1

PLATELIA™ LYME IgM 1 placa – 96 72951 Detecção qualitativa de anticorpos IgM para borrelia burgdorferi sensu lato em soro ou plasma humano por ensaio imunoenzimático

883688 – 2015/11 1. APLICAÇÃO O ensaio Platelia™ Lyme IgM é um ensaio imunoenzimático com recurso à técnica de imunocaptura para a detecção qualitativa de anticorpos IgM para Borrelia burgdorferi sensu lato em soro ou plasma humano. 2. VALOR CLÍNICO A Lyme borreliosis (ou doença Lyme) é uma infecção não contagiosa causada por uma bactéria da família spirochetaceae, Borrelia burgdorferi, que é transmitida por carraças do género Ixodes (2). Vários animais são utilizados como hospedeiros para a bactéria e a transmissão para os humanos ocorre através de picadas de carraças infectadas. O risco de transmissão é maior quando a picada for mais longa. A prevalência da doença de Lyme é maior nos países do hemisfério norte com clima ameno ou frio, que vão desde a China à América do Norte e da Escandinávia até ao norte de África. Estima-se que anualmente são relatados cerca de 17 000 casos nos Estados Unidos (3) e provavelmente mais de 50 000 na Europa, onde existe um gradiente positivo desde a zona ocidental até à zona leste (4). Está agora claramente demonstrado que Borrelia burgdorferi descrita em 1984 como uma bactéria única é, na realidade, um complexo de várias espécies entre as quais cinco delas são patogénicas para humanos: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii e Borrelia bavariensis (7,8). Duas outras espécies são potencialmente patogénicas: Borrelia valaisiana e Borrelia lusitaniae. Essas sete espécies estão a circular na Europa enquanto apenas a B. burgdorferi sensu stricto está presente nos Estados Unidos. Os sintomas clínicos da doença de Lyme são diversos e por vezes difíceis de reconhecer (6). Durante a evolução clínica da doença podem ser distinguidas três fases. A fase inicial (Fase I) pode ser assintomática e é caracterizada por uma síndroma tipo gripe. Em 50% a 80% dos casos, vários dias ou semanas após a picada da carraça, aparece uma irritação cutânea localizada típica com expansão circular denominada eritema migratório (EM). Sem tratamento, a disseminação hematógena da Borrelia induzirá varias semanas depois artrite inflamatória, distúrbios neurológicos ou meníngeos e sintomas cutâneos ou cardíacos (Fase II). Após vários meses ou anos, a doença pode desenvolver-se para uma fase crónica associando em diferentes níveis a acrodermatite crónica atrófica, a encefalopatia, a encefalomielite e a artrite crónica (Fase III) (1). Cada espécie de Borrelia burgdorferi possui um tropismo particular. O eritema migratório na fase I está indiferentemente associado às três espécies. Contudo, as complicações neurológicas estão mais frequentemente associadas à B. garinii e a artrite à B. burgdorferi ss, enquanto que a acrodermatite crónica atrófica é específica da B. afzelii. O diagnóstico da doença de Lyme não deve ser confirmado sem que seja realizada uma investigação cuidadosa do historial médico do paciente, critérios clínicos e biológicos e estimativa do risco da exposição à picada. Dadas as dificuldades na detecção directa, no isolamento da cultura ou na implementação dos métodos de biologia molecular, a serologia continua a ser um elemento chave no diagnóstico biológico da doença de Lyme (1, 5, 9). Os anticorpos IgM para a Borrelia burgdorferi surgem cerca de 3 a 6 semanas após a contaminação e podem persistir durante o desenvolvimento da doença, enquanto que os anticorpos IgG surgem mais tarde e atingem um pico somente após meses ou mesmo anos. Apesar de a serologia ser menos útil durante a fase inicial, ela é, contudo, essencial durante a fase secundária ou terciária, particularmente na ausência de eritema migratório. Quando a serologia é negativa apesar do estado clínico sugestivo, deve ser realizada uma nova serologia 3 semanas após o teste inicial. A presença de anticorpos IgM específicos não é sinónimo de infecção recente. De igual modo, a presença de anticorpos IgG específicos nem sempre é sinal de ocorrência prévia de infecção. Os antigénios e anticorpos utilizados nos ensaios Platelia™ Lyme IgM (Ref. 72951) e Platelia™ Lyme IgG (Ref. 72952) foram seleccionados para permitir a detecção dos anticorpos IgM específicos e IgG específicos respectivamente para as estirpes americana e europeia da Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINCÍPIO O ensaio Platelia™ Lyme IgM é um teste qualitativo para a detecção de anticorpos IgM para Borrelia burgdorferi sensu lato em soro ou plasma humano através de um ensaio imunoenzimático com captura de IgM em estado sólido. Anticorpos de cadeias μ anti-humanas são revestidos na fase sólida (poços da microplaca). Uma mistura do antigénio nativo de Borrelia e do antigénio-anticorpo monoclonal anti-Borrelia flagelar marcado com peroxidase é utilizada como o conjugado. O teste utiliza os seguintes passos:

