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UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
PCM
Papel de galectina-3 e WNT na migração de células neoplásicas de mama em culturas
tridimensionais multicelulares que mimetizam o nicho subendosteal
ANA PAULA DANTAS NUNES DE BARROS
Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas
Orientador: Maria Isabel Doria Rossi Roger Chammas LABCAM – Laboratório de Biologia Celular Aplicada a Medicina
Rio de Janeiro
Julho 2011
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Papel de galectina-3 e WNT na migração de células neoplásicas de mama em culturas
tridimensionais multicelulares que mimetizam o nicho subendosteal
ANA PAULA DANTAS NUNES DE BARROS
Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas
Revisada por:
Profa. Christina Takiya, ICB, UFRJ
Avaliada por: Prof. Mauricio Augusto Silva Magalhães Costa, Faculdade de Medicina, UFRJ
Prof. Robson de Queiroz Monteiro, IBqM, UFRJ Profa. Tatiana Lobo Coelho de Sampaio, ICB, UFRJ
Suplentes:
Profa. Christina Takiya, ICB, UFRJ
Profa. Vivian Rumanjnek, IBqM, UFRJ
iii
Barros, Ana Paula Dantas Nunes de. Papel de galectina-3 e WNT na migração de células neoplásicas de mama em culturas tridimensionais multicelulares que mimetizam o nicho subendosteal / Ana Paula Dantas Nunes de Barros. Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Ciências Biomédicas, 2011. xii, 184 p. il. Tese de Doutorado - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, 2011. 1.Cultura Tridimensional 2.Medula Óssea 3.Interações Celulares 4. Nicho subendosteal 5.Câncer de Mama 6.Galectina-3 7.Wnt 8.Tese (Doutorado-UFRJ/ICB)
iv
Aos meus pais que me deram a vida, os sonhos e o amor que existe em mim.
E sempre, a cada dia novo e imprevisível
por vir.
v
“Matar o sonho é matarmo-nos. É mutilar a nossa alma. O sonho é o que temos de realmente nosso, de
impenetravelmente e inexpugnavelmente nosso.”
Fernando Pessoa
vi
Agradecimentos Ø Aos meus pais pelo amor, incentivo, paciência e fé inesgotável em mim. Ø À minha irmã por todo o companheirismo, estímulo e risadas na divulgação
do meu trabalho para os amigos, como se ele fosse salvar o mundo!
Ø Ao Hugo, meu sobrinho, por ser o menino mais doce que existe, sempre me
perguntando sobre a tese enquanto era redigida, sendo sempre meu
primeiro e mais curioso ouvinte. Ø Aos meus amados amigos Leandro, Gabriel, Gabriela, Carla, Milla e
Juliana que me apoiaram ao longo desses anos e sempre me ajudaram a
relaxar de todo o estresse em indispensáveis “dias do duvido”. Ø À Araci e Anneliese que foram muito mais que colegas e orientandas
minhas: foram verdadeiras amigas trabalhando ao meu lado, sem
restrições, e sem as quais esse trabalho não teria sido possível. Ø À Renata, uma amiga sem igual que, independente do tempo e da
distância, sempre se faz presente. Ø Um agradecimento especial à Daniela que esteve ao meu lado durante esse
difícil processo do fechamento da tese e me ajudou muito com as
referências bibliográficas! Ø À Isabel por toda a fé que tem em mim, por toda a paciência, compreensão,
incentivo, apoio, consultoria profissional, puxões de orelha, carinho, lições
de vida e companheirismo, que tanto me ensinou o que é ser uma
profissional e a torna muito mais do que uma orientadora para todos os
seus alunos. Ø Ao Prof. Roger Chammas por todo o apoio ao projeto e a mim. Ø Ao Prof. Radovan que foi fundamental desde os primeiros passos deste
projeto e é uma inspiração para todos nós. Ø Ao Dr. Martin Bonamino por ter aberto prontamente o seu laboratório e me
guiado no mundo da Biologia Molecular. Ø À Prof.Christina Takiya por ter me orientado nos processamentos de
histologia, por ter me recebido com tanta boa vontade em seu laboratório e
pela excelente revisão. Ø A todas as companheiras de bancada: Daiana, Dani, Mariana, Rhayra e a
todo o pessoal do transplante de medula óssea que sempre nos apoiou.
vii
Ø SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................... 01
1.1. O câncer de mama......................................................... 01
1.2. Mecanismos de carcinogênese e progressão Tumoral.. 02
1.3. O microambiente e o câncer de mama.......................... 14
1.4.Galectina-3 no Câncer .................................................... 18
1.5. Via de Sinalização de WNT e seu papel no câncer de
mama.............................................................................................. 27
1.6.Interrelações entre as vias de Galectina-3 e WNT.......... 34
1.7.Células tumorais disseminadas e micrometástase medular
no tumor de mama.......................................................................... 35
1.8. Galectina-3 no microambiente hematopoiético e na
metástase medular......................................................................... 40 1.9. Influência da via de sinalização de WNT no
microambiente hematopoético........................................................ 44
1.10. Microambiente Medular e Células-Tronco.................... 48
1.10.1. Interação entre o microambiente medular e
células tumorais..................................................................... 48
1.10.2. Nicho subendosteal e Células Mesenquimais do
Estroma da Medula Óssea.................................................... 51
1.10.3. Migração na MO............................................... 59
1.11. Modelos in vitro tridimensionais................................... 64
1.12. Esferóides (Multicellular Tumor Spheroids, MCTS)….. 71
viii
2. OBJETIVOS............................................................................... 75
3. METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL.......... 76
4. RESULTADOS .......................................................................... 98
5. DISCUSSÃO ........................................................................... 143
6. CONCLUSÕES ....................................................................... 156
7. BIBLIOGRAFIA....................................................................... 157
8. ANEXOS I................................................................................ 182
9. ANEXOS II............................................................................... 184
ix
RESUMO
Há muitos anos, o câncer de mama é predominante e a principal causa de morte entre as mulheres ocidentais. No Brasil, responde por 22% dos tumores e 49.240 novos casos foram diagnosticados em 2010, com 11.735 mortes. No entanto, mesmo em países desenvolvidos, apesar do diagnóstico precoce, 20-30% das pacientes evoluirão com recidivas e metástases seguidas de morte. A disseminação precoce do tumor de mama, em especial para a medula óssea (MO), tem surgido como um fator prognóstico independente, mesmo após cinco anos da retirada do tumor primário. Desta forma, os mecanismos responsáveis pelo estabelecimento da micrometástase na MO devem ser esclarecidos. A galectina-3 (Gal-3) é uma proteína de 30 KDa, bastante citada em câncer, que possui ação intracelular bloqueando apoptose, estimulando proliferação, podendo se localizar no núcleo com potencial cruzamento com a via de WNT. No meio extracelular, pode formar ligações cruzadas entre elementos da MEC, glicoproteínas e glicolipídeos, presentes na membrana de células, devido a sua propriedade de ligar galactosídeos presentes em epítopos de carboidratos; propriedade esta correlacionada ao fenômeno de metástase. Na MO a Gal-3 é encontrada em grande quantidade e bastante difundida na matriz extracelular, porém, predomina nos ossos e região subendosteal sendo assim um alvo interessante de estudo. Utilizamos nosso modelo in vitro 3D representativo do nicho subendosteal humano de HSC, formado a partir de células-tronco mesenquimais (MSC) de MO humana, induzidas ou não para a linhagem osteogênica. As células induzidas foram cultivadas como agregados esféricos (esferóides) sobre os quais as MSC não induzidas foram distribuídas, formando esferóides mistos com populações segregadas. O padrão de matriz extracelular foi semelhante ao observado in vivo, com colágeno I exclusivamente na região central de pré-osteoblastos. Esse modelo foi testado funcionalmente e reproduziu as propriedades do nicho subendosteal, como migração de células CD34+ com padrão de circulação contínua, localização destas na interface das duas populações estromais e um maior percentual de HSC em quiescência. Estes dados validam o modelo para o estudo do padrão de interação das células tumorais de mama. As linhagens tumorais de mama, com fenótipo descrito para células-tronco de câncer (CD44+CD24-) efetivamente invadiam o modelo de esferóide misto, de forma mais eficiente do que esferóides constituídos por fibroblastos que, por sua vez, apresentavam menor expressão de galectina-3. Ensaios neutralizadores de Gal-3 e modelos nocautes para essa molécula demonstraram que de fato a invasão dependia da presença de galectina-3 no microambiente medular. Quanto às vias de sinalização envolvidas no processo de invasão dos esferóides, não houve correlação entre a expressão intracelular de gal-3 e a ocorrência ou grau de invasão, porém, a ativação da via canônica de Wnt se correlacionou diretamente com a proliferação celular e inversamente com a invasão. Portanto, levantamos a hipótese de que o microambiente medular subendosteal rico em gal-3, junto com o “desligamento” da via de Wnt na célula tumoral de mama, seja fundamental para indução de um estado menos proliferativo e mais invasivo durante o estabelecimento da micrometástase de mama na MO.
x
ABSTRACT Breast cancer is still the most prevalent and the leading cause of death in Western women. In Brazil, it accounts for 22% of tumors and 49,240 new cases were diagnosed in 2010 with 11,735 deaths. However, even in developed countries, despite early diagnosis, 20-30% of patients will develop recurrences and metastasis followed by death. The early dissemination of breast cancer, especially for the bone marrow (BM), has emerged as an independent prognostic factor even after five years of removal from the primary tumor. Thus, the mechanisms responsible for the establishment of micrometastases in BM must be clarified. Galectin-3 is a protein of 30 kDa, closely related to cancer that possess dual action, intracellularly it blocks apoptosis, stimulates proliferation and may be located in the nucleus with potential cross with the WNT pathway, extracellularly it forms cross-links between elements of the ECM, glycoproteins and glycolipids on the membrane of cells, due to its ability to bind galactosides present in carbohydrate epitopes so it’s believed to modulate the phenomenon of metastasis. In the bone marrow is highly present and widespread on the extracellular matrix, but predominates in the subendosteal region and bones so it is an interesting target of study. We used our 3D in vitro model representative of human subendosteal HSC niche, formed from mesenchymal stem cells (MSC) from human BM induced or not toward the osteogenic lineage. The induced cells were cultured as spherical aggregates (spheroids) on which the non-induced-MSC were distributed to form spheroids with segregated mixed populations. The pattern of extracellular matrix was similar to that observed in vivo, with collagen I only in central pre-osteoblasts. This model was tested and reproduced the functional properties of the subendosteal niche, such as migration of CD34 + cells with continuous movement in and out of the spheroids, location at the interface of the two stromal populations and a high percentage of HSC in quiescence was observed. Showing itself to be a valid model for studying the interaction pattern of breast tumor cells in BM. The breast tumor cell lines, with the phenotype described for cancer stem cells (CD44 + CD24-) effectively invaded spheroid mixed model more efficiently than control fibroblasts spheroids, which in turn had a lower expression of galectin- 3. Neutralizing tests for Gal-3 and knockouts models showed that in fact the invasion was dependent on the presence of galectin-3 in the BM microenvironment. As for the signaling pathways involved in the invasion of spheroids, there was no correlation between the expression of intracellular galectin-3 and the occurrence or degree of invasion, but the activation of the canonical Wnt pathway is directly correlated with cell proliferation and inversely correlated with invasion. Therefore, we hypothesized that the BM subendosteal microenvironment rich in galectin-3, along with the "shutdown" of the Wnt pathway in breast tumor cells, is essential to induce a less proliferative and more invasive state during the establishment of breast micrometastases in BM.
xi
Lista de Abreviaturas 2D Bidimensional
3D Tridimensional
5-FU Fluorouracil
AGM/PAE Aorta-Gonada-Mesonefrons/Para-Aorta-Esplancnopleura
Ang-1 Angiopoietina-1
BMP-4 Bone Morphogenetic Protein-4
BSA Éster albumina sérica bovina
BSS Balanced Saline Solution
BSS.CMF Balanced Saline Solution. Calcium and Magnesium Free
CFSE 5-(e 6-)-carboxifluoresceína diacetato succinil
CFU-e Colony Forming Unit-Erithrocyte
CFU-F Colony Forming Unit-Fibroblast
CFU-GM Colony Forming Unit-Granulocyte Macrophage
CFU-S Colony Forming Unit-Spleen
CM-DiI Cell TrackerTM Chloromethylbenzamido
CRD Domínio de reconhecimento de carboidrato
CRD* Domínio rico em cisteína
CSC Célula-tronco do câncer
DKK Dickkopf
EMT Transição Epitélio-Mesenquimal
ER Receptor de Estrogênio
FACs Fluorescence Activated Cell Sorter
FAKs Focal Adhesion Kinasis
FGF-4 Fibroblast Growth Factor-4
FITC Fluorescein Isothiocyanate
Fzd Frizzled
GAGs Glicosaminoglicanos
Gal-3 Galectina-3
HA/TCP Hidroxiapatita / tricálcio fosfato
HER-2 Epidermal Growth Factor receptor type 2
HSC Célula Tronco Hematopoética
xii
Ig Imunoglobulina
LEF Lymphocyte enhancer factor
LRP Lipoproteína de baixa densidade
LT-HSC Long Term-Hematopoietic Stem Cell
MCTS Multicellular Tumor Spheroids
MEC Matriz Extracelular MMPs Metaloproteinases
MO Medula Óssea
MSC Célula Tronco Mesenquimal
NCI National Cancer Institute
NOD/SCID Non-Obese Diabetes Severe Combined Immunodeficient mice
OMS/WHO Organização Mundial de Saúde/World Health Organization
OP Osteopontina
PBS Phosphate Buffered Solution
PE Phyco-Eritryn
PR Receptor de Progesterona
PTx Toxina Pertussis
RSV Rous Sarcoma Virus
Sca-1 Stem Cell Antigen-1
SCF Stem Cell Factor
SDF-1 Stromal Derived Factor-1
SFB Soro Fetal Bovino
Shh Sonic Hedgehog
SLAM Signaling Lymphocyte Activation Molecule
ST-HSC Short Term-Hematopoietic Stem Cell
TCF T cell factor
Tdlu Unidade ducto-lobular terminal
Tis Carcinoma in situ
UICC União Internacional Contra o Câncer
VCAM Vascular Cell Adhesion Molecule
VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1
VLA Very Late Antigen
INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer de Mama
O câncer de mama é predominante e a principal causa de morte entre as
mulheres ocidentais há muitos anos. No Brasil, responde por 22% dos tumores
e 49.240 novos casos foram diagnosticados em 2010, com 11.735 mortes
(INCA, 2010). O número elevado de óbitos no Brasil deve-se provavelmente ao
diagnóstico tardio. No entanto, mesmo em países desenvolvidos, apesar do
diagnóstico precoce, 20-30% das pacientes evoluirão com recidivas e
metástases seguidas de morte (Engel et al., 2003).
O estadiamento do câncer de mama é baseado na classificação clínica
TNM proposta pela União Internacional Contra o Câncer (UICC) e pela
Organização Mundial de Saúde (OMS). A classificação TNM reúne informações
sobre o tumor primário como tamanho do tumor, presença de microinvasões,
ulcerações e infiltrado inflamatório (T), presença de metástase em linfonodos
regionais (N) e à distância (M) (cancer, 2003) (Tab.1). No caso dos tumores de
mama, é importante a classificação histopatológica com avaliação de
receptores de estrogênio (ER), de progesterona (PR) e do receptor 2 de fator
de crescimento epidérmico (HER-2, epidermal growth factor receptor type 2)
(Scarff, Bloon, Richardson modificado por Elston-Ellis, 1998 em (cancer, 2003).
Esta classificação direciona a estratégia terapêutica loco-regional (cirurgia e
radioterapia) ou sistêmicas (hormonioterapia e quimioterapia), associadas a
terapias adjuvantes, como homonioterapia para pacientes com tumores que
expressam ER e/ou PR. Digno de nota, as pacientes que apresentam tumores
denominados triplo negativos (ER- PR- e HER-2-) tem sido descritas como
apresentando pior prognóstico com menos opções de tratamento (Gluz et al.,
INTRODUÇÃO
2
2009). No entanto, como ressaltado acima, independentemente do estágio e da
estratégica terapêutica, em torno de 20% das pacientes evoluirão com
recidivas e metástases (Engel et al., 2003).
Tabela 1. Estadiamento clínico no câncer de mama. *Tis=Carcinoma in situ:
Estadiamento
Estágio 0 Tis* N0 M0
Estágio I T1 N0 M0
Estágio IIA T0 N1 M0
T1 N1 M0
T2 N0 M0
Estágio IIB T2 N1 M0
T3 N0 M0
Estágio IIIA T0 N2 M0
T1 N2 M0
T2 N2 M0
T3 N1,N2 M0
Estágio IIIB T4 N0,N1,N2 M0
Estágio IIIC Qlqr** T N3 M0
Estágio IV Qlqr**T Qlq N M1
**Qlqr = qualquer. Adaptado de (cancer, 2003)
1.2. Mecanismos de Carcinogênese e Progressão Tumoral
Em geral, o câncer de mama se origina das células epiteliais da unidade
ducto-lobular terminal da mama (TDLU), mas não existe nenhuma alteração
genética ou funcional comum a todos os cânceres de mama. A maioria das
alterações ocorre em subconjuntos de carcinomas e em geral em combinações
variáveis com outras alterações (cancer, 2003). Essas alterações genéticas são
originadas aos poucos em um processo ―passo a passo‖, no qual a primeira
mutação proporciona um ganho de função, por exemplo, resistência a apoptose
e, conseqüentemente, o fenômeno de instabilidade genética; que, por sua vez,
INTRODUÇÃO
3
gera o acúmulo de mutações e a evolução do câncer (Nowell, 1976). O modelo
clássico de carcinogênese diz que para uma célula se tornar cancerosa deve
adquirir seis propriedades: auto-suficiência de sinais de crescimento, evasão
de sinais inibitórios de crescimento, resistência a apoptose, potencial replicativo
ilimitado, estimulo a angiogênese e transição epitélio mesenquimal (EMT,
Epithelial-Mesenchymal Transition) (Hanahan & Weinberg, 2000) (Fig.1).
Recentemente esse modelo foi atualizado com acréscimo de duas novas
propriedades: metabolismo energético e evasão do sistema imune (Hanahan &
Weinberg).
Figura 1. Via carcinogênica clássica. A partir de uma mutação inicial e o processo
de instabilidade genética, as seis propriedades do câncer se originam: auto-suficiência de sinais de crescimento, evasão de sinais inibitórios de crescimento, resistência a apoptose, potencial replicativo ilimitado, estímulo a angiogênese e transição epitélio mesenquimal (EMT). Modificado de (Hanahan & Weinberg, 2000).
INTRODUÇÃO
4
Além de mudanças no código genético da célula, alterações
epigenéticas também têm sido responsabilizadas pelo processo de
carcinogênese e evolução da doença, uma vez que modificações do padrão de
metilação do DNA, de distribuição das histonas e remodelamento nucleossomal
podem ser transmitidos para as gerações celulares seguintes (Jones & Baylin,
2007; Jovanovic et al., 2010). Por exemplo, a maioria dos cânceres de mama é
inicialmente positivo para ER, sendo o seu crescimento estimulado por
estrógenos e inibido por anti-estrógenos. A perda de expressão do ER tem sido
correlacionada com pior prognóstico, pois as células se tornam auto-
suficientes, não precisando mais de sinalização. Esta perda do ER se dá via
hipermetilação do DNA das células tumorais, particularmente das regiões
promotoras, ESR1 e PGR (Ramos et al., 2010). Estudos com células primárias
ER- cujas vias de metilação foram bloqueadas levaram a reaquisição da
expressão de ER (Ferguson et al., 1995). Outro exemplo da importância de
alterações epigenéticas no câncer de mama foi demonstrado em linhagem
celular MCF7, onde a hipometilação de genes correlacionados com resistência
a drogas como ABCB1, GSTP1, Upa e MGMT levou à resistência a
Doxorubicina (Chekhun et al., 2006). Alterações similares foram observadas
em sublinhagens de MCF7 resistentes a Tamoxifen e Fulvestran (Fan et al.,
2006). Análise de amostras de pacientes comparando o estado de metilação do
DNA em promotores GSTP1, FOXC1 e ABCB1 e a sobrevivência destes,
mostrou que a metilação dos promotores correspondia a uma maior sobrevida
dos pacientes, e esse tipo de análise tem sido considerada como fator
prognóstico independente (Dejeux et al., 2010).
INTRODUÇÃO
5
A idéia de que a progressão tumoral é fruto da instabilidade genética foi
recentemente desafiada por um novo modelo. Esse modelo propõe que a
progressão do câncer e seu crescimento são dependentes de uma população
tumoral minoritária, a célula-tronco do câncer (Bonnet & Dick, 1997; Reya et al.,
2001). O modelo não implica que a célula-tronco do câncer deve ser derivada
da célula-tronco tecidual, mas sugere que tumores são organizados
hierarquicamente como tecidos normais com as células-tronco tumorais
sofrendo mudanças epigenéticas que originariam células tumorais mais
diferenciadas com capacidade limitada de proliferação (Dick, 2008; Reya et al.,
2001; Shackleton et al., 2009) (Fig.2).
Figura 2. Modelo esquemático da formação de tumores pela teoria da célula-tronco do câncer (CSC). A massa tumoral é heterogênea e apenas a célula-tronco
do câncer seria capaz de proliferar vastamente e gerar novos tumores (Reya et al., 2001).
INTRODUÇÃO
6
Dados com células leucêmicas mostram bem claramente em ensaios in
vivo uma população pós-mitótica derivada das células tumorais (Lapidot et al.,
1994) e revelam que apenas uma minoria das células do tumor são capazes de
gerar um novo tumor, apoiando assim o modelo da célula-tronco do câncer
(Reya et al., 2001). A esperança de encontrar um alvo tão específico levou
diversos grupos a buscarem a célula-tronco em diversos tipos de cânceres
(Abdul Khalek, Gallicano & Mishra, 2010; Singh et al., 2003; Wang & Shen,
2010; Zhang et al., 2011a). A hipótese da CSC proveu um mecanismo celular
muito atraente, pois explicava fenômenos de baixa resposta a tratamento e
comportamento de dormência exibido por diversos tipos tumorais quando
tratados (Fig.3). Por exemplo, em câncer de mama foi demonstrada a
resistência dessas células a radioterapia (Phillips, McBride & Pajonk, 2006).
Figura 3. Modelo esquemático da resposta de tumor à quimioterapia se baseando no modelo da célula-tronco do câncer. Fármacos que teriam como alvo
a massa tumoral pareceriam ter efeito positivo inicialmente com a diminuição desta, porém a CSC permaneceria e originaria um novo tumor. Por outro lado, drogas ou terapias que tivessem como alvo a CSC dariam conta da base do tumor e este seria naturalmente desfeito devido a perda da capacidade de se manter (Reya et al., 2001).
INTRODUÇÃO
7
A célula-tronco do câncer de mama foi descrita como a subpopulação
CD44HiCD24-/Lo que era capaz de dar origem a novos tumores em
camundongos imunodeficientes NOD/SCID, tumores esses heterogêneos que
continham a população CD44-/LoCD24Hi não tumorigênica (Al-Hajj et al., 2003).
As populações CD24+/CD44- e CD44+/CD24- apresentam assinaturas
genéticas distintas sugerindo que representam populações celulares definidas,
sendo a população CD24+ mais diferenciada, enquanto a população CD44+
apresenta um fenótipo progenitor (Shipitsin et al., 2007). A expressão
heterogênea de CD24 e CD44 entre e dentro de tumores tem sido descrita
como uma conseqüência dos processos de auto-renovação, proliferação,
diferenciação e morte (Honeth et al., 2008).
A identificação das células-tronco tumorais se baseia no surgimento de
tumor após injeção de subpopulação específica de células tumorais em animal
imunodeficiente. Porém, dados recentes vêm demonstrando que o
desenvolvimento tumoral é dependente do modelo de animal imunodeficiente,
o quão imunocomprometido ele é, e do meio utilizado na injeção das células-
tronco tumorais, levantando assim a questão da influência do microambiente e
de mecanismos epigenéticos na determinação do comportamento tumoral
(Bissell & Inman, 2008; Bissell et al., 2002; Jaenisch & Bird, 2003; Jones &
Baylin, 2007; Quintana et al., 2008). Recentemente, foi demonstrado que a
indução de EMT em linhagem de célula tumoral de câncer de mama resultou
na aquisição do fenótipo de célula-tronco, CD44+CD24-. A EMT é um processo
no qual uma célula epitelial perde sua polaridade, ganha expressão de
proteínas de fenótipo mesenquimal, perde expressão de caderinas desaderindo
da matriz e remodela seu citoesqueleto, migrando e sendo responsável, desta
INTRODUÇÃO
8
forma, pela invasão local e metástases em sítios distantes (Fig.4) (Blick et al.,
2010; Mani et al., 2008; Micalizzi, Farabaugh & Ford, 2010).
INTRODUÇÃO
9
Fig
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4.
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10
).
INTRODUÇÃO
10
Linhagens celulares tumorais não representam os tumores clínicos, pois
são, de forma geral, derivadas de células que sobreviveram as pressões
seletivas geradas in vitro e foram extensamente expandidas. No entanto, a
associação entre as assinaturas transcricionais dos diferentes subtipos de
tumor de mama e as diversas linhagens celulares que poderiam ser
representativas destes subtipos têm chamado atenção (Blick et al., 2010; Blick
et al., 2008; Neve et al., 2006) . Em torno de 70 diferentes linhagens de tumor
de mama foram estudadas e identificadas como subtipo Luminal, Basal A ou
Basal B, este também denominado de mesenquimal devido a sua morfologia e
padrão de expressão gênica semelhante a de células-tronco. A classificação
considera o fenótipo (expressão de moléculas de superfície e/ou de diferentes
queratinas), a expressão gênica e características funcionais (como potencial
invasivo), demonstrando que há correlação entre as linhagens e os tumores
primários, e que o padrão de aberrações genômicas é similar as das linhagens
estudadas; que, por sua vez, se agrupam por análises de transcriptoma,
expressão protéica e comportamento biológico (Neve et al., 2006; Perou et al.,
2000). Esta classificação pode ser bastante aplicada futuramente na escolha
terapêutica, uma vez que diferentes subtipos tem diferentes respostas a
drogas. Por exemplo, Basal B responde melhor a agentes de dano ao DNA do
que tumores luminais, podendo ter esse efeito potencializado especificamente
pelo tratamento com outras drogas como dasatinib (inibidor de Src)
(Kurebayashi et al., 2010) .
Utilizando linhagens de câncer de mama, observou-se que a indução de
EMT resultou na aquisição de propriedades descritas para as CSC de mama,
como capacidade de produzir mamosferas e tumores de forma eficiente, além
INTRODUÇÃO
11
do fenótipo CD24-/LoCD44+, concordando assim com os resultados obtidos do
subtipo basal B (Mani et al., 2008; Morel et al., 2008). Portanto, é possível que
as CSC descritas no tumor de mama sejam na verdade resultado do fenômeno
de EMT, que também envolve além do escape do tumor primário, resistência a
quimioterapia, subtipo basal, fuga do sistema imune e resistência à
senescência (Fig. 5) (Micalizzi et al., 2010).
Figura 5. Consequências funcionais da EMT. Além do seu papel como responsável pela invasão local das células tumorais e metástases, atualmente tem se correlacionado o fenômeno de EMT também a fenótipo iniciador de tumor, resistência a quimioterapia, subtipo basal, fuga do sistema imune e resistencia a senescencia (Micalizzi et al., 2010).
INTRODUÇÃO
12
A interconvenção entre os fenótipos CD24-/LoCD44+ e CD24+CD44-/Lo
tem sido demonstrada in vitro e in vivo (Creighton, Chang & Rosen, 2010;
Croker & Allan, 2008; Kaipparettu et al., 2008; Meyer et al., 2009), levantando
questionamentos sobre o processo biológico envolvido e a importânica deste
fenótipo na classificação dos tipos de tumor, já que a expressão de CD24 é
associada aos tipos luminais mais diferenciados, e a de CD44 aos tipos basais
mais agressivos (Balic et al., 2006; Blick et al., 2010; Hwang-Verslues et al.,
2009).
Naturalmente buscou-se uma correlação entre a expressão de CD44 e
pior prognóstico, mas curiosamente mesmo correlações inversas já foram
encontradas sendo a expressão de CD44 relacionada à sobrevivência dos
pacientes (Gotte & Yip, 2006). De fato, sabe-se da complexidade da molécula
de CD44, pois ela sofre splicing alternativo originando uma série de isoformas
que podem ter efeitos diferentes. Por exemplo, CD44v6 tem sido relacionada
com mal prognóstico enquanto CD44v7-8 tem sido correlacionada com bom
prognóstico, mas não há informação sobre quais papeis as demais isoformas
desempenham na progressão do câncer (Kaufmann et al., 1995; Sleeman &
Cremers, 2007; Watanabe et al., 2005).
Outra possivel explicação para as divergências de resultados é uma
certa flexibilidade do fenótipo das CSC, uma vez que, como esclarecido acima,
a conversão de fenótipos já foi demonstrada (Meyer et al., 2009) e estudos
com células progenitoras não transformadas mostraram que estas podem se
reverter para células-tronco pela modulação de vias de sinalização, um
processo chamado de desdiferenciação (Brawley & Matunis, 2004; Sheng &
Matunis, 2009). Esse tipo de observação abre espaço para diversas hipóteses,
INTRODUÇÃO
13
inclusive da modulação do fenótipo da célula tumoral dependendo do
microambiente. Ou seja, é possível que a população denominada de CSC não
seja necessariamente responsável pela disseminação dos tumores, mas que
populações não-CSC possam originar metástases e ganhar propriedades de
CSC no sítio secundário (Sleeman & Cremers, 2007).
De fato, há heterogeneidade em todos os tipos tumorais, sejam eles
experimentais ou espontâneos, causados por fatores químicos, físicos ou
agentes virais (Heppner, 1984). Populações celulares com diferentes graus de
mutação ocorridas em diferentes ―momentos evolutivos‖ coexistem (Hanahan &
Weinberg, 2000) e análises de ploidia de DNA de amostras obtidas de
pacientes de câncer de mama mostraram que dois terços dos tumores
primários apresentam múltiplas aneuploidias (Cornelisse et al., 1987). E
exatamente essa heterogeneidade faz do câncer uma doença complexa.
Neste sentido, estudo com biopsias de pacientes com câncer de mama
comparando a presença de CD44 e CD24 com o estado chamado de triplo-
negativo (ER- PR- e HERB2-), um forte indicativo de pior prognóstico, mostrou
que células CD44+ estavam mais presentes nestes tumores (Giatromanolaki et
al., 2010). Por outro lado, estudos de tumores primários com análise de
prevalência de células CD44+/CD24- não encontraram correlação com
prognóstico da doença, mas sim com metástase em sítios distantes,
principalmente metástase óssea (Abraham et al., 2005). Além disso, um grupo
canadense ao comparar subpopulações selecionadas, através de Cell Sorter,
levando em conta a expressão de aldeído desidrogenase (ALDH), enzima
relacionada com proteção de células-tronco, mostrou uma correlação entre a
expressão desta enzima e de CD44 com o fenótipo maligno. Os pesquisadores
INTRODUÇÃO
14
mostraram que as células com fenótipo ALDHhiCD44+CD24- ou
ALDHhiCD44+CD133+ apresentavam, em relação a população ALDHlowCD44-,
maior taxa de proliferação, invasão, migração, adesão, formação de colônia e,
quando injetadas em camundongos imunodeficientes, se mostraram mais
tumorigênicas e metastáticas (Croker et al., 2009; Ginestier et al., 2007). Logo,
existe uma importância inegável desta população que continua sendo alvo de
novos estudos e pode se tornar futuramente um alvo terapêutico, independente
do seu modelo de origem (Bauerschmitz et al., 2008).
1.3. O microambiente e o câncer de mama
Apesar de tantos avanços no entendimento de mecanismos de
progressão tumoral, é claro que teorias de gene único ou de aquisição de
mutações seriais subestimam a natureza das mudanças genéticas e
epigenéticas nos tumores, não explicando diversos fenômenos como, por
exemplo, o fato de que muitos genes de suscetibilidade a câncer apresentam
um enorme grau de especificidade tecidual, como BRCA1 e APC, entre outros
(Bissell et al., 2002). Exemplos como o de ferimentos cutâneos criando um
microambiente condutivo para a tumorigenese induzida pelo vírus do sarcoma
de Rous (RSV, Rous Sarcoma Virus) (Sieweke & Bissell, 1994) e a correlação,
em humanos, entre inflamação crônica e risco de desenvolvimento de câncer
(Lu, Ouyang & Huang, 2006), reforçam a idéia de que o contexto celular e
tecidual confere informação fundamental para o desenvolvimento do câncer
(Bissell et al., 2002; Orimo & Weinberg, 2006; Pukrop et al., 2006).
A glândula mamária normal apresenta células epiteliais luminais e basais
organizadas em ácinos, com um lúmen central, sobre uma membrana basal
INTRODUÇÃO
15
definida. Ao redor desses ácinos encontram-se células mioepiteliais e uma
vasta rede de matriz extracelular (MEC) própria na qual estão presentes
macrófagos não ativados (teciduais), adipócitos e fibroblastos (Fig. 6a).
Acompanhando a transformação neoplásica, há uma mudança na composição
da MEC, a membrana basal se desfaz, assim como a organização ácinar,
perde-se a polaridade, há surgimento de miofibroblastos e aumento do número
de macrófagos ativados (Fig. 6b-d). Um grande exemplo de alterações na MEC
é a perda de laminina 1, tendo sido descrito que no câncer de mama as células
mioepiteliais, mesmo quando presentes, deixam de secretar esse elemento de
matriz, que é responsável por estabelecer a polaridade das células epiteliais e
organizar os ácinos, assim como a tridimensionalidade (Gudjonsson et al.,
2002). Estudo com linhagem celular antes (células S1) e depois da sua
transformação (células T4-2) detectou que parte da transformação incluía a
superexpressão de 1-integrina. Curiosamente, quando esse receptor era
bloqueado as células tumorais readquiriram fenótipo normal em cultura 3D e in
vivo. É importante ressaltar que as células não mais se organizavam ou se
comportavam como células tumorais em detrimento do seu genoma, que era e
permaneceu mutado (Weaver et al., 1997). Outras linhagens foram testadas,
muitas agressivas, metastáticas, apresentando uma grande variedade de
mutações e deleções com o objetivo de verificar se o fenômeno de reversão de
malignidade também ocorreria. De fato, a reversão ou apoptose ocorreu,
mostrando que o fenômeno não é específico de uma linhagem (Wang et al.,
2002).
Nesse contexto, diversas populações do estroma tumoral parecem
contribuir para a progressão, como macrófagos (Chen et al., 2011) e adipócitos
INTRODUÇÃO
16
(Dirat et al., 2011). Dentre estas populações celulares, notou-se que
miofibroblastos estão presentes no microambiente de carcinomas invasivos
(Ronnov-Jessen, Petersen & Bissell, 1996). Acreditava-se que esses
miofibroblastos se originavam dos fibroblastos intersticiais e perivasculares.
Porém, recentemente, observou-se que células do estroma da MO contribuem
para esse estroma reativo, também chamado de fibroblastos associados ao
câncer (CAF, cancer associated fibroblasts) (Karnoub et al., 2007; Mori et al.,
2005). O papel das CAFs no câncer de mama parece ser o de indução da
progressão da doença por diversas vias, como estímulo a invasão,
angiogênese e proliferação (Dimanche-Boitrel et al., 1994; Fabris et al., 2010;
Fukumura et al., 1998; Mi et al., 2011; Tyan et al., 2011; Zhang et al., 2011b).
Mecanismos diversos têm sido descritos pelos quais as CAFs modulam as
células tumorais, como a secreção de HGF e RANTES (CCL5), esta
relacionada com metástase, invasividade e proliferação, e aquela com
tumorigênese (Karnoub et al., 2007; Tyan et al., 2011; Zhang et al., 2009).
Deve ser acrescentado que a sensibilidade a quimioterápicos também é
modificada pelo microambiente, o que será discutido adiante, destacando-se a
organização tridimensional da célula e de suas interações célula-célula e
célula-MEC (Weaver, 2002; Weigelt et al., 2010).
Tendo em vista o grau de complexidade que o microambiente insere no
modelo de câncer e sua importância na integridade funcional do tecido,
postula-se que exatamente esta perda da integridade da estrutura tecidual e da
polaridade celular é que seria permissiva a manifestação do fenótipo maligno
(Bissell et al., 2002; Ronnov-Jessen & Bissell, 2009). Conseqüentemente, tem-
INTRODUÇÃO
17
se considerado o microambiente como grande alvo para terapias no câncer
(Micke & Ostman, 2005; Ronnov-Jessen & Bissell, 2009).
Figura 6. Desenvolvimento do câncer de mama levando em conta os elementos do microambiente. (Ronnov-Jessen & Bissell, 2009)
INTRODUÇÃO
18
1.4. Galectina-3 no câncer
A Galectina-3 (Gal-3) ou, como previamente conhecida, Mac-2, L-29,
CBP35, CBP-30 ou eBP, pertence a uma família de lectinas que é vastamente
expressa no reino animal (Toscano et al., 2007) e que está envolvida em
processos de diferenciação, morfogênese, apoptose, adesão, invasão,
angiogênese, metástase e regulação da proliferação celular (Le Marer, 2000;
Liu & Rabinovich, 2005).
Dentre os mamíferos, 15 diferentes galectinas já foram identificadas e há
indícios de que várias isoformas existam, o que aumenta a variedade de
galectinas expressas. A Gal-3 é uma proteina de 30KDa composta de três
domínios estruturais definidos: (a) curta região N terminal de 12 aminoácidos,
que determina a formação de dímeros ou oligômeros maiores e o alvo celular;
(b) uma sequência repetitiva similar a colágeno, rica em glicina, tirosina e
prolina, que é substrato para Metaloproteinases (MMP); e (c) região C terminal
de estrutura globular que apresenta domínio conservado de aproximadamente
130 aminoácidos de reconhecimento de carboidratos (CRD) (Balan et al., 2010;
Barondes et al., 1994; John et al., 2003). A Gal-3 é vastamente expressa por
células mielóides e epiteliais, e liga-se a β-galactosídeos, reconhecendo,
portanto, laminina e fibronectina, inibindo in vitro a adesão celular (Sato,
Burdett & Hughes, 1993; Sato & Hughes, 1992).
