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CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: SANIDADE ANIMAL LÍVIA AIRES LISBOA
O Papel da BRG1 no Controle Epigenético em
Ovários Suínos
LONDRINA
2008
9
Lívia Aires Lisboa
O Papel da BRG1 no Controle Epigenético em
Ovários Suínos
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Medicina Veterinária. Orientador: Marcelo Marcondes Seneda
Lívia Aires Lisboa
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O Papel da BRG1 no Controle Epigenético em Ovários
Suínos
Dissertação de Mestrado
Orientador:Marcelo Marcondes Seneda
COMISSÃO EXAMINADORA
_____________________________________________________
Prof a. Dr a. Evelyn Rabelo Andrade
___________________________________________________________
Prof a. Dr a. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga
___________________________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda
Londrina, ___ de ______ de 2008.
11
Aos meus pais José Carlos e Marina e a minha irmã Laís.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me capacitar para este trabalho, pelas pessoas que Ele coloca em minha vida e pelo discernimento e sabedoria para resolver os problemas.
12
A minha mamãe Marina pela companhia no laboratório durante a noite, pelas idas ao frigorífico, enfim pelo apoio incondicional e pela participação ativa nesses anos de mestrado.
Ao meu papai José Carlos que nesses anos não poupou ligações e mensagens para diminuir a distância entre nós.
A minha irmã e amiga Laís por sempre corrigir meus trabalhos e
pelo apoio incondicional mesmo quando eu estava errada. A minha vovó Maria Aparecida que é responsável por grande
parte da minha educação.
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda por acreditar em mim, pela paciência e compreensão nestes anos.
Aos meus queridos amigos da equipe CENTRA, Fabiana, Evelyn, Wanessa, Kátia, Gustavo, Marilu, Roberta, Augusto, Mariana e Letícia pelo companheirismo, apoio e pela amizade.
As minhas amigas Marilu, Evelyn e Wanessa por não pouparem esforços para colaborar com meu trabalho e com meu bem estar.
Aos meus amigos Thales, Alexandre, Tiago e Mariana pela boa vontade em colaborar e principalmente pela amizade sincera.
À equipe do Laboratório de Virologia por viabilizar a realização do meu trabalho, ao funcionário Paulão por estar sempre tão disposto a ajudar.
Aos residentes de grandes animais por me cederem tantas vezes
o computador para pesquisas. Aos funcionários Beto do frigorífico KM3 e Ju do frigorífico de
Ibiporã pela atenção, boa vontade e por se colocarem sempre à disposição.
A todos que de alguma forma colaboraram para a conclusão
deste trabalho.
13
SUMÁRIO
PÁGINA
1. INTRODUÇÃO 08
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 11
2.1. Ovário mamífero 11
2.2. Oogênese 11
2.3. Foliculogênese 14
2.4. Epigenética 17
2.5. Estrutura do nucleossomo mamífero 18
2.6. Modificações epigenéticas 19
2.7. Complexo SWI/SNF – BRG1 21
REFERÊNCIAS 23
3. JUSTIFICATIVA 27
4. OBJETIVOS
4.1. Gerais 28
4.2. Específico 28
5. ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO 29
REFERÊNCIAS 46
LEGENDA 50
1. Introdução
14
A reprodução é uma área da ciência que desafia os pesquisadores. Por
representar o início da vida, a possibilidade da compreensão de seus mecanismos
reguladores gera crescentes perspectivas e interesse de diversas áreas.
Neste contexto, os avanços nas biotécnicas associadas à reprodução animal,
têm trazido inegáveis benefícios às medicinas veterinária e humana. Na pecuária
esses avanços resultam no melhor aproveitamento do material genético dos animais
de alto valor zootécnico, otimizando a produção do rebanho nacional. Este fato
contribui para que o Brasil possua o terceiro maior rebanho mundial de suínos e
alcance expressiva competitividade no mercado internacional. Já em relação à
medicina humana, as pesquisas com suínos assumem inestimável importância visto
a semelhança da espécie com o homem. Os suínos, através do uso de biotécnicas
reprodutivas na medicina regenerativa, tais como transgenia e clonagem, podem
fornecer substâncias vitais ao homem, como insulina e hormônio tireoidiano, sendo
ainda a espécie responsável pelos xenotransplantes. Conclui-se assim pela
importância e necessidade do profundo conhecimento da fisiologia reprodutiva desta
espécie.
Um campo fundamental do conhecimento é a fisiologia reprodutiva feminina,
na qual a interação de dois processos, a foliculogênese e a oogênese, origina o
gameta feminino. Apesar do amplo interesse e das muitas pesquisas realizadas,
existem ainda várias lacunas a serem esclarecidas, principalmente quanto à fase
inicial do desenvolvimento folicular, sendo o conhecimento dos mecanismos
reguladores do início da foliculogênese um dos pontos essenciais para o progresso
da ciência. Nesta linha, a epigenética, uma recente área do conhecimento, traz
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promissoras perspectivas para o esclarecimento de aspectos pouco compreendidos
da fisiologia ovariana.
A epigenética consiste no estudo das modificações fenotípicas herdáveis sem
alteração na seqüência do DNA. Os mecanismos epigenéticos regulam a atividade
de transcrição, alterando os padrões de expressão gênica. Relevante contribuição
trouxe o Projeto Genoma Humano, ao revelar que o ser humano e um fungo
possuem quantidades aproximadas de genes, comprovando que a complexidade
biológica não depende do número de genes, mas sim de como esses genes são
usados (expressos), aspecto regulado pela epigenética.
Portanto, os mecanismos epigenéticos são fundamentais, atuando no núcleo
da célula, na estrutura do nucleossomo. Por muito tempo acreditou-se em uma
função apenas estrutural para o nucleossomo, mas recentemente, descobriu-se o
seu papel crucial e dinâmico no controle da expressão gênica. Alguns mecanismos
podem modificar sua estrutura, permitindo ou inibindo o acesso ao DNA, controlando
assim a expressão do código genético. Um exemplo são os complexos
remodeladores de cromatina, que alterando de maneira energia-dependente os
contatos DNA-histona, modificam os padrões de expressão gênica. Há evidências
que a BRG1, uma importante subunidade do complexo remodelador SWI/SNF
participa nos processos de foliculogênese e embriogênese modulando a transcrição;
entretanto o modo de funcionamento destes remodeladores e de suas subunidades
é desconhecido até o momento.