2

Etapa 1 As amostras e controlos dos pacientes são diluídos 1/101 e depois distribuídos pelos poços da microplaca. Durante esta incubação de uma hora a 37°C, os anticorpos IgM para a Borrelia burgdorferi presentes na amostra unem-se aos anticorpos anti-µ revestidos nos poços da microplaca. Após a incubação, os anticorpos não específicos e outras proteínas séricas não ligadas são removidos por lavagem. Etapa 2 O conjugado (mistura de antigénio Borrelia com anticorpo anti-Borrelia etiquetado com peroxidase) é adicionado aos poços da microplaca. Durante esta incubação de uma hora a 37°C, o conjugado une-se aos anticorpos anti-Borrelia IgM específicos. O conjugado não ligado é removido por lavagens no fim da incubação. Etapa 3 A presença de imunocomplexos (cadeias µ anti-humanas/anti-Borrelia IgM/antigénio Borrelia/anticorpo monoclonal anti-Borrelia etiquetado com peroxidase) é demonstrada pela adição em cada poço de uma solução de desenvolvimento enzimática. Etapa 4 Após a incubação a temperatura ambiente (entre +18°C e +30°C), a reacção enzimática é parada pela adição de uma solução 1N de ácido sulfúrico. A leitura da densidade óptica obtida com um espectrofotómetro a 450/620 nm é proporcional à quantidade de anticorpos IgM para a Borrelia burgdorferi presente na amostra. 4. INFORMAÇÃO DO PRODUTO As quantidades fornecidas de reagentes foram calculadas para permitir 96 testes no máximo de 6 ocorrências. Todos os reagentes são exclusivamente para utilização em diagnóstico in vitro.

Etiquetagem Natureza dos reagentes Apresentação

R1 Microplate Microplaca (pronta para utilização) 12 tiras com 8 poços quebráveis, revestidos com cadeias µ anti-humanas

1 microplaca

R2 Concentrated Washing

Solution (20x)

Solução de lavagem concentrada (20x) Tampão TRIS-NaCl (pH 7,4), 2% Tween® 20 Conservante: 0,04 % ProClin™ 300

1 x 70 ml

R3 Negative Control

Controlo negativo Soro humano negativo para anticorpos IgM para Borrelia burgdorferi e negativo para antigénio HBs, anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCV Conservante: 0,15% ProClin™ 300

1 x 0,75 ml

R4 Cut-off Control

Controlo de corte Soro humano reactivo para anticorpos IgM para Borrelia burgdorferi e negativo para antigénio HBs, anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCV Conservante: 0,15% ProClin™ 300

1 x 0,75 ml

R5 Positive Control

Controlo positivo Soro humano reactivo para anticorpos IgM para Borrelia burgdorferi e negativo para antigénio HBs, anti-HIV1, anti- HIV2 e anti-HCV Conservante: 0,15% ProClin™ 300

1 x 0,75 ml

R6a Antigen Antigénio (liofilizado) Albumina de soro bovino, antigénio Borrelia 2 x qsp. 8,0 ml

R6b Conjugate (51x)

Conjugado (51x) Anticorpo monoclonal murino anti-Borrelia etiquetado com peroxidase Conservante: 0,16% ProClin™ 300

1 x 0,4 ml

R7 Diluent

Diluente para amostras e conjugados (prontos para utilização) Tris-NaCl (pH 7,7), soro bovino fetal, 0,1% Tween® 20 e fenol vermelho Conservante: 0,15% ProClin™ 300

2 x 65 ml

R9 Chromogen TMB Cromogénio (pronto para utilização) 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina (< 0,1%), H2O2 (<1%) 1 x 28 ml

R10 Stopping Solution Solução de paragem (pronta para utilização) Solução de ácido sulfúrico 1N 1 x 28 ml

Consulte as indicações da caixa para obter informações sobre as condições de armazenamento e data de validade.

