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Universidade Federal de São João del-Rei Coordenadoria do Curso de Química
Óleo essencial de Lippia origanoides: avaliação do potencial fungitóxico e estudo do
efeito inibitório sobre acetilcolinesterase
Stephanne Yonara Barbosa de Carvalho
São João del-Rei – 2017
ÓLEO ESSENCIAL DE LIPPIA ORIGANOIDES: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FUNGITÓXICO E ESTUDO DO EFEITO
INIBITÓRIO SOBRE ACETILCOLINESTERASE
Monografia de Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado no 2º semestre do ano de 2017 ao Curso de Química, Grau Acadêmico Bacharelado, da Universidade Federal de São João del-Rei, como requisito parcial para obtenção do título Bacharel em Química. Autor: Stephanne Yonara Barbosa de Carvalho Docente Orientador: Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães Modalidade do Trabalho: Pesquisa
São João del-Rei – 2017
RESUMO
O óleo essencial da espécie Lippia origanoides Kunth. tem sido muito estudado, pois
apresenta em sua constituição compostos como timol e carvacrol. Estes compostos são
monoterpenos aromáticos e apresentam diversas atividades biológicas. O objetivo deste
trabalho foi avaliar a capacidade inibitória sobre a acetilcolinesterase e o potencial
antifúngico sobre a Candida albicans pelos óleos essenciais obtidos das folhas de L.
origanoides, coletadas em diferentes localidades. A acetilcolinesterase é uma enzima, cuja a
função está relacionada com a hidrólise do neurotransmissor acetilcolina, sendo a sua
inibição uma das formas de trameto mais utilizado para a doença de Alzheimer. As plantas
foram coletadas em cinco localidades na região do Campo das Vertentes-MG, pertencentes
à microrregião de São João del-Rei. Os estudos foram realizados por meio de análises in
vitro. Os valores das concentrações do inibidor necessário para reduzir a taxa da reação
enzimática em 50% (IC50), encontrados nas análises dos cinco óleos essenciais e dos
padrões de carvacrol e 1,8-cineol variaram entre 0,57 – 7,2 μg mL-1. A partir destes dados foi
possível determinar que o carvacrol e 1,8-cienol, constituintes majoritários dos óleos
essenciais das plantas coletadas em algumas localidades, apresentaram os maiores
potenciais ativos. Sendo estes, submetidos a ensaios cinéticos para determinação de seus
mecanismos de inibição, e consequente obtenção dos valores da constante de inibição (Ki).
Podendo observar que a inibição da acetilcolinesterase pelo carvacrol, apresentou um perfil
de inibição mista e um valor de Ki= 0,0271 mM e o 1,8-cineol, apresentou um perfil de
inibição competitiva e um valor de Ki= 0,2011 mM. Os óleos essenciais de L. origanoides
apresentaram também a atividade antifúngica sobre a Candida albicans, tendo o melhor
potencial na concentração de 160 mg mL-1. Os halos de inibição do crescimento das
leveduras variaram de 7,83 a 32,5 mm, sendo que, o óleo essencial coletado na Serra do
Lenheiro apresentou o melhor potencial de inibição. Por meio dos resultados obtidos pode
se concluir que o óleo essencial de L. origanoides, possui atividade inibitória sobre
acetilcolinesterase e sobre o crescimento de Candida albicans.
Palavras chaves: Carvacrol, 1,8-Cineol, Doença de Alzheimer, Candida albicans.
SUMÁRIO
1.Introdução 01
2. Objetivos 05
3. Metodologia 06
4. Resultados e discussões 10
5. Conclusão 21
6. Referências bibliográficas 21
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2017
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1. INTRODUÇÃO
A aplicação de plantas para tratamento de doenças é uma das práticas mais
antigas da humanidade, sendo durante muito tempo uma das principais fontes para
obtenção de medicamentos (SIVIERO et al., 2012). Apesar do desenvolvimento dos
fármacos sintéticos, estudos realizados para entender a composição química e a
atividade biológica das plantas, tornam-se cada dia mais importantes. Pois os produtos
obtidos de fontes naturais, possuem uma grande diversidade química em sua
composição, que favorece a descoberta de novos medicamentos (BADKE et al., 2012;
TREVISAN et al., 2003)
Os óleos essenciais são compostos sintetizados pelo metabolismo secundário
das plantas e podem ser extraídos de flores, folhas, sementes, frutas e raízes (DE
SOUSA, 2015). Eles são definidos como os produtos obtidos de partes de plantas por
meio de destilação por arraste com vapor d’água, bem como os produtos obtidos por
expressão dos pericarpos de frutos cítricos (SIMÕES et al., 2017). Eles são líquidos e
apresentam características como volatilidade, solubilidade em solventes orgânicos,
são normalmente incolores e geralmente apresentam aroma agradável (SIMÕES et
al., 2017). Os óleos essenciais possuem constituição variada, podendo conter
compostos de diversas classes químicas, como álcoois, éteres ou óxidos, aldeídos,
cetonas, ésteres, aminas, amidas, fenóis, heterociclos. Sendo a maioria desses
compostos pertecentes a classe dos terpenoides ou dos fenilpropanoides (BILIA et al.,
2014; DHIFI et al., 2016).