Infere-se do exposto que a epigenética se apresenta como uma inédita e
promissora área de investigação dos mecanismos que regulam a foliculogênese
inicial. Considerando a importância da espécie suína no contexto da biotecnologia
16
reprodutiva, o objetivo deste trabalho foi analisar a presença da BRG1 em folículos
ovarianos em diferentes estágios do desenvolvimento com a finalidade de propor
uma possível função desta proteína no processo da foliculogênese.
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2. Revisão Bibliográfica
2.1. Ovário mamífero
O ovário mamífero é constituído pelas regiões cortical e medular. A região
cortical contém folículos ovarianos em diferentes estágios de desenvolvimento, bem
como corpos lúteos, albicans e hemorrágicos. A região medular é localizada na
porção mais interna do ovário, com exceção dos eqüídeos, sendo constituída por
tecido conjuntivo, algumas células musculares lisas, nervos, artérias e veias
(Comarck, 1991), responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (Hafez, 1996).
O ovário desempenha funções endócrina e exócrina ou gametogênica. A
primeira é responsável pela produção e liberação de hormônios esteróides e
diversos peptídeos e a segunda, a qual é exercida pela interação de dois
fenômenos, a oogênese e a foliculogênese (Saumande, 1991), é responsável pela
produção e liberação de oócitos (Hafez, 1996).
2.2. Oogênese
A oogênese em mamíferos pode ser definida como uma seqüência de
eventos através dos quais as células germinativas primordiais (CGPs) desenvolvem-
se e diferenciam-se até a formação do oócito haplóide fecundado (Russe, 1983). É
um processo que se inicia na vida fetal e envolve crescimento e diferenciação
celular, assim como síntese e armazenamento de novas organelas (Song et al.,
2006). Vale ressaltar que somente alguns oócitos conseguem completar este
processo, meses ou anos mais tarde no animal adulto, após a fecundação
(Wassarman, 1988).
18
Através de sucessivas divisões mitóticas, as CGPs se multiplicam e originam
grupos de oogônias, conectados entre si por interações citoplasmáticas (van den
Hurk & Zhao, 2005). Em algumas espécies, como ruminantes, roedores, suínos e
primatas, a diferenciação e a multiplicação das oogônias ocorrem ainda no feto em
desenvolvimento, muito antes do parto. Em outras, como carnívoros e lagomorfos,
esses processos se prolongam para o período imediatamente pós-natal (Banks,
1992). Em suínos, o processo de diferenciação das CGPs em oogônias ocorre entre
os dias 33º e 60º de gestação (Oxender et al., 1979; McCoard et al., 2001). Por
volta do 60º dia de gestação ocorre o pico da mitose e a quantidade máxima de
oogônias (Black & Erickson, 1968); estas por sua vez sofrem replicação do DNA,
iniciam a meiose e diferenciam-se em oócitos (van den Hurk & Zhao, 2005).
Os oócitos formados iniciam a primeira divisão meiótica, passando pelos
estágios da prófase I: leptóteno, zigóteno, paquíteno e diplóteno (Hirshfield, 1991). O
estágio de diplóteno também é conhecido como dictioteno ou vesícula germinativa
(Gordon, 1994), e é nesta fase que ocorre a primeira interrupção da meiose (Moore
& Persaud, 1994). Os oócitos cujos núcleos encontram-se em prófase I são
denominados oócitos primários ou imaturos (Figueiredo et al., 2002).
Nestas fases iniciais da meiose, onde várias proteínas de reparo do DNA e
outros fatores são solicitados para a recombinação do cromossomo, os oócitos são
extremamente vulneráveis, resultando na degeneração de muitos deles. Essa perda
de oócitos pode chegar a 60% em suínos (van den Hurk & Zhao, 2005).
O núcleo do oócito permanecerá em prófase I até a puberdade, quando
ondas de hormônio luteinizante estimulam a retomada da meiose (Eppig et al., 2004)
e o núcleo oocitário entra em diacinese (Figueiredo et al, 2002). Neste momento,
19
ocorre o rompimento da vesícula germinativa (VG), seguida das fases de metáfase I,
anáfase I e telófase I, quando então ocorrerá a expulsão do primeiro corpúsculo
polar, resultando na formação do oócito secundário (Betteridge et al., 1989). O
núcleo do oócito começa a segunda divisão meiótica, que avança apenas até a fase
de metáfase II, quando ocorre a segunda parada da meiose (Gordon, 1994). A
divisão somente será retomada caso ocorra a fecundação ou a ativação por
partenogênese, possibilitando assim a expulsão do segundo corpúsculo polar e a
formação do oócito haplóide fecundado (Moore & Persaud, 1994).
Os mecanismos que regulam a oogênese ainda não são esclarecidos, porém
sabe-se que durante o crescimento oocitário ocorrem alterações dinâmicas na
estrutura e função da cromatina, essenciais para o desenvolvimento e capacitação
meiótica do oócito (De La Fuente, 2006). Estudos em camundongos demonstraram
um remodelamento da cromatina durante o crescimento oocitário, onde inicialmente
a cromatina apresentou-se descondensada (NSN, do inglês non-surrounded
nucleolus), no entanto após os processos de crescimento e diferenciação, foi
observada uma alteração na organização nuclear, tornando-a progressivamente
condensada (SN, do inglês surrounded nucleolus) (Debey et al., 1993). Esta
diferença está relacionada com importantes modificações durante a oogênese (De
La Fuente, 2006). Oócitos com a configuração NSN apresentam alto nível de
transcrição, enquanto que a aquisição da configuração SN está associada a uma
repressão global da atividade transcricional in vivo (Miyara et al., 2003). Apesar
destas informações, pouco é conhecido sobre os eventos biológicos envolvidos nas
modificações da estrutura da cromatina durante a oogênese nos oócitos mamíferos
(De La Fuente, 2006).
20
2.3. Foliculogênese
A foliculogênese é um processo que ocorre simultaneamente à oogênese,
quando o oócito está entre as fases de prófase I e metáfase II. Também inicia-se na
vida pré-natal na maioria das espécies e caracteriza-se pela formação, crescimento
e maturação folicular. Este evento origina-se com a formação do folículo primordial e
culmina com o desenvolvimento do folículo pré-ovulatório ou De Graaf (Saumande,
1991; Moore & Persaud, 1994).
