Pesquisador Prodoc: Humberto Actis Zaidan

Responsável Institucional: Karina Gramacho

Instituição Hospedeira: Ceplac/Cepec

Departamento: Seção de Fitopatologia

Instituição Parceira: UESC/DCB

Área: Agronegócios/Cacau

Caracterização molecular da resistência do cacaueiro (Theobroma cacao L.) à vassoura de

bruxa e à podridão parda*

*Projeto financiado pela FAPESB – Convênio 76/2002-Prodoc 1

Objetivos do Projeto

• Identificar e caracterizar molecularmente genes associados à resistência de frutos de cacau à vassoura de bruxa (VB)

• Construção de primers específicos para genes de resistência visando a seleção indireta de plantas resistentes

• Caracterização de diferentes acessos de cacaueiro quanto à presença/ausência de genes de resistência

Introdução• Em 1989 foi detectado o primeiro foco de

vassoura de bruxa no sul da Bahia• Em 1990, o Brasil era o segundo maior produtor

mundial de cacau• Em conseqüência do avanço dessa doença, o

Brasil caiu para o sexto lugar no ranking e passou de exportador a importador de cacau

• O que resultou em mudanças no uso da terra, venda de propriedades, aumento do desemprego e danos ao meio ambiente

• Em 2005, a lavoura recuperou-se um pouco, principalmente devido a clonagem de plantas resistentes à doença

Fonte: Revista Veja, 26 de abril de 2006

Material e Métodos• Foram inoculados com Crinipellis perniciosa (Cp)

frutos de três variedades de cacau:

-TSH1188 resistente a VB

-TSH565 medianamente resistente

-Catongo suscetível• Com polinização controlada, e cerca de 40 dias de

idade

•Foram testadas diferentes formas de inoculação (copinho de massa de modelar, disco de papel filtro, e spray), utilizando-se diferentes concentrações de inóculo (1x105; 2x105; e 1x106 esporos/mL

• Após a inoculação, os frutos foram ensacados, e amostras da casca dos frutos foram coletadas, no local inoculado, com três repetições, nos seguintes intervalos de tempo: 24, 48, e 72 horas; 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 dias

• As amostras de casca colhidas foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido, identificadas, e armazenadas em freezer -80ºC

• Posteriormente, as amostras colhidas nos diferentes intervalos de tempo, foram moídas conjuntamente em nitrogênio líquido, mas separadamente por variedade

• O RNA da casca dos frutos de TSH-1188 inoculado com Cp foi extraído, sendo aplicado em gel de agarose 1% para verificar a qualidade do mesmo

• A biblioteca de cDNA de casca de fruto TSH-1188 inoculado com Cp, foi construída utilizando-se o Kit Creator Smart cDNA Library Construction (Clontech)

• A biblioteca de TSH-1188 inoculado com Cp foi plaqueada em meio LB contendo Cloranfenicol, as melhores colônias foram selecionadas, transferidas para 40 microplacas de 96 poços, sendo a seguir feitos os minipreps e reações de sequenciamento

• As 10 primeiras microplacas foram seqüenciadas no MegaBace (Amersham) da UESC

• E outras 30 microplacas foram sequenciadas no ABI3100 (Applied Biosystems) do CEPEC/CEPLAC, adquirido com recursos do FINEP

• As 3.840 seqüências obtidas, a partir da biblioteca de cDNA de casca de frutos TSH-1188 inoculados com Cp, foram analisadas no Laboratório de Bioinformática da UESC, por Nicolas Carels, tendo sido selecionadas 1.274 (33%), que preenchiam os seguintes pré-requisitos:

- qualidade Phred>10

- seqüências com comprimento >90pb

- não correspondiam a seqüência do vetor

- não correspondiam a cauda polyA

• Essas 1.274 seqüências selecionadas formaram 191 Contigs e 675 seqüências simples não redundantes, sendo 866 a soma de ambos

• As 866 seqüências foram comparadas com os seguintes bancos de dados públicos:

– Proteínas não redundantes “nr” através do Blast-X (GenBank - NCBI)

– ESTs de Cacau Verica et al. 2004 (Plant Cell Reports, 23:404-413)

– ESTs de Cacau de Jones et al. 2002 (Planta, 216:255-264)

Resultados Alcançados

Sintomas de VB emTSH1188 Inoculado

TSH1188 Inoculado Assintomático

Sintomas de VB em Catongo Inoculado com Cp na concentração 1x105 esporos/mL pelo método do copinho

Sintomas de VB em Catongo Inoculado com Cp na concentração 1x106 esporos/mL, pelo método do Spray

