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Porque usar CROMATOGRAFIA???????
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M. TSWEET (1903): Separação de misturas depigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos e solventes variados.éter depetróleo
CaCO3
mistura depigmentos
pigmentosseparados
Cromatografia =kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
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•Centrifugação
•Cristalização
•Destilação
•Extração
•Filtração
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CONVENCIONAIS
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO INSTRUMENTAIS;
•Cromatografia
•Eletroforese
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Classificação dos métodos Classificação dos métodos CromatográficCromatográficosos
CromatografiaCromatografia
Planar Planar Coluna Coluna
F.M. LíquidaF.M. Líquida
C.CamadaC.CamadaDelgadaDelgada
C.PapelC.Papel
F.M. GasosaF.M. Gasosa F.M. LíquidaF.M. Líquida
C. GasosaC. Gasosa CLAECLAECCCCCC
CCCCCC-Cromatografia em Coluna Clássica.CLAECLAE-Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
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Separação de misturas
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apolar
Flux
o
# (���*$�����3���*$�
apolar
Flux
o
polarpolar
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1940
1950
1960
“CGS” rudimentar
CGL proposta (Martin e Synge)Separação de ácidos orgânicos por
CGL: primeiro cromatógrafo (Martin e James)
Primeiro equipamento comer-cial (Griffin & George)
Detector por Densidade de Gás (Martin e James)
Detector por Ionização em Chama (McWillian e Dewar)
Detector por Captura de Eletrons (Lovelock e Lipsky)
Colunas Capilares (Golay)
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Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e o gás de arraste:
Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO
O número de pratos teó-ricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:
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Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece
o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e na fase móvel
Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na fase móvel.
[[[[ ]]]][[[[ ]]]]M
SC A
AK ====KC = Constante de Distribuição
[A]S = concentração do analito na FE
[A]M = concentração do analito na FM
MENOR RETENÇÃO !!!Volatilidade [A]M
Afinidade pela FE [A]S
Eficiência de Sistemas Cromatográficos
A migração um analito pela coluna provoca
inevitavelmente o alargamento da sua
banda:TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:Separação deficiente de analitos
com retenções próximas.Picos mais largos e menos
intensos = menor detectabilidade
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
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Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejamVOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
(para uma substância qualquer poder ser“arrastada” por um fluxo de um gás ela
deve ser dissolver - pelo menos parcialmente -nesse gás)
DE FORMA GERAL:CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que termicamente estáveis.
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2
3
4
6
5
1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.4 - Detector.5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).
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Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amos-tra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente
referida como GÁS DE ARRASTEGÁS DE ARRASTE
Requisitos:
INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
oxida / hidroliza algumas FEincompatíveis com DCE
H2O, O2
hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC
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Requisitos:CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
CU
ST
O
PUREZAA
BC
A = 99,995 % (4.5)B = 99,999 % (5.0)C = 99,9999 % (6.0)
LINHA DE GÁS
Componentes necessários à linha de gás:controladores de vazão / pressão de gásdispositivos para purificação de gás (“traps”)
1
2
34
5
6
1 - Cilindro de Gás2 - Regulador de Pressão Primário
3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás4 - Regulador de Pressão Secundário
5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo)6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)
Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre
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Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
Injeção instantânea:
Injeção lenta:
t = 0
t = x
t = 0
t = x
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3
4
1 - Septo (silicone)2 - Alimentação de gás de arraste)3 - Bloco metálico aquecido4 - Ponta da coluna cromatográfica
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2 3
1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna.2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna.3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.
1
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TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil
VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra
COLUNAAmostrasGasosas
AmostrasLíquidas
empacotada∅ = 3,2 mm (1/4”)
0,1 ml ... 50 mL0,2 µL ... 20 µL
capilar∅ = 0,25 mm
0,001 ml ... 0,1 mL0,01 µL ... 3 µL
Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução
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LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microseringa de 10 µµµµ L:
Microseringa de 1 µµµµ L (seção ampliada):
corpo
guiaêmbolo (fio de aço soldado ao guia)
agulha
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EMPACOTADA∅∅∅∅ = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
CAPILAR∅∅∅∅ = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m
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PRESSÃO DE VAPOR (p0).
p0 = fEstrutura química
do analitoTemperatura
da coluna
Temperaturada
coluna
Pressãode
vapor
Velocidadede
migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE
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TEM
PE
RATU
RA
DA
C
OLU
NA
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Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:
TCOL ALTA:
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A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
TEMPO
TE
MP
ER
ATU
RA
tINI tFIM
TINI
TFIM
R
Parâmetros de uma programação de temperatura:
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Possíveis problemas associados à PLT:VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidadede um gás aumenta com a temperatura.
viscosidade vazão
DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido ao aumentode volatilização de FE líquida
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Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não a Fase Móvel
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece
como um PICO no cromatograma.