O papel biológico de Gal-3 é definido pela sua localização em
compartimentos intracelulares ou como parte do microambiente. Portanto, ora
tem função como mediador intracelular, ora como sinal extracelular (Dumic,
Dabelic & Flogel, 2006).
INTRODUÇÃO
19
No microambiente, galectinas formam ligações cruzadas entre
elementos da MEC, glicoproteínas e glicolipídeos existentes na membrana de
células vizinhas, devido a sua propriedade de ligar galactosídeos presentes em
epítopos de carboidratos (Fig.7). Elas levam, assim, a formação de redes entre
diferentes células e a MEC (Ozeki et al., 1995). No entanto, a secreção de
galectina ocorre por via não-clássica, uma vez que sua cadeia peptídica não
possui sequência de inserção no retículo endoplasmático. O mecanismo exato
não está elucidado, porém existem evidências que sugerem que a galectina é
secretada por diferentes vias, dependendo da sua estrutura, do tipo e da
polaridade celular (Hughes, 1999).
Em vertebrados, galectinas podem ser encontradas também no
citoplasma e no núcleo, com múltiplas funções em processos fisiológicos e
patológicos (Fig.8) (Dumic et al., 2006; Satelli et al., 2008). O seu transporte
para o núcleo pode se dar por difusão passiva ou transporte ativo,
apresentando dois domínios independentes responsáveis por este transporte
(Nakahara et al., 2006). No núcleo, Gal-3 pode se associar a complexos
ribonucleoproteicos, que funcionam como fatores de splicing do pré-mRNA
(Dagher, Wang & Patterson, 1995). No entanto, ainda existem conflitos quanto
ao domínio de ligação de Gal-3. Trabalhos mais antigos afirmam que a ligação
à fita única de DNA e RNA era independente de lactose (Wang et al., 1995),
indicando que não era via CRD. Dados mais recentes sugerem uma interação
indireta, via Gemin4, entre Gal-3 e pré-mRNA (Park et al., 2001). Foi
demonstrada também a ligação, no núcleo, de Gal-3 a β-catenina, uma
proteína mediadora da via canônica de WNT (Shimura et al., 2004), que será
abordada à frente. Curiosamente, a maior parte das interações intracelulares
INTRODUÇÃO
20
realizadas por Gal-3 são relações proteína-proteína, enquanto que no meio
extracelular as interações são com carboidratos, via seu domínio CRD (Liu &
Rabinovich, 2005).
Figura 7. Funções extracelulares de galectina-3. Setas vermelhas indicam ativação.
AGE— Produto avançado de glicosilação, C4.4A—glicoproteína ancorada a GPI, CEA—Antígeno Carcino-embrionário, CRD—Domínio de reconhecimento de carboidrato, EGFR—Receptor de EGF, FcεR—Rceptor de Fcε, Gal-3—galectina-3, L1—molécula de adesão neural L1, Lamp 1/2—Proteína lisossomal associada a membrana 1/2, LPS—Lipopolisacarídeo, Mac-2BP—proteína ligadora de Mac-2, MAG—Glicoproteína associada a mielina, N-CAM—Molécula de adesão celular neural, NCA-160—Antígeno de reação cruzada não-específican 160, ND—Domínio N terminal, NG2—Proteoglicano transmembrana condroitin sulfato NG2, TβR—Receptor de TGF β, TCR—rceceptor de célula T (Dumic et al., 2006).
INTRODUÇÃO
21
Figura 8. Funções intracelulares da galectina-3. Setas vermelhas indicam ativação. Linhas azuis indicam bloqueio. AKT- Serina/Treonina cinase. ASK-1 – Cinase reguladora de apoptose 1, CBP70-Proteína ligadora de carboidrato 70, Chrp-Proteína rica em cisteína e histidina, CREB – Proteína ligadora de elemento responsivo a cAMP, ERK-Cinase regulada por sinais extracelular, Gal-3-galectina-3, GTP- guanosina trifosfato, JNK-cinase N-terminal c-Jun, MEK- cinase ERK ativada por mitógenos, P-fosfato, PI3K-Fosfatidil inositol 3 cinase, Raf-1- Serina/Treonina cinase, TCF4- Fator de célula T 4, TF- fator de transcrição (Dumic et al., 2006).
O papel da Gal-3 no câncer, quer como mediador interno, quer como
integrante do microambiente, tem sido estudado em diversos modelos onde
parece envolvida no potencial tumorigênico, na metástase, na proliferação e na
resistência a morte celular.
Como mediador interno, foram traçadas correlações entre o potencial
metastático de diversas linhagens tumorais e o aumento na expressão de Gal-
3, possivelmente devido ao seu envolvimento com motilidade celular (Raz et
al., 1990). Foi demonstrado, por exemplo, que a superexpressão de Gal-3 nas
linhagens tumorais de mama, Evsa-T e BT549, gera aumento da adesão à
INTRODUÇÃO
22
laminina, fibronectina e vitronectina, com remodelamento do citoesqueleto e
consequente migração, além do aumento de sobrevivência frente a estímulos
apoptóticos, como radiação, ou morte celular induzida por perda de adesão
(anoikis) (Cheong, Shin & Chun, 2009; Kim et al., 1999; Matarrese et al.,
2000a). Outro exemplo que pode ser citado ocorre em câncer pancreático. O
silenciamento de Gal-3 em diversas linhagens provocou redução de migração
em ensaio transwell e invasão em matrigel, via redução na expressão de β-
catenina e MMP2 (Kobayashi et al., 2011). Quanto à modulação de
sobrevivência celular, do mesmo modo acredita-se que há contribuição da
translocação, seja do citosol ou do núcleo, para as mitocôndrias quando ocorre
o estímulo apoptótico. Nas mitocôndrias, Gal-3 agiria bloqueando mudanças do
potencial de membrana, evitando, desta forma, a apoptose (Matarrese et al.,
2000b). A saída do núcleo envolve fosforilação de Gal-3, que se insere na
membrana mitocondrial e regula MAPK, uma enzima reguladora de apoptose
(Liu & Rabinovich, 2005; Takenaka et al., 2004). Já em proliferação celular, foi
demonstrado em células epiteliais de mama o seu controle pela translocação
de Gal-3 para o núcleo, via interação direta desta com o promotor de ciclina D1
(Lin et al., 2002).
A fosforilação de Gal-3 também foi correlacionada com malignidade.
Utilizando linhagem nocaute para Gal-3, demonstrou-se que a inserção do
gene selvagem de Gal-3 tornava as células capazes de originar tumores em
camundongos NUDE, porém, a inserção de Gal-3 mutante, sem o sítio de
fosforilação, era ineficaz. Os genes modulados pela Gal-3 selvagem, e não
pela mutante, incluíam os envolvidos no estresse oxidativo, na via de apoptose
independente de caspase, no ciclo celular, no remodelamento do citoesqueleto,
INTRODUÇÃO
23
na adesão e na invasão tumoral (Mazurek et al., 2005). Recentemente, foi
demonstrado que Gal-3 pode ser fosforilada em resíduos tirosina, indicando
que ela pode ser enquadrada como um novo membro de proteínas
sinalizadoras do tipo tirosina cinase, e, portanto, pode ter papel nos
mecanismos de sobrevivência celular (Balan et al., 2010).
Desta forma, Gal-3 intracelular parece ter papel importante na
manutenção do fenótipo maligno. A supressão da expressão de Gal-3 na
linhagem tumoral MDA435 levou a reversão do fenótipo transformado, com
aquisição de inibição de crescimento por contato, perda da capacidade de
crescimento independente de adesão, além de diminuição da tumorigenicidade
em camundongos imunodeficientes NUDE (Honjo et al., 2001). As vias
envolvidas neste fenômeno de reversão da malignidade ainda não estão claras,
mas uma das grandes suspeitas é a via de KRAS, proteína oncogênica
conhecida por atribuir diversos aspectos do fenótipo maligno (Dumic et al.,
2006; Liu & Rabinovich, 2005).
No microambiente, Gal-3 pode estimular ou inibir o processo
metastático, dependendo, por exemplo, da expressão de seu receptor pelas
células e de sua concentração no meio extracelular. Além disto, diferentes tipos
tumorais podem ter sua invasividade estimulada ou inibida na presença de Gal-
3, independente da sua concentração. De modo geral, acredita-se que em
baixas concentrações (0.1–0.25 M) suas interações com integrinas
(corretamente glicosiladas) e elementos da matriz formam redes que auxiliam a
manutenção da adesão celular. Em contrapartida, altas concentrações (acima
de 5 M) de Gal-3 favorecem a metástase, pois parecem perturbar as
interações célula-célula ou célula-matriz, sequestrando sítios de moléculas de
INTRODUÇÃO
24
adesão e induzindo endocitose de grupos de integrina, com consequente perda
de adesão (Ochieng, Furtak & Lukyanov, 2004).
Um bom exemplo da influência de Gal-3 na metástase, como membro do
microambiente, foi demonstrado em leucemia mielóide. Foi descrito que
neutrófilos normais produziam uma MMP9 com alta afinidade por Gal-3,
enquanto células leucêmicas produziam uma MMP9 com modificações nas
cadeias glicídicas levando a uma baixa afinidade por Gal-3. Acredita-se que a
MMP9 de menor afinidade se mantenha livre no espaço intersticial para se
deslocar e clivar a matriz extracelular provocando o aumento na motilidade
celular e promoção de metástase. O mesmo fenômeno foi visto em linhagem
tumoral de mama, MCF7 (Fry et al., 2006).
A participação da Gal-3 na membrana de células tumorais não está
completamente esclarecida, porém, dados de análise proteômica por MALDI-
ToF da membrana de clone superinvasivo derivado de MDA435 indicaram que
dentre as proteínas superexpressas em relação a linhagem parental
encontrava-se Galectina-3, sugerindo um possível papel desta no
favorecimento da invasividade tumoral (Dowling et al., 2007). Acredita-se que a
Gal-3 é capaz de ativar vias de sinalização intracelulares através ligação
cruzada entre glicoconjugados da superfície celular, integrinas e elementos de
matriz extracelular que seriam capazes, então, de induzir as modificações
conformacionais necessárias para o disparo de vias de sinalização (Fukushi,
Makagiansar & Stallcup, 2004; John et al., 2003).
Em experimentos in vivo, camundongos NUDEs transplantados
ortopicamente com tumores derivados da linhagem MDA435 eram tratados
sistemicamente com Gal-3 modificada (retirada porção N terminal, responsável
INTRODUÇÃO
25
pela formação de dímeros e oligômeros de Gal-3 e ligações cruzadas com
proteínas) e o seu efeito foi analisado: a Galectina-3 apresentou vasta
biodistribuição, incluindo fígado, rins e baço, porém, não atingiu os pulmões ou
coração. Quanto aos tumores, observou-se uma significativa diminuição do
tamanho e peso, além do menor número de animais apresentando células
tumorais nos linfonodos. Curiosamente, não houve alteração na incidência de
metástases pulmonares, sendo possível correlacionar a isso a ausência da
molécula estudada nesse órgão. Quanto ao mecanismo por trás da inibição
tumoral, acredita-se que a Gal-3 modificada compete com a Gal-3 endógena e,
como não promove ligações cruzadas, não ativaria vias de sinalização
intracelulares, interagindo com matriz e receptores celulares (agindo
extracelularmente). A Gal-3 preveniria ainda, caso internalizada, interações
protéicas intracelularmente, servindo assim como um regulador negativo da via
independente de localização. O bloqueio de ligações cruzadas já foi
demonstrado por diversos grupos, assim como a internalização de Gal-3, o que
fortalece a hipótese. A proposta final do grupo é o uso de Gal-3 modificada
como adjuvante no tratamento de tumores estabelecidos. (John et al., 2003;
Massa et al., 1993; Ochieng et al., 1998; Prochiantz, 2000).
Em outro modelo de câncer de mama, linhagem MDA-MB-435Lung2
com metástase preferencial para pulmão, foi demonstrado que o bloqueio de
Galectina-3 por inibidor sintético, baseado em carboidrato, diminui o número de
metástases mas não a incidência. Porém, o simultâneo bloqueio de Gal-3 com
administração de paclitaxel diminuiu ambos, levando de 14 para 70% o número
de animais livres de doença, mostrando como a combinação de estratégias
pode ser proveitosa para terapia (Glinsky et al., 2009).
INTRODUÇÃO
26
Outro mecanismo de ação de Galectina-3 já descrito é como quimiocina.
A demostração foi realizada em monócitos e macrófagos, em concentrações
mais elevadas, acima de 1µM, e a molécula se mostrou sensível a toxina
pertussis, explicitando a participação de proteína Gi na via de sinalização
downstream (Sano et al., 2000). A Galectina-3 pode estimular ou inibir
metástase, dependendo da sua concentração e do receptor da superfície
celular. Diferentes tipos tumorais submetidos a tratamento com galectina-3 em
mesma concentração podem ter invasividade estimulada ou inibida. De modo
geral, acredita-se que em baixas concentrações (0.1–0.25 μM) as suas
interações com integrinas (corretamente glicosiladas) e elementos da matriz
formem redes que ajudem a manter a adesão celular, inibindo a migração. Em
contra partida, altas concentrações (acima de 5μM) são correlacionadas com
indução de metástase. Acredita-se que sua administração exógena
(mimetizando secreção pela célula tumoral) perturba interações célula-célula
ou célula-matriz, via glicoproteínas e integrinas, sequestrando sítios de
moléculas de adesão e induzindo endocitose de grupos de integrina, levando a
perda de adesão e metástase (Ochieng et al., 2004).
Em pacientes, comparados com indivíduos saudáveis, o nível sérico de
Galectina-3 mostrou-se significativamente elevado, sendo essa relação válida
para câncer de mama, pulmão, ovário, melanoma e linfoma não-Hodkins. Além
disso, a concentração de Galectina-3 revelou-se maior no soro de pacientes
metastáticos em comparação a pacientes com tumores localizados (Iurisci et
al., 2000). Em camundongos, já foi demonstrado que a galectina-3 circulante
aumenta a adesão celular das células tumorais às células endoteliais, devido à
polarização de MUC1, que expõe moléculas de adesão menores, como CD44,
INTRODUÇÃO
27
acarretando a migração transendotelial. Testes em cultura mostraram que este
fenômeno independia das condições físicas: se estáticas ou de fluxo contínuo
(Zhao et al., 2009). Já análises de tumores primários por imunohistoquímica
demonstraram correlação da marcação do estroma tumoral, Galectina-3
positivo, com maior grau de malignidade tumoral e mau prognóstico (Moisa et
al., 2007). Já análises de tumores não metastáticos, ou por PCR de fases
variadas de tumores de mama, não trazem relação de Gal-3 com prognóstico
(Logullo et al., 2007; O'Driscoll et al., 2003). Uma importante correlação foi a da
presença de Galectina-3 no núcleo das células tumorais com um pior
prognóstico (Jones et al., 2004).
Em resumo, Gal-3 extracelular apresenta diversos efeitos autócrinos e
parácrinos, mediando adesão e ativação celular, além de migração quando
parece ter efeito quimiotático para certos tipos celulares. Logo, a Gal-3
influencia vários processos biológicos, incluindo invasão tumoral e metástase
(Nangia-Makker, Balan & Raz, 2008; Ochieng et al., 2004).
1.5. Via de Sinalização de WNT e seu papel no cancer de mama.
As proteínas WNT são parte de uma grande família de moléculas de
sinalização extracelular altamente conservada e encontrada ao longo de todo
reino animal. WNT é uma glicoproteína secretada, rica em cisteína, com 38 a
43 KDa, e está envolvida tanto no desenvolvimento embrionário, quanto em
processos fisiológicos e patológicos na vida adulta, regulando destino celular,
sobrevivência, proliferação, e migração de diversos tipos celulares (Clark et al.,
1993; Gordon & Nusse, 2006).
INTRODUÇÃO
28
A via de WNT possui duas vertentes: a canônica, que é mediada por -
catenina, e a não-canônica, que envolve outros mensageiros, como Ca2+ ou
JNK (c-jun NH2 ter21254minal cinase) (Gordon & Nusse, 2006; Serra et al.,
2011). A via de WNT é complexa, pois 19 membros da família foram descritos
até o momento, e estes, por sua vez, ligam-se a uma família de receptores
trasmembranares do tipo serpentina chamada Frizzled (Fzd). Além disso, a
sinalização da via pode envolver mais de 50 mediadores intracelulares (Gordon
& Nusse, 2006). Os receptores Frizzled possuem na porção amino-terminal um
domínio rico em cisteína (CRD*), que é fundamental na promoção da interação
deste com as proteínas WNT. Contudo, para que haja ativação da via, além da
ligação ao receptor Frizzled também deve haver ligação ao co-receptor de
lipoproteína de baixa densidade (LRP) (Tamai et al., 2000; Wehrli et al., 2000).
O principal mediador intracelular da via canônica de WNT é a proteína -
catenina. Na ausência de sinalização, a -catenina citoplasmática forma um
complexo com as proteínas APC (Adenomatous polyposis coli) e Axina, que,
por sua vez, são substratos de GSK-3, uma proteína cinase. A -catenina
fosforilada pela GSK-3 é ubiquitinada e destruída pelo complexo proteasoma
(Gordon & Nusse, 2006). A ativação da via de WNT inibe a atividade do
complexo APC/Axina/CK1/GSK3β pela ligação da proteína Dsh (Dishevelled), o
que permite a translocação nuclear de -catenina (Gordon & Nusse, 2006;
MacDonald, Tamai & He, 2009; Wu et al., 2008). Uma vez no núcleo, ela
interage com os membros da família de fatores de transcrição TCF (T cell
factor) / LEF (Lymphocyte enhancer factor), deslocando os repressores
transcricionais Groucho, as histonas deacetilases e ativando os genes-alvo,
como c-myc e ciclina D1 (Fig.9). Por essa razão, é descrito como um
INTRODUÇÃO
29
importante fator no controle da proliferação celular de células-tronco de
diversos tecidos e também em processo neoplásico (Daniels & Weis, 2005;
MacDonald et al., 2009). No entanto, como dito anteriormente, diversos
mediadores adicionais podem se envolver nesta via, inclusive moléculas que
agem diretamente nos mecanismos de ativação transcricional, como Legless
(Lgs) e Pygopus (Pygo); o que pode influenciar a resposta celular à sinalização
de WNT (Gordon & Nusse, 2006; Nusse et al., 2008).
Existem também inibidores solúveis da via de WNT, antagonistas, como
Dickkopf (DKK) – uma família de proteínas capazes de se ligarem ao co-
receptor de Fzd, LRP, e bloquear a sua ligação com o complexo Fzd/WNT –,
responsável pela ativação da via (ten Dijke et al., 2008). Outra classe de
moduladores são os receptores solúveis de Frizzled (SFRPs), que também
possuem o domínio CRD e, por isso, competem com os receptores ancorados
à membrana pela ligação às proteínas WNT, servindo como importantes
moduladores negativos da via (Pannone et al., 2010).
Como citado inicialmente, a via não-canônica de WNT não está bem
descrita. O seu princípio básico é a independência de β-catenina. Em
vertebrados, a ativação da via ocorre por ligação de proteínas WNT ao receptor
Frizzled e a um co-receptor, um proteoglicano chamado Knypek. A proteína
Dsh também está envolvida, porém, deve estar localizada na membrana. A
partir desse ponto as possibilidades se abrem, podendo haver ativação da
superfamília de pequenas GTPases, como Rac e cdc42, que ativariam JNK ou
influxo da Ca2+ de forma dependente de Dsh, com ativação de PKC e CamKII;
que, teoricamente, bloqueariam a sinalização por β-catenina e a ativação do
INTRODUÇÃO
30
fator de transcrição sensível a cálcio, NFAT (nuclear factor of activated T cells)
.(Kuhl et al., 2000; Veeman, Axelrod & Moon, 2003).
Figura 9. Modelo resumido da via canônica de WNT. (A) Na ausência de sinal ativador, β-catenina fica solta no citoplasma e é capturada pelo complexo APC/Axina/CK1/GSK3β. Ela é osforilada na porção N-terminal e, em seguida, ubiquitinada e degradada; permanecendo TCF bloqueado por Groucho. (B) No momento em que WNT se liga ao complexo receptor, leva a adesão de DSH, que interage com o complexo APC/Axina/CK1/GSK3β, inibindo-o. Sem a ocorrência de fosforilação, a β- catenina se acumula no citoplasma e é translocada para o núcleo, culminando no deslocamento do inibidor Groucho e ativação de TCF/LEF em cooperação com múltiplos fatores de transcrição para ativar a transcrição gênica. Ao longo de todo esse processo, diversas moléculas podem interferir na ativação da via, algumas demonstradas em vermelho (Wend et al., 2010).
Ao longo dos anos, mutações relacionadas à via de WNT têm sido
correlacionadas com o aparecimento de diversos tipos de câncer, como a
mutação em APC, presente na síndrome hereditária da polipose adenomatosa
familiar; e o alto risco de câncer colorretal (Morin et al., 1997) ou em -
catenina, com produção de uma proteína constitutivamente ativa, que não é
INTRODUÇÃO
31
fosforilada e degradada, presente em cânceres gástricos, de cólon e
endométrio (Gordon & Nusse, 2006).
A importância da via de WNT no câncer de mama tem sido abordada
desde a identificação de aquisição da expressão de WNT-1 como
consequência da integração do vírus de tumor mamário murino (MMTV) (Nusse
& Varmus, 1982).
Na mama, a via de WNT parece ter papel importante, pois sua inibição
em modelo transgênico murino bloqueou seu desenvolvimento e a proliferação
induzida por gravidez. Em contrapartida, a hiperativação da via levou a um
aumento da proliferação e formação de tumores de fenótipos distintos,
dependendo do tipo de mutação (Teissedre et al., 2009). Mutações em ligantes
de WNT, como os receptores Frizzled, SFRP, membros da famímia de WIF
(fatores inibidores de WNT) e APC foram descritas em diversos tumores,
incluindo tumor de mama. Apesar disto, a associação entre a localização
subcelular de -catenina no citoplasma e núcleo, que caracterizaria a ativação
da via canônica de WNT, e pior prognóstico, ainda é inconclusiva, pois embora
alguns grupos tenham encontrado uma correlação positiva, outros relataram o
oposto (Geyer et al., 2011; Khramtsov et al., 2010; Lin et al., 2000; Wong et al.,
2002; Zardawi et al., 2009). Além de mutações na via, aumento de expressão
de receptores FZD1 e FZD2, a amplificação dos genes da via canônica de
WNT também têm sido observada em cânceres de mama, o que leva à
hiperatividade da via e levanta a possibilidade de estratégias terapêuticas que
visem inibir essa via (Barker & Clevers, 2006; Benhaj, Akcali & Ozturk, 2006;
Huguet et al., 1994; Klarmann, Decker & Farrar, 2008; Wend et al., 2010;
Zardawi et al., 2009).
INTRODUÇÃO
32
Deve ser considerado que -catenina também faz parte dos complexos
de adesão celular mediados por caderina. Recentemente, tem se observado
que a clivagem sequencial de caderinas por MMP e, em seguida, pelo
complexo enzimático de -secretase, leva a um aumento do pool citoplasmático
de -catenina não fosforilada que pode ser translocada para o núcleo,
potencializando a sinalização canônica de WNT (Jeanes, Gottardi & Yap, 2008;
Shoval, Ludwig & Kalcheim, 2007). A associação entre caderinas e invasão
tumoral é reconhecida há muito tempo. Em modelo experimental de melanoma
foi demonstrado que a superexpressão de caderina leva a uma dimiuição do
potencial tumorigênico e de invasão (Jacobs et al., 2011; Tamura et al., 2003).
Esses resultados sugerem que a interação de -catenina, mediador da via de
WNT, com caderinas, tem papel importante no fenômeno de EMT.
Clássicamente, a EMT requer a cooperação de oncogenes Ras e
receptores tirosina cinase. A sinalização por TGF-β é conhecida por agir
inibindo a proliferação de células normais, porém, essa resposta é contexto-
dependente e TGF-β pode contribuir para a progressão tumoral se as células
adquirirem resistência aos seus efeitos inibitórios. Essa resistência origina-se
exatamente da expressão de oncogenes Ras e receptores tirosina cinase.
Ambos induzem ativação da via de MAPK/PI3K, com diferentes membros de
MAPK atuando em diferentes tipos celulares, mas todos levando fatalmente ao
estimulo de proliferação. TGF-β induz diversos fatores de transcrição que
regulam migração e adesão celular, como Sip1, Snail, Smad3 e RhoA. Os
primeiros três agem como repressores transcricionais de E-caderina, enquanto
RhoA age sobre o citoesqueleto aumentando a motilidade celular, logo,
contribuindo no fenômeno de EMT (Lehmann et al., 2000; Oft et al., 1996;
INTRODUÇÃO
33
Thiery, 2002; Zavadil et al., 2004). Esse fenômeno pode ainda ser amplificado,
pois TGF-β induz sua própria secreção formando um looping autócrino que
acredita-se ser essencial para a manutenção da EMT e a ocorrência de
metástase, como demonstrado em modelos murinos (Lehmann et al., 2000; Oft
et al., 1996; Thiery, 2002; Zavadil et al., 2004).
A relação entre a via canônica de WNT e EMT parece complexa e,
possivelmente, dependente do tipo celular envolvido. Em alguns tipos tumorais,
como no câncer colo-retal, a presença de β-catenina nuclear foi correlacionada
com EMT (Baldus et al., 2004; Thiery, 2002). Porém, em fibroblastos, linhagens
de carcinoma de cólon (SW48, HCT116, SW480 e DLD1), de melanoma
(M619) e na linhagem HeLa, o aumento da expressão de β-catenina e sua
presença nuclear não levou a EMT, mas sim a apoptose de forma
independente de LEF (Kim et al., 2000).
O envolvimento da via canônica de WNT com EMT é dependente de
modulação da expressão membranar de E-caderina, diminuição por clivagem,
(Huber, Kraut & Beug, 2005) e possivelmente da atividade transcricional no
núcleo. A atividade está aparentemente mediada por outros elementos do
complexo de adesão, como o fragmento CTF2 de E-caderina (que é
translocada para o núcleo) ou p120, ou ainda Kaiso, que podem, todos, atuar
na expressão gênica inibindo a atividade transcricional de β-catenina (Daniel,
2007; Ferber et al., 2008; Park et al., 2005b).
Desta forma, a grande questão definida em termos de EMT é o controle
de caderinas. Aparentemente, fatores de crescimento como FGF1, EGF, IGF2
e HGF induzem sua internalização, sendo a caderina degradada, enquanto a β-
catenina seria translocada para o núcleo, onde ativaria a transcrição de c-myc
INTRODUÇÃO
34
e snail. Este, por sua vez, leva a perda de adesão celular por diminuição da
expressão de E-caderina membranar, de desmossomas, de conexinas e,
simultaneamente, induz secreção de proteases (Micalizzi et al., 2010; Thiery,
2002). Em linhagem de câncer de mama, já foi demonstrado que -catenina
induz a atividade de snail com consequente aumento da expressão de
vimentina, indicando sua participação na EMT (Gilles et al., 2003; Yook et al.,
2006).
1.6. Interrelações entre as vias de Galectina-3 e WNT
A hipótese de interação entre as vias de Gal-3 e WNT advém de
análises da sequência de Gal-3 que mostram similaridades com -catenina,
como a sequência S92XXXS96, responsável pelo reconhecimento de GSK-3.
De fato, ensaio bioquímico mostrou que Gal-3 pode servir como substrato de
GSK-3o que modifica a interação com seus ligantes e promove a
translocação nuclear, influenciando funções como malignidade e sobrevivência
celular (Balan et al., 2010; Mazurek et al., 2000; Mazurek et al., 2005;
Takenaka et al., 2004). Adicionalmente, a proteína axina também reconhece
Gal-3, pelo mesmo domínio que reconhece a -catenina, sugerindo que Gal-3
funcione como regulador da via de WNT (Shimura et al., 2005). Além dessas
similaridades estruturais, tem sido cada vez mais estudada a interação física
entre β-catenina e Gal-3, pois ambas podem se localizar no núcleo. Foi
demonstrado que, de fato, elas ligam-se por suas porções N- e C-terminais,
respectivamente. Essa interação forma um complexo com TCF4 e transcrição
de c-myc e ciclina D1, entre outros. Funcionalmente, isso pode ser traduzido da
seguinte forma: (i) linhagens que não expressam Gal-3 (BT549), quando
INTRODUÇÃO
35
transfectadas com Gal-3 apresentam um aumento de 5 vezes na atividade da
via de WNT e (ii) linhagens que já apresentavam Gal-3 (HT29), quando
transfectadas, ou seja, com superexpressão de Gal-3, ainda assim
apresentavam aumento de 3,8 vezes da atividade de WNT (Shimura et al.,
2004). Em tumores tireoidianos e carcinoma cístico de adenóide, tem-se
verificado a correlação entre presença nucelar de Gal-3 e β-catenina com
expressão de ciclina D1 (Ferrazzo et al., 2009; Weinberger et al., 2007). Já em
carcinoma de cólon, estudos com as linhagens LS174T e LiM6 mostraram que
o silenciamento de Gal-3 leva a diminuição dos níveis de β-catenina nuclear e,
consequentemente, da atividade de TCF4, com indução de apoptose. Por outro
lado, a tranfecção de Gal-3 levou a um aumento de β-catenina nuclear e da
atividade transcricional de TCF4. Na verdade, o efeito de Gal-3 foi dependente
de AKT, PI3K e GSK-3β. Seu silenciamento provocou desfosforilação de GSK-
3β, tornando-a mais ativa e, consequentemente, levando a um aumento da
degradação de β-catenina (Shi et al., 2007; Song et al., 2009).
1.7. Células tumorais disseminadas e micrometástase medular no tumor de mama. Como falado anteriormente, a avaliação de metástase em linfonodo é utilizada
rotineiramente no estadiamento dos tumores de mama.No entanto,
recentemente, tem-se investido na avaliação de prognóstico pela presença de
micrometástases ou células tumorais disseminadas, pois este fenômeno
parece ser um evento inicial nos tumores de mama (Allan & Keeney, 2010;
Pantel & Alix-Panabieres, 2010). Deve ser ressaltado que células tumorais
isoladas, células tumorais disseminadas, metástases ocultas, doença residual
mínima e células micrometastáticas são termos usados na literatura para
INTRODUÇÃO
36
descrever micrometástases. Porém, células tumorais isoladas devem ser
mencionadas de forma distinta das micrometástases propriamente ditas, uma
vez que estas se distinguem por contato de células metastáticas com vasos
sanguíneos ou linfáticos, reação estromal extravascular e proliferação tumoral
formando grupos de células, menores que 2mm, distantes da lesão primária.
Em contrapartida, as células isoladas (doença residual mínima) seriam, na
realidade, uma etapa anterior das micrometástases (Ozbas et al., 2003).
A disseminação precoce do tumor de mama, em especial para a MO,
tem surgido como um fator prognóstico independente (Braun, Auer & Marth,
2009; Braun et al., 2001; Braun et al., 2000; Braun et al., 2005; Engel et al.,
2003; Ozbas, Dafydd & Purushotham, 2003; Pantel & Otte, 2001; Vincent-
Salomon, Bidard & Pierga, 2008), mesmo após 5 anos da retirada do tumor
primário (Riethdorf & Pantel, 2008; Slade et al., 2005; Vincent-Salomon et al.,
2008). Entre 24-43% das pacientes com câncer de mama apresentam
micrometástase na MO (Pantel & Otte, 2001). Embora a maioria das pacientes
com micrometástase medular possua tumores em estádios mais avançados,
negativos para ER, a presença de micrometástse medular foi observada em
pacientes com tumores menores do que 2 cm e que não apresentavam
metástase em linfonodo (Braun et al., 2005). O índice de mortalidade dessas
pacientes era maior, 14% contra 1% das que não apresentavam
micrometástase (Fig. 10), tornando este achado um fator prognóstico
independente (Braun et al., 2000; Tjensvoll et al., 2010). Mais importante:
recentemente foi descrita a identificação de células tumorais na MO de
pacientes com carcinoma dutal in situ (DCIS), sendo detectadas em 57% das
pacientes que apresentavam microinvasões e em 21% das que não
INTRODUÇÃO
37
apresentavam microinvasão. Após 30 meses de acompanhamento, 25%
dessas pacientes desenvolveram carcinoma contralateral ou DCIS contralateral
(Sanger et al., 2011), indicando que o fenômeno é precoce e importante no
prognóstico das pacientes. Apesar disto, em função do desconforto causado
para obter-se aspirados de medula, o monitoramento de micrometástase
medular não tem sido utilizado na rotina clínica e, por isso, tem-se investido na
análise de células tumorais no sangue periférico (Criscitiello, Sotiriou &
Ignatiadis, 2010; Muller et al., 2005; Zhao et al., 2011) e na caracterização, no
tumor primário, de células com potencial de disseminação precoce (Falck et al.,
2010; Taranger-Charpin et al., 2009; Woelfle et al., 2003).
INTRODUÇÃO
38
Figura 10. Curva de sobrevida de pacientes com de câncer de mama pós-
cirurgia comparando diferentes prognósticos em pacientes que apresentavam ou não células tumorais em linfonodos ou medula óssea (Braun et al., 2000).
As análises de células tumorais circulantes e a presença de
micrometástase medular mostraram um fato curioso. O tempo de latência das
células na MO pode variar, chegando a anos para formação ou não de micro
ou macrometástases detectáveis. Um grupo norueguês analisou 110 pacientes,
correlacionando a presença de micrometástases na MO com o intervalo livre de
doença e mostrou que as pacientes com células na MO apresentavam maior
intervalo livre de doença do que aquelas onde não foram observadas células
na MO (Bidard et al., 2008). Esses achados fortalecem a idéia de que o
microambiente da MO favorece a manutenção de células tumorais dormentes
e resistentes a quimioterapia (Bidard et al., 2008; Nicola et al., 2003; Ozbas et
al., 2003). Seguindo a hipótese da existência de CSC, que seriam quiescentes
e responsáveis pelas metástases, Balic e colaboradores observaram que na
INTRODUÇÃO
39
MO em torno de 72% das células positivas para citoqueratina são CD44+CD24-,
enquanto apenas 10% das do tumor primário apresentam este fenótipo (Al-Hajj
et al., 2003; Balic et al., 2006). No entanto, células com fenótipo distinto das
CSC de mama também foram observadas, o que levou a proposta,
anteriormente citada, de que as variações no percentual de células
CD44+CD24-, CD44+CD24+, CD44-CD24+ e dupla negativas se devessem a
processos de auto-renovação, proliferação, diferenciação e apoptose (Honeth
et al., 2008; Meyer et al., 2009). Contudo, é possível que o fenótipo seja
influenciado pelo microambiente, como já mencionado antes (Kaipparettu et al.,
2008; Meyer et al., 2009).
Acredita-se que as metástases não sejam aleatórias, uma vez que sítios
preferenciais, dependendo do tipo de câncer, são observados. Os alvos
preferenciais do tumor de mama são ossos, pulmões e fígado. Esta idéia de
que uma interrelação entre a célula tumoral (semente=seed) e o microambiente
do órgão em questão (solo=soil) é fundamental (Fidler & Nicolson, 1976;
Heppner, 1984) tem sido apoiada por observações que descrevem
mecanismos como a expressão de moléculas de adesão (VCAM1),
metaloproteinases (MMP-1) e quimiocinas (CXCL1), que direcionam
especificamente a metástase (Minn et al., 2005). Mais: modificações no
microambiente do tecido alvo, que antecedem a chegada das células tumorais,
formariam um nicho pré-metastático, favorecendo a metástase (Kaplan, Rafii &
Lyden, 2006; Kaplan et al., 2005; Peinado, Lavotshkin & Lyden, 2011; Psaila et
al., 2006; Psaila & Lyden, 2009). No entanto, os mecanismos podem ser
múltiplos e variados, o que requer ainda investigações.
INTRODUÇÃO
40
As células tumorais que semeiam a MO devem usar a via hematogênica,
pois não se observou correlação entre metástase em linfonodo e
micrometástase medular, embora esta tenha se correlacionado com a área de
microvasos no tumor primário (Benoy et al., 2005). Importante citar que a
vascularização do tumor primário se correlaciona com um maior índice de
mortalidade (Hansen et al., 2000). Na MO, as células tumorais deixam os
sinusóides e localizam-se em grupos nos espaços intertrabeculares (Ozbas et
al., 2003; Pantel & Otte, 2001). Porém, a localização da doença residual
mínima não é bem descrita ainda, pois este ponto da progressão requer
enorme sensibilidade técnica para identificação e localização de células
isoladas (Pantel & Otte, 2001).
1.8. Galectina-3 no microambiente hematopoiético e na metástase medular
Como mencionado anteriormente, Gal-3 foi observada no microambiente
medular. Análises por citometria de fluxo, imunocitoquímica e imunoblotting
demonstraram a presença de Gal-3 como parte da MEC, solúvel no meio
intersticial e aderida à superfície celular na medula óssea de ratos (Glinsky et
al., 2001; Krugluger et al., 1997). Em camundongos, Gal-3 pôde ser observada
nos ossos, sendo expressa em condrócitos da placa de crescimento e nos
osteoblastos, osteócitos trabeculares e osso cortical da diáfise, assim como em
osteoclastos dessa região. Também foi vista nas células mononucleares da
MO, principalmente células mielóides e no estroma que as circunda.