Nas plantas podem desempenhar o papel de proteção contra fungos, bactérias
insetos, auxiliando na adaptação desta ao ambiente. Sendo que, essas propriedades
biológicas são normalmente referentes aos compostos majoritários presentes em sua
composição. Alguns compostos presentes na composição dos óleos essenciais
também possuem atividade antioxidante, o que confere a eles a capacidade de
proteção dos sistemas biológicos. Essa propriedade atua preservando o organismo de
danos causados pelo estresse oxidativo, que é responsável pelo envelhecimento,
doenças cardiovasculares, neurodegenerativas e de células tumorais (RODRIGUES et
al., 2015). Devido a essas propriedades os óleos essências têm se tornando
importantes objetos de estudos, podendo ser aplicados especialmente na indústria
farmacêutica, agronômica, alimentar e cosméticas (BAKKALI et al., 2008).
A espécie Lippia origanoides Kunth pertence a familia das Verbaceas, que são
conhecidas por apresentarem grande potencial na produção de óleo essencial (Figura
1) (TOZIN et al., 2014). Popularmente é conhecida como alecrim-pimenta e possui
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aplicação na medicina tradicional, para o tratamento de doenças gastrointestinais,
antisséptico, inflamação de garganta, entre outros (OLIVEIRA et al., 2007). Trata-se de
um arbusto silvestre, que pode chegar até 3 m de altura, possue folhas simples, flores
de cor branca, caule quebradiço, são aromáticas e de sabor picante, daí a
denominação alecrim-pimenta (PINTO et al., 2007). Essa espécie tem se tornado
grande alvo de pesquisa, devido seu óleo essencial possuir um elevado valor
terapêutico, destacando a atividade antimicrobiana (SILVA et al, 2010).
Figura 1. Lippia origanoides Kunth no ambiente natural em Santa Cruz de Minas – Minas
Gerais (Fonte: própria).
A L. origanoides podem apresentar em suas folhas um teor de óleo essencial
de até 4,5%, sendo o timol e carvacrol seus constituintes majoritários, podendo sofrer
variações de acordo com o quimiotipo da espécie. Podem apresentar também
compostos como 1,8-cineol, ρ-cimeno, 4-terpineol, timol metil éter, (E)-cariofileno,
entre outros. Normalmente é encontrada no nordeste Brasileiro, porém estudos
recentes demonstraram a presença desta espécie na região do Campo das Vertentes
do Estado de Minas Gerais. As análises realizadas com o óleo essencial das plantas
coletadas na região de Minas demonstraram a presença de altos teores de carvacrol e
a ausência ou baixos teores de timol (GUIMARÃES et al., 2015; LIMA et al., 2011).
Esses dois compostos, timol e carvacrol são isômeros e ambos apresentam diversas
atividades biológicas, tornando o estudo dos óleos essenciais desta espécie
importantes no desenvolvimento de novos fármacos (Figura 2).
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Figura 2. Estruturas químicas do Cravacrol e do Timol (SOUZA et al., 2016).
Os óleos essenciais apresentam uma grande diversidade química em suas
constituições, sendo uma das principais fontes para a descoberta de novos
medicamentos com o potencial inibitório da acetilcolinesterase (AChE). A AChE é uma
enzima que pertence à família das colinesterases. Essa enzima possui a função de
encerrar a transmissão do impulso nervoso nas sinapses colinérgicas, por meio da
hidrólise rápida do neurotransmissor acetilcolina (ACh) (Figura 3). A ACh é um
neurotransmissor formado na região terminal dos neurônios, chamada de axônio
terminal, sendo que sua função está relacionada diretamente com a memória e com o
aprendizado (PETRONILHO et al., 2011; FA-JIE LI et al., 2017). O comprometimento
das vias colinérgicas é uma das principais causas para o desenvolvimento de doenças
neurodegenerativas, como doença de Alzheimer depressão, esquizofrenia, problemas
com a regulação do sono, entre outros (DRACZKOWSKI et al., 2016).
Figura 3. Esquema do processo de transmissão e controle nervoso nas sinapses
(PETRONILHO et al., 2011).
A doença de Alzheimer (DA) é um dos maiores problemas que provoca a
demência do indivíduo portador. Sua descoberta ocorreu em 1907, pelo
neuropatologista Alois Alzheimer. Em 2015 a doença já afetava cerca de 46,8 milhões
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de pessoas e as estimativas é que em 2030 aumente para 74,7 milhões, sendo que a
grande maioria da população afetada é composta por idosos (PETRONILHO et al.,
2011; ZHAN et al., 2016). A DA é uma desordem neurodegenerativa progressiva e
irreversível, que acarreta vários distúrbios cognitivos como o comprometimento da
memória, linguagem, habilidades motoras e possivelmente pode levar à morte
(ABUHAMDAH et al., 2015).
Entre os principais medicamentos para o tratamento da DA estão os inibidores
da acetilcolinesterase. A abordagem terapêutica para tratar a DA é aumentar a
disponibilidade da acetilcolina no cérebro, por meio da inibição da sua principal enzima
catalítica, a acetilcolinesterase (SANTOS et al., 2011). No mercado estão disponíveis
quatro medicamentos sintéticos (tacrina, donepezila, rivastigmina, galantamina) que
são utilzados para interver na progressão da doença de Alzheimer (MOTA et al.,
2012). Porém, são utilizados apenas quando a doença está no estágio inicial, e podem
apresentar efeitos colaterais, como hepatotoxicidade e problemas gastrintestinais
(MUREBWAYIREA et al., 2009; MARKMEE et al., 2006). Dessa forma, existe uma
necessidade de encontrar novas drogas com uma maior eficiência para o DA.
Para avaliar a atividade da acetilcolinesterase, normalmente se utiliza o método
descrito por Ellman. Esse método se baseia na hidrólise da acetiltiocolina (ACTI) pela
acetilcolinesterase (AChE), produzindo tiocolina que reage com o DTNB, obtendo
como produto o composto 5-tio-2-nitro-benzoato, que apresenta coloração amarela e
absorve no comprimento de onda de 412 nm (SILVA et al., 2009). A Figura 4
apresentas as reações químicas que ocorrem nesse ensaio.
