. Observation: Visible. B) Chromatographic conditions similar to plate A. Spray Reagent: Ferric chloride. Observation: Visible C) Chromatographic conditions similar to plate B. Spray Reagent: Natural Product 0.5%. Observation: UV = 365 nm. D) Mobile phase: chloroform: methanol (8:2, v/v). Spray reagent: Dragendorff reagent. Observation: Visible.

Table 1 Preliminary phytochemical screening of S. paniculatum roots.

Reactions Ethanolic extract

Ferric chloride Reaction +

Shinoda Reaction +

Gelatina Assay +

Alkaloids Assay +

58

5.2 O artigo “Phytochemical screening, cytotoxicity and antimicrobial action of Spondias mombin on superinfecting microorganisms from an oral environment” será enviado para o periódico “Journal of Ethnopharmacology” que possui fator de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina II.

59

Phytochemical screening, cytotoxicity and antimicrobial action of

Spondias mombin on superinfecting microorganisms from an oral

environment

Maria Regina Macêdo-Costaa*, Isabelle Helena Gurgel de Carvalhoa, Bárbara

Cabralb, Silvana Maria Zucolotto Langassnerb, Kenio Costa de Limaa









[email protected] (Isabelle Helena Gurgel de Carvalho),

[email protected] (Bárbara Cabral), [email protected] (Silvana Maria

Zucolotto Langassner), [email protected] (Kenio Costa de Lima).

mailto:[email protected]


60

Abstract

O objetivo do estudo foi avaliar a ação antimicrobiana de Spondias mombin

sobre Enterococcus faecalis, Candida albicans, Staphylococcus aureus e

Pseudomonas aeruginosa, ATCC e isolados do ambiente bucal, bem como

caracterizar seu perfil fitoquímico e citotoxicidade. O screening fitoquímico do

extrato foi investigado por reações químicas e Cromatografia em Camada

Delgada (CCD). Nas análises por CCD foram utilizadas placas de sílica gel 60;

acetato de etila: ácido fórmico: água 8,4:0,7:0,7 v/v/v) e (Tolueno: Acetato de

etila:ácido fórmico 5:5:0,5 v/v/v) como fases móveis; e para detecção dos

metabólitos secundários, usou-se Reagente A natural. Posteriormente, foi

determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Inibitória

Mínima de Aderência (CIMA) e Cinética bactericida e fungicida de Spondias

mombin. Utilizou-se como controle positivo, o digluconato de clorexidina a

0,12% e nistatina 100.000U.I. Ao nível de 5% de significância aplicou-se o teste

t-Student ou de Mann Whitney (p<0,05). O potencial citotóxico do extrato foi

avaliado através da viabilidade celular de fibroblastos da linhagem 3T3. Foram

detectados através de reações químicas: compostos fenólicos, flavonoides,

taninos e saponinas. As análises por CCD revelam a presença de flavonoides,

ácido fenólico, ácido elágico, quercetina e canferol. S. mombin apresentou

desempenho médio superior à clorexidina e estatisticamente significativo até a

diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e

P. aeruginosa ATCC, respectivamente. S. mombin apresentou ação bactericida

sobre E. faecalis (ATCC e AB) e C. albicans (ATCC e AB) e ação antiaderente

sobre todas as bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e

E. faecalis (ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL). O extrato

apresentou citotoxicidade em cultura de células nas concentrações testadas.

Conclui-se que S. mombin apresentou expressiva atividade bacteriostática,

fungistática, antiaderente, bactericida e fungicida porém são necessários

estudos que considerem a ação antimicrobiana do extrato sobre biofilme, e

outros testes que avaliem a toxicidade seletivamente a fim de permitir futura

aplicabilidade clínica em canais radiculares e sítios periodontais e

perimplantares.

Palavras-chaves: Spondias mombin; Fitoterapia; Cromatografia em Camada

Delgada; Microbiologia; Toxicidade

61

Introduction

Infecções polimicrobianas tendem a ser complexas, resultar em formas

agressivas de doenças e seus agentes frequentemente apresentam resistência

a antibióticos e ao impacto de medidas terapêuticas (Brogden, 2002; Harriott,

Noverr, 2009; Jenkinson, 1990; Douglas, 2002; Lynch, Robertson, 2008;

Schlecht et al, 2015).

No que diz respeito a infecções polimicrobianas do ambiente bucal,

espécies de bactérias comumente associadas com infecções hospitalares e

multirresistência aos antimicrobianos, tais como Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis, são detectados em

proporções elevadas no biofilme subgengival de indivíduos com periodontite

(Slots et al., 1990;. Colombo et al., 2002) , em canais endodônticos (Brito et al.,

2007; Gupta et al., 2015), e em sítios de implantes falhos (Persson, Renvert,

2014; Aguayo et al., 2015; Verdugo 2016).

Pseudomonas aeruginosa é um bacilo gram-negativo que pode ser

encontrado na água, solo, bem como no ambiente bucal de indivíduos

hospitalizados. Essa espécie apresenta capacidade para produzir e secretar

enzimas extracelulares e toxinas, aderir e formar biofilme, bem como apresenta

resistência a muitos antibióticos (Souto et al., 2014).

Staphylococcus aureus é um agente patogênico, gram positivo e

representa a bactéria mais importante em infecções de pele em seres

humanos. Apresenta uma variedade de fatores de patogenicidade incluindo a

produção de toxinas, formação de biofilme, transferência horizontal de genes

de resistência e estratégias de evasão do sistema imunológico (Cuesta et al.,

2010).

A prevalência de E. faecalis no ambiente bucal é baixa em indivíduos

saudáveis, isto é, 1-20% (Sedgley et al., 2004, 2006), porém elevada, até 68%

em pacientes com doenças bucais como periodontite, cáries e infecções

endodônticas (Sedgley et al., 2006; Souto et al., 2014; Kouidhi et al., 2011).

Essa bactéria é capaz de sobreviver a desafios ambientais extremos e é

particularmente resistente a agentes antimicrobianos convencionais utilizados

rotineiramente (Gupta et al,2015). Trata-se de um patógeno oportunista típico

62

da microbiota gastrointestinal humana e representa a terceira causa mais

comum de infecções nosocomiais (Colombo et al, 2013).

Candida albicans também é um agente patogênico oportunista, e vive

comensalmente no intestino, faringe, trato genito-urinário, pele e boca. A

patogenicidade das espécies de Candida é atribuída a fatores como a evasão

de defesas do hospedeiro, aderência a superfícies, formação de biofilme e

produção de enzimas proteolíticas. Tal espécie tem sido relacionada a doenças

periodontais e perimplantares refratárias, além de cáries dentárias (Sardi et al,

2011).

Torna-se claro, portanto, que a presença e interações entre agentes

superinfectantes exógenos ao ambiente bucal podem resultar em

comportamentos alterados, como patogenicidade aumentada, a formação de

biofilme, a tolerância aos antibióticos ou antifúngicos, o que pode influenciar na

progressão da doença e em sua manifestação clínica, caracterizando infecções

persistentes. Nesse sentido, a análise dos efeitos biológicos de plantas poderia

ajudar na síntese de novas drogas antimicrobianas frente a esses micro-

organismos.

O Brasil tem uma enorme biodiversidade, incluindo várias plantas de

interesse econômico (Albuquerque et al., 2007). As regiões Norte e Nordeste

do país são as que concentram a maior parte da biodiversidade existente, o

que permite acesso a inúmeros tipos de plantas e espécies frutíferas (Mattietto;

Lopes; Menezes, 2010).

Dentre estas, destaca-se Spondias Monbim, popularmente conhecida

como “cajá”, pertencente à família Anacardiaceae, encontrada em países

como Peru, Brasil, Venezuela, Bolívia, Colômbia, as Três Guianas, bem como

o sul do México, Belize, Costa Rica e as Antilhas (Adedokun et al., 2010). O

uso das folhas é indicado popularmente em gargarejos, como adstringente, nas

inflamações da boca e da garganta. Há relatos de uso bucal em casos de

prostatite e de herpes labial. No que se refere às atividades biológicas, foram

citadas: atividade antimicrobiana (Corthout et al. 1994; Abo et al., 1999; Silva et

al. 2012); moluscida (Corthout et al. 1994); antiviral (Silva et al. 2011);

leishmanicida (Accioly, 2001) e antioxidante (Silva et al. 2012). Em relação à

composição química foi descrita a presença de compostos fenólicos simples

(Corthout et al., 1992; Corthout et al. 1994), taninos (Corthout et al., 1991; Abo

63

et al., 1999; Njoku; Akumefula, 2007; Silva et al., 2011), flavonoides (Njoku,

Akumefula, 2007; Silva et al., 2012), triterpenos (Fred-Jaiyesimi, Kio, Wilkins,

2009), alcaloides (Njoku; Akumefula, 2007), saponinas e antraquinonas

glicosiladas (Abo et al., 1999; Njoku, Akumefula, 2007).

Nesse sentido, o objetivo do estudo foi avaliar in vitro a ação

antimicrobiana, antiaderente, bactericida e fungicida do extrato das folhas de

Spondias mombin sobre Enterococcus faecalis, Candida albicans,

Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, ATCC e isolados do

ambiente bucal, bem como analisar fitoquimicamente o material vegetal e seu

potencial efeito citotóxico.

2. Materials and Methods

2.1 Coleta e preparação do extrato das folhas de Spondias mombin

As folhas de S. mombin foram coletadas em uma fazenda particular na

região de Tábua em Dom Marcolino Dantas/ RN (Tabua- RN S S° 28’ 14’’ W

35° 27’ 37’’). A espécie foi identificada pelo botânico Alan de Araújo Roque,

com número de exsicata 12252.

As folhas de S. mombin foram submetidas à secagem na sombra, sob

temperatura ambiente durante duas semanas. Após secas, foram trituradas em

um moinho de facas. O extrato foi preparado por maceração utilizando etanol:

H2O (70:30), durante um período de sete dias, obtendo-se assim o extrato

hidroetanólico das folhas (EH). O extrato foi filtrado e eliminado todo solvente

orgânico com auxílio de um rotaevaporador à temperatura de 45° C. Para os

testes biológicos o EH foi liofilizado.

2.2 Prospecção fitoquímica

Foi realizada uma triagem fitoquímica preliminar em que foram testadas

as principais reações de caracterização para metabólitos secundários. Para a

identificação de fenóis adicionou-se ao extrato bruto uma quantidade do agente

oxidante cloreto férrico (FeCl3). Para a identificação de flavonoides foi utilizado

64

o teste de Shinoda. Os taninos foram caracterizados pela reação de

precipitação com gelatina. Para detecção da presença de saponinas,

empregou-se o teste de formação de espuma. O teste para alcaloides baseou-

se em reações de formação de complexos insolúveis produzidos por reagentes

específicos como: Dragendorff; Mayer; Wagner e Bertrand (Langassner e

Giordani 2013).

2.3 Caracterização química por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

O E.H foi analisado por CCD utilizando como fase estacionária

cromatoplacas de alumínio de sílica gel 60 GF254 e como fase móvel vários

sistemas de eluentes (Wagner; Bladt, 2001). O revelador utilizado foi o

Reagente Natural A (difenilboriloxietilamina 0,5% em metanol). Os

cromatogramas foram visualizados sob luz UV 254 e 365 nm. Para a

identificação dos compostos presentes no extrato foram utilizados padrões de

referências adquiridos da Sigma Aldrich® (St. Louis, Missouri, EUA).

2.4 Linhagens microbianas

Foram utilizadas amostras de Enterococcus faecalis (ATCC 292012) e

Candida albicans (ATCC 36802) da coleção de cultura do Laboratório da

Universidade Estácio de Sá e Laboratório de Micologia da UFRJ (Rio de

Janeiro/RJ) que foram reativadas no Laboratório de Microbiologia do

Departamento de Odontologia/CCS/UFRN. As amostras de Pseudomonas

aeruginosa (ATCC 19429) e Staphylococcus aureus (ATCC 23235) foram

obtidas obtidas mediante solicitação na Fundação Oswaldo Cruz (Rio de

Janeiro/RJ) e posteriormente reativadas no Laboratório de Microbiologia do

Departamento de Odontologia/CCS/UFRN.