3

ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES A fiabilidade dos resultados depende da implementação correcta das boas práticas de laboratório indicadas a seguir: • Não utilize reagentes cujo prazo de validade tenha expirado. • Não misture nem associe dentro de uma dada ocorrência reagentes provenientes de diferentes lotes. OBSERVAÇÃO: Para a solução de lavagem (R2, identificação da etiqueta: 20x cor verde), Cromogénio (R9, identificação da etiqueta: TMB cor turquesa) e solução de paragem (R10, identificação da etiqueta: 1N cor vermelha), é possível utilizar outros lotes para além dos incluídos no kit, desde que estes reagentes sejam estritamente equivalentes e o mesmo lote seja utilizado dentro da mesma ocorrência de teste. • Antes da utilização, espere 30 minutos para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+18°C a +30°C). • Proceda cuidadosamente à reconstituição ou diluição dos reagentes evitando possíveis contaminações. • Não realize o teste na presença de vapores reactivos (vapores ácidos, alcalinos ou aldeídicos) ou poeira que possa alterar

a actividade enzimática do conjugado. • Utilize material de vidro bem lavado e enxaguado com água desionizada ou, de preferência, material descartável. • A lavagem da microplaca é um passo crucial no procedimento: siga o número recomendado de ciclos de lavagem e

certifique-se de que os poços enchem completamente sendo, em seguida, completamente esvaziados. As lavagens incorrectas podem levar a resultados imprecisos.

• Não deixe a microplaca secar entre o fim da operação de lavagem e a distribuição dos reagentes. • Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento. • A reacção enzimática é muito sensível à presença do metal ou de iões metálicos. Consequentemente, não permita que

nenhum elemento metálico entre em contacto com as várias soluções que contenham o conjugado ou o cromogénio. • A solução de cromogénio (R9) deve ser incolor. A presença de uma cor azul indica que o reagente não pode ser utilizado,

devendo este ser substituído. • Utilize uma nova ponta de pipeta para cada amostra. • Verifique as pipetas e outros equipamentos para o funcionamento preciso e correcto. Instruções relativas à saúde e segurança O material de origem humana utilizado na preparação dos reagentes foi testado e considerado não reactivo para o antigénio de superfície da hepatite B (HBs Ag), anticorpos para o vírus da hepatite C (anti-HCV) e para o vírus da imunodeficiência humana (anti-HIV1 e anti-HIV2). Porque nenhum método pode garantir em absoluto a ausência de agentes infecciosos, manuseie os reagentes de origem humana e as amostras de pacientes como possíveis transmissores de doenças infecciosas. • Qualquer material, incluindo soluções de lavagem, que entre em contacto directo com amostras ou reagentes contendo

materiais de origem humana deve ser considerado como possível transmissor de doenças infecciosas. • Utilize luvas descartáveis ao manusear as amostras e os reagentes. • Não pipete com a boca. • Evite derrames de amostras ou de soluções que contenham amostras. Os derrames devem ser lavados com lixívia diluída

a 10%. No caso de derrame de um ácido, este deve ser primeiro neutralizado com bicarbonato de sódio e depois lavado com lixívia diluída a 10% e seco com papel absorvente. O material utilizado na limpeza deve ser eliminado num recipiente de resíduos contaminados.

• As amostras dos pacientes, os reagentes contendo material de origem humana, assim como os materiais e produtos contaminados devem ser eliminados após descontaminação apenas: - por imersão em lixívia a uma concentração final de 5% de hipoclorito de sódio durante 30 minutos; - ou por autoclavagem a 121°C durante 2 horas no mínimo.

ATENÇÃO: Não introduza soluções contendo hipoclorito de sódio na autoclave • Evite qualquer contacto do cromogénio e da solução de paragem com a pele e a mucosa (risco de toxicidade, irritação ou

queimadura). • Os resíduos químicos e biológicos devem ser manuseados e eliminados de acordo com as boas práticas de laboratório. • Todos os reagentes incluídos no kit são exclusivamente para utilização em diagnóstico in vitro. • Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes químicos neste kit de

teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com.

5. RECOLHA DO ESPÉCIME, PREPARAÇÃO E ARMAZENAMENTO 1. O soro e o plasma (EDTA, heparina ou citrato) são os tipos de amostra recomendados. 2. Observe as seguintes recomendações para o manuseamento, processamento e armazenamento das amostras de

sangue: • Recolha todas as amostras de sangue com precaução de rotina durante a venipunctura. • No soro, permita que as amostras coagulem completamente antes da centrifugação. • Mantenha sempre os tubos fechados. • Após a centrifugação, separe o soro ou plasma do coágulo ou glóbulos vermelhos num tubo de armazenamento bem

fechado.

