NEURODEGENERAÇÃO E PERFORMANCE MNEMÔNICA DE … · Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional - 2014 1 ISSN 1980-7406 NEURODEGENERAÇÃO E PERFORMANCE

Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional - 2014 1

ISSN 1980-7406

NEURODEGENERAÇÃO E PERFORMANCE MNEMÔNICA DE RATOS WISTAR DE MEIA IDADE AO

MODELO 4-VO DE HIPOPERFUSÃO CEREBRAL CRÔNICA PARA DOENÇAS

NEURODEGENERATIVAS ALIMENTADOS COM DIETA DE CAFETERIA.

MARASCHIN, Viviane Cristine.1

HENNING, Pamela Regina.2

PEREIRA, Francine Martins.3

RESUMO

Introdução:A manutenção do fluxo sanguíneo de um organismo, relacionada à adequada perfusão cerebral, é um processo fisiológico essencial para

a realização de todas as atividades metabólicas de um ser. A indução de hipercolesterolemia em um organismo, envolvendo aumento dos níveis de

LDL E VLDL plasmáticos, e ainda diminuição dos níveis de HDL, pode influenciar o desenvolvimento de complicações vasculares, que em longo prazo poderão estar relacionadas ao comprometimento do fluxo sanguíneo cerebral. Fatores como hipoperfusão cerebral, relacionados a uma “dieta de

cafeteria” podem estar relacionados à desregulação dessa homeostase, e ainda, ao processo de neurodegeneração das regiões hipocampais e corticais.

Objetivo:Ratos Wistar (meia idade) submetidos ao modelo 4-VO de hipoperfusão cerebral crônica e progressiva para doenças neurodegenerativas, e alimentados com “dieta de cafeteria” estão sendo estudados pelo possível comprometimento de suas funções cognitivas, e ainda pelo grau de

neurodegeneração ao qual podem estar submetidos. Uma dieta não-balanceada também pode ser um importante agravante no desempenho de

memória, promovendo patologias relacionadas ao envelhecimento. Metodologia:Os estudos realizados foram embasados em artigos/revistas científicas, dando suporte às hipóteses posteriormente apresentadas. Após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais da FAG, 60 ratos

Wistar serão submetidos ao treinamento comportamental e à “dieta de cafeteria”, envolvendo o uso do labirinto radial aversivo de 8-braços, visando à

avaliação de efeitos cognitivos da HCC em ratos de meia-idade. Os ratos ainda serão submetidos a procedimentos cirúrgicos tanto para visualização do rompimento das AV bilateralmente, quanto para localização das áreas de contagem neuronal no hipocampo e córtex.

PALAVRAS-CHAVE: Hipoperfusão, neurodegeneração, hipercolesterolemia, dieta.

NEURODEGENERATION AND MNEMONIC PERFORMANCE OF MIDDLE-AGED WISTAR RATS MODEL 4-VO OF CHRONIC

BRAIN HYPOPERFUSION FOR NEURODEGENERATIVE DISEASES FED WITH CAFETERIA DIET.

ABSTRACT

Introduction: The maintenance of blood flow in an organism, related to adequate cerebral perfusion, is an essential physiological process for the

realization of all metabolic activities of a being. The induction of hypercholesterolemia in an organism, involving increased levels of plasma VLDL

and LDL, and also decreased levels of HDL, may influence the development of vascular complications, which in the long term may be related to

impaired cerebral blood flow. Factors such as cerebral hypoperfusion, related to a "cafeteria diet" may be related to dysregulation of this homeostasis,

and also to the neurodegeneration of hippocampal and cortical regions process. Objective: Wistar rats (middle-aged) submitted to 4-VO model of

chronic and progressive cerebral hypoperfusion for neurodegenerative diseases, and fed with "cafeteria diet" are being studied for possible

impairment of their cognitive functions, and also by the degree of neurodegeneration which it may be submitted. An unbalanced diet can also be a

significant aggravating in the memory performance, promoting aging-related pathologies. Methods: Studies were based on articles / journals,

supporting the hypotheses that Will be presented later. After approval by the Animal Ethics Committee (FAG), 60 Wistar rats will be subjected to

behavioral training and the "cafeteria diet", involving the use of aversive radial maze 8-arms, in order to evaluate the cognitive effects of HCC in

middle-aged rats. The rats still will be undergoing surgical procedures for both viewing the rupture of AV bilaterally, and for localization of the

neuronal counts in the hippocampus and cortex.

PALAVRAS-CHAVE EM LÍNGUA ESTRANGEIRA: Hypoperfusion, neurodegeneration, hypercholesterolemia.