De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser divididos em pré-
antrais ou não cavitários e antrais ou cavitários (Hulshof et al., 1994). Os folículos
pré-antrais representam cerca de 90% da população folicular do ovário (Erickson,
1986) e são constituídos pelos folículos primordiais, primários e secundários
(Hulshof et al., 1995; van den Hurk et al., 1997). Os folículos antrais podem ser
classificados como folículos terciários e folículos De Graaf, denominados ainda
maduros ou pré-ovulatórios. É importante salientar que alguns folículos podem ser
ativados e se desenvolverem até o estágio terciário na fase pré-natal, no entanto,
somente na vida pós-natal, sob efeito hormonal, podem atingir o estágio pré-
ovulatório (Fortune, 1994).
Os folículos primordiais são os primeiros a serem formados e os que se
encontram em maior quantidade no ovário, sendo denominados de pool de reserva
(Figueiredo et al., 2002). São caracterizados por um oócito imaturo central
circundando por uma camada de células somáticas planas, conhecidas como células
da pré-granulosa, originárias do mesoderma. Os folículos permanecem neste
estágio de quiescência até a ativação folicular, quando é dada continuidade ao
desenvolvimento.
21
A ativação folicular consiste na transição do folículo primordial para primário,
e é caracterizada por três eventos principais: mudanças na forma das células da
granulosa de plana para cúbica, proliferação destas células e aumento de tamanho
do oócito (Hirshfield, 1991). Há vários aspectos a serem esclarecidos sobre este
mecanismo, no entanto é possível que fatores que estimulam a proliferação das
células da granulosa sejam prováveis promotores da ativação folicular (Fair, 2003).
Como descrito acima, após ativação são formados os folículos primários, que
consistem em um oócito circundado por uma camada de células cubóides. Nesta
classe folicular, as células da granulosa aumentam de número e tornam-se mais
volumosas (van den Hurk, 1997). Outro evento marcante é a expressão gênica para
a síntese de proteínas para a formação da zona pelúcida, estrutura ao redor do
oócito mantida por todo desenvolvimento (Seneda & Bordingon, 2007). As
informações sobre a ativação e o crescimento folicular são escassas, contudo,
admite-se para a fase inicial do crescimento, uma ação predominantemente local e
de vários fatores de crescimento, como o Kit Ligand (Parrot & Skinner, 1999), GDF-9
(Vitt et al., 2000), bFGF (Nilsson et al., 2001) e LIF (Nilsson et al., 2002).
A próxima etapa são os folículos secundários, formados por proliferação das
células da granulosa, sendo caracterizados por uma ou mais camadas de células ao
redor do oócito. Nestes folículos o tamanho do oócito aumenta, a zona pelúcida já
pode ser observada e nos mais desenvolvidos é possível observar células tecais.
Durante o processo de formação do folículo secundário, alguns marcadores têm sido
reportados como de grande importância, tais como ativina– A (Zhao et al., 2001),
EGF (Gutierrez et al., 2000) e BMP-15 (Juengel et al., 2002).
22
A etapa seguinte do desenvolvimento consiste no folículo terciário, cuja
principal característica é a formação do antro, uma cavidade repleta de líquido.
Ocorre também a multiplicação das camadas da granulosa e a organização
completa das células da teca. Nesta etapa a ação gonadotrófica já pode ser
detectada, sendo então iniciados os efeitos amplos do FSH e LH (van den Hurk et
al., 2000). Alguns marcadores, como ativina – A e sua proteína de ligação -
folistatina - foram identificados desde o estágio de folículo primordial até grandes
folículos antrais (Silva et al., 2004). Com a evolução dos folículos terciários, a
cavidade antral aumenta e o oócito fica aderido à parede do folículo pelas células do
cumulus, originando o folículo pré-ovulatório que corresponde a fase final do
desenvolvimento folicular (Hulshof et al., 1994).
Durante a foliculogênese, as células dos folículos ovarianos sofrem intensa
proliferação e diferenciação desde o momento da ativação do folículo primordial até
alcançarem capacidade ovulatória (Ruiz-Cortez et al., 2005). Admite-se um
programa coordenado entre elementos genômicos e epigenéticos regulando o
complexo processo da foliculogênese em ovários mamíferos (Ruiz-Cortez et al.,
2005).
Apesar do interesse crescente, pouco se sabe sobre os mecanismos que
regulam a foliculogênese, principalmente no que se refere à fase inicial do
desenvolvimento folicular. Com o objetivo de auxiliar na elucidação destes
mecanismos, áreas recentes do conhecimento, como a epigenética, começam a
trazer perspectivas promissoras (Seneda & Bordignon, 2007).
23
2.4. Epigenética
O termo “epigenética” refere-se ao estudo das modificações fenotípicas
herdáveis sem alterações na seqüência do DNA. Conforme alterações bioquímicas,
a mobilidade do nucleossomo pode ser alterada pela modificação na interação do
DNA com as histonas, permitindo assim uma importante mudança na capacidade de
expressão do código genético (Seneda & Bordignon, 2007).
Os processos epigenéticos são naturais e essenciais para muitas funções do
organismo, porém se ocorrerem inadequadamente podem ter efeitos adversos na
saúde e no comportamento (Weinhold, 2006). Agentes como metais pesados,
pesticidas, hormônios, vírus, bactérias entre outros podem gerar alterações
bioquímicas na cromatina, interferindo na expressão de certos genes, podendo levar
a disfunções respiratórias, reprodutivas e a vários tipos de câncer. Essas
modificações epigenéticas podem ser transmitidas por até quatro gerações
(Weinhold, 2006), evidenciando assim a importância da epigenética no processo
evolutivo.
2.5. Estrutura do nucleossomo mamífero
No núcleo dos eucariotos, a cromatina carrega não somente informação
genética codificada pelo DNA, mas também informação epigenética carreada pelas
histonas na forma de modificações covalentes reversíveis (Mellor, 2006).