4

• Os espécimes podem ser armazenados entre 2°C e 8°C se o teste for realizado dentro de 7 dias. • Se o teste não for concluído ou enviado para transporte dentro de 7 dias, congele as amostras a pelo menos -20°C. • Não utilize amostras que tenham sido descongeladas mais do que cinco vezes. Os espécimes previamente congelados

devem ser eficazmente homogeneizados (vórtice) após descongelação, antes de serem testados. 3. As amostras contendo 90 g/l de albumina ou 100 mg/l de bilirrubina não conjugada, as amostras lipémicas contendo o

equivalente a 36 g/l de trioleína (triglicerídeo) e as amostras hemolisadas contendo até 10 g/l de hemoglobina não afectam os resultados.

4. As amostras não devem ser aquecidas. 6. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 7.1 Materiais necessários não fornecidos • Agitador de vórtice. • Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm e 620 nm (*). • Incubadora de microplaca termostaticamente definida para 37±1°C (*). • Lavador de microplacas automático, semi-automático ou manual (*). • Água destilada ou desionizada esterilizada. • Luvas descartáveis. • Viseira ou óculos de protecção. • Papel absorvente. • Pipetas ou multipipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou predefinidas para medir e distribuir 10 µl a 1000 µl

e 1 ml, 2 ml e 10 ml. • Provetas graduadas com capacidade de 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1000 ml. • Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. • Recipiente para resíduos de risco biológico. • Tubos descartáveis.

(*) Consulte o nosso departamento técnico para obter informações detalhadas relativamente ao equipamento recomendado. 7.2 Reconstituição dos reagentes • R1: Mantenha os reagentes durante 30 minutos a temperatura ambiente (entre +18°C e +30°C) antes de abrir o saco.

Retire o tabuleiro de transporte, devolva imediatamente as tiras não utilizadas no saco e verifique a presença de dissecante. Torne a selar cuidadosamente o saco e armazene-o a uma temperatura entre +2°C e 8°C.

• R2: Dilua 1/20 de solução de lavagem R2 em água destilada: por exemplo 50 ml de R2 e 950 ml de água destilada para obter a solução de lavagem pronta para utilização. Se lavar manualmente, prepare 350 ml de solução de lavagem diluída para uma placa de 12 tiras.

• R3, R4, R5: Dilua 1/101 em diluente (R7) (exemplo: 10 µL de R3 + 1 ml de R7). • R6a: Numa placa, reconstitua o antigénio liofilizado adicionando 8 ml de diluente (R7) a cada frasco. Misture

completamente. Esperar 15 minutos antes de misturar com o conjugado (R6b) permite uma rehidratação homogénea do antigénio.

• R6b: Prepare a quantidade necessária de conjugado para uma ocorrência adicionando um volume de conjugado concentrado (51x) a 50 volumes de diluente (R7). Numa placa, misture 0,3 ml de R6b e 15 ml de R7.

• R6 (R6a+R6b): Misture volumes iguais de reagentes reconstituídos R6a e R6b. Numa placa, misture 12 ml da solução reconstituída R6a e 12 ml da solução reconstituída R6b. Espere 45 minutos antes de utilizar.

7.3 Armazenamento e validade dos reagentes abertos e/ou reconstituídos O kit deve ser armazenado a uma temperatura entre +2°C e +8°C. Quando o kit é armazenado entre +2°C e +8°C antes de ser aberto, cada componente pode ser utilizado até à data de validade indicada na etiqueta externa do kit. • R1: Uma vez aberto o kit, as tiras permanecem estáveis durante um mês se forem armazenadas entre +2°C e +8°C no

mesmo saco cuidadosamente fechado (verifique a presença de dissecante). • R2: Uma vez diluída, a solução de lavagem pode ser guardada durante 2 semanas a uma temperatura entre +2°C e

+30°C. A solução de lavagem concentrada armazenada a uma temperatura entre +2°C e +30°C, na ausência de contaminação, é estável até à data de validade indicada na etiqueta.

• R3, R4, R5, R6b, R7: Uma vez abertos e sem qualquer contaminação, os reagentes armazenados a uma temperatura entre +2°C e +8°C são estáveis durante um mês.

• R6a+R7: Uma vez reconstituído, o antigénio encontra-se estável durante 15 dias a temperaturas entre +2°C e +8°C ou congelado a -20°C. O antigénio reconstituído e armazenado congelado não deve ser descongelado mais do que três vezes.

• R6b+R7: Uma vez reconstituída, a solução conjugada é estável durante 8 horas a temperatura ambiente (entre +18°C e +30°C) ou durante 24 horas a uma temperatura entre +2°C e +8°C.