Enterococcus faecalis isolado clinicamente (AB 44) foi obtido da coleção

de cultura do Laboratório de Microbiologia da UNESA (Comitê de Ética em

Pesquisa CEP protocolo nº. 0248/08), coletado de pacientes de clínicas

endodônticas da UFRJ e UNESA. Inicialmente, cones de papel de filtro foram

https://www.google.com.br/search?biw=1366&bih=638&q=St.+Louis&stick=H4sIAAAAAAAAAOPgE-LUz9U3sLC0SK5U4gAxzcoryrW0spOt9POL0hPzMqsSSzLz81A4VhmpiSmFpYlFJalFxQDMHhGVQwAAAA&sa=X&ved=0ahUKEwiW2qf_q6HPAhWKIZAKHdXDDOIQmxMIjAEoATAO

65

introduzidos nos canais radiculares desses pacientes. O material foi transferido

para caldo Enterococcosel e incubadas durante 72 h a 35 °C. Posteriormente

foram introduzidos em placas de Agar sangue e incubadas a 35 °C durante 72

h. Colônias puras foram submetidas a testes para a identificação de espécies

de enterococos (coloração de Gram, morfologia da colônia, teste de catalase,

crescimento em caldo de NaCl, hidrólise de arginina, utilização de piruvato,

motilidade, produção de pigmentação e testes de fermentação de carboidratos.

A identificação foi confirmada pela PCR utilizando iniciadores específicos de E.

faecalis.

Candida albicans isolada clinicamente (AB 100) foi obtida da coleção de

cultura do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Análises Clínicas e

Toxicológicas da UFRN (Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário

Onofre Lopes - CEP-HUOL protocolo nº. 152/07). As amostras clínicas foram

coletadas de pacientes a partir de saliva estimulada e semeadas em ágar

Sabouraud-dextrose. As mesmas foram identificadas através das provas do

tubo germinativo, caldo hipertônico, tolerância à temperatura de 42ºC ,

microcultivo, assimilação de hidratos de carbono, fermentação de açúcares e

PCR.

2.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)


metodologia adaptada de Bauer et al. (1966) para a determinação da

Concentração Inibitória Mínima . As linhagens microbianas foram cultivadas em

caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados

Unidos), incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de petri contendo Agar

Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi introduzida solução

salina inoculada com cada crescimento microbiano e foram confeccionados

cinco orifícios padronizados de aproximadamente seis mm de diâmetro em

cada placa. Foram introduzidos 50µL da substância teste (EB até a diluição em

água destilada 1:512) nos orifícios e as placas foram incubadas a 37°C por 24

horas. Cada ensaio foi realizado em triplicata sobre cada linhagem. O mesmo

procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina

66

a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e

nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).

Foi considerada CIM, a menor concentração do extrato capaz de inibir o

crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição,


Aos resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima

aplicou-se ao nível de 5% de significância, o teste t-Student ou de Mann

Whitney (p<0,05), comparando a atividade antimicrobiana entre o extrato e os

controles positivos.

2.6 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida

O potencial bactericida e fungicida do extrato de S. mombin foi avaliado

pelo método adaptado de Peyret et al. (1990). As amostras foram inoculadas

em caldo nutritivo BHI (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos), incubadas a 37º C

por 18 a 20 horas e subcultivadas em Caldo Mueller Hinton (DIFCO®,

Michigan, Estados Unidos) por 1 hora. A 9mL de cada cultura microbiana, foi

adicionado 1mL do extrato (bruto e na CIM), e ao tubo controle foi adicionado

1mL de água destilada e esterilizada. Os tubos foram mantidos na estufa a 37º

C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4, 6, e 24 horas de

incubação e semeadas em placas de petri com Agar Mueller Hinton (DIFCO®,

Michigan, Estados Unidos). Cada procedimento foi realizado em duplicata.

A leitura foi efetuada após incubação por 48 horas a 37ºC pelo método

padrão de contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) nos

tempos determinados.

2.7 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)

A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de S.

mombin foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996),

utilizando concentrações correspondentes ao extrato bruto e diluído até 1:512.

A partir do crescimento microbiano, as cepas foram subcultivadas a 37ºC em

caldo Mueller-Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Foram distribuídos

1,8 mL do subcultivo em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,2mL

67

da solução correspondente às diluições do extrato. A leitura foi realizada após

24 horas através da observação visual da aderência dos microrganismos às




(Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA.) e Nistatina


A CIMA foi definida como a menor concentração do agente que impediu

a aderência ao tubo de vidro.

2.8 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Spondias mombin sobre




UFRN).

Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com

7 mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em

2 grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado

apenas em meio básico; (ii) grupo de Spondias mombin : cultivado em meio

básico adicionado do extrato em concentrações definidas pelos testes

supracitados.

A citotoxicidade do extrato foi analisada nos intervalos de 24h e 48 h











USA).

68

3.Results

3.1 Reações de identificação

Na prospecção fitoquímica foram observados a presença de compostos

fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas.

3.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Na análise por CCD após a revelação com o Reagente Natural A, quatro

bandas com coloração amarela foram observadas, indicando a presença de

flavonoides, sendo ainda verificada uma banda de coloração azul, sugestiva de

ácido fenólico. A análise ainda confirmou através da comparação do Fator de

retenção (Rf), coloração e Co-CCD com padrões de referência a presença do

ácido elágico, quercetina e canferol no EH das folhas de S. mombin.


O extrato de S. mombin apresentou atividade antimicrobiana sobre todos

os micro-organismos testados e os halos de inibição variaram entre 8 e 30 mm.

O extrato apresentou efeito antibacteriano até a diluição de 1:512 (CIM-0,97

mg/mL) para E. faecalis ATCC, S. aureus ATCC e P. aeruginosa ATCC; 1:32

(CIM-15,65 mg/mL) para E. faecalis AB; e ação antifúngica até a diluição 1:128

(CIM-3,90 mg/mL) para C. albicans ATCC e 1:2 (CIM-250 mg/mL) para C.

albicans (AB). S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina

e estatisticamente significativo até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95

mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. E

para C. albicans ATCC e S. aureus ATCC o extrato apresentou ação

bacteriostática em uma maior diluição/menor concentração do que os grupos

controles.


69

O efeito bactericida e fungicida do extrato de S. mombin foi observado

sobre E. faecalis (ATCC e AB) quando o extrato se encontrava bruto nas duas

primeiras horas de contato com a bactéria e .após vinte e quatro horas de

contato com C. albicans (ATCC e AB).


O extrato de S. mombin apresentou efeito antiaderente sobre todas as

bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis

(ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL). A clorexidina apresentou efeito

antiaderente até a diluição 1:512 apenas para E. faecalis.

3.6 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Spondias mombin sobre


O extrato de S. mombin apresentou citotoxicidade nas concentrações

testadas (250 mg/mL, 1,95 mg/mL e 0,97 mg/mL), representada pela baixa

densidade óptica comparada ao grupo controle (cultivo em meio básico),

indicando ausência de proliferação celular.

4. Discusson

A crescente resistência entre os micro-organismos aos medicamentos,

suscitou a pesquisa por métodos alternativos para tratamento através da

obtenção de drogas com menos efeitos colaterais e toxicidade.

. A etnofarmacologia associada com o estudo químico tornou-se uma

ferramenta importante na bioprospecção. Muitos estudos têm associado às

informações sobre o uso tradicional de plantas medicinais a fitoquímica e

estudos farmacológicos para o desenvolvimento de novos fármacos e

medicamentos fitoterápicos (Medeiros et al., 2013).

Nesse sentido, este trabalho buscou caracterizar quimicamente e avaliar

a atividade bacteriostática, fungistática, antiaderente, bactericida e fungicida do

extrato de folhas de S. mombin e seu potencial efeito citotóxico.

70

Os resultados evidenciaram através de uma prospecção fitoquímica

prévia, a presença de alguns metabólitos secundários, dentre eles: compostos

fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas, em concordância aos achados de

Silva et al. (2012) e Corthout et al. (1992). Tendo em vista que diversos

estudos têm comprovado a efetividade dos compostos fenólicos, flavonoides e

taninos como agentes antimicrobianos e antioxidantes (Nascimento et al.,

2000; Elzaawely et al., 2005; Kumar, 2013; Corthout et al., 1994), pode-se

sugerir que a grande atividade antibacteriana apresentada por S. mombin

deve-se à presença desses metabólitos em sua composição.

Foi constatada ainda a presença de ácido elágico e quercetina. A

presença desses metabolitos no extrato de S. mombin já foi relatado por Silva

et al. (2012), que acreditam que a existência dos mesmos garante ao referido

extrato suas atividades antibacteriana e antioxidante. Além de possuir atividade

antibacteriana (Cushnie; Lamb, 2005), a literatura relata que a quercetina

exibe atividade antioxidante, atividade de proteção do DNA (Undeger et al.,

2004) e efeito anti-humoral (Ren et al., 2003), enquanto que o ácido elágico

apresenta atividades antioxidante (Hassoun et al.,1997, 2004; Hayes et al.,

2010), anticancro (Whitley et al., 2003), antimutagênica (Loarca-Piña et al.,

1998) e antiproliferativa (Seeram et al., 2005).

Uma vez identificados metabólitos secundários com atividade

antimicrobiana já conhecida, foi avaliada in vitro a atividade antibacteriana e

antifúngica do extrato.

S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina e

estatisticamente significativo (p 0,001) até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e

1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC,

respectivamente.

Embora Silva et al. (2012) não tenham encontrado atividade

antimicrobiana no extrato de S. mombin sobre P. aeruginosa, Sethi, Ramasamy

(2012) e Abo et al. (1999) a encontraram, corroborando assim os resultados

deste estudo, que comprovaram a atividade do extrato de S. mombin sobre

essa bactéria.

De um modo geral, as cepas isoladas clinicamente apresentaram menos

susceptibilidade ao extrato quando comparadas com as ATCC, que possuem

perfil conhecido. Entretanto, para se avaliar a atividade antimicrobiana de um















71

novo produto se faz necessário a inclusão de cepas de origem clínica, pois

apresentam diferentes perfis de susceptibilidade, assegurando maior fidelidade

na avaliação.

S. mombin apresentou ação bactericida sobre E. faecalis (ATCC e AB) e

C. albicans (ATCC e AB) e ação antiaderente sobre todas as bactérias

testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis (ATTC e AB)

até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL), confirmando a expressiva atividade

antimicrobiana do extrato sobre micro-organismos superinfectantes do

ambiente bucal.

No que diz respeito à citotoxicidade, as celulas 3T3 são comumente

utilizadas para se avaliar a toxicidade de compostos. Os dados mostraram que

através desse método e nas concentrações testadas, o extrato apresentou

citotoxicidade, uma vez que a densidade óptica obtida foi inferior ao do controle

positivo. Quando o extrato se encontrava na concentração de 250 mg/mL, o

valor da densidade óptica foi similar ao grupo controle. Entretanto, essa leitura

não representa um aumento na proliferação celular, uma vez que antes de

introduzir o MTT, as células apresentavam morfologia diferente. Pode-se

aventar que provavelmente houve alguma reação do MTT com o corante da

amostra.

No trabalho realizado por Cabral et al (2016), foi observado que o

extrato hidroetanólico das folhas de S. mombin não apresentaram toxicidade.

Foi observado, inclusive, um aumento no metabolismo mitocondrial dos

fibroblastos 3T3, com uma proliferacao de 25 -100% a mais que o controle,

podendo inferir que essa amostra possue atividade mitogênica, contrariando o

nosso estudo.