Comparação com o Banco de Dados de Proteínas Não Redundantes “nr” (Blast-X)

• Das 866 sequências estudadas:

- 552 (64%) apresentaram homologia com “nr”

- 314 (36%) não mostraram homologia (no hits)

• Das 1.274 sequências previamente selecionadas:

- 11 (0,9%) tiveram homologia com sequências de proteínas de fungos

- Destas 11, apenas 9 (0,7%) apresentaram homologia com as sequências do banco de dados do genoma de Crinipellis perniciosa

Comparação através do Blast com o banco de dados de ESTs de Cacau

• Das 866 sequências comparadas com os ESTs de Cacau de Verica et al. 2004:

- 116 (13%) apresentaram homologia

- 750 (87%) não

• Das 866 sequências comparadas com os ESTs de Cacau de Jones et al. 2002:

- 148 (17%) apresentaram homologia

- 718 (83%) não

Comparação entre “nr”, Verica e Jones

• De 314 sequências “no hits”, sem homologia no banco de dados de proteínas não redundantes “nr”, 41 (13%) apresentaram homologia com os ESTs de Verica e/ou Jones

25 24

314

4121 20

4

JonesVerica

No Hits “nr”

127 16032

223

552

95 128

•De 552 sequências com homologia no banco de dados “nr”, 223 (40%) também tiveram homologia com os ESTs de Verica e/ou Jones

Verica Jones

Hits “nr”

• Foram encontradas homologias com as seguintes classes de proteínas, entre outras:

• Pathogenesis-related proteins – proteínas de plantas que são induzidas em situações patológicas ou relacionadas,

– Algumas possuem propriedades antifúngicas

Anotação Blast-X

Proteínas E-value

Avr9/Cf-9 rapidly elicited protein 141 [Nicotiana tabacum] 1,00E-17

Putative pathogenesis related protein 1 precursor (Vitis vinifera) , PR-1

6,00E-30

Pathogenesis-related protein [Pyrus pyrifolia] 1,00E-57

Pathogenesis-related protein 4B [Nicotiana tabacum], PR-4B 2,00E-57 Pathogenesis-related thaumatin family protein [Arabidopsis thaliana] , PR-5

4,00E-07

Putative pathogenesis-related protein (U20347) [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]

5,00E-31

Thaumatin-like protein [Sambucus nigra], PR-5 2,00E-43

Osmotin-like protein linusitin [Linum usitatissimum], PR-5d 8,00E-19

Beta-1,3-glucanase [Salix gilgiana] , PR-2 9,00E-39

Peroxidase [Arabidopsis thaliana], PR-9 7,00E-08

• Enzimas da via metabólica Fenilpropanóide

Proteínas E-value

Phenylalanine ammonia lyase - PAL [Citrus clementina x Citrus reticulata]

1,00E-155

Chalcone synthase [Hypericum androsaemum] 1,00E-74

Flavonol_synthase_[Ginkgo_biloba] 2,00E-48

• Estresse oxidativo: resposta de defesa da planta após o reconhecimento do patógeno, conduzindo a reação de hipersensibilidade

• Esta resposta é devido à geração de espécies ativas de oxigênio (ROS), tal como H2O2, O2

-, e OH-

• Peróxido de hidrogênio pode ser diretamente tóxico ao patógeno e está envolvido com o fortalecimento da parede celular, uma vez que é necessário para a biossíntese de lignina

• Fonte: Resende et al., 2003 (Fitopatol. Bras.,v.28, n.2)

Proteínas E-value

Peroxidase [Arabidopsis thaliana], PR-9 7,00E-08

Monodehydroascorbate reductase [Arabidopsis thaliana] 3,00E-25

Putative CuZn-superoxide dismutase (Populus tremula x P.tremuloides)

3,00E-18

Superoxide dismutase [Fagus sylvatica] 2,00E-58

Peroxiredoxin [Populus tremula x Populus tremuloides] 2,00E-68

Outras proteínas importantesProteínas E-value

Serine/threonine protein kinase putative [Arabidopsis thaliana)

4,00E-25

S-adenosyl-L-methionine synthetase [Elaeagnus umbellata]

1,00E-37

Leucine-rich repeat transmembrane protein kinase, putative [Arabidopsis thaliana]

1,00E-10

Lectin-related [Arabidopsis_thaliana] 1,00E-23

Caffeine synthase (Camellia_sinensis) 3,00E-45

Cytochrome P450 monooxygenase [Glycine_max] 5,00E-67

Ubiquitin family protein [Arabidopsis thaliana] 5,00E-35

Heat-shock protein 80 [Euphorbia esula] 2,00E-56

Metallothionein-like protein [Gossypium hirsutum] 7,00E-24

Divulgação

• Zaidan*, H. A., Gramacho, K. P., Silva, S. M., Damaceno, V. O., Rios, V. P., Cruz*, A. P. & Reis, J. Avaliação de métodos de inoculação de Crinipellis perniciosa em frutos de cacau1 (Projeto1 e Bolsas* Financiados pela Fapesb - Convênio 76/2002-Prodoc) XXXVIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Brasília-DF, 1-5 agosto, 2005.