1. INTRODUÇÃO

A redução do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) é um estado comumente relacionado às doenças de origem

vascular no envelhecimento, podendo ocasionar, através de evidências clínicas e experimentais, declínio das funções

cognitivas e neurodegeneração.

A manutenção do FSC é necessária para proporcionar ao organismo condições fisiológicas adequadas e

aporte suficiente para manutenções metabólicas. No entanto, inúmeros são os fatores de risco, como: diabetes, fumo,

idade, qualidade de vida, hipercolesterolemias e outros. O sobrepeso e a obesidade são grandes problemas de saúde

pública, levando em conta ainda o aumento do número de jovens que apresentam esses problemas, resultantes

1Acadêmica do curso de Medicina da Faculdade Assis Gurgacz. E-mail:[email protected] 2Acadêmica do curso de Medicina da Faculdade Assis Gurgacz. E-mail:[email protected] 3Docente do curso de Medicina da Faculdade Assis Gurgacz. E-mail:[email protected]

2 Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional – 2014

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principalmente da exposição a fatores ambientais inadequados, como dietas com alta densidade energética e inatividade

física.

Sabe-se que pelo acesso financeiro mais viável e pela disponibilidade, muitos substituem a alimentação

balanceada (preventiva) por dietas “de cafeteria”, o que resulta em níveis aumentados da disponibilidade de gordura na

corrente sanguínea, e na diminuição da taxa metabólica de quem a consome. No entanto, estudos envolvendo a indução

da obesidade, hipercolesterolemia e suas complicações em humanos apresentariam entraves éticos e financeiros, o que

nos direciona a modelos animais para entendimento fisiológico.

Nossa proposta é verificar se o consumo de “dieta de cafeteria” associado ao modelo 4-VO de redução do

fluxo sanguíneo cerebral em ratos de meia-idade pode interferir na quantidade neuronal das regiões hipocampais e

corticais, importantes para a performance de memória. Abordaremos ainda o desempenho da memória, para inferirmos

a possibilidade de que a alimentação não-balanceada possa ser importante fator no agravamento de patologias

associadas ao envelhecimento e a doenças neurodegenerativas.

A Pesquisa tem como objetivo geral verificar a performance de memória e neurodegeneração em ratos de

meia-idade submetidos ao 4-VO de HCC de doenças neurodegenerativas e à “dieta de cafeteria”, e como objetivo

específico, mensurar a latência da realização da tarefa de memória no labirinto radial de 8 braços, e realizar a

quantificação neuronal de ratos expostos à “dieta de cafeteria” e ao 4VO de HCC.

2. REFERENCIAL TEÓRICO OU FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Os novos hábitos alimentares aliados ao crescente sedentarismo da população podem ser chamados de estilo de

vida ocidental (KUMANYAKA et al, 2001). Essas práticas nutricionais envolvem dietas de cafeterias, como “fast food”

e alimentos refinados, que são caracterizados pela sua baixa qualidade nutritiva. Há grandes relações desse tipo de dieta

com alterações de funções normais do organismo, quando ingeridas por períodos prolongados. Isso se dá pela

quantidade excessiva de calorias, gorduras e açúcares que fornecem ao organismo; além de outras hipóteses, como a de

que os radicais livres gerados no metabolismo desses componentes, principalmente os ácidos graxos saturados,

danifiquem o material genético das células, originando maiores danos para os indivíduos acometidos (MACQUEEN et

al, 2007).

Outros autores como De Fronzo (1991), Reaven (1994) e Bray e Popkin (1998) citaram inclusive a relação

dessa mudança de padrões alimentares, somada ao sedentarismo, com a elevação de riscos para o surgimento de

doenças como a obesidade e de fatores relacionados, como hipercolesterolemia, resistência a insulina, diabetes mellitus,

distúrbios da coagulação e problemas cardiovasculares, caracterizando então o que se conhece atualmente como

síndrome metabólica (RAVEN, 1988), descrita como um conjunto de anormalidades metabólicas e hemodinâmicas

frequentemente presentes no indivíduo obeso.

Muitos dos mecanismos subjacentes às alterações de funções homeostáticas produzidas por esses componentes

dietéticos ainda não foram facilmente elucidados (MACQUEEN et al, 2007), a ponto de não ser esclarecido se são

apenas fatores agravantes de estados prejudiciais à homeostase ou podem ser desencadeantes e indutores do

aparecimento destes. Nesse sentido, descreve-se o objetivo desse trabalho, que busca relacionar um possível fator de

gênese de doença vascular com escolhas inadequadas de alimentação.