O nucleossomo é a unidade estrutural fundamental da cromatina e consiste
de aproximadamente 146 pares de bases de DNA arranjados ao redor de um
octâmero de proteínas denominadas histonas (figura 1). Este octâmero é formado
por duas cópias de cada uma das quatro histonas centrais, H2A, H2B, H3 e H4
24
(Trotter & Archer, 2007) e uma histona de conexão denominada H1, que delimita o
local onde o DNA entra e deixa o nucleossomo, concluindo assim duas voltas de
DNA ao redor das histonas (Kamakaka & Biggins, 2005). Por muito tempo,
acreditou-se em uma função apenas estrutural do nucleossomo, uma maneira da
célula realizar o empacotamento da longa fita do DNA, para permitir a condensação
e organização do mesmo no núcleo da célula (Cosgrove & Wolberger, 2005).
Recentemente, descobriu-se o papel crucial e dinâmico do nucleossomo no controle
da expressão gênica. Conforme alterações bioquímicas, a interação do DNA com as
histonas pode variar, permitindo assim uma importante modificação na capacidade
de expressão do código genético (Seneda & Bordingnon, 2007).
As histonas são constituídas por um domínio globular e por uma estrutura
indefinida denominada cauda. Ambas as estruturas são alvos de modificações pós-
translacionais que estão relacionadas com estados distintos da cromatina, os quais
regulam o acesso ao DNA (Cosgrove et al., 2004). Dessa acessibilidade ao DNA
depende o controle da transcrição e expressão gênica. Uma alta mobilidade do
nucleossomo é necessária para desestabilizar a fibra da cromatina e assim
aumentar a acessibilidade ao DNA, enquanto uma baixa mobilidade do nucleossomo
está presente na estabilização da cromatina, diminuindo assim o acesso ao DNA
(Cosgrove et al., 2004). A mobilidade do nucleossomo é regulada por mecanismos
epigenéticos.
25
Figura 1: estrutura do nucleossomo, DNA envolto no octâmero (em verde) de histonas H2A, H2B, H3 e H4 e H1, histona de conexão.
2.6. Modificações epigenéticas
É bem estabelecido que modificações epigenéticas nas histonas regulam a
estrutura da cromatina e consequentemente a expressão gênica. No entanto há
diferentes mecanismos que podem modular a cromatina, são eles: metilação do
DNA, modificações covalentes nas histonas e fatores remodeladores da cromatina
energia-dependente.
A metilação do DNA consiste na adição de uma radical metil à base citosina
na fita de DNA. Este processo está relacionado com a repressão da transcrição por
impedir o acesso ao DNA no local da reação e é importante na repressão gênica de
mamíferos e plantas, embora não ocorra em alguns eucariotos como leveduras e
Caenorhabditis elegans (Bird, 2002)
As modificações covalentes são mediadas por enzimas e consistem na adição
ou remoção de grupos químicos capazes de interferir na coesão do DNA com as
26
histonas, basicamente por modificações de cargas elétricas (Seneda & Bordignon,
2007). As proteínas histonas são alvos de muitas modificações pós-translacionais,
incluindo metilação, fosforilação, acetilação e ubiquitinização (Zhang, 2001). Essas
reações são predominantemente reversíveis, constituindo assim uma maneira
dinâmica de facilitar ou reprimir a ação do DNA (Mellor 2006).
Os remodeladores da cromatina consistem em complexos protéicos que
utilizam energia da hidrólise do ATP para alterar a posição do nucleossomo no DNA,
conduzindo à ativação ou repressão da transcrição (Cosgrove et al., 2004). Os
eucariotos contêm pelo menos cinco famílias de remodeladores de cromatina:
SWI/SNF, ISWI, NURD/Mi-2, INO80 e SWR1 (Saha et al., 2006). O complexo
SWI/SNF e suas subunidades são objetos de muito interesse.
2.7. Complexo SWI/SNF – BRG1
O complexo remodelador de cromatina SWI/SNF é um complexo proteico
ATP-dependente e está envolvido em aspectos críticos do crescimento celular e
estabilidade do genoma (Kadam & Emerson, 2003). Possui massa molecular de 1
MDa e consiste de aproximadamente nove subunidades, embora essa composição
possa variar nos diferentes tipos celulares (Mohrmann & Verrijzer, 2005). Foi
primeiramente identificado em leveduras e é altamente conservado entre os
eucariotos (Peterson & Workman, 2000). Este complexo tem um papel importante no
controle da expressão gênica, de uma maneira energia-dependente ele altera a
estrutura do nucleossomo por modificar a interação DNA-histona, influenciando a
atividade transcricional, podendo esta ser ativada ou reprimida.
27
A BRG1 (brahma related gene 1) é uma importante subunidade da família
SWI/SNF. A função exata desta proteína é desconhecida, entretanto estudos
mostram que ela está envolvida na ativação do genoma embrionário (AGE) e é um
marcador da qualidade oocitária e embrionária. Oócitos com a expressão da BRG1
inativada completaram a meiose e foram fecundados, porém houve bloqueio dos
embriões no estágio de 2 células e redução de 30% na trasncrição dos genes
(Bultman et al., 2006). A ausência da expressão da BRG1 foi associada à letalidade
embrionária precoce (Bultman et al., 2000).
Um estudo analisou a expressão desta proteína em diferentes tecidos
humanos saudáveis e constatou que a expressão da BRG1 foi predominantemente
vista em tipos celulares que sofrem constante proliferação e auto-renovação como
células das criptas intestinais, epitélio da bexiga e espermatogônias (Reisman et
al.,2005). Sabe-se que durante o crescimento folicular ocorre intensa proliferação,
requerendo assim uma investigação mais detalhada sobre a função desta proteína
durante o desenvolvimento folicular.
28
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32
3. Justificativa
A foliculogênese é um universo a ser explorado. Apesar dos extraordinários
avanços verificados nos últimos anos, ainda há várias lacunas para uma perfeita
compreensão do processo de crescimento folicular, especialmente na fase pré-
antral. A fim de auxiliar nesse entendimento, a epigenética se apresenta como uma
promissora área do conhecimento. Os complexos remodeladores de cromatina
regulam a transcrição por alterar a interação DNA-histonas no nucleossomo. Um
importante complexo é o SWI/SNF, composto por várias subunidades protéicas,
entre elas a BRG1. A função da BRG1 ainda é desconhecida, porém há evidências
do seu envolvimento na oogênese, foliculogênese e embriogênese. O
esclarecimento da função e/ou modo de ação desta subunidade durante o
crescimento folicular auxiliará na compreensão dos mecanismos regulatórios da
foliculogênese, desconhecidos até o momento.