• Zaidan*, H. A., Gesteira*, A. S., Ceita, G. O., Cascardo, J. M., Carels, N., Costa*, E. A., Lima*, L. S., Serra*, W. O., Braz*, N. R. & Gramacho, K. P. Caracterização molecular da resistência do cacaueiro (Theobroma cacao L.) à vassoura-de-bruxa1 (Projeto1 e Bolsas* Financiados pela FAPESB - Convênio 76/2002-Prodoc) XXXVIII Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Brasília-DF, 1-5 agosto, 2005.

• Zaidan*, H. A.; Gesteira*, A. S.; Ceita, G. O.; Carels, N.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J. C. M.; Costa*, E. A.; Lima*, L. S.; Serra*, W. O.; Braz, N. G. R.; Gramacho, K. P. Biblioteca de interação Crinipellis perniciosa X frutos de cacau 1 (Projeto1 e Bolsas* financiados pela FAPESB, Convênio 76/2002-Prodoc). Workshop da Vassoura de Bruxa, UESC, Ilhéus-Ba, 30 novembro a 02 dezembro, 2005.

• Zaidan,H.A.*; Gramacho, K.P.; Gesteira, A.S.*; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa, E.A.*; Lima, L.S.*; Serra, W.O.*; Braz, N.G.R.* Molecular analysis of the interaction between cocoa pods and Crinipellis perniciosa1 (1Project and *Fellowship supported by FAPESB, Agreement 76/2002-Prodoc). 15TH INTERNATIONAL COCOA RESEARCH CONFERENCE, San José, Costa Rica, 09-14 Outubro, 2006. (Submetido)

• Zaidan*,H.A.; Gramacho, K.P.; Gesteira*, A.S.; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa*, E.A.; Lima*, L.S.; Serra*, W.O.; Braz*, N.G.R. Análise molecular da interação entre frutos de cacau e Crinipellis perniciosa. (Projeto1 e Bolsas* financiados pela FAPESB, Convênio 76/2002-Prodoc). XXXIX Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Salvador-Ba, 14-18 agosto, 2006. (Submetido)

• Zaidan,H.A*.; Gramacho, K.P.; Gesteira, A.S*.; Ceita, G.O.; Carels, N.; Silva, S.D.V.M.; Micheli, F.F.L.; Cascardo, J.C.M.; Costa, E.A.*; Lima, L.S.; Serra, W.O.*; Braz, N.G.R.* Molecular analysis of the interaction between cocoa pods and Crinipellis perniciosa1 (1Project and *Fellowship supported by FAPESB, Agreement 76/2002-Prodoc). Artigo científico em fase de elaboração para ser enviado para publicação em Periódico Internacional Qualis A

Impactos

• Este foi o primeiro trabalho a identificar possíveis genes de resistência à vassoura de bruxa em casca de frutos de cacau, o que vem gerando novos conhecimentos, publicações e mais trabalhos na mesma linha de pesquisa

• Foram treinados alunos de iniciação científica e técnicos, bolsistas da Fapesb, que hoje continuam a trabalhar na área de pesquisa

• Como continuidade dos objetivos deste projeto, podemos citar a Dissertação de Mestrado de Lívia Santos Lima (ex-técnica projeto Prodoc), iniciada em 2005, que está em andamento na UESC:

– Mapeamento de genes de resistência obtidos pela genômica da interação cacau-crinipellis, aplicados à programas de melhoramento. (Mestrado em Genética e Biologia Molecular da UESC). Co-orientada por Karina Gramacho, Orientada por Profa. Fabienne Micheli.

Aplicação• Os resultados deste projeto estão permitindo um

melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na interação cacau-crinipellis

• O que está sendo de grande importância para traçar estratégias eficientes para o desenvolvimento de clones de cacaueiro com resistência efetiva e durável à vassoura de bruxa

• A partir dos genes seqüenciados, foram construídos 30 primers específicos para os genes de resistência identificados, o que permitirá a caracterização de diferentes acessos de cacaueiro quanto à presença/ausência desses genes (parte da Dissertação Lívia)

Agradecimentos

• FAPESB• Bolsistas do projeto• CEPLAC• UESC• FINEP