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Em estudo publicado pela American Heart Assocition (2000), realizado por Dobrian e colaboradores, no qual

foi induzido um modelo de obesidade em ratos pela administração de dieta semelhante à ocidental, observou-se o

desenvolvimento de hipertensão leve acompanhada de alterações vasculares e renais, semelhante às observadas em

humanos obesos hipertensos. Uma das alterações drasticamente observada é a do perfil lipídico dos ratos tratados com

dieta hipercalórica. Os níveis plasmáticos de colesterol foram aumentados, em ambas as frações LDL e VLDL, com

diminuição dos níveis de HDL, sugerindo que a depuração do colesterol é prejudicada nesses ratos, o que pode levar a

complicações vasculares com o decorrer do tempo. A peroxidação lipídica também foi precocemente detectada nesse

modelo de estudo. Os radicais livres são conhecidos pelo seu envolvimento em uma grande variedade de patologias

humanas, incluindo a aterosclerose, obesidade e hipertensão, o que pode levar a neurodegeneração e alterações na

aprendizagem e memória.

Levando em consideração o supracitado, percebemos que a integridade da vascularização cerebral e,

posteriormente, da perfusão sanguínea cerebral, são essenciais para a manutenção das funções homeostáticas.

Entretanto, uma diminuição do fluxo sanguíneo cerebral ocorre no envelhecimento normal, podendo levar a um declínio

das funções cognitivas, porém, sem caracterizar um estado de demência. O conceito de hipoperfusão cerebral infere que

a quantidade de sangue que supre o cérebro é reduzida a um ponto minimamente crítico, a partir do qual as necessidades

metabólicas do tecido cerebral deixam de ser atendidas, instalando-se então uma crise energética em termos do

suprimento de glicose e oxigênio (de la Torre, 2000). Atingido esse limiar de redução do FSC em algumas regiões

específica do cérebro (ex., hipocampo), particularmente no ser idoso, surgem os sinais de disfunções cognitivas,

caracterizados principalmente por amnésia (de la Torre, 2009).

Em humanos, as alterações do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) associadas às alterações cognitivas estão, na

maioria das vezes, vinculadas a alterações na artéria carótida (Bakker et al., 2000), das quais resultam alterações

circulatórias, microembolismo ou hipoperfusão cerebral crônica. Doenças tais como hipertensão, hipotensão,

coronariopatias, miocardiopatias, hipercolesterolemia, hiperhomocisteinemia, diabetes, tabagismo e obesidade

representam importantes fatores de risco para a instalação de um estado de hipoperfusão cerebral crônica (HCC)

(Chmayssani et al., 2007; De la Torre, 2000). O relato de caso de um indivíduo de 55 anos de idade com oclusões

severas em ambas as carótidas internas e em uma das artérias vertebrais apontou uma redução de 40 a 50% do FSC e

das funções metabólicas segundo Chmayssani et al. (2007).

Independente da origem precisa, estudos in vivo realizados em humanos são viáveis do ponto de vista

cognitivo, mas não dos pontos bioquímico e neuropatológico, o que inviabiliza a compreensão dos mecanismos

fisiopatológicos envolvidos no processo de HCC, na ação terapêutica de drogas e na gênese desta patologia. Sendo

assim, modelos animais com HCC são viáveis para o objetivo acadêmico, tendo Pereira et al. (2012) vinculado um

estado de neurodegeneração e amnésia retrógrada ao modelo 4-VO/ ACI (oclusão de 4 vasos/artéria carótida interna).

Porém, fatores como hábitos alimentares, necessitam ser estudados.

3. METODOLOGIA

3.1.1 Animais


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Após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais da FAG, serão utilizados 60 ratos Wistar

machos entre 12 e 15 meses de idade, sendo 20 deles designados ao grupo controle (operados, mas sem nenhuma

oclusão de vasos). Os demais serão submetidos ao procedimento 4-VO/ACI (grupo 4-VO/ACI, ver item 3.1.5 para

procedimento cirúrgico). Todos os animais serão provenientes do Biotério Central da FAG. Os animais serão mantidos

em ambiente com temperatura controlada (22 ± 10 C), ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes acendiam as 07:00),

exaustor para renovação do ar e com ingestão de ração e água ad libitum.

3.1.2 Delineamento experimental

A figura 1 ilustra um esquema do delineamento experimental. No experimento proposto, ratos Wistar de meia

idade serão submetidos ao treinamento comportamental e “dieta de cafeteria” durante 15 dias e após, modelo 4-VO de

hipoperfusão cerebral crônica através da oclusão das AV e ACIs com intervalo entre as oclusões (IEO) de 4 dias. Após,

os mesmos serão submetidos novamente à mesma dieta durante 7, 30 ou 90 dias. Retestes comportamentais serão

realizados 1 vez durante 4 semanas, sendo a memória retrógrada e a quantificação neuronal hipocampal e cortical

mensurada após este período.