Curiosamente, não foi observada em nichos de eritropoiese ou linfopoiese. Sua
localização era predominantemente intracelular, no citoplasma ou no núcleo,
em zona de calcificação e em osteoblastos novos, raramente apresentando-se
INTRODUÇÃO
41
em meio extracelular (Colnot et al., 1999; Krugluger et al., 1997). Sua presença
em osteoblastos levantou a questão do seu envolvimento na diferenciação
destas células. Verificou-se que a expressão de Gal-3 é controlada por RUNX2,
um fator de transcrição responsável pelo desenvolvimento ósseo. A
superexpressão de RUNX2 levou a expressão de Gal-3 em linhagem de
células mesenquimais murinas, verificando-se que Gal-3 estava ausente no
esqueleto de camundongos nocautes para RUNX2. De fato, foi demonstrado
que a indução osteogênica em calvária de rato leva ao aumento concomitante
da expressão de genes característicos de osteoblastos (fosfatase alcalina,
BMP e osteocalcina) e de Gal-3. Além disso, foi mostrada a presença de sítios
de ligação para RUNX2 no promotor de Gal-3 de camundongos e também de
humanos (Aubin et al., 1996; Stock et al., 2003). Portanto, a Gal-3 faz-se
presente na medula óssea murina e é secretada em regiões de diferenciação
de osteoblastos, ou seja, nicho subendosteal, que temos como modelo nesse
estudo, havendo indícios de que isso seja também verdade para humanos.
Em células hematopoiéticas, verificou-se que a adição de Gal-3 exógena
inibe a proliferação induzida pelo fator etimulador de colônias de granulócitos e
macrófagos (GM-CSF, Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor),
mostrando seu possível papel regulador da mielopoese (Krugluger et al., 1997).
Além disto, observou-se que Gal-3 influencia a produção de eosinófilos,
linfócitos e plasmócitos, uma vez que camundongos nocautes para Gal-3
apresentam aumento dessas populações (Oliveira et al., 2007).
Recentemente, tem-se atribuído a expressão de Gal-3 o papel imunorregulador
que as MSC de MO apresentam, uma vez que MSC silenciadas para Gal-3, via
INTRODUÇÃO
42
siRNA, perdiam sua capacidade de inibir a proliferação de linfócitos T (Sioud et
al., 2010). Logo, essa Gal-3 medular apresenta diversos papéis fisiológicos.
O papel de Gal-3 na metástase tumoral e sua presença no
microambiente medular levantam questões sobre sua possível função no
desenvolvimento de micrometástases medulares. Observou-se, por exemplo,
que células de tumor de próstata aderiam preferencialmente a células
endoteliais derivadas da MO, de forma dependente de Gal-3 (Lehr & Pienta,
1998), o que foi posteriormente comprovado também para células de tumor de
mama. O bloqueio de Gal-3 na interação com HUVEC levava à inibição de
adesão de 50% das células tumorais, em média, enquanto com endotélio
medular a inibição chegou a 82%. Diversos ensaios foram realizados, inclusive
de microscopia confocal, permitindo observar que a galectina-3 da superfície
das células endoteliais de MO interagiam com o antígeno T nas células
tumorais, sendo este o primeiro passo sugerido para o desencadeiamento da
migração transendotelial e para que a galectina-3 faça parte do mecanismo de
tropismo do câncer de mama e próstata para o osso quando metastizado
(Glinsky et al., 2001; Glinsky et al., 2000). Mais recentemente, foi demonstrado
em modelo de neuroblastoma - um tumor que frequentemente produz
metástase para osso, fígado e medula óssea -, que as células tumorais
secretam uma proteína que se liga a Gal-3 das células estromais da MO,
induzindo estas a secretarem IL-6, provavelmente pela ativação da via de Erk-1
/ 2 (Fukaya et al., 2008). Deve ser ressaltado que IL-6 produzida por células do
estroma da MO tem um papel importante no estabelecimento de metástases
ósseas.
INTRODUÇÃO
43
Para o estabelecimento de metástase óssea, após a migração
transendotelial, uma série de outros eventos que modificam o metabolismo
ósseo de forma a favorecer a sobrevivência e a proliferação celular devem
ocorrer. Essas mudanças incluem um novo equilíbrio no remodelamento ósseo,
angiogênese e escape do sistema imune, e parecem ser mediadas por contato
célula-célula e por produção de fatores solúveis parácrinos ou autócrinos (Ara
& Declerck, 2010; De et al., 2003). A IL-6 é um dos fatores solúveis com papel
crucial nestes eventos. Ela age como fator de crescimento, via fosforilação de
pRB, ativação de Ras e STAT-3, e regula sobrevivência celular, por aumento
da expressão de diversas proteínas como Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 e survivina (Ara
& Declerck, 2010; Meads, Hazlehurst & Dalton, 2008). Além disso, a IL-6
reprime a expressão de e-caderinas, via STAT-3, favorecendo um fenótipo
mesenquimal invasivo (Leslie et al.). Quanto ao microambiente circundante, a
IL-6 contribui para lise óssea por indução de RANKL em osteoblastos e células
tumorais, além de outros fatores relacionados com a reabsorção óssea, PTHrP,
IL-8, IL-11 e Cox-2 (Ara & Declerck, 2010; Chauhan et al., 1997; Guillen, de
Gortazar & Esbrit, 2004; Gunn et al., 2006; Urashima et al., 1997).
Adicionalmente, IL-6 promove a secreção de DKK-1, que age sobre
osteoblastos bloqueando a via de WNT, fundamental, como já falado, para a
osteogênese (Kim et al., 2007). Assim, a IL-6 tem um papel fisiológico, porém,
o seu desbalanço durante o câncer leva a manutenção da célula tumoral e lise
óssea, característica das metástases que afetam esse órgão.
INTRODUÇÃO
44
1.9. Influência da via de sinalização de WNT no microambiente
hematopoético
A ativação da via de WNT tem papel importante no microambiente
hematopoético agindo sobre as HSC. Em experimentos com camundongos
nocautes condicionais para c-myc, gene alvo de TCF-LEF, foi verificado
acúmulo de HSC no nicho subendosteal com concomitante aumento da
expressão de N-caderina e integrinas. Além disso, também foi verificado que
após a divisão das HSC, a célula filha, que mantém alta expressão de c-myc e
baixa expressão de moléculas de adesão, entra em proliferação e
diferenciação, sugerindo que c-myc seja fundamental na regulação da saída do
nicho subendosteal e expansão do pool para diferenciação, o que foi
confirmado por outros trabalhos (Duncan et al., 2005; Wilson et al., 2004).
A N-caderina, como dito, é um dos mediadores da interação entre HSC e
osteoblastos, via interação homotípica; estabelece junções aderentes, onde -
catenina se liga à porção citoplasmática da molécula de caderina e se associa
também com -catenina e -actina, formando um complexo estável com o
citoesqueleto. Nesta conformação, a -catenina fica aprisionada,
impossibilitada de se translocar para o núcleo e, consequentemente, ativar a
via canônica de WNT (Shoval et al., 2007). Logo, pode-se levantar a hipótese
de que a presença de N-caderina esteja diretamente relacionada com o
bloqueio da via de WNT, e que isto seja importante na quiescencia da célula, já
que a via de WNT parece ser importante no processo de expansão das HSC
(Reya et al., 2003). Uma vez que isto já está descrito para a HSC, imagina-se
que a suposta CSC também possa utilizar-se dos mesmos sinais para se
INTRODUÇÃO
45
manter, sendo o câncer notoriamente uma doença oportunista e a medula
óssea considerada santuário para células tumorais.
Análises da expressão de diferentes membros da via de WNT em
tecidos hematopoéticos, durante o período fetal murino, permitiu a observação
de WNT5a (que utiliza principalmente a via não canônica) e WNT10b (via
canônica) no saco vitelino, no dia 11, e no fígado fetal, no dia 14, condizente,
assim, com o momento de expansão das HSC. Além disso, os autores
estudaram o efeito de meio condicionado enriquecido em WNT-1, 5a ou 10b,
no comportamento de HSC isoladas de fígado fetal, e observaram uma
significativa expansão no número de células e unidades formadoras de
colônias, 7, 8 e 11 vezes respectivamente em relação ao controle (Austin et al.,
1997).
Trabalhos com progenitores hematopoéticos humanos chegaram a
resultados semelhantes. Em ensaios de co-cultura de células CD34 com
células estromais de primatas transfectadas com WNT-5a, 2b ou 10b,
observou-se expansão do número de células CD34+ e de colônias mielóides de
granulócito e macrófago e de eritrócitos (CFU-GM, granulocyte macrophage-
colony forming unit e BFU-e, erithrocyte-burst forming unit) em todos os casos
(Van Den Berg et al., 1998).
Em 2003, o grupo de Weissman, em um belo trabalho demonstrando a
contribuição da via canônica de WNT na auto-renovação de HSC, observou
que a transfecção de HSC com gene de -catenina constitutivamente ativa
levava a expansão celular, mantendo sua propriedade de HSC, já que o
transplante destas células em camundongos irradiados letalmente levou a
reconstituição da hematopoese de longa duração (Reya et al., 2003). Essa é
INTRODUÇÃO
46
uma área de estudo ainda em desenvolvimento e a literatura apresenta
incongruências no que diz respeito ao papel de WNT sobre as HSC. Em 2004,
por exemplo, um grupo do Japão publicou um trabalho contradizendo o
trabalho de Weissman, relatando terem transfectado células estromais de MO
humana com WNT5a (via não canônica) ou WNT3a (via canônica), e analisado
o co-cultivo destas células com células CD34+ de sangue de cordão umbilical.
Eles observaram que os co-cultivos com WNT5a foram responsáveis por um
aumento do número de cooblestone (áreas de interação das HSC com o
estroma de MO), de células CD34 e de unidades formadoras de colônias (CFC)
após 2 semanas, que se mantinha por até 35 dias. Já células transfectadas
com WNT3a induziram efeito parecido com o controle e, após 35 dias, o
número de colônias foi menor em relação ao controle, levando-os a sugerir que
WNT3a não seria responsável pela expansão das HSC (Chiba et al., 2004).
Neste mesmo ano, Cobas e colaboradores publicaram um trabalho com
nocautes condicionais para -catenina na MO mostrando que a ausência desta
não impossibilita a auto-renovação ou a capacidade de formação das linhagens
hematopoéticas diferenciadas (Cobas et al., 2004). No entanto, a importância
de WNT-5a na expansão do pool de HSC é uma concordância entre os
diferentes grupos. Em 2003, foi publicado um trabalho demonstrando in vivo a
importância desta molécula. Camundongos imunodeficientes irradiados que
recebiam injeção intraperitoneal de meio condicionado com WNT5a em dias
alternados, por 2 semanas, antes do transplante com células humanas
CD34+CD38-Lin- apresentaram, após 14 dias, enxerto de células
hematopoéticas humanas, inclusive de células CD34+CD38-, quatro vezes
maior que os controles que não receberam WNT5a. Ensaios funcionais in vitro
INTRODUÇÃO
47
mostraram que as células da MO de animais tratados com WNT-5a possuíam
um maior número de unidades formadoras de colônia em comparação com o
controle, mostrando o papel desta molécula na expansão do pool de
progenitores hematopoéticos humanos. Curiosamente, em ensaios com
transplantes de HSC murinas, nenhum efeito de WNT5a foi observado,
sugerindo que a regulação de hematopoese por WNT é espécie-específica
(Murdoch et al., 2003).
Neste mesmo trabalho, usando camundongos transgênicos com duplo
reporter para Notch (CBF-1 associado a GFP) e para WNT (TCF/LEF
associado a -galactosidase), os autores observaram que na MO destes
animais o número de células duplo positivas na região trabecular era grande
(85% das células -galactosidade+ também eram GFP+). Quando realizaram
transplantes com HSC onde a via de Notch havia sido bloqueada através de
transfecção de HSC com dominantes negativos, ou seja, com a porção
intracelular inativa, observaram uma diminuição de 70% na pega dos
transplantes. No entanto, estas células eram capazes de responder ao estímulo
com WNT3a, pois quando cultivadas com este fator aumentavam a taxa de
proliferação, mostrando que o efeito de WNT3a é independente de Notch.
Porém, estas células diferenciaram com maior rapidez, indicando que a
manutenção do estado indiferenciado é papel de Notch. Logo, na realidade,
Notch e WNT agiriam sinergicamente no controle da auto-renovação,
controlando processos distintos de forma não acoplada, sendo de WNT a
função de controlar a proliferação (Duncan et al., 2005).
INTRODUÇÃO
48
1.10. Microambiente Medular e Células-Tronco. 1.10.1. Interação entre o microambiente medular e células tumorais.
A idéia de que a MO poderia ser um ―santuário‖, onde as células
tumorais entrariam em quiescência e adquiririam resistência aos
quimioterápicos advém das pesquisas com as células-tronco hematopoiéticas
(HSC, Hematopoietic Stem Cells). Acredita-se, como discutiremos adiante, que
a auto-renovação, uma característica de células-tronco, e a quiescência das
HSC na MO sejam controladas tanto por mecanismos autônomos como pelo
microambiente, em especial o nicho subendosteal (Calvi et al., 2003; de Barros
et al., 2010; Zhang et al., 2003). Portanto, é possível que as células tumorais
utilizem os mecanismos fisiológicos de manutenção das HSC, estabelecendo
assim a doença residual mínima intramedular (Meads et al., 2008; Rao et al.,
2004), o que foi demonstrado em modelo experimental de leucemia mielóide
aguda (Ishikawa et al., 2007).
A relação de células tumorais de mama com o nicho subendosteal da
MO pode ser inferida por ensaios de microarray comparando células isoladas
de tumores primários de mama de pacientes com e sem micrometástase
medular. Em acordo com as evidências de que um dos fatores que favorece a
manutenção das HSC no nicho subendosteal é a hipoxia (Kubota, Takubo &
Suda, 2008; Parmar et al., 2007), observou-se um aumento de 2,7 vezes na
expressão do fator 1 induzido por hipoxia (HIF-1α, Hypoxia-Inducible Factor-1)
nas pacientes com micrometástase medular em relação às que não
apresentavam micrometástase (Woelfle et al., 2003). Em 2006, Phadke e
colaboradores fizeram um elegante trabalho para acompanhar a dinâmica da
invasão da MO por células da linhagem tumoral MDA435, desde o momento de
INTRODUÇÃO
49
células isoladas até o surgimento de grupos celulares. Após uma semana da
injeção sistêmica dessas células, foram observados pequenos focos de 2-10
células associadas a osteoblastos na região endosteal das metáfises. Com o
tempo, os focos se fusionaram, tornando-se menos numerosos, porém
maiores. Após 4 semanas, estes focos culminaram com a formação de uma
grande massa única, com redução no número de osteoblastos, mas quase
nenhuma influência no número de osteoclastos. Duas observações importantes
devem ser ressaltadas: em primeiro lugar, a localização inicial das células
tumorais na região subendosteal, corroborando a hipótese formulada; e em
segundo, uma possível explicação para o quadro de osteólise por diminuição
da população de osteoblastos que se associa à ativação de osteoclastos e
indução de osteoclastogênese pelas células tumorais, via RANK/RANKL, que,
por sua vez libera fatores de crescimento da matriz óssea e gera um feedback
positivo de lesão óssea e proliferação tumoral (Canon et al., 2008).
Além da quiescência, o fenômeno de indução de resistência a múltiplas
drogas, chamado de EM-MDR (Environment Mediated-Multiple Drug
Resistance), pela MO tem sido observado em neoplasias hematológicas. A MO
parece contribuir para este fenômeno através de múltiplos fatores, incluindo
fatores solúveis, como IL-6, contato direto com as células estromais, via
Notch/Jagged e VLA-4/VCAM1, e elementos de matriz, como fibronectina e
osteopontina, que, agindo em conjunto, inibiriam as vias de apoptose e
induziriam resistência a drogas (Fig.11) (Meads et al., 2008). Após pressão
seletiva, clones alterados genética e epigenéticamente que sobreviveram
originariam um fenótipo mais complexo de resistência a drogas de forma
independente do microambiente (Hazlehurst et al., 2006). Existem indícios de
INTRODUÇÃO
50
mecanismo de EM-MDR em células tumorais de mama e próstata. A adesão a
MEC via β1-integrina inibiu a apoptose induzida por Paclitaxel e Vincristina
(Aoudjit & Vuori, 2001) e a expressão de integrina αvβ3, normalmente expressa
por leucócitos ativados, e que reconhece fibronectina e osteopontina (Cooper,
Chay & Pienta, 2002), em células tumorais é fundamental para o
estabelecimento de metástases ósseas no caso de tumor de próstata (McCabe
et al., 2007) e de mama (Takayama et al., 2005). A superexpressão de αvβ3 na
linhagem de tumor de mama MCF-7 induziu resistência ao efeito de éster de
forbol, que era abolida quando a adesão a osteopontina, uma molécula que, na
medula óssea, é caracteristicamente expressa no nicho subendosteal (Nilsson
et al., 2005; Stier et al., 2005), era inibida por anticorpo anti-αvβ3 (Noti, 2000).
Esses fatores colocam a interação tumor-microambiente e, em especial, o
microambiente da MO, como fundamental alvo terapêutico para que se
alcancem melhores prognósticos.
INTRODUÇÃO
51
Figura 11. Modelo de Resistência a múltiplas drogas induzida pelo microambiente (EM-MDR). Fatores presentes no microambiente da MO induzem o
fenômeno de EM-MDR em tumores hematopoiéticos, protegendo essas células de agentes quimioterápicos. CXCL12/SDF-1 induz o homing das células tumorais para a
MO via receptor CXCR4. Em seguida, interações com células estromais, via Notch e integrina (VLA-4), e com a MEC, principalmente fibronectina, e fatores solúveis, como IL-6, secretados pelas células estromais estimuladas pelas tumorais, via FGF e VEGF. Na célula tumoral há aumento da expressão de p27/Kip1, c-FLIPL e Bcl-XL e dimunuição da expressão de Bim, todos contribuindo para o fenômeno EM-MDR (Meads et al., 2008).
1.10.2. Nicho subendosteal e Células Mesenquimais do Estroma da Medula Óssea. A hematopoese, processo de formação de todas as células sanguíneas,
depende de uma única célula, a HSC, caracterizada por sua capacidade de
auto-renovação e de diferenciação para as várias linhagens hematopoiéticas
(Kondo et al., 2003), cuja manutenção depende de interação com nichos
INTRODUÇÃO
52
específicos (Adams et al., 2006; Calvi et al., 2003). Na vida adulta, a
hematopoiese ocorre na medula óssea, mas durante a vida fetal ela ocorre em
diferentes sítios, de forma sequencial (Godin & Cumano, 2002). A colonização
de um sítio pelas HSC parece ser precedida por modificações no
microambiente, como co-localização do par VCAM-1/fibronectina que não é
mais observada, uma vez que o órgão deixa de ser hematopoiético (Tada,
Widayati & Fukuta, 2006). Esse processo é curiosamente similar à formação do
nicho pré-metastático.
Na MO, as HSC localizam-se majoritariamente na região subendosteal
(Nilsson, Johnston & Coverdale, 2001) e, ao longo do processo de proliferação
e diferenciação para as diversas linhagens do sangue, os progenitores
hematopoiéticos migram em direção aos seios venosos centrais, entrando em
contato com diferentes nichos (Schofield, 1978), para, finalmente, atingir a
corrente sanguínea (Fig. 9) (Taichman, 2005). Os diversos nichos são
reconhecidos pela localização das células hematopoiéticas e pouco se sabe
sobre sua composição. Admite-se que sejam formados pela interação dos
progenitores hematopoiéticos com as células do estroma medular, a matriz
extracelular, aliada a fatores de crescimento e quimiocinas, que geram
sinalização intracelular e estabelecem um determinado
comportamento/fenótipo (Kim et al., 2009; Lazar-Karsten et al., 2010; Mansour
et al., 2011; Nilsson et al., 1997; Reya et al., 2001; Taichman, 2005). Essas
observações levantaram grande interesse na caracterização dos nichos e dos
fatores envolvidos no controle do destino das HSC, ou seja, quiescência,
proliferação, auto-renovação ou diferenciação e migração. No entanto, o
estroma da MO é heterogêneo e inclui células reticulares e adventícias,
INTRODUÇÃO
53
osteoblastos, células acumuladoras de gordura, endotélio e células de origem
hematopoiética, como macrófagos (Weiss, 1976). A MEC da MO é rica
principalmente em fibronectina, amplamente distribuída, proteoglicanos (ex:
heparan sulfato) e glicosaminoglicanos (ex: ácido hialurônico). Outros
componentes apresentam localização mais restrita, como colágenos do tipo I,
no osso trabecular, e do tipo IV, formando, com laminina, a membrana basal
dos vasos (Nilsson et al., 1998; Zuckerman, 1984), e osteopontina, que, como
informado anteriormente, é predominantemente observada na região
subendosteal (Nilsson et al., 2005; Stier et al., 2005). Além destas, galectina-3,
uma lectina que pode se associar a moléculas da MEC ou localizar-se em
compartimentos celulares, e cujo papel na biologia de cálulas tumorais será
abordado adiante, foi observada em diversos sítios, incluindo ossos e estroma,
que circunda as células da linhagem mielóide (Glinsky et al., 2001; Krugluger et
al., 1997).
A região subendosteal é formada por osteoblastos, uma camada de
células reticulares subendosteais, e osteoclastos esparsamente dispostos ao
longo do endósteo, em sítios de reabsorção óssea (Balduino et al., 2005;
Purton & Scadden, 2006; Rossi et al., 2005). Na verdade, essa região é
complexa e dinâmica, sendo possível imaginar que isto afete a formação dos
nichos de HSC e modifique sua migração e auto-renovação. Células da
linhagem osteogênica (bone lining cells), que se encontram em diferentes
graus de ativação, recobrem a superfície interna dos ossos compacto e
trabecular. O pólo basal está aderido firmemente à superfície óssea, enquanto
o lado apical interage com as células do sistema hematopioético,
especialmente com as HSC (Calvi et al., 2003; Purton & Scadden, 2008; Zhang
INTRODUÇÃO
54
et al., 2003). As características e a função das células reticulares
subendosteais são pouco conhecidas, pois, em geral, não há uma distinção
muito clara entre estas e as demais células reticulares que constituem o
estroma medular. Recentemente, trabalhos experimentais sugerem que uma
população celular denominada de célula-tronco mesenquimal ou célula
mesenquimal do estroma (MSC, Mesenchymal Stromal Cells) localizam-se
nesta região, em íntimo contato com as HSC (Fig. 12) (Muguruma et al., 2006).
Figura 12. Nicho subendosteal e cascata de diferenciação restritiva hematopoética.
Esquema mostra a organização espacial das células em diferenciação, com as populações mais diferenciadas mais próximas da região central da medula. Em detalhe, imagem por microscopia confocal das células-tronco hematopoéticas humanas transplantadas, em amarelo, localizadas no nicho subendosteal de camundongos NOD/SCID irradiados, entre o osso e células mesenquimais derivadas de MO humana previamente implantadas na cavidade medular, em verde. Núcleos em azul. (Montagem a partir de (Muguruma et al., 2006; Taichman, 2005).
Desde o trabalho pioneiro de Friedenstein (1976), demonstrando a
presença de uma população de células aderentes fibroblastóides clonogênicas,
as unidades formadoras de colônias de fibroblasto (CFU-F, Fibroblast-colony
INTRODUÇÃO
55
forming unit), e o trabalho de Pittenger e colaboradores (1999), mostrando o
potencial de diferenciação desta população, admite-se que o estroma não-
hematopoiético da MO também seja dependente de uma população de células-
tronco quiescentes e multipotentes, as MSC, que representam 0,0001 a 0,01%
das células nucleadas na MO (Bianco, Robey & Simmons, 2008). Deve ser dito
que células com características de MSC foram observadas em associação com
microvasos, portanto, relacionadas com os chamados pericitos, em diversos
órgãos (Crisan et al., 2008; da Silva Meirelles, Chagastelles & Nardi, 2006; da
Silva Meirelles et al., 2009; Sacchetti et al., 2007), não estando clara a relação
entre estas diferentes populações.
Embora tenha-se atribuído a osteoblastos a propriedade de manutenção
do pool de HSC no nicho subendosteal (Calvi et al., 2003; Zhang et al., 2003),
é interessante notar que as MSC de MO expandidas in vitro, ao contrário de
outras células estromais, como os próprios osteoblastos ou MSC
osteoinduzidas in vitro por 2 semanas, são caracteristicamente capazes de
organizar o microambiente hematopoiético. A injeção destas células em
associação com hidroxiapatita e fosfato de cálcio (HA/TCP) no subcutâneo
induz a formação de um ossículo ectópico com MO organizada e funcional
(Miura et al., 2006; Sacchetti et al., 2007). Dignas de nota são a sequência de
eventos e a contribuição das MSC e de outras populações celulares na
organização do microambiente hematopoiético. Há, inicialmente, formação de
trabéculas ósseas e estroma, ambos formados pelas MSC. Em seguida,
observa-se vascularização, sendo o endotélio de origem do hospedeiro, e,
finalmente, este microambiente é colonizado por células hematopoiéticas,
também do hospedeiro. Esses achados estenderam resultados obtidos
INTRODUÇÃO
56
anteriormente e confirmaram a propriedade exclusiva das MSC da MO de
organizar um microambiente hematopoiético, que não é compartilhada por
MSC isoladas de ligamento dentário (Shi et al., 2005). Portanto, é possível
imaginar que estas células tenham papel fundamental na preparação do nicho
de HSC, o que parece ser corroborado pela observação de que a migração de
MSC precede a migração das HSC nos sítios hematopoiéticos durante o
desenvolvimento embrionário (Mendes, Robin & Dzierzak, 2005).
A caracterização incompleta do nicho subendosteal tem como
consequência incertezas quanto aos fatores responsáveis pela regulação das
propriedades de quiescência, auto-renovação ou diferenciação e migração das
HSC. Acredita-se que a acoragem das HSC no nicho subendosteal seja
fundamental para indução de quiescência. Interações do tipo osteopontina/1
integrinas (Nilsson et al., 2005), a forma transmembranar do fator de células-
tronco (tm-SCF, Stem Cell Factor) e seu receptor, c-kit, expresso pelas HSC
(Driessen, Johnston & Nilsson, 2003), Angiopoietina-1(Ang-1)/Tie-2 (Arai et al.,
2004) e N-caderina (Hosokawa et al., 2010; Zhang et al., 2003), além de
fatores secretados, como TGF-β (Li, 2011) têm sido estudados.
A adesão de HSC a osteopontina (OP), uma glicoproteína fosforilada
que, na MO, localiza-se preferencialmente na superfície endosteal, via 1-
integrinas, reduz sua proliferação (Haylock & Nilsson, 2006; Nilsson et al.,
2005) e apoptose (Haylock & Nilsson, 2006; Stier et al., 2005). Embora ainda
não completamente esclarecido, o mecanismo parece envolver a diminuição da
expressão de Notch-1 (Haylock & Nilsson, 2006; Iwata et al., 2004), cuja via
está relacionada com a auto-renovação das HSC (Duncan et al., 2005; Karanu
et al., 2000; Stier et al., 2005), como veremos.
INTRODUÇÃO
57
Arai e colaboradores mostraram, em 2004, não somente a localização
específica de Ang-1 no nicho subendosteal, como também a presença de HSC
quiescentes que expressavam Tie-2+, receptor de Ang-1, e N-caderina,
sugerindo que a interação Ang-1/Tie2 seria importante para a ancoragem das
HSC no seu nicho e indução de quiescência. As vias de sinalização por trás do
processo de quiescência ainda não estão totalmente elucidadas, porém dois
mecanismos foram descritos. O primeiro é direto e baseado na propriedade de
Tie-2 como um receptor tirosina cinase, que, uma vez ativado através da
ligação com Ang-1, ativaria a via de Pi3-k (fosfatidil inositol-3 cinase)/Akt. Akt;
que, por sua vez, tem como um de seus alvos p21, proteína fundamental no
controle de ciclo celular, levando à estabilização desta e possivelmente inibindo
o ciclo celular. A outra possibilidade é uma ação indireta de Tie-2 devido à sua
ação estimuladora dos níveis de expressão de 1-integrina e N-caderina,
também via Akt (Gomei et al., 2010), consequentemente, aumentando a
adesão celular (Suda, Arai & Shimmura, 2005). Apesar da controvérsia (Kiel et
al., 2009), foi recentemente demonstrado que a adesão mediada por N-
caderina é necessária para a manutenção de hematopoiese de longa duração
após infusão sistêmica (Hosokawa et al., 2010).
A auto-renovação, uma característica de células-tronco, é um fenômeno
que pode ser dividido em 2 processos: indução de proliferação e manutenção
da célula progenitora indiferenciada. O controle de auto-renovação das HSC,
como a maior parte dos fenômenos biológicos, possui na realidade diversos
moduladores que conjuntamente produzem o efeito final. A decisão entre auto-
renovação e diferenciação é um processo refinado e complexo, e algumas
moléculas envolvidas neste controle incluem Notch-1 – e sua ligação com seu
INTRODUÇÃO
58
receptor –, Jagged-1 (Duncan et al., 2005; Karanu et al., 2000; Stier et al.,
2002), BMP-4 (Bone Morphogenic Protein-4), Sonic Hedgehog (Bhardwaj et al.,
2001) e ativação da via canônica de Wnt que será melhor explorada à frente
(Chiba et al., 2004; Murdoch et al., 2003; Reya et al., 2003).
Recentemente, um aspecto metabólico tem sido investigado. A região
subendosteal é um nicho hipóxico, enquanto as regiões mais centrais da
medula, nicho vascular, são ricas em oxigênio (Suda et al., 2005), levantando a
hipótese de que a sobrevivência das HSC em condições de hipoxia seria
necessária, pois a prevenção de senescência depende da inibição de estresse
oxidativo ocasionado por espécies reativas de oxigênio (ROS, Reactive Oxygen
Species). As células-tronco em geral apresentam baixa taxa de fosforilação
oxidativa e altos níveis de glicólise anaeróbica para síntese de ATP (Suda et
al., 2005). Níveis baixos de ROS foram observados nas HSC com maior
potencial de auto-renovação, que, em adição, apresentavam maior expressão
de N-caderina, Notch-1 e p21 (Jang & Sharkis, 2007). Além disso, as HSC
apresentam altos níveis de expressão de ATM, uma proteína responsiva à
estresse oxidativo que está envolvida na resposta a dano de DNA.
Camundongos nocautes para ATM apresentam HSC proliferativas, o que
levava a esgotamento da população, independente da atividade telomerase. O
efeito pôde ser revertido com o tratamento dos camundongos com anti-
oxidantes (Ito et al., 2004).
Resumindo: o nicho subendosteal possuiria três propriedades básicas:
ancoragem, indução de quiescência e auto-renovação. Por definição,
quiescência e auto-renovação seriam propriedades temporalmente
excludentes. Assim, as HSC passariam por ciclos de auto-renovação
INTRODUÇÃO
59
intercalados por períodos de quiescência e, desta forma, o nicho subendosteal
seria dinâmico e possuiria diferentes facetas temporais e espaciais. ―Todo o
progresso observado nos últimos anos no campo do nicho das HSC claramente
indica que a expansão clonal substancial das HSC in vitro inquestionavelmente
requer mais do que coquetéis de citocinas, ao invés disso requer uma
reconstrução tridimensional do nicho, incluindo as células apropriadas e matriz
extracelular para permitir a geração da sinapse no nicho da HSC‖ (Wilson &
Trumpp, 2006).
1.10.3. Migração na MO
A MO é um órgão dinâmico, pois as células hematopoiéticas migram
intensamente. Além da migração durante o processo de diferenciação, as HSC
circulam em condições fisiológicas, retornando a seus nichos na região
subendosteal (Wright et al., 2001).
A migração para o microambiente medular envolveria quatro etapas
básicas: rolamento sobre o endotélio, migração transendotelial, migração
transmedular e fixação em seu nicho (Fig.13) revisado por (Nilsson, Simmons &
Bertoncello, 2006). No entanto, os mecanismos envolvidos neste processo
ainda não foram completamente esclarecidos, tendo sido observada a
ocorrência de vias compensatórias, ou seja, o bloqueio de uma das vias é
ineficiente, pois outra mantém a migração, o que indica a complexidade do
processo de migração das HSC (Bonig, Priestley & Papayannopoulou, 2006).
Moléculas de adesão do tipo selectinas- P e E e VLA-4 estão envolvidas (Alon
et al., 1995; Hidalgo & Frenette, 2005).
INTRODUÇÃO
60
Figura 13. Homing da HSC para a MO, seguindo suas quatro etapas básicas:
rolamento sobre o endotélio (1), migração transendotelial, (2) migração transmedular (3) e fixação em seu nicho (4) (Nilsson et al., 2006).
O papel de pequenas proteínas GTPases, como Rho, Rac e cdc42, na
migração das HSC na MO também tem sido investigado em modelos
tridimensionais in vitro (Bug et al., 2002), assim como in vivo, onde observou-se
que as HSC derivadas de camundongos nocautes para Rac1 são incapazes de
reconstituir a hematopoiese medular de camundongos irradiados (Cancelas et
al., 2005).
A manutenção das HSC no nicho parece ser dependente do par
CXCL12/CXCR4, pois o tratamento com toxina pertussis (Ptx), que bloqueia a
proteína Gi associada a CXCR4, ou a clivagem de CXCL12 por elastases, gera
mobilização das HSC para o sangue periférico (Papayannopoulou et al., 2003;
Petit et al., 2002). A migração é orientada por um gradiente quimiotático
formado principalmente pela quimiocina CXCL12/SDF-1 secretada pelas
células estromais da MO de forma dependente de contato célula-célula via
conexinas 43 e 45 (Hidalgo et al., 2001; Nilsson et al., 2001; Schajnovitz et al.,
2011; Teixido et al., 1992). A interação de CXCL12 com seu receptor, CXCR-4,
expresso pelos progenitores hematopoiéticos, gera um aumento, nestes, da
INTRODUÇÃO
61
afinidade dos pares LFA-1/ICAM1, VLA-5/fibronectina e da expressão e
afinidade da integrina VLA-4 para VCAM1 e fibronectina, estimulando, assim, a
adesão celular e a migração transendotelial e ecotaxia (homing) (Hidalgo et al.,
2001; Peled et al., 2000).
A mobilização das HSCs de seu nicho na MO para a circulação,
classicamente induzida por tratamento com fator estimulador de colônias de
granulócitos (G-CSF, granulocyte-colony stimulating factor), parece depender
da modificação do gradiente de SDF-1α, tanto por diminuição de expressão,
quanto pela clivagem por proteases (elastase, catepsina G, catepsina K e
CD26) (Christopherson, Cooper & Broxmeyer, 2003; Lapidot, Dar & Kollet,
2005; Petit et al., 2002) revisado por Lapidot (Lapidot et al., 2005). Nestes
trabalhos, a capacidade de clivar SDF-1 das células propriamente ditas ou seus
sobrenadantes foi testada, em ensaios de cultivo com substrato cromogênico
ou até isolamento de fragmentos protéicos por HPLC, e análise por
espectrometria de massa, verificando-se a presença e caracterizando-se os
fragmentos. Desta forma, constatou-se que SDF-1 é clivado no seu domínio N-
terminal, perdendo sua atividade. No entanto, elastase e catepsina G também
são capazes de clivar CXCR4 (Lapidot et al., 2005). Posteriormente, ensaios
de migração ou homing demonstraram o efeito funcional sobre a célula. Foi
observado, por exemplo, que a inibição de CD26 aumenta em 30% o homing
de HSC murinas para a medula do receptor. Ensaios com CD34 humana em
condições de inibição de CD26 mostraram aumento da migração destas em
gradiente de SDF-1 (Christopherson et al., 2003; Lapidot et al., 2005). Porém,
outros mecanismos, como a já mencionada atividade de metaloproteinases,
também parecem ter papel relevante na modulação da migração das HSCs,
INTRODUÇÃO
62
embora ainda não completamente esclarecidos em humanos (Lapidot & Petit,
2002; Papayannopoulou, 2004; Rossi et al., 2005). Em 2006, Katayama e
colaboradores demonstraram a importância do Sistema Nervoso Simpático
(SNS) na mobilização das HSC. Sua ação parece ser mediada por neurônios
noradrenérgicos através da produção de β-antagonistas e β2-agonistas, cujo
balanço afeta os osteoblastos que são, então, modulados, retendo ou liberando
as HSC (mobilização). G-CSF induz, entre outros fenômenos, a liberação de
β2-agonistas pelos neurônios, que, por sua vez, suprimem a atividade dos
osteoblastos, diminuindo a expressão de diversos genes como Runx2,
colágeno-I e CXCL-12, esta última sendo responsável pela mobilização das
HSC. Desde 2002 já havia sido descrita a presença de receptores de diversos
neuropeptídeos em osteoblastos (Togari, 2002).
Este conceito parece inovador, porém, já em 1968 Calvo descreveu a
presença de fibras nervosas na MO e, em 1990, Yamazaki e Allen
descreveram os chamados complexos neuro-reticulares através de estudos
ultraestruturais que seriam junções comunicantes entre neurônios e células do
estroma da medula. Porém, naquela ocasião, nenhuma função foi atribuída a
esta interação. Até que ponto o SNS estaria modulando o comportamento dos
osteoblastos e células estromais, que participam da manutenção das HSC,
permanece um mistério. No entanto, como N-caderina, uma molécula de
adesão expressa em neurônios, é também expressa na subpopulação de
células que reveste internamente as trabéculas ósseas – as bone-lining cells
(Zhang et al., 2003), que são células estromais comprometidas com a linhagem
osteoblástica (Balduino et al., 2005), capazes de interagir com as HSC –,
suspeita-se que esta subpopulação seja selecionada e ativada por neurônios
INTRODUÇÃO
63
dentre os demais osteoblastos (Katayama et al., 2006). Este, portanto, é um
campo bastante interessante que deve se desenvolver nos próximos anos.
Ainda no ano de 2006, Kollet e colaboradores demonstraram a influência
de osteoclastos na mobilização de HSC. A administração de RANKL gerou um
quadro de osteoclastogênese, com aumento de expressão de proteases como
MMP-9 e catepsina K, levando a mobilização das HSC. Em camundongos
transgênicos para a proteína tirosina fosfatase,epsilon (PTPe), que apresentam
osteoclastos e macrófagos não funcionais, observou-se que a administração de
RANKL não era mais capaz de induzir mobilização, demonstrando assim a
importância direta dos osteoclastos no processo. Como a produção de RANKL
está relacionada com inflamação e reparo tecidual, foi sugerido que este pode
ser um mecanismo de mobilização para situações de emergência (Purton &
Scadden, 2006).
A capacidade de migração para a MO de diferentes fontes de HSC varia.