• R6 (R6a+R6b): Uma vez reconstituída, a solução de acção conjugada é estável durante 8 horas a temperatura ambiente (entre +18°C e +30°C).

• R9: Uma vez aberto e sem qualquer contaminação, o reagente armazenado a uma temperatura entre +2°C e +8°C é estável durante 2 meses.

• R10: Uma vez aberto e sem qualquer contaminação, o reagente armazenado a uma temperatura entre +2°C e +8°C é estável até à data de validade indicada na etiqueta.

5

7.4 Procedimento Siga rigorosamente o procedimento de ensaio e as boas práticas de laboratório. Antes da utilização, dê tempo suficiente para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (entre +18°C e +30°C). Utilize os controlos negativo, de corte e positivo em cada ocorrência para validar os resultados do ensaio. 1. Estabeleça cuidadosamente o plano de distribuição e identificação para os controlos e amostras dos pacientes. 2. Prepare a solução de lavagem diluída (R2) [consulte a secção 7.2]. 3. Retire o tabuleiro de transporte e as tiras (R1) dos respectivos invólucros [consulte a secção 7.2]. 4. Reconstitua o frasco de antigénio R6a adicionando 8 ml de diluente (R7). Misture completamente. 5. Dilua os controlos R3, R4, R5 e as amostras dos pacientes (S1, S2…) em diluente (R7) para obter uma diluição 1/101:

10µl de amostra e 1,0 ml de diluente (R7). Agite as amostras diluídas no vórtice. 6. Prepare a solução de acção conjugada (R6): dilua 1/51 da quantidade necessária de conjugado (R6b) com o diluente (R7).

De seguida, misture volumes iguais de reagentes R6a e R6b reconstituídos [consulte a secção 7.2]. A solução de acção conjugada deve ser preparada pelo menos 45 minutos antes da distribuição na placa. Misture completamente.

7. Seguindo rigorosamente a sequência indicada abaixo, distribua 200 µl de controlos e amostras de pacientes diluídas em cada poço:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12

8. Cubra a microplaca com um selante de placa adesivo e prima firmemente a placa para assegurar uma selagem perfeita.

Incuba imediatamente a microplaca num banho de água controlado por termóstato ou numa incubadora seca durante 1 hora ± 5 minutes a 37°C ± 1°C.

9. No final da primeira incubação, remova o selante de placa adesivo. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos de risco biológico (contendo hipoclorito de sódio). Lave a microplaca 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem (R2). Inverta a microplaca e passe cuidadosamente o papel absorvente para remover o líquido restante.

10. Distribua 200 µl de solução de acção conjugada (R6) em todos os poços. A solução deve ser agitada suavemente antes de ser utilizada.

11. Cubra a microplaca com um selante de placa adesivo e prima firmemente a placa para assegurar uma selagem perfeita. Incuba imediatamente a microplaca num banho de água controlado por termóstato ou numa incubadora seca durante 1 hora ± 5 minutes a 37°C ± 1°C.

12. No final da segunda incubação, remova o selante de placa adesivo. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos de risco biológico (contendo hipoclorito de sódio). Lave a microplaca 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem (R2). Inverta a microplaca e passe cuidadosamente o papel absorvente para remover o líquido restante.

13. Num local escuro, distribua rapidamente em cada poço 200 µl de solução de cromogénio (R9). Deixe a reacção ocorrer no escuro, durante 30 minutos ± 5 minutos a uma temperatura ambiente (entre +18°C e +30°C). Não utilize selante de placa adesivo durante esta incubação.

14. Pare a reacção enzimática adicionando 100 µl de solução de paragem (R10) em cada poço. Utilize a mesma sequência e proporção de distribuição da solução de desenvolvimento.

15. Seque cuidadosamente o fundo da placa. Leia a densidade óptica a 450/620 nm, utilizando um leitor de placa, nos 30 minutos após ter parado a reacção. As tiras devem sempre ser guardadas longe da luz antes da leitura.

16. Antes de relatar os resultados, verifique a consonância entre a leitura e o plano de distribuição da placa e amostras. 8 CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 8.1 Cálculo do valor de corte (CO) O valor de corte (CO) corresponde ao valor médio das densidades ópticas (DO) dos duplicados de controlo de corte (R4): CO = média da DO R4 8.2 Cálculo da razão para cada amostra O resultado da amostra é expresso por uma razão utilizando a seguinte fórmula: Razão da amostra = DO/CO amostra 8.3 Controlo de qualidade Inclua todos os controlos para cada microplaca e para cada ocorrência e analise os resultados obtidos. Para a validação do ensaio, devem ser reunidos os seguintes critérios:

6

• Valores da densidade óptica: - CO > 0,2 - 0,80 x CO < DO R4 replicado 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < DO R4 replicado 2 < 1,20 x CO (A DO individual de cada replicado de controlo de corte (R4) não deve divergir em mais do que 20% do valor do CO).