Figura 1: Representação esquemática do delineamento experimental para avaliação da performance mnemônica e grau

de neurodegeneração em ratos Wistar submetidos ao modelo 4-VO de HCC e alimentados com “dieta de cafeteria”.

AV, artéria vertebral; ACI, artéria carótida interna; s, semana

3.1.3 Teste comportamental

3.1.3.1 Aparato de teste

A Figura 2 mostra um desenho do labirinto radial aversivo de 8-braços desenvolvido no Laboratório

de Isquemia Cerebral e Farmaconeuroproteção da UEM (Paganelli et al., 2004) e utilizado no presente estudo para

avaliação dos efeitos cognitivos da HCC em ratos de meia-idade.


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O labirinto radial aversivo (LRA) é composto por 8 braços radiais (55 cm X 15 cm) que se projetam a partir de

uma plataforma poligonal central com dezesseis lados (71 cm lado a lado). Na extremidade de cada braço, uma abertura

(9 cm de diâmetro) fornece o acesso à caixa de madeira escura (23 X 11 X 9,5 cm), a qual pode ser introduzida e

removida como uma gaveta posicionada logo abaixo das aberturas, servindo como um refúgio (goal box ou zona de

recompensa) para o rato, em relação à superfície iluminada, aversiva do labirinto. Dos 8 braços, somente um contém o

refúgio verdadeiro. Nos braços restantes, o esconderijo não possui fundo. Nas bordas dos braços erguem-se paredes de

acrílico transparente (2,5 cm de altura) para impedir que o animal caia. A área central é separada internamente dos

braços por portas-guilhotina, também de acrílico transparente (19 cm de altura). O labirinto eleva-se 90 cm acima do

solo, podendo girar livremente em torno do seu eixo central. A partir de uma ante-sala, um sistema de cordas e roldanas

conecta individualmente cada porta-guilhotina, permitindo que o experimentador controle o confinamento do animal na

arena central, antes de liberá-lo para explorar os braços. Diversas pistas extra-labirinto (como objetos tridimensionais)

ficam disponíveis na sala de teste. Um pequeno ventilador gera um constante ruído de fundo durante todo o

experimento, amenizando a interferência de barulhos bruscos e imprevisíveis. Duas lâmpadas de 200W e 40W ficam

fixas no teto, 180 cm acima do labirinto. A câmera de vídeo é posicionada a 220 cm de distância e 130 cm acima do

labirinto.

Os 8 braços foram numerados de acordo com a posição das pistas extra-labirinto, de forma que a sequência e

freqüência das visitas a cada diferente posição podem ser registradas.

3.1.3.2 Procedimento do teste

Primeiramente os animais serão habituados ao ambiente de teste. Para tanto, as pistas extra-labirinto serão

retiradas do ambiente de teste. O animal é colocado na arena central por 30 segundos, e então liberado para explorar o

interior dos braços. Ao entrar em um determinado braço, o acesso aos demais braços serão fechados. Ao retornar para a

arena central, o braço recentemente visitado é fechado, ficando o animal confinado por 10 segundos e então novamente

liberado para mais uma tentativa para encontrar o esconderijo. Este procedimento é repetido até que um tempo máximo

Figura 2: Representação do labirinto radial aversivo, em

sua versão de confinamento. A versão confinada consiste

na colocação de portas de entrada de cada braço, as quais

podem ser fechadas ou abertas pelo experimentador. Este

procedimento evita que comportamentos, tais como

entradas em braços consecutivos adjacentes sejam

utilizadas pelo animal (reproduzido de Neto et al., 2005).


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de 4 minutos transcorra. Caso o animal não encontre o braço correto, este é conduzido pelo experimentador ao braço

correto, sendo colocado no esconderijo, ali permanecendo por 1 minuto. Após este período, o animal é levado ao

biotério e o labirinto limpo, retirando-se o excesso de fezes e urina e o esconderijo trocado de braço aleatoriamente. A

posição espacial do esconderijo em relação às pistas extra-labirinto é, contudo, mantida constante. O procedimento de

adaptação é aplicado uma vez ao dia, durante 3 dias. Concluída a adaptação, o animal é submetido ao treino para

aquisição (aprendizagem) da localização espacial do esconderijo. O treino transcorre durante um período de 15 dias,

sendo 3 tentativas/dia, com uma latência máxima de 4 minutos em cada tentativa. Os procedimentos serão os mesmos

empregados durante a adaptação, exceto que nesse estágio, as pistas extra-labirinto serão dispostas em seus lugares. No

teste do LRA, o desempenho comportamental de aprendizagem e memória espacial é expresso por três parâmetros: (i)

tempo (latência) gasto para encontrar o esconderijo, (ii) número de erros de memória de referência e, (iii) número de

erros de memória operacional (ou memória de trabalho).