Assim, enquanto as células progenitoras de sangue periférico mobilizado e
sangue de cordão umbilical migram rapidamente para a MO, as células
derivadas de MO parecem apresentar menor capacidade de migração. No caso
das células progenitoras de sangue periférico, esta capacidade se reflete na
prática clínica, onde se observa rápido enxerto e recuperação precoce da
hematopoese (Bonig et al., 2006). Entre as hipóteses propostas para explicar
estas diferenças funcionais, recentemente verificou-se que CXCR4, o receptor
da quimiocina SDF-1a, que faz parte dos receptores do tipo serpentina
associados à proteína G, pode ser incorporado em microdomínios de
membrana enriquecidos em gangliosídios (GEMs) ou rafts lipídicos; o que, em
HSC, potencializa a migração para a MO. Esta associação de CXCR4 em
INTRODUÇÃO
64
microdomínios de membrana pode ser estimulada por microvesículas ou
produtos de plaqueta, presentes na leucaférese (Wysoczynski et al., 2005).
1.11. Modelos in vitro tridimensionais
Em 1887, Julius Richard Petri descreveu o crescimento de colônias de
bactérias em uma base gelatinosa em placas de vidro. Esta técnica, a primeira
de cultura de células, originou as técnicas modernas e tornou Petri
imortalizado, pois permitiu o desenvolvimento de várias áreas como
bacteriologia, microbiologia, biologia celular e molecular. A primeira descrição
de cultura de células animais foi feita por Harrison, em 1907. Estudando a
regeneração de tecidos em sapos (Xenopus), o autor estabeleceu uma cultura
em monocamada a partir de explante tecidual com o objetivo de diminuir as
variáveis e, assim, entender melhor as bases do comportamento celular
(Freshney, 2000). A partir destes estudos, as culturas de células animais se
tornaram amplamente difundidas. No entanto, são modelos de cultivo
bidimensional e, embora tenham contribuído grandemente para ampliar os
conhecimentos de biologia celular – e sejam o melhor modelo de estudo para
determinados protocolos experimentais –, eles estão longe de mimetizar o que
ocorre in vivo, onde as células estabelecem comunicações complexas num
microambiente tridimensional.
Atualmente, os pesquisadores, liderados pelos que trabalham na área de
neoplasias, estão defendendo a utilização de culturas tridimensionais, pois uma
série de publicações apresentou resultados distintos em ensaios em 2D versus
3D (Frankel, Buckman & Kerbel, 1997; Klunder & Hulser, 1993; Weaver et al.,
INTRODUÇÃO
65
1997). Posteriormente, foi detectado que culturas 3D estavam mais próximas
dos fenômenos que ocorriam in vivo (Weaver et al., 1997; Wolf et al., 2003a).
As células de mamíferos no seu ambiente natural não se conectam
apenas entre si, mas também a uma intrincada rede tridimensional de matriz
extracelular (MEC), que contém proteoglicanos, glicosaminoglicanos (GAGs) e
proteínas, como colágeno, elastina e laminina dando ao tecido suas
características físicas e arquitetura particular (Alberts B. & Walter, 2002).
A interação entre células e matriz é feita por receptores na membrana
plasmática chamados integrinas, que ancoram o citoesqueleto dessas
células à matriz extracelular (MEC) e desencadeiam vias de sinalização
devido a agrupamentos (clustering) e mudanças conformacionais na porção
intracelular da integrina, gerando sinal e modulação do comportamento da
célula em questão (Fig.14) (Boudreau & Jones, 1999; Schwartz, Schaller &
Ginsberg, 1995). Além disso, mudanças no formato celular, logo no
citoesqueleto, também acionam vias de sinalização intracelular (Lambert et
al., 2001). Um exemplo de comportamento influenciado pela sinalização por
integrinas e pelo formato celular é o controle da entrada no ciclo celular,
como demonstrado por Huang e Ingber, em 1999. Em um elegante
experimento, eles demonstraram que células endoteliais em contato com
fibronectina, sob forma de uma ou várias ilhotas com área de contato
constante de 30m2, apresentam comportamentos distintos. Quando pouco
espraiadas as células permaneciam em G1, enquanto que quando
plenamente espraiadas, como nas várias pequenas ilhotas, as células
entravam na fase S do ciclo celular. Como a área final era constante
(30m2), os autores propuseram que o formato celular por si só influenciaria
INTRODUÇÃO
66
o comportamento celular independentemente da ação de integrinas, que
estão igualmente ativadas em ambos os casos.
Eric Schaefer, PhD
Figura 14. Esquema de interação entre célula e matriz extracelular via integrinas,
mostrando algumas vias de sinalização influenciadas por este contato que alteram transcrição gênica. (Fonte:http://www.biocarta.com/pathfiles/m_integrinPathway.asp )
Estas duas variantes, contato com a matriz e formato celular, estão
profundamente ligadas ao surgimento das culturas 3D, pois uma das principais
vantagens desta forma de cultura é o restabelecimento destes dois fatores
como o encontrado in vivo. Em culturas 2D, as células estabelecem uma falsa
polarização, entre a porção aderida ao plástico e a porção superior em contato
com o meio de cultura. Esta polarização gera um formato celular espraiado e
completamente diferente do encontrado in vivo, ao contrário do que ocorre nas
INTRODUÇÃO
67
culturas em 3D, que permitem um formato assimétrico, próximo do real (Fig.15)
(Kunz-Schughart, 1999).
Figura 15. Esquema de cultura bidimensional e tridimensional. A cultura bidimensional
apresenta uma polarização artificial, enquanto a cultura tridimensional apresenta formato assimétrico sem polarização induzida (Barros, APDN).
Tradicionalmente, a adesão celular em monocamada induz a formação
de adesão focal, caracterizada pela fosforilação de cinases de adesão focal
(FAKs, focal adhesion kinasis). No entanto, este evento foi questionado, pois
em fibroblastos cultivados em 3D não se observou a formação de adesões
focais, nem fosforilação de FAKs, de forma semelhante ao observado in vivo
(Cukierman et al., 2001).
Outro exemplo de modulação da via de sinalização de integrinas
dependendo da complexidade do sistema foi mostrado pelo grupo de Bissel
(Weaver et al., 1997). Os autores foram capazes de reverter o fenótipo maligno
de células de carcinoma mamário em culturas 3D pela incubação destas com
X
2D 3D
INTRODUÇÃO
68
anticorpo anti-1 integrina. Este fenômeno foi confirmado in vivo, onde o
implante das células tratadas previamente com anticorpo mostrou uma redução
da tumorigenicidade caracterizada pela diminuição do tamanho dos tumores e
do número de camundongos com tumores. No entanto, o mesmo efeito não foi
observado em culturas bidimensionais (monocamadas).
A utilização de culturas 3D tem gerado modificações nos conceitos
estabelecidos de metástase e migração celular. Classicamente, a metástase
tumoral dependeria da secreção de enzimas que digerem moléculas de matriz
(metaloproteinases - MMPs), permitindo assim a sua migração para locais
secundários, através de protrusões membranares com formação de lamelipódia
(Palecek et al., 1997; Stetler-Stevenson, Aznavoorian & Liotta, 1993). Porém,
em muitos testes clínicos com administração de inibidores dessas enzimas não
se via resultados favoráveis, e as metástases continuavam se formando
(Overall & Lopez-Otin, 2002). Então, o grupo de Friedl (Wolf et al., 2003a) fez
culturas 3D – em gel de colágeno de linhagens incubadas com esses inibidores
– e observou que as células continuavam migrando através de movimento
amebóide, por entre as fibras de colágeno. A injeção dessas células em
camundongo e a análise por microscopia multifóton permitiram a observação
desses movimentos exatamente como nas culturas 3D, explicando assim os
resultados dos testes clínicos. O mesmo grupo descreveu recentemente a
importância do formato e rigidez nuclear durante processo de migração. Tal
efeito só pode ser visto por estudos conduzidos em matriz extracelular 3D
(Friedl, Wolf & Lammerding, 2010).
O grupo de Christopher Marshall (Sahai & Marshall, 2003) conseguiu
determinar que a via de sinalização envolvida nessa forma de migração era
INTRODUÇÃO
69
Rho / Rock, e não Rac, que está ligada à migração dependente de MMPs, com
formação de prolongamentos de membrana. A incubação com inibidores de
proteases, associados à inibidores de Rho e de Rock, bloqueou totalmente a
migração. Porém, quando só uma das vias foi inibida, a outra era ativada e a
migração continuava. Esta mesma forma de migração independente de MMPs
foi descrita em células não malignas como linfócitos T e células dendríticas
(Wolf et al., 2003b).
As culturas 3D estão sendo aplicadas em diversas áreas, como
bioengenharia tecidual e terapia gênica (Thompson et al., 2011). Foi descrita
uma técnica de cultura 3D em nanofibras protéicas que permite a diferenciação
de uma linhagem de célula-tronco hepática (Lig-8) para hepatócito maduro,
capaz de expressar enzimas características. Este fato não era obtido com a
manutenção desta linhagem em monocamada, onde as células se mantinham
indiferenciadas e apresentavam alta taxa proliferativa (Semino et al., 2003). Os
autores propuseram que o próximo passo seria a reconstrução de um
microambiente representando o nicho da célula-tronco no organismo, para
promover a auto-renovação de células-tronco extraídas do tecido. Nessas
mesmas nanofibras, células-tronco cardíacas foram cultivadas, apresentaram
um número maior de células incorporadas em relação a cultivos tradicionais e
maior resistência a forças compressivas também, sendo, assim, um modelo
promissor (Hosseinkhani et al., 2010).
Outra aplicação muito interessante desse tipo de nanofibras é a
possibilidade de controle da liberação de citocinas de forma gradual
adicionando mais uma grau de complexidade, do timing do sinal (Gelain,
Unsworth & Zhang, 2010). Anders e colaboradores, em 2003, estudando
INTRODUÇÃO
70
receptores de superfície celular para adenovírus em monocamada e culturas
3D de epitélio de mama normal e maligno, observaram que em monocamada a
expressão deste receptor é alta tanto nas células mamárias malignas quanto
nas células de mama normais, porém, nas culturas 3D, apenas as células de
carcinoma mamário apresentavam grande expressão deste receptor. Portanto,
o adenovírus é um possível vetor para a realização de terapia gênica em
células transformadas.
Não é surpreendente que há anos sutilezas biológicas têm sido perdidas
levando em conta que grande parte do conhecimento construído teve como
base o uso de monocamadas. E é através de culturas 3D que se pode observar
e estudar tais sutilezas. Sendo assim, o Instituto Nacional do Câncer dos EUA
(National Cancer Institute, NCI) previu o lançamento, em 2003, de um
programa em microambiente celular focado em estudos 3D, com um orçamento
anual de 40 milhões de dólares. Alguns acreditam que em 10 anos quem
estiver utilizando estudos 2D para responder suas perguntas terá sérias
dificuldades para conseguir financiamento (Abbott, 2003). Este investimento já
deu frutos, como, entre outros, o desenvolvimento de biorreatores que
permitem a organização tridimensional das células, favorecendo sua
diferenciação e formação de um microtecido com as características morfo-
funcionais do tecido original. Já foram desenvolvidos reatores de cartilagem,
osso, tendão, enxertos vasculares, entre outros (Abilez et al., 2006; Feng et al.,
2006; Huang et al., 2004; Mauney et al., 2004) ;(Boccafoschi et al., 2011; El Haj
& Cartmell, 2011).
INTRODUÇÃO
71
1.12. Esferóides (Multicellular Tumor Spheroids, MCTS)
Esta forma de cultura foi criada na década de 40 por J. Holtfreter e A.
Moscona, sendo em 1971 adaptada por Sutherland e colaboradores para
possibilitar um modelo in vitro de crescimento tumoral que permitisse testes
com drogas antitumorais (observando a penetração, ligação com o alvo e sua
ação), radioterapia e novas combinações de drogas e terapias (Kunz-
Schughart, 1999). Utilizando esta técnica, observou-se uma resistência a
terapias com radiação ionizante e drogas alquilantes, mediada pela
―conformação multicelular‖. A resistência do tumor murino EMT6 a estas drogas
pôde ser completamente revertida quando as células foram isoladas e
cultivadas em monocamada. Porém, se as células fossem mantidas em cultura
como a de esferóide, a resistência às drogas se reestabelecia (Graham et al.,
1994; Kobayashi et al., 1993).
Esta técnica é baseada no princípio de adesão celular. Assim, através
da formação de uma película inerte (não aderente) na superfície de cultivo, a
adesão ao plástico fica impossibilitada e as células aderentes passam a aderir
entre si, formando uma estrutura multicelular arredondada, os esferóides
(Kunz-Schughart, 1999; Kunz-Schughart, Kreutz & Knuechel, 1998; Mueller-
Klieser, 1997). Esta estrutura tridimensional reproduz com maior fidelidade as
características encontradas in vivo, pois contém uma extensiva matriz
extracelular que é diferente tanto na quantidade quanto na disposição dos seus
componentes em comparação com a matriz produzida pelas células em
monocamada (Kunz-Schughart, 1999). Em 2002, Layer e colaboradores,
estudando o comportamento de células da retina de embriões de galinha
cultivadas na conformação de esferóides, observaram uma reorganização
INTRODUÇÃO
72
histotípica absolutamente condizente com a organização de uma retina in vivo,
com a presença de todas as camadas organizadas. Apresentou, inclusive,
fotoreceptores organizados em rosetas após nove dias de cultura. Esta
reorganização não foi apenas devido ao posicionamento das células aplicadas
inicialmente, mas também devido a proliferação e diferenciação celular
ocorridas durante o cultivo ex-vivo (Layer et al., 2002).
Uma grande vantagem deste tipo de cultura é a possibilidade de criar um
ambiente tridimensional com diferentes tipos celulares e, portanto, estudar os
mecanismos de crescimento, proliferação e diferenciação celulares em um
modelo reprodutível com um ambiente interno ditado pelo metabolismo e pelas
respostas adaptativas das próprias células. Os MCTS possuem uma geometria
morfológica e fisiológica que modula características celulares como formato,
tamanho, distribuição de organelas, atividade enzimática (Kunz-Schughart et
al., 1998) e expressão gênica (Klunder & Hulser, 1993). Estes autores
compararam a expressão do gene de b-actina em células mantidas em
monocamada e em cultura tridimensional (esferóides) e observaram expressão
de b-actina na monocamada, enquanto que nos esferóides a maioria das
células era negativa. Este efeito era reversível, pois a dissociação dos
esferóides e o cultivo em monocamada induzia a expressão do gene de b -
actina.
Atualmente, este modelo vem sendo aplicado para avaliar o papel de
fatores do microambiente e outras variáveis epigenéticas nas células em
cultura, pois, como visto, o cultivo de agregados celulares esféricos restaura
características bioquímicas, morfológicas e funcionais do tecido original (Kunz-
Schughart, 1999; Kunz-Schughart et al., 2001; Kunz-Schughart et al., 1998).
INTRODUÇÃO
73
Além disso, este modelo permite a adição de diferentes tipos celulares para
analisar a interação deles (Korff et al., 2001; Kunz-Schughart et al., 2001;
Kunz-Schughart et al., 1998) e migração de um tipo celular para o interior do
esferóide de outro tipo celular (Bug et al., 2002; Kelm et al., 2005; Silzle et al.,
2003). Tudo isso pode ser realizado através de técnicas simples como
distribuição celular por etapas, distribuição simultânea ou fusão de esferóides
celularmente distintos (Kunz-Schughart et al., 1998). Os diferentes tipos
celulares podem então ser facilmente diferenciados por técnicas específicas.
De acordo com a literatura, modelo de esferóides permite a formação de
agregados multicelulares complexos com expressão de matriz extracelular e de
moléculas de adesão semelhantemente ao observado no tecido original (Kunz-
Schughart, 1999; Mueller-Klieser, 1997).
Considerando-se a importância das interações celulares na biologia
celular e como essas dependem de um microambiente complexo e
tridimensional, torna-se primordial desenvolver métodos de estudo que incluam
modelos tridimensionais. Além disso, modelos animais são fundamentais,
porém, apresentam limitações quanto ao estudo de passos isolados de
processos complexos e principalmente pelas diferenças entre espécies.
Recentemente, Muguruma e colaboradores demonstraram, nas quimeras com
camundongos NOD/SCID onde MSC humanas haviam sido previamente
injetadas em uma das tíbias, que as HSC de sangue de cordão umbilical
humano migravam preferencialmente para a tíbia, que possuía células
mesenquimais humanas, comprovando as limitações de xenoenxertos e
evidenciando a necessidade de modelos de cultura baseados em células
INTRODUÇÃO
74
humanas que permitam estudos mais complexos da fisiologia destas células
(Muguruma et al., 2006).
Em 2010, descrevemos o primeiro modelo in vitro tridimensional que
permitia, de fato, a reorganização celular para estudo de microambiente
hematopoético constituído exclusivamente com células humanas. Para tal,
utilizamos o modelo base de reagregados celulares esferóides (esferóides).
Construímos esses esferóides com células de estroma de medula óssea
humana e foi possível estabelecer um modelo que mimetiza o nicho
subendosteal, com centro de pré-osteoblastos recoberto por células de
estroma; que se mostrou funcional, possibilitando estudos de migração e
quiescência de progenitores hematopoéticos, uma propriedade fundamental do
nicho subendosteal. Este modelo foi importante pela sua descrição, na
comprovação da importância dos osteoblastos na indução de quiescência das
HSC, e na demonstração do papel das células estromais de medula no
regimento da migração das mesmas na medula óssea (de Barros et al., 2010).
Uma vez com este modelo em mãos, partimos para estudar linhagens tumorais
de mama sobre ele e para tentar entender o processo de surgimento das
micrometástases na medula óssea.
OBJETIVOS
75
2. OBJETIVO PRINCIPAL
Investigar o papel de galectina-3 e da via de WNT na migração de células
neoplásicas de mama em culturas tridimensionais multicelulares que
mimetizam o nicho subendosteal.
2.1. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS
Estabelecer modelo esferóide misto que reproduza propriedades do nicho
subendosteal.
Comparar capacidades de invasão de células mesenquimais de medula
óssea por células tumorais em relação a fibroblastos ou outras fontes de
célula mesenquimal.
Verificar correlação entre invasividade e perfil imonofenotípico, analisando
expressão de CD44 e CD24.
Isolar populações estáveis CD44 e CD24 para avaliar capacidades
invasivas, tumorigênicas e avaliar funcionalidade como célula-tronco do
câncer.
Verificar a importância de galectina-3 seja no microambiente ou
intracelular com o grau de invasividade das células tumorais.
Verificar a importância da via canônica de Wnt na invasividade tumoral e
capacidade de proliferativa das linhagens tumorais.
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
76
3. METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
3.1. Células e Amostras
Osteoblastos (HOB), fibroblastos de pele humanos (FPH), NG97ht
(linhagem de glioma humano), M3/38 (hibridoma – ATCC#TIB-166), TIB105
(hibridoma– ATCC#TIB-105), as linhagens de tumor de mama humano MCF-7
(ATCC#HTB-22™), MDA435 (ATCC#HTB-129™) e MDA468 (ATCC#HTB-
132™) foram obtidas no Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ, RJ,
Brasil). As linhagens de tumor de mama humano MDA231 (ATCC#HTB-26™) e
T47D (ATCC#HTB-133™) foram gentilmente cedidas pelo Prof. Roger
Chammas, da Faculdade de Medicina da USP. A MCF-7 é uma linhagem de
tumor não invasiva, a T47D é considerada pouco invasiva, enquanto as
linhagens MDA231, MDA468 e MDA435 são invasivas (Croker et al., 2009;
Imanishi et al., 2007; Lacroix & Leclercq, 2004; Phadke et al., 2006). As
linhagens de célula L controle (ATCC#CRL-2648™), célula L WNT 3A (clone
estável secretor de WNT3A - ATCC#CRL-2647™) e célula L WNT 5A (clone
estável secretor de WNT5A - ATCC#CRL-2814™) foram obtidas do American
Tissue Cell Culture Bank (ATCC). Amostras de sangue de cordão umbilical
humano (SC) foram obtidas de fetos nascidos a termo na maternidade Pró-
Matre do Rio de Janeiro. Amostras de medula óssea (MO) foram obtidas a
partir de aspirados da crista ilíaca de doadores voluntários da Unidade de
Transplante de Medula Óssea do Serviço de Hematologia Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho (HUCFF), da UFRJ. Amostras de tecido adiposo ou
lipoaspirados, ambos de parede abdominal, foram obtidas de pacientes adulto-
jovens hígidos submetidos a cirurgia plástica estética no HUCFF. Os
procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa do HUCFF,
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
77
processo nº 022/02. As células CD34+ foram purificadas por bilhas magnéticas
(CD34 Progenitor Cell Selection System, Dynal Biotech, Lake Success, NY,
USA), da fração mononuclear, obtidas por gradiente de Ficoll-PaqueTM Plus
(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), de sangue de cordão ou medula
óssea adulta. As células mesenquimais de medula óssea (MSC) foram obtidas
após hemossedimentação em Hespan® (hidroxietil de amido, McGaiy, Irvine,
CA, USA), seguindo-se o protocolo descrito anteriormente de Unidade
Formadora de Colônia de Fibroblasto (CFU-F) (Friedenstein, Gorskaja &
Kulagina, 1976). Resumidamente, as células de medula óssea foram
distribuídas em frascos de cultura com meio Dulbecco’s (Low-glucose, LGC
biotecnologia, São Paulo, Brasil) suplementado com 10% de soro fetal bovino
(SFB, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e antibióticos (100U/mL de Penicilina G
sódica e 100μg/mL de Estreptomiocina, ambos da Sigma, St. Louis, MO, USA).
As células foram incubadas a 37ºC com 5% de CO2 e, após 3-4 dias em
cultura, o sobrenadante foi retirado e as células aderentes mantidas até pré-
confluência, quando foram expandidas, após retirada enzimática, com 0,125%
de tripsina e 0,2g/L de EDTA (Sigma, St. Louis, MO, USA). As células
mesenquimais do estroma do tecido adiposo (TA) foram obtidas como descrito
(Zuk et al., 2001). Resumidamente, os fragmentos de tecido ou os
lipoaspirados foram incubados com colagenase tipo IA (Sigma,) a 1mg/mL
overnight a 4oC, em seguida colocados a 37oC em banho-maria, sob agitação
por 30 minutos e, após lavagem com salina tamponada, as células foram
ressuspensas em meio de cultura (Dulbecco’s Modified Eagle Medium-Low
Glucose, DMEM-LG; LGC ou Gibco) suplementado com 10% de soro fetal
bovino (FCS, fetal calf serum) e antibióticos (100 UI/ml de penicilina G sódica e
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
78
100 mg/ml de estreptomicina). Distribuídas em garrafas de cultura de 25cm2
(2,5x106 células) e mantidas a 37ºC com 5% de CO2 até o dia seguinte, as
células não aderentes foram retiradas por meio de lavagem com salina
tamponada e as células aderentes mantidas em cultura até semi-confluência e
expandidas, por até quinta passagens, para uso experimental.
3.2. Modelos Animais.
Foram utilizados nesse trabalho dois modelos animais, o C57BL/6
selvagem e nocaute (KO) para Galectina-3, e camundongos Balb/c NUDEs
para transplantes com células e teste de tumorigenicidade. Cada grupo constou
de animais com 8 semanas, sendo 6 camundongos selvagens para o gene da
galectina-3 e 6 animais nocautes de mesmo background genético, porém,
nocautes para o gene da galectina-3 (foram gentilmente cedidos pelo Dr. Fu-
Tong Liu-University of Califórnia, Davis). Os animais Specific Pathogen Free
(SPF) foram provenientes do Biotério central da Faculdade de Medicina da
USP. Agrupados em grupo de 3 animais por unidades micro-isoladoras,
mantidas em ―racks‖ com temperatura controlada entre 20oC a 25oC, e com
ciclo de fotoperíodo de 12/12 horas, dentro do Biotério de Experimentação da
disciplina de Oncologia, os animais receberam água e ração estéreis ad libitum
trocadas três vezes por semana para manutenção da qualidade SPF. Os
C57BL/6 que foram sacrificados tiveram os fêmurs e tíbias retiradas, com
posterior realização de lavagem da cavidade medular com meio DMEM. As
células foram dissociadas mecanicamente e distribuídas (1,5x107 células em
10mL) em garrafa de 25cm2 de cultura com meio Dulbecco’s (Low-glucose,
LGC biotecnologia, Rio de Janeiro, Brasil) suplementado com 15% de soro fetal
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
79
bovino (SFB, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e antibióticos (100U/mL de
Penicilina G sódica e 100μg/mL de Estreptomiocina, ambos da Sigma, St.
Louis, MO, USA). As células foram incubadas a 37ºC, com 5% de CO2, e
tiveram metade do meio trocado a cada 7 dias até o aparecimento das colônias
(CFU-F), quando o meio passa a ser completamente trocado a cada 3 dias e as
células aderentes mantidas até pré-confluência; quando foram expandidas,
após retirada enzimática, com 0,125% de tripsina e 0,2g/L de EDTA (Sigma, St.
Louis, MO, USA), para utilização experimental. Os animais Balb/c NUDEs
foram mantidos da mesma forma e utilizados após 8 semanas de idade para
transplantes de subpopulações celulares CD44+ e CD24+ derivadas da
linhagem T47D. Foram inoculadas de 1x105 até 1x106 células na mama dos
animais, que foram acompanhados, dia a dia. Após aparecimento do tumor, o
volume será determinado através da aproximação do formato tumoral à figura
de uma elipse e medida por paquímetro. Os animais foram sacrificados após 6
semanas do inóculo das células e os tumores fixados em paraformaldeído
tamponado 4%, para posteriores análises histológicas. Todos os
procedimentos foram executados de acordo com as normas éticas
estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e
aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de
Medicina-USP. Número do Comitê de Ética em Pesquisa da FMUSP: 0995/09.
3.3. Indução de diferenciação para a linhagem osteogênica e
desenvolvimento de reagregados esferóides multicelulares.
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
80
As células foram induzidas para a linhagem osteogênica com meio
indutor, ou seja, Dulbecco’s suplementado com 10% de SFB e antibióticos
contendo 10mM de -glicerofosfato (Sigma, St. Louis, MO, USA), 50M de
ácido ascórbico (Sigma, St. Louis, MO, USA) e 10-7M de Dexametazona
(Decadron, Prodome Química e Farmacêutica Ltda). As culturas foram
mantidas por 7 dias com trocas de meio em dias alternados. Para a formação
dos esferóides, poços, com fundo em “U”, de uma placa de 96 poços, foram
previamente recobertos com uma película de agarose (Sigma, St. Louis, MO,
USA) a 1% e as células foram distribuídas nas placas após polimerização da
agarose. Para formação de esferóides simples, 2,5 x 104 células mesenquimais
de MO, induzidas ou não, células mesenquimais de TA, fibroblastos de pele
humana (FPH) ou linhagens de osteoblastos (HOB), foram distribuídas em
cada poço, em meio Iscove's suplementado com 10% de SFB e antibióticos. As
células foram incubadas a 37oC com 5% de CO2 por um período mínimo de 4
dias. Para formação de esferóides multicelulares mistos, foram distribuídas
1,25 x 104 células mesenquimais de MO induzidas e, após a formação do
esferóide, 1,25 x 104 células mesenquimais de MO não induzidas foram
distribuídas sobre estes. A cultura foi mantida a 37ºC com 5% de CO2 por, no
mínimo, 24 horas. Para identificação dos diferentes tipos celulares, as células
induzidas para pré-osteoblasto foram previamente marcadas com CM-DiI como
descrito abaixo.
3.4. Detecção de células apoptóticas nos esferóides
Núcleos apoptóticos serão detectados por TdT-mediated dUTP terminal
nick-end labeling kit (TUNEL, ApopTag® Plus Fluorescein In Situ Detection Kit,
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
81
Chemicon, USA), sendo que os núcleos serão contracorados com DAPI
(1g/mL) e observados em microscópio de fluorescência Axiovert (Zeiss).
3.5. Rastreamento celular
Para identificação das diferentes populações celulares, estas foram
marcadas com CFSE (5-(e 6-)-carboxifluoresceína diacetato succinil éster), que
é excitado em 488nm e emite em 517nm, ou com CM-DiI, um derivativo do 1,1-
didodecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI-C18), excitado em
546nm e que emite em 570nm, ambos da Molecular Probes, Invitrogen
Eugene, OR, USA. As células CD34+, isoladas de SC ou MO, e as linhagens
de tumor de mama foram marcadas com CSFE, na proporção de 2-5 x 106
células em suspenção para cada 1mL de solução com 5-10M de CFSE em
PBS 0,1% BSA. Após 10 minutos em agitação no banho-maria a 37°C, as
células foram lavadas duas vezes com PBS 10% SFB e ressuspensas em meio
apropriado para cultivo. A monocamada de células mesenquimais do estroma
da MO osteo-induzidas foram, como já dito, marcadas com CM-DiI,
adicionando-se solução de 2g/mL de CM-DiI diluído em meio com soro (3mL
em garrafa de 25cm2 ou 5mL em garrafa 75cm2). A monocamada foi mantida a
37oC por 5 minutos e, em seguida, colocada no gelo por 15 min, sob proteção
da luz ambiente. Finalmente, as células foram lavadas quatro vezes com PBS
morno, tripsinizadas e ressuspensas em meio de cultura.
3.6. Co-cultivo das linhagens de células de tumor de mama e esferóides
de células mesenquimais do estroma da MO ou de FPH - Fusão, co-cultivo
simultâneo e co-cultivo sucessivo
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
82
No método de fusão, dois esferóides pré-formados (de linhagens
tumorais e de células estromais) foram colocados em poços em U previamente
revestidos com agarose para interagir, sendo acompanhados ao longo do
tempo. Esta metodologia tem sido utilizada para estudos de invasão celular
(Kunz-Schughart, 1999). O método de co-cultivo simultâneo foi desenvolvido
distribuindo-se duas populações celulares, seguindo certa proporção, linhagens
tumorais e células estromais (mesenquimais do estroma de MO ou FPH) nos
poços de fundo em U previamente recobertos com agarose. Este método pode
ser chamado de teste de afinidade, já que populações afins geram esferóides
coesos com mistura das células, enquanto populações não afins geram
esferóides com segregação das células (Layer et al., 2002; Wirz et al., 2008). O
método de co-cultivo sucessivo foi estabelecido desenvolvendo-se um
esferóide “suporte” ou “originador de microambiente”, formado pelas células
estromais, sobre o qual a célula-alvo (células CD34+ de SC e MO ou linhagens
tumorais) foi distribuída. Este modelo favorece o estudo do potencial de
migração ou invasão de populações celulares que não são capazes de
desenvolver esferóides (Kunz-Schughart, 1999).
3.7. Migração de células CD34+ e ensaio de invasão de linhagens
tumorais de mama em esferóides.
Após a formação dos esferóides, estes foram co-cultivados com 2-3 x
104 células CD34+ de SC, ou MO, ou com 3 x 103 células das linhagens de
tumor de mama, previamente marcadas com 5m (CD34+) ou 10m
(linhagens tumorais) de CFSE, por até 72h. Após 4, 16, 24 e 48h de co-cultura,
as células no sobrenadante de duplicatas de pool de três esferóides por ponto
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
83
foram retiradas e os esferóides foram lavados com PBS e dissociados por
digestão enzimática com tripsina-EDTA para análise por citometria de fluxo. As
células foram quantificadas em hemocitômetro e a mortalidade foi determinada
pelo método de exclusão com azul de tripan. Alguns esferóides foram mantidos
íntegros para análise morfológica (microscopia óptica, confocal e eletrônica).
Para verificar se havia circulação das células CD34+, células não marcadas
foram distribuídas sobre os esferóides mistos. Após 24h de cultura, as células
do sobrenadante foram retiradas e os esferóides foram lavados como descrito.
Em seguida, células CD34+ marcadas com CFSE foram distribuídas sobre os
esferóides, que foram mantidos em cultura por mais 48h. O sobrenadante e os
esferóides dissociados foram analisados após 24h e 48h por citometria de fluxo
e o percentual das populações CD34+ marcadas e não marcadas foi
determinado.
3.8. Citometria de fluxo e análises de migração e proliferação celular
Suspensões celulares dos co-cultivos com esferóide, obtidas por
dissociação enzimática, e dos sobrenandantes destes, foram lavadas com PBS
contendo 3% de SFB e 0,01% de azida sódica (tampão de FACS). Para análise
da migração de células CD34+ de SC ou MO, as suspensões foram incubadas
com anticorpo anti-CD34 conjugado a PE (clone 8G12, BD Bioscences) por 30
minutos, a 4ºC e, após este período, lavadas com tampão de FACS. No caso
das linhagens de tumor de mama, as células eram previamente marcadas,
como já explicado, co-cultivadas com os esferóides, dissociados
enzimaticamente, lavados com tampão de FACS. Todas as células foram
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
84
ressuspensas rigorosamente em 400 μl de tampão de FACS para aquisição em
citômetro de fluxo, estabelecendo-se o tempo como parâmetro da aquisição.
Para imunofenotipagem das linhagens tumorais, as suspensões
celulares obtidas pela digestão enzimática das monocamadas foram lavadas
em tampão de FACS e linhagens incubadas com anticorpo anti-CD24 e CD44
conjugado à PE (clone ML5, Caltag) ou APC (clone IM7, E Bioscences),
respectivamente, a 4ºC, por 30 minutos, e lavadas com tampão de FACS.
Além disso, células CD44-CD24+ ou CD44+CD24- marcadas foram
ressuspensas em PBS com 10% SFB, filtradas em malha de nylon com poros
de 70µm e, em seguida, com auxílio do aparelho MoFlo High-Performance Cell
Sorter, as células foram selecionadas. As populações separadas foram
cultivadas para expansão e acompanhamento de imunofenótipo, ou cultivadas
em matrigel sobre os esferóides, ou ainda transplantadas em animais Balb/C
NUDEs, como já explicado.
Para análise da proliferação das MSC de MO nos esferóides, a
expressão do antígeno nuclear Ki67 foi investigada por citometria de fluxo,
como descrito (Zupo et al., 1994). Resumidamente, a suspensão celular obtida
por dissociação enzimática dos esferóides foi fixada com paraformol
tamponado a 1%, por 40 minutos a temperatura ambiente (TA). Após a fixação,
as células foram permeabilizadas com etanol 70% a –20ºC por 1 hora, lavadas
com tampão de FACS, incubadas com anticorpo anti-Ki-67 conjugado a FITC
(clone mib1, BD Bioscences) a 4ºC, por 1 h, e lavadas com tampão de FACS.
A proliferação das células CD34+ de SC ao longo da cultura foi avaliada pela
técnica de incorporação de bromo-deoxiuridina (BrdU, Sigma Chemical Co.).
No momento da adição de células CD34+ sobre os esferóides, 10μM de BrDU
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
85
foi acrescentado na cultura e o meio foi trocado de 2 em 2 dias. Após 48h e 7
dias de co-cultura, o sobrenadante foi coletado e os esferóides dissociados,
como descrito. Após marcação de superfície, as células foram fixadas com
paraformaldeído 1% e permeabilizadas com etanol 70% gelado, como descrito
anteriormente. Em seguida, as células foram lavadas e incubadas por 30
minutos, a 25ºC, em solução de 0,15M de NaCl com 100 U/mL de DNAse
(Worthington Biochemical Corporation®), 4,2 mM de MgCl2 e 10 μ M de HCl.
Após lavagem, as células foram incubadas com anticorpo anti-BrdU FITC
(clone B44, BD) por 20 minutos a TA e lavadas com tampão de FACS. A
aquisição foi feita em FACSCalibur com software CellQuest 3.1 e as análises
foram feitas utilizando o programa livre WinMDI 2.8
(http://facs.scripps.edu/software.html).
3.9. Cultivo em Matrigel
Após a seleção das subpopulações a serem testadas pelo MoFlo High-
Performance Cell Sorter, poços de placas de 48 poços foram recobertos com
100 µl de Matrigel (BD MatrigelTM Basement Membrane Matrix, BD
Biosciences, Bedford, MA,EUA). A placa foi mantida a 37ºC com 5% de CO2,
por 30 minutos, para a polimerização do Matrigel. As células tumorais foram
ressuspensas em meio Iscove’s suplementado com 20% SFB e 2% de
Matrigel e 2,5 x 104 células em um volume de 200 µl, e aplicadas sobre a
camada de Matrigel polimerizada. A cultura foi mantida a 37ºC com 5% de
CO2 durante 10 dias. As trocas de meio foram realizadas a cada dois dias.
Após 10 dias a cultura foi fixada em paraformaldeído tamponado a 4% (Vetec
Química Fina, Duque de Caxias, RJ, Brasil), por 30 minutos. Os poços foram
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
86
lavados com PBS e, em seguida, as células foram coradas com TO-PRO®-3
(Invitrogen – Molecular Probes).
3.10. Análise histológica e ultraestrutural
Os esferóides íntegros e tumores retirados dos animais foram fixados
em paraformaldeído tamponado a 4% e processados rotineiramente para
inclusão em parafina. O material foi desidratado em concentrações crescentes
de álcool (70%, 100% por duas vezes) por 20 minutos (para esferóides) e 40
minutos (para tumores) cada. Após a desidratação, o material foi imerso em
Xileno, em dois banhos de 20 minutos (para esferóides) e 40 minutos (para
tumores cada. Em seguida, o material foi imerso em Parafina purificada em
dois banhos de 20 minutos (para esferóides) e 40 minutos (para tumores) cada,
a 58ºC. Os blocos de parafina foram cortados com 5μm de espessura em
micrótomo (Lupe ―820‖ Spencer Microtome). Os cortes foram desparafinados,
reidratados e corados rotineiramente com Hematoxilina e Eosina-Floxina (H-E).