33
4. Objetivos
4.1. Gerais:
• Considerar modificações epigenéticas de remodeladores de cromatina
no desenvolvimento folicular
• Auxiliar na elucidação de mecanismos envolvidos na
foliculogênese, ainda pouco compreendidos.
4.2. Específico:
• Pesquisar a imunolocalização da BRG1 em folículos primários,
secundários, terciários e antrais na espécie suína
34
5. Artigo para publicação
O Papel da BRG1 no Controle Epigenético em
Ovários Suínos
35
Resumo
Durante o crescimento folicular e oocitário ocorrem alterações dinâmicas na
estrutura da cromatina e conseqüentemente na expressão gênica. Estas
modificações são reguladas por mecanismos epigenéticos capazes de modificar a
estrutura do nucleossomo através de reações bioquímicas, influenciando assim a
expressão do DNA. Os remodeladores de cromatina alteram as interações DNA-
histonas, influenciando a atividade transcricional, por facilitar ou inibir o acesso ao
DNA. Uma família importante de remodeladores é o complexo SWI/SNF, composto
por várias subunidades protéicas, entre elas a BRG1. Nosso objetivo foi analisar os
padrões de expressão da BRG1 em diferentes estágios do desenvolvimento
folicular. Para tal, ovários de marrãs (n=10) foram coletados imediatamente após a
evisceração e então lavados duas vezes em PBS resfriado. Os ovários foram
divididos em fragmentos de aproximadamente 8x8x8 mm e homogeneizados por
agitação constante em solução de paraformaldeído 4% em temperatura de 4°C por
12 h. Os fragmentos ovarianos foram posteriormente lavados três vezes em PBS a
4°C e imediatamente transferidos para álcool 70% para posterior processamento
para imunofluorescência. Os tecidos foram inclusos em parafina e seccionados
utilizando protocolos histológicos padrão. Para a imunofluorescência, as amostras
foram desparafinizadas e reidratadas por três passagens sucessivas em etanol.
Após lavar em PBS-Brij, a recuperação antigênica foi realizada pela incubação em
tampão citrato de sódio por 5 minutos em uma panela de pressão.
Subseqüentemente, as seções foram bloqueadas por 1 h com soro total caprino e
então incubadas com anticorpo policlonal anti-BRG1 produzido em coelho (1/200) ou
com IgG de coelho não imunizado (controle) na mesma concentração dos anticorpos
primários, durante 12 horas a 4°C.Os anticorpos primários foram identificados
36
utilizando-se AlexaFluor 594-anti IgG de coelho na diluição 1/1000. As células foram
contracoradas com DAPI. Sinais de imunofluorescência foram mensurados em
microscópio Nikon eclipse 80i. Sinais positivos para BRG1 foram detectados em
todas as amostras analisadas. Nos folículos primários a proteína foi encontrada
apenas no núcleo do oócito, no entanto conforme o desenvolvimento folicular foi
identificado a expressão da BRG1 nas células da granulosa e nas células da teca,
em um padrão bem definido conforme a proximidade das células em relação ao
oócito. Estes resultados sugerem uma participação importante da BRG1 no
processo de crescimento folicular, possivelmente modulando a proliferação das
células da granulosa e da teca, além de todo crescimento e maturação do oócito.
Palavras-chave: BRG1, oócito, foliculogênese, complexo SWI/SNF, suínos
37
Abstract
Dynamic changes in chromatin structure and gene expression occur during follicular
and oocyte growth. Epigenetic mechanisms regulate these changes through
biochemical reactions that modify the nucleosome structure, and consequently
affecting DNA expression. Chromatin remodelers that alter DNA-histones interactions
can influence transcriptional activity by facilitating or repressing DNA access. The
SWI/SNF complex represents an important chromatin remodeling family, which
comprises many proteins subunits including the BRG1 (brahma-related gene 1). Our
aim in this study was to analyze BRG1 expression patterns in different stages of
follicular development. Ovaries (n=10) were collected from pre-pubertal gilts
immediately after evisceration and then rinsed twice in cold PBS. Ovarian fragments
of 8x8x8 mm were cut and placed into a 4% paraformaldehyde solution at 4˚C for 12
hours. Ovarian fragments were then washed three times in PBS at 4˚C and
transferred to 70% Ethanol. Tissues were processed for embedding in paraffin, and
sectioned using standard histological protocols. For immunofluorescence, samples
were deparaffinized and rehydrated through three changes of alcohol. After washing
in PBS-Brij, antigen retrieval was performed by incubating the tissue sections in
sodium citrate buffer for 5 min in a pressure cooker. Sections were subsequently
blocked for 1 h with normal goat serum and then incubated with primary antibodies,
polyclonal rabbit anti-BRG1 (1/200) or control rabbit IgG at the same concentration,
overnight at 4 degrees. Primary antibodies were detected using Alexa Fluor 594-anti-
rabbit 1/1000 diluted secondary antibody. Cells were counterstained with DAPI.
Immunofluorescence signals were evaluated using a Nikon eclipse 80i microscope.
Positive fluorescent signal for BRG1 was detected in all analyzed samples. In
primary follicles, the protein was detected only in the oocyte nucleus. However, in
38
growing follicles, BRG1 was identified in granulosa and theca cells in a well defined
pattern according to the proximity of the cells from the oocyte. These results suggest
an important participation of BRG1 in the regulation of follicular growth, probably
modulating granulosa and theca cells proliferation, as well as oocyte growth and
maturation
Key-words: BRG1, oocyte, folliculogenesis, SWI/SNF complex, porcine
39
Introdução
O ovário mamífero é responsável pela produção de oócitos aptos para
fecundação e pela produção de hormônios esteróides essenciais à fecundação e
prenhez (Seneda et al., 2008). Os oócitos encontram-se inclusos em folículos, os
quais são responsáveis pela manutenção da viabilidade, bem como crescimento e
maturação oocitária (Figueiredo et al., 2002). Os primeiros folículos a serem
formados no ovário são denominados primordiais, nos quais o oócito é envolvido por
uma camada de células somáticas denominada células da pré-granulosa. Após a
formação, componentes do folículo primordial são mantidos em um estado de
quiescência, sendo o oócito mantido em prófase I da meiose, enquanto as células da
pré-granulosa permanecem na fase G-Zero do ciclo celular (Pepin et al., 2007). Essa
quiescência permanece até a ativação do folículo primordial, caracterizada pela
mudança na forma das células da granulosa e pela proliferação das mesmas (Braw-
Tal & Yossefi, 1997). A ativação ainda não é totalmente compreendida, mas admite-
se os fatores de proliferação celular como prováveis promotores deste processo
(Fair, 2003). Em relação à expressão gênica, a transição do folículo primordial para
o primário é a fase de maior incidência de alterações na expressão dos genes,
quando comparada com todas as outras fases do desenvolvimento folicular (Pan et
al., 2005).