Computa-se um erro de referência quando o animal entra, pela primeira vez, em um braço falso. Portanto, em

cada tentativa, ele poderá cometer, no máximo, sete erros de referência (sete braços com esconderijo falso). Acredita-se

que seja através da memória de referência que o animal se lembra de COMO realizar a tarefa (por exemplo, que ele

deve caminhar até a extremidade dos braços para, talvez, encontrar o esconderijo). A memória de referência é de longo

prazo, e se consolida ao longo das várias tentativas e sessões (dias) de teste. Em contraste, um erro de memória

operacional (ou memória de trabalho – „working memory‟) é registrado quando, dentro de uma mesma tentativa, o

animal retorna a um braço falso já visitado, ou seja, ele repete o erro. A memória operacional é um fenômeno contexto-

dependente, relevante apenas para um dado momento, no caso, durante uma tentativa de teste. Portanto, a memória de

trabalho é de curto prazo, tal que, a memória que foi útil para guiar o comportamento do animal dentro de uma

tentativa, não terá mais utilidade na próxima tentativa, e muito menos nas próximas sessões de testes. É através da

memória operacional que o animal se lembra de O QUE fazer (por exemplo, que um determinado braço já foi visitado e

o esconderijo não se encontra nele, devendo, portanto, procurar em outro lugar), ou seja, a memória operacional implica

na utilização correta da informação que seja necessária para um dado momento em particular e/ou propósito específico

(Dudchenko, 2004). Evidências mostram que a capacidade de memória operacional diminui na medida em que o

intervalo de tempo entre uma tentativa e outra aumenta. Pensa-se que seja durante esse curto intervalo de tempo que o

animal processa a informação (no caso, localização espacial do esconderijo), antes que a mesma seja utilizada

corretamente no evento subsequente (Nunn & Hodges, 1994; Hodges, 1996; Dudchenko, 2004). Ao contrário da

memória operacional, a memória de referência é tipicamente adquirida com o treinamento repetitivo e envolve o uso de

informações que permanecem constantes ao longo do tempo. No modelo do labirinto radial aversivo (LRA), o rato usa a

memória de referência para se lembrar de algumas regras, por exemplo, que para encontrar o esconderijo ele deve

adentrar aos braços radiais e caminhar até sua extremidade distal, e investigar a presença do esconderijo. O animal

aprende esses procedimentos ao longo de várias repetições e as usa de um dia para o outro com mais e mais eficiência.

Por isso que, tipicamente, a memória de referência é de longo prazo.

Uma visita a um determinado braço do labirinto é considerada efetuada quando o rato alcança a metade do

braço. O animal é considerado estar fora do braço quando estivesse com as quatro patas e mais a cauda sobre a arena

central. Após o período de cronicidade pós-cirurgia, os retestes serão realizados uma vez por semana, durante quatro

semanas, conforme os mesmos procedimentos usados durante o treino, com exceção à fase de adaptação. Os retestes


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têm o propósito de mensurar a capacidade do animal em se lembrar (memória) da localização espacial do esconderijo

aprendida durante a fase de treino.

3.1.4–Dieta de cafeteria

Os animais do grupo cafeteria, denominação dada para os animais do grupo de estudo, serão submetidos à dieta

hipercalórica pelo período de 12 semanas, composta por alimentos hipercalóricos caracterizados como dietas de

cafeterias. Esses alimentos serão fornecidos de maneira fracionada ou granulada, quando for o caso, de maneira que

mimetizem o aspecto da ração a qual os ratos já estão habituados. A quantidade fornecida será estipulada pela

quantidade de ração ofertada ao grupo controle, de maneira que os animais do grupo cafeteria também se alimentem à

vontade. Também será fornecido a esses animais água ad libtum, além de refrigerante do tipo cola ou guaraná. Para esse

grupo, a alimentação será igualmente fornecida através de comedouro para ração granulada localizado na tampa da

gaiola, e a água e o refrigerante serão oferecidos em bebedouros.