Na literatura não há outros relatos de viabilidade celular com fibroblastos

3T3 para a espécie S. mombin. Devido a esses resultados referentes à

toxicidade contraditórios, outros testes tais quais como o de citoxicidade em

hemácias e de índice de seletividade (indica quantas vezes o produto testado é

mais eficaz frente a determinados alvos do que a células humanas) podem ser

indicados para nosso objetivo e futura aplicabilidade clínica em canais

radiculares e sítios periodontais e perimplantares.

Os resultados dessa pesquisa demonstraram que S. mombin apresentou

expressiva atividade bacteriostática, fungistática, antiaderente, bactericida e

72

fungicida sobre todos os micro-organismos associados a infecções

persistentes, justificado pelos achados farmacológicos. O extrato apresentou

citotoxicidade sendo necessários outros testes que o avaliem seletivamente

permitindo a extrapolação para o uso clínico odontológico.



Acknowledgment


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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Colombo%20AP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25242933

76

5.3 O artigo “Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial action of

Lycium barbarum L. on microorganisms involved in persistent oral infections”

será enviado para o periódico “Journal of Ethnopharmacology” que possui fator

de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina II.

77

Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial action of Lycium

barbarum L. on microorganisms involved in persistent oral infections

Maria Regina Macêdo-Costaa*, Isabelle Helena Gurgel de Carvalhoa, Manoel

André de Souza Netob, Julia Morais Fernandesb, Silvana Maria Zucolotto

Langassnerb, Kenio Costa de Limaa









[email protected] (Isabelle Helena Gurgel de Carvalho), [email protected]

(Manoel André de Souza Neto), [email protected] (Julia Morais Fernandes),

[email protected] (Silvana Maria Zucolotto Langassner), [email protected] (Kenio Costa

de Lima).


78

Abstract

Os fitoterápicos têm sido uma alternativa viável para eliminar micro-organismos

oportunistas e resistentes a múltiplos antimicrobianos, que ocasionalmente

colonizam o ambiente bucal, como Enterococcus faecalis, Candida albicans,

Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. O objetivo do estudo foi

avaliar a ação antimicrobiana dos frutos de Lycium barbarum Linn sobre micro-

organismos relacionados a infecções bucais persistentes. Também foi

realizado um screening fitoquímico e investigada a citotoxicidade do extrato.

Foi realizada Cromatografia em Camada Delgada (CCD) através de placas de

sílica gel 60; tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (5:2,5:0,25, v/v/v), acetato

de etila:n-propanol:ácido acético:água (4:2:2:0,6, v/v/v/v) como fases móveis; e

para detecção dos metabólitos secundários, usou-se KOH a 5% (v/v),

Reagente Natural A 0,2 %/ luz ultravioleta em 365 nm, vanilina sulfúrica e

reagente de Drangendorff. Posteriormente, foi determinada a Concentração

Inibitória Mínima (CIM), Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) e

Cinética bactericida e fungicida de L. Barbarum Linn. Utilizou-se como controle

positivo o digluconato de clorexidina a 0,12% e nistatina 100.000U.I. Ao nível

de 5% de significância aplicou-se o teste t-Student ou de Mann Whitney

(p<0,05). As análises por CCD evidenciaram a presença de ácidos fenólicos,

cumarinas, flavonoides e carboidratos. L. barbarum apresentou atividade

bacteriostática sobre E. faecalis ATCC, P. aeruginosa ATCC e C. albicans AB.

O extrato apresentou desempenho médio superior ao controle positivo e

estatisticamente significativo até a diluição 1:4 (125 mg/mL) e 1:16 (31,25

mg/mL) sobre Enterococcus faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC,

respectivamente. L. barbarum não apresentou efeito bactericida e fungicida

sobre os micro-organismos testados, mas apresentou efeito antiaderente até a

diluição 1:32 (15,65 mg/mL) sobre P. aeruginosa ATCC. Foi verificada

citotoxicidade em cultura de células nas concentrações testadas (15,65 mg/mL

e 6,67 mg/mL). L. barbarum apresentou ação antimicrobiana expressiva sobre

P. aeruginosa, porém é necessário a realização de testes de toxicidade que

indiquem quantas vezes o produto testado é mais eficaz frente a determinado

alvo do que a célula humana, para permitir sua futura aplicação clínica.

Palavras-chave: Lycium barbarum; Microbiologia; Fitoterapia; Cromatografia

em camada delgada; Toxicidade.

79

1 Introduction

Nas últimas duas décadas, a prevalência de bactérias resistentes a uma

série de antibióticos e linhagens multirresistentes aos medicamentos, têm

causado doenças no homem. Não há tratamentos disponíveis para infecções

causadas por micro-organismos-antimicrobianos-resistentes e a resistência a

agentes comumente utilizados é expressiva (Orhan et al., 2010).

No que diz respeito a infecções bucais, diversos estudos têm identificado

a participação de micro-organismos que não são frequentemente encontrados

nessa microbiota, tais como Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae,

Candida albicans e Pseudomonas aeruginosa (Renvert et al., 2008; Salvi et al.,

2008; Seelan et al., 2015).

Enterococcus faecalis é a espécie mais comumente isolada de infecções

bucais, incluindo periodontite, infecção em canais radiculares infectados,

abcessos perirradiculares e também são detectados em terapia endodôntica

falha (Tennert et al, 2014).

P. aeruginosa é capaz de expressar diferentes fenótipos devido ao seu

alto grau de flexibilidade genômico e é reconhecida por sua resistência

intrínseca a antibióticos. Essa resistência pode ser atribuída à baixa

permeabilidade da sua parede celular, a ação de bombas de efluxo que

removem as moléculas antibióticas que penetram nos canais

intramembranosos, as mutações que podem alterar a expressão e função dos

cromossomos, a aquisição de resistência a genes por elementos genéticos

móveis, tais como plasmídeos, bacteriófagos e transposons, e a capacidade

para invadir as células eucarióticas e tornar-se um patógeno intracelular

oportunista. Em biofilmes, a resistência a antibióticos de P. aeruginosa pode

ser 10-1000 vezes maior do que na cultura planctônicas. Devido a estes

mecanismos de resistência, infecções crônicas e difíceis de erradicar estão

associadas a biofilmes de P. aeruginosa (Prochnow et al., 2016).

Cerca de 80% das infecções relacionadas com implantes podem ser

causadas por estafilococos e o patógeno nosocomial Staphylococcus aureus

representa 34% dos casos. Fungos patogênicos, incluindo Candida spp.,

também são capazes de colonizar implantes, sobretudo Candida albicans.

Ambos S. aureus e C. albicans são conhecidos por sua capacidade de formar

80

biofilmes (Kuchar kova et al., 2016). Infec es associadas a biofilme s o

difíceis de erradicar, visto que a estrutura em consórcio representa diminuição

da sensibilidade para acolher as defesas imunológicas e resistência a

tratamentos com antibióticos e antifúngicos (Tennert et al., 2014).

Nesse sentido, a busca pela farmacologia alternativa apresenta

destaque entre a comunidade cientifica nos últimos anos em virtude do alto

potencial antimicrobiano dos produtos naturais.

Nessa perspectiva, Goji berry (Lycium barbarum Linn, Solanaceae) é um

medicamento e alimento tradicional na Ásia Oriental e, mais recentemente, na

Europa e na América do Norte. Os frutos de L. barbarum têm sido amplamente

utilizados na prevenção e tratamento de várias doenças no leste da Ásia há

mais de 2000 anos (Amagase et al., 2011). Tais frutos vermelhos contêm 18

tipos de aminoácidos incluindo 8 tipos de aminoácidos essenciais, 21 tipos de

minerais, tais como zinco, ferro, cobre, cálcio, germânio, selénio e fósforo e

alguns componentes funcionais da natureza tais como flavonoides,

carotenoides e polissacarídeos (Yin et al., 2008; Wang et al., 2010; Liu et al.,

2014). Polissacarídeos são os componentes bioativos mais importantes do

fruto em termos quantitativos (arabinose, glucose, galactose, manose,

ramnose, xilose e/ou ácido galacturônico) (Fit et al., 2013). Nos últimos anos,

os polissacarídeos isolados dos extratos aquosos de L. barbarum têm sido

identificados como um dos principais ingredientes ativos responsáveis por sua

atividade biológica (Jin et al., 2013). Muitos estudos sobre Farmacologia e

fitoquímica demonstraram que L. barbarum apresenta resultados biológicos

atuando como antioxidante, imunomodulador, antitumoral, neuroprotetor,

radioprotetor (Li; Zhou, 2007; Gong et al., 2005), antidiabetes (Zhu et al., 2013),

protetor hepático , antiosteoporose, antifadiga (Jin et al., 2013) e antifúngica

(Lee et al., 2004).


antimicrobiana, antiaderente e bactericida do extrato dos frutos de Lycium

barbarum Linn sobre Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus e Candida albicans, ATCC e isolados do ambiente

bucal, bem como analisar fitoquimicamente o material vegetal e seu potencial

efeito citotóxico.

81

2. Materials and Methods

2.1 Preparação do extrato de Lycium barbarum Linn

Os frutos secos de Lycium barbarum Linn (gojiberry), foram obtidos em

loja especializada na cidade do Rio de Janeiro-RJ. A preparação do extrato foi

conduzida no Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia,

Centro de Ciências da Saúde, UFRN. O extrato foi preparado por maceração

por 7 dias com álcool etílico 70 %, na proporção 1:5 (droga vegetal: solvente,

p/v). O macerado foi filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato hidroetanólico (HE)

dos frutos de L. barbarum. O HE foi seco sob pressão reduzida com auxílio de

um evaporador rotatório a temperatura não superior a 45º C, obtendo-se o

extrato seco (EC) de L. barbarum. O EC foi retomado em água destilada, e

depois liofilizado.


As condições cromatográficas utilizadas na análise por CCD foram: i.

adsorvente: cromatoplacas de alumínio de gel de sílica F254 (Macherey-

Nagel®, Düren, Germany); ii: fase móvel A: tolueno:acetato de etila:ácido

fórmico (5:2,5:0,25, v/v/v); fase móvel B: acetato de etila:n-propanol:ácido

acético: água (4:2:2:0,6, v/v/v/v). iii: reveladores: KOH a 5% (v/v), Reagente

Natural A 0,2 %/ luz ultravioleta em 365 nm (flavonoides); vanilina sulfúrica

(terpenos); reagente de Drangendorff (alcaloides). Os fatores de retenção (Rf),

a cor e o comportamento das zonas foram comparados com perfis

cromatográficos de substâncias de referência na literatura (Wagner; Bladt,

2001).

2.3 Linhagens microbianas

Foram utilizadas amostras de Enterococcus faecalis (ATCC 292012) e

Candida albicans (ATCC 36802) da coleção de cultura do Laboratório da

Universidade Estácio de Sá e Laboratório de Micologia da UFRJ (Rio de

Janeiro/RJ) que foram reativadas no Laboratório de Microbiologia do

82

Departamento de Odontologia/CCS/UFRN. As amostras de Pseudomonas

aeruginosa (ATCC 19429) e Staphylococcus aureus (ATCC 23235) foram

obtidas obtidas mediante solicitação na Fundação Oswaldo Cruz (Rio de

Janeiro/RJ) e posteriormente reativadas no Laboratório de Microbiologia do

Departamento de Odontologia/CCS/UFRN.