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LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas
capilares)
FElíquida
SUPORTESólido inerte
poroso
Tubo capilar de material inerte
Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é:
Entrecruzada Quimicamente ligadas
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SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.
a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar,
aromático ...)
FE Seletiva: separação adequada dos
constituintes da amostra
FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com
coluna de boa eficiência
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S u b s t i t u i n t e s N o m e s C o m e r c i a is O b s e r v a ç õ e s- - S E -3 0 O V -1 O V -1 0 1 S P -2 1 0 0 m a is a p o la r e s d a s é r ie
p o u c o s e le t iv a sc a r b o r a n o ? - D e x s il 3 0 0 G C s i m ila r a P D M S
e s tá v e l a té > 4 0 0 o C
fe n il 5 % - S E -5 2 S E -5 4 O V -3 O V -5O V -7 3
p o u c o p o la r
c ia n o p r o p il 7 % fe n il 7 % O V -1 7 0 1 S P B -7 C P -S il 1 9 C B m o d e r a d a m e n te p o la r
fe n il 5 0 % - O V -1 7 S P -2 2 5 0 H P -5 0 +S P B -5 0
m o d e r a d a m e n te p o la rr e té m a r o m á t ic o s
t r if lu o r o p r o p i l 5 0 % - O V -2 1 0 Q F -1 m o d e r a d a m e n te p o la rr e té m c o m p o s to s c a r b o n í lic o s
c ia n o p r o p il 5 0 % fe n il 5 0 % O V -2 2 5 S P -2 3 0 0 C P -S il4 3 C B
p o la rr e te m d o a d o r e s d e e lé t r o n s
c ia n o p r o p il 1 0 0 % - S P -2 3 4 0 S P -2 3 3 0 S ila r -9 C P a lta m e n te p o la r
Diferenças entre FE de composição similar provenientes de fornecedores diferentes: pureza, viscosidade.
����������������Famílias de FE Líquidas
Separação de pesticidas - FE = 100 % PDMS
1 - TCNB2 - Dichloram3 - Lindano4 - PCNB5 - Pentacloroanilina6 - Ronilano7 - Antor8 - pp’-DDE9 - Rovral10 - Cypermetrin11 - Decametrin
Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 µµµµm)
TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)Gás de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FIDAmostra: 2µµµµL de solução dos pesticidas “on-column”
17 min
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����������������Famílias de FE Líquidas
Separação de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone1 - piridina2 - 2-metilpiridina3 - 2,6-dimetilpiridina4 - 2-etilpiridina5 - 3-metilpiridina6 - 4-metilpiridina
3 minColuna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 µµµµm)TCOL:110oC (isotérmico)
Gás de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FIDAmostra: 0,1µµµµL de solução 1-2% das piridinas em 3-
metilpiridina
����������������Famílias de FE Líquidas
Separação de fenóis - FE = fenilmetilsilicones
50% Ph
50% Me
5% Ph
95% Me
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����������������FE Quirais
Separação de isômeros óticos:
FÁRMACOS Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.
PRODUTOS BIOLÓGICOS Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
Propriedades físico-químicas de isômeros óticos são MUITO SIMILARES
FE convencionais não interagem diferencialmente com isômeros óticos
Separação de misturas de isômeros óticos só é possível com FE oticamente ativas
=
FE Quirais
������������� �Conceitos Gerais
Fontes de Informações Qualitativas
RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para suaidentificação
DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre assubstâncias eluídas
Identificação individual das espécies contidas na amostra
Determinação da identidade da amostra propriamente dita
Aplicações Qualitativas de
CG
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������������� �Tempos de Retenção
t’R = fInterações analito / FE
Pressão de vapor do analitoCondições operacionais (TCOL, FC ...)
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
������������� �Tempos de Retenção
Identificação por t’R é muito pouco confiável:
Dependência com FC e TCOL Variações nestas condições afetam sensivelmente os t’R
VARIAÇÃO DE ±±±± 1% NO t’R
∆∆∆∆TCOL = ±±±± 0,1%
∆∆∆∆FC = ±±±± 1%
Sobrecarga na coluna Aumento excessivo na massa de material eluido deforma o pico cromatográfico e altera o seu tR
MA
SS
A
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������������� �Tempos de Retenção
Comparação de t’R usando dopagem (“spiking”) da amostra com o analito suspeito: aumento da confiabilidade de identificação.
������������� �Métodos de Detecção Qualitativos
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV)
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica de Massas (CG-EM)
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)
Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção
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������������� �Espectrometria de Massas
1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact =EI) ou íons (chemical ionization = CI):
ABCDE + e- →→→→ ABCDE.+ + 2 e-
2 O íon formado se fragmenta:ABCDE.+ →→→→ AB. + CDE+
ABCDE.+ →→→→ AB+ + CDE.ABCDE.+ →→→→ A+ + BCDE.