Alguns exemplares dos alimentos que serão ofertados aos animais do grupo cafeteria são: chips, bolachas

recheadas, pão branco, salsicha, mortadela e refrigerantes, que serão distribuídos em cardápios diários, como

apresentado na tabela abaixo:

Tabela 1 – Cardápio diário dos animais do grupo de estudo, baseados em alimentos encontrados nas dietas de cafeterias:

ALIMENTOS

2º feira Chips queijo, Marshmallow, Chocolate e Mortadela

3º feira Chips bacon, Bolacha recheada, Ração e Salsicha

4º feira Pão branco, Chips queijo, Marshmallow e Ração

5º feira Paçoca, Chocolate, Bolacha recheada e Mortadela

6º feira Bolacha recheada, Ração, Chips queijo e Salsicha

Sábado Bolacha recheada, Ração, Chips queijo e Salsicha

Domingo Bolacha recheada, Ração, Chips queijo e Salsicha

3.1.5 Cirurgias

Os animais serão submetidos à oclusão permanente das AVs e ACIs, sendo anestesiados pela associação de

Quetamina (15mg/kg) e Xilazina (1,0mg/kg), administrados por via intramuscular.

Após fixação auricular do animal na base de um aparelho esteriotáxico, uma incisão longitudinal medindo 3

cm será realizada na porção cervical dorsal para expor o forame alar, localizado na primeira vértebra cervical. Os

músculos adjacentes serão dissecados e a ponta de um eletrocautério será introduzida no forame alar e girada


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delicadamente até que a presença de hemorragia comprove o rompimento das AV bilateralmente, a qual é prontamente

estancada mediante a aplicação de uma corrente elétrica (3 mA).

Nessas condições, as AVs serão consideradas permanentemente ocluídas. A incisão é suturada com fio de

algodão e o animal devolvido ao biotério setorial. Passados 4 dias da primeira etapa cirúrgica (estágio 2-VO), os

animais distribuídos nos seus respectivos grupos experimentais serão novamente anestesiados e submetidos à oclusão

permanente da ACI direita, mediante uma incisão longitudinal (3 cm) na porção ventral do pescoço, conforme as

técnicas de rotina do laboratório. A incisão cervical é suturada e o animal conduzido ao biotério setorial. Novamente,

após 4 dias a ACI esquerda é ocluída, completando, assim, a sequência AVACIACI (modelo 4-VO/ACI de 3

estágios). Os animais dos grupos controles (“sham”) serão submetidos aos mesmos procedimentos cirúrgicos, porém,

sem oclusões. As localizações dos pontos de oclusão estão representadas na Figura 2.

Figura 3: Representação esquemática dos locais cirúrgicos para a oclusão permanente dos 4-vasos. Em A, visão dorsal

do rato demonstrando os forames alares (a) por onde passam as artérias vertebrais (v) (reproduzido de Pulsinelli &

Brierly, 1979). Em B, desenho mostrando a posição relativa das artérias carótida comum, carótida interna e

pterigopalatina (reproduzido de Ohta et al., 1997).

3.1.6 Histologia

Um dia após o término do teste comportamental, os animais serão submetidos à anestesia profunda

(Tiopental, 50 mg/kg, i.p.) e então, sofrerão perfusão transcardiacamente com solução salina (0,9%) e solução de Bouin

durante 5 minutos (20 ml/min). Durante o procedimento, as soluções serão mantidas a 1-2ºC, e a cabeça, após

decapitada, mantida em banho de gelo (2-4 ºC) durante 3 horas para evitar o aparecimento dos chamados “neurônios

negros” („dark neurons‟, Cammermeyer, 1961). Os neurônios negros, hipercromáticos, aparecem mesmo no animal

controle quando o cérebro, ainda fresco e metabolicamente viável, sofre algum tipo de trauma mecânico (por ex.,

elevada pressão de perfusão, traumatismo causado pela espátula no ato da extração, etc.). Também podem aparecer

quando a perfusão in situ não é adequada, e o tecido não perfundido é traumatizado. A presença de neurônios negros

gera resultados de neurodegeneração falso-positivos, pois sua morfologia e coloração muito se assemelham a dos

neurônios em vias de morte devido à isquemia (por ex.).

Após extração, o cérebro de cada animal é dividido em 2 partes e mantido em solução fixadora de Bouin,

inicialmente por 2 horas ou até a sua desidratação em álcool. As partes seccionadas do cérebro (próximo ao quiasma

óptico) serão emblocadas em parafina para corte em micrótomo rotativo (Olympus, CUT 4055). Para cada cérebro, doze


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secções coronais (7 µm de espessura) semi-seqüenciais (70 µm aparte) serão obtidas em um nível esteriotáxico

equivalente a 3,60 - 4,30 mm posterior ao bregma (Paxinos & Watson, 1998). Dispostas em lâminas gelatinizadas, as

secções serão processadas para desidratação, diafanização e subsequentemente coradas pelo método de Nissl (cresil

violeta). Para a contagem neuronal, utiliza-se o procedimento relatado por Ferreira et al. (2011) como descrito a seguir.