Figura 4. Reações envolvidas no método de Ellman (SILVA et al., 2009).
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Os óleos essenciais já possuem descrito na literatura atividade antifúngica,
porém ainda existe uma grande necessidade em saber os mecanismos de ação dos
seus compostos frente aos fungos. O gênero Candida spp. é composto de
aproximadamente 200 espécies de leveduras e vivem como parasitas na microbiota de
um inidviduo saudável. Suas colônias apresentam coloração branca ou creme, com
uma surperfície lisa ou rugusa, um tamanho entre 2 a 6 μm, sendo sua reprodução por
brotamento. Normalmente se manifestam como patogênicos quando a imunidade do
hospedeiro se encontra comprometida (PEIXOTO et al., 2014). Os indivíduos que
possuem uma maior probabilidade de serem infectados pelo fungo são aqueles
portadores de doença como AIDS, leucemia, linfoma, diabetes, uma vez que, essas
doenças podem afetar a imunidade do corpo humano (LIMA et al., 2006). A maioria
das infecções é atribuída a várias espécies como a Candida albicans, Candida
glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis e Candida krusei (OLIVEIRA et al.,
2014).
Os fármacos utilizados para o tratamento do fungo apresentam baixa eficácia e
vários efeitos colaterais. Dessa forma, existe uma crescente procura para a
descoberta de compostos, que apresentam características antifúngicas, com uma
ação mais eficiente sobre o fungo da Candida spp. (FONTENELLE et al., 2007). Já foi
comprovado que os óleos essenciais possuem capacidade de inibir fungos
patogênicos, porém ainda não são muito utilizados clinicamente. Dessa forma,
pesquisas que relatam compostos presentes nos óleos essenciais, que possuem
caráter antifúngico, são importantes para o desenvolvimento de novos medicamentos.
Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi extrair e realizar a
caracterização química dos óleos essenciais de L. origanoides, coletadas em cinco
localidades diferentes, bem como avaliar o potencial farmacológico destes óleos como
possíveis inibidores da enzima acetilcolinesterase e do crescimento de Candida
albicans.
2. OBJETIVOS
Extrair o óleo essencial das folhas da espécie L. origanoides;
Identificar e quantificar os constituintes do óleo essencial de L. origanoides;
Avaliar a atividade anticolinesterásica do óleo essencial de L. origanoides;
Avaliar atividade antifúngica do óleo essencial de L. origanoides sobre Candida
albicans.
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3. METODOLOGIA
3.1. Obtenção do material vegetal
A coleta das folhas da espécie L. origanoides, foi realizada na estação da
primavera (novembro de 2015) no período entre 8h e 9h da manhã, nas localidades do
Município de Santa Cruz de Minas (21°07'12" S, 44°12'07" W Alt: 894m), Resende
Costa (20°59'26" S, 44°11'23" W Alt: 971m), Ritápolis (21°01'16" S, 44°20'16" W Alt:
992m), Madre de Deus de Minas (21°24'35" S, 44°23'20" W Alt: 940m) e São João del
Rei/Serra do Lenheiro (21°09'06" S, 44°18'14" W Alt: 1100m), na região dos campos
das vertentes/MG, microrregião de São João del Rei. O material vegetal coletado foi
encaminhado para o Laboratório de Química Orgânica do Departamento de Ciências
Naturais da Universidade Federal de São João del-Rei, para extração dos óleos
essenciais.
Para confirmação da identidade botânica foram preparadas exsicatas, sendo
posteriormente depositada no Herbário da Universidade Federal de São João del-Rei
(UFSJ), localizado no departamento de Ciências Naturais (registros 8303, 8299, 8298,
8302 e 8302 respectivamente).
3.2. Extração dos óleos essenciais
Os óleos essenciais foram extraídos do material vegetal fresco (50 g), por meio
do método de hidrodestilação utilizando-se um aparelho de Clevenger modificado
adaptado a um balão de fundo redondo com capacidade de 1 litro. O processo de
extração foi realizado em um período de 2 horas, mantendo a mistura em ebulição. Os
hidrolatos obtidos foram coletados e centrifugados em centrífuga de cruzeta horizontal
a 900 g por 5 minutos. Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur o óleo essencial foi
retirado e acondicionado em frasco de vidro âmbar, mantidos em baixas temperaturas.
3.3 Análises qualitativas e quantitativas dos óleos essenciais de L. origanoides
As análises qualitativas dos óleos essenciais foram realizadas por
cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG/EM-EM), na
Universidade Federal de São João del Rei, sendo utilizado um equipamento Agilent
Triplo Quadrupolo, modelo 7000C, equipado com detector seletivo de massa modelo.
O equipamento foi operado nas seguintes condições: coluna capilar de sílica fundida
com fase apolar; temperatura do injetor de 220 °C; gás carregador hélio (1 mL min-1);
pressão inicial na coluna de 100,2 kPa; taxa de Split 1:50 e volume injetado de óleo
essencial de 1,0 µL [1% (m/v) em hexano]. Para o espectrômetro de massas (EM)
foram utilizadas as seguintes condições: energia de impacto de 70 eV; velocidade de
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decomposição de 1000; intervalo de decomposição de 0,50 e fragmentos de 40 Da e
400 Da decompostos. A identificação dos constituintes foi realizada comparando-se os
espectros obtidos por meio das análises em CG/MS-MS, com os do banco de dados
da biblioteca NIST, e pela comparação dos índices de retenção calculados para cada
constituinte do óleo essencial, por meio da injeção de uma mistura de hidrocarbonetos
(C9H20; C10H22; C11H24; C24H50; C25H52; C26H54) feita nas mesmas condições dos óleos
essenciais para cada constituinte do óleo essencial com os valores tabelados
(ADAMS, 2007).