Enterococcus faecalis isolado clinicamente (AB 44) foi obtido da coleção

de cultura do Laboratório de Microbiologia da UNESA (Comitê de Ética em

Pesquisa CEP protocolo nº. 0248/08), coletado de pacientes de clínicas

endodônticas da UFRJ e UNESA. Inicialmente, cones de papel de filtro foram

introduzidos nos canais radiculares desses pacientes. O material foi transferido

para caldo Enterococcosel e incubadas durante 72 h a 35 °C. Posteriormente

foram introduzidos em placas de Agar sangue e incubadas a 35 °C durante 72

h. Colônias puras foram submetidas a testes para a identificação de espécies

de enterococos (coloração de Gram, morfologia da colônia, teste de catalase,

crescimento em caldo de NaCl, hidrólise de arginina, utilização de piruvato,

motilidade, produção de pigmentação e testes de fermentação de carboidratos.

A identificação foi confirmada pela PCR utilizando iniciadores específicos de E.

faecalis.

Candida albicans isolada clinicamente (AB 100) foi obtida da coleção de

cultura do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Análises Clínicas e

Toxicológicas da UFRN (Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário

Onofre Lopes - CEP-HUOL protocolo nº. 152/07). As amostras clínicas foram

coletadas de pacientes a partir de saliva estimulada e semeadas em ágar

Sabouraud-dextrose. As mesmas foram identificadas através das provas do

tubo germinativo, caldo hipertônico, tolerância à temperatura de 42ºC,

microcultivo, assimilação de hidratos de carbono, fermentação de açúcares e

PCR.




da Concentração Inibitória Mínima. As linhagens microbianas foram cultivadas

em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados

83

Unidos), incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de Petri contendo Agar








a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e

nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).





aplicou-se ao nível de 5% de significância, o teste t-Student ou de Mann-




O potencial bactericida e fungicida do extrato de L. barbarum foi avaliado

pelo método adaptado de Peyret e colaboradores (1990). As amostras foram

inoculadas em caldo nutritivo BHI (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos),

incubadas a 37º C por 18 a 20 horas e subcultivadas em Caldo Mueller Hinton

(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) por 1 hora. A 9mL de cada cultura

microbiana, foi adicionado 1mL do extrato (bruto e na CIM), e ao tubo controle

foi adicionado 1mL de água destilada esterilizada. Os tubos foram mantidos na

estufa a 37º C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4, 6, e 24

horas de incubação e semeadas em placas de petri com Agar Mueller Hinton

(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Cada procedimento foi realizado em

duplicata.




84


A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de L.

barbarum foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996),










(Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA.) e Nistatina


A CIMA foi definida como a menor concentração do agente impediu a

aderência ao tubo de vidro.

2.7 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Lycium barbarum sobre




UFRN).

Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com 7

mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em 2

grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado

apenas em meio básico; (ii) grupo de Lycium barbarum: cultivado em meio

básico adicionado do extrato em concentrações definidas pelos testes

supracitados.




85









USA).

3. Results


Após a análise por CCD, utilizando reveladores específicos e universais,

foi observada a presença de zonas de cor azul esverdeado fluorescente (luz

UV365 nm), azul fluorescente (KOH 5%/ UV 365 nm), laranja e verde

fluorescentes (Reagente Natural A), assim como zonas de cor negra e laranja

(vanilina sulfúrica/luz visível) (figuras 1 e 2), sugestivas da presença de ácidos

fenólicos, cumarinas, flavonoides e carboidratos (Wagner et al, 2001). Usando-

se o reagente de Drangendorff não foi possível visualizar zonas de cor laranja,

o que permite sugerir a ausência de alcaloides nesse extrato.


O extrato de L. barbarum apresentou atividade sobre E. faecalis ATCC,

P. aeruginosa ATCC e C. albicans AB. Os halos variaram entre 14 e 35 mm. O

extrato apresentou ação antimicrobiana até a diluição de 1:8 (62,5 mg/mL) para

E. faecalis ATCC e até 1:16 (31,25 mg/mL) para P. aeruginosa e C. albicans

(AB). Os controles positivos se apresentaram eficazes sobre todos os micro-

organismos. Observou-se que para E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, o

86

extrato apresentou desempenho médio superior ao controle e estatisticamente

significativo até a diluição 1:4 (62,5 mg/mL) e 1:16 (31,25 mg/mL),

respectivamente.


O extrato de L. barbarum não apresentou efeito bactericida e fungicida

sobre os micro-organismos testados.


O extrato de L. barbarum apresentou efeito antiaderente sobre

Pseudomonas aeruginosa ATCC até a diluição 1:32 (15,65 mg/mL). Os

controles apresentaram efeito antiaderente até a diluição 1:512.

3.5 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Lycium barbarum sobre


O extrato de L. barbarum apresentou citotoxicidade nas concentrações

testadas (15,65 mg/mL e 6,67 mg/mL), representada pela baixa densidade

óptica comparada ao grupo controle (cultivo em meio básico), indicando

ausência de proliferação celular.

4. Discussion

Segundo Wang et al., (2016), durante a última década, o rápido

aparecimento de patógenos multirresistentes tornou-se uma preocupação

global. As infecções bucais refratárias são multifatoriais e a composição

microbiana do biofilme dentário é considerada como determinante direto

dessas doenças.

O surgimento de resistência aos antibióticos e antifúngicos, seja

devido a tensões mutagênicas ou devido a seus vários efeitos colaterais,

87

sublinhou a necessidade de se desenvolver estratégias seguras e potentes

contra os micro-organismos. Nesse sentido, os agentes naturais bioativos

parecem ser promissores (Vadekeetil et al., 2016; Aghazadeh et al., 2016).

Este trabalho buscou avaliar a atividade bacteriostática, fungistática,

antiaderente, bactericida e fungicida do extrato de frutos de L. Barbarum, bem

como analisar fitoquimicamente o material vegetal e seu potencial efeito

citotóxico.

Para tanto, o extrato de L. barbarum foi submetido a triagem por CCD

com diferentes reveladores, a fim de identificar as classes de metabólitos

secundários. Nesse sentido, foi observada a presença de ácidos fenólicos,

cumarinas, flavonoides e carboidratos, corroborando a literatura (Yin et al.,

2008; Wang et al., 2010; Liu et al., 2014).

Flavonoides são compostos que tem uma gama de atividades biológicas,

incluindo antialérgica, antibacteriana, antidiabética, anti-inflamatória, antiviral,

antiproliferativa, antimutagênica, antitrombótico, anticarcinogênico,

hepatoprotector, estrogênico, inseticida e antioxidante (Trigali, 2001). Três

flavonoides foram identificados por meio de LC-MS: campferol, quercetina e

miricetina (Le, Chiu, Ng, 2007).

Cumarinas são metabólitos secundários que podem apresentar atividade

antiagregante plaquetária, anti-inflamatória e potente efeito anti-tumoral (Ito et

al., 1999; Souza et al, 2005).


antimicrobiana já conhecida e estudada, foi avaliada in vitro a atividade

antibacteriana e antifúngica do extrato.

O extrato de L. barbarum apresentou efeito bacteriostático sobre E.

faecalis ATCC e Pseudomonas aeruginosa ATCC e fungistático frente Candida

albicans AB. Observou-se que para E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC o

extrato apresentou desempenho médio superior ao controle e estatisticamente

significativo (p 0,001) até as diluições 1:4 (125 mg/mL) e 1:16 (31,25 mg/mL),

respectivamente. Ambas espécies ATCC foram as mais susceptíveis ao extrato

do que as correspondentes isoladas clinicamente, uma vez que as cepas

padrão possuem perfil de sensibilidade conhecida.

O extrato de L. barbarum não apresentou efeito bactericida e fungicida

sobre nenhum micro-organismo testado o que surpreende, visto que segundo

88

Orhan e colaboradores (2010) a presença de compostos, tais como

flavonoides, justificam ação antimicrobiana in vitro. Entretanto é importante

salientar a multirresistência dos micro-organismos envolvidos nesse estudo.

Na determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência

(CIMA) foi observado que o extrato apresentou efeito antiaderente,

representado pela ausência de aderência microbiana ao tubo de vidro,

simulando uma superfície do ambiente bucal até a diluição 1:32 (15,65 mg/mL)

sobre P. aeruginosa ATCC.

Alguns estudos relatam o efeito antimicrobiano do extrato aquoso de

gojiberry sobre E. coli, com halos de inibição de até 25 mm (Fit et al., 2013).

Em outro estudo, a atividade antimicrobiana do extrato da flor de L. barbarum

foi avaliada por meio do ensaio de difusão em ágar, revelando que o extrato foi

mais ativo nas cepas de bactérias Gram-positivas, sobretudo sobre

Staphylococcus aureus.

Era esperado que o extrato de L. barbarum apresentasse uma ação

antimicrobiana mais expressiva, visto a identificação de flavonoides. Entretanto,

muitos estudos estão sendo realizados a partir do isolamento das principais

classes de flavonoides encontrados na planta. Estes têm sido propostos como

agentes modernos e adjuntos para o tratamento de infecções bacterianas,

terapias antipatogenicidade e como moléculas de captura para a remoção de

endotoxina a partir de preparações farmacêuticas (Cushnie et al 2011).

No que diz respeito ao potencial citotóxico sobre filbroblastos 3T3, o

extrato de L. barbarum, nas concentrações testadas (15,65 mg/mL e 6,67

mg/mL), apresentou toxicidade. Na literatura nao há outros relatos de

viabilidade celular com fibroblastos 3T3 para a espécie L. Barbarum.

Entretanto, esses resultados referentes à toxicidade são contraditórios, visto

que tais frutos são um ingrediente popular na culinária chinesa e em demais

países asiáticos. Outros testes tais quais o índice de seletividade (indica

quantas vezes o produto testado é mais eficaz frente a determinados alvos do

que a células humanas) podem ser indicados para esse objetivo e para que

possa ter futura aplicabilidade clínica.

89



Acknowledgment

No financial support was received during the current study

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91

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chelliah%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26538921

92

Figuras Figura 1. Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da fase móvel A

Rf Cor

UV 365 nm

KOH 5% (v/v)/UV 365 nm

Vanilina Sulfúrica

Reagente Natural A/ UV

365 nm Dragendoff

0,25 - Azul-verde - - -

0,31 - - - Verde -

0,42 - - - Laranja -

0,50 - Azul-verde Negro - -

0,68 - - - Verde -

0,78 - - Laranja Laranja -

0,80 - Azul-verde - - -

0,95 - Azul-verde - - -

Figura 2. Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da fase móvel B

Rf Cor

UV 365 nm

KOH 5% (v/v)/UV 365 nm

Vanilina Sulfúrica

Reagente Natural A/

UV 365 nm Dragendoff

0,10 - - Negro - -

0,25 - - - Laranja -

0,30 - - - Verde -

0,44 Azul Azul brilhante - Azul -

93

5.4 O artigo “Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial potential of

Solanum paniculatum Linn on Staphylococcus aureus e Pseudomonas

aeruginosa” será enviado para o periódico “Journal of Ethnopharmacology” que

possui fator de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina II.

94

Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial potential of

Solanum paniculatum Linn root extract on Staphylococcus aureus and

Pseudomonas aeruginosa

Maria Regina Macêdo-Costaa*, Manoel André de Souza Netob, Julia Morais

Fernandesb, Silvana Maria Zucolotto Langassnerb, Kenio Costa de Limaa









[email protected] (Manoel André de Souza Neto), [email protected] (Julia

Morais Fernandes),(Silvana Maria Zucolotto Langassner), [email protected] (Kenio Costa de

Lima).