• Razões da densidade óptica: - Razão R3 (DO R3/CO) < 0,5 - Razão R5 (DO R5/CO) > 2,0 Se estes critérios de controlo de qualidade não forem reunidos, deve repetir-se a ocorrência de teste. 8.4 Interpretação dos resultados

Razão da amostra Resultado Interpretação

Razão < 0,80 Negativo A amostra é considerada não reactiva à presença de anticorpos IgM para a Borrelia burgdorferi sensu lato.

0,80 ≤ Razão < 1,2 Ambígua

A amostra é considerada ambígua quanto à presença de anticorpos IgM para a Borrelia burgdorferi sensu lato. O resultado deve ser confirmado através de outro teste realizado numa segunda amostra colhida pelo menos 3 semanas após a amostra inicial.

Razão ≥ 1,2 Positivo A amostra é considerada reactiva à presença de anticorpos IgM para a Borrelia burgdorferi sensu lato.

No caso de se suspeitar da presença de infecção, pode ser útil a realização de testes serológicos complementares como a detecção de anticorpos IgG anti-Borrelia para confirmar o diagnóstico. Se a serologia for positiva ou ambígua, é recomendado testar a amostra com um método de confirmação como o Western-Blot (9). 8.5 Guia de detecção e resolução de problemas As reacções não validadas ou impossíveis de repetir são frequentemente causadas por: • Lavagens inadequadas da microplaca. • Contaminação de amostras negativas com soro ou plasma com uma grande dose de anticorpos. • Contaminação da solução de desenvolvimento com agentes oxidantes químicos (lixívia, iões metálicos...). • Contaminação da solução de paragem. 8.6 Exemplo de cálculo Nota: Os dados seguintes são fornecidos como um exemplo e não devem ser utilizados em detrimento dos resultados do utilizador.

Controlos e

amostras dos pacientes DO (450/620 nm) Razão Resultado

R3 0,155 0,22 Negativo R4 0,709 / / R4 0,697 / / R5 2,280 3,24 Positivo

Amostra 1 1,181 1,67 Positivo Amostra 2, etc... 0,597 0,85 Positivo

• Valor de corte: - CO = (0,709+0,697)/2 = 0,703 • Valores da densidade óptica: - DO CO = 0,703 (N > 0,200) - DO R4 Replicado 1 = 0,709 (0,80 x DO CO < DO R4 Replicado 1 < 1,20 x DO CO) - DO R4 Replicado 2 = 0,697 (0,80 x DO CO < DO R4 Replicado 2 < 1,20 x DO CO)

• Razões da densidade óptica: - Razão R3 = 0,22 (N < 0,5) - Razão R5 = 3,24 (N > 2,0) • Controlo de qualidade: Aceite

7

9 DESEMPENHOS 9.1 Prevalência Por forma a determinar a prevalência dos anticorpos IgM contra Borrelia burgdorferi sensu lato em soro humano, foi utilizado um painel de 296 amostras obtidas de dadores de sangue do norte de França. Foram obtidos os seguintes resultados: 286 soros negativos, 8 ambíguos e 2 positivos. A prevalência, medida através do ensaio Platelia™ Lyme IgM, foi estabelecida a 0,68% (2/296). 9.2 Especificidade 9.2.1 Especificidade de uma zona não endémica A especificidade foi determinada com base num painel de 286 soros recolhidos junto de dadores de sangue que habitam uma zona não endémica no norte de França. Estas amostras foram seleccionadas com base nos resultados negativos obtidos através de um ensaio EIA comercializado na Europa (marcação CE) e considerado como referência. 9.2.2 Especificidade de uma zona endémica A especificidade foi igualmente determinada com base num painel de 197 soros recolhidos junto de dadores de sangue que habitam uma zona endémica na parte oriental de França, os quais não apresentavam critérios relacionados com a doença de Lyme (ausência de sintomas clínicos de borreliose ou ausência de picada de carraça). Estas amostras foram seleccionadas com base nos resultados negativos obtidos através de um ensaio EIA comercializado na Europa (marcação CE) e considerado como referência. Os resultados obtidos são apresentados no quadro seguinte:

Painel de soros Negativo Ambíguo (1) Positivo (2) Especificidade

Zona não endémica (n=286) [IC 95%] (3) 280 5 1

99,6% (280/281)