Para os esferóides também foi realizada coloração picrossírius modificado para
observação além de luz não polarizada e polarizada, observação por confocal
(Dolber & Spach, 1993). Para microscopia eletrônica de transmissão (MET), os
esferóides foram fixados em Glutaraldeído 2,5%, em tampão cacodilato 0,1M
3,5% sacarose, por 1 hora no gelo. Em seguida, foram pósfixados com uma
solução de ósmio-ferrocianeto, em tampão cacodilato 0,1M 3,5% sacarose,
desidratados com séries crescentes de acetona, incluídos em resina Epon 812
(MET) e cortados em ultramicrótomo (Ultracut, Leica SUCT). Os cortes
semifinos foram colocados sobre lâmina de vidro e corados com azul de
toluidina, e os cortes ultrafinos foram colocados sobre grades de cobre com
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
87
300-mesh, contrastados com citrato de chumbo e acetato de uranila, e
examinados em um microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 10C.
3.11. Imunohistoquímica para Galectina-3, CD24, CD34+ ou Pan-
citoqueratina (Pan-CK)
Os cortes de parafina foram desparafinizados com banhos sucessivos de xilol,
depois hidratados em concentrações decrescentes de etanol e finalmente em
água destilada. Após lavagem em PBS foi realizada recuperação antigênica em
tampão citrato pH6 a 90oC, por 15 minutos, seguida de inibição de peroxidase
endógena com banho em solução 50% de H2O2 em metanol, por 10 minutos.
Os cortes foram lavados com PBS e os sítios inespecíficos de ligação de
imunoglobulina foram bloqueados com PBS BSA 5%, Triton X100 0,5%, por 30
minutos. Em seguida, os cortes foram incubados com os seguintes anticorpos
primários: anti-Galectina-3 humana (meio condicionado derivado de linhagem
M3/38), anti-CD24 (Santa Cruz, CA, USA), anti-pan-CK mouse anti-human
(Sigma, St. Louis, MO, USA), que reconhece as citoqueratinas 1, 4, 5, 6, 8, 10,
13, 18 e 19, ou camundongo anti-CD34 humano (clone QBEND10, Biogenex,
San Ramon, CA), diluídos em PBS-BSA1% overnight na geladeira em câmara
úmida. Após 3 lavagens de 5 minutos com PBS Tween 0,25% pH7,4, os cortes
foram incubados com EnVision™+ System, Peroxidase (DAKO EnVision™+
System, HRP) ou Novolink™ Polymer Detection System (Novocastra
Laboratories) por 1h a TA em câmara úmida. Após duas lavagens com PBS
Tween 0,25% pH7,4, foi realizada incubação com DAB (Liquid DAB da DAKO)
até a revelação em, no máximo, 10 minutos. Após uma lavagem com PBS
Tween 0,25% pH7,4 e outras duas com água destilada, de 5 minutos cada, os
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
88
cortes foram contracorados com Hematoxilina diluída (1:3), por 5 minutos. Os
cortes foram lavados em água corrente por 10 minutos e diferenciados
rapidamente em solução de HCl 0,5%. Em seguida, foram desidratados em
concentrações crescentes de etanol, lavados em Xilol e as lâminas montadas
em entellan (MERCK).
3.12. Imunofluorescência e Microscopia Confocal
Os esferóides foram fixados com paraformaldeído 4% tamponado por 6h
e, em seguida, incubados com sacarose 15% (overnight), sacarose 30% (6h),
incluídos em OCT (tissue teck), congelados e cortados em criostato (Leica CM
1850). Após lavagem com PBS, para análise de moléculas de matriz
extracelular, os cortes foram previamente incubados com PBS-Triton X 0,01%
durante 15 minutos. Já para localização das células tumorais, os cortes foram
incubados PBS-Triton X 0,2% por 15 minutos. Seguindo lavagem com PBS e
bloqueio dos sítios inespecíficos com solução de BSA 5% em PBS por 1h. As
lâminas foram incubadas por 16h, a 4ºC, em câmara úmida, com os seguintes
anticorpos primários: (i) coelho anti-fibronectina (Sigma Chemical Co.) dilluído
1:400, (ii) camundongo anti-colágeno I (Sigma) dilluído 1:1000, (iii) coelho anti-
laminina (Sigma Chemical Co.) dilluído 1:50, (iv) cabra anti-osteopontina (Santa
Cruz) dilluído 1:1000, (v) camundongo anti-colágeno IV dilluído 1:50 (Sigma
Chemical Co.) e (vi) anti-pan-CK dilluído 1:100 (Sigma) em PBS 0,1% BSA. As
lâminas foram lavadas com PBS e incubadas, por 60 minutos a TA, com os
anticorpos secundários específicos conjugados a Alexa 488 ou 546 (Molecular
Probes). As lâminas foram lavadas e, em seguida, incubadas com 4’,6-
diamidino-2-fenilindole (DAPI, Sigma Chemical Co.) ou TOPRO-3 (Molecular
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
89
Probes), 1:5000 (NACl 0.9%) por 5 minutos TA ou 1:1000 (PBS) por 1h a TA,
respectivamente. As lâminas foram montadas em vectashield ou N-propil-
galato (meios anti-fading) e observadas em microscópio de fluorescência
(Nikon, Eclipse E400) ou em microscópio Confocal LSM 510 Meta (Carl Zeiss).
3.13. Efeito de Galectina-3 na migração das linhagens tumorais
Galectina-3 foi neutralizada nos esferóides pela incubação destes, por
48h, com meio suplementado com 20% de meio condicionado obtido de
hibridomas secretores de anti-Gal3 humano/murino (M3/38) ou anti-CD8
humano (ATCC#TIB105) como controle não-relacionado. O anticorpo anti-Gal3
produzido por M3/38 não reconhece o sítio de ligação da Gal-3 com substratos
glicoconjugados, e sim uma série de repetições no sítio N-terminal; sítio este
fundamental para o processo de cooperação positiva ou ―positive cooperativity‖,
processo bioquímico no qual a interação de um ligante em um sítio aumenta a
afinidade da molécula por um segundo ligante, neste caso, os glicoconjugados,
que logo bloqueiam as ligações cruzadas (Massa et al., 1993; Sackett & Saroff,
1996; Schaffert, Pour & Chaney, 1998). O meio condicionado foi obtido pelo
plaqueamento dos hibridomas em garrafas de 25cm2 com 10mL de meio RPMI
20% SFB, na concentração de 105 células/mL. As culturas foram mantidas por
4 dias e, após esse período, o sobrenadante foi coletado, centrifugado a
3000rpm por 30 minutos, filtrado, aliquotado e congelado a -20°C.. Após a
incubação dos esferóides com 20% de meio condicionado dos hibridomas por
24h, o meio foi então trocado por novo meio com 20% de meio condicionado
para mais 24h, completando um total de 48h de bloqueio do microambiente.
Células tumorais foram distribuídas sobre estes esferóides em meio
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
90
convencional e, após 16h de co-cultura, a invasão foi avaliada por citometria de
fluxo, como descrito.
Outra estratégia foi utilizar esferóides de células de estroma de medula
óssea derivadas de camundongos C57BL/6 selvagens e nocautes para
Galectina-3 (gal3-/-), cujo protocolo de estabelecimento já foi descrito. Após a
formação dos esferóides, as linhagens tumorais foram co-cultivadas com os
mesmos por 16h e o percentual de células capazes de invadir os esferóides foi
determinado por citometria de fluxo, como descrito.
3.14. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western
Blotting
3.14.1. Extratos fracionados de proteínas solúveis e insolúveis em
Triton X-100
Para preparação de extratos enriquecidos em citoesqueleto e
membranas (fração insolúvel), ou em citoplasma e núcleo (fração solúvel),
utilizou-se o protocolo descrito (Goichberg et al., 2001). As células foram
distribuídas em placas de 60 mm2, 106 células por placa, e mantidas em cultura
por 48h. A monocamada foi incubada com 500 µL de tampão MES (MES a 50
mM pH 6,0), contendo Triton X-100 a 0,5%, EGTA a 2,5 mM, MgCl2 a 5 mM de
inibidores de proteases (aprotinina a 1mg/ml; leupeptina a 1 mg/ml; pepstatina
a 1mg/ml; PMSF a 1mM; fluoreto de sódio a 1mM e ortovanadato de sódio a
1mM, todos da Sigma-Aldrich), por 2 minutos, à temperatura ambiente e sob
agitação. Em seguida, o sobrenadante (fração solúvel) foi recolhido e diluído na
proporção de 1:1 em tampão de amostra para SDS-PAGE (Tris-HCl 125Mm,
pH 6,8; SDS a 4%; glicerol a 20%; β-mercaptoetanol a 10% de azul de
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
91
bromofenol a 0,002%), como descrito (Laemmli, 1970). Na mesma placa,
adicionou-se mais 500 µL de tampão MES e a monocamada foi raspada. Este
extrato (fração insolúvel) foi diluído em tampão de amostras para SDS-PAGE,
conforme citado anteriormente. Posteriormente, ambas as frações foram
incubadas a 100ºC, por 3 minutos, e mantidas a -20ºC até o uso.
3.14.2. Extratos fracionados de citoplasma e núcleo.
As frações de núcleo e citoplasma foram obtidas utilizando-se o kit de
fracionamento celular NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents
(Pierce, Rockford, IL). Todo o protocolo foi realizado seguindo as instruções do
fabricante. Resumidamente, as células foram distribuídas em placas de 60
mm2, 106 células por placa, e mantidas em cultura por 48h. Após este período,
as células foram removidas com solução de tripsina e contadas. Ao sedimento
foram acrescentados 100 µL do reagente de extração citoplasmático I (CER I)
contendo inibidores de proteases (ver item 4.12.1). As amostras foram
vortexadas por 15 segundos, em velocidade máxima, e incubadas no gelo por
10 minutos. Terminada esta etapa, adicionou-se 5,5 µl do reagente de extração
citoplasmático II (CER II), vortexando novamente, por mais 5 segundos, e
incubando no gelo por mais 1 minuto. Em sequência, as amostras foram
vortexadas por 5 segundos e centrifugadas a 16.000 x g, por 5 minutos, a 4ºC.
O sobrenadante foi coletado (extrato citoplasmático) e diluído na proporção de
1:1 em tampão de amostra para SDS-PAGE como descrito anteriormente. O
sedimento nuclear obtido foi ressuspenso em 50 µl do reagente de extração
nuclear (NER), contendo inibidores de proteases, e vortexado por 15 segundos
em velocidade máxima. Em seguida, as amostras foram incubadas no gelo por
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
92
40 minutos, sendo vortexadas a cada 10 minutos. Após esta etapa, as
amostras foram centrifugadas a 16.000 x g por 10 minutos, a 4ºC. O
sobrenadante (fração nuclear) foi coletado e diluído como descrito acima. Por
fim, as amostras foram incubadas a 100ºC por 3 minutos e mantidas a -20ºC
até o uso.
A dosagem de proteínas das amostras foi realizada pelo método de
Bradford (ver item 4.13), utilizando-se uma alíquota dos extratos sem tampão
de amostra. Para eletroforese, utilizou-se 15g por amostra.
3.14.3. Quantificação de proteínas pelo Método de Bradford
Para este procedimento utilizou-se o reagente de Bradford (Sigma-
Aldrich) e o protocolo foi realizado segundo especificado pelo fabricante. As
amostras, em duplicata, foram diluídas na proporção de 1:30 em reagente de
Bradford e incubadas por 5 minutos. Em seguida, realizou-se a medição
fotométrica das soluções em comprimento de onda de 595 nm. Para a
determinação das concentrações proteicas, realizou-se uma curva-padrão com
soluções de albumina bovina em concentrações conhecidas. A partir da reta
obtida, as concentrações das amostras teste foram determinadas em função
dos valores de absorbância obtidos nas respectivas leituras.
3.14.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida e Western Blotting
Quantidades iguais de cada amostra foram aplicadas em gel de
poliacrilamida a 12% em condição desnaturante (SDS-PAGE) como descrito
(Laemmli, 1970). As eletroforeses foram realizadas sob corrente constante.
Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para folhas de PVDF
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
93
(Milipore, São Paulo, Brasil), de acordo com o descrito por Towbin e
colaboradores (1979), com modificações (Towbin, Staehelin & Gordon, 1979).
O gel foi colocado no tampão de transferência (Tris a 25 mM, glicina a 191 mM
e metanol a 20%), por 20 minutos. A folha de PVDF foi lavada por 10 segundos
em metanol a 100%, colocada em água destilada por 5 minutos (sob agitação)
e depois por 10 minutos em tampão de transferência. Em seguida, as proteínas
foram transferidas eletroforeticamente para a folha de PVDF, overnight, a 40 V
e a 4°C. As proteínas imobilizadas na PVDF foram imediatamente bloqueadas
por 1h, à temperatura ambiente, com uma solução de leite em pó desnatado a
5% (Molico) em tampão TBS-Tween (Tween a 0,001%). Em seguida, a
membrana foi incubada com anticorpo primário específico, anti-Gal3 (M3/38 -
diluído 1:20) ou anti -catenina (coelho anti-humano, AbCam#16051,
Cambridge, MA, USA), diluído neste mesmo tampão, overnight, a 4°C. Após a
incubação, a PVDF foi lavada quatro vezes, por 10 minutos cada, com TBS-
Tween. Em sequência, incubou-se com o anticorpo secundário anti-IgG
específico conjugado à peroxidase diluído 1:5000 (Sigma ou Amersham
Biosciences), diluído em tampão TBS-Tween, por 1 hora, a temperatura
ambiente e sob agitação. Após quatro lavagens de 10 minutos cada, a PVDF
foi submetida à revelação por DAB 0,006% em água contendo peróxido de
hidrogênio (Sigma - 5 L para cada 7 mL) ou Super Signal West Pico ECL
Pierce Kit (Pierce) e todo o procedimento foi feito segundo o protocolo do
fabricante.
3.15. Papel da via de Wnt canônica e não-canônica na migração e
proliferação das linhagens tumorais
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
94
Para investigar o papel da via de WNT na biologia das linhagens de
tumor de mama humano foram desenvolvidas duas estratégias: (1) As células
foram tratadas com meio de cultura suplementado com 10% de meio
condicionado enriquecido em Wnt3a, ou Wnt5a e controle. O meio
condicionado foi obtido distribuindo-se células L controle, L WNT 3A ou L WNT
5A, previamente selecionadas com neomicina, em garrafas de 75cm2 com 14
mL de meio DMEM 10% SFB, na concentração de 1,34 x 106 células. As
culturas foram mantidas por 4 dias e, após esse período, o sobrenadante foi
coletado, centrifugado a 3000rpm, por 30 minutos, filtrado, aliquotado e
congelado a -20°C. Para os ensaios de invasão, as células tumorais foram
incubadas com 10% dos referidos meios condicionados por 48h. Após este
período as células foram co-cultivadas com os esferóides de células de
estroma por 16h na presença dos respectivos meios condicionados e a análise
foi feita por citometria de fluxo, como descrito. (2) As células foram
transfectadas com plasmídeos moduladores da via de Wnt, -catenina
selvagem (Plasmid 16828: human beta-catenin pcDNA3), -catenina mutada
(S33Y –Plasmid 19286: pcDNA3-S33Y beta-catenin) e TCF-4 mutado (-TCF4
–Plasmid 16513: pcDNA/Myc DeltaN TCF4), todos da Addgene (Cambridge,
MA, USA; www.addgene.org). (3) Para bloqueio farmacológico da via, as
células tumorais foram pré-incubadas por 24h com 100M de Quercetina e
plaqueadas sobre os esferóides em contato com a droga.
3.15.1. Caracterização e Linearização dos plasmídeos e transfecção
A identidade dos plasmídeos foi confirmada por digestão com enzimas
de restrição que liberassem o gene do vetor (backbone) e permitissem assim a
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
95
análise do tamanho da banda liberada. Seguindo-se os mapas, os plasmídeos
de β-catenina selvagem (20µg) e β-catenina mutada S33Y (20µg) foram
digeridos com BamHI por 2h e XhoI por 10 minutos, em tampão NEB 3 (New
England Biolabs inc.), na presença de BSA (0.10 mg/ml), em volume final de
20µL. O plasmídeo Δ-TCF4 (20µg) foi digerido apenas com BamHI por 2h em
tampão NEB 3 (New England Biolabs inc.), na presença de BSA (0.10 mg/ml),
em volume final de 20µL. Posteriormente, os produtos da digestão foram
aplicados em gel de agarose 1% com SYBR® Safe DNA gel stain 10,000X
(Invitrogen). Os plasmídeos foram linearizados com digestão por enzima Pvu1
nas mesmas condições descritas anteriormente, cortando os plasmídeos em
um único ponto não codificante. Esta estratégia foi utilizada porque foi
recentemente demonstrado que plasmídeos linearizados aumentam a
possibilidade de integração estável no genoma (Stuchbury & Munch).
A transfecção foi realizada cultivando-se as células com 90 a 95% de
confluência (6x 104 células/poço) em poços de placa de 24 cm2, em meio sem
soro e sem antibióticos. O protocolo de transfecção com lipofectamina 2000 foi
realizado preparando-se uma mistura desta (0,8µL por poço) com solução de
DNA (plasmídeo -0,8µg por poço) em meio sem soro, na proporção de 1:1.
Esta mistura foi gentilmente homogenizada e incubada por 20 minutos, a
temperatura ambiente, perrmitindo assim a formação dos lipoplexos. Estes
possuem 6h de estabilidade e, sendo assim, foram imediatamente colocados
em contato com as células, que foram então mantidas na estufa de CO2 a
37ºC, pelo perído acima citado. Em seguida, o meio de cultura foi trocado para
meio com 10% de SFB e antibiótico. As células foram mantidas na estufa para
sua recuperação, overnight. Porém, para análise de expressão do transgene foi
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
96
necessário aguardar de 24 a 48 horas antes de dar inicio a seleção por
Neomicina (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1mg/mL por 7 dias. Após esse
período a maior parte das células havia morrido porém todas as restantes, que
se mostraram resistentes ao antibiótico foram expandidas para uso nos
protocolos experimentais. Não foi realizada subclonagem. Apenas de tempos
em tempos pulsos de neomicina eram realizados para garantir alta
concentração da população resistente. As células transfectadas foram co-
cultivadas com os esferóides de células de estroma por 16h e a análise de
invasão foi feita por citometria de fluxo ou imunohistoquímica.
3.16. Isolamento de m-RNA e reação de polimerase em cadeia com
transcrição reversa (RT-PCR)
A expressão de genes envolvidos no processo de migração e
manutenção de quiescência de progenitores hematopoéticos, e possivelmente
células tumorais que ocupem esse nicho, foi avaliada comparando as
populações de MSC de medula, linhagem de osteoblasto (HOB) e fibroblasto
de pele humana (FPH). Para tanto, as células foram lisadas com Trizol (Gibco
BRL) para extração de RNA total, seguindo-se o protocolo recomendado pelo
fabricante. Para a síntese de cDNA foram utilizadas 2 g de RNA total. Foi
adicionada 0,5µg de oligo-dT primer (oligo-dT primer 500 g/mL, Gibco BRL) e
a mistura foi incubada a 68°C por 4 minutos. Após este período, adicionou-se
0,01 M de DTT (DTT, 0,1M, Invitrogen), 0,5 mM de uma mistura de
nucleotídeos (dNTPs 25mM, Invitrogen) e 200U da enzima de Transcrição
Reversa (M-MLV RT 200 U/mL; Invitrogen). A mistura foi incubada a 39°C por
2h. Em seguida, foi colocada a 90º C por 10 minutos e armazenada a – 20 °C.
METODOLOGIA E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
97
Para as reações de RT-PCR, 2 L de cDNA foram adicionados numa solução
contendo 0,4 pMoles/µL de primers (Tab. 1), 1,5U de Taq Polimerase (Cenbiot
Enzimas) e tampão da enzima contendo 2mM de MgCl2 e 0,1 mM de uma
mistura de nucleotídeos (dNTPs 25mM, Invitrogen). Após 60 segundos a 96ºC,
foram realizados 34 ciclos de 96°C por 30 segundos, seguidos de 45 segundos
a temperatura média de anelamento para cada primer (Tab. 1) e 72°C por 1
minuto para alongamento. Ao final, um ciclo a 75ºC por 5 minutos. O produto
amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1,2% e posterior
coloração com brometo de etídeo (0,17 μg / mL) em TAE (Tris49 Acetato-
EDTA). A visualização foi realizada com o auxilio de um transiluminador.
Tabela 1. Primers utilizados.
Fator Seqüência TM Produto
amplificadoo
GAPDH 5’ATCACCATCTTCCAGGAGCG3’
3’CCTGCTTCACCACCTTCTTG5’ 57,5ºC 573pb
DKK-1 5’TGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCC3’
3’CTGGCTTGATGGTGATCTTTCTGTA5’ 67,5ºC 149pb
SCF 5’GACAGCTTGACTGATCTTCTGGAC3’
3’ACTGCTGTCATTCCTAAGGGAGCT5’ 58ºC 359pb
SDF-15’CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG3’
3’CTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT5’ 64°C 226pb
Wnt 5a 5’TTTTTCTCCTTCGCCCAGGTTGT3’
3’GGCTCATGGCGTTCACCAC5’ 57,5ºC 358pb
TM = Temperatura média de anelamento
RESULTADOS
98
4. RESULTADOS
4.1. Desenvolvimento de esferóides simples e mistos com MSC de MO
induzidas para a linhagem osteogênica
O modelo de cultura tridimensional multicelular do tipo esferóide com
células de estroma de MO, associadas (esferóide misto) ou não (esferóide
simples) às células de estroma de MO osteo-induzidas foi desenvolvido e
caracterizado. Foi possível desenvolver um modelo de esferóide misto com
segregação das duas populações, de tal forma que se criasse uma interface
entre estas, mimetizando a região subendosteal da MO (Fig. 16A-B). A
distribuição de matriz extracelular nestes esferóides mistos foi muito
semelhante ao descrito in vivo, ressaltando-se a ampla rede tridimensional de
fibronectina tanto nas regiões centrais osteo-induzidas quanto nas periféricas
não induzidas (Fig. 16I-J) e a deposição de fibras colágenas, particularmente
colágeno I, exclusivamente na região central de células diferenciadas para a
linhagem osteogênica (Fig. 16D-F) e ausente em esferóides simples não
induzidos (Fig.16C). Porém, outros elementos foram também observados,
como pequenas quantidades de laminina (Fig.16G) e colágeno IV (Fig.16H).
Uma vez que osteopontina é observada exclusivamente na interface entre osso
e cavidade medular (Nilsson et al., 2005), e tem papel fundamental no nicho
subendosteal (Nilsson et al., 2005; Stier et al., 2005), sua expressão em
esferóides mistos foi também investigada. Osteopontina é expressa em baixos
níveis principalmente na interface entre células mesenquimais osteo-induzidas
e não osteo-induzidas (Fig.16K), sugerindo que esferóides mistos reproduzem
o padrão de expressão de matriz extracelular e elementos do microambiente no
nicho subendosteal. Quanto ao perfil fenotípico dessas células, é sabido que
RESULTADOS
99
células estromais de MO expressam constitutivamente α-actina de músculo liso
(α–SMA) tanto in vitro 2D quanto in vivo. Porém, já foi demonstrada em
fibroblastos, que são α–SMA positivos em cultivos 2D, a perda de expressão
desta molécula quando cultivados em 3D (modelo esferóide), reproduzindo um
padrão similar ao que se tem in vivo – uma vez que não há expressão de α –
SMA em fibroblastos –, mostrando que a expressão em 2D, nesse caso, se
trata de artefato de cultura (Bianco et al., 2001; Kunz-Schughart et al., 2001;
Remy-Martin et al., 1999). Fomos observar, então, a presença de α–SMA em
esferóides mistos de células estromais de MO osteo-induzidas ou não.
Observamos que elas eram positivas para esse marcador, mostrando se tratar
de uma real marcação. Porém, as células osteo-induzidas apresentavam uma
marcação fraca para a mesma molécula, tendo uma maioria de células
negativas (Fig.16L). Esse dado é bastante relevante, uma vez que se tem
correlacionado na literatura osteoblastos mais avançados na cascata de
diferenciação com menor expressão de α–SMA, sugerindo assim que uma
semana de indução osteogênica foi suficiente pra induzir um fenótipo de
osteoblastos α–SMA negativos secretores de colágeno I (Kalajzic et al., 2008).
4.2. As MSC de MO não proliferam em cultura do tipo esferóide
Os esferóides apresentam células em estado quiescente,
homogeneamente negativas para o marcador Ki-67, antígeno nuclear expresso
por células em ciclo (Fig. 17A-B). A análise, por técnica de TUNEL, mostrou
que a maioria das células nos esferóides está viável, apresentando em torno de
10% de células apoptóticas (Fig. 17C). Validando o modelo de esferóide como
RESULTADOS
100
um modelo de cultivo válido e apresentando padrão de comportamento similar
ao observado in vivo.
Figura 16. Caracterização morfológica dos esferóides mistos. (A) Microscopia
óptica de esferóides mistos mostrando a segregação das populações celulares
segregadas (cabeça de seta). H-E. Barra correspondendo a 100m. (B) Microsopia Confocal dos esferóides mistos com população osteoinduzida marcada com CM-DiI (vermelho) confirmando a segregação. Núcleo marcado com DAPI (azul). Barra
correspondendo a 50m. Coloração por Picrossírius de esferóides simples (C) e mistos (D) destacando fibras colágenas na camada celular interna. Barra
correspondendo a 100m. (E-K) Microscopia confocal de coloração por picrossírius mostrando a deposição de fibras colágenas na região de células osteoinduzida (E), Colageno I, em verde, (F) na região central de células osteo-induzidas, marcadas com CM-DiI, em vermelho, Laminina, em verde, (G), Colageno IV, em verde, (H), fibronectina, em verde, na região periférica (I) e central (J), Osteopontina, em verde,
(K) e α –SMA em esferóides mistos (L). (G-J) Barras correspondendo a 20m. (F)
Barra correspondendo a 10m. (K) Barra correspondendo a 50m.
RESULTADOS
101
Figura 16.
RESULTADOS
102
Figura 17. Análise de viabilidade e proliferação dos esferóides. (A) Histograma
mostrando a expressão de Ki-67 em células de estroma de MO (MSC) e osteoblastos humanos (HOB) cultivados 2D ou 3D. Linha pontilhada o controle de isotipo, linha cheia preta cultura 3D e linha cheia cinza cultura 2D. (B) Gráfico representativo do percentual de MSC, HOB e fibroblastos de pele humana (SFB) positivas para Ki67 nas diferentes formas de cultivos. (C) Análise por TUNEL de células apoptóticas nos
esferóides. Barra correspondendo a 20m. Sc - semiconfluente. C - Confluente. * - cultivo com colchicina.
RESULTADOS
103
4. 3. Células CD34+ de SC ou MO são capazes de migrar em esferóides
Simples e Mistos
A migração de progenitores hematopoéticos de sangue de cordão e
medula óssea foi testada tanto em esferóides simples compostos unicamente
de células mesenquimais de medula óssea não osteo-induzidas quanto no
modelo de esferóide misto, previamente descrito. As análises histológicas e
ultraestruturais permitiram observar que as células progenitoras foram capazes
de migrar por entre as células de estroma que compõem os esferóides. Após
48h, células hematopoéticas foram observadas na região central dos
esferóides simples de células mesenquimais de medula óssea (Fig. 18A). Foi
possível observar célula hematopoética polarizada, com protrusões
membranares junto às junções intercelulares de células de estroma da
superfície dos esferóides (Fig 18B). Verificou-se por MET que inúmeras células
hematopoéticas apresentavam as características ultraestruturais de células
CD34+ (Servida et al., 1996), ou seja, núcleo arredondando com cromatina
frouxa, citoplasma escasso e pobre em organelas e apresentando alguns
vacúolos (Fig. 18C). Estas estabeleceram interações com as células estromais,
originando áreas em que as membranas plasmáticas de ambas as células
encontravam-se próximas (Fig. 18D). As análises histológicas dos esferóides
mistos co-cultivados com células CD34+ de SC permitiram observar que neste
modelo de cultura as células hematopoéticas encontram-se, inicialmente,
distribuídas na camada de MSC não induzida (Fig 18E). Curiosamente, após
48 à 72h de co-cultura, algumas células hematopoéticas foram observadas no
limite entre o esferóide central, formado por células osteo-induzidas, que
chegaram a organizar matriz osteóide, e as MSC não induzidas, que o
RESULTADOS
104
recobriam, mas nunca no centro deste (Fig. 18F-G). Esta localização próxima à
região formada por MSC induzidas para a linhagem osteogênica foi confirmada
por imunohistoquímica e microscopia confocal.(Fig. 18H-I).
A cinética de migração das células CD34+ de SC nos esferóides mistos
foi testada e comparada com a cinética de migração nos esferóides simples de
MSC não induzidas, e com a cinética em esferóides simples de MSC induzidas
(Fig. 19A). Observou-se que as células CD34+ de SC migraram de forma
semelhante, tanto nos esferóides mistos, quanto nos simples de células não
induzidas, atingindo um platô em torno de 15% em 24h. Curiosamente,
observou-se que as células hematopoéticas não só eram capazes de migrar
nos esferóides simples osteo-induzidos, como o faziam com grande eficiência e
continuamente, sem atingir um platô. Ao contrário do observado nos modelos
anteriores de esferóides, as células continuaram a migrar mesmo após 24h de
co-cultivo. Esse resultado demonstra que a localização preferencial na interface
do esferóide misto não se deveu a uma barreira física pela grande presença de
colágeno I, mas sim a uma reconstrução de um microambiente informativo que
possivelmente envolve gradientes de quimiocinas e moléculas de adesão
diferencialmente expressas. Para diferenciar o fenômeno de proliferação da
migração dentro dos esferóides, células hematopoéticas foram removidas após
24h de co-cultivo e os esferóides foram mantidos em cultura por até 48h. E não
houve diferença no número de células no interior dos esferóides durante o platô
de 24 para 48h, mostrando, assim, que não há proliferação (Fig.19B).
A capacidade de migração in vivo de células CD34+ derivadas de
diferentes fontes difere, sendo que as células de SC parecem migrar mais
eficientemente para a MO do que as de MO (Bonig et al., 2006). Com o objetivo
RESULTADOS
105
de verificar se estas diferenças, observadas in vivo, seriam reproduzidas num
modelo in vitro 3D, células CD34+ foram isoladas de SC e MO e co-cultivadas
com esferóides mistos para avaliar a cinética de migração. Ao contrário do SC,
a seleção magnética de células CD34+ de MO chegou a 90% de pureza. As
análises por citometria de fluxo mostraram que, como descrito na literatura, as
células progenitoras de SC parecem migrar com maior eficiência em relação às
de MO (Fig. 19C). Enquanto a população de SC atingiu, em média, 16,28% (±
4,14) de migração em 24h, em três experimentos independentes, a população
de MO atingiu somente 7,4% (± 4,34). Estes resultados sugerem que este
modelo 3D permite identificar diferenças na capacidade de migração em
estroma medular de progenitores hematopoéticos. Além disto, mesmo na
presença de pré-osteoblastos, que induzem migração eficiente das células
CD34+ de SC, a cinética de migração dos progenitores hematopoéticos parece
ser determinada pelas MSC não induzidas.
RESULTADOS
106
Figura 18. Co-cultura de esferóides simples e mistos com células CD34+ de SC e MO. (A-B) Cortes semi-finos de esferóides simples de MSC após 48h de co-cultivo
com células CD34+ de SC. Células hematopoéticas distribuidas homogeneamente (A) e emitindo projeção citoplasmática na superfície do esferóide (B). Azul de metileno.
Barras = 30m e 10m, respectivamente. (C-D) Ultraestrutura mostrando célula CD34+
interagindo com células estromais. Detalhe em (D). Barras = 2,25m e 1,4m, respectivamente. Histologia das co-culturas em 24h (E) com células hematopoéticas (setas) na periferia dos esferóides e após 48h (F-G), onde algumas células se encontram na interface das duas populações estromais (cabeça de seta), sendo que o esferóide central chegou a organizar matriz osteóide (cabeça de seta, G). Barras =
30m. (H) Imunohistoquímica para CD34 confirmando o fenótipo e localização destas. (I) Microscopia confocal mostrando células hematopoéticas CFSE+ (verde) na interface das duas populações celulares após 72h de co-cultivo. Células osteo-induzidas
marcadas com CMDiI (vermelho) e núcleo em azul (DAPI). Barra = 10m.
RESULTADOS
107
Figura 19. Cinética de migração de células CD34+ em esferóides. (A) Células
CD34+ de SC foram co-cultivadas com esferóides simples não induzidos (linha cheia), mistos (linha pontilhada) ou simples osteo-induzidos (linha tracejada) e a migração foi analisada ao longo do tempo. (p=1.00). (B) Para diferenciar o fenômeno de proliferação de migração dentro dos esferóides, células hematopoéticas foram removidas após 24h de co-cultivo e os esferóides foram mantidos em cultura por até 48h. O número de eventos CD34+ dentro dos esferóides lavados (círculos fechados) foi comparado com o número de eventos CD34+ dentro dos esferóides não-lavados (círculos abertos). (C) Cinética de migração de células CD34+ de SC (linha cheia) e de MO (linha pontilhada) em esferóides mistos ao longo do tempo (n=3; p=0,046 em 16h e p=0,011 em 24h). A média do percentual de migração é apresentada. Barras representam erro padrão.
4. 4. Recirculação das células CD34+ nos esferóides mistos
A cinética de migração das células CD34+ nos esferóides mistos e nos
simples formados por MSC não induzidas ou induzidas para a linhagem
osteogênica mostrou, como já descrito, que a presença de MSC não induzidas
estabelecia um platô em 24h, enquanto nos esferóides formados
exclusivamente por células induzidas isto não era observado (Fig.19A). A
ocorrência desse platô levantou duas possibilidades: a primeira de que as
células teriam atingido um ponto de saturação da migração, e a segunda de
que existisse contínua recirculação das células. Para investigar essas
hipóteses, as células hematopoéticas foram co-cultivadas com os esferóides e,
após 24h, as que não haviam migrado foram retiradas e os esferóides foram
mantidos em cultura. Observou-se, 24h e 48h após, a presença de células
hematopoéticas no sobrenadante, principalmente dos esferóides mistos (Fig.
20A) ou de MSC não induzidas (dado não mostrado). Após 48h, o número de
RESULTADOS
108
células hematopoéticas no sobrenadante era ainda maior (Fig.20B), mostrando
assim que a saída de células é um processo contínuo. O percentual de saída
em relação ao total de células CD34+ presentes nos esferóides, quantificadas
por citometria de fluxo, foi calculado no ponto de 48h, comparando-se a saída
de células CD34+ de SC ou MO em esferóides mistos ou simples de MSC
induzidas. Tanto as células CD34+ de SC, quanto às de MO, migraram para o
sobrenadante dos esferóides mistos, porém, o percentual de saída dos
esferóides simples induzidos foi menor (Fig.20C). Estes resultados sugerem
que o platô de migração, observado nos esferóides mistos, poderia se dever a
uma recirculação das células CD34+. Ou seja, se estabeleceria um equilíbrio
dinâmico com entrada e saída contínua de células hematopoéticas na mesma
proporção. Para verificar esta hipótese, células CD34+ não marcadas foram
distribuídas sobre esferóides mistos e, após 24h, as células do sobrenadante
foram retiradas. Em seguida, células CD34+ marcadas com CFSE foram
distribuídas sobre os esferóides. O sobrenadante e os esferóides dissociados
foram analisados após 24h e 48h por citometria de fluxo, e o percentual das
populações marcadas ou não nos esferóides e no sobrenadante foi
determinado. Como previsto, verificou-se que 24h após a lavagem dos
esferóides as células não marcadas estavam presentes em pequenas
quantidades no sobrenadante, havendo um aumento neste percentual após
48h. Paralelamente, observou-se que o percentual de células CFSE+ diminui
progressivamente no sobrenadante. No interior dos esferóides verificou-se
exatamente o contrário. Após 24h, já foi possível observar um pequeno
percentual de células CFSE+ e este valor aumentou após 48h, ao mesmo
tempo que houve redução do percentual de células não marcadas (Fig. 20D).
RESULTADOS
109
Estes resultados preliminares confirmaram a hipótese de que nos esferóides
mistos estabelece-se uma dinâmica de migração das células hematopoéticas,
com entrada e saída simultânea de células por até 72h de cultura, o que leva a
formação do platô.
4. 5. Os esferóides mistos têm maior capacidade de manter células CD34+
de SC quiescentes em relação aos simples
Verificamos que os esferóides mistos mantêm uma organização celular
própria e que os progenitores hematopoéticos que migram neste modelo
localizam-se preferencialmente na vizinhança das MSC induzidas, embora
sejam capazes de migrar para o interior de esferóides formados somente por
células induzidas. Estes resultados sugerem que haja a formação, nos
esferóides mistos, de microambientes específicos capazes de controlar a
localização dos progenitores hematopoéticos de forma semelhante ao nicho
subendosteal da MO. Uma vez que esta região parece controlar não só a
localização, mas também a quiescência das CTH in vivo, a proliferação das
células CD34+ de SC foi investigada no modelo de co-cultura com esferóides
mistos e simples. Para tanto, esferóides mistos e simples foram co-cultivados
por até 7 dias com progenitores CD34+ de SC, na presença de BrdU, que foi
adicionado ao meio de cultura. Posteriormente, os esferóides foram
dissociados e o percentual de células CD34+BrdU- foi verificado por citometria
de fluxo. Nossos resultados mostraram que os esferóides mistos mantiveram,
em média, o dobro das células CD34+ em estado quiescente em relação aos
esferóides simples, 14% e 7,9% em 48h, respectivamente. E após 7 dias esta
proporção se manteve, porém, com valores inferiores, 2,4% e 1,2%. Esse
RESULTADOS
110
experimento teve número amostral igual a 4 e p=0.037, sendo assim a
diferença estatisticamente significante. (Fig.20E-G). Logo, os esferóides mistos
mimetizam o nicho subendosteal de CTH, determinando sua localização
preferencial na vizinhança de pré-osteoblastos e induzindo quiescência.
Pode-se concluir deste conjunto de resultados que o modelo de
esferóide misto mimetiza o nicho subendosteal da MO e, portanto, pode ser
utilizado para análise das vias envolvidas no mecanismo de migração
transmedular e indução de quiescência; não só de HSC, mas também de
células-tronco de neoplasias hematológicas ou que produzem micrometástases
na MO, como o câncer de mama.