95

Abstract

O objetivo do estudo foi avaliar a ação antimicrobiana de Solanum paniculatum

Linn sobre Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, bem como

caracterizar o perfil fitoquímico e citotoxicidade. Nas análises por CCD foram

utilizadas placas de sílica gel 60; AcOEt:Ácido fórmico:MeOH:Água

(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH:Ácido fórmico:Água (3:1:1, v/v/v) e

Clorofórmio:MeOH (8:2, v/v) como fases móveis; e para detecção dos

metabólitos secundários, usou-se vanilina sulfúrica, solução FeCl3 1 %,

Reagente Natural A 0,5% e Dragendorff. Posteriormente, foi determinada a

Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Inibitória Mínima de

Aderência (CIMA) e Cinética bactericida de S. paniculatum. Utilizou-se como

controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12%. Ao nível de 5% de

significância aplicou-se o teste t-Student ou de Mann Whitney (p<0,05). O

potencial citotóxico do extrato foi avaliada através da viabilidade celular de

fibroblastos da linhagem 3T3. As análises por CCD sugerem a presença de

terpenos, flavonoides, compostos fenólicos, glicosídeos de ácidos fenólicos,

cumarinas e alcaloides. O extrato apresentou desempenho médio superior à

clorexidina e estatisticamente significativo (p 0,001) até a diluição 1:16 (31,25

mg/mL) sobre P. aeruginosa. S. paniculatum não apresentou efeito bactericida

sobre os micro-organismos testados, mas apresentou efeito antiaderente até a

diluição 1:8 (62,5 mg/mL) para S. aureus e 1:2 (250 mg/mL) para P.

aeruginosa. Foi verificada citotoxicidade nas concentrações testadas (31,25

mg/mL, 7,81 e 0,97 mg/mL). S. paniculatum apresentou ação bacteriostática e

antiaderente, sobretudo para P. aeruginosa despertando a busca de

metabólitos secundários bioativos a partir de fontes naturais frente a micro-

organismos superresistentes.

Palavras-chave: Solanum paniculatum; Microbiologia; Fitoterapia;

Cromatografia em camada delgada

96

1. Introduction

A ineficácia dos antibióticos contra vários micro-organismos é uma

ameaça crescente no campo da saúde bucal (Smith et al., 2013). A resistência

aos antimicrobianos e a presença de espécies superinfectantes têm levado a

periodontites refratárias e intervenções endodônticas e sítios de implantes

falhos, realçando as barreiras terapêuticas em infecções dentárias (Rôças;

Siqueira, 2013; Al-Ahmad et al., 2014; Karygianni et al., 2016).

Tendo em vista a crescente ineficiência na erradicação de bactérias que

causam infecções bucais persistentes, a implementação de novos tratamentos

inspirados pela natureza têm suscitado interesse.

Muitos estudos têm sido desenvolvidos visando avaliar o uso popular de

plantas na Odontologia, tornando possível a identificação de espécies vegetais

com potencial atividade biológica (Ocheng et al., 2014; Mogosanu et al., 2015),

inclusive contra micro-organismos superinfectantes do meio ambiente bucal,

tais como: Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa.

Staphylococcus aureus é uma bactéria gram-positiva, espécie ubíqua

encontrada na pele, cabelo, nariz e garganta de pessoas e animais. É o agente

causador de um amplo espectro de infecções em seres humanos (Otto, 2013).

S. aureus pode produzir um biofilme de várias camadas incorporado dentro de

uma estrutura de glicocálice com expressão de proteínas heterogêneas

(Laverty et al., 2013; Giaouris et al., 2015). S. aureus abriga uma variedade de

adesinas proteicas e não proteicas que medeiam a ligação com uma

multiplicidade de fatores do hospedeiro, tais como a matriz extracelular e

proteínas plasmáticas e células hospedeiras humanas, ou adesão intercelular,

que é essencial para a acumulação de biofilme (Heilmann, 2011; Giaouris et

al., 2015).

Pseudomonas aeruginosa, é um patógeno oportunista, que estabelece a

sua patogênese através de um arsenal de fatores, tais como exoenzimas

(protease e elastase), sideróforos, alginato e rhamnolipídeos. Para intensificar

a infecção, este organismo forma consórcios microbianos que o torna menos

vulnerável a agentes antimicrobianos e à imunidade do hospedeiro, além de

três mecanismos de quorum sensing. Assim, a era pós-antibiótica precisa de

estratégias alternativas para controlar a patogenicidade e resistência

97

antimicrobiana, bem como para manter a homeostase da microbiota

(Vadekeetil et al., 2016).

No Brasil, existem diversas plantas potencialmente medicinais, como a

Solanum paniculatum Linn (jurubeba). Esta espécie está listada na

Farmacopeia Brasileira (Brasil, 1959) e pertence a "Relação Nacional de

Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (Renisus)” (Brasil,

2008) por apresentar potencial em gerar produtos de interesse do Ministério da

Saúde. O gênero Solanum é considerado um dos mais vastos e complexos

entre as angiospermas, possuindo 1500 espécies Nativa do Brasil, pertence à

família Solanaceae, comum em vários estados do país, estende-se desde os

limites das Guianas até São Paulo e Minas Gerais. Também é comumente

encontrada no Paraguai, Bolívia e Argentina.

No que se refere a aspectos farmacológicos, são constatadas em

Solanum paniculatum são constatadas ação antibacteriana, antifúngica,

antiviral, moluscicida, anticancerígena, anti-inflamatória, antioxidante, diurética,

antidiarreica, hepatoprotetora, gastroprotetora e antiulcerogênica. No entanto,

Solanum paniculatum pode determinar sinais de toxicidade, diarreias, náuseas,

vômitos, gastrite e duodenite erosiva, elevação das enzimas hepáticas e

eventualmente sintomas neurológicos. (Mesia-Vela et al., 2002; Oliveira et al.,

2006; Valadares et al., 2009; Lôbo et al., 2010; Vieira et al., 2013; Silva et al.,

2013; Macêdo-Costa et al., 2014; Vieira Júnior et al., 2015; Gregoris et al.,

2013; Martins et al., 2015; Clementino-Neto et al., 2016).


antibacteriana, antiaderente e bactericida do extrato das raizes de Solanum

paniculatum sobre Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, bem

como analisar fitoquimicamente o material vegetal e seu potencial efeito

citotóxico.

2.Materials and Methods

2.1 Preparação do extrato de Solanum paniculatum

98

As raizes de S. paniculatum foram obtidas na cidade do Natal- RN,

possuindo como coordenadas geográficas latitude: 5º 51’ 30” S e longitude: 5º

51’ 30” W. A identifica o botânica foi realizada pela Profa. Dra. Maria Iracema

Bezerra Loyola (Departamento de Biologia/UFRN), e a exsicata depositada no

Herbário do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Brazil (UFRN 5468).

As raízes secas foram submetidas à maceração (1:2 p/ v, planta / etanol)

durante 72 h à temperatura ambiente para se obter o extrato etanólico de S.

paniculatum (rendimento: 1, 0,80% em relação à planta seca). O macerado foi

filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato etanólico (EE) das raízes de S.

paniculatum e seco sob pressão reduzida, com auxílio do Rotaevaporador

(Buchi R-210 Rotavapor®, Nova Castel, DE). O extrato seco foi retomado em

água destilada, e depois liofilizado.


As condições cromatográficas utilizada na análise por CCD foram: i.

adsorvente: cromatoplacas de alumínio de gel de sílica F254 (Merck®,

Darmstadt, Germany); ii: fase móvel: AcOEt:Ácido fórmico:MeOH:Água

(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH:Ácido fórmico:Água (3:1:1, v/v/v) e

Clorofórmio:MeOH (8:2, v/v) e iii: reveladores: vanilina sulfúrica (terpenos,

heterosídeos tritepênicos (saponinas) e substâncias de óleos essenciais);

cloreto férrico (detecção de compostos fenólicos); Reagente Natural A 0,5 %

(difenilboriloxietilamina), (detecção específica de flavonoides)/seguido de

observação sob luz ultravioleta em 365 nm; e Reagente de Drangendorf

(detecção de alcaloides). Os fatores de retenção (RF), a cor e comportamento

dos pontos foram comparados com perfis cromatográficos de substâncias de

referência na literatura (Wagner; Bladt, 2001).

2.3 Linhagens bacterianas

Foram utilizadas amostras de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 19429)

e Staphylococcus aureus (ATCC 23235) obtidas mediante solicitação à

99

Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro/RJ) e posteriormente reativadas no

Laboratório de Microbiologia do Departamento de Odontologia/CCS/UFRN.




da Concentração Inibitória Mínima. As linhagens microbianas foram cultivadas

em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados

Unidos), incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de petri contendo Agar








a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA).





aplicou-se ao nível de 5% de significância, o teste t-Student ou de Mann-



2.5 Determinação da Cinética Bactericida

O potencial bactericida do extrato de S. paniculatum foi avaliado pelo

método adaptado de Peyret e colaboradores (1990). As amostras foram

inoculadas em caldo nutritivo BHI (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos),

incubadas a 37º C por 18 a 20 horas e subcultivadas em Caldo Mueller Hinton

(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) por 1 hora. A 9mL de cada cultura

microbiana, foi adicionado 1mL do extrato (bruto e na CIM), e ao tubo controle

100

foi adicionado 1mL de água destilada e esterilizada. Os tubos foram mantidos

na estufa a 37º C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4, 6, e 24

horas de incubação e semeadas em placas de petri com Agar Mueller Hinton

(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Cada procedimento foi realizado em

duplicata.





A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de S.

paniculatum foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996),










(Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA.).

A CIMA foi definida como a menor concentração do agente impediu a

aderência ao tubo de vidro.

2.7 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de S. paniculatum sobre




UFRN).

Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com 7

mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em 2

101

grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado

apenas em meio básico; (ii) grupo de S. paniculatum: cultivado em meio básico

adicionado do extrato em concentrações definidas pelos testes supracitados.












USA).

3 Results


Após a análise por CCD, com o uso do revelador universal vanilina

sulfúrica, foram observadas zonas de coloração negra, violácea e amarela,

sugestivas, respectivamente, de carboidratos, terpenos e flavonoides. A

presença de zonas violáceas (fase móvel A-Figura 1) mais afastadas do fronte

(Rf < 0,7) permite inferir que sejam glicosídeos de terpenos. Quando a

revelação foi feita com cloreto férrico, foram visualizadas bandas de coloração

marrom, sugerindo a presença de compostos fenólicos. Sob visualização em

luz UV a 365 nm e posterior revelação com o Reagente Natural A, foram

observadas zonas de cor azul fluorescente, indicativas de ácidos fenólicos,

cumarinas e flavonoides, que ocorreram principalmente após o uso da fase

móvel B (Figura 2), de maior polaridade, sendo possivelmente glicosídeos.

Após o uso da fase móvel C e revelação o reagente de Dragendorff, foi

visualizada uma banda alaranjada, sugerindo a presença de alcaloides.

102


O extrato de S. paniculatum apresentou desempenho médio superior à

clorexidina e estatisticamente significativo (p 0,001) até a diluição 1:16 (31,25

mg/mL) sobre P. aeruginosa. Não houve ação bacteriostática sobre S. aureus

em nenhuma das diluições. O controle positivo apresentou eficácia sobre os

microrganismos até a diluição 1:256.

3.3 Determinação da Cinética Bactericida

O extrato de S. paniculatum não apresentou efeito bactericida sobre os

micro-organismos testados.

.


O extrato de S. paniculatum apresentou efeito antiaderente sobre os

micro-organismos testados até a diluição 1:8 (62,5 mg/mL) para S. aureus e 1:2

(250 mg/mL) para P. aeruginosa. A clorexidina apresentou efeito antiaderente

até a diluição 1:128.

3.5 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de S. paniculatum sobre


O extrato de S. paniculatum apresentou citotoxicidade nas

concentrações testadas (31,25 mg/mL, 7,81 mg/mL e 1,95 mg/mL),

representada pela baixa densidade óptica comparada so grupo controle (cultivo

em meio básico), indicando ausência de proliferação celular.