Uma vez ativados, os folículos passam pelos estágios primário, secundário,
terciário e antral. Admite-se para a fase inicial do crescimento folicular, uma ação
predominantemente local e de vários fatores de crescimento, como o Kit Ligand
(Parrot & Skinner, 1999), GDF-9 (Vitt et al., 2000), bFGF (Nilsson et al., 2001) e LIF
(Nilsson et al., 2002). Sinalizações entre o oócito e as células da granulosa têm se
40
mostrado como uma chave regulatória na transição do folículo primário para
secundário e antral, e membros da família TGFB são requeridos para esta transição
(Pangas & Matzuk, 2004). Os oócitos tornam-se competentes para retomar a meiose
durante o estágio final de desenvolvimento do folículo antral (Eppig et al., 1992),
fase estimulada por ondas de hormônio luteinizante (LH). Uma vez retomada a
meiose, os oócitos progredirão até a fase de metáfase II, quando ocorrerá a
segunda interrupção da divisão. A meiose somente será retomada caso ocorra a
fecundação, possibilitando assim a formação do oócito haplóide fecundado (Moore &
Persaud, 1994).
Apesar da foliculogênese ser objeto de grande interesse de pesquisadores,
vários mecanismos envolvidos no processo de ativação folicular e oocitário
permanecem obscuros, mas admite-se um programa coordenado de elementos
genômicos e epigenômicos regulando o complexo processo da foliculogênese nos
ovários mamíferos (Ruiz-Cortez et al, 2005). Estudos recentes mostraram o
crescimento oocitário durante as mudanças dinâmicas na estrutura e função da
cromatina, essenciais para conferir maturação e competência meiótica ao oócito (
De La Fuente, 2006).
Nos eucariotos, a infomação genética é armazenada em um polímero
dinâmico denominado cromatina, composta pela associação do DNA com proteínas
chamadas histonas (H1, H2A, H2B, H3 e H4). A unidade estrutural fundamental da
cromatina é o nucleossomo, constítuido por 146 pares de bases do DNA arranjados
ao redor destas histonas (Trotter e Archer, 2007). O controle transcricional da
expressão gênica depende crucialmente da acessibilidade do DNA, a qual é
epigeneticamente regulada por modificações nas histonas (Narlikar et al., 2000). O
41
remodelamento da cromatina é uma forma de modificação epigenética capaz de
regular a transcriçao por alterar a organização do nucleossomo, facilitando ou
restringindo o acesso ao DNA, determinando assim a ativação ou repressão,
respectivamente, da transcrição. Os complexos remodeladores da cromatina
realizam atividades enzimáticas, modificando a estrutura da cromatina por alterar o
contato DNA-histonas com o nucleossomo de uma forma ATP dependente (Martens
& Winston, 2003).
Os eucariotos contém pelo menos cinco famílias de remodeladores de
cromatina : SWI/SNF, ISWI, NURD/Mi-2, INO80 e SWR1 (Saha et al, 2006). O
complexo SWI/SNF é um dos mais estudados e é composto por multisubunidades (7
a 13 subunidades) reguladoras da expressão gênica por remodelamento da
estrutura da cromatina através de elementos promotores e regulatórios ( Knott et al.,
2006). A proteína BRG1 (brahma related gene) é uma importante subunidade
ATPase deste complexo. Sua exata função não é conhecida, no entando sabe-se
que ela se liga a outras proteínas, glicocorticóides (Inayoshi et al., 2005) e
receptores de estrógeno (Ichinose et al., 1997). A expressão da BRG1 em oócitos
(Bultman et al., 2000) e embriões (Bultman et al, 2006) de camundongos evidenciam
a participação desta proteína na foliculogênese e embriogênese, embora pouco
tenha sido relatado a respeito. Oócitos de fêmeas que sofreram mutação para anular
a expressão da BRG1 completaram a meiose e foram fecundados, porém os
embriões concebidos destes óvulos exibiram problemas na ativação do genoma
embrionáio e o desenvolvimento dos mesmos foi interrompido no estágio de 2 a 4
células com a atividade transcricional reduzida em 30% dos genes (Bultman et al,
2006).
42
Considerando as evidências da participação da BRG1 na foliculogênese, bem
como a importância das modificações epigenéticas na organização da cromatina e
expressão gênica, objetivou-se neste trabalho pesquisar a presença da BRG1 nas
diferentes fases do denvolvimento folicular. A partir de ovários suínos submetidos à
imunofluorescência, foram analisados folículos primários, secundários, terciários e
antrais, bem como os oócitos neles inclusos.
Material e métodos
Ovários de marrãs foram coletados em abatedouros imediatamente após a
evisceração. Logo após a coleta, os ovários foram lavados duas vezes em PBS
resfriado, divididos em fragmentos de aproximadamente 8x8x8 mm e
homogeneizados por agitação constante em solução de paraformaldeído 4% em
temperatura de 4°C por 12 h. Os fragmentos ovarianos foram posteriormente
lavados três vezes em PBS a 4°C e imediatamente transferidos para álcool 70%. Foi
utilizado protocolo histológico padrão, no qual os tecidos foram desidratados em
diferentes concentrações de álcool, diafanizados em Citrisolve (Fisher Scientific
Canadá, Ottawa, Ontario), incluídos em parafina e seccionados seriadamente à
espessura de 3 µm. Nesses cortes foi realizada a técnica de imunofluorescência.
Imunofluorescência
Os fragmentos ovarianos foram desparafinizados com Citrisolve (Fisher
Scientific Canadá, Ottawa, Ontario) e reidratados por três passagens sucessivas em
43
etanol. Após lavar em PBS-Brij (tampão fosfato salina [PBS] com 0,03% de Brij 35)
por 10 minutos, a recuperação antigênica foi realizada pela incubação em tampão
citrato de sódio por 5 minutos em uma panela de pressão. As secções foram
resfriadas à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas três vezes em PBS-Brij.