[98,0%-100,0%]

Zona endémica (n=197) [IC 95%]

191 4 2 99,0%

(191/193) [96,3%-99,9%]

(1) Os resultados ambíguos foram excluídos do cálculo da especificidade. (2) Uma das três amostras positivas com o ensaio Platelia™ Lyme IgM também foi considerada positiva com o teste de Western-blot. (3) IC 95%: intervalo de confiança de 95%. 9.3 Sensibilidade A sensibilidade do ensaio Platelia™ Lyme IgM foi calculada e incluída nos resultados do ensaio Platelia™ Lyme IgG (Ref. 72952) com base num painel de 70 amostras de pacientes que apresentavam várias formas da doença de Lyme em diferentes fases clínicas. Os resultados são apresentados no quadro seguinte e comparados com as sensibilidades obtidas através de um ensaio EIA comercializado na Europa (marcação CE) e considerado como referência:

Fase clínica Número de soros

Platelia™ Lyme (1) Referência Europa (1)

IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG

Eritema migrante (Fase I) [IC 95%]

17 58,8% [32,9%-81,6%]

66,7% [38,4%-88,2%]

82,4% [56,6%-96,2%]

93,3% [68,1%-99,8%]

Neuroborreliose (Fase II) [IC 95%] 33 36,7%

[19,9%-56,1%] 96,9%

[83,4%-99,9%] 96,9%

[83,4%-99,9%] 97,0%

[84,2%-99,9%]

Acrodermatite crónica atrófica (Fase III)

[IC 95%] 5 20,0%

[0,05%-71,6%] 100,0%

[54,9%-100,0%] 100,0%

[54,9%-100,0%] 100,0%

[54,9%-100,0%]

Artrite de Lyme (Fase III) [IC 95%]

15 0,0% [0,0%-18,1%]

100,0% [81,9%-100,0%]

100,0% [81,9%-100,0%]

100,0% [81,9%-100,0%]

(1) Os resultados ambíguos foram excluídos do cálculo da sensibilidade.

8

A sensibilidade do ensaio Platelia™ Lyme IgM foi igualmente demonstrada num painel documentado de amostras fornecido pelo CDC (Center for Disease Control – Centro para o Controlo de Doenças) e foi comparada com as sensibilidades obtidas através de um ensaio EIA comercializado na Europa (marcação CE) e nos EUA (aprovação FDA) e considerado como referência. Os resultados são apresentados no quadro seguinte:

Fase clínica Número de soros

Platelia™ Lyme (1) Referência Europa (1)

Referência EUA (1)

IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG IgM + IgG

Eritema migrante [IC 95%]

28 73,7% [48,8%-90,9%]

38,5% [20,2%-59,5%]

86,4% [65,1%-97,1%]

70,4% [49,8%-86,3%]

87,0% [66,4%-97,2%]

Artrite/Artralgia [IC 95%] 6 40,0%

[5,3%-85,3%]

100,0% [60,7%-100,0%]

100,0% [60,7%-100,0%]

100,0% [60,7%-100,0%]

100,0% [60,7%-100,0%]

Fase não determinada

[IC 95%] 4

100,0% [0,05%-100,0%]

100,0% [36,8%-100,0%]

100,0% [47,3%-100,0%]

100,0% [19,4%-99,9%]

100,0% [36,8%-100,0%]

(1) Os resultados ambíguos foram excluídos do cálculo da sensibilidade. 9.4 Precisão • Precisão dentro da ocorrência (repetibilidade): De forma a avaliar a repetibilidade intra-ensaio, foram testadas uma amostra negativa e três amostras positivas 30 vezes durante a mesma ocorrência. A razão (DO/CO da amostra) foi determinada para cada amostra. A razão média, o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (% CV) para cada um dos quatro espécimes são apresentado no quadro seguinte: Precisão dentro da ocorrência (repetibilidade)

N=30 Amostra negativa Amostra positiva baixa Amostra positiva Amostra positiva alta

Razão (DO /valor de corte amostra)

Média 0,24 1,17 1,88 4,23

DP 0,040 0,052 0,070 0,104

%CV 15,2% 4,4% 3,7% 2,5% • Precisão entre ocorrências (reproducibilidade): De forma a avaliar a reproducibilidade inter-ensaio, cada um dos quatro espécimes (uma amostra negativa e três positivas) foi testado em duplicado em duas ocorrências por dia durante um período de 20 dias. A razão (DO/CO da amostra) foi determinada para cada amostra. A razão média, o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (% CV) para cada um dos quatro espécimes são apresentado no quadro seguinte: Precisão entre ocorrências (reproducibilidade)

