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Meio e condições de cultura in vitro
Antonio C. Torres
VI Congresso Brasileiro de
Cultura de Tecidos de Plantas
Planta organismo autotrófico
• Precisa para crescimento e desenvolvimento:
– Luz
– CO2
– H20
– Elementos essenciais• Os elementos essenciais são obtidos na forma de íons inorgânicos
do solo e entram na biosfera predominantemente pelo sistema
radicular.
Elementos essênciais• Critérios de essencialidade:
– a) sem ele a planta não pode completar o seu
ciclo de vida;
– b) se for parte da molécula de um componente
ou metabólito essencial;• a vida é impossível sem água; a água é um dos principais
metabólitos das plantas e de todos os seres vivos:
– hidrogênio e oxigênio são, então, essenciais.
– C) não podem ser substituídos por outro com
características químicas similares.
• Hidrogênio, oxigênio e carbono
– Não são considerados nutrientes minerais
porque são obtidos primariamente da água e
do dióxido de carbono.
Observação
Taiz & Zeiger, 2004. Fisiologia Vegetal, 3.ed., p.96
Taiz & Zeiger, 2004. Fisiologia Vegetal, 3.ed., p.97
Elementos benéficosParecem ser essenciais para pequeno número de plantas
• Sódio:
– para planta halófitas• Espécies com adaptação evolutiva a ambientes salinos
• Silício:
– Para gramíneas (arroz, cana-de-açúcar)
Taiz & Zeiger, 2004. Fisiologia
Vegetal, 3.ed., p.104
Classificação dos elementos de acordo com
mobilidade na planta e tendência de
translocação durante deficiências
Móveis Baixa mobilidade na planta
Nitrogênio Cálcio
Potássio Enxofre
Magnésio Ferro
Fósforo Boro
Cloro Cobre
Sódio
Zinco
Molibdênio
Lista de acordo com abundância
na planta
Taiz & Zeiger, 2010.
Quando não presentes em condições adequadas distúrbio no metabolismo com
sintomas mais ou menos característico para cada elemento
Componentes do meio nutritivo
Essenciais:
Água
Sais minerais
Fonte carbono e energia
Vitaminas e
Substâncias reguladoras de crescimento
Opcionais:
Aminoácidos
Amidas
Ácidos orgânicos
Substâncias naturais
Água
• Necessária à vida
• Melhor e mais abundante solvente conhecido
• Faz parte do meio para o movimento de moléculas
dentro e entre células
• Influência estruturas de proteínas e ácidos nucleicos,
polissacarídeos e outros constituintes celulares
• Forma o ambiente onde ocorre reações bioquímicas
• Participa de reações químicas essenciais como
hidrólise e condensação
• Maior parte da massa celular constituída de água (80-
90%) (Taiz & Zeiger, 1998; 2003;2009).
Água
• Componente em maior quantidade
• Fonte potencial de impurezas
• Recomenda-se usar água destilada e deionizada
• Armazenamento:
– Em geral em recipientes de polietileno ou de pirex.
– Não é recomendável o armazenamento por período
prolongado:
• recipientes podem liberar substâncias tóxicas.
Nutrição mineral
• Os meios de cultura incluem em sua
composição:
– Elementos essenciais:
• necessários ao crescimento da planta in vivo
• papel fisiológico distinto no metabolismo da planta
– Alguns elementos não essenciais
• O alumínio faz parte do meio de Heller;
• O iodo, o sódio e o cobalto são componentes do
meio MS.
Nitrogênio
• Planta requer em maior quantidade
• Constituinte de vários componentes celulares,
incluindo:
– Aminoácidos, proteínas, amidas, Ácidos nucleicos,
nucleotídeos, coenzimas
• Tem importância na síntese proteica
• Cultura de tecidos meio enriquecido com
nitrogênio é fundamental para:
• Diferenciação de parte aérea
• Indução da embriogênese somática
• Pode ser suplementado nas formas de:
• Nitrato (NO3-)
• Nitrito (NO2-)
• Amônio (NH4+)
– Toxicidade em alta concentração
– Necessidade de controlar pH do meio
• Aminoácido
• Amida
• Assimilação do nitrato (NO3-)
– NO3- NO2
- NH4+ glutamina
Nitrogênio-amida
• O nitrato é convertido em uma forma mais energética (nitrito) e
finalmente em forma mais energética (amônio).
• O processo consome o equivalente a 12 ATP para cada
nitrogênio (Bloone et al., 1992).
Metabolismo nitrogênio
• Absorção de NO3
-ocorre somente em pH ácido.
– Sendo acompanhada pelo influxo de H+
na
célula;
– Extrusão de anions para o meio, ocasionando
aumento do seu pH
• Absorção de NH4
+
– Secreta prótons no meio
– Decresce pH do meio, tornando-o mais ácido
Vantagens de usar formas balanceadas de
nitrogênio
• Tende a reduzir o rápido aumento do pH do
meio, quando o nitrogênio é fornecido apenas
na forma de íon nitrato ( Asher & Edwards, 1983)
• A maioria das plantas cresce melhor se tiver
acesso tanto a NH4+ quanto NO3
-
• A absorção e assimilação dessas duas formas
de nitrogênio promovem um balanço cátion-
ânion dentro da planta (Raven & Smith, 1976; Bloon, 1994)
Meio para cultura de tecido
• pH em torno de 5,5-5,8
• Contendo os íons NO3-e NH4
+
• Absorção rápida de amônio pela planta causa
decréscimo do pH por exemplo 4,2-4,6.