4 Discussion

Diversas condições que afetam a saúde bucal podem ser prevenidas,

controladas e/ou tratadas com o uso de recursos naturais - medicamentos ou

103

formulações. Há uma longa lista de drogas baseadas e derivadas de produtos

naturais, tais como, antissépticos bucais, pastas de dentes, dentre outros, que

estão disponíveis para consumo ou são administradas sob prescrição

(Newman; Cragg, 2016). Entretanto, as razões pela busca de novas

modalidades de tratamento não cessa: resistência microbiana, toxicidade a

curto e longo prazo, efeitos adversos e colaterais e custos elevados (Freires;

Rosalen, 2016).

Nesse sentido, este trabalho avaliou a atividade bacteriostática,

antiaderente e bactericida do extrato de S. paniculatum sobre S. aureus e P.

aeruginosa, bem como analisou fitoquimicamente o material vegetal e seu

potencial efeito citotóxico.

Para tanto, o extrato de S. paniculatum foi analisado por triagem por

CCD com diferentes reveladores, a fim de identificar as classes de metabólitos

secundários.

Alguns estudos anteriores identificaram como constituintes químicos da

jurubeba: alcaloides (jurubebina, jubebina, isojuripidina); as solaninas

(solamina, solanidina, solasodina); as resinas (jupebina e jupebenina);

saponinas (isojurubidina, isopaniculidina, isojurupidina e jurubidina); os

compostos esteroidais nitrogenados (paniculina, jurubina); agliconas; ácidos

graxos; ácidos orgânicos; os glicosídeos (paniculoninas A e B), além de

mucilagens e princípios amargos (Mesia-Vela et al., 2002).

Análises fitoquímicas realizadas com o extrato etanólico da raiz de

jurubeba também indicam a existência de taninos flobabênicos (taninos

condensados ou catéquicos), flavonóis, flavanonas, triterpenoides pentacíclicos

livres e saponinas (Cordeiro, 2008).

Nosso estudo corrobora alguns citados acima visto que também

identificamos a presença de alcaloides (Rf 0,07). Identificamos manchas

sugestivas de terpenos (Rf 0,24, 0,53, 0,66, 0,75, 0,84, 0,92) e flavonoides (Rf

0,25, 0,43 e 0,55). Dessas, algumas manchas poderiam corresponder a

agliconas terpenoídicas, enquanto que as manchas entre os valores de Rf 0,24

e 0,84 podem ser heterosídeos triterpênicos (saponinas). Visualizamos também

a presença de bandas de compostos fenólicos, essas substâncias

possivelmente são glicosídeos de ácidos fenólicos ou cumarinas, mas ainda é

possível que algumas dessas substâncias sejam flavonoides, pois as zonas

104

fluorescentes de valor de Rf 0,31, 0,43 e 0,62 apresentaram-se como manchas

amarelas na placa revelada com vanilina sulfúrica. A literatura relata o aspecto

de apenas alguns flavonoides para o método de análise utilizado neste estudo.

Logo, são necessárias análises com técnicas de maior poder informativo para

esclarecer essas hipóteses, como técnicas espectroscópicas (espectroscopia

no ultravioleta e infravermelho, ressonância magnética nuclear) e

espectrométricas (espectrometria de massas).

Macedo-Costa et al. (2014) analisaram o extrato da raiz de S.

paniculatum por triagem fitoquímica preliminar e impressões digitais por CCD.

Os resultados obtidos revelaram a presença de fenóis (dentre os quais

flavonoides e traços de taninos pirogálicos), gomas, lactonas e alcaloides (em

presença dos reativos de Dragendorff e Bertrand) e saponinas. Na análise

qualitativa de fenóis, em relação aos flavonoides e taninos, encontrou-se

mancha sugestiva de isovitexina e ácido tânico, respectivamente.

Em estudo realizado por Vieira Júnior et al., (2015) através do

fracionamento dos extratos etanólicos (70%) de partes aéreas (folhas e galhos)

de S. paniculatum, foram isoladas as saponinas, (22R, 23S, 25R)-3b, 6a, 23-

trihydroxy-5a-spirostane 6-O-b-D-xylopyranosyl-(100 00 ?300 0)-O-[b-D-

quinovopyranosyl(100 0 ?20)]-O-[a-L-rhamnopyranosyl(100 ?30)]-O-b-D-

quinovopyranoside e diosgenin 3-O-b-D-glucopyranosyl(100 ?60)-O-b-D-

glucopyranoside, bem como quatro componentes já conhecidos: ácido cafeico,

diosgenina b-D-glucopiranósido, rutina, e quercetina 3-O-a-L-ramnopiranosil

(100 0? 600) -O-b-D-glucopiranósido.


antimicrobiana já conhecida, foi avaliada in vitro a atividade antibacteriana do

extrato.

O extrato de S. paniculatum apresentou atividade bacteriostática sobre

P. aeruginosa até a diluição 1:16 (31,25 mg/mL) apresentando desempenho

médio superior à clorexidina, sendo estatiscamente significativa (p 0,001) até

essa concentração. Sobre S. aureus o extrato não apresentou atividade, o que

não surpreende visto que trata-se de uma bactéria extremamente patogênica,

resistente a antibióticos e comumemente envolvida na falha de implantes

dentários (Thurnheer et al, 2015) e, em alguns estudos, relatada em cáries com

comprometimento de dentina (Kaur et al., 2015).

105

Lôbo et al. (2010) e Pereira et al. (2010) constataram a ação

antibacteriana de raizes de S. paniculatum sobre Escherichia coli, P.

aeruginosa e S. aureus, contrariando o nosso estudo para essa última bactéria,

porém as linhagens de ambos estudos foi bovina.

Além da ação antibacteriana, foi avaliada in vitro por Valadares et al.,

(2009), a atividade antiviral do extrato de folhas de S. paniculatum sobre vírus

da Herpes tipo I (HSV-1), vírus da encefalomiocardite de murídeo (EMCV) e

vírus da vacínia (VACV). S. paniculatum inibiu a replicação de HSV-1

[Concentração eficaz 50% antiviral = (298,0 ± 11,2) µg / mL] e não mostrou

nenhum efeito sobre EMCV e VACV.

Em relação ao grupo controle, o digluconato de clorexidina, “gold

standard”, é um agente anti-séptico ou desinfetante, que é ativo contra diversas

bactérias, vírus e fungos. Seu mecanimo de ação se dá através da

desestabilização a parede celular bacteriana e interferência com a osmose.

Além disso, a absorção bacteriana de clorexdina é muito rápida, o que facilita a

ruptura da parede celular e membrana citoplasmática causando a morte celular

(Asokan et al., 2009; . Ilango et al., 2013). No nosso estudo ambas bactérias

apresentaram sensibilidade a essa substância, entretanto S. paniculatum

apresentou desempenho médio superior para P. aeruginosa.

No nosso estudo o extrato não apresentou efeito bactericida, e foi

verificada uma discreta ação antiaderente até a diluição 1:8 (62,5 mg/mL) para

S. aureus e 1:2 (250 mg/mL) para P. aeruginosa, salientando a capacidade que

essas bactérias possuem de aderir a estruturas duras e que não descamam, tal

qual fazem no ambiente bucal.

Ao contrário desse estudo, Macedo-Costa et al. (2014) avaliaram a

ação antibacteriana do extrato da raiz de S. paniculatum, sobre bactérias

bucais endógenas: Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguinis, S. oralis, S.

salivarius e Lactobacillus casei. O extrato apresentou CIM de 7,81 mg/mL,

CIMA de 62,5 mg/mL e foi bactericida na concentração de 500 mg/mL em 2

horas de contato com S. mutans e na CIM em 4 horas. Esse estudo também

avaliou a ação do extrato bruto e diluído (CIM) de S. paniculatum sobre micro-

organismos em cultura mista na forma planctônica e organizados em biofilme, a

partir de saliva humana. Observou-se que o extrato bruto de jurubeba

apresentou ação antimicrobiana sobre os micro-organismos em cultura mista

106

na forma planctônica e organizados em biofilme, entretanto, considerando a

sua CIM, não foi evidenciada tal ação, visto que o extrato se encontrava

diluído, portanto não apresentando ação sobre cultura mista e tão pouco sobre

micro-organismos organizados em consórcios.

No que diz respeito à citotoxicidade, as celulas 3T3 são comumente

utilizadas para se avaliar a toxicidade de compostos. Os dados mostraram que

através desse método e nas concentrações testadas, o extrato apresentou

citotoxicidade, uma vez que a densidade óptica obtida foi inferior ao do controle

positivo.

Na literatura não há outros relatos de viabilidade celular com fibroblastos

3T3 para a espécie S. paniculatum, entretanto a toxicidade aguda da raiz de S.

paniculatum em camundongos pela determinação da dose letal (DL50) e o

potencial citotóxico em eritrócitos humanos foi avaliada por Macedo-Costa et al.

(2014). O extrato não provocou mortalidade em nenhuma das concentrações

testadas (500 mg/mL-0,97 mg/mL) após 24, 72 hs e 15 dias. Quanto às

principais alterações comportamentais observadas nos camundongos tratados

com o extrato nos tempos de 30, 60, 90 e 240 minutos, foram verificadas

apenas piloereção e movimentos intensos das vibrissas até os primeiros 60

minutos até a concentração de 31,25 mg/mL (diluição 1:16). Não foi observado

nenhum efeito colateral grave e os animais apresentaram apenas pequenas

alterações comportamentais sugestivas de estimulação do SNC. Na avaliação

de citotoxicidade, foi observado nesse estudo que S. paniculatum induziu uma

baixa atividade hemolítica (menor que 50%) frente a eritrócitos humanos dos

tipos A, B, O e AB na concentração de 7,81 mg/mL (CIM), entretando

apresentou citotoxicidade na concentração de 250 mg/mL (diluição de 1:2).

Ainda no que diz respeito à toxicidade, Vieira, Santos e Chen-Chen

(2010) avaliaram as atividades mutagênica e citotóxica dos extratos etanólico

das folhas e dos frutos de S. paniculatum, utilizando o teste do micronúcleo em

medula óssea de camundongos. Os resultados indicaram que os extratos

etanólicos, tanto das folhas quanto dos frutos de S. paniculatum, não

apresentaram ação mutagênica em medula óssea de camundongos, porém,

em doses mais elevadas, ambos extratos exibiram atividade citotóxica. No

entanto, este estudo não apresentou um aumento de citotoxicidade em dose-

resposta de 200 e 300 mg.kg-1.

107

Devido a esses resultados contraditórios referentes à toxicidade, outros

testes como o de citoxicidade em hemácias e de índice de seletividade (indica

quantas vezes o produto testado é mais eficaz frente a determinados alvos do

que a células humanas) podem ser indicados.



Acknowledgment


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110

Figuras

Figura 1. Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da fase móvel A

Rf

Cor

Vanilina Sulfúrica

Cloreto férrico UV 365 nm Reagente Natural A/ UV 365 nm

0,05 negro Marrom azul Azul

0,24 violeta - - -

0,39 - - - Azul

0,53 violeta - - -

0,66 violeta - - -

0,75 violeta - - Azul

0,84 violeta - azul Azul

0,92 violeta - - -

Figura 2. Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da fase móvel B

Rf

Cor

Vanilina Sulfúrica

Cloreto férrico UV 365 nm Reagente

Natural A/ UV 365 nm

0,25 amarelo - azul Azul

0,32 - marrom azul Azul

0,34 - - azul Azul

0,43 amarelo - azul Azul

0,47 - marrom - -

0,54 amarelo - azul -

0,64 - marrom azul Azul

0,69 - - azul Azul

0,78 violeta - - -

0,81 - - azul Azul

0,87 violeta - - -

111

6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES

A tese “Caracterização química, citotoxicidade e ação antimicrobiana

de extratos vegetais sobre micro-organismos superinfectantes do meio

ambiente bucal” é resultado da colaboração do Laboratório de Microbiologia

(Departamento de Odontologia-UFRN), Laboratório de Farmacognosia

(Departamento de Farmácia-UFRN), Laboratório de Biotecnologia de polímeros

naturais (Departamento de Bioquímica-UFRN), Laboratório de Pesquisa em

Petróleo (Núcleo de Processamento Primário e Reúso de Água produzida e

resíduo-UFRN), Laboratório de Microbiologia Clínica (Departamento de

Microbiologia e Parasitologia-UFRN), Laboratório de Cultura de Células

(Departamento de Bioquímica-UFRN), Laboratório de Microbiologia

(Universidade Estácio de Sá- Rio de Janeiro/RJ), Laboratório de Micologia (Rio

de Janeiro/RJ-UFRJ) e Laboratório de Microbiologia (Departamento de

Análises Clínicas e Toxicológicas-UFRN).