As análises quantitativas dos constituintes dos óleos essenciais foram
realizadas por um cromatógrafo em fase gasoso, Shimadzu, modelo GC-2010,
equipado com um detector de ionização de chamas (DIC) e coluna capilar RTX-5MS
(30 m x 0,25 mm x 0,25 μm de espessura de filme). Como gás de arraste foi utilizado o
nitrogênio (1,18 mL·min-1); taxa de Split 1:50; pressão na coluna de 115 KPa e o
volume injetado de 1 L, diluído em hexano (1:100 v/v). A temperatura da coluna foi
programada de 60 °C até 240 °C a uma taxa de 3 °C min-¹, em seguida, passando
para uma taxa de aquecimento de 10 °C·min-¹ até 300 °C, permanecendo nessa
temperatura por 10 min. As temperaturas do injetor e do detector foram fixadas em
220 e 300 °C, respectivamente, com a pressão da coluna de 115 kPa.
3.4 Avaliação da atividade inibidora da acetilcolinesterase pelos óleos
essenciais de L. origanoides
A atividade da acetilcolinesterase foi realizada pelo método de Ellman
(ELLMAN et al., 1961), seguido por modificações. Para o ensaio padrão da atividade
inibitória da acetilcolinesterase, foram preparadas soluções dos óleos essenciais e dos
padrões de carvacrol e 1,8-cineol com concentrações entre 0,075 – 50 μg mL-1, sendo
estes diluídos em etanol. Preparou se uma solução tampão 50 mM de tris-HCl (pH 8)
contendo 0,1 M de NaCl e 0,02 M de MgCl2.6H2O. Uma solução estoque de DTNB
[ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico)] (10 mM) foi preparada dissolvendo 0,02 g deste
composto em 5 mL da solução tampão. A solução 0,02 M de iodeto de acetiltiocolina
foi preparada dissolvendo 0,0273 g deste composto em 5 mL de água deionizada.
Inicialmente em 3 mL da solução tampão tris-HCl foram adicionados 50 μL da
solução de acetilcolinesterase (0,04 U mL-1) e 25 μL das soluções dos óleos
essenciais nas respectivas concentrações. Em seguida a mistura foi incubada por 15
minutos a 37 ºC. Subsequentemente, 25 μL da solução de iodeto de acetiltiocolina e
100 μL da solução de DTNB foram adicionados. A mistura resultante foi mantida por
mais 15 min na mesma temperatura. Em seguida a absorbância foi medida a 412 nm.
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Paralelamente foi feito um controle para desconsiderar a hidrólise não enzimática do
iodeto de acetitiocolina, pela substituição da solução enzimática por 50 μL da solução
tampão. Preparou-se uma mistura controle utilizando apenas etanol ao invés da
solução dos óleos essenciais, a qual foi considerada com 100% de atividade. Como
branco utilizou-se apenas solução tampão. Todo o teste foi realizado em triplicata. A
porcentagem de inibição foi determinada utilizando a seguinte equação:
I (%) = 100 - (A1/A0) x 100
Onde I é a porcentagem de inibição da acetilcolinesterase;
A0 é a absorbância do controle;
A1 os valores de absorbância das misturas reacionais contendo as diferentes
concentrações dos óleos essenciais.
3.4.1 Determinação dos valores de IC50
Para determinar os valores das concentrações de inibidor necessário para
reduzir a taxa da reação enzimática em 50% (IC50), foram construídas curvas de dose-
resposta para cada óleo e para os padrões de carvacrol e do 1,8-cineol. Os dados
para a construção desses gráficos foram obtidos por meio da análise de uma
concentração fixa de substrato com diversas concentrações dos óleos essenciais e
dos padrões de carvacrol e 1,8-cineol variando entre 0,075 – 50 μg mL-1, dependendo
do composto. As curvas de inibição foram obtidas construindo gráficos das
porcentagens de inibição versus a concentração do inibidor. Foram traçados os
parâmetros de regressão não linear para curva e os valores de IC50 foram obtidos
utilizando o software CurveExpert 1.4.
3.4.2 Determinação do mecanismo de inibição enzimática do carvacrol e do 1,8-
cieneol
Foram preparadas soluções dos padrões de carvacrol com concentrações de 0,
0,64 e 2,13 mM e de 1,8-cineol com concentrações de 0, 0,08 e 0,41 mM, sendo estes
diluídos em etanol. Preparou se uma solução tampão 50 mM de tris-HCl (pH 8)
contendo 0,1 M de NaCl e 0,02 M de MgCl2.6H2O. Uma solução estoque de DTNB
[ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico)] (10 mM) foi preparada dissolvendo 0,02 g deste
composto em 5 mL da solução tampão. A solução 1 mM de iodeto de acetiltiocolina foi
preparada dissolvendo 0,0027 g deste composto em 10mL de água deionizada.
Inicialmente, em 3 mL da solução tampão tris-HCl foram adicionados 50 μL da solução
de acetilcolinesterase (0,04 U mL-1) e 25 μL das soluções dos padrões nas respectivas
concentrações. Em seguida a mistura foi incubada por 15 minutos a 37 ºC.