– Esse decréscimo de pH causa inibição da
absorção de amônio
– Mas estimula absorção de nitrato com
concomitante aumento de pH
• Em meio não tamponado a absorção eficiente de
nitrogênio depende da presença de ambos íons.
Fósforo
• Adicionado ao meio na forma de H2 PO4-
• Absorção: Processo ativo
• H2PO4- (pH<7)
• H PO4-2 (pH >7) Processo ativo
• incorporado em moléculas orgânicas
• Desempenha papel importante no:
– metabolismo energético
– regulação de processos enzimáticos
– ativação de enzimas
– estrutura dos ácidos nucleicos
– síntese de ATP
• Na organogênese:
– envolvido na diferenciação da parte aérea,
– pode reverter o efeito das auxinas na inibição de brotações
• Sintomas de deficiência: coloração púrpura do tecido
Meio MS
• Concentração H2PO4- 1,25 mM
– Insuficiente em algumas culturas
– Elevar para:
• 1,86 mM (Jones & Murashige, 1974)
• 2,48 mM (Murashige, 1972)
• 3,81mM (Thorpe & Murashige, 1970)
• Concentração elevada de H2PO4-
– Crescimento diminui devido
• redução absorção
• precipitação com macronutrientes como íon Ca++
• precipitação com micronutrientes
Potássio• Adicionado ao meio como NO3
-, H2PO4
-, Cl-
• Absorvido na forma K+
• conserva a carga elétrica na planta
• Principal cátion presente tecidos plantas que
contrabalança ânions orgânicos e inorgânico no
citoplasma
– Quando nitrato é reduzido a amônia e assimilado, íons de
ácido carboxílico (RCO3
-, malato) são produzidos que se
associam ao potássio que é transportado
• Regulação do pH intracelular e manutenção potencial
osmótico das células
• Cofator de enzimas do metabolismo de carboidratos e
proteínas
– Quinase do piruvato, enzima chave da glicólise e respiração
• Deficiência em cultura in vitro:
– vitrificação e decréscimo absorção de fosfato
Cálcio
• Adicionado como: Cl-, NO3-
• Controla estrutura e função da membrana
– Se liga aos fosfolipídios estabilizando a dupla camada de lipídeos
• Atua na divisão celular
• Balanço iônico celular
• Componente importante da lamela média na forma de
pectato de cálcio
• Atua como mensageiro secundário em várias respostas da
planta tanto a sinais ambientais quanto hormonais
– ao se ligar à proteína calmodulina, forma um complexo capaz de se
ligar a diferentes proteínas:
• incluindo quinases, fosfatases, proteínas mensageiras secundárias de
sinalização regulando diversos processos celulares, desde controle da
transcrição e sobrevivência celular a liberação de sinais químicos.
• Cofator de enzimas da hidrólise do ATP
Cálcio- cont
• Regula várias funções celulares
– Bomba de proteínas que regula absorção e movimento de
nutrientes para raiz e através das células da planta
– Na raiz estimula canais de proteínas que regula absorção e
translocação de nutrientes
• Importante na germinação de grãos de pólen
• Estabelecimento polaridade celular
• Apresenta pouca mobilidade na planta
• Nível de cálcio insuficiente leva:– a deterioração da membrana celular
– perda de compostos celulares
– morte celular
• Necrose do ápice caulinar
• Altas concentrações (6 a 9 mM) necessárias no controle da necrose do
ápice caulinar em cultura in vitro
• Na morfogênese Ca+2
induz diversas respostas,
particularmente, associado a auxina e citocinina
Plant Cell v.17, p2142-2155, 2005
Garcia et al. Informações técnicas econômicas agraria, v.107, n.4, 2011 Polouse et al. Plant Cell Tiss Organ Culture, v.88, p.51–59, 2007
Sintomas de deficiência de cálcio in vitro
Necrose de brotaçõesNecrose do ápice caulinar
Magnésio
• Adicionado como sulfato: SO4-
• Constituinte essencial da Clorofila
• Cofator de enzimas envolvidas na:
– Respiração
– Fotossíntese
– Síntese de DNA e RNA
• Quinase Transporte do P
• Envolvido balanço de cátion e neutraliza ânions e
ácidos orgânicos
• Mg+2 móvel, difunde livre na planta
• Propriedade físico-química única:
– Menor raio iônico entre os cátions
– Maior envoltório de hidratação (400 vezes de aumento)
Plant Cell v.21, p.4018-4030, 2009
Enxofre
• Adicionado como SO4- ou amino-ácidos
• Sulfato (SO4-2) Sulfito (SO3
-2) Sulfide (S-2)
• Em geral, absorvido na forma inorgânica de Sulfato (SO4-2),
seguido da redução enzimatica a Sulfeto (S-2) para ser,
então, incorporado em compostos orgânicos.
