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Métodos Clássicos
1976 – Allan Maxam e Walter Gilbert (EUA)
Método da Degradação Química(Tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula de DNA
em nucleo9deos específicos)
1977 – F. Sanger e A.R. Coulson (Reino Unido)
Método enzimáQco, dideóxi ou do término da cadeia(Síntese enzimá@ca de uma fita complementar, cujo crescimento é
interrompido pela adição de um dideoxinucleo9deo)
domingo, 30 de maio de 2010
Seqüenciamento X PCR
PCR:Amplificação exponencialDois primersdNTPs
Sequenciamento:Amplificação linearUm primerdNTPs e ddNTPs
domingo, 30 de maio de 2010
+ddGTP+ddCTP +ddTTPGATTCGAGCTGddAGATTCGddAGddA
GATTCGAGddCGATTddC
GATTCGAGCTddGGATTCGAddGGATTCddGddG
GATTCGAGCddTGATddTGAddT
domingo, 30 de maio de 2010
Método de Sanger – AUTOMATIZADOELETROFORESE CAPILAR
Os ácidos nucléicos migram para o ânodo, pois em pH neutro sua carga é nega@va
domingo, 30 de maio de 2010
Método de Sanger – AUTOMATIZADOELETROFORESE CAPILAR
A separação das fitas de DNA é dependente:
Tempo de migração,
Temperatura,
Força iônica do tampão,
Intensidade do campo elétrico,
Viscosidade do meio.
domingo, 30 de maio de 2010
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
Reagentes
QuanQdadeBigDye
Mix8 µL
Primer 4 µL (3,2 pmol)Água q.s.p. 20 µLDNA 5 µL
domingo, 30 de maio de 2010
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
Reagentes
QuanQdadeBigDye
Mix8 µL
Primer 4 µL (3,2 pmol)Água q.s.p. 20 µLDNA 5 µL
domingo, 30 de maio de 2010
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
TERMOCICLAGEM:
Inicial: 96ºC – 1 min
25 – 40 ciclosDesnaturação: 96ºC – 15 segAnelamento: 50ºC – 15 segExtensão: 60ºC – 4 min
Final: 4-‐10ºC infinito
Rampa: 1ºC/seg para facilitar o anelamento do primer
domingo, 30 de maio de 2010
PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
T
T T
T
G
G G
GC
C
CC
CC
C
A
A
A A
A
A
Isopropanol 70%
Etanol/EDTA/Acetato de
sódio
Kit BigDye X-‐Terminator
domingo, 30 de maio de 2010
PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGATGCTTCTGG
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGCAGATC
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ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCA
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ATGCTTCTGGCAGATCTGAATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
T
T T
T
G
G G
GC
C
CC
CC
C
A
A
A A
A
A
Isopropanol 70%
Etanol/EDTA/Acetato de
sódio
Kit BigDye X-‐Terminator
domingo, 30 de maio de 2010