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Posteriormente, para o ensaio do carvacrol foram adicionadas soluções de iodeto de
acetiltiocolina nas concentrações 2,59; 1,73; 1,38; 1,04; 0,69; 0,34 e 0,17 mM e 100 μL
da solução de DTNB. No ensaio do 1,8-cineol foram adicionadas soluções de iodeto
de acetiltiocolina nas concentrações 0,69; 0,52; 0,35; 0,26; 0,24; 0,19 e 0,17 mM e 100
μL da solução de DTNB. A mistura resultante foi mantida por mais 15 min na mesma
temperatura. Em seguida a absorbância foi medida a 412 nm. Paralelamente foi feito
um controle para desconsiderar a hidrólise não enzimática do iodeto de acetitiocolina,
pela substituição da solução enzimática por 50 μL da solução tampão. Preparou-se
uma mistura controle utilizando apenas etanol ao invés da solução dos óleos
essenciais, a qual foi considerada com 100% de atividade. O mecanismo de inibição
enzimática foi determinado graficamente por meio do método de linearização dos
parâmetros cinético. Desta forma, foi construído um gráfico duplo-recíproco
correlacionando 1/Absorvância versus 1/[Inbidor] para determinar o mecanismo de
ação do inibidor, sendo utilizando o software Sigmaplot (ELLMAN et al., 1961).
3.5 Avaliação da atividade antifúgica do óleo essencial de L. origanoides
A atividade antifúngica sob Candida albicans (ATCC 18804) foi avaliada por
meio do método de difusão em meio sólido, empregando a técnica de poços (ALVES
et al., 2006). O fungo foi cultivado em Ágar Sabouraud Dextrose e incubado a 37º C
por 24 horas em estufa bacteriológica. Posteriormente, foram preparadas suspensões
de Candida em solução salina com concentração final de 106 UFC mL-1, utilizando a
Câmara de Neubauer. Para o ensaio antifúngico, foram preparadas cinco placas de
Petri de 12 cm de diâmetro, sendo adicionado em cada uma 30 mL do meio de cultura
Ágar Sabouraund Dextrose. Em seguida, colocaram-se dez esferas de vidro em
posições equidistantes e adicionou-se mais 30 mL do meio de cultura. Após a
solidificação dessa camada a suspensão de Candida, previamente preparada, foi
espalhada sobre a superfície do meio de cultura, utilizando uma alça de Drigalski.
Posteriormente, foram retiradas as esferas para a formação dos poços de 3 mm de
diâmetro, nos quais foram adicionados 20 μL das soluções dos óleos essenciais nas
diferentes concentrações diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO). As soluções dos óleos
essenciais de L. origanoides foram preparadas nas concentrações de 160; 80; 40; 20;
10; 5; 2,5; 1,25 mg mL-1, por meio de uma diluição seriada. Para os controles positivo
e negativo foram utilizados, respectivamente, fluconazol diluído em água (5 mg mL-1) e
DMSO. As placas foram incubadas em um período de 24 horas a 37º C em estufa
bacteriológica. Para a coleta dos dados mensuraram-se os halos de inibição do
crescimento fúngico com o auxílio de uma régua milimetrada e, em seguida, calculou-
se o diâmetro médio dos halos de inibição para cada concentração avaliada. Sendo
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considerada como a concentração inibitória mínima aquela capaz de formar um halo
de inibição visível nos poços analisados. Todo procedimento foi realizado em triplicata.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização química do óleo essencial de L. origanoides
Os constituintes presentes nos óleos essenciais de L. origanoides e seus
teores, acompanhados pelos índices de retenção calculado se encontram na Tabela1.
Foram identificados 56 compostos nos cinco óleos essenciais analisados,
representando uma média de 87,91% a 99,24% do total para cada óleo essencial.
Tabela 1. Constituintes químicos do óleo essencial L. origanoides.
COMPOSTOS IR Santa
Cruz de Minas
Resende Costa
Ritápolis Madre de Deus de Minas
Serra do Lenheiro
α-Tujeno 920 0.14 - - 0.07 - α-Pineno 933 0.10 0.18 - - 0.05 Canfeno 942 - - - - - Sabineno 972 - 0.78 - 1.35 0.04 β-Pineno 978 0.26 0.23 - - 0.04 Mirceno 983 - 0.07 - - 0.10
α-Felandreno 1008 0.14 0.42 - 0.78 0.13 α-Terpineno 1018 4.63 0.23 - - 0.32 ρ-Cimeno 1025 - 1.20 0.45 1.08 5.39 Limoneno 1024 - 1.54 0.31 1.00 0.07 1,8-Cineol 1026 - 9.84 2.17 7.28 1.04
γ-Terpineno 1054 3.17 1.59 - 1.67 3.21 cis-Sabineno hidratado 1065 0.31 1.06 0.35 1.67 0.22
Terpineno 1080 - 0.07 - 0.10 0.06 trans-Sabineno hidratado 1098 0.47 0.96 1.11 7.52 0.33
Linalol 1095 - - 0.10 0.08 - Cânfora 1135 0.32 - 0.34 - - Borneol 1156 - 0.04 - - -
4-Terpineol 1174 0.61 1.62 0.79 1.37 0.66 α-Terpineol 1181 - 0.46 - - -
Timol metil éter 1230 3.11 0.29 0.11 0.81 1.00 Neral 1241 - - - - -
Geraniol 1252 - 0.07 0.05 24.32 - Geranial 1271 - - - - -
Timol 1289 21.30 0.34 - 0.80 22.02 Carvacrol 1298 49.35 6.47 - 11.40 56.12
Acetato de timol 1342 - - - - 1.03 Acetato de carvacrol 1360 - - - - -
α-Copaeno 1374 - 1.01 1.01 0.41 - β-Bourboneno 1380 - - - - -
β-Elemeno 1389 - 0.43 - 1.19 - α-Cedreno 1410 - 0.70 - - 0.05
(E)- Cariofileno 1417 3.02 10.91 5.25 9.13 4.05 β-Copaeno 1425 0.21 - - - -
α-trans-Bergamoteno 1428 - 0.07 0.20 - -
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IR = índice aritmético calculado.