• Envolvido biossíntese lipídeos e metabolismo energético
• Os compostos principais de enxofre são os amino-ácidos
cistina, cisteina e metionina, fazem parte da estrutura de
proteínas formando pontes S-S dentro e entre cadeias
polipeptídicas
• Atua na ligação entre Fe, Zn e Cu nas metaloproteínas e
enzimas
Micronutrientes
• Mn, Fe, B, Mo, Cu, Cl, Zn, Ni
Manganes
• Adicionado na forma de SO4-
• Ativa várias enzimas do ciclo de Krebs em plantas:
– Descarboxilases
– Desidrogenases
• Tem função provável na definição da estrutura das
proteínas metálicas envolvidas na respiração e
fotossíntese
• Ultraestrutura dos cloroplastos
• Atividade Fotossistema II da FS
Ferro
• Adicionado ao meio na forma de Fe-EDTA, combinando
FeSO4.7H2O com Na2EDTA.
• Envolvido na fotossíntese, respiração, fixação de
nitrogênio, biossíntese hormonal (etileno, ácido
giberélico e ácido jasmônico).
• Participa das reações de oxirredução nos cloroplastos,
na mitocôndria e nos peroxisomos
• Ferrodoxina Transporte de elétrons na fase luminosa
da FS
• Essencial para síntese da clorofila
• Participa das funções enzimáticas catalisadas pela
catalase, peroxidase , nitrogenases
• 75% do Ferro na planta se localiza nos cloroplastos
Boro
• Adicionado ao meio como H3BO3
• Forma complexos com manitol, ácido
polimanurônico e outros constituintes das
paredes celulares
• Envolvido no alongamento celular e no
metabolismo de ácidos nucleicos
• Deficiência causa redução síntese citocinina
• Biossíntese de lignina e carboidrato
• Germinação de pólen e crescimento do tubo
polínico
Molibidênio
• Adicionado na forma de Na2MoO4
• Cofator redutase do nitrato, nitrogenase e
xantina desidrogenase
• Meio deficiente de molibidênio, a
presença de nitrato causa sintoma de
toxidade
Cobre
• Adicionado na forma de CuSO4
• Constituinte de enzimas envolvidas em oxidação
e hidroxilação de grupos fenólicos
• Constituinte da plastocianina
– Importante componente do transporte de elétrons
Cloro
• Adicionado como KCl
• Requerido para reações fotossintéticas envolvendo
evolução de O2 (reação Hill)
• Manutenção do turgor celular
• Balanceamento na troca iônica de cátions livres K+,
Mg++, Na+
Zinco
• Adicionado como ZnSO4
• Participa das reações de oxirredução das plantas
• Constituinte das enzimas:
– anidrase carbônica,
– álcool desidrogenase,
– desidrogenase glutâmica, dentre outras
• Reações de oxirredução
• Envolvido na atividade da enzima para síntese de
triptofano precursor AIA
Outros elementos essenciais
• Hidrogênio:
– Papel importante no metabolismo da planta.
– Com exceção do CO2 todos os compostos orgânicos têm
hidrogênio
• Carbono:
– Forma o esqueleto de todos os compostos orgânicos.
– Adicionado ao meio na forma de compostos orgânicos e
carboidratos
• Oxigênio:
– Similar ao carbono, sendo componente de todos compostos
orgânicos do organismo vivo: carboidratos, lipídios, ácidos
nucleicos.
– O oxigênio livre funciona como aceptor de elétrons na respiração
Níquel
• Componente de enzimas:
– Hidrogenase
– Urease converte uréia em amônio
• Ainda não foi demonstrado seu
benefício em cultura de tecidos
Outros elementos não essenciais
• Iodo: agente redutor (?)
• Cobalto: componente B12
• Alumínio: (?)
Os elementos minerais são adicionados ao meio
de cultura mediante formulações pre-
estabelecidas
• Formulação MS é a mais utilizada (Murashige & Skoog, 1962)
• Formulação B5 (Gamborg, 1968)
• Nitsch (Nitsch, 1951)
• Heller (Heller, 1963)
• Wood Plant Medium (Lloyd, G. & McCown, B., 1980)
• Observar nas referências dos meios se há alteração de
concentrações dos carboidratos, vitaminas, suplementos
orgânicos e substâncias reguladoras de crescimento o que
algumas vezes, não é muito claro
Formulações
LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of
mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture.
Combined Proceedings International Plant Propagators Society,
Seattle, v.30, p.421-427, 1980
000
Formulações comercial de sais minerais
Nutrição orgânica
• Carboidratos
• Substâncias reguladoras de crescimento
• Vitaminas
• Aminoácidos e amidas
• Outros:
– hexitóis
– purinas e pirimidinas
– ácidos orgânicos
– compostos fenólicos
– extratos naturais
CarboidratosFonte de Carbono, energia, agente osmótico e modulação da
expressão gênica
• Sacarose– Universalmente usada em cultura tecidos de plantas
– Autoclavagem converte 10 -15% em frutose e glucose
– Explante em cultivo libera enzima que converte a sacarose em frutose e
glucose
– Cultura de calo e suspensão celular e protocolos de propagação
• 2 a 4% de sacarose
– Na micropropagação muitos desconsideram o seu efeito na morfogênese:• A concentração adequada sacarose para um genótipo pode não ser para outro
– Absorção duas rotas:• Sacarose: processo ativo via proteínas carreadoras
• Glicose e frutose: processo ativo via proteína carreadoras
– absorção desses monossacarídeos é seguida da sua fosforilação e canalização para
diferentes rotas metabólicas
• Frutose
• Glucose
Potencial osmótico
• Macro e micronutrientes MS Ѱ = -0,237
• Meio MS + 3% sacarose Ѱ = -0,460
Fonte: George, E.F. 1993. Plant propagation by tissue culture: the technology. Part 1.