N=80 Amostra negativa Amostra positiva baixa Amostra positiva Amostra positiva alta

Razão (DO /valor de corte amostra)

Média 0,24 1,21 1,76 4,18

DP 0,029 0,067 0,104 0,153

%CV 12,0% 5,5% 5,9% 3,7%

9

9.5 Reactividade cruzada Foram testadas 338 amostras, com características que poderiam potencialmente resultar em reacções não específicas, através do ensaio Platelia™ Lyme IgM. Os resultados são apresentados no quadro seguinte:

Painel Número de amostras Ambíguo (1) Positivo Reactividade cruzada %

Sífilis 83 0 1 1,2% (2)

CMV 30 0 1 3,3% (2)

EBV 17 1 5 29,4% (3)

Leptospiroses 15 0 2 13,3% (3)

Malária 20 0 6 30,0% (3)

Anticorpos antinucleares (ANA) 22 1 0 0,0%

Anticorpos heterófilos (HAMA) 10 0 0 0,0%

Factor reumatóide 43 0 0 0,0%

HSV 10 0 0 0,0%

Toxoplasmose 38 0 1 2,6% (2)

Rubéola 10 0 0 0,0%

Sarampo 10 0 0 0,0%

Papeira 10 2 0 0,0%

VIH 10 0 0 0,0%

VZV 10 0 0 0,0%

TOTAL 338 4 16 4,8% (1) Os resultados ambíguos foram excluídos do cálculo da reactividade cruzada. (2) Não é significativamente diferente da prevalência em zona endémica (teste de Fisher, p>0,05). (3) Significativamente diferente da prevalência em área endémica (teste de Fisher, p<0,05). As 16 amostras com resultados positivos no ensaio Platelia™ Lyme IgM foram igualmente testadas com um ensaio EIA comercializado na Europa (marcação CE) e com o método de Western-blot. Os resultados são apresentados no quadro seguinte:

Amostra Ensaio EIA Western blot (1) Amostra Ensaio EIA Western blot (1)

Sífilis Negativo Negativo Leptospiroses Positivo Positivo

CMV Negativo Negativo Malária Ambíguo NT

EBV Positivo Positivo Malária Positivo NT

EBV Positivo Negativo Malária Ambíguo NT

EBV Positivo Negativo Malária Positivo NT

EBV Positivo NT Malária Negativo NT

EBV Positivo Ambíguo Malária Negativo NT

Leptospiroses Negativo Positivo Toxoplasmose Positivo Negativo (1) NT: Não testado devido ao volume insuficiente da amostra.

10

10 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO O diagnóstico da infecção Borrelia burgdorferi só pode ser estabelecido com base numa combinação de dados clínicos e biológicos. O resultado de um único teste de detecção de anticorpos IgM anti-Borrelia burgdorferi não constitui uma prova suficiente para o diagnóstico da infecção por Borrelia burgdorferi sensu lato. Se a serologia for positiva ou ambígua, é recomendado testar a amostra com um método de confirmação como o Western-Blot (9). Em particular, foi detectado que os pacientes com malária ou os pacientes infectados com o vírus de Epstein Barr ou outras espécies espiroquetas (leptospirose, etc.) podiam potencialmente apresentar reacções positivas falsas em ensaios de diagnóstico de anticorpos contra Borrelia burgdorferi. Estas situações devem ser tidas em consideração ao interpretar os resultados obtidos com estes testes. 11 CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE Todos os reagentes fabricados são preparados de acordo com o nosso sistema de qualidade, desde a recepção da matéria-prima até à comercialização do produto final. Cada lote é submetido a testes de controlo de qualidade e só é introduzido no mercado quando estiver em conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos de produção e de controlo de cada lote são mantidos no seio da Bio-Rad. 12 REFERÊNCIAS 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. 2005. Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev.

18: 484-509. 2. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P. 1982. Lyme disease – a tick-

borne spirochetosis? Science. 216: 1317-1319. 3. Center for Disease Control and Prevention. 2004. Lyme disease – United States, 2001-2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep.

53: 365-369. 4. Hubalek, Z., Halouzka, J. 1997. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J.

Epidemiol. 13: 951-957. 5. Reed, K. D. 2002. Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: 319-324. 6. Stanek, G., Strle, F. 2003. Lyme borreliosis. Lancet. 362: 1639-1647. 7. Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J. 1999. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato:

taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: 633-653. 8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L. 2011. Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to

public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): 123-128. 9. Wilske, B. 2003. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3: 215-227.

11

12

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2015/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 883688 www.bio-rad.com