No óleo essencial extraído das plantas do município de Santa Cruz de Minas
os constituintes predominantes foram carvacrol (49,35%), timol (21,30%), γ-terpineno
(3,17%) e timol-metil-éter (3,11%). No das plantas pertencentes ao município de
Resende Costa os constituintes predominantes foram acetato de (2Z-6E) farnesila
(11,33%), (E)-cariofileno (10,91%), 1,8-cineol (9,84%) e óxido de cariofileno (7,91%).
O acetato de (2Z,2E) farnesila (30,82%), também foi o constituinte majoritário do óleo
essencial das plantas coletadas no município de Ritápolis, seguindo pelo, (2E,6E)-
farnesal (9,85%), óxido de cariofileno (9,01%) e (E)-cariofileno (5,25%), não sendo
observada a presença de timol e carvacrol em sua composição. Já o óleo essencial
das plantas coletadas no município de Madre de Deus de Minas, os constituintes
predominantes foram geraniol (24,32%), carvacrol (11,40%), (E)-cariofileno (9,13%) e
trans-sabineno hidratado (7,52%). Já no óleo das plantas coletadas na Serra do
Lenheiro, município de São João del Rei, observou-se o carvacrol (56,12%) e o timol
(22,02%) como constituintes majoritários, seguidos pelo ρ-cimeno (5,39%) e o cis-
sabineno hidratado (3,21%). Relacionando os resultados encontrados com a literatura,
observou que plantas da mesma espécie, apresentaram alguns constituintes
majoritários diferentes ou compostos com percentual variável. Segundo Hernandes et
al. (2017) plantas coletadas na cidade de Jardinópolis no estado de São Paulo,
apresentaram como principais componentes dos óleos essenciais o carvacrol
α-Humuleno 1447 0.44 2.05 1.82 0.77 0.36 (E)-β-Farneseno 1450 - 1.95 2.96 0.99 -
Alloaromadendreno 1458 - 0.05 - 1.00 0.63 Germacreno D 1496 0.25 2.03 3.67 4.30 0.63 cis-β-Guaieno 1487 0.10 - - 1.01 -
α-Muroleno 1496 0.07 0.63 1.21 0.97 - β-Bisaboleno 1505 - 1.10 0.82 - 0.03
Germacreno A 1508 0.12 1.22 1.92 1.36 0.19 γ-Cadineno 1513 - 0.92 - - -
trans-Calomeneno 1521 - 0.36 - - - cis-Calomeneno 1528 - 0.25 - 0.48 -
(E)-Nerolidol 1561 2.46 2.48 2.52 2.08 - Óxido de cariofileno 1582 0.51 7.91 9.01 3.70 1.25
Veridiflorol 1592 0.93 0.81 - - - Cubenol 1618 - 1.63 5.66 0.66 -
Cariofilla-4(12),8(13)- dien-5α-ol or Cariofilla- 4(12),8(13)-dien-5β-
ol
1639 - 1.99 0.44 0.66 -
14-hidroxi-9-epi-(E)-cariofilleno 1669 - 6.70 - - 0.16 (2Z,6Z)-Farnesol 1695 - 2.21 - - 0.06 (2Z,6E)-Farnesal 1710 - 0.85 5,28 - - (2E,6E)-Farnesal 1738 - 1.72 9.85 1.19 -
Acetato de (2Z,6E) farnesila 1821 - 11.33 30.82 - -
Total 92.02 88.77 88,22 91.20 99.24
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12
(26,28%), ɣ-terpineno (12,01%) e p-cimeno (10,70%). Em outro estudo realizado com
plantas coletadas na região Norte de Minas Gerais foi apresentado como compostos
majoritários o carvacrol (32,70%), p-cimeno (23,00%), timilme-til éter (10,03%),
cariofileno (7,98%) e o ɣ -terpineno (5,40%) (DE ALMEIDA et al., 2016). Sendo assim,
fica evidente uma variação na constituição química do óleo essencial da espécie L.
origanoides de acordo com localidade. Essas modificações na composição podem ser
explicadas tendo em vista as características genéticas, e consequentemente a
existência de diferentes quimiotipos ou pela influência que a produção de metabólitos
secundários sofre com a variação de fatores ambientais, como altitude, temperatura,
tipo de solo, entre outros (GOBBO-NETO et al., 2007).
4.2 Avaliação da atividade inibidora da acetilcolinesterase do óleo essencial de
L. origanoides
Os valores de IC50 foram encontrados a partir da análise das curvas de dose-
resposta (Figuras 5-11). A partir desses dados é possível comparar o potencial que os
diferentes óleos essenciais/compostos apresentam em inibir a mesma enzima. Sendo
que, o composto que apresentar baixo valor de IC50 possui maior potencial de inibição,
enquanto que o composto com valor de IC50 alto possui menor potencial de inibição.
Os dados obtidos nos ensaios demonstraram que os óleos essenciais extraídos das
plantas de L. origanoides, coletadas nas diferentes localidades, apresentaram
atividade de inibição maior que 50% sobre a acetilcolinesterase, nas concentrações
utilizadas. De modo que, o óleo essencial extraído das plantas coletas em Ritápolis
apresentou o maior potencial de inibição (IC50 = 1,81 μg mL-1), seguido do óleo
essencial das plantas de Resende Costa (IC50 = 3,40 μg mL-1), Santa Cruz de Minas
(IC50 = 4,89 μg mL-1), Madre de Deus de Minas (IC50 = 5,73 μg mL-1) e da Serra do
Lenheiro com menor potencial de inibição (IC50 = 7,20 μg mL-1).