A Figura 4 ilustra um corte coronal do cérebro de um animal controle („sham‟) para mostrar a localização das

áreas de contagem neuronal no hipocampo e córtex. No hipocampo, o número de células piramidais aparentemente

normais é contado bilateralmente ao longo dos subcampos CA1, CA2, CA3 e CA4, em 3 cortes coronais de cada

cérebro. Por neurônios aparentemente normais entendem-se aquelas células grandes, com formato arredondado, núcleos

e nucléolos visíveis, íntegros e distintos.

Ao contrário, neurônios com aspecto de enrugamento („srinkage‟), formato triangular ou fusiforme,

hipercromático (intensa eosinofilia), núcleo e nucléolo compactados e indistinguíveis denotam elementos em vias de

degeneração e, portanto, não foram quantificados. Com base nesses critérios, o número de neurônios „viáveis‟ em cada

subcampo hipocampal foi estimado (objetiva 40X, microscópio binocular Olympus BX41). Em cada corte, os valores

registrados em CA1, CA2, CA3 e CA4 serão somados, para então ser expresso como o número de neurônios na área

CA1-CA4. Para cada animal, o número final de neurônios é dado pela média das seis áreas CA1-CA4 (1 área x 2

hemisférios x 3 cortes).

No córtex cerebral, as células piramidais serão contadas em duas regiões: córtex retroesplenial (CR) e córtex

parietal (CP), conforme mostrado na Figura 4. Usando uma objetiva de 40x (microscópio binocular, Olympus BX41),

uma área no CR e duas áreas no CP serão digitalizadas (361x270µm2) e capturadas através de uma câmera de alta

performance (QColor3, Ontario, Canada) acoplada ao microscópio. Em cada área digitalizada, neurônios piramidais

aparentemente normais serão marcados (clicados), conforme critérios descritos acima para o hipocampo, e seu

somatório realizado automaticamente. Para cada animal, o número final de neurônios estimado no CR é dado pela

média dos seis campos (1 área x 2 hemisférios x 3 cortes). No CP, o número final de neurônios piramidais é dado pela

média de 12 mensurações (2 áreas x 2 hemisférios x 3 cortes).

Tanto no hipocampo quanto no CP e CR, os valores individuais serão transformados em percentual. Para tanto,

o valor médio de cada grupo controle, respectivamente, como que valendo 100%. A identificação dos grupos não é

revelada durante a contagem neuronal.

3.1.7 Análise estatística

Figura 4: Microfotografia em

pequeno aumento (objetiva 5x) para

mostrar o hipocampo e o córtex

cerebral logo acima, onde o número

de neurônios piramidais

aparentemente normais foi

estimado. (modif. de Pereira et al.,

2012).


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Para análise comportamental global, ANOVA não-paramétrica será utilizada (Teste de Friedman). No caso de

um valor global significativo (com declive acentuado da curva), o teste post-hoc de Dunn será usado para localizar em

quais tempos (retestes) a capacidade de memória esteve prejudicada devido à HCC. Adicionalmente, o teste U de

Mann-Whitney será utilizado para comparações entre grupos durante cada reteste (grupo 4VO/ACI vs. grupo “sham”).

Quanto à quantificação neuronal, ANOVA seguida de teste de Dunn será utilizada para comparação entre grupos.

Quando necessário, teste t para amostras independentes será disponibilizado para tratamento estatístico, com valores

aceitáveis de p<0,05.

3.2-Orçamento

Recursos Materiais

Material Quantidade Unidade Valor Responsável

Lâminas e lamínulas 10 R$ 10,00 R$ 100,00 Pesquisadores/IES

Ketamina 3 R$ 15,00 R$ 45,00 Pesquisadores/IES

Xilasina 3 R$ 30,00 R$ 90,00 Pesquisadores/IES

Éter 2 R$ 15,00 R$ 30,00 Pesquisadores/IES

Animais 60 R$ 10,00 R$ 600,00 Pesquisadores/IES

Total R$ 90,00 R$ 865,00

3.3-CRONOGRAMA

ATIVIDADE ANO: 2013-2014

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pesquisa

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4. ANÁLISES E DISCUSSÕES

4.1 RESULTADOS

A Figura 5, aponta os efeitos do modelo experimental 4-VO/ACI sobre a performance de aprendizagem e

memória no labirinto radial aversivo de oito braços, onde os animais sofreram um teste inicial e re-testes este feito 30

dias após a realização 4-VO/ACI. Comparado com os shans, o grupo operados apresentou uma redução da capacidade

de aprendizagem e memória, expresso pela maior latência e pelo maior número de erros cometidos. A análise de

variância revela que o parâmetro “número de erros de referência” foi significativamente afetado, ficando evidente o

aumento no tempo para encontrar o braço correto e no número de erros cometidos pelos animais.