Substâncias reguladoras de crescimento
• Auxinas
– AIA, AIB, ANA, 2,4-D
• Citocininas
– BA, Cin, Zea, meta-Topolina
• Ácido giberélico: GA3
• Ácido abscísico
• Etileno
Substâncias reguladoras de crescimentoKogh, Haagen-Smit, Erxleben, 1934
Ácido 3-indolilacético
Efeitos fisiológicos da auxina
• Divisão, crescimento e diferenciação celular
• Regulação da dominância apical
• Fototropismo
• Gravitropismo
• Ativação do câmbio vascular
• Regeneração de raiz em adventícias em estacas
• Desenvolvimento de flores e fruto
• Indução de frutos partenocárpicos
• Prevenção de abscisão
• Abscisão celular
• Herbicida para dicotiledôneas
Ação herbicida de auxinas
• 2,4-D, Picloran, Tordon em concentrações adequadas funcionam
como herbicida.
• Aplicação de auxina em plantas dicotiledôneas causam:
• parada de crescimento caulinar e radicular
• Epinastia das folhas
• Aumento da expansão radial
• Epinastia e o entumescimento do caule são efeitos do etileno
– Auxina induz biossíntese do etileno.
– Etileno induz biossíntese do ABA
• ABA acumula nas folhas e é transportado para toda planta
• ABA causa fechamento estomático: limita assimilação do carbono.
Auxinas naturais e sintéticas
Ilustração: Mercier H. Auxinas. In: Kerbauy, G. Fisiologia Vegetal. 2004, p.219.
Auxinas sintéticas
Funções fisiológicas da citocinina
• Regulam a divisão celular nas partes aéreas e raízes
• Necessária para o crescimento normal do meristema
apical da parte aérea
• Promovem diferenciação celular
• A razão auxina/citocinina regula a morfogênese em
cultura in vitro
• Modificam a dominância apical e promovem o
crescimento de gemas laterais
• Retardam a senescência foliar
• Promovem a mobilização de nutrientes (drenos)
• Promovem o desenvolvimento de cloroplastos
Citocininas
Miller, Skoog, Saltza & Strong 1955. J. Am. Chem. Soc., v.77, p.1392-1393, 1955.
Citocininas
• Derivadas da adenina
– Isoprenoides:
• Processo crescimento envolvendo
continuidade ciclo celular
– Aromática:• Envolvidas no processo de desenvolvimento
• Difenil uréia
Exemplos de citocininas isoprenóides derivadas da adenina
• Isopreno– Processo crescimento envolvendo continuidade ciclo celular
Exemplos de citocininas aromáticas derivadas da adenina
• Envolvidas no processo de desenvolvimento
1-fenil-3-(1,2,3-thidiazol-5-il) uréia
Fenil
uréia
Thidiazol
Citocininas derivadas da Feniluréia
Não ocorrem naturalmente em plantas
o
Problemas relacionados à aplicação
comercial de protocolos da micropropagação
• Baixa taxa multiplicação de brotações
• Anormalidades fisiológicas
– Parada de crescimento
– Variação epigenética
– Variação somaclonal
– Vitrificação
• Anormalidades morfológicas
• Deficiente enraizamento dos propágulos
Preparo de soluções estoques
• Auxinas dissolvem-se em base:
– Para cada 10 mg de auxina 300µl de NaOH 1N
• Citocininas dissolvem-se em ácido:
– Para cada 10 mg de citocinina 300µl de HCl 1N
• ou seja, 03 gotas da solução 1N HCl, usando pipeta
Pasteur
Etileno
• Selamento dos frascos de cultura
com filme de PVC, que possui boa
adesão a frasco de vidro, provoca
aumento na concentração interna de
etileno, podendo produzir
desenvolvimento de sintomas
típicos de exposição ao etileno, por
exemplo em Solanum tuberosum L.
– Brotações “anormais”
– Folhas pequenas
– Perda da resposta fototrópica
– Entumescimento do caule
– Diferenciação de raízes adventícias ao
longo do caule
Calbo, A.G. & Torres, A.C. 1989. ABCTP Notícias, n.11, p.2-4.