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*Equação do Gráfico: Y = 1/(1,051e-2 + 1,622e2X 1,832)
Figura 5. Representação gráfica da curva dose-resposta da atividade anticolinesterase
do óleo essencial extraído das plantas de Santa Cruz de Minas.
*Equação do Gráfico: Y = 1,005e2 – 1,779e4X+ 8,433e5X2
Figura 6. Representação gráfica da curva dose-resposta da atividade anticolinesterase do óleo
essencial extraído das plantas de Resende Costa.
*Equação do Gráfico: Y = 1/(9,992e-3 + 1,834e3X 1,919)
Figura 7. Representação gráfica da curva dose-resposta da atividade anticolinesterase do óleo
essencial extraído das plantas de Ritápolis.
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*Equação do Gráfico: Y = 1/(9,972e-3 + 2,059e3X 2,370)
Figura 8. Representação gráfica da curva dose-resposta da atividade anticolinesterase do óleo
essencial extraído das plantas de Madre de Deus de Minas.
*Equação do Gráfico: Y = 1,011e2 - 2,3099e3X- 5,683e5X2
Figura 9. Representação gráfica da curva dose-resposta da atividade anticolinesterase do óleo
essencial extraído das plantas da Serra do Lenheiro.
*Equação do Gráfico: Y = 1/(9,879e-3 + 1,118X 7,768e-1)
Figura 10. Representação gráfica da curva dose-resposta da atividade anticolinesterase do
padrão de carvacrol.
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*Equação do Gráfico: Y = 1/(9,627e-3 + 1,308X 6,516e-1)
Figura 11. Representação gráfica da curva dose-resposta da atividade anticolinesterase do
padrão de 1,8-cineol.
De acordo com os resultados é possível verificar que todos os óleos essenciais
estudados apresentaram atividades inibitória sobre a acetilcolinesterase. No entanto,
as atividades variaram de acordo com as diferentes composições apresentadas pelos
óleos essenciais. Segundo Rodrigues et al. (2015) o óleo essencial extraído das folhas
de L. origanoides, no município de José de Freitas, Piauí, Brasil, tendo como
constituintes majoritários o timol com 23,89%, seguido do carvacrol com 21,78% e p-
cimeno com 18,87%, mostrou-se ativo no ensaio apresentando o valor de IC50 de
387,5 µg/mL, sendo que, as concentrações utilizadas do óleo essencial foram de 62,5;
125; 250 e 500 µg mL-1. Dessa forma, os resultados demonstram que os óleos
essenciais das plantas de L. origanoides utilizados nesse ensaio, apresentam maior
potencial de inibição sobre acetilcolinesterase comparados com os resultados
descritos na literatura. Sendo que, os óleos com o melhor potencial inibitório, foram
aqueles que possuem maior teor do composto acetato de (2Z,6E) farnesila, ainda não
descrito na literatura como inibidor da enzima acetilcolinesterase.
O carvacrol e o 1,8-cineol também foram avaliados sobre a enzima
acetilcolinesterase, sendo que, seus resultados demonstraram inibição relevante, com
valores de IC50 iguais a 2,30 e 0,57 μg mL-1, respectivamente. De acordo com os
estudos realizados por Jukic et al. (2007), o carvacrol apresentou atividade inibitória
sobre AChE com IC50 de 63 μg/mL, tendo uma atividade 10 vezes mais forte do que o
isômero timol (IC50 740 μg mL-1). Isto propõe, que a posição do grupo hidroxila na sua
estrutura molecular, possuem grande importância para o efeito inibitório da
acetilcolinesterase. Esse fator pode ser observado no óleo essencial das plantas de
Santa Cruz de Minas, que apresentou um melhor potencial inibitório comparado ao
óleo das plantas da Serra do Lenheiro, que possuem em sua composição maior teor
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2017
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do composto timol. O 1,8-cineol também foi relatado na literatura como potente inibidor
da acetilcolinesterase, apresentando um valor IC50 de 5 μg/mL (MIYAZAWA et
al.,1998).
4.3 Determinação do mecanismo de inibição enzimática do carvacrol e do 1,8-
cineol
O mecanismo de inibição foi deduzido graficamente para cada composto
(Figuras 12 e 13). O carvacrol apresentou uma inibição mista onde o inibidor pode se
ligar tanto no sítio ativo da enzima como no complexo enzima-substrato. De forma
que, suas linhas para os valores das concentrações de inibidor se interceptam a
esquerda do eixo 1/Absorvância, ou seja, a medida que a concentração de inibidor
aumenta o Vmáx diminui e o Km aumenta. Em contraste, o 1,8-cineol mostrou uma
inibição competitiva onde o inibidor compete com o substrato pelo sítio ativo da
enzima. Os inibidores competitivos possuem suas linhas para os valores da
concentração do inibidor interceptando no eixo 1/Absorvância, ou seja, a medida que a
concentração de inibidor aumenta o Vmáx permanece constante e o Km aumenta
(VOET et al., 2014).
Um importante parâmetro a ser denominado é a constante de inibição (Ki), ela
define a afinidade com que o inibidor se liga a enzima, de forma que, quanto menor o
valor de Ki, maior é afinidade da enzima pelo inibidor, ou seja, maior é a capacidade
inibitória do composto (HABENSCHUS et al., 2016). Por meio da inclinação da reta
versus concentração de inibidor foi possível calcular os valores Ki para o carvacrol e o
1,8-cineol, sendo eles 0,0271 e 0,2011 mM, respectivamente. Desta forma, o carvacrol
apresentou maior afinidade com a enzima em relação ao 1,8-cineol (Figuras 14 e 15).