RESULTADOS
111
Figura 20. Dinâmica de migração e quiescência de progenitores hematopoéticos nos esferóides. (A-B) Contraste de fase de esferóides mistos após 24h (A) e 48h (B) da remoção do sobrenadante de co-cultura com células CD34+ de SC. Barras = 100µm. (C) Percentual de células que emigraram dos esferóides após 48h. Barras representam erro padrão. (D) Esferóides mistos foram cultivados por 24h com células CD34+ não marcadas, lavados e em seguida incubados com células CD34+ marcadas com CFSE por 24h (barras cheias) e 48h (barras axuradas). O percentual de células CD34+ marcadas com CFSE (barras verdes) ou não (barras vermelhas) no sobrenadante ou no interior dos esferóides foi determinado por FACS. (E-G) Análise, por FACS, de proliferação de células CD34+ de SC nos esferóides simples e mistos. (F) Histograma mostrando a incorporação de BrdU nas células CD34+ (R2, em E) de SC cultivadas em esferóides mistos (linha preta) ou esferóides simples não-induzidos (linha pontilhada). Controle de isotipo (linha cinza). (G) Gráficos mostrando a média do percentual de células CD34+BrdU- (população quiescente) em esferóides simples (barra branca) e mistos (barra preta), após 48h e 7 dias de cultivo. Barras mostram desvio padrão. (n=4, p=0,037).
RESULTADOS
112
4. 6. Estratégias de co-cultivo de células tumorais de câncer de mama e
células mesenquimais de medula óssea em modelo 3D do tipo esferóide
Com o objetivo de investigar se o modelo de esferóide seria adequado
como modelo de invasão tumoral, linhagens de tumor de mama foram
selecionadas e estratégias de co-cultura desenvolvidas. Linhagens invasivas
MDA435, MDA231, T47D e MDA468 (Phadke et al., 2006) e não invasiva,
como MCF-7 (Imanishi et al., 2007), foram utilizadas. Inicialmente, diferentes
formas de co-cultivo dos esferóides de células estromais de MO e tumorais,
bem como diferentes concentrações de células por esferóide foram realizadas,
pois, como as células tumorais proliferam, os esferóides cresceriam com o
tempo, levando ao surgimento de centro necrótico (Kunz-Schughart et al.,
1998). Assim, as linhagens tumorais foram distribuídas sobre esferóide pré-
formado de células estromais de MO (cultura sucessiva), ou promoveu-se
fusão de dois esferóides distintos (de linhagem tumoral e de células estromais
de MO), ou, ainda, foi feito o co-cultivo simultâneo das duas populações
envolvidas (Fig. 21). A cultura sucessiva nos pareceu ideal para análise de
invasão, apesar da fusão ter dado bons resultados para MCF7. No entanto,
neste caso, a área de contato é bem menor e o tempo para uma fusão
completa seria demasiado longo (Fig 21D-F). Além disso, MDA435 e MDA231
não são capazes de formar esferóides isoladamente, logo, a fusão se torna
impossível (dados não mostrados). Na cultura sucessiva, uma grande área de
contato com o esferóide de células estromais de MO, que é totalmente
envolvido pela MCF7, com apenas 24h de co-cultivo (Fig. 21B), se
estabeleceu.
RESULTADOS
113
Figura 21. Morfologia das co-culturas de células tumorais de mama e células estromais de medula óssea. (A-C) A linhagem de tumor de mama, MCF-7, foi distribuída sobre esferóide pré-formado de estroma de MO, início da cultura (A), 24h (B) e 4 dias (C). (D-F) Fusão dos esferóides de MCF7 (maior e com menor contraste) e de estroma de MO (menor e com maior contraste) no início da cultura (D), após 24h (E) e 48h (F). (G-I) Cultura simultânea da linhagem tumoral MCF-7 com células de estroma de MO após 4 dias (G) e 5 dias (H-I). (A, B, D, E, G, H) Contraste de fase; aumento original de 5X. (C, F e I) Secções histológicas coradas por H-E; aumento original de 10X.
4. 7. As linhagens de câncer de mama invasivas são capazes de migrar
nos esferóides mistos
Todas as linhagens foram, então, cultivadas com a metodologia de
cultura sucessiva sobre esferóides mistos ou esferóides de fibroblasto de pele
humana (FPH), como um controle que nos permitiria diferenciar fenômenos
relacionados especificamente ao microambiente subendosteal daqueles mais
gerais de invasão de tecido conjuntivo, mimetizado pelos esferóides de FPH
(Fig. 22). Observou-se, inicialmente, diferenças no padrão de interação das
RESULTADOS
114
linhagens com os esferóides. As linhagens não invasivas formaram uma densa
camada em torno do esferóide e um limite nítido entre as células tumorais e o
esferóide pôde ser observado (Fig. 22A e C). Já no caso das linhagens
invasivas, como a MDA231, não foi possível observar limites entre as duas
populações (Fig.22B), notando-se clara invasão dos esferóides por células
fusiformes mas positivas para citoqueratina (Fig. 22E). O mesmo padrão de
interação foi observado nas linhagens MDA435 (Fig. 22D) e MDA468 (Fig.22G-
H). Curiosamente, a linhagem T47D considerada invasiva apresentou padrão
de interação com o esferóide similar a MCF7. Sua avaliação demonstrou que,
de fato, se trata de uma linhagem invasiva, porém, ao contrário das demais
linhagens, apresenta um foco de invasão bem delimitado e as demais células
compõem uma capsula em torno do esferóide (Fig.22F) similar a de MCF7 (Fig.
22C). Isso nos foi sugestivo de heterogeneidade. Nos perguntamos quais
subpopulações seriam responsáveis por quais comportamentos.
RESULTADOS
115
Figura 22. Co-cultura de linhagens de câncer de mama com esferóides mistos.
Co-cultura das linhagens tumorais com esferóides mistos após 48h. MCF7 (A,C), MDA435 (D), MDA231 (B,E), T47D (F), MDA468 (G-H). (A-B) Constraste de fase. (C-
H) IHQ para pan-citoqueratina (pan-CK). Barras: (A-B) 100 m (C-G) 60m.
RESULTADOS
116
4.7. Imunofenotipagem das linhagens tumorais quanto à expressão de
CD44 e CD24
Tendo em vista as atuais descrições de subpopulações tumorais
responsáveis pela manutenção e avanço tumoral (Al-Hajj et al., 2003), foi
realizada uma análise das linhagens em questão quanto à expressão dos
antígenos de superfície CD24 e CD44. A linhagem MCF7 se apresentou
homogeneamente CD44loCD24lo (Fig.23D;H), enquanto as linhagens invasivas
(MDA231 e MDA435) se mostraram CD44HiCD24- (Fig.23A;E;B;F), perfil
compatível com o de célula-tronco do câncer. Já a linhagem T47D mostrou-se
heterogênea, confirmando sugestões iniciais (Fig.23C;G).
Figura 23. Análise imunofenotípica das sub-populações nas linhagens tumorais quanto a expressão de CD44 e CD24. (A-D) Perfil SSC VS FSC das linhagens. (E-H)
Distribuição das populações pela expressão de CD24 vs CD44. (A,E) MDA435, (B,F) MDA231, (C,G)T47D, (D,H) MCF7. Tem uma imagem melhor da T47D, sem autofluorescência.
RESULTADOS
117
4.8. As subpopulações CD24+ e CD44+ são funcionalmente distintas e
não dão origem uma a outra
Uma vez que a linhagem T47D mostrou-se heterogênea, levantou-se a
questão se a subpopulação CD44HiCD24-, doravante denominada CD44+, seria
capaz de originar a subpopulação CD44-CD24+, denominada CD24+. Essas
subpopulações foram selecionadas por citometria de fluxo e a análise pós-
seleção mostrou pureza maior que 95% (Fig. 24A-C). Curiosamente, verificou-
se, após expansão in vitro da subpopulação CD24+, a presença de células
CD44+ que predominavam na cultura ao longo do tempo (Fig. 24E). No entanto,
não observou-se o aparecimento de células CD24+ nas culturas iniciadas com
a subpopulação CD44+ (Fig. 24F). Estes dados levantaram duas hipóteses: (1)
Ao contrário do descrito (Al-Hajj et al., 2003), as células CD24+ seriam capazes
de gerar a subpopulação CD44+, ou (2) o perqueno contaminante (cerca de
2%) de células CD44+ na cultura inicial expandiria preferencialmente. Para
testar estas hipóteses, foi realizado duplo sorting da população CD24+, para
alcançar pureza de 99,8% (Fig. 24D).
Nas culturas iniciadas com populações purificadas, verificou-se que a
subpopulação CD44+ apresentava morfologia mesenquimal, ou seja, as células
eram fusiformes e ricas em projeções celulares (Fig.25A). Já a população
CD24+ apresentou uma morfologia epitelial clássica com formação de ilhotas
com células intimamente aderidas e de formato cuboidal (Fig.25B).
RESULTADOS
118
Figura 24. Seleção e expansão das subpopulações da linhagem T47D. (A) T47D
original mostrando as regiões (R2 e R3) de seleção das subpopulações. (B) Análise pós-sorting da população CD44+. (C) Análise pós-sorting da população CD24+. (D) Análise pós sorting da população CD24+. Os percentuais de pureza estão indicados. (E) Cultura da população CD24+ selecionada pós-sorting (99,8% pureza) acompanhada até 34 dias em meio RPMI. (F) Cultura da população CD44+ pós-sorting (99,9% pureza) acompanhada até 20 dias em meio ISCOVE’S.
Culturas tridimensionais em matrigel favorecem a organização
ramificada e morfogênese, reproduzindo eventos da glândula mamária (Stahl,
Weitzman & Jones, 1997). Logo, as células foram cultivadas desta forma.
Observamos que as CD44+ formaram cordões ramificados semelhantes a
dutos (Fig.25C) similares às estruturas descritas por Stahl e colaboradores em
1997, também trabalhando com linhagem de tumor mamário que
demonstraram cobertura por laminina 5 e lúmen. Já a população CD24+
formou estruturas arredondadas muito semelhantes a ácinos de glândula
mamária (Fig.25D). Para confirmar se, de fato, se tratava de formação de
ácinos, a cultura foi mantida por 10 dias, verificando-se a formação lúmen (Fig.
RESULTADOS
119
25F), de acordo com o descrito por Debnath e colaboradores (Debnath et al.,
2002). Curiosamente, em cultivos menos puros das populações sortadas foi
possível ver a interrelação das duas estruturas (Fig.25E).
O ensaio de invasão em esferóides mistos de MO mostrou que as
células CD44+ se apresentavam em cachos (Fig.25G) como as linhagens
invasivas (Fig.22E) e, de fato, invadiam os esferóides (Fig.25I), enquanto a
população CD24+ se organizava em torno do esferóide (Fig.25H), como
observado nas co-culturas com MCF7 (Fig.22C) e não os invadia (Fig.25J). O
fenótipo dessas duas populações em cultura se mostrou estável, ou seja, uma
população não originou a outra, mesmo após meses em cultura (dados não
mostrados). O ensaio de tumorigênese em camundongos fêmeas NUDE
mostrou que as células CD24+ não originam tumor, enquanto as células
CD44+ são tumorigênicas (Fig. 26A). Porém, não foram observadas células
CD24+ nestes tumores (Fig. 26B), questionando a teoria de células-tronco
tumorais para câncer de mama.
RESULTADOS
120
Figura 25. Análise funcional das subpopulações CD24+ e CD44+ que coexistiam na linhagem tumoral T47D. Células sortadas cultivadas em monocamada, CD44+ (A)
CD24+(B). Cultura em Matrigel das populações sortadas, CD44+ (C), CD24+ (D) e mista (E). Ensaio de invasão de esferóides mistos com as células selecionadas, CD44+ (G,I) e CD24+ (H,J); contraste de fase (G-H), imunohistoquímica para pan-CK (I-J).
RESULTADOS
121
Figura 26. Potencial tumorigênico em camundongos NUDE. (A) Apenas as células
CD44+ foram capazes de originar tumores. Imagem representativa de 3 experimentos realizados. (B) IHQ para CD24 nos tumores. Inserto é o controle positivo, epitélio murino.
RESULTADOS
122
4. 9. As linhagens tumorais apresentam maior afinidade pelas células de
estroma de medula óssea em comparação a fibroblastos
Partindo do princípio embriológico da segregação e agregação de
populações celulares a partir de suas afinidades, ditadas pelo padrão de
moléculas de adesão expressas (Layer et al., 2002; Wirz et al., 2008), foi
realizado um ensaio simples de afinidade entre duas das linhagens tumorais,
MCF7 e MDA435, e as células derivadas de diferentes estromas, MO e FPH,
em co-culturas simultâneas. Verificou-se que independentemente da célula
estromal, de MO ou FPH, havia sempre segregação da linhagem MCF7, que se
organizava formando uma camada externa (Fig. 27A-B; E-F). No entanto, a
MDA435 apresentou comportamento distinto, dependendo da linhagem
estromal. Notou-se segregação nas co-culturas com FPH (Fig. 27C;G), mas
não nas co-culturas com células de estroma de MO, nas quais as células
tumorais permearam as células estromais (Fig. 27D; H). Estes resultados
sugerem que as linhagens não invasivas, como a MCF7, tendem a se associar
entre si, segregando-se das células estromais. Por outro lado, as linhagens
invasivas, como a MDA435, de fato apresentam maior afinidade pelas células
estromais da MO. Já a interação com esferóides de fibroblasto em todas as
linhagens invasivas apresentaram aparentemente uma menor eficiência na
invasão, exemplificado pela MDA231 e T47D (Fig. 27I e J, respectivamente),
concordando, assim, com a sugerida menor afinidade.
.
RESULTADOS
123
Figura 27. Ensaio de afinidade das células tumorais com fibroblasto de pele e estroma de medula óssea por co-cultura simultânea das células. (A-I) Cultivo simultâneo de células tumorais. MCF7 (A-B, E-F) ou MDA435 (C-D, G-H) com FPH (A, C, E e G) ou células estromais de MO (B, D, F e H). (A-D) Contraste de fase. Aumento original de 50X. (E-F) Secções histológicas de esferóides de cultivo simultâneo de MCF7, mostrando segregação com nítida delimitação entre as duas populações (setas). H-E. (G) Secções histológicas de esferóides de cultivo simultâneo de MDA435 com FPH, evidenciando segregação (cabeça de seta). (H) Secções histológicas de esferóides de cultivo simultâneo de MDA435 com estroma de MO, evidenciando as células tumorais de permeio às células estromais (setas) (H). (E-H) Aumento original de 400X. (I-J) Co-cultivo de MDA231 (I) e T47D (J) sobre esferóides de FPH. IHQ para
pan-CK e Barras correspondentes a 60m (I) 50m (J).
RESULTADOS
124
RESULTADOS
125
4. 10. As linhagens de tumor de mama apresentam maior eficiência de
invasão em esferóides mistos de medula óssea comparativamente a
esferóides de fibroblasto de pele
Para confirmar a possível maior afinidade das linhagens tumorais
invasivas por esferóides de MO em relação aos de fibroblasto, cinéticas de
invasão das linhagens foram estudadas em esferóides mistos, de FPH ou
mesenquimal de tecido adiposo (TA), pelo modelo de cultura sucessiva. O
acréscimo de esferóides de TA no planejamento experimental se deu como
mais um controle, verificando se a maior afinidade à MO se dá apenas contra
fibroblastos de pele ou se células fibroblastóides derivadas de outros tecidos
também teriam menor capacidade de suportar migração. Para o cálculo do
percentual, os esferóides foram lavados e dissociados e as células tumorais
CFSE+ que foram capazes de migrar no esferóide, quantificadas por citometria
de fluxo (Fig.28A-C). As linhagens invasivas MDA231, MDA435, MDA468 e
T47D CD44+ foram testadas. A interação destas linhagens na superfície dos
esferóides de células estromais se dá de forma diferenciada (sem formação de
camadas de células tumorais em torno do esferóide), organizando cachos
pouco aderidos, permitindo a fácil a separação entre a população que migrou e
a que não migrou. Verificou-se que todas as linhagens mostraram maior
afinidade pelos esferóides mistos de medula óssea. A invasão da linhagem
MDA231, após 24h, era significativamente maior nos esferóides mistos em
relação aos esferóides de fibroblastos. Nos esferóides mistos a invasão era tão
efetiva que após 48h atingia quase 100% (Fig. 28D), não apresentando o platô
observado nas co-culturas com células CD34+ (Fig.19A). Isto sugere que a
formação de um platô pelas células CD34+, em 24h, por recirculação continua
RESULTADOS
126
(Fig. 20D), é específico desta população celular e não um artefato do modelo,
possivelmente relacionado a saturação do esferóide. No caso da linhagem
MDA435, uma diferença significativa só foi observada a partir de 48h e,
novamente, não houve formação de platô (Fig.28E). A linhagem MDA468
também apresentou um padrão de invasão similar, com aparente maior
afinidade por esferóide misto do que de FPH ou de TA, porém, não houve
significância estatística (Fig.28F). A população T47D CD44+ também foi
testada quanto a sua invasão e obtivemos resultados similares aos de
MDA231, com a migração significativamente mais efetiva em esferóides mistos
do que em esferóides de fibroblastos já a partir de 24h (Fig.28G).
RESULTADOS
127
Figura 28. Cinética de migração das diferentes linhagens de tumor de mama em esferóides mistos, de fibroblasto ou mesenquimal de tecido adiposo. (A-C)
Análise por citometria de fluxo de esferóide dissociado após co-cultura com células de tumor de mama previamente marcadas com CFSE. As células selecionadas em R1 (A) foram selecionadas em R2 pela expressão de CFSE (B) e tempo de aquisição (C). (D-G) Gráfico representando o percentual de migração da MDA231 (D), MDA435 (E), MDA468 (F) e T47D CD44+ (G) em esferóides mistos (quadrado, linha preta), de fibroblasto (circulo, linha pontilhada) e de MSC derivada de TA (triangulo; linha tracejada). A média e erro padrão estão representados. O número de experimentos e significância estatísitca são: (D) n=2; p=0.03 em 24h; p=0.0035 em 48h; p= 0.0078 em 72h; (E) n=3; p=0.03 em 48h; p=0.0198 em 72h; (F) (n=2) e (G) (MO vs FPH n=5; p=0.0009 em 24h; MO vs TA n=5; p=0.003 em 24h; MO vs FPH n=3; p=0.002 em 48h; MO vs TA n=3; p=0.07 em 48h).
RESULTADOS
128
4. 11. Análise comparativa da expressão de mRNA para fatores descritos
no nicho subendosteal por RT-PCR em células MSC e FPH
Em busca de entendimento dessa migração mais efetiva em esferóides
de MO, realizamos uma análise comparativa da expressão de alguns genes
relacionados ao controle de migração e ciclo celular por células mesenquimais
de medula, fibroblastos de pele e linhagem de osteoblastos por RT-PCR.
Surpreendentemente, verificou-se que FPH expressam quantidades
significativas de SDF-1 (Fig.29). Todas as linhagens expressam SCF, Wnt5a
e DKK-1 (Fig.29).
Figura 29. Análise por RT-PCR da expressão de genes nas células de estroma de medula óssea, fibroblastos de pele e osteoblastos em culturas 2D. Gel de agarose mostrando a expressão de gene constitutivo, GAPDH, e de SDF-1α, SCF, Wnt5a e DKK-1 em células de estroma de MO (MSC), FPH e osteoblastos (HOB).
RESULTADOS
129
4.12. A Galectina-3 é fortemente expressa em esferóides mistos em
detrimento de fibroblastos
A presença de Galectina-3 nos esferóides mistos de MO e de
fibroblastos foi investigada, notando-se forte marcação para Gal-3 tanto nos
esferóides simples de progenitores mesenquimais osteo-induzidos (Fig.30A),
quanto nos não osteo-induzidos (Fig.30B). Em esferóides de FPH a presença
de Gal-3 era bastante reduzida (Fig.30C). Verificou-se ainda que nos
esferóides mistos de MO a marcação para Gal-3 era mais intensa no centro
osteo-induzido (Fig.30D-E).
RESULTADOS
130
Figura 30. Presença de Galectina-3 em esferóides mistos e de fibroblastos. A presença de Galectina-3 (Gal-3) foi observada por
imunohistoquímica em cortes histologicos de esferóides osteo-induzidos (A), de células mesenquimais de MO não oste-induzidas (B), de FPH (C) e esferóides mistos (D-E). Insertos em cada imagem correspondem aos controles da IHQ (A-D). (A-D) Magnificação 200X, (E) 400X.
RESULTADOS
131
4.13. A migração das linhagens tumorais depende de Galectina-3 no
microambiente
Uma vez que se observou expressão diferencial de Gal-3 nos esferóides
mistos de MO em relação aos de FPH, investigou-se a hipótese de Gal-3,
expressa no microambiente, estar modulando a invasão das linhagens de
tumor de mama. Para tanto, os esferóides foram previamente incubados por
48h, com 20% de meio condicionado de hibridoma secretor de anticorpo anti-
Gal3 e, como controle, meio condicionado do hibridoma secretor de anti-CD8.
Observou-se que o bloqueio com anti-Gal3 levou a diminuição do
percentual de migração em relação ao controle de todas as linhagens
estudadas, que variou de 10,6 a 58,2% (Fig.31).
CNTR
Anti-
Gal
3
CNTR
Anti-
Gal
3
CNTR
Anti-
Gal
3
CNTR
Anti-
Gal
3
0
20
40
60
80 CD44 MDA468 MDA435MDA231
% M
igra
çã
o
Figura 31. Ensaio neutralizador de Galectina-3 no microambiente com meio condicionado de linhagem M3/38. Meio suplementado com 20% de meio
condicionado da linhagem M3/38 (AntiGal-3, barras pretas) ou TIB105 (CNTR, barras brancas) foi utilizado para pré-incubar, por 48h, os esferóides mistos que seriam utilizados na realização do ensaio de migração. Após 16h de migração os esferóides e seus respectivos sobrenadantes foram coletados e analisados por citometria de fluxo de forma a permitir a construção de gráfico demonstrando o percentual de migração de cada linhagem em cada situação (n=2 para todas as linhagens).
RESULTADOS
132
Para confirmar esses resultados outra estratégia foi utilizada. Foram
desenvolvidos esferóides de células de estroma derivadas da medula óssea de
camundongos selvagens e nocautes para Gal-3 que foram co-cultivados tanto
com as linhagens humanas quanto com linhagens de tumor mamário murino
(M3 e 4T1). Observou-se que, a exceção da linhagem MDA-MB-231, o
percentual de células que invadiu os esferóides foi significativamente menor
nas co-culturas com esferóides de estroma derivado de animais nocautes em
relação aos selvagens (Fig.32). Os percentuais de inibição variaram entre
70.1% (± 23.7%) para M3, 69.9% (± 9.3%) para 4T1, 82% (± 15.6%) para T47D
CD44+ e 82.4% (± 9.2%) para MDA468. Esses resultados sugerem que a
presença de Gal-3 no microambiente favorece a migração de células tumorais
de mama e, possivelmente, é um dos motivos da menor migração nos
esferóides de FPH, que apresentam baixa expressão de Gal-3 (Fig.30C).
WT
KO
WT
KO
WT
KO
WT
KO
WT
KO
0
20
40
60
80 M3 4T1 T47D CD44
+ MDA468 MDA231
* *
*p=0.01
p=0.027 p=0.004% M
igra
çã
o
Figura 32. Ensaio de migração em esferóides de estroma de medula murinos selvagens ou nocautes para Galectina-3. Linhagens de tumor de mama murino (M3
e 4T1) ou humano (T47D CD44+, MDA468 e MDA231) foram postas para migrar sobre esferóides de estroma de medula murino selvagem (WT, barras brancas) ou nocaute (KO, barras pretas). Após 16h de migração, os esferóides e seus respectivos sobrenadantes foram coletados e analisados por citometria de fluxo de forma a permitir a construção de gráfico demonstrando o percentual de migração de cada linhagem em cada situação. (n=3, para M3, 4T1 e T47D CD44+). (n=1,para MDA468 e MDA231).
RESULTADOS
133
4.14. Nas linhagens tumorais a Galectina-3 se localiza predominantemente
no citoplasma
Uma vez que galectina-3 é descrita como moduladora funcional por 2
mecanismos bastante diferentes, ora como agente do microambiente, ora como
mediador intracelular (Dumic et al., 2006), e tendo avaliado sua importância
como fator do microambiente para a invasão dos esferóides mistos, partimos
para a avaliação de sua localização nas linhagens celulares e se há correlação
com grau de invasividade.
A expressão de Gal-3 nas linhagens estudadas foi investigada por IHQ e
Western Blotting das frações nucleares e citoplasmáticas. Todas as linhagens
estudadas, MCF7, T47D, MDA231 e MDA435, se mostraram positivas para
galectina-3, sendo que MDA231 (Fig.33C) e MDA435 (Fig.33B) apresentavam
marcação intensa, possivelmente nuclear (Fig.33B-C , setas), enquanto MCF7
(Fig.33A) e T47D (Fig.33D) apresentavam uma marcação moderada no
citoplasma.
RESULTADOS
134
Figura 33. Caracterização da presença de Galectina-3 nas linhagens de câncer de mama por IHQ. A presença de Galectina-3 (Gal-3) foi observada por
imunohistoquímica em cortes histologicos de co-cultivo das linhagens sobre esferóides mistos (A-C) ou de FPH (D). Co-cultivo de esferóide com MCF7 (A), MDA435 (B), MDA231 (C) e T47D parental (D). (B-C) Setas apontam aparente galectina-3 nuclear. Insertos em cada imagem correspondem aos controles da IHQ.
Para confirmar esses resultados foi realizado fracionamento celular por
duas metodologias, uma que originava uma fração insolúvel (membranar, I) e
uma fração solúvel (Citoplasma+núcleo, S), e a outra que originava uma fração
de citoplasma (FC) e uma fração nuclear (FN). A análise por western blot
destas frações (Fig.34) mostrou que Gal3, nas linhagens, se apresenta
principalmente no citoplasma, não estando presente na membrana e em pouca
quantidade no núcleo. Uma análise semiquantitativa é apresentada na tabela 2.
RESULTADOS
135
Figura 34. Localização de Galectina-3 em diferentes linhagens de câncer de mama. As populações celulares foram lisadas e processadas por protocolos distintos, dando origem a 4 frações: fração insolúvel (membranar, I), fração solúvel (Citoplsama+núcleo, S), fração de citoplasma (FC) e fração nuclear (FN). Foram avaliadas nessas frações a presença de Gal-3 e
-actina. (controle positivo de galectina-3,NG97ht, +).
RESULTADOS
136
Tabela 2. Tabela resumida dos resultados obtidos nos Western Blots para Galectina-3.
MDA231 MDA435 T47D CD44 T47D CD24
Insolúvel NA NA NA NA
Solúvel ++++ ++++ + +
Fração Citoplasmática ++++ ++++ ++ ++
Fração Nuclear ++ ++ + +
4.17. Avaliação da importância da via WNT na migração das linhagens
tumorais
Considerando o papel de Gal-3 na invasão de células de tumor de mama
no modelo de esferóide e sua propriedade de translocar -catenina para o
núcleo (Shi et al., 2007; Song et al., 2009; Weinberger et al., 2007), associado
ao fato de que o papel da sinalização canônica de Wnt no câncer de mama
ainda não está claro (Geyer et al., 2011; Khramtsov et al., 2010), a importância
desta via no processo de invasão no modelo de esferóide foi investigada.
Inicialmente, as células da linhagem MDA435 foram tratadas com meios
condicionados obtidos de célula L parental ou de clones selecionados
secretores de WNT3A (ativador da via canônica de WNT), ou WNT5A (ativador
da via não canônica de WNT), e co-cultivadas com esferóides mistos de MO e
de fibroblasto. Nenhuma diferença significativa foi encontrada quanto ao
percentual de migração nas diferentes condições experimentais (Fig.35).
RESULTADOS
137
MCL
WNT5A
WNT3A
MCL
WNT5A
WNT3A
0
2
4
6
8
10
MO FPH
% M
igra
çã
o
Figura 35. Ensaio de invasão na presença de WNT3A e WNT5A. A linhagem
MDA435 foi posta para migrar na presença de meio condicionado controle (MCL), suplementado com WNT5A ou WNT3A. Após 16h de migração os esferóides, mistos ou de FPH, e seus respectivos sobrenadantes foram coletados e analisados por citometria de fluxo de forma a permitir a construção de gráfico demonstrando o percentual de migração de cada linhagem em cada situação. (n=2)
Com o objetivo de investigar de forma mais direta o papel da ativação da
via canônica de Wnt na invasão das linhagens tumorais em modelo de
esferóide, 3 plasmídeos moduladores da via de WNT, -catenina selvagem, -
catenina mutada (S33Y) e TCF-4 mutado (-TCF4), foram selecionados. A
mutação de -catenina, do tipo missense no códon 33, resulta na troca de uma
serina por uma tirosina que se localiza na região N-terminal da proteína, região
reconhecida e fosforilada por GSK-3. Portanto, a mutação S33Y origina uma
proteína resistente a degradação, logo, constitutivamente ativa (Kolligs et al.,
1999; Korinek et al., 1997; Morin et al., 1997). A mutação de TCF-4 também se
dá na porção N-terminal, porém, é uma deleção de 30 aminoácidos no domínio
responsável pela interação com -catenina e transcrição dos genes. Desta
forma, este mutante perde a capacidade de interação com -catenina, sendo
RESULTADOS
138
considerado um dominante negativo da via (Korinek et al., 1997). Na literatura,
tem-se descrito que a transfecção da β-catenina selvagem, em linhagem de
células renais de rato (RK3E), leva a um aumento na transcrição por TCF/LEF
de 3 vezes, enquanto a mutante S33Y aumenta em 12 vezes a transcrição, nos
dando, assim, uma idéia da efetividade dos genes em questão (Kolligs et al.,
1999). A identidade dos plasmídeos foi confirmada por análise do tamanho da
banda gerada após digestão enzimática (Fig.36A-C). Em seguida, os
plasmídeos foram digeridos com enzima de restrição selecionada a partir dos
respectivos mapas, de forma a linearizar-los, cortando em um ponto único não
codificante (Fig.36D).
Figura 36. Confirmação da identidade dos plasmídeos e preparação para transfecção. Plasmídeos contendo os genes foram digeridos com a combinação
apropriada de enzimas de restrição. (A) -catenina selvagem. (B)-catenina S33Y
(constitutivamente ativa). (C) -TCF4 (dominante negativo). O tamanho de banda esperado está explicitado ao lado do nome de cada plasmídeo. (D) Linearização dos plasmídeos através de digestão com Sca1, Lanes não digeridas, N, e Lanes digeridas,
D. Seta indicativa dos plasmídeos linearizados.
RESULTADOS
139
Após tranfecção com os plasmídeos contendo -catenina selvagem ou
mutada (S33Y) e seleção com neomicina, observou-se que a grande maioria
das células morreu (dados não mostrados), e as células resistentes foram
expandidas. Não foi possível expandir as células transfectadas com o
plasmídeo contendo TCF4, pois o bloqueio da via de Wnt para essas células
se mostrou fatal (dados não mostrados).
4.18. Avaliação da importância da via WNT canônica na proliferação das
linhagens tumorais
O efeito da ativação da via de Wnt na proliferação das linhagens
estudadas também foi investigado. Inicialmente, o efeito de meios
condicionados (MC) ricos em Wnt3A (ativador da via canônica) e Wnt5A
(ativador da via não canônica) sobre a proliferação das linhagens tumorais foi
analisado. Foi observado um aumento significativo na proliferação de MDA435
quando cultivada em contato com MC de Wnt3A, porém, em MCF7 nenhum
efeito foi observado. WNT5A não alterou a proliferação de nenhuma das duas
linhagens (Fig.37A). Foi analisada ainda a proliferação das células
transfectadas com -catenina WT ou -catenina S33Y, não sendo observada
modulação na taxa de proliferação pela transfecção (dados não mostrados).
Essas mesmas células foram comparadas na presença ou ausência de
Quercetina e, num primeiro momento, nenhuma modificação morfológica foi
observada (dados não mostrados). Porém, quando calculado o percentual de
proliferação foi observada inibição em todas as linhagens tratadas com
quercetina, com uma variação, principalmente dependendo da linhagem,
MDA231 (26,8%), MDA231 WT (44,9%±8.4), MDA231 S33Y (34,5%±0.8), 44
RESULTADOS
140
(22,3%±9.8), 44 WT (14,8%±7.1), 44 S33Y (23,3%±13.8), 435 (35%±4.7), 435
WT (41,7%±16.9) e 435 S33Y (43%±6.8), porém, embora as diferenças ainda
não tenham sido estatisticamente significativas, todas tiveram suas taxas
proliferativas reduzidas por quercetina independentemente do grau de ativação
da via de WNT (Fig.37B).
Figura 37. Efeito da via de Wnt na proliferação de células tumorais. (A) As células
MCF7 e MDA435 foram cultivadas na presença de MC rico em Wnt3A ou Wnt5A e, após 48h, as células foram quantificadas. *Diferença significativa (p=0,02) em relação ao controle (n=3). (B) As Análise do efeito de quercetina na proliferação das linhagens
parentais e suas subpopulações isoladas estáveis com expressão de -catenina selvagem (WT) ou constitutivamente ativa (S33Y). As linhagens comparadas na presença ou ausência de quercetina foram MDA231 (barras pretas), T47D CD44+ (barras brancas) e MDA435 (barras listradas) (n=2).
4.18. Avaliação da capacidade de invasão das linhagens transfectadas
A partir das populações resistentes estabelecidas, ensaios de invasão
foram realizados em esferóides mistos de MO e de FPH. Verificou-se que para
MDA231, tanto em esferóides mistos quanto em esferóides de FPH, a
população estável WT apresentou uma tendência de redução na capacidade
invasiva das células tumorais, sendo este fenômeno mais acentuado e
estatisticamente significativo, no caso dos esferóides mistos, na população
originada do plasmídeo constitutivamente ativo (S33Y); mostrando-se, assim,
RESULTADOS
141
dose-dependente (Fig. 38A). As demais linhagens não apresentaram o mesmo
efeito, mantendo sua capacidade invasiva independente da ativação da via
canônica de WNT (Fig.38B-C).
Figura 38. Efeito da ativação da via canônica de Wnt na invasão de células tumorais em esferóides mistos ou de FPH. Linhagens tumorais MDA231 (A), T47D
CD44+ (B) e MDA435 (C) foram transfectadas com plasmídeos contendo -catenina selvagem (WT) ou constitutivamente ativa (S33Y), selecionadas e co-cultivadas com esferóides mistos ou de FPH. Após 16h de migração os esferóides, mistos (barras brancas) ou de FPH (barras pretas), e seus respectivos sobrenadantes, foram coletados e analisados por citometria de fluxo e o percentual de invasão determinado. MDA231 (MO,n=3, FPH,n=2), T47D CD44+ (MO,n=2, FPH,n=1), MDA435 (n=1).
Outra abordagem utilizada foi a inibição farmacológica da via de WNT
pela droga Quercetina (Park et al., 2005a). As linhagens foram pré-incubadas
por 24h em meio contendo 100M de Quercetina e, em seguida, co-cultivadas
com os esferóides na presença de Quercetina. Obtivemos neste experimento
uma tendência geral da quercetina a estimular a migração nas diversas
linhagens estudadas. Isso pôde ser visto tanto em esferóides mistos (Fig.39B-
C), quanto em esferóides de FPH (Fig.39E). Tanto nas linhagens parentais,
quanto nas estáveis -catenina selvagem, bem como nas estáveis S33Y
(Fig.39B;C e E). Porém, ficou bem claro que existe uma variabilidade
dependendo da linhagem estudada, por exemplo, em esferóides mistos.
Enquanto a MDA435 mostrou efeito em todas as subpopulações estudadas, a
T47D CD44+ mostrou efeito apenas na população S33Y, e MDA231 não
RESULTADOS
142
apresentou efeito em nenhuma das subpopulações (Fig.39A-C).
Curiosamente, observamos que a subpopulação S33Y da linhagem MDA231,
em esferóides de FPH, teve sua migração inibida por Quercetina (Fig.39D).
Figura 39. Análise do bloqueio farmacológico da via canônica de Wnt na invasão de células tumorais em esferóides mistos ou de FPH. Linhagens tumorais MDA231
(A;D), T47D CD44+ (B;E) e MDA435 (C) parentais, com cópia adicional de -catenina
selvagem (WT) ou -catenina constitutivamente ativa (S33Y) foram postas para migrar em esferóides mistos ou de FPH na presença ou ausência de Quercetina. Após 16h de migração, os esferóides, mistos ou de FPH e seus respectivos sobrenadantes foram coletados e analisados por citometria de fluxo de forma a permitir a construção de gráfico demonstrando o percentual de migração de cada linhagem em cada situação. (n=1).
DISCUSSÃO
143
5. DISCUSSÃO
A metástase para a medula óssea é um fator de pior prognóstico no
câncer de mama e tem sido atribuída a disseminação precoce de células com
características de células-tronco do câncer de mama. Nossos resultados
indicam que as células mesenquimais do estroma da medula óssea favorecem
o comportamento invasivo de células de tumor de mama em modelo 3D que
mimetiza o nicho subendosteal, por mecanismo dependente de galectina-3 e
independente da via canônica de Wnt. As células tumorais invasivas, embora
apresentassem fenótipo de células-tronco do câncer de mama, não foram
capazes de gerar, nem in vitro nem in vivo, a progênie de células diferenciadas
luminais.
No câncer de mama, um pior prognóstico tem sido atribuído a
disseminação precoce do tumor, em especial para a medula óssea (MO), que
tem surgido como um fator prognóstico independente (Braun et al., 2009; Braun
et al., 2001; Braun et al., 2000; Braun et al., 2005; Engel et al., 2003; Ozbas et
al., 2003; Pantel & Otte, 2001; Vincent-Salomon et al., 2008). Porém, como
esse processo ocorre e quais os sinais que sustentam as células tumorais na
medula ainda não são conhecidos. A medula óssea possui diversos nichos,
mas, particularmente, o nicho subendosteal, para onde as HSC migram e onde
se mantêm quiescentes e auto-renovam, surge como um nicho ideal capaz de
proteger células tumorais da ação de quimioterápicos (Ishikawa et al., 2007).