Vitaminas ou melhor mistura orgânica de White
• Tiamina
– Necessária em cultura
de raízes
• Piridoxina
• Ácido nicotínico
• Glicina
Aminoácidos e amidas
L-tirosina: Iniciação de parte aérea em cultura de calo
L-arginina: Enraizamento
L-serina: Embriões haplóides em cultura de micrósporos
L-glutamina e L-asparagina: benéficas embriogênese
somática
Cisteina: agente redutor
Hexitóis: mio-inositol
• Estimula processo de crescimento in vitro
• Papel importante na:
– biossíntese do ciclitol,
– armazenamento de compostos polihídricos como reserva,
– transporte de açúcar,
– nutrição mineral,
– metabolismo de carbohidrato,
– estrutura de membranas,
– rota biossintética de pectina e hemicelulase,
• formação da parede celular
– homeostase de hormônios,
– estresse fisiológico (Loevus & Loevus, 1983)
Purinas
• Adenina ou sulfato de adenina: – Formação de parte aérea
Poliaminas
• Putrescina
• Espermidina
– Benéficos na embriogênese somática e
formação de calo
Ácidos orgânicos
• Malato, succinato, fumarato, ou citrato
– em meio com amônio como fonte de nitrogênio
– Esses compostos atuam como substâncias
quelantes melhorando disponibilidade de macro
e micronutrientes;
– Funcionam como substância-tampão
Compostos fenólicos
• Monohidroxifenóis: (Estimula AIA Oxidase)
– Desenvolvimento parte aérea
• Bihidroxifenóis: (Inibe AIA oxidase)
– Iniciação de raízes
Extrato naturais
• Leite de coco
• Água de coco
• Suco de laranja
• Polpa de banana
• Extrato de levedura
• Proteínas hidrolisadas:
– caseina hidrolisada,
– lacto-albumina hidrolisada.
Fonte: George, 1993
Materiais de suporte
• Ágar: + usado, 0,6 a 1%• Extraído de algas marinhas
• Funde a 100 ⁰C e solidifica a 45 ⁰C
• Não digerido por enzimas da planta
• Pouca reação com componentes do meio
• Concentração inadequada pode estimular vitrificação
• Hidrolisado autoclavado em pH ácido
• Vários graus de pureza
– Capacidade de formar gel aumenta com a pureza
» Nobel > Purified > Bacto
• Gelrite, Phytagel: – Produzidos por Pseudomonas elodea.
– Agentes gelificantes compostos de manose, celobiose e glucuronato
– Concentração usada 0,2%
• Papel de filtro
Fonte: George, 1993
Qualidades físicas do meio
• Gelificado:
– ápices caulinares
– gemas axilares
– iniciação de calo, etc...
• Líquido:
– suspensão celular
– protoplastos
– gemas axilares
– raízes
• Papel de filtro:
– germinação de sementes
– cultura de ovários
Observar: aeração, polaridade, difusão
pHMedida da concentração de hidrogênio
Explante in vitro tolera mudança de pH na faixa de 4,0-7,2
• pH do meio deverá ser ajustado para:
– 5,7- 5,8 meio gelificado
– 5,0 meio líquido
• Autoclavagem X pH
– Autoclavagem reduz pH
• Preciptação de componentes do meio
• Preciptação do Ferro
• Quantidade de meio: depende tamanho do frasco3 ml 20 ml 50 ml
Esterilização de meio de cultura
• Temperatura: 121°C
• Pressão: 103,4 KPa = 1,05 kg.cm-2
• Período de autoclavagem: 15 a 20 minutos
– Dependendo da quantidade de meio
– Ver tabela da Sigma no material distribuído
• Substâncias que são decompostas pelo
calor e antibióticos:
– Esterilizar a frio por filtração através de membranas
com poros de 0,2 µm
– Usar membrana adequada para filtrar composto
dissolvido em solvente orgânico
Condições de incubação
Condições de incubação
Foto Philips www.lighting.philips.com/.../general-booklet-philips
• Após a desinfestação, o explante
excisado deve ser introduzido em
recipientes contendo meio de cultura.
• Em geral, os frascos contendo os
respectivos meios, com os explantes
inoculados devem ser mantidos em
condições controladas de luz e
temperatura.
• Tenta-se imitar in vitro as condições de
desenvolvimento da espécie in natura.
Considerações sobre as condições de incubação
Espécies com diferentes exigências em termo e fotoperíodo
Devem ser mantidas em câmaras de crescimento distintas
Tomateiro: Cultura de frutos
mantidas em temperatura constante
(27oC) desenvolve frutos
partenocápicos in vitro.
Cultura de frutos expostas ao
termo-período de 27/17oC
desenvolve frutos com semente.
Considerações sobre condições de incubação
• Reatores das lâmpadas: colocados externamente
• Disposição das lâmpadas:
– horizontalmente na parte superior das prateleiras
– lateralmente ás culturas instaladas em suporte vertical
• Trocas gasosas do interior dos frascos com o exterior
Foto: catálogo Philips
Condições de incubação
• Luz
– Qualidade
– Intensidade luminosa
– Fotoperíodo
• Temperatura
– Termoperiodismo
• Umidade relativa
– Alta umidade: usar desumidificador
• Trocas gasosas
– Acúmulo de CO2 e Etileno
Condições de incubação – cont.
• Luz:
– forma de radiação eletromagnética essencial ao
crescimento/desenvolvimento das plantas.
– O espectro eletromagnético vai de comprimentos de
onda () muito curtos (raios cósmicos 10-12 m), até
longos >10-1 m
• Luz visível:
– Porção da radiação eletromagnética percebível olho
de entre 380 a 760 nm
• Essa faixa a radiação eletromagnética está envolvida nos
processos de:
– Fotossíntese
– Fotomorfogênese
– Fotoperiodismo
– Fototropismo
Condições de incubação – cont.