De acordo com Movahhedin et al. (2016) o carvacrol e o 1,8- cineol, possuem
capacidade inibitória sobre a acetilcolinesterase. Porém, não foi encontrado na
literatura nenhum relato sobre o mecanismo de inibição desses compostos.
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Figura 12. Cinética de duplo-recíproco para a determinação do Ki e mecanismo de inibição do
carvacrol sobre enzima acetilcolinesterase.
Figura 13. Cinética de duplo-recíproco para a determinação do Ki e mecanismo de inibição do 1,8-cineol sobre enzima acetilcolinesterase.
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18
Figura 14. Inclinação da reta versus concentração do carvacrol.
Figura 15. Inclinação da reta versus concentração do 1,8-cineol.
4.4 Avaliação da atividade antifúgica do óleo essencial de L. origanoides
A atividade antifúngica sobre a Candida albicans foi avaliada por meio do
método de difusão em meio sólido, sendo utilizada as concentrações de 160; 80; 40;
20; 10; 5; 2,5; 1,25 mg mL-1, dos diferentes óleos essenciais (Figura 16).
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Figura 16. Atividade antifúngica dos óleos essenciais de Lippia origanoides Kunth das localidades de (A) Santa Cruz; (B) Ritápolis; (C) Resende Costa; (D) Madre de Deus; (E) Serra
do Lenheiro.
Os resultados da atividade antifúngica das folhas de L. origanoides sobre C.
albicans, foram caracterizados pela formação de halos de inibição do crescimento
microbiano, apresentando diâmetro igual ou superior a 10 mm. Pode se observar, que
os óleos demostraram atividade de inibição sobre cepas, onde o aumento do diâmetro
dos halos ocorreu a medida que a concentração dos óleos essenciais foi aumentando,
tendo o melhor potencial na concentração de 160 mg mL-1 (Figura 17). Para o controle
positivo com fluconazol diluído em água (5 mg mL-1), foram obtidos halos de inibição
entre 10 a 15 mm, enquanto que o DMSO não apresentou efeito inibitório.
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2017
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Figura 17. Atividade antifúngica do óleo essencial de Lippia origanoides Kunth. contra Candida
albicans.
Entre os resultados obtidos, ressaltam-se as capacidades em inibir o
crescimento de C. albicans dos óleos essenciais das plantas coletadas na Serra do
Lenheiro e no município de Santa Cruz de Minas, visto que ambos tiveram o maior
potencial de inibição, apresentando halos de inibição do crescimento das leveduras de
32,5 e 25,6 mm, respectivamente. Seguido do óleo essencial das plantas de Madre de
Deus de Minas com 11,16 mm, Ritápolis com 9,16 mm, Resende Costa 7,83 mm.
Portanto, a atividade do óleo essencial de L. origanoides sobre a C. albicans, podem
estar relacionadas com a presença do carvacrol e do timol na constituição dos óleos
essenciais, uma vez que os óleos que apresentaram melhores atividades foram
aqueles que apresentaram maiores teores destes compostos em suas constituições,
tendo em vista um grande potencial antifúngico já relatados para estes compostos (DE
FREITAS, 2014). Segundo Fontenelle et al. (2007) estudos realizados com o óleo
essencial da espécie L. origanoides, coletadas no Nordeste do Brasil, apresentou um
potencial inibitório significativo sobre a Candida, exibindo halos de inibição do
crescimento variando de 9,8 + 0,9 a 23,3 + 1,8 mm, tendo como constituinte
majoritário do óleo essencial o timol. De acordo com o estudo realizado por Botelho et
al. (2007) as zonas de inibição para C. albicans foram 10,6 e 9 mm para timol e
carvacrol, respectivamente. Sendo assim, pode se observar que os óleos essenciais
extraídos das plantas de L. origanoides, que apresentaram maior teor dos compostos
timol e carvacrol, tiveram o melhor potencial inibitório sobre o fungo estudado.
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2017
21
5. CONCLUSÃO
As amostras dos óleos essenciais da L. origanoides, apresentaram variações
em suas constituições e teores em função das localidades. Destacando-se como
compostos majoritários o carvacrol, acetato de (2Z,2E) farnesila e o geraniol.
Os resultados dos estudos de inibição da acetilcolinesterase permitem concluir
que o óleo essencial de Lippia origanoides Kunth. demonstrou ser promissor quanto à
inibição da acetilcolinesterase, apresentando uma taxa de redução da reação
enzimática maior que 50% (IC50), sendo que o melhor potencial de inibição foi do óleo
essencial rico em acetato de (2Z,2E) farnesila com um IC50 de 1,81 μg mL-1 . A partir
dos dados obtidos foi possível determinar que a inibição da acetilcolinesterase pelo
carvacrol, apresentou um perfil de inibição mista e do 1,8-cineol, apresentou um perfil
de inibição competitiva.
Também pode ser observado que os óleos essenciais de L. origanoides
apresentaram a atividade antifúngica sobre a C. albicans, sendo que, o óleo essencial
obtido das plantas coletadas na Serra do Lenheiro apresentou o melhor potencial de
inibição. Por meio dos resultados pode se concluir que o óleo essencial de L.
origanoides, possui atividade inibitória sobre acetilcolinesterase e sobre o crescimento
de C. albicans variáveis de acordo com suas composições químicas.
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