Ensaios utilizando camundongos imunodeficientes ou geneticamente
modificados, bem como modelos in vitro, têm contribuído enormemente para a
caracterização do nicho de HSC, incluindo a importância dos osteoblastos na
indução de quiescencia das HSC e, portanto, da quimioresistência das
DISCUSSÃO
144
leucemias (Adams et al., 2006; Calvi et al., 2003; Ishikawa et al., 2007; Nilsson
et al., 2006; Suda et al., 2005; Taichman, 2005; Wilson & Trumpp, 2006; Zhang
et al., 2003). No entanto, modelos in vivo são extremamente complexos, além
de poderem ocultar detalhes espécie-específicos. Por outro lado, modelos in
vitro bidimensionais não reproduzem as sutilezas da organização tridimensional
que as células estabelecem in vivo (Abbott, 2003; Frankel et al., 1997; Klunder
& Hulser, 1993; Weaver et al., 1997; Wolf et al., 2003a).
Para investigar a interação de células humanas num microambiente
tridimensional que mimetizasse o nicho subendosteal, formado por células
estromais de MO humanas, foram desenvolvidas culturas 3D do tipo esferóide
de MSC isoladas de MO humana osteoinduzidas ou não. O tempo de indução
osteogênica de apenas uma semana foi determinado, uma vez que existem
evidências de que osteoblastos imaturos, mas não os terminalmente
diferenciados, são capazes de sustentar a osteoclastogênese in vitro (Atkins et
al., 2003) e in vivo (Corral et al., 1998). Além disto, foi demonstrado que MSC
de MO humana, cultivadas por mais de duas semanas na presença de meio
osteoindutor, perdem sua capacidade de sustentar a hematopoese in vitro e,
embora sejam capazes de formar um ossículo ectópico quando injetadas com
molde de HA/TCP no subcutâneo, não formam cavidade medular (Miura et al.,
2006). No esferóide misto, as duas populações celulares estabeleceram
microambientes específicos com uma clara delimitação entre elas. As células
mostraram ser quiescentes, aspecto esse que deve ser ressaltado, pois está de
acordo com o observado fisiologicamente (Krebsbach et al., 1999). Em nosso
modelo, a morte celular não parece ter sido um evento importante, uma vez
que raras células em apoptose foram observadas nas preparações
DISCUSSÃO
145
histológicas. Além disso, a viabilidade celular pelo método de exclusão com
azul de tripan, após dissociação dos esferóides, foi sempre acima de 95%
(dados não mostrados) e análises por técnica de TUNEL nos mostraram que
apenas 10% das células se encontravam em apoptose.
Na MO, a distribuição de moléculas da matriz extracelular é bastante
peculiar (Nilsson et al., 1998). Observou-se nos esferóides mistos um padrão
semelhante, com deposição de colágeno I restrita a região de MSC
osteoinduzidas, confirmando sua diferenciação para a linhagem osteogênica e
ampla distribuição de fibronectina, formando uma rede tridimensional em
ambas as regiões, porém, mais abundante na camada de MSC não induzidas;
enquanto a deposição de colágeno IV e laminina era escassa e descontínua. A
presença de laminina em ambas as regiões diferiu do observado in vivo, mas
pode ser atribuída a origem perivascular das MSC de MO (Sacchetti et al.,
2007) e ao estabelecimento de fenótipo de célula de parede de vaso in vitro
(Dennis & Charbord, 2002), estando de acordo com a observação de que nos
esferóides as MSC mantêm a expressão de α-actina de músculo liso. A
presença de osteopontina foi investigada nos esferóides mistos, uma vez que
sua produção é atribuída aos osteoblastos subendosteais e seu papel na
localização no nicho subendosteal e indução de quiescência das HSC foi
demonstrado (Nilsson et al., 2005; Stier et al., 2005). Observou-se a presença
desta proteína em ambas as regiões de MSC, induzidas e não induzidas, não
tendo sido possível determinar se havia diferenças quantitativas na expressão
e síntese desta molécula. No entanto, notou-se, por vezes, a presença de focos
de osteopontina depositados na interface das duas populações de MSC.
Portanto, o modelo de esferóide misto mostrou semelhanças com o observado
DISCUSSÃO
146
in vivo, porém análises funcionais quanto a sua capacidade de induzir a
migração das HSC e sua localização foram necessárias para avaliar seu
potencial como modelo de nicho subendosteal.
O enxerto de longo-prazo das HSC depende de homing, migração
transmedular e ancoragem em nicho específico. A cinética de migração das
células CD34+ de SC nos esferóides mistos e simples não-induzidos foi
inicialmente similar. Porém, após 24h, observou-se um platô, determinado por
um equilíbrio dinâmico entre a entrada e saída das células. Por outro lado, a
migração contínua de células CD34+ humanas de SC ou MO nos esferóides
osteo-induzidos parece dever-se a retenção destas, indicando que há uma
adesão mais forte que mobilidade celular. Esses fenômenos são
aparentemente específicos da origem celular, uma vez que células CD34+ de
SC migram mais eficientemente que as de MO em camundongos
imunodeprimidos (Bonig et al., 2006) e espécie-específicos, uma vez que
células progenitoras hematopoéticas humanas migram continuamente em
esferóides de MO murinos (Bug et al., 2002). A entrada e saída dos
progenitores hematopoiéticos nos esferóides mistos reproduz a migração
durante a regeneração da MO após administração intravenosa de progenitores
hematopoéticos (Askenasy et al., 2003).
A localização especifíca das células CD34+, na interface entre as duas
populações estromais dos esferóides mistos – o que não foi observado nos
esferóides simples, osteo-induzidos ou não –, sugere que ambas as
populações estromais de medula, ou seja, células mesenquimais do estroma e
osteoblastos secretores de colágeno I, são necessárias e suficientes para
estabelecer um microambiente informativo, que permite o posicionamento e o
DISCUSSÃO
147
controle da proliferação dos progenitores hematopoéticos. Essa ancoragem da
HSC na região subendosteal é provavelmente determinada por gradientes
opostos de fatores associados com osteoblastos e MSC, tais como íons de
cálcio (Adams et al., 2006; Adams & Scadden, 2006) e SDF-1. A deleção de
osteoblastos sob o controle do promotor de colágeno I, mas não osteocalcina,
é seguida de diminuição no número de HSC, sugerindo que osteoblastos não
terminalmente diferenciados são importantes organizadores do nicho
subendosteal, e nossos resultados apóiam essa hipótese. Apenas uma semana
de osteo-indução foi suficiente para levar à perda de α-actina de músculo liso e
induzir secreção de colágeno I, tendo sido estas células capazes de reduzir a
proliferação de células progenitoras hematopoéticas que interagiram com o
esferóide. O conjunto de dados permite concluir que o modelo de esferóide
misto mimetiza propriedades do nicho subendosteal e, portanto, é apropriado
para investigar mecanismos de invasão medular por células de câncer de
mama. O modelo de CSC de mama levantou a hipótese de que estas seriam
responsáveis pela disseminação precoce e micrometástase medular, tendo
sido observado que a maioria das células tumorais detectadas na medula
óssea mostra o fenótipo de CSC de mama descrito por Al-Hajj e colaboradores
em 2003 (Balic et al., 2006; Reuben et al., 2011). No entanto, recentemente
demonstrou-se que linhagens de tumor de mama podem adquirir o fenótipo de
CSC a partir da EMT (Blick et al., 2010; Mani et al., 2008). Embora linhagens
celulares tumorais sejam derivadas de crescimento clonal de subpopulações
que sobreviveram às pressões seletivas in vitro, e por isso não representem
plenamente tumores clínicos in vivo, descrições recentes têm mostrado a
associação entre seus perfis transcricionais e subtipos específicos de câncer
DISCUSSÃO
148
de mama. Cerca de setenta linhagens foram estudadas e classificadas como
mesenquimais (Basal B), basais (Basal A) e luminais (Blick et al., 2010; Blick et
al., 2008; Neve et al., 2006). Notou-se que a expressão de CD24 e CD44,
marcadores utilizados para caracterizar as CSC de mama (Al-Hajj et al., 2003),
era diferencialmente modulada, ou seja, a expressão aumentada de CD44 foi
observada no subtipo mesenquimal/Basal B, enquanto o subtipo luminal se
caracterizava pela expressão aumentada de CD24 (Blick et al., 2010; Neve et
al., 2006). A análise da expressão de CD24 e CD44 nas linhagens MCF-7,
MDA231 e MDA468 mostrou-se de acordo com o descrito (Neve et al., 2006).
Porém, ao contrário desses estudos, que concordam que a linhagem T47D
pertence ao subgrupo luminal, demonstramos que esta linhagem é
heterogênea, apresentando duas subpopulações distintas, uma CD24+CD44-/Lo
luminal e outra CD24-/LoCD44Hi mesenquimal (basal B), cujo fenótipo se
mostrou estável após seleção e expansão in vitro. O potencial tumorigênico das
sublinhagens de T47D foi testado e observou-se que a subpopulação
CD24+/CD44- não é tumorigênica, ao contrário da população CD44-/LoCD24Hi
que mostrou-se tumorigênica e invasiva in vivo e in vitro, classificados,
respectivamente, em subtipo luminal e basal B/mesenquimal (Blick et al., 2010;
Honeth et al., 2008; Neve et al., 2006). Porém, nos tumores formados pela
subpopulação CD44+ não houve aparecimento da população CD24+/CD44-,
questionando, assim, a hipótese das células CD24-CD44+ representarem, de
fato, células-tronco do câncer mama. Esse resultado concorda com uma nova
linha de estudos que vem questionando a teoria de células-tronco tumorais. Ao
demonstrar que o desenvolvimento tumoral é dependente do modelo de animal
imunodeficiente, ou seja, do quão imunocomprometido ele é, e do meio
DISCUSSÃO
149
utilizado na injeção das células-tronco tumorais, esses estudos levantaram a
questão da influência do microambiente e de mecanismos epigenéticos na
determinação do comportamento tumoral (Bissell & Inman, 2008; Bissell et al.,
2002; Jaenisch & Bird, 2003; Quintana et al., 2008). Portanto, não é possível
descartar a hipótese de que a ausência de reconstituição da população tumoral
luminal a partir da população tumorigênica CD44+, seja consequência de uma
limitação do modelo utilizado, injeção em meio de cultura em glândula mamária
de camundongo NUDE.
O co-cultivo das diferentes linhagens de tumor de mama com esferóides
mistos ou simples de fibroblastos, utilizados como um controle de invasão de
sítio primário, mostrou que o modelo permite avaliar o potencial invasivo, pois a
invasão dos esferóides somente ocorreu pelas linhagens descritas como
invasivas. Curiosamente, observou-se que o percentual de invasão dessas
linhagens nos esferóides de MO foi significativamente maior do que nos
esferóides de FPH. Deve ser ressaltado que a invasão de esferóides
desenvolvidos com MSC derivadas de tecido adiposo humano foi semelhante
ao observado com os esferóides de FPH. Neste sentido, ensaios de co-cultivo
simultâneo de células estromais de medula ou FPH e linhagem tumoral
mostraram uma maior afinidade das linhagens pelas células de MO, uma vez
que ambas se mantiveram homogeneamente distribuídas; enquanto que com
fibroblastos, duas camadas celulares se formaram. Esse fenômeno de
exclusão baseado em afinidade ocorre com bastante frequência durante a
embriogênese e envolve afinidade de moléculas de adesão (Foty & Steinberg,
2004; Taneyhill, 2008).
DISCUSSÃO
150
Outros mecanismos para explicar a maior invasão de esferóides de MO
incluiriam a expressão diferenciada de: quimiocinas como CXCL12/SDF-1α
(fundamental em processos de migração na MO); SCF, (organiza
microdomínios de membrana contendo CXCR4 e aumenta motilidade de HSC);
e Wnt5a (antagonista da via canônica de Wnt que está relacionada com
migração celular) (Bonig et al., 2006; Hart et al., 2004; Li et al., 2011; Medrek et
al., 2009; Serra et al., 2011) . Porém, análises por RT-PCR demonstraram que
a expressão de SDF-1, SCF e WNT5a não era diferente em MSC de MO
comparado com FPH.
Outra hipótese seria que diferenças no microambiente, em especial na
composição da matriz ou na sua estrutura física (rigidez), poderiam influenciar
a invasão tumoral. Elementos de matriz como Gal-3 têm sido correlacionados
com modulação de migração/invasão, enquanto o aumento na rigidez da matriz
tem sido correlacionado com aquisição de fenótipo invasivo por células
tumorais de mama (Alcaraz et al., 2008; Miroshnikova et al., 2011; Ochieng et
al., 2004; Paszek et al., 2005).
A galectina-3 tem ação ambivalente na migração, pois sua concentração
determina se a migração será estimulada ou inibida. Acredita-se que em baixas
concentrações (0.1–0.25 μM) suas interações com integrinas (corretamente
glicosiladas) e elementos da matriz ajudem a formar redes que favoreçam a
adesão celular. Porém, em altas concentrações (acima de 5μM) sua ação,
sequestrando sítios de moléculas de adesão e induzindo endocitose de grupos
de integrina, perturba as interações célula-célula ou célula-matriz dependentes
de glicoproteínas e integrinas, levando à perda de adesão e metástase
(Ochieng et al., 2004).
DISCUSSÃO
151
Verificou-se que Gal-3 era mais expressa em esferóides de MO do que
nos de FPH, sugerindo seu envolvimento na maior invasão dos esferóides de
MO. Verificou-se que o tratamento dos esferóides com anticorpo contra Gal-3
induziu uma redução na invasão dos esferóides de MO pelas linhagens
tumorais de mama. Mais: sua ausência no microambiente acarretou uma
diminuição significativa do percentual de invasão dos esferóides de MO.
Importante ressaltar que foram reportadas correlações, em pacientes, entre a
presença de Gal-3 no soro e/ou nas células estromais do tumor de mama com
maior malignidade e pior prognóstico, indo de acordo com os nossos resultados
(Iurisci et al., 2000; Moisa et al., 2007).
Além da sua ação no microambiente, Gal-3 tem também ação
intracelular. Em câncer de mama, foi demonstrado que sua superexpressão na
célula tumoral leva a aumento de motilidade e sobrevivência frente a estímulo
apoptótico, enquanto sua supressão leva à reversão do fenótipo transformado
(Cheong et al., 2009; Honjo et al., 2001). Análise da sua presença e localização
nas linhagens tumorais mostrou que não houve correlação entre o potencial
invasivo das linhagens e a expressão e localização intracelular de Gal-3, que
estava presente tanto no núcleo, quanto no citoplasma, em todas as linhagens
estudadas. Curiosamente, ela não foi detectada na fração insolúvel,
enriquecida em membranas celulares, de nenhuma das linhagens estudadas,
sugerindo que não há contribuição default microambiental de galectina-3 pelas
linhagens. Porém, pode-se observar que dentre as linhagens humanas, a
subpopulação T47D CD44+ foi a que apresentou maior diminuição da invasão
frente ao bloqueio ou ao nocauteamento de Gal-3, e que, junto com a
população CD24+, mostrou menor quantidade de Gal-3 intracelular. Portanto,
DISCUSSÃO
152
pode-se sugerir a hipótese de que as linhagens tumorais sejam capazes de
secretar, de forma compensatória, Gal-3 no microambiente quando esta está
ausente. Essa hipótese será investigada posteriormente.
O papel de Gal-3 na invasão levantou a hipótese de envolvimento da via
de Wnt, uma via de sinalização bastante relacionada com invasão em cânceres
em geral e que, recentemente, tem sido associada à via de Gal-3 em câncer
colo-retal, de glândulas salivares e de tireóide (Ferrazzo et al., 2009; Shi et al.,
2007; Weinberger et al., 2007). Essa conexão, como já dito, se dá tanto por
mediadores intracelulares comuns às duas vias (Shimura et al., 2005), quanto
por uma parceria direta, na qual Gal-3, no núcleo, interage diretamente com β-
catenina no complexo TCF, induzindo atividade transcricional (Shi et al., 2007;
Shimura et al., 2004). Em câncer de mama essa correlação não foi estudada e
o papel da via de Wnt é ainda bastante controverso (Lin et al., 2000; Wong et
al., 2002; Zardawi et al., 2009). Verificou-se, nos ensaios de invasão em
esferóide, que, a expressão aumentada de β-catenina selvagem ou expressão
de β -catenina mutada não modificou o potencial invasivo da maioria das
linhagens tumorais, à exceção da linhagem MDA231, onde uma inibição foi
observada. A hipótese de saturação da atividade da via foi levantada e, para
verificar se confirmava, foi realizado bloqueio da via pela adição de quercetina.
Resultados preliminares indicam que há, de fato, uma tendência de aumento
na taxa de invasão de todas as linhagens estudadas, tanto em MO quanto em
FPH. No entanto, o número amostral deste experimento é limitante, o que
trouxe certa variação experimental. Embora o papel da ativação da via
canônica de Wnt na invasão de células de tumor de mama ainda deva ser
esclarecido, a proliferação das linhagens foi efetivamente modulada pela via de
DISCUSSÃO
153
Wnt. A adição de meio condicionado rico em Wnt3a (via canônica) levou ao
aumento de proliferação da linhagem MDA435, e o bloqueio da via, por
quercetina, inibiu a proliferação de todas as linhagens invasivas. Curiosamente,
meio condicionado rico em Wnt3a não foi capaz de estimular a proliferação da
linhagem não invasiva MCF7, mostrando que existe variação dependendo da
linhagem utilizada. Em conjunto, esses resultados sugerem que as funções de
migração e proliferação são controladas dissociadamente.
O estímulo de proliferação pela via de Wnt e sua inibição por quercetina
condiz com o esperado, uma vez que a via canônica de Wnt leva à expressão
de c-myc e ciclina D1 (Daniels & Weis, 2005; MacDonald et al., 2009). Já o
fenômeno de inibição da invasão devido a estimulo da via foi inicialmente
surpreendente, porém, como dito anteriormente, o papel da via de Wnt no
câncer de mama não é conclusivo. Há divergências entre os diferentes grupos,
com relatos mostrando que a ocorrência de β-catenina nuclear em populações
de carcinoma invasivo dutal é rara, sendo mais comum a marcação
citoplasmática que se correlaciona com expressão de ciclina D1 (Lin et al.,
2000). Outros grupos correlacionaram o envolvimento de linfonodos (pior
prognóstico) com a diminuição da marcação de β- catenina (Wong et al., 2002;
Zardawi et al., 2009) . Foram demonstradas em fibroblastos algumas linhagens
de carcinoma de cólon (SW48, HCT116, SW480 e DLD1), de melanoma
(M619) e, na linhagem HeLa, demonstrado que o aumento da expressão de β-
catenina não leva a EMT, mas sim a apoptose (Kim et al., 2000). O grupo do
Dr. Weinberg mostrou, em 2008, que o aumento da expressão de β-catenina
em linhagem imortalizada de epitélio mamário não era suficiente para induzir
EMT (Onder et al., 2008). No entanto, a interação entre moléculas de caderina
DISCUSSÃO
154
e β-catenina pode ser um fator relevante neste processo. De fato, a ocorrência
de EMT está relacionada à perda de E-caderina, que pode ocorrer por
clivagem, seguida do deslocamento de β-catenina não fosforilada da junção
aderente e seu acúmulo no citoplasma, permitindo sua fosforilação, caso a via
de Wnt esteja ativa; deslocamento para o núcleo e associação com TCF/LEF
(Gottardi & Gumbiner, 2004; Huber et al., 2005; Hugo et al., 2011); e ainda
ação do fragmento CTF2 de E-caderina como fator de transcrição, reforçando a
progressão EMT (Daniel, 2007; Huber et al., 2005). Outro meio de indução de
EMT é por ação direta ou indireta na expressão de E-caderina, reduzindo-a e
levando aos mesmos fenômenos posteriores (Hugo et al., 2011). É importante
ressaltar que a estabilidade das caderinas nas junções aderentes dependem
da sua associação a p120 e β-catenina. Quando a E-caderina não está ligada a
p120 e β-catenina ela expõe um domínio dileucina que leva a sua
desestabilização e endocitose, desmembrando a junção (Davis & Reynolds,
2006; Green et al., 2010; Paterson et al., 2003). Levantou-se a hipótese de que
o acúmulo de β-catenina nas células transfectadas se associaria às moléculas
de E-caderinas estabilizando as junções e, assim, inibindo a invasão em um
fenômeno oposto a EMT. Para avaliar essa hipótese, serão investigadas a
expressão e localização intracelular de E-caderina e β-catenina nas células
transfectadas e tratadas ou não com quercetina.
Concluindo: somente as linhagens tumorais de mama, com fenótipo
descrito para células-tronco, invadem efetivamente o modelo de esferóide
misto que mimetiza propriedades do nicho subendosteal, de forma mais
eficiente do que os esferóides de FPH. A invasão parece ser dependente da
presença de galectina-3 no microambiente. Quanto às vias de sinalização
DISCUSSÃO
155
envolvidas no processo de invasão dos esferóides, não houve correlação entre
a expressão intracelular de galectina-3 e a ocorrência ou grau de invasão,
porém, a ativação da via canônica de Wnt se correlacionou diretamente com a
proliferação celular e inversamente com a invasão. Portanto, os dados
permitem levantar a hipótese de que o microambiente medular subendosteal
rico em galectina-3, junto com o ―desligamento‖ da via de Wnt na célula tumoral
de mama, seja fundamental para indução de um estado menos proliferativo e
mais invasivo durante o estabelecimento da micrometástase de mama na
medula óssea.
CONCLUSÕES
156
6. CONCLUSÕES
O modelo esferóide misto reproduz propriedades do nicho
subendosteal e serve como modelo de migração de células
CD34+ e de invasão para células tumorais de mama.
As células estromais de MO apresentam maior afinidade e são
mais eficientes na indução de invasão do que fibroblastos, sejam
de pele ou derivados de tecido adiposo.
Houve correlação entre invasividade e alta expressão de CD44.
Foi possível isolar populações estáveis CD44 e CD24 a partir de
linhagem T47D, com capacidades invasivas e tumorigênicas
distintas, porém, uma não deu origem a outra in vitro ou in vivo.
A galectina-3 presente no microambiente se mostrou fundamental
na indução de invasão tumoral. Não há correlação entre
galectina-3 citoplasmática ou nuclear com o grau de invasividade
das células tumorais.
A via canônica de Wnt se correlacionou inversamente com a
capacidade de invasividade tumoral e diretamente com a
capacidade de proliferação dessas células.
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ANEXO I
182
8. ANEXO I
Soluções Utilizadas
Phosphate Buffered Saline – PBS
NaCl 8,0g KCl 0,2g Na2HPO4 1,2g KH2PO4 0,2g H2O tridestilada q.s.p. 1000mL PH 7,4 Autoclavar para esterilizar. Meio de Congelamento Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 10% Soro fetal Bovino (SFB) 40% Meio Iscove’s 50% Tripsina-EDTA
Tripsina 0,125g EDTA 0,02g BSS.CMF q.s.p. 100mL PH 7,8 Solução de Azul de tripan
Azul de Tripan 400mg PBS q.s.p. 100mL PH 7,2 Solução de TURK
Ácido Acético 2% Cristal Violeta 0,01% Fixador de Eletrônica Glutaraldeído 2,5% Em tampão Cacodilato 0.1 M com 3,5% sacarose pH 7,4
ANEXO I
183
Tampão Cacodilato 0,1M Cacodilato Sódico 4,28g Cloreto de Cálcio 25g Ácido Hidroclórico 0,2N 2,5mL H2O destilada q.s.p. 200mL PH 7,4 Tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) Tris 4,84g Ácido Acético Glacial (Merck) 2 mL EDTA 0,5 M 2 mL H2O destilida q.s.p 1000 mL Ajustar o pH para 8,0
ANEXO II
184
9. ANEXO II
Osteoblasts and Bone Marrow Mesenchymal StromalCells Control Hematopoietic Stem Cell Migration andProliferation in 3D In Vitro ModelAna Paula D. N. de Barros1, Christina M. Takiya1, Luciana R. Garzoni2, Mona Lisa Leal-Ferreira3, Helio S.
Dutra1, Luciana B. Chiarini3, Maria Nazareth Meirelles2, Radovan Borojevic1, Maria Isabel D. Rossi1*
1 Hospital Universitario Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil, 2 Departamento de Ultrastructura e Biologia Celular,
Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brazil, 3 Instituto de Biofısica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
Abstract
Background: Migration, proliferation, and differentiation of hematopoietic stem cells (HSCs) are dependent upon a complexthree-dimensional (3D) bone marrow microenvironment. Although osteoblasts control the HSC pool, the subendostealniche is complex and its cellular composition and the role of each cell population in HSC fate have not been established. Invivo models are complex and involve subtle species-specific differences, while bidimensional cultures do not reflect the 3Dtissue organization. The aim of this study was to investigate in vitro the role of human bone marrow–derived mesenchymalstromal cells (BMSC) and active osteoblasts in control of migration, lodgment, and proliferation of HSCs.
Methodology/Principal Findings: A complex mixed multicellular spheroid in vitro model was developed with human BMSC,undifferentiated or induced for one week into osteoblasts. A clear limit between the two stromal cells was established, anddeposition of extracellular matrix proteins fibronectin, collagens I and IV, laminin, and osteopontin was similar to theobserved in vivo. Noninduced BMSC cultured as spheroid expressed higher levels of mRNA for the chemokine CXCL12, andthe growth factors Wnt5a and Kit ligand. Cord blood and bone marrow CD34+ cells moved in and out the spheroids, andsome lodged at the interface of the two stromal cells. Myeloid colony-forming cells were maintained after seven days ofcoculture with mixed spheroids, and the frequency of cycling CD34+ cells was decreased.
Conclusions/Significance: Undifferentiated and one-week osteo-induced BMSC self-assembled in a 3D spheroid andformed a microenvironment that is informative for hematopoietic progenitor cells, allowing their lodgment and controllingtheir proliferation.
Citation: de Barros APDN, Takiya CM, Garzoni LR, Leal-Ferreira ML, Dutra HS, et al. (2010) Osteoblasts and Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells ControlHematopoietic Stem Cell Migration and Proliferation in 3D In Vitro Model. PLoS ONE 5(2): e9093. doi:10.1371/journal.pone.0009093
Editor: Raquel Goncalves, Universidade do Porto, Portugal
Received July 27, 2009; Accepted January 12, 2010; Published February 8, 2010
Copyright: � 2010 de Barros et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was supported by grants of the Brazilian agencies Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, Conselho Nacional dePesquisa, Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nıvel Superior, and Associacao e Programa de Biologia Celular Aplicada a Medicina. The funders had norole in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
Introduction
Self-renewal and multilineage differentiation capacities that are
dependent upon complex cell-autonomous and cell non-autono-
mous regulatory mechanisms are hallmarks of hematopoietic stem
cells (HSC). In vivo studies have extensively documented the
concept of a HSC niche, described as a three-dimensional
microenvironment within the subendosteal region of bone marrow
(BM) [1–3]. In this niche, HSC are protected from differentiation
and loss of stem cell function possibly by induction of quiescence
[4]. When they leave it, they enter into the transitional amplifying
pool of committed progenitors, followed by terminal differentia-
tion. However, HSC can exit the niche, circulate in blood, and
eventually return to the BM niche. HSC homing to bone marrow
is thus a physiological process [5,6]. The role of several molecules
such as the chemokine CXCL12 (SDF1-a), b1-integrins, and
metalloproteinases in homing has been identified [7-9], but the
complex interplays of cells and extracellular matrix (ECM) that
allow some HSC to lodge at the subendosteal niche while others
are actively mobile in the marrow cavity after intravenous
injection [10,11] are still puzzling. Furthermore, changes in the
cellular composition of the niche modify the rate of HSC
mobilization and homing [12]. Since the HSC niche was largely
defined by their localization in marrow cavity, characterization of
the stromal cell population within this niche and their role in the
niche are still to be determined.
In the subendosteal niche, osteoblasts have been proposed to be
a crucial component, controlling HSC fate, the size of HSC pool
[13,14], and HSC quiescence [15], by production of factors, such
as angiopoietin-1 [16], CXCL12 [17,18], and osteopontin [19,20].
Cells of the sympathetic nerves [21] and osteoclasts [22] were
recently described as important components of the niche.
Furthermore, the subendosteal region is complex, harboring all
cells that line at the interface between the bone surface and the
marrow cavity, including stromal cells with differences in their
osteogenic and myelopoietic supportive potential [23]. The
PLoS ONE | www.plosone.org 1 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
endosteal surface of bones is covered not only by a heterogeneous
cell population called bone lining cells [11,24], but also by actively
bone-producing osteoblasts [24].
Besides the subendosteal niche, HSC were also observed close
to sinusoids, and the existence of a vascular niche was claimed
[25], raising the question about the contribution of each niche to
HSC regulation [26]. Trabecular bones are aligned with blood
vessels [27] that are part of the bone remodeling compartment
[28]. Recent data showed that the subendosteal region is also rich
in blood vessels [11,29,30], suggesting that endothelial cells that
were shown to contribute to hematopoiesis [31] might be part of
the subendosteal niche. Blood vessel walls harbor a reserve of
progenitor cells, known as mesenchymal stem cells or mesenchy-
mal stromal cells [32–35]. Bone marrow-derived mesenchymal
stromal cells (BMSC) exhibit the phenotype and anatomy of
adventitial reticular cells [34] and organize marrow microenvi-
ronments when injected in vivo [34,36], but their role in the
subendosteal niche has not been fully studied. They were proposed
to control HSC homing during ontogeny [37] and their renewal
during adult life, phenomena that are dependent upon species-
specific factors [38]. Despite the increasing knowledge on the HSC
niche, central questions on the relative importance of each cell
type, how they cooperate, as well as how HSC localize within the
subendosteal niche which regulates their anchorage to osteoblasts
require further analyses.
In vivo studies are restricted to animal models that might not
reproduce species-specific subtleties. Although the contribution of
conventional hematopoietic culture systems to the knowledge of
human HSC biology is unquestionable, they are reductionist and
do not reproduce the complex three-dimensional hematopoietic
microenvironment. Striking differences in gene expression using
bidimensional (2D) cultures as opposed to those obtained in vivo
and in three-dimensional (3D) cultures have been reported [39].
The idea that mechanical and structural cues influence cell
behavior and cell fate decisions is increasingly clear [40].
Our goal was to address the question of the relative
participation of active osteoblasts and BMSC in the control of
migration, anchorage, and proliferation of HSC. We have
developed a 3D culture model with human BMSC that mimic
the subendosteal region. We report that BMSC and osteo-induced
BMSC assembled to form a well-organized multicellular spheroid
where a clear boundary between these two cell populations were
observed. Furthermore, human hematopoietic progenitor cells
migrated dynamically in and out of these complex spheroids,
where they lodged within discrete regions.
Results
Morphological Characterization of Simple and MixedBMSC Spheroids
Considering that the three-dimensional structure of bone
marrow may be important for the organization of specialized
niches, undifferentiated (non-induced) BMSC were cultured on a
non-adherent surface that favors cell aggregation. After 4 days,
BMSC formed spheroid structures (simple non-induced spheroids)
of approximately 400 mm diameters (420 mm 6 23.7) (Fig. 1A–B).
Scanning electronic microscopy showed that cells with numerous
filopodia-like projections contacted neighboring cells (Fig. 1C) and
delicate filaments indicative of extracellular matrix (ECM) (Fig. 1D,
arrow) formed a smooth external layer (Fig. 1B). Histological and
ultrastructural sections of simple non-induced spheroids confirmed
the fusiform aspect of cells at the periphery (Fig. 1E, H). Inner cells
were polyedric (Fig. 1H) and had irregular nuclei, vacuolized
cytoplasms, well-developed rough endoplasmic reticulum and
many mitochondria (Fig. 1F–G). Cytoplasmic projections contact-
ing neighboring cells (Fig. 1F) formed a complex three-dimen-
sional network (Fig. 2A) similar to reticular cells in vivo [41]. The
intercellular space was filled with a granular material suggestive of
ECM deposition (Fig.1F). Osteo-induced BMSC formed similar
spheroids, called simple osteo-induced spheroids (data not shown).
Thus, human BMSC, were able to reassemble in a complex 3D
network similar to reticular cells in the marrow cavity [41].
We were then able to develop mixed spheroids formed by osteo-
induced and non-induced BMSC. The aim was to create
specialized regions, and by surrounding osteo-induced spheroids
with BMSC we sought to mimic the trabecular bone that is also
surrounded by reticular cells. Furthermore, homing of HSC
involves migration throughout a three-dimensional meshwork of
cytoplasmic projections of stromal cells, followed by lodgment at
the subendosteal niche [1,8]. Since cells of the osteoblast lineage
within the endosteal niche are heterogeneous [23,24] and differ in
their capacity to support hematopoiesis [23,36], BMSC were
osteo-induced in vitro for just one week. Osteo-induced cells were
thus plated to form an inner spheroid that was covered with layers
of non-induced BMSC. In fact, non-induced BMSC were found
around the spheroids formed by osteo-induced BMSC. Clear
boundaries were observed between the two cell populations
(Fig. 1I–J).
In tumor spheroids, cell proliferation is seen at the periphery,
and a central necrotic area is observed in spheroids larger than
400–500 mm [42] due to critical O2 concentration in the central
region [42,43]. Cell death may lead to a decrease in the diameter
of spheroids along time [44]. However, the size of simple non-
induced (Fig. 1L) and of mixed spheroids correlated with numbers
of plated cells and did not change with time in culture. We then
investigated the frequency of cell proliferation and death in the
spheroids. In simple non-induced spheroids, cell death reached
11.1% (6 6.43) (Fig. 1K) after 5 days in culture while in mixed
spheroids 18.1% (6 7.1) were observed. Cell proliferation in
simple non-induced and mixed spheroids was evaluated by Ki-67
staining. In agreement with in vivo descriptions [45], almost all the
BMSC cells were quiescent (Fig.1M–N). Distribution of ECM
proteins in bone marrow is well known, so we investigated the
pattern of ECM in mixed spheroids. Similarly to what has been
described in vivo [46], collagen I fibers, the major ECM protein of
bone, were observed exclusively in the central region formed by
osteo-induced BMSC (Fig. 2C–E). No collagen fibers were present
in simple non-induced spheroids (Fig. 2B). Low amounts of
laminin (Fig. 2F), and collagen IV (Fig. 2G), but high levels of
fibronectin (Fig. 2I–J) were present in central and peripheral
regions, as well as in simple non-induced spheroids (Fig. 2K). Since
osteopontin is observed exclusively in the interface between bone
and marrow cavity [20], and it has a fundamental role in the
subendosteal niche [19,20], its expression in mixed spheroids was
also investigated. Osteopontin was expressed at low levels, mostly
at the interface between osteo-induced and non-induced BMSC
(Fig. 2H), suggesting that mixed spheroids reproduced the
subendosteal ECM protein pattern.
Human BMSC constitutively express a-smooth muscle actin (a-
SMA) both in vitro [47] and in vivo [45]. However, it was shown
that a-SMA+ fibroblasts in 2D cultures lose this marker when
cultured in 3D systems such as multicellular spheroids [48].
Comparison between our 2D and 3D cultures, showed that non-
induced BMSC are a-SMA+ in both culture systems (Fig. 2L, N)
although differences in orientation of the filaments were observed.
While stress fibers were present in cells cultured in 2D (Fig. 2L–
M), they were absent in cells that formed 3D spheroids as in vivo
(Fig. 2N–O). Pre-osteoblastic differentiation into more mature
HSC Niche-Like Spheroids
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stages was shown to be associated with a decrease in a-SMA [49].
We observed that in mixed spheroids most osteo-induced BMSC
were negative for a-SMA (Fig. 2P–R), suggesting that one-week of
induction in vitro lead to differentiation of BMSC into a-SMA2
collagen I-secreting osteoblast. We concluded that fresh and osteo-
induced BMSC can be induced to form 3D structures in culture,
with many features previously described for normal marrow
stromal cells in situ.
Differential Gene Expression in BMSC Cultured in 2D or3D
Gene expression pattern differ depending on whether the cells
are grown in a 2D or in a 3D substrates [39]. We sought to
investigate the expression of the transcription factor RUNX2
(CBFA1), which is involved in osteoblast differentiation [24], and
of genes that control HSC properties in the niche [2,3]. Non-
induced as well as osteo-induced BMSC expressed RUNX2,
Notch ligands, DELTA1 and JAG1 (Jagged1), ANGPT1 (Angio-
poietin1), SPP1 (Osteopontin), and the Wnt inhibitor DKK1
(Fig. 3A). No differences were observed regarding the culture
condition. However, non-induced BMSC expressed higher levels
of CXCL12 (Fig. 3B–C), WNT5a (Fig. 3B, D), and KITLG (Kit-
ligand, SCF) (Fig. 3B, E), and the difference was even more
evident in simple non-induced spheroids compared to simple
osteo-induced ones. These findings suggested that in BMSC
normal patterns of gene expression are unlikely to be achieved in
conventional adherent cell cultures and that geometry influences
stromal cell differentiation.
Hematopoietic Progenitor Cells Migrate into Simple andMixed Spheroids
Homing of transplanted HSC to the host marrow is a multi-step
process that involves trans-endothelial migration, followed by
adhesion to the marrow stroma and migration towards the specific
anatomical sites [7,8]. Therefore, we asked whether hematopoietic
cells could invade and physically interact with our in vitro model.