– Fotossíntese, fotomorfogênese, fotopropismo fotoperiodismo
1Å = 0,1 nm
Curvas de sensibilidade da luz
Light sensitivity curve of the human eye Light sensitivity curve of plants
Para o olho humano a luz é a parte
visível do espectro eletromagnético.
Medida em lux
Para o crescimento plantas a luz é
definida micropartículas denominadas
fótons ou quanta. Medida: µmol/s/m2
Fonte: Philips www.lighting.philips.com/.../general-booklet-philips
Espectro de absorçãoMostra a quantidade de energia luminosa captada ou absorvida por
uma molécula ou substância em função do comprimento de onda
Fonte: Taiz & Zeiger
2009
Luz
• Fotossíntese:
– Energia luminosa entre 400 a 700 nm é convertida
em energia química via biossíntese de compostos
orgânicos a partir de CO2 e H2O
Luz – continuação
• Fototropismo:
– Resposta de crescimento direcional da planta induzido
por um estímulo luminoso direcional
• Fotoperiodismo:
– Resposta não direcional do desenvolvimento em resposta
ao estímulo luminoso periódico e não direcional.
Foto: Taiz & Zeiger 2010, p.551
Luz – continuação
• Fotomorfogênese:
– Resposta não direcional do desenvolvimento a um estímulo
luminoso não direcional e não periódico.
• As respostas da fotomorfogênese são induzidas por comprimentos de
onda () nas regiões:
– do Azul (450-492) (Aphalo et al., 2012)
– do Vermelho (622-770) (Aphalo et al., 2012)
– As amplitudes da região azul e vermelho variam de acordo com autores
Aphalo, P. J.; Albert, A.; Björn, L. O.; McLeod, A.; Robson, T. M.; Rosenqvist, E. (eds.) 2012. Beyond the visible: A handbook of best practice in
plant UV photobiology. COST Action FA0906 UV4growth. Helsinki: University of Helsinki, Division of Plant Biology. ISBN 978-952-10-8362-4
(Paperback), 978-952-10-8363-1 (PDF). xxx + 176 pp. https://helda.helsinki.fi/bitstream/.../Handbook_BeyondtheVisible.pdf?...
Importância da luz na diferenciação,
crescimento e desenvolvimento dos explantes
– Culturas de calo de fumo mantidas no escuro• Meio otimizado com alta conc. de citocinina e baixa de auxina
– Não diferenciaram parte aérea
– Culturas similares expostas a baixa intensidade
de luz artificial:
• Formação de brotações (Murashige, 1977)
Parâmetros importantes da luz
• Densidade do fluxo de luz incidente
– Plumbago (Nitsch & Nitsch, 1967);
– Asparagus (Hasegawa et al., 1973);
– Crescimento e iniciação de parte aérea em calo de fumo
(Seibert et al., 1975);
– Ápices caulinares de Gerbera (Murashige, 1977);
– Geranium (Hammerschlag, 1978)
» Unidades usadas: lux (iluminância) e W.m-2 (irradiância)
sendo difícil comparar com unidades atuais medição
• Distribuição espectral
• Fotoperíodo
Instrumentos para medição da luz
• Radiômetro
• Fotômetro
• Espectro-radiômetro
• Quantum-espectômetro, dentre outros
– Várias unidades são usadas para
comparar a qualidade da iluminação
emitida por uma fonte de luz.
Instrumentos para medição da luz-cont.
• Radiômetro: Quantidade de energia radiante
que incide na superfície do detector. – Doses de luz é expressa em energia/área ou seja J.m-2
• A intensidade de luz ou irradiância corresponde
a densidade do fluxo de energia e pode ser
expressa como:
– energia/área/tempo ou seja J.m-2.s-1
– potência/área W.m-2
• 1 W (watt) = 1J.s-1
• Fotômetro: Iluminação da superfície por luz branca em
unidade de lux ou lumens.m-2.
– Iluminância:
• Expressa a densidade de luz em certa superfície baseada na
sensibilidade do detectado pelo olho humano, considerando fluxo
luminoso/área
– As unidades fotométricas:
• Descrever as condições de iluminação de uma área:
– a iluminação de interiores,
– ajuste na tela da televisão, sendo o olho o primeiro sensor
• Foram usadas no passado em fisiologia vegetal
– Crítica: • Os pigmentos vegetais não possuem a mesma sensibilidade relativa do olho
humano para percepção dos diferentes comprimentos de onda de radiação.
Instrumentos para medição da luz-cont
Instrumentos para medição da luz-cont
• Quantum espectrômetro:
– A luz pode ser considerada como corrente de partículas,
que é a energia radiante na forma de comprimento de onda,
emitida em quantidades indivisíveis discretas denominadas
quanta ou fótons.
– No sistema SI quanta é medido em moles ou em Einstein.
– O valor de um Einstein corresponde à energia de 6,023 x
1023 (número de Avogrado, moléculas por grama de
moléculas) fótons.
– A substância deve absorver um Einstein de energia radiante
por mol para participar de uma reação fotoquímica.