Subseqüentemente, as seções foram bloqueadas por 1 h em PBS-Brij com 10% de
soro total caprino e albumina sérica bovina 2,5% e então incubadas com anticorpo
policlonal, produzido em coelho, anti-BRG1 (Abcam Inc., Cambridge, MA; ab8895,
1/200). O controle negativo foi realizado utilizando IgG de coelho não imunizado
(Jackson Immunoresearch Laboratórios, PA) na mesma diluição dos anticorpos
primários. A incubação com o anticorpo primário foi realizada sob agitação por 12 h
a 4°C. Os anticorpos primários foram detectados utilizando-se AlexaFluor 594-anti-
IgG de coelho (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) na diluição 1/1000. As células
foram contracoradas com 4',6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI). Sinais de
imunofluorescência foram mensurados em microscópio Nikon eclipse 80i e as
imagens capturadas em sistema de fotodocumentação digital.
Resultados
Através de análise de imunofluorescência realizada em ovários de porcas pré-
púberes, foi analisada a presença da proteína BGR1, uma subunidade do complexo
remodelador da cromatina SWI/SFN, em folículos primários, secundários, terciários e
antrais. Sinais de imunofluorescência positivos para BGR1 foram expressos em
todas as amostras analisadas (figura 1), sugerindo assim um envolvimento da
proteína com o desenvolvimento folicular. Nos folículos primários a BRG1 esteve
presente apenas no núcleo do oócito, no entanto a expressão da mesma foi
evidenciada nas células da granulosa nas próximas etapas do desenvolvimento. Nos
44
folículos secundários, além do núcleo, houve expressão da BRG1 também nas
células da granulosa próximas ao oócito. Nesta etapa de desenvolvimento, o folículo
é uma estrutura mais compacta e não há muito espaço entre o folículo e oócito. Já o
folículo terciário é caracterizado pelo início da formação cavidade antral e pela
completa organização das células da teca, dividas em teca interna e externa. Neste
estágio, o contato oócito-granulosa começa a diminuir, pois o espaço central começa
a ser preenchido pelo fluído folicular. Nesta fase observamos a expressão da BRG1
nas células da granulosa mais próximas às células tecais e também no núcleo do
oócito. Nos folículos antrais, a BRG1 além de presente no núcleo do oócito, também
foi observada nas células da granulosa e nas células tecais. É importante informar
que folículos primordiais não foram analisados por não apresentarem marcação para
BRG1.
Discussão
Em todas as classes foliculares analisadas foram observados sinais de
imunofluorescência positivos para a expressão da BRG1, sugerindo o envolvimento
desta subunidade do complexo SWI/SNF no processo da foliculogênese.
O desenvolvimento folicular é um processo lento, o período do início do
crescimento do folículo primordial até o estágio de folículo pré-ovulatório leva quatro
meses em suínos (Morbek et al, 1992), e as células do folículo ovariano sofrem
intensa proliferação e diferenciação (Ruiz-Cortez et al, 2005). O complexo SWI/SNF
parece estar envolvido nestes dois processos, a BRM (proteína brama), uma das
subunidades deste complexo, foi relacionada com a diferenciação celular, pois seus
níveis aumentaram durante o processo de diferenciação de hepatócitos e células
neurais (Itoh et al, 2008). Já a BRG1, parece ter maior envolvimento com a
45
proliferação celular, pois sua expressão foi predominantemente vista em tecidos em
constante proliferação ou auto-renovação, como células das criptas intestinais,
epitélio da bexiga e espermatogônias (Reisman et al., 2005). Estas informações
podem sugerir uma função para a BRG1 durante a foliculogênese no processo de
proliferação das células da granulosa.
Para o sucesso do desenvolvimento folicular é necessária a ativação dos
folículos primordiais. As mudanças na expressão gênica durante a transição de
folículo primordial para folículo primário têm sido considerado o evento mais
complexo da foliculogênese, pela intensa reorganização da estrutura folicular e início
do crescimento e desenvolvimento (Pan et al, 2005). No entanto, as mudanças na
estrutura da cromatina, quando ocorre ativação da BRG1, são pobremente
caracterizadas durante essa transição (Pan et al, 2005). Em nosso trabalho a BRG1
apareceu somente no núcleo do oócito de folículos primários e só depois, nas fases
subseqüentes do desenvolvimento é que sua expressão se expande, sendo evidente
também nas células da granulosa, sugerindo que esta proteína começa a participar
da foliculogênese após a ativação dos folículos primordiais, que não apresentaram
marcação.
Após ativação, os folículos primários iniciam a fase de crescimento, cujos
mecanismos regulatórios são pouco esclarecidos, porém um papel crucial do oócito
tem sido demonstrado (Eppig, 2001). O desenvolvimento folicular inicial parece ser
dependente de fatores secretados pelo próprio oócito, como GDF-9 (fator-9 de
crescimento e diferenciação) e BMP-15/GDF-9B (proteína-15 óssea morfogenética)
(Carabatsos et al., 1998; Galloway et al., 2000). Vale ressaltar que a BRG1 esteve
46
presente nos oócitos de todos folículos analisados, demonstrando assim a sua
participação no desenvolvimento folicular por meio da atividade regulatória do oócito.
O processo de transição do folículo primário para secundário é marcado por
proliferação das células da granulosa e aumento do oócito. Alguns marcadores têm
sido reportados como de grande importância para a formação do folículo secundário,
tais como ativina-A (Zhao et al., 2001), EGF (Gutierrez et al., 2000) e BMP-15
(Juengel et al., 2002). Neste estágio a zona pelúcida já pode ser evidenciada, as
células tecais começam a se organizar e os folículos parecem começar a responder
às gonodatrofinas (Fair, 2003). No folículo secundário as células da granulosa
adquirem capacidade proliferativa e em nossos resultados, é nesta fase que foi
observado o início da expressão da BRG1 na granulosa, reforçando a idéia de um
possível papel desta proteína na regulação da proliferação das células da granulosa.
A etapa seguinte do desenvolvimento consiste no folículo terciário, cuja
principal característica é o início da formação do antro. As camadas da granulosa se
multiplicam e as células da teca se organizam completamente em teca externa e
interna (Driancourt, 1991). Nesta etapa, a ação gonadotrófica já pode ser detectada,
sendo então iniciados os efeitos amplos do FSH e LH (van den Hurk et al, 2000).