Figura 5. Efeito do modelo 4-VO/ACI sobre o comportamento em ratos idosos, os dados foram registrados

durante os dias de treinamento e de re-testes em animais com um periodo de cronicidade de 30 dias apos as cirurgias

Ilustra a latência total para encontrar a caixa meta oculta (A), o número de erros de referência (B) e o número referência

de memória (C), a latencia total (D), o total de erros de referência (E) e o total de erros operacionais(F).


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Os resultados abaixo demosntram a quantificação neuronal realizada no hipocampo:

Figura 6: Efeito da hipoperfusão cerebral crônica e progressiva sobre o numero de neurônios piramidais do

hipocampo nas áreas CA1, CA2, CA3 e CA4. Na imagem A pode-se observar as regiões submetidas a contagem e em

B, o número de neurônios hipocampais.

4.2 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

O modelo 4-VO/ACI vem sendo estudado devido à hipoperfusão gerada e que resulta em uma redução nos

déficits cognitivos e neuronais; porém, isso só ocorre quando realizado com ratos idosos, sendo um modelo que não

apresenta limitações como degeneração na retina ou atrofia do nervo ótico, apresentado pelo modelo 4 VO/ACC

(NETO et al., 2005; BARROS et al., 2009). O presente trabalho faz parte de um grupo de pesquisas que tenta elucidar

um modelo experimental que mais se assemelhe ao estado de hiporperfusão presentes nas doenças neurodegenerativas,

incluindo a este metodologias que possam influenciar a cotidiano e consequentemente, alterar de forma drástica os

resultados observados.

Os modelos experimentais criam um estado de hipoperfusão crônica cerebral, o que causa um grande número

de mortalidade de animais, principalmente quando o trabalho é realizado, com animais idosos que se encontram mais

debilitado. Estudos relatados por Pereira et al., (2010) relata uma série de teste com diferentes cronicidades de intervalo

entre as cirurgias, observando-se que quando menor era o período de intervalo, maior era a taxa de mortalidade dos

animais. Tal fato também foi constatado para o intervalo de 7 dias entre as cirurgias, onde um grande número de

animais morre entre as primeiras 4 semanas (Barros et al. , 2009),

Relacionando-se ainda ao período de intervalo, verifica-se que períodos menores, como os de 2 e 3 dias, foram

os que apresentaram maior índices de mortalidade do animal ( o que é um fator essencial quando se quer elucidar um

modelo experimental), porém, quando verificado os intervalos de 4 e 5 dias, a mortalidade reduzia-se significantemente,

mantendo o mesmo padrão de morte neuronal. Devido a relação entre o menor período de tempo e índice de


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mortalidade, foi considerado o com 4 dias a melhor opção para sobrevivência do animal e a realização do experimento (

PEREIRA et al., 2010).

A oclusão crônica e progressiva dos 4 vasos causa morte neuronal, por hipóxia ou isquemia, devido ao

estado de hipoperfusão que reduz o fluxo sanguíneos no encéfalo principalmente nas regiões CA1, CA2, CA3 e CA4 do

hipocampo. Essa morte neuronal faz com que o animal tenha uma redução na aprendizagem e memória, como

visualizado nos gráficos comportamentais, onde os animais operados tiveram um número maior de erros e demoraram

mais tempo para encontrar o braço correto (FARKAS et al., 2000).

O menor índice de neurônios apresentados pelos animais com cronicidade de 30 dias pode ser devido a uma

suposta recompensação do fluxo sanguíneo cerebral, o que de fato é comprovado em animais jovens (BARROS et al.,

2010), porém experiência realizadas com animais idosos comprovam que a capacidade de compensação do fluxo

sanguíneo cerebral é bem mais reduzida ( DE LA TORRE, STEFANO, 2000; HE et al.,1997).

A diferença na densidade neuronal presentes na analise histológica também foi constatadas por outros autores,

onde ocorreu um aumento no número de mortes neuronais após a realização do modelo 4-VO/ACI, comprovando o

estado de hipoxia e isquemia. ( BARROS et al., 2010; MOHAMAD et al. 2007).

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Conclui-se que o tempo de administração da dieta de cafeteria pode ter sido pequeno, acarretando na necessidade

de aplicação por um tempo maior, como observado nos resultados tendenciosos apresentados.

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