• A unidade densidade de fluxo de fótons é: µmol.m-2.s-1
Conversão de unidade de luz
• Para converter lux (unidade de iluminância) para
irradiância ou densidade de fluxo de fótons, divide lux
pelos fatores abaixo dependendo do tipo de tubo de
luz fluorescente
Unidade Branca
quente
Branca fria GroLux
µmol.m-2.s-1
µE.m-2.s-1
83 80 59
Catálogo Philips
Intensidade luminosaMurashige, 1977. Dados apresentados em Lux, convertidos para µmol.m-2.s-1
• Estádio I:
– Fase inicial de desenvolvimento do explante requer
baixa intensidade luminosa: 12 µmol.m-2.s-1 emitidas
por lâmpada branca-fria.
• Estádio II:
– Fase de multiplicação da parte aérea as
exigências são de 12 a 36 µmol.m-2.s-1
• Estádio III:
– Fase de aclimatação: 36 a 120 µmol.m-2.s-1
Intensidade luminosa. Cont.
Murashige 1977. Dados apresentados em Lux, convertidos para µmol.m-2.s-1
• Gerbera :
– 12 µmol.m-2.s-1: ótima para iniciação de parte aérea;
– 3,6 µmol.m-2.s-1: considerada inadequada;
– 36 µmol.m-2.s-1: repressão na diferenciação de parte
aérea
• Várias espécies herbáceas seguem esse
padrão de diferenciação de parte aérea (Murashige, 1977)
Qualidade da luz : Contraditório
• Indução de parte aérea:
– Região azul do espectro é crítica e a luz vermelha não apresenta
efeito (Murashige, 1977).
– Fumo radiação monocromática de 467 nm foi mais efetiva para
formação de brotações (Seibert, 1975).
– Outros autores salientam importância da luz vermelha na
formação de brotações adventícias em cultura de tecidos de:
• Pseudotsuga menziesii (Kadkade & Jobsen, 1978);
• Petunia hibrida (Economou & Read, 1986);
• Brassica oleraceae “Botrytis” (Bagga et al., 1986).
– Espécies lenhosas ornamentais o uso de lâmpadas de vapor de sódio promoveu
formação de maior numero de brotações em cultura de ápices caulinares
(Norton, 1988).
• Qual tipo de lâmpada de vapor de sódio de baixa ou alta
pressão?
• Diferenciação de raízes adventícias e laterais
parecem ter exigências diferentes em termos de
qualidade de luz
– Iniciação de raízes adventícias parece ser estimulada pela
luz vermelha:
• Em Helianthus tuberosus a diferenciação de raízes adventícias em
secções de tubérculos foi induzidas quando as culturas foram expostas
à luz vermelha com o ótimo a 660 nm (Letouzé & Beauchesne, 1969).
– Iniciação de raízes laterais pode ser inibida pela luz
vermelha, enquanto a vermelho-distante pode reverter o
efeito (Furuya & Torrey, 1964).
• Em espécies lenhosas ornamentais o uso de
lâmpadas de vapor de sódio promoveu formação de
maior numero de brotações em cultura de ápices
caulinares (Norton, 1988)
– Qual tipo de lâmpada de vapor de sódio de baixa ou alta
pressão?
Fonte: Cathey & Campbell, 1980
• As lâmpadas recomendadas para iluminação das culturas
in vitro são do tipo fluorescentes:
– Branca-fria,
– Gro-lux ou
– Lâmpadas com emissão balanceada nas regiões do azul (430 nm) e
vermelho (660 nm)
– As taxas de fótons da região azul para a vermelha e da região
vermelha para vermelho-distante e são importantes na
fotomorfogênese (Fugiwara & Kozai, 1995).
• Em algumas situações as lâmpadas fluorescentes podem
ser suplementadas com lâmpadas incandescentes para
garantir adequado suprimento de emissão no final da
região vermelho do espectro.
• O uso somente de lâmpadas incadescentes não é recomendado, pois
emitem fótons nas regiões do vermelho e vermelho-distante e esta
última radiação não é adequada para cultura de tecidos.
Qualidade da luz – cont.
Lâmpadas Espectro Finalidade Substituição
Lâmpadas
Philips
Greenpower
Espectro
completo
Estádio
vegetativo e
floral
A cada 6-9
meses
Lâmpadas
SOLAAR
Espectro
completo
Estádio
vegetativo e
floral
A cada 6
meses
Lâmpadas
Grolux
Espectro
completo
Estádio
vegetativo e
floral
A cada 4
meses
Lâmpadas
Sunmaster
Espectro
completo
Estádio
vegetativo e
floral
A cada 5
meses
Lâmpadas
SodiumLaranja/Verm Estádio floral
A cada 6
meses
Lâmpadas
Metal HalideAzul
Estádio
vegetativo
A cada 9
mesesReferência: Tabela da
Philips traduzida
Observação:
Lâmpada Philips
Greenpower vapor
de sódio
Curvas espectral de energia radiante de lâmpadas usadas em plantas
Fonte: Cathey & Campbell, 1980
Curvas espectral de energia radiante de lâmpadas de alta pressão de
sódio de 400 watt na faixa de comprimento de onda de 400 a 2500 nm
Lâmpada
Philips Green Power LedThe Philips GreenPower LED production module is specifically designed for multilayer cultivation in
conditioned environments (such as tissue culture or young plant production). The production module makes
it possible to use light as a tool to control plant growth and development. The module (50-150 µmol/s/m2)
can replace conventional fluorescent lighting reducing energy consumption up to 60%. Several spectrum
versions are available, so the light intensity and color ratio can be selected and reproduced. In this way, it is
possible to tune the light to the specific needs of each crop in all its growth phases.