In order to investigate the role of each BM stromal cell population
and their interaction in the control of migration and location of
hematopoietic stem and progenitor cells, magnetically selected
cord blood (CB) or bone marrow (BM) CD34+ cells were co-
Figure 1. Characterization of simple and mixed spheroids. Simple non-induced spheroids are round cell aggregates (A–B) with elongatedcells at the periphery (C, E) that show numerous cytoplasmic projections contacting neighbor cells (C), and delicate filaments (arrow) at the cellsurface, indicative of ECM deposition (D). Inner cells have cytoplasmic vacuoles (F), irregular nucleus, well-developed rough endoplasmic reticulum(arrow), and many viable mitochondria (arrow heads) (G). Phase contrast (A), SEM (B–D), and TEM (E–G). Simple non-induced (H), and mixed (I)spheroids with osteo-induced BMSC at the center. Note the limit between the two cell populations (arrowhead). H–E. (J) Confocal microscopy ofmixed spheroids confirming that CM-Dil labeled osteo-induced BMSC (in red) were confined to the central region. Nuclei were stained with DAPI(blue). (K) Detection of apoptotic cells (in green) in simple non-induced spheroids by TUNEL method after 5 days in culture. Nuclei were stained withDAPI (blue). (L) Correlation between the diameter of simple non-induced spheroids and the number of plated cells after 4 and 11 days of culture. Datarepresent mean of 3 spheroids per cell number per day. Error bars are standard error of the mean (6 SEM). (M–N) Ki-67 expression in simple non-induced (M, full black line) and mixed (N, full black line) spheroids. Dotted lines are isotype control, and grey line (N) represents a cell line (porcineaortic endothelial cell) used as a positive control. Numbers above scale bars represent the value (in micrometers) of each scale bar.doi:10.1371/journal.pone.0009093.g001
HSC Niche-Like Spheroids
PLoS ONE | www.plosone.org 3 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
Figure 2. Extracellular matrix distribution and cytoskeleton organization in simple non-induced and mixed spheroids. (A) Confocalmicroscopy of paraffin sections stained with H&E showing complex cellular interactions in the center of simple non-induced spheroids. (B–D)Picrosirius staining of simple non-induced (B) and mixed (C–D) spheroids showing, by optical (B–C) and confocal (D) microscopy, collagen fiberdeposition restricted to the inner region of mixed spheroids. (E–J) Expression of ECM protein in mixed spheroids. Immunofluorescence staining (ingreen) for collagen I (E), laminin (F), collagen IV (G), osteopontin (H), and fibronectin (I–J). Osteo-induced BMSC were labeled with CM-DiI (red). Anegative control is shown as an insert in (E). (K) Fibronectin expression in simple non-induced spheroids is shown for comparison. (L–O) Expression ofa-SMA (L, N) and actin polymerization (M, O, phalloidin staining) in non-induced BMSC. Note the formation of stress fibers in monolayers (L–M) thatare absent in 3D cultures (N–O). Nuclei were stained with DAPI (blue). (P–R) a-SMA expression (green) in mixed spheroids. Osteo-induced BMSC werelabeled with CM-DiI (red in P, R). Numbers above scale bars represent the value (in micrometers) of each scale bar.doi:10.1371/journal.pone.0009093.g002
HSC Niche-Like Spheroids
PLoS ONE | www.plosone.org 4 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
cultured with simple non-induced, simple osteo-induced, and with
mixed spheroids. CD34+ cells were seen in enzymatically digested
spheroids by FACS analysis (Fig. 4A). No CD34+ events were
found in control spheroids that were not co-cultured with
hematopoietic cells (Fig. 4B). To distinguish migration from
proliferation inside the spheroids, hematopoietic cells were
removed after 24 hours of co-culture, the spheroids were
vigorously washed, and maintained for up to 48 hours. The
content of CD34+ events in washed (1239 6 297.8) and no-washed
(1412.3 6 202.7) spheroids was quite similar (p = 0.309) after
48 hours of culture (Fig. 4C). This suggests that no significant
proliferation of CD34+ cells occurs within 48 hours of co-culture
with mixed spheroids. Migration of CD34+ cells was seen as early
as 4 hours after initiation of co-cultures with simple non-induced
and mixed spheroids and increased thereafter, reaching a plateau
around 24 hours (Fig. 4D). Conversely, in simple osteo-induced
spheroids the cells migrated continuously (Fig. 4D).
Various sources of CD34+ cells are known to differ in their
capacity to engraft immunocompromised mice. For example, CB
CD34+ cells engraft in vivo more rapidly and efficiently than BM
CD34+ cells [50]. We investigated whether our 3D in vitro model
would reproduce these differences, and indeed, BM CD34+ cells
migrated less efficiently than CB CB34+ cells at 16 (p = 0,046) and
24 hours (p = 0,011) (Fig. 4E). Thus, migration into BMSC
spheroids was not random, but depended upon the properties of
CD34+ and stromal cells.
Migration of Hematopoietic Progenitor Cells intoSpheroids Is Dynamic
After BM transplantation, HSC migrate in and out the marrow
within hours [10]. As shown above, in our 3D model, migration of
CD34+ reached a plateau after 24 hours of culture with mixed and
simple non-induced spheroids, but not with simple osteo-induced
spheroids (Fig. 4D). We questioned whether differences in
adhesion to non-induced versus osteo-induce BMSC were leading
to the migration of CD34+ cells in and out of the spheroids.
CD34+ cells were co-cultured for 24 hours with spheroids that
were subsequently washed and maintained in culture. After 24
(Fig. 5A) and 48 hours (Fig. 5B), CD34+ cells migrated out the
mixed spheroids, with no differences between CB and BM CD34+
cells (Fig. 5E). However, CB CD34+ cells migrated out from simple
osteo-induced spheroids to a lesser extent (Fig. 5E), explaining the
absence of a plateau during 48 hours of culture. Virtually no BM
CD34+ cells migrated out of simple osteo-induced spheroids (data
not shown).
We then investigated whether CD34+ cells were actively moving
in and out of mixed spheroids. Unlabeled CB CD34+ cells were
cultured with mixed spheroids for 24 hours and washed out. Since
no non-adherent cells were observed in the supernatant, CFSE
labeled CB CD34+ cells were added, and the cultures were
maintained for up to 48 hours. The percentage of CD34+ cells that
were positive or negative for CFSE in the supernatant and
spheroids was determined by FACS (Fig. 5C–D). Although no
Figure 3. Gene expression profile of BMSC in 2D or 3D cultures. (A) A representative RT-PCR analysis is shown for osteo-induced BMSCcultured for 4 days as monolayers (2D ind) or as simple osteo-induced spheroids (3D ind), and non-induced BMSC cultured as monolayers (2D) orsimple non-induced spheroids (3D). Blots correspond to the transcriptional factor RUNX2, the Notch ligands DELTA1 and JAG1 (Jagged-1), ANGPT1(Angiopoietin-1), the inhibitor of Wnt pathway, DKK1, and SPP (Osteopontin). (B–E) Semiquantitative analysis is shown for GAPDH, CXCL12 (C),WNT5a (D), and KITLG (E). (n = 3, 6 SEM).doi:10.1371/journal.pone.0009093.g003
HSC Niche-Like Spheroids
PLoS ONE | www.plosone.org 5 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
changes in the total number of CD34+ events were observed (data
not shown), an inverted relationship between labeled and
unlabeled cells in spheroids and supernatants was seen along the
culture period (Fig. 5F). At 24 hours, the proportion of unlabeled
cells in relation to CFSE+ cells in the supernatant was 1:8 and the
inverse (8:1) was observed inside the spheroids. At 48 hours, the
proportion changed to 1:2 (unlabeled CD34+ cells: CFSE+ cells) in
the supernatant, whilst the exact opposite in the spheroids (2:1)
was seen. Such a tight correlation is not explained by cell death or
proliferation. Moreover, CFSE labeling showed that the mean
fluorescence intensity of the dye did not change within 48 hours
(data not shown) and no increase in CD34+ events inside spheroids
that were washed was observed after 48 hours of co-culture
(Fig. 4C). Taken together, the data suggest that CD34+ cells
moved in and out the mixed spheroids in a very dynamic way.
Furthermore, since a higher retention was observed in simple
osteo-induced spheroids that lack an outer layer of undifferentiated
BMSC, these data suggest that the quality of hematopoietic
progenitor cells adhesion to the stromal cells or ECM components
control their migration.
Mixed Spheroids Mimic Subendosteal Niches in BMIn BM, HSC home to and lodge within the subendosteal niches
[1]. Since a very clear zone limiting the central region of
osteoblasts and the peripheral area of non-induced BMSC was
established in mixed spheroids, we investigated whether CB
CD34+ cells would recognize and localize specifically in this area.
CB CD34+ cells cultured for 48 hours with simple non-induced
spheroids were homogenously distributed among the stromal cells,
even in the central regions (Fig. 6A–B). The same was observed in
cultures with simple osteo-induced spheroids (data not shown).
However, in mixed spheroids, hematopoietic cells were initially
observed at the periphery, but within 48 hours they were close to
the central region (Fig. 6C–F). Non-mineralized osteoid tissue was
occasionally formed in this type of cultures and hematopoietic cells
surrounded it (Fig. 6D). It is striking that although CB CD34+ cells
were able to migrate throughout the simple osteo-induced
spheroids, no CD34+ were found in the central region of mixed
spheroids. This localization of CB CD34+ cells was confirmed by
immunohistochemistry and confocal microscopy (Fig. 6E–J). CB
CD34+ cells were found in clusters at the vicinity of the central
area formed by osteo-induced BMSC, as it has been described in
vivo [1,11,30], suggesting that mixed spheroids formed a
microenvironment that is representative of the subendosteal niche,
identified as such by human hematopoietic progenitor and stem
cells.
Proliferation and differentiation potentials of cultured CB
CD34+ cells were evaluated by colony assays. To avoid
contamination with stromal cells, CD34+ cells were sorted after
2 and 7 days of co-culture with simple non-induced or mixed
spheroids (Fig. 7A–C) and plated into methylcellulose. We found
that the frequency of CFU-c was quite similar to the freshly
isolated CB CD34+ cells, although a significant (p = 0.0015)
reduction in colony forming cells was observed after 7 days. This
Figure 4. Time-dependent migration of CD34+ cells into spheroids. At defined intervals, cells in the supernatant were collected andspheroids were harvested and trypsinized. (A) The proportion of CD34+ cells (R2) was determined by flow cytometry, and calculated as percentages ofCD34+ cells inside the spheroids in relation to the total plated. (B) Dot plot of control spheroids without hematopoietic cells. (C) To distinguishmigration from proliferation of cells inside the spheroids, hematopoietic cells were removed after 24 hours of co-culture, and the spheroids weremaintained in culture for up to 48 hours. The number of CD34+ events inside the washed spheroids (closed symbols) was compared to the number ofCD34+ events inside no washed spheroids (open symbols). (D) Time-dependent migration of CB CD34+ cells into simple non-induced (full line, dots),simple osteo-induced (dotted line, triangles), and mixed (dotted line, circles) spheroids. (E) The migratory profile of BM (closed squares) and CB (opensquares) CD34+ cells in mixed spheroids is shown. Data are mean 6 SEM.doi:10.1371/journal.pone.0009093.g004
HSC Niche-Like Spheroids
PLoS ONE | www.plosone.org 6 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
was mainly due to the loss of BFU-e inside simple non-induced
and mixed spheroids but not in the supernatants (Fig. 7D–F).
Some CFU-GEMM were recovered from spheroids even after a
week of culture.
HSC residing in bone marrow divide regularly but infrequently
[51], so we investigated this parameter in our culture model. CB
CD34+ cells were cultured with mixed or simple spheroids in the
presence of BrdU and incorporation of this label was determined
by FACS (Fig. 7G). The percentages of CD34+ cells that did not
incorporate BrdU after 2 and 7 days of culture were significantly
higher (p = 0.037) in mixed spheroids (Fig. 7H), implying that
BMSC osteo-induced for just one week are able to restrain
hematopoietic progenitor cell proliferation in this 3D microenvi-
ronment. Taken together, the data suggest that association of
BMSC and active osteoblasts in a 3D structure form an
informative microenvironment that control migration, lodgment,
and proliferation of hematopoietic progenitor and stem cells.
Discussion
HSC niche have been defined based on HSC localization within
the subendosteal region with poor description of the neighboring
Figure 5. Migration of CD34+ cells in mixed spheroids is dynamic. CB and BM CD34+ cells were co-cultured with simple or mixed spheroidsfor 24 hours. The supernatant was removed and the spheroids were washed and maintained in culture for more 48 hours. Phase contrast microscopyof CB CD34+ cells emigrating from mixed spheroids at 24 hours (A) and 48 hours (B). Number above scale bar represents the value (in micrometers) ofboth scale bars. Percentage of CB and BM CD34+ cells that migrated out from mixed and simple osteo-induced spheroids was determined by flowcytometry (E). Unlabeled cells were co-cultured with mixed spheroids for 24 hours and then the supernatants were removed and the spheroids werewashed. CFSE labeled CD34+ cells were added to these spheroids and the co-cultures were maintained for an additional 48 hours. RepresentativeFACS analysis showing CD34+ cells that were CFSE2 or CFSE+ in supernatants (C) and spheroids (D) after 48 hours of co-culture. (F) Histogramshowing the percentage of CD34+ cells that were positive or negative for CFSE in the supernatant or spheroids after 24 (open bar) and 48 hours (greybar). Data represent average percentages (6 SEM) of CFSE+ and CFSE2 among CD34+ cells in one experiment with duplicates. Similar results wereobtained in a second independent experiment.doi:10.1371/journal.pone.0009093.g005
HSC Niche-Like Spheroids
PLoS ONE | www.plosone.org 7 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
cells and their role in the control of HSC niche function.
Osteoblasts and more recently blood vessel endothelial cells have
been proposed to be key elements in the HSC niche. Here, we
show that non-induced and one-week osteo-induced human bone
marrow stromal cells self-reassembled in vitro in 3D spheroids,
and they are required and sufficient to control migration,
lodgment and proliferation of human hematopoietic progenitor
cells. These two cell populations developed a microenvironment in
vitro that reproduced some properties of the subendosteal niche.
Bone marrow stromal cells became quiescent, organized them-
selves forming a meshwork, deposited extracellular matrix, and
formed specialized microenvironments that were recognized by
hematopoietic CD34+ cells.
Perivascular BMSC are a-SMA+ quiescent cells [45] with
cytoplasmic projections that form a 3D meshwork and closely
envelop hematopoietic cells [41]. Conventional culture systems
disrupt these features and induce cytoskeleton reorganization and
stress fibers [48] that could modulate cell differentiation [52]. Here
we show that in 3D spheroid cultures, without any scaffold, BMSC
rearranged their cytoskeleton, lost stress fibers, became quiescent,
and emitted numerous membrane projections. Furthermore, the
distribution of ECM proteins, fibronectin, laminin, collagen I and
IV reproduced the in vivo situation [46], with collagen I at the
central region formed by osteo-induced BMSC, very little laminin
and collagen IV, and a wide distribution of fibronectin.
Osteopontin was observed mostly at the interface between the
two cell populations. Since its expression was shown to be
restricted to the subendosteal niche [19,20], we propose that
mixed spheroids mimic the ECM distribution of the subendosteal
niche.
Long-term engraftment of HSC depends upon homing,
transmarrow migration and lodgment of HSC within a specific
niche. Mixed and simple non-induced spheroids initially elicited
CD34+ cell migration with similar kinetics. However, the outwards
migration was rapidly established, reaching already after 24 hours
the steady state equilibrium of cells retained in the spheroid with
the free cell pool, indicating equal input and output. On the other
hand, human CB and BM CD34+ cells migrated continuously into
the osteo-induced BMSC spheroids and were not released,
indicating that adhesion was stronger than cell motility, retaining
the cells within the spheroid. These phenomena are apparently
specific of the cell origin, since CB CD34+ cells homed more
efficiently than BM CD34+ cells in immunocompromised mice
[50], and species-specific, since human hematopoietic progenitor
cells were reported to migrate continuously into murine bone
marrow stroma spheroids [53]. The entrance and exit of
progenitors in mixed spheroids is similar to the natural
maintenance of blood cell homeostasis and during regeneration
of hematopoietic bone marrow after intravenous injection of blood
cell progenitors [10].
Figure 6. CD34+ cells localize at the vicinity of osteo-induced BMSC in mixed spheroids. (A) Semithin section of simple non-inducedspheroids after 48 hours of co-culture with CB CD34+ cells, showing numerous hematopoietic cells homogeneously distributed throughout thespheroids, even at the center. Methylene Blue. (B) Ultrastructure of the co-cultures, showing a CD34+ cell in contact with stromal cell projections. (C–D) Mixed spheroids co-cultured for 72 hours with CB CD34+ cells. Hematopoietic cells (arrows) were aligned at the interface of the two stromal celllayers (C, arrowhead) or at the vicinity of osteoid tissue (* in D). H–E. (E–F) Clusters of CD34+ cells (inserts) are seen at the vicinity of the osteo-inducedBMSC after 48 hours. Immunohistochemistry. (H–J) Confocal microscopy of mixed spheroids co-cultured for 72 hours with CFSE labeled CB CD34+
cells (green, H, J). Osteo-induced BMSC were labeled with CM-DiI (red, I–J) and nuclei, that was not confocalized, were stained with DAPI, (blue, G, J).Note that hematopoietic cells are located in close proximity to osteo-induced CM-Dil+ BMSC but actually at the transitional region between the twocell populations. Numbers above scale bars represent the value (in micrometers) of each scale bar. (Bars in inserts = 30 mm).doi:10.1371/journal.pone.0009093.g006
HSC Niche-Like Spheroids
PLoS ONE | www.plosone.org 8 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
Figure 7. Colony formation in Methylcellulose and BrdU incorporation. The sorted CD34+ cells from the supernatant or from inside simplenon-induced and mixed spheroids after 2 and 7 days of culture were subjected to methylcellulose assay to determine their potential clonal growth asCFU-GEMM, BFU-e and CFU-GM. (A–C) Representative profile of single-cell suspension isolated from co-cultures before (A–B) and after sorting of CBCD34+ cells (C). (D–E) Morphology of day-10 colonies (inverted microscope, x 5); inserts shows cellular morphology of individual colonies (MGGstaining, x 40 in D, x 60 in E). (F) Clonogenic myeloid potential in methylcellulose of CD34+ freshly isolated from CB or co-cultured for 2 and 7 dayswith mixed or simple non-induced spheroids (* p = 0.0015). Data is representative of two independent experiments with triplicates. Mean 6 SEM. (G)FACS analysis of BrdU expression in CB CD34+ cells co-cultured for 48 hours with simple non-induced (dotted line) or mixed spheroids (black line).The grey line represents isotype control. (H) The percentage of CD34+ cells that were negative for BrdU after co-culture for 2 or 7 days with simplenon-induced (grey bars) and mixed (white bars) spheroids is shown. (** p = 0.037; n = 4 6 SEM).doi:10.1371/journal.pone.0009093.g007
HSC Niche-Like Spheroids
PLoS ONE | www.plosone.org 9 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
HSC lodgment within the subendosteal niche [1–3,18] is
dependent upon intrinsic features and microenvironment cues,
such as angipoietin-1 and CXCL12, provided by osteoblasts
[11,13–18,22]. However, osteoblast lineage cells that are found
within the subendosteal niche include osteoprogenitor cells,
quiescent bone lining cells, and active osteoblasts [11,24]. Besides,
recent data showed that the subendosteal niche is perivascular and
a role for endothelial cells in HSC fate decisions was proposed
[11,21,22]. However, mesenchymal stromal cells are located in the
perivascular niche [32–35] and they secrete an array of cytokines
and chemokines, including angiopoietin-1 [34]. In mice with the
GFP reporter gene knocked into the CXCL12 locus, expression of
this chemokine was observed in perivascular reticular cells that
were also a-SMA+ [54]. We observed that BMSC were a-SMA+ in
spheroids and had more CXCL12 transcripts as compared to
osteo-induced cells, especially in a 3D microenvironment. This is
in agreement with the idea that gene expression is modulated in
response to geometric and mechanical cues [39]. Moreover, since
CXCL12 gene expression is regulated by hypoxia-inducible fator-
1 (HIF) [55,56], the hypoxic milieu of spheroid cultures [42,43]
might mimic the low perfusion regions of BM [29,57] and increase
CXCL12 production by BMSC, which is currently under
investigation. This difference in CXCL12 expression raises the
hypothesis that BMSC have essential role in establishing a
chemokine gradient that controls HSC engraftment and location
inside the marrow cavity. Since accumulation of human CD34+
cells in a specific region was only observed in mixed spheroids, we
propose that both BMSC and active osteoblasts are needed to
establish an informative microenvironment that allows positioning
of human CB CD34+ cells. This specific location of HSC was not
observed in simple non-induced or simple osteo-induced spheroids
where human CD34+ cells were randomly distributed among
stromal cells. Cross-talk between the two phenotypes of cells
composing the niche is apparently required, and in our model it
was sufficient to control the positioning and proliferation of
hematopoietic progenitors. The lodgment of HSC within the
subendosteal region is probably determined by opposing gradients
of factors associated with osteoblasts, such as calcium ions [3,58],
and those produced by BMSC, such as CXCL12. Although
calcium deposits were only rarely observed in these mixed
spheroids (data not shown), it is possible that higher concentrations
of this ion exist in the central region. HSC adhere to collagen I
[58], which is secreted by osteo-induced BMSC in mixed
spheroids. Adhesion of CD34+ cells to collagen I could contribute
to the localization of these cells at the vicinity of osteo-induced cells
and to their retention inside simple osteo-induced spheroids.
Furthermore, OPN, that attracts and retains HSC to the endosteal
surface [20], was also predominantly deposited at the interface
between the two stromal cell populations in mixed spheroids.
Although the BMSC were osteo-induced for just one week, they
were able to display some properties of the subendosteal
environment in agreement with other findings in the literature
[36,59]. The fact that deletion of osteoblasts under the control of
collagen a1 type I promoter, but not osteocalcin promoter, is
followed by a decrease in the numbers of HSC [59] suggests that
osteoblasts that have not reached terminal differentiation are
important organizers of the subendosteal niche. Our findings
support this hypothesis. In mixed spheroids, one-week osteo-
induced BMSC lost the expression of a-SMA2, were actively
secreting collagen-I, and were sufficient to reduced proliferation of
hematopoietic cells that interact with them.
Another aspect that deserves comments is the role of hypoxia in
regulating HSC function [29,55]. Although the low oxygen tension
in the inner regions of spheroids [42,43] might mimic the low
perfusion regions of BM [29,57] and regulate CXCL12 gene
expression [55,56] as already pointed out, it also might result in
the observed decrease in BFU-e content after 7 days. In the
absence of erythropoietin, hypoxia suppresses erythroid progen-
itor/precursor cell proliferation and differentiation [60,61]. The
absence of those progenitors compromised the read-out of the
colony assay since numbers of early progenitors are based on the
presence of CFU-GEMM. In order to clarify this point SCID
repopulating or Long-Term Culture - Initiating Cell (LTC-IC)
assays should be done.
In conclusion, non-induced and one-week osteo-induced BMSC
self-assembled as a 3D spheroid formed an informative microen-
vironment that allows migration and lodgment of hematopoietic
progenitor and stem cells. Osteo-induced BMSC restrain migra-
tion and proliferation of hematopoietic CD34+ cells. It will be
important to learn if requirements for self-renewal are satisfied,
and if that is the case we can construct even more complex
environments by including endothelial and other cell types to
investigate their role in HSC fate.
Materials and Methods
Cells and SampleHuman skin fibroblasts (HSF) and porcine aortic endothelial
cell (PAEC) were obtained from the Rio de Janeiro Cell Bank
(BCRJ, Rio de Janeiro, Brazil). Human cord blood (CB) samples
were obtained from healthy full-term newborns at the Pro-Matre
Hospital (Rio de Janeiro, RJ, Brazil). Bone marrow samples were
obtained from voluntary donors at the Bone Marrow Transplant
Unit, Hematology Service, Hospital Universitario Clementino
Fraga Filho (HUCFF) at UFRJ by washing with phosphate
buffered saline (PBS) the bone marrow collection kits after bone
marrow aspirates were transferred to infusion bags. Informed
consent exemption was approved by the Investigational Review
Board at HUCFF since data were analyzed anonymously and
derived from discarded samples.
AntibodiesFluorescein (FITC) or R-phycoerythrin (PE) conjugated mono-
clonal mouse anti-human antibodies, CD45 (HI-30), 5-bromo-29-
deoxyuridine (BrdU; B44), Ki-67 (mib-1, B56), anti-CD34
(HPCA-2, 8G12) were purchased from BD-Pharmingen (San
Jose, CA). Unlabeled mouse anti-a-smooth muscle actin (Dako,
Glostrup, Denmark), anti-CD34 (QBEND10, Biogenex, San
Ramon, CA), and anti-collagen I and IV, rabbit anti-fibronectin
and anti-laminin (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), and
goat anti-osteopontin (Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA)
were used for immunofluorescence or immunohistochemistry.
Primary antibodies were revealed by secondary reagents, tetra-
methylrhodamine (TRITC) conjugated goat anti-mouse IgG
(Sigma-Aldrich), Alexa 488 conjugated rabbit anti-mouse IgG
and donkey anti-goat IgG (Invitrogen-Molecular Probes, Carls-
bad, CA), and FITC anti-rabbit IgG, F(ab)2 fragment (Boehringer
Mannheim, Mannheim, Germany).
Isolation of CD34+ Cells and Stromal CellsMononuclear cells were collected from CB or adult BM by
Ficoll-Hypaque PlusTM (GE Healthcare Life Sciences, Sao Paulo,
SP, Brazil) centrifugation. Enrichment for CD34+ cells was
performed using immunomagnetic beads (CD34 Progenitor Cell
Selection System, Dynal Biotech, Lake Success, NY), following
manufacturer’s instructions. The purity of CD34+ cells obtained
from CB and BM was respectively 60–90% (median = 78.7) and
around 90%, as described by the manufacturers. Bone marrow-
HSC Niche-Like Spheroids
PLoS ONE | www.plosone.org 10 February 2010 | Volume 5 | Issue 2 | e9093
derived stromal cells (BMSC) were obtained and maintained as
previously described [62]. Briefly, hemo-sedimentation was
performed by diluting (6:1) BM aspirates with HespanH (hydro-
xyethyl starchhaline, American Hospital Supply Corp., McGaw
Park, IL). After 30 minutes at room temperature (RT), the
supernatant was collected, washed with PBS and 16106 cells/mL
were plated in 25 cm2 flasks with Dulbecco’s low-glucose medium
(DMEM Low-glucose, LGC, Sao Paulo, SP, Brazil) supplemented
with 10% fetal bovine serum (FBS, Cultilab, Campinas, SP, Brazil)
and antibiotics (100 U/ml of penicillin and 100 mg/ml of
streptomycin, both from Sigma-Aldrich). After 3 days, non-
adherent cells were removed, and the adherent cells were washed
twice with PBS. Fresh complete medium was added and cells were
cultured for up to 21 days. Adherent cells were harvested with
0.125% trypsin and 0.78 mM EDTA (Sigma-Aldrich).
In Vitro Differentiation of BMSC Toward the OsteoblasticLineage
BMSC were grown in osteoinductive medium [62], that is,
DMEM Low-glucose containing 10% FBS, 50 mM ascorbic acid,
10 mM b-glycerophosphate, 1028 M dexamethasone (all from
Sigma-Aldrich) and antibiotics. Cells were maintained in osteoin-
ductive medium for one week with alternate day media exchange.
Development of Simple and Mixed Spheroid Cell CultureSystems
Spheroids were developed as previously reported [53]. Briefly,
200 mL of 1% agarose (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)
were added per well of a 96 well round bottom plates and
immediately removed. The plates were allowed to dry at RT, and
6.25–506103 BMSC were distributed per well. After 4 and 11
days in culture, spheroids were examined under an inverted
microscope equipped with a digital camera. Their diameter in X
and Y axis was measured with the help of a millimeter scale ruler.
To avoid differences in spheroid diameter, simple spheroids were
done with 2.56104 non-induced BMSC (simple non-induced
spheroids) or one week-osteo-induced BMSC (simple osteo-
induced spheroids) per each well while mixed spheroids were
developed as following. Initially, 1.256104 of osteo-induced
BMSC were plated per each well, and after 3–4 days, the same
amount of non-induced BMSC was plated onto pre-formed osteo-
induced spheroids.
Cell TracingOsteo-induced BMSC were stained with the fluorescent tracker
CM-DiI (indocarbocyanines) and CD34+ cells were labeled with
CFSE (5-(and 6-)-carboxifluorescein diacetate succinyl ester) both
from Invitrogen. Staining was done according to manufacture’s
instructions.
Coculture of CD34+ Cells with BMSC SpheroidsAfter the development of simple and mixed spheroids, 2–36104
CB or BM magnetically selected CD34+ cells were plated onto
each spheroid and co-cultured in Iscove’s Dulbecco’s modified
medium with 10% FBS for up to 7days. Cells in the supernatant
were collected at intervals. Spheroids were vigorously washed
three times to remove non-adherent cells and cells attached to
their surface, and enzymatically dissociated with 0.125% trypsin
(0.78 mM EDTA) associated with mechanic dissociation (pipett-
ing). The content of CD34+ cells in the supernatant and spheroids
was evaluated by flow cytometry and the proportion of cells that
migrated into the spheroids was calculated as percentage of the
total. To distinguish cell migration from proliferation, the
supernatant was removed after 24 hours of co-culture and the
spheroids were vigorously washed, maintained for up to 48 hours,
and analyzed as described. For each time-point, pools of three
spheroids in duplicate were analyzed. Cell proliferation was
investigated by BrdU incorporation assay. Immediately after
plating CB CD34+ cells onto spheroids, 100 ng/mL BrdU (Sigma-
Aldrich) were added in the culture medium, and the medium was
renewed every two days.
Cell Sorting and Methylcellulose CultureColony assays were done after 2 and 7 days of co-culture with
simple or mixed spheroids. Briefly, CD34+ cells from the
supernatants and from enzymatically digested spheroids were
sorted using a MoFloTM (Dako Inc., Fort Collins, Co, USA). The
sorted cells (300 cells / 25 mm dish) were then cultured in
methylcellulose using MethoCult GF H4535 medium (Stem Cell
Technologies, Vancouver, BC, Canada), and 4 U/mL rhEPO
(EritromaxH, Blausiegel) were added. All cultures were maintained
at 37uC in a humidified incubator with 5% CO2 in air. Differential
colony counts were scored after 10 to 12 days by morphologic
characteristics using an inverted microscope and confirmed by
staining individual colonies with May-Grunwald-Giemsa (MGG).
Ultrastructural AnalysisFor Transmission and Scanning Electronic Microscopy (TEM
and SEM) spheroids were fixed in 2.5% glutaraldehyde (Ted Pella
Inc., Redding, CA) in 0.1 M Na-cacodylate (EMS, Electron
Microscopy Sciences, Hatfield, PA) buffer (pH 7.2) for 1 hour on
ice. After post-fixation for 30 min with 1% OsO4 (EMS), 3.8%
potassium ferricyanide (Vetec Quımica Fina, Rio de Janeiro, RJ,
Brazil) and 2.5 mM CaCl2 (Sigma Aldrich) in the same buffer,
samples were dehydrated in a series of acetone (30%–100%), and
finally embedded in Epon 812 (EMS) for TEM. Ultrathin sections
were cut (Ultracut, Leica SUCT), collected in copper grids, stained
with uranyl acetate and lead citrate (Vetec), and examined under a
Zeiss EM 10C transmission electron microscope. For SEM,
spheroids were dried at the critical point with CO2 (Critical Point
Dryer, CPD 030, Balzers Union), mounted on aluminum stubs,
and coated with 20 nm-thick layer of gold (MED 010, Balzers
Union). The samples were examined with a Zeiss 940 DSM
scanning electron microscope.
Morphological AnalysisSpheroids were fixed in 4% paraformaldehyde (Vetec) and
processed routinely for paraffin inclusion. Paraffin slices were
rehydrated and stained with Hematoxilin-Eosin (HE), Von
Kossa, and picrosirius modified for confocal microscopy [63].
Since eosin is a fluorescent green dye [64], H-E stained slices
were also prepared for confocal microscopy. Immunohistochem-
istry was performed using NovolinkTM Polymer Detection System
(Novocastra Laboratories, New Castle, UK). After block of
endogenous peroxidase, and recovery of antigen epitope with
heated water bath, sections were incubated with the primary
antibody overnight at 4uC. Sections were then washed and
incubated with the NovolinkTM, according to manufacture’s
instructions. The reaction was developed using a solution of 3-3-
diaminobenzidine (DAB) with hydrogen peroxide. Nuclei were
counterstained with hematoxylin. For immunofluorescence, fixed
spheroids were embedded in Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek
USA inc., Torrance, CA) and snap frozen. Cryostat sections of 5-
20 mm were treated with 0.01% (or 0.2% for cytoskeleton
staining) Triton X (Sigma-Aldrich) for 15 minutes. Non-specific
sites were blocked with PBS 5% bovine serum albumin (BSA,
Sigma-Aldrich) for 1 hour. Sections were incubated for 16 hours
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at 4uC with primary unlabeled antibodies diluted in PBS 1%
BSA, washed three times with PBS and incubated for 1 hour at
RT with conjugated secondary antibodies. Finally, sections were
incubated with 1 mg/mL of 49,69-diamidino-2-phenylindole
(DAPI, Invitrogen-Molecular Probes). Slides were examined
and images were captured using a LSM510META (Carl Zeiss,
Jena, Germany).
Detection of Apoptotic CellsApoptotic nuclei were detected by TdT-mediated dUTP
terminal nick-end labeling kit (TUNEL, ApopTagH Plus Fluores-
cein in Situ Detection Kit, Chemicon Int., Inc., Temecula, CA).
Nuclei were counterstained with 1 mg/mL DAPI. Slides were
examined in a fluorescence microscope (Axiophot, Zeiss) and
images were acquired with AxioCam Hrc digital camera. To
determine the percentage of apoptotic cells, cell nuclei were
counted within regions measuring 800 mm2 in the peripheral and
central area of each spheroid slice.
FACS Analysis and Cell Proliferation AssayCell suspensions were washed with PBS with 3% FBS and 0.1%
sodium azide (staining buffer) and incubated for 30 min at 4uCwith antibodies. Cells were washed with the staining buffer and
carefully suspended in exactly 400 mL. Acquisition was performed
on a FACSCalibur using the CellQuest 3.1 software (BD
Bioscience), determining time as the parameter to limit acquisition
[53]. Intracellular staining was performed after cell surface
staining as previously described [65]. Analysis was done using
the WinMDI 2.8 software (http://facs.scripps.edu.in/pub/pc).
RT-PCR AnalysisTotal RNA was extracted using TRIZOL reagent (Invitrogen)
following the manufacturer’s instructions. First-strand cDNA was
prepared using oligo-dT primer (500 mg/mL, Invitrogen) and
Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV
RT,200 U/mL, Invitrogen) following standard protocols. Briefly, to
2 mg of total RNA, 0.5 mg of oligo-dT was added, and the mixture was
kept at 68uC for 4 min before the addition of 0.01 M of DTT (DTT
0.1 M, Invitrogen), nucleotides (dNTPs 25 mM, Invitrogen), and
200 U of M-MLV RT. The mix was sequentially incubated at 39uCand 90uC for 2 hour and 10 min, respectively, and stored at 220uC.
The cDNA was used for PCR amplification with specific primers
ANGPT1: 59ACTGTGCAGATGTATATCAAGC39, 39GTGGA-
ATCTGTCATACTGTGAA59; CXCL12: 59CCGCGCTCTGC-
CTCAGCGACGGGAAG39, 39CTTGTTTAAAGCTTTCTCCA-
GGTACT59; DELTA1: 59CCACGCAGATCACGAACACC39, 39-
TTGCTATGACGCACCATCC59; DKK1: 59TGGTCCAAGAT-
CTGTAAACCTGTCC39, 39CTGGCTTGATGGTGATCTTTC-
TGTA59; GAPDH: 59ATCACCATCTTCCAGGAGCG39, 39C-
CTGCTTCACCACCTTCTTG59; JAG1: 59GACTCATCAGCC-
GTGTCTCA39, 39TGGGGAACACTCACACTCAA59; KITLG:
59GACAGCTTGACTGATCTTCTGGAC39, 39ACTGCTGTCA-
TTCCTAAGGGAGCT59; RUNX2: 59CTCACTACCACACCTA-
CCTG39, 39TCAATATGGTCGCCAAACAGATTC59; SPP1: 59-
CCCTTCCAAGTAAGTCCAACGAAAGC39, 39CTGGATGTC-
AGGTCTGCGAAACTTC59 and WNT5a: 59TTTTTCTCCTT-
CGCCCAGGTTGT39, 39GGCTCATGGCGTTCACCAC59. The
PCR was performed on a TGradient thermal gradient cycler
(Biometra, Gottingen) in 30 mL containing 2 mL cDNA, 1.5 U Taq
polymerase (Cenbiot Enzimas, Porto Alegre, RGS, Brazil), 2 mM
MgCl2, 0.1 mM of dNTPs, and 0.4 pmol/mL of each primer.
Samples were cycled for 1 min at 96uC, 45 seconds annealing at
specific temperatures for each primer, and 1 min extension at 72uCwith a final extension of 5 min at 72uC. Aliquots (5 mL) were collected
after 34 cycles and loaded on a 1.2% agarose gel. Gels were stained
with ethidium bromide (Sigma-Aldrich) and visualized under a UV
transilluminator. Changes in gene expression were verified by
semiquantitative analysis. Densitometry analysis of the agarose gel
was normalized against GAPDH, as an internal standard. Negative
control was done as described with a PCR-mix lacking cDNA.
Statistical AnalysisData were presented as mean 6 standard error of the mean (6
SEM). Gaussian distribution of samples was tested and the
statistical significance of the data was evaluated using the two-
tailed t-test. The P value is shown in figures and statistical
significance was considered when p,0.05.
Acknowledgments
We are grateful to Dr. Paul W. Kincade for insightful comments and
revision of the manuscript. We thank Dr. Andrea P. Rodrigues and Fonte
Medicina Diagnostica Laboratory for the immunochemistry, Dr. Ivone B.
Otazu and Leandro Thiago for RT-PCR assistance, Prof. Marcelo
Santiago for Confocal training and assistance, Maithe Arruda-Carvalho
for help with the TUNEL assay, and Alessandra Granato for sorting
assistance. We are also thankful to Prof. Leonardo de Andrade that kindly
provided us with the anti-osteopontin antibody.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: APDNdB MIDR. Performed the
experiments: APDNdB LRG MLLF. Analyzed the data: APDNdB CMT
HdSD LBC MNM RB MIDR. Contributed reagents/materials/analysis
tools: CMT LRG MLLF HdSD LBC MNM RB MIDR. Wrote the paper:
APDNdB RB MIDR. Technical assistance and orientation: CMT.
Technical assistance: MLLF LBC.
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