3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente deacordo com suas massas moleculares e contados:
AB
UN
DÂ
NC
IA
MASSA / CARGA
������������� �Espectrômetro de Massas
1
2
3
41 Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecidobombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos peloeletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético.
2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo (natm).
3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons comdeterminada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento.
4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou umfotodiodo gera um sinal elétrico proporcional aonúmero de íons que incide sobre o elemento.
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������������� �Espectro de Massas
m/Z = 118
m/Z = 80
m/Z = 79
- CO
- (CO + H)
m/Z = 90
20 40 60 80 100 1200m / Z
������������� �CG-EM: TIC x SIM
Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME
TICAparecem os picos
correspondentes a todas substâncias eluídas
SIM (m/z = 149)Cromatograma construido a
partir dos mesmos dados acima, mas apenas usando
fragementos com massa = 149 (ftalatos: plastificante)
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!���������Detector por Condutividade Térmica
PRINCÍPIO Variação na condutividade térmica do gás quando da eluição de um analito.
Cela de Detecção do DCT:
12
35
4
i1 Bloco metálico (aço)
2 Entrada de gás de arraste
3 Saída de gás de arraste
4 Filamento metálico (liga W-Re) aquecido
5 Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento
DCT: Aplicações
Coluna: CP Sil 5CB(50 m x 0.32 mm x 5 µm)
Gás de Arraste: He @ 3 ml.min-1
TCOL: 40�C Detector: DCT
1 N2 2 CH4
3 CO2 4 n-C2
5 NH3 6 n-C3
7 i-C4 8 n-C4
Separação de Gases e Hidrocarbonetos:
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Detector por Ionização em Chama
O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 +
O2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica.
Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica
Detector por Captura de Eletrons
Um fluxo contínuo de eletrons lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte radioativa β β β β -emissora) e um catodo.
Na passagem de uma substância eletrofílica alguns eletrons são
absorvidos, resultando uma supressão de corrente elétrica.
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Características Operacionais do DCE
SENSIBILIDADE :QMD = 0,01 pg a 1 pg (organoclorados),
10 fg Lindano (C6H6)µµµµ-ECD HP-6890
PESTICIDAS1 tetracloro-m-xileno2 α α α α - BHC3 Lindano4 Heptachlor5 Endosulfan6 Dieldrin7 Endrin8 DDD9 DDT10 Metoxychlor10 decaclorobifenila
~250 fg cada analito
DCE: Aplicações
Contaminantes em ar atmosférico - detecção paralela DIC + DCE
DIC
DCE
1, 2, 3 - Hidrocarbonetos aromáticos4, 5, 6 - Hidrocarbonetos clorados
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4 ���������������������� �����0 �����4 �� 0 �4 ���������������������� �����0 �����4 �� 0 ������������5����6 ����������2���������������5����6 ����������2����
7 ������� ��������8 ��� �7 ������� ��������8 ��� �-�(�����������# � ��������9�����������3������-�(�����������# � ��������9�����������3������
��������������������� � � � � � � � � � � � � �� � � � � � � � � � � � � �� � � � � � � � � � � � � �� � � � � � � � � � � � � � ���� ��������
9�� :7 4 ; � �7 ��7 ���6 � <= ; � �# � 9:�; -# � ��0 �9�� :7 4 ; � �7 ��7 ���6 � <= ; � �# � 9:�; -# � ��0 �# -<0 �6 > ; �# -<0 �6 > ; �
2 �"�#����$��%344 �,�������� ���!��
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2 +��$*���(��"�(#�,#-�$��%$��5����
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2 7�,��.��.������
2 7�,����������
2 ����$����
2 *����������
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8484
!"�"��#)�12�$"'�#3��(�)(")���14"�"�$#�"�")�"�!"�"��#)�12�$"'�#3��(�)(")���14"�"�$#�"�")�"�����#-"�5�"��$"���$*��6�1*(��6�(#$"-67778����#-"�5�"��$"���$*��6�1*(��6�(#$"-67778
�"�9$*��"��,#�")����"�9$*��"��,#�")���:: !"�#)#12�$�;��',"��
Situação Atual da Produção de Alimentos
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8989
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8:8:
Desenvolvimento e validação de métodos multirresíduo de pesticidas em alimentos
Preparo da Amostra
GC-MS/MS LC-(ESI)MS/MS
2/7/2010
32
8;8;
Cromatogramas dos 50 pesticidas analisados por GC-MS NCI, modo SIM,soluções padrão preparadas no extrato “branco” de tomate,A) 10 µg L-1, B) 50 µg L-1 e C) 100 µg L-1.