Fonte: Philips www.lighting.philips.com/.../general-booklet-philips
The Philips GreenPower LED module HF is specially designed for research. It allows you to
use light as a tool to control plant growth and development. The module’s dimming capability
allows you to set exactly the level of light you require. The Philips GreenPower LED module HF
is available in red, blue and far-red versions. Red and blue are the most important colors for crop
growth, while far-red (barely visible to the human eye) influences the development of specific
plant characteristics. With modules in these three colors, it is now possible to apply the optimum
light recipe at every stage of a crop’s growth.
Description:
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The GreenPower LED production module for multilayer applications (50-400 μmol/s/m ) can replace conventional TL
lighting (36 W or 58 W) reducing energy consumption up to 60%. For most applications, the modules with the mix deep
red/blue can be used. Next to energy efficiency, LEDs provide less heat and a more uniform light distribution. This makes
the module also perfectly fit for conditioned environments.
LEDs are used most effectively if the spectrum and light level are exactly tuned to the crop and growth conditions. In the
past years, Philips conducted more than 50 field tests to determine the optimal spectrum and light level for multilayer
production. This results in the GreenPower LED production module reducing energy consumption and creating a more
uniform light distribution.
Optimized lighting
Two spectrum versions are presently available. Next to the most commonly used deep red/blue mix we offer a deep
red/white version if work light is needed.
Consistent quality
The GreenPower LED production module ensures a uniform light distribution across the shelves, which means that every
plant receives the same level and quality of light.
Efficient heat management
Thanks to its LED technology and optimized thermal design, the GreenPower LED production module radiates very little
heat toward the plants. As a result, the layers can be fit closer to eachother if required. Furthermore, no additional cooling
(e.g. air, water) is required for the module to function efficiently.
Philips GreenPower LED module are specially designed for multilayer cultivation and research. They allow you to use light as
a tool to control plant growth and development, and enables you to select intensity and color ratio.
The Philips GreenPower LED module is available in red, blue, white, and far-red versions. Red and blue are the most important
colors for crop growth, while far-red – barely visible to the human eye – influences the development of specific plant
characteristics. With modules in these three colors, it is now possible to apply the optimum light recipe at every stage of a crops
growth.
Tune the light
With the GreenPower LED modules, you can decide for yourself how much red, how much blue and how much far-red light you
want at any given moment. And the module’s dimming capability allows you to set exactly the level of light you require. With
this flexibility, you can truly tune the light to meet the specific needs of each crop.
Consistent quality
The GreenPower LED module’s specially developed optics ensure a uniform light distribution across the shelves, which means
that every plant receives the same level and quality of light.
Efficient heat management
Thanks to its LED technology and optimized thermal design, the GreenPower LED module radiates very little heat toward the
plants. It can accommodate additional forms of cooling (e.g. air, water) for even more efficient heat management.
Reliable solution
The GreenPower LED module is robust, waterproof and safe (low voltage). Combined with its long service life, this means little
or no maintenance.
Referências
• Aphalo, P. J.; Albert, A.; Björn, L. O.; McLeod, A.; Robson, T. M.; Rosenqvist, E. (eds.) 2012. Beyond
the visible: A handbook of best practice in plant UV photobiology. COST Action FA0906
UV4growth. Helsinki: University of Helsinki, Division of Plant Biology. ISBN 978-952-10-8362-4
(Paperback), 978-952-10-8363-1 (PDF). 176 p.
• Aramu, A.O. The role of meta-topolins on the physiology of micropropagated ‘Williams” bananas
(Musa spp. AAA). 2012. Tese de PhD. College of Agriculture, Engineering and Science, University of
KwaZulu-Natal, Pietermaritzburg, South Africa.
• Caldas, L.S.; Ferreira, A.V.; Machado, M.A. Protocolo: um suporte vertical para bancas de lâmpadas em
salas de incubação. ABCTP Notícias, n.17, p.2-4, 1992.
• Caldas, L.S.; Haridassan, P.; Machado, M.A. Meio de cultura. In: Torres, A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A.
Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. V.1. Brasília: Embrapa. 1998.
• Cathey, H.M.; Campbell, L.E. Light and lighting systems for horticultural plants. Horticultural Reviews,
v.2, p.491-537, 1980.
• George, E.F.; Hall, M.A.; Klerk, G-J. De. Plant propagation by tissue culture: the background. v.1. 3rd
ed. Dordrecht: Springer, 2008.
• Philips. Led lighting in horticulture. www.lighting.philips.com/.../general-booklet-philips...
• Taiz, L.; Zeiger, E. Fisiologia Vegetal. 4 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.
• Torres, A.C.; et al. Meio e condições de incubação para cultura de tecidos de plantas. Circular Técnica,
n. 24. Brasília: Embrapa Hortaliças. 2001. 20p.
• Zumtobel . The lighting handbook 4. ed. 2013. In: www.zumtobel.com/PDB/ teaser/EN/lichthandbuch.pdf
• www.researchgate.net/...the...plant.../9fcfd5123585565a33.pdf
Agradeço a atenção