Quanto à expressão da BRG1, a localização nas células da granulosa diferiu dos
folículos secundários, sendo sua expressão evidente nas células da granulosa
próximas às células da teca. Considerando-se a intensa participação interativa entre
as células da teca e da granulosa para a esteroidogênese, admite-se uma possível
atividade da BRG1 neste processo, principalmente pelo fato de já se ter
demonstrado o vínculo da BRG1 com receptores de estrógeno (Ichinose et al.,
1997).
47
Nos folículos antrais, a cavidade antral aumenta muito e o oócito fica preso à
granulosa pelas células do cumulus. Sabe-se que o progresso através dos
sucessivos estágios da foliculogênese é dependente de uma efetiva comunicação
do oócito com as células da granulosa e da granulosa com as células da teca
(Knight & Glister, 2003). A BRG1 esteve presente no oócito, na granulosa e nas
células da teca. Considerando-se as dinâmicas modificações morfo-funcionais nesta
etapa do desenvolvimento folicular, sugere-se uma participação efetiva da BRG1 de
maneira bastante ampla. A BRG1 pode exercer funções distintas nas diferentes
estruturas, podendo atuar na regulação da transcrição no oócito, na proliferação
celular nas células da granulosa e da teca, além do possível envolvimento na
esteroidogênese. Contudo estas informações ainda devem ser melhor investigadas.
Dentre as histonas com atividades importantes na foliculogênese, destaca-se
a histona H3. A fosforilação da serina 10 da histona H3 foi relacionada com atividade
transcricional favorável ao processo de divisão celular (Hans e Dimitrov, 2001). Por
sua vez, esta modificação da H3 apresentou-se vinculada à ação tanto do FSH
como do estradiol, durante o período pré-ovulatório, comprovando a estreita relação
desta alteração na cromatina com a regulação do crescimento folicular (Ruiz-Cortés
et al., 2005). Ainda da H3, a lisina 4 (K4), tem despertado o interesse dos
pesquisadores. A H3K4 e a enzima reguladora da sua metilação – Lysine Specific
Demethylase 1 (LSD1) – parecem exercer um papel central no comando da
expressão gênica de gametas, tanto em organismos mais simples, como a
Drosophila (Di Stefano et al., 2007), como também nos mamíferos (Godmann et al.,
2007). Ao longo do desenvolvimento folicular, demonstrou-se uma distribuição
específica da H3K4 mono, di e tri-metilada, com presença bem definida em folículos
48
antrais e um surpreendente e progressivo decréscimo com a proximidade da
ovulação (Seneda et al., 2008).
Uma associação da H3K4 com a BRG1 foi apresentada por Bultman et al.
(2002). Durante a ativação do genoma de embriões oriundos de oócitos de
camundongas com depleção do gene BRG1, houve um decréscimo na expressão da
H3K4 dimetilada. Esses autores demonstraram uma redução de aproximadamente
61% de expressão da H3K4 dimetilada, quando em comparação com embriões
originados de camundongas normais. Comparando a modulação da BRG1 nas
diversas categorias foliculares do presente trabalho com os resultados de H3K4
mono, di e trimetilada obtidos por Seneda et al. (2008), constata-se identidade de
expressão entre BRG1 e H3K4 em folículos ovarianos. Os oócitos dos folículos
primários, secundários e terciários apresentaram marcação tanto para H3K4 mono,
di e trimetilada como para BRG1, porém nas células da granulosa apenas a BRG1
foi expressa. Já em folículos antrais, todas as formas de metilação da H3K4 foram
identificadas (Seneda et al., 2008) em oócitos, células da granulosa e da teca,
situação idêntica à observada no presente trabalho para a BRG1. Estes resultados
evidenciam uma relação entre esses marcadores, no entanto mais estudos são
necessários para afirmar uma possível função correlacionada entre BRG1 e H3K4.
O fato de se ter identificado a BRG1 em oócitos desde as fases iniciais do
crescimento folicular, atesta a ativa participação deste gene a partir do começo do
crescimento oocitário até a fase embrionária, tendo sido demonstrada letalidade
embrionária precoce em homozigotos para a nulidade de BRG1 e vários problemas
para os heterozigotos (Bultman et al, 2000). A ativação do genoma embrionário foi
claramente associada com a BRG1 em estudo posterior, sendo mesmo considerado
49
um gene primordial neste processo de ativação (Bultman et al., 2006). O início do
desenvolvimento embrionário, antes da ativação do genoma embrionário, é
coordenado por RNAs e proteínas sintetizadas e armazenadas pelo oócito (Sirard &
Coenen, 1994). Como demonstrado no presente trabalho, a expressão da BRG1
ocorre de maneira bastante precoce, sugerindo a sua importância no controle do
genoma embrionário advindo desde período anteriores, no início do crescimento
oocitário.
O complexo SWI/SNF foi primeiramente identificado em leveduras e é
altamente conservado entre os eucariotos (Peterson & Workman, 2000). Esta
informação nos leva a pensar em uma função básica para esse complexo e suas
subunidades. No entanto estudos mais detalhados são necessários para afirmar a
exata função da BRG1 durante a foliculogênese, porém nossos resultados sugerem
que esta proteína é requerida no processo de crescimento folicular e oocitário, que
envolve proliferação e diferenciação celular.
50
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54
Legenda
Figura 1: Localização por imunofluorescência da BRG1 em folículos
ovarianos de diferentes estágios de desenvolvimento. Na primeira coluna a
coloração DAPI (em azul) foi utilizada para evidenciar núcleo de células foliculares, a
segunda coluna mostra a localização da BRG1 (em vermelho) e a terceira, a
sobreposição das figuras. Nos folículos primários a BRG1 está presente somente
nos oócitos, nos secundários a expressão da proteína já pode ser detectada também
nas células da granulosa próxima ao oócito. Nos terciários a BRG1 está presente no
oócito e na granulosa e nos folículos antrais também pode ser vista nas células da
teca, além da granulosa e oócito.
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20x
60x
Primary
follicle
Secondary
follicle
DAPI SNF2 BRG1 merge
20x
60x
60x
Tertiary
follicle
Antral follicle
Oocyte from
antral follicle
Antral follicle
20x
Figura 1.