Inicialmente, a doutoranda avaliou a atividade antimicrobiana de

diversos extratos vegetais (jenipapo, corama, urucum, umbu, juá, maracujá

amarelo, quixabeira, cajá, jurubeba e gojiberry). Dentre esses, as raízes de

Solanum paniculatum, os frutos de Lycium barbarum e folhas de Spondias

mombin apresentaram significativa ação biológica justificando a sua inclusão

na referida pesquisa. Foi aventada a possibilidade de se realizar ensaios

clínicos controlados randomizados com os extratos, entretanto é mandatório

que seja cumprido todo o protocolo, envolvendo inúmeros testes in vitro,

ensaios pré clínicos e a autorização da Agência Nacional de Vigilância

Sanitária (ANVISA) para iniciar tal estudo de intervenção. Todas essas etapas

não seriam concluídas no período de doutoramento, visto que a jornada

investigativa desde a identificação de uma planta até a confecção de um

produto é árduo, oneroso e dinâmico, exigindo até décadas de estudo e

experimentações. Alguns autores apontam o período de 15 anos para tal feito.

Todas as etapas da pesquisa foram realizadas pela doutoranda Maria

Regina Macedo Costa e contribuiu para a capacitação de alunos da graduação

em Odontologia, monitores da disciplina de Microbiologia e Imunologia Oral,

alunos de iniciação científica e pós graduandos do curso de Odontologia e

Farmácia.

112

Os recursos disponíveis para a pesquisa foram escassos, o acesso aos

laboratórios e equipamentos para confecção e liofilização dos extratos e

desenvolvimento dos métodos foram bastante restritos, mas o compromisso

das pessoas envolvidas, a motivação, e o amor à ciência fizeram com que

chegássemos à concretização de nossos objetivos de maneira exitosa.

A partir dos resultados da pesquisa, pretende-se: desenvolver soluções

naturais para tratamento de infecções bucais persistentes ou refratárias, que

apresentem custo mais acessível à população e aos serviços públicos de

saúde, a fim de que seu uso possa ser implementado prioritariamente nos

serviços de Atenção Básica; solicitação de patente dos fitoterápicos cuja

concentração a ser testada in vivo for determinada a partir dos resultados da

pesquisa; produção de cartilha referente ao uso de fitoterápicos no meio

ambiente bucal e distribuição das mesmas nas unidades de saúde do SUS da

cidade do Natal-RN.

Durante o período do doutorado houve participação da aluna em 3 cursos

relacionados à referida pesquisa; 53 resumos publicados em anais e

apresentados em Congressos internacionais, nacionais, regionais e locais

relacionados ao tema da pesquisa do doutorado e 6 trabalhos apresentados

contemplam diretamente os resultados da pesquisa da tese; 3 artigos

científicos publicados em periódico internacional e 1 artigo científico aceito em

periódico internacional; e 3 artigos científicos que serão submetidos à

publicação em periódicos internacionais. A aluna e seu orientador foram

contemplados com financiamento do Projeto de Pesquisa Científica,

Tecnológica ou de Inovação, do Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação e

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq

(Edital N º 01/2016 – Universal, intitulado: “Caracterização química,

citotoxicidade e ação antimicrobiana de Solanum paniculatum Linn e Lycium

barbarum Linn sobre microrganismos superinfectantes do meio ambiente

bucal” (tese de doutorado). Foram publicados 2 livros: “Plantas medicinais e

produtos bioativos na Odontologia” (2016), em que a aluna Maria Regina

Macedo Costa é uma das autoras e organizadoras do mesmo, e um dos

capítulos do referido livro, intitulado: ”Solanum paniculatum Linn: Agente

antimicrobiano potencial frente a micro-organismos do meio ambiente bucal” foi

produzido a partir dos resultados da tese de doutorado e tem como autores,

113

além da aluna, o orientador Prof. Dr. Kenio Costa de Lima. O segundo livro

“Triagem Fitoquímica e a o antibacteriana de Spondias mombin L.”que inclui

uma das plantas pesquisadas na tese. Foi criado o Grupo de Pesquisa “Liga de

Microbiologia do ambiente bucal” envolvendo alunos dos cursos de graduação

em Odontologia e foi proposto e aprovado pelo Núcleo Docente Estruturante

(NDE-DOD-UFRN) o componente curricular “Práticas Integrativas e

Complementares na Odontologia”, que tem como objetivo estimular alternativas

inovadoras e socialmente contributivas (dentre elas, a Fitoterapia) ao

desenvolvimento sustentável de comunidades e possibilitar o resgate e

valorização do conhecimento tradicional propiciando a troca de informações

entre, detentores de conhecimento tradicional, pesquisadores e docentes,

discentes e trabalhadores em saúde.

Logo, a realização dessa pesquisa foi fundamental para o estudo, o

desenvolvimento ordenado e a aplicação da pesquisa nacional neste Campo,

visto que a partir da conclusão dessa tese foi possível determinar a

concentração dos extratos que servirá de base para formulação de

fitoterápicos, cuja autorização e comercialização será solicitada para a Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a fim de que os mesmos possam

ser testados in vivo. A pesquisa sugere a capacitação de profissionais em

saúde bucal e geral, além de contribuir com a inserção de uma prática de

saúde tradicional no âmbito da assistência pública, respaldada pelo uso

popular, porém à luz do conhecimento científico.

114

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APÊNDICES

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4 SOLANUM PANICULATUM LINN: AGENTE ANTIMICROBIANO

POTENCIAL FRENTE A MICRO-ORGANISMOS DO MEIO AMBIENTE BUCAL

Maria Regina Macêdo-Costaa

Kenio Costa de Limaa

aDepartamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

[email protected], [email protected].

Ao longo dos séculos, a humanidade tem se beneficiado da medicina

natural para tratar ou prevenir uma ampla gama de doenças. Metabólitos

secundários de plantas e produtos microbianos e marinhos têm sido

considerados uma valiosa fonte de novas moléculas com potencial para o

desenvolvimento de medicamentos (CRAGG; NEWMAN, 1860). Diversas

condições que afetam a saúde bucal podem ser prevenidas, controladas e/ou

tratadas com o uso de recursos naturais - medicamentos ou formulações. Há

uma longa lista de drogas baseadas e derivadas de produtos naturais,

antissépticos bucais, pastas de dentes, dentre outros, que estão disponíveis

para consumo ou são administradas sob prescrição (NEWMAN; CRAGG,

2014). Entretanto, as razões pela busca de novas modalidades de tratamento

não cessa: resistência microbiana, toxicidade a curto e longo prazo, efeitos

adversos e colaterais e custos elevados. Assim, parece consensual que exista

uma persistente necessidade de obtenção de formulações para higiene bucal

mais potentes, eficazes, de baixo custo, que não desequilibrem a microbiota,

sejam seguros e bem tolerados (FREIRES; ROSALEN, 2016).

Nesse sentido, a utilização de plantas na prevenção e tratamento de

doenças infecciosas bucais e como agente antibiofilme, continua a ser

valorizada em muitas partes do mundo, é recomendado pela OMS (WHO,

1987), e em nosso país muitos estudos têm sido desenvolvidos visando avaliar

o uso popular de plantas na Odontologia, tornando possível a identificação de

espécies vegetais com potencial atividade biológica (OCHENG et al., 2014;

MOGOSANU et al., 2015).

No Brasil, existem diversas plantas potencialmente medicinais, como a

Solanum paniculatum Linn. Esta espécie está listada na Farmacopeia Brasileira

139

(BRASIL, 1959) e pertence a "Relação Nacional de Plantas Medicinais de

Interesse ao Sistema Único de Saúde (Renisus)” (BRASIL, 2009) por

apresentar potencial em gerar produtos de interesse do Ministério da Saúde.

O gênero Solanum é considerado um dos mais vastos e complexos

entre as angiospermas, possuindo 1500 espécies (HAMEED; HUSSAIN, 2015).

Nativa do Brasil, pertence à família Solanaceae, comum em vários estados do

país, estende-se desde os limites das Guianas até São Paulo e Minas Gerais.

Também é comumente encontrada no Paraguai, Bolívia e Argentina.

Solanum paniculatum Linn. é uma espécie vegetal do tipo arbusto ereto,

1,5-1,7m de altura, caule e ramos com acúleos cônicos, folhas alternas, lâmina

largo-ovoide ou lanceolada, inflorescências ramificadas, flores com pétalas

estrelada-retácea, alva ou lilás e fruto tipo baga (MESIA-VELA et al., 2002;

BOTION et al., 2005) (Figura 1).

Figura 1. Solanum paniculatum Linn (Teixeira-PB e Natal-RN).

Fonte: Medeiros (2015); Macedo-Costa (2015).

Geralmente conhecida como Jurubeba, o nome desta planta é originado

do Tupi-guarani, yu’beba, referente à presen a de espinho em alguma das

espécies (SILVA et al., 2005). Também conhecida como Jurupeba, Juripeba,

Juvena, Jubeba Juina ou Juna (MESIA-VELA et al., 2002).

Seus principais farmacógenos são folhas, raízes e frutos que são

amplamente utilizados pela medicina tradicional como tônico, antitérmico, no

tratamento de disfunções gástricas, bronquite, anemia, artrite, icterícia e

hepatite. A raiz de jurubeba é considerada a parte mais ativa da planta.

(MESIA-VELA et al., 2002; BOTION et al., 2005). No que se refere a aspectos

140

científicos, são constatadas ação antibacteriana, antifúngica, antiviral,

moluscicida, anticancerígena, anti-inflamatória, antioxidante, diurética,

antidiarreica, hepatoprotetora, gastroprotetora e antiulcerogênica. No entanto,

Solanum paniculatum pode determinar sinais de toxicidade, diarreias, náuseas,

vômitos, gastrite e duodenite erosiva, elevação das enzimas hepáticas e

eventualmente sintomas neurológicos. (MESIA-VELA et al., 2002; OLIVEIRA et

al., 2006; CARVALHO et al., 2007; VALADARES et al., 2009; LÔBO et al.,

2010; VIEIRA et al., 2013; SILVA et al., 2013; MACÊDO-COSTA et al., 2014;

VIEIRA JÚNIOR et al., 2015; GREGORIS et al., 2013; STEHMANN et al., 2015;

MARTINS et al., 2015; MACÊDO-COSTA, 2016; CLEMENTINO-NETO et al.,

2016).

A planta é componente de várias formulações farmacêuticas incluindo

xaropes, infusos e decoctos, extratos, tinturas e elixir. Infuso das flores é

indicado para bronquite e tosse, enquanto as raízes maceradas são indicadas

para artrite e os frutos para anemia. O decocto das folhas é empregado para

tratar parasitas intestinais, mas também é indicado para desordens estomacais

(MESIA-VELA et al., 2002; . BOTION et al., 2005).

Há um fitofarmacêutico brasileiro, que possui em sua formulação extrato

fluido das folhas de Solanum paniculatum, a Ierobina® (Laboratório Belfar, Belo

Horizonte, Brasil). O produto, comercializado há décadas, também possui

extratos de Remijia ferruginea, Jacaranda caroba, e a exótica Erythraea

centarium. Com exceção desta última, tais plantas ocorrem no Brasil e são

popularmente empregadas para tratar diferentes doenças, dentre as quais a

dispepsia (280 mg/kg/dia). Entretanto, mais estudos são necessários para

identificar os compostos responsáveis pela ação antidispépica da Lerobina®

(BOTION et al., 2005; TAGLIATI et al., 2008).

Existem outros produtos disponíveis no mercado que apresentam

Solanum paniculatum em sua composição, tais como a Jurubeba Composta

Elixir® (Infabra Ind. Farm. Bras. Ltda, Rio de Janeiro, Brasil) e a Atalaia

Jurubeba® (Farmabraz, Rio de Janeiro, Brasil). Ambos possuem extratos de

jurubeba e boldo na sua composição e são indicados como

colerético/colagogo, nas dispepsias, flatulências e desconforto gastrintestinal.

Bebidas clássicas como aguardentes Jurubeba Leão do Norte® (Leão do Norte

Ltda, Bahia, Brasil), Jurubeba Nordestina® (Pernambuco, Brasil) e Coleguinha

141

Jurubeba® (Colonial, Ceará, Brasil) representam uma combinação de

macerado de frutos de jurubeba, extratos alcoólicos de plantas aromáticas,

decoctos de plantas amargas, xarope de açúcar de cana e álcool etílico. Os

usuários salientam as propriedades medicinais da planta e suas qualidades

hepáticas, digestivas, tonificantes e afrodisíacas.

Justificando as inúmeras propriedades medicinais acima citadas, alguns

dos constituintes químicos da jurubeba são: os alcaloides (jurubebina, jubebina,

isojuripidina); as solaninas (solamina, solanidina, solasodina); as resinas

(jupebina e jupebenina); saponinas (isojurubidina, isopaniculidina, isojurupidina

e jurubidina); os compostos esteroidais nitrogenados (paniculina, jurubina);

agliconas; ácidos graxos; ácidos orgânicos; os glicosídeos (paniculoninas A e

B), além de mucilagens e princípios amargos (SCHREIBER; RIPPERGER,

1966; RIPPERGER et al., 1967; BLANKEMEYER et al., 1998; MESIA-VELA et

al., 2002).

Análises fitoquímicas realizadas com o extrato etanólico da raíz de

jurubeba também indicam a existência de taninos flobabênicos (taninos

condensados ou catéquicos), flavonóis, flavanonas, triterpenoides pentacíclicos

livres e saponinas (CORDEIRO, 2008).

Em diversos estudos fitoquímicos em espécies do gênero Solanum,

muitos alcaloides têm sido isolados como anteriormente descrito, bem como

uma grande variedade de esteroides, saponinas, glicoalcaloides e flavonoides

que são importantes na defesa natural das plantas e possuem diversas

atividades biológicas (SILVA et al., 2005; CHENG et al., 2008; CHANG et al.,

2013; CHOU et al., 2012; KANADA et al., 2012; LI et al., 2014; MANASE et al.,

2012; MIRANDA et al., 2013; PINTO et al., 2013; ZHANG et al., 2013).

Em estudo realizado por Lôbo (2009) foi detectado um valor médio

tanífero de 4,6% (46g de TC/kg de MS) da raiz de S. paniculatum, empregando

o método de Stiasny (GUANGCHENG et al., 1991), adaptado por Paes et al.

(2006).

Através do fracionamento dos extratos etanólicos (70%) de partes

aéreas (folhas e galhos) de S. paniculatum, Vieira Júnior et al, 2014 isolaram

novas saponinas, (22R, 23S, 25R)-3b, 6a, 23-trihydroxy-5a-spirostane 6-O-b-D-

xylopyranosyl-(100 00 ?300 0)-O-[b-D-quinovopyranosyl(100 0 ?20)]-O-[a-L-

rhamnopyranosyl(100 ?30)]-O-b-D-quinovopyranoside (1) e diosgenin 3-O-b-D-

142

glucopyranosyl(100 ?60)-O-b-D-glucopyranoside (2), bem como quatro

componentes já conhecidos: ácido cafeico (3), diosgenina b-D-glucopiranósido

(4), rutina (5), e quercetina 3-O-a-L-ramnopiranosil (100 0? 600) -O-b-D-

glucopiranósido (6).

Macedo-Costa et al. (2014) e Macedo-Costa (2016) analisaram o extrato

da raíz de S. paniculatum por triagem fitoquímica preliminar e impressões

digitais por CCD com diferentes reveladores, a fim de identificar as classes de

metabólitos secundários. Os resultados obtidos corroboram estudos

farmacológicos anteriormente realizados e revelaram a presença de fenóis

(dentre os quais flavonoides e traços de taninos pirogálicos), gomas, lactonas e

alcaloides (em presença dos reativos de Dragendorff e Bertrand) e saponinas.

Na análise qualitativa de fenóis, em relação aos flavonoides e taninos,

encontrou-se mancha sugestiva de isovitexina e ácido tânico, respectivamente.

Tendo em vista a potencial atividade antimicrobiana desses compostos, foi

avaliado in vitro a ação de S. paniculatum sobre micro-organismos bucais

planctônicos e organizados em biofilme.

Macedo-Costa et al. (2014) avaliaram a ação antibacteriana do extrato

da raiz de S. paniculatum, sobre bactérias bucais endógenas na forma

planctônica: Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguinis, S. oralis, S.

salivarius e Lactobacillus casei. O extrato apresentou Concentração Inibitória

Mínima (CIM) de 7,81 mg/mL, Concentração Inibitória Mínima de Aderência

(CIMA) de 62,5 mg/mL e foi bactericida na concentração de 500 mg/mL em 2

horas de contato com S. mutans e na CIM em 4 horas. Esse estudo também

avaliou a ação do extrato bruto e diluído (CIM) de Solanum paniculatum sobre

micro-organismos em cultura mista na forma planctônica e organizados em

biofilme, a partir de saliva humana. Observou-se que o extrato bruto de

jurubeba apresentou ação antimicrobiana sobre os micro-organismos em

cultura mista na forma planctônica e organizados em biofilme, entretanto,

considerando a sua CIM, não foi evidenciada tal ação.

Macedo-Costa (2016) avaliou também a ação antimicrobiana de

Solanum paniculatum sobre micro-organismos superinfectantes do ambiente

bucal: Enterococcus faecalis e Candida albicans, ATCC (American Type

Culture Collection) e isolados clínicos. S. paniculatum apresentou ação

bacteriostática e fungistática e houve diferença estatisticamente significativa

143

entre o extrato e o controle positivo (digluconato de clorexidina a 0,12% e

nistatina 100.000 UI) até as diluições/concentrações: 1:64/ 7,81 mg/mL (E.

faecalis ATCC), 1:32/15,65 mg/mL (E. faecalis isolado do ambiente bucal - AB),

1:128/ 3,90 mg/mL (C. albicans AB) e 1:64/3,90 mg/mL (C. albicans ATCC).

Apresentou ação antiaderente (1:512/ 0,97 mg/mL) superior aos controles e

ação bactericida e fungicida quando do extrato bruto.

Lôbo et al. (2010) e Pereira et al. (2010) constataram a ação

antibacteriana de raízes de S. paniculatum sobre Staphylococcus aureus

(origem bovina e ATCC), Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.

Valadares et al. (2009) avaliaram in vitro a atividade antiviral do extrato

de folhas de S. paniculatum sobre vírus da Herpes tipo I (HSV-1), vírus da

encefalomiocardite de murídeo (EMCV) e vírus da vacínia. S. paniculatum

inibiu a replicação de HSV-1 [Concentração eficaz 50% antiviral = (298,0 ±

11,2) µg / mL] e não mostrou nenhum efeito sobre EMCV e VACV.

Diferentes doses (31,25-500 mg/kg) de extrato etanólico de folhas de S.

paniculatum foram avaliados contra a úlcera gástrica induzida em ratos. A dose

mais baixa do extrato capaz de promover efeito antiúlcera foi de 125 mg/kg. O

tratamento com S. paniculatum por via oral foi capaz de diminuir a área de

lesão gástrica e também reduzir níveis de mieloperoxidase (MPO) em mucosa

gástrica (VIEIRA JÚNIOR et al., 2014).

Endringer et al, 2010 verificaram in vitro que plantas brasileiras com

atividade anti-inflamatória, dentre as quais S. paniculatum, são promissoras

fontes de agentes quimiopreventivos do câncer. Porém, são necessários

estudos para identificação dos princípios ativos que estariam relacionados a

essa ação farmacológica.

No que diz respeito à toxicidade, Vieira, Santos e Chen-Chen (2010)

avaliaram as atividades mutagênica e citotóxica dos extratos etanólico das

folhas e dos frutos de S. paniculatum, utilizando o teste do micronúcleo em

medula óssea de camundongos. Os resultados indicaram que os extratos

etanólicos, tanto das folhas quanto dos frutos de S. paniculatum, não

apresentaram ação mutagênica em medula óssea de camundongos, porém,

em doses mais elevadas, ambos extratos exibiram atividade citotóxica. No

entanto, este estudo não apresentou um aumento de citotoxicidade em dose-

resposta de 200 e 300 mg.kg-1.

144

A toxicidade aguda da raiz de S. paniculatum em camundongos pela

determinação da dose letal (DL50) e o potencial citotóxico em eritrócitos

humanos foi avaliada por Macedo-Costa et al. (2014). O extrato não provocou

mortalidade em nenhuma das concentrações testadas (500 mg/mL-0,97

mg/mL) após 24, 72 hs e 15 dias. Quanto às principais alterações

comportamentais observadas nos camundongos tratados com o extrato nos

tempos de 30, 60, 90 e 240 minutos, foram verificadas apenas piloereção e

movimentos intensos das vibrissas até os primeiros 60 minutos até a

concentração de 31,25 mg/mL (diluição 1:16). Não foi observado nenhum efeito

colateral grave e os animais apresentaram apenas pequenas alterações

comportamentais sugestivas de estimulação do SNC. Na avaliação de

citotoxicidade, foi observado nesse estudo que S. paniculatum induziu uma

baixa atividade hemolítica (menor que 50%)158 frente a eritrócitos humanos

dos tipos A, B, O e AB na concentração de 7,81 mg/mL (CIM), entretando

apresentou citotoxicidade na concentração de 250 mg/mL (diluição de 1:2).

Diversos estudos demonstram que Solanum paniculatum Linn apresenta

atividade bacteriostática, fungistática, antiaderente, bactericida, fungicida e

antiviral, in vitro, sobre suspensão microbiana de monocultura, cultura mista

planctônica e sobre biofilme multiespécie, justificada pelos achados

farmacológicos. Também foi evidenciado praticamente a ausência de efeitos

deletérios em termos toxicológicos pré clínicos, viabilizando a realização de um

ensaio clínico controlado randomizado e estimulando a pesquisa de

substâncias naturais bioativas para tratamento de infecções bucais associadas

a micro-organismos endógenos e superinfectantes.

Claramente, existe um grande potencial para a utilização de compostos

terapeuticamente relevantes a partir da natureza. Estes devem ser resultado da

colaboração interdisciplinar baseada no conhecimento empírico oriundo de

“raizeiros”, “mateiros”, “rezadeiras”, erveiros, curandeiros, pajés e outros; aliada

à etnofarmacologia, botânica, química dos compostos naturais, Microbiologia e

Farmacologia, visando minimizar a lacuna entre o in vitro e in vivo,

proporcionando eficácia clínica e segurança em seres humanos. Até então

algum progresso foi alcançado, mas ainda há um longo caminho a ser

superado.

145

REFERÊNCIAS

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ANEXOS

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ANEXO 1 – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa CEP protocolo nº. 140/04 –

CEP – Faculdade de Medicina - UFRJ

152

ANEXO 2 – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa CEP- HUOL –UFRN, protocolo

nº. 152/07

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