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2/7/2010 1 Porque usar CROMATOGRAFIA???????

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Porque usar CROMATOGRAFIA???????

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M. TSWEET (1903): Separação de misturas depigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes sólidos e solventes variados.éter depetróleo

CaCO3

mistura depigmentos

pigmentosseparados

Cromatografia =kroma [cor] + graph [escrever]

(grego)

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•Centrifugação

•Cristalização

•Destilação

•Extração

•Filtração

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CONVENCIONAIS

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO INSTRUMENTAIS;

•Cromatografia

•Eletroforese

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Classificação dos métodos Classificação dos métodos CromatográficCromatográficosos

CromatografiaCromatografia

Planar Planar Coluna Coluna

F.M. LíquidaF.M. Líquida

C.CamadaC.CamadaDelgadaDelgada

C.PapelC.Papel

F.M. GasosaF.M. Gasosa F.M. LíquidaF.M. Líquida

C. GasosaC. Gasosa CLAECLAECCCCCC

CCCCCC-Cromatografia em Coluna Clássica.CLAECLAE-Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

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Separação de misturas

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# ����*$�

apolar

Flux

o

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apolar

Flux

o

polarpolar

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1940

1950

1960

“CGS” rudimentar

CGL proposta (Martin e Synge)Separação de ácidos orgânicos por

CGL: primeiro cromatógrafo (Martin e James)

Primeiro equipamento comer-cial (Griffin & George)

Detector por Densidade de Gás (Martin e James)

Detector por Ionização em Chama (McWillian e Dewar)

Detector por Captura de Eletrons (Lovelock e Lipsky)

Colunas Capilares (Golay)

����� ����

Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e o gás de arraste:

Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO

O número de pratos teó-ricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:

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Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece

o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e na fase móvel

Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na fase móvel.

[[[[ ]]]][[[[ ]]]]M

SC A

AK ====KC = Constante de Distribuição

[A]S = concentração do analito na FE

[A]M = concentração do analito na FM

MENOR RETENÇÃO !!!Volatilidade [A]M

Afinidade pela FE [A]S

Eficiência de Sistemas Cromatográficos

A migração um analito pela coluna provoca

inevitavelmente o alargamento da sua

banda:TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos:Separação deficiente de analitos

com retenções próximas.Picos mais largos e menos

intensos = menor detectabilidade

EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

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Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Misturas cujos constituintes sejamVOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

(para uma substância qualquer poder ser“arrastada” por um fluxo de um gás ela

deve ser dissolver - pelo menos parcialmente -nesse gás)

DE FORMA GERAL:CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos

constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que termicamente estáveis.

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2

3

4

6

5

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.4 - Detector.5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

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Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amos-tra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente

referida como GÁS DE ARRASTEGÁS DE ARRASTE

Requisitos:

INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento.

PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

oxida / hidroliza algumas FEincompatíveis com DCE

H2O, O2

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

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Requisitos:CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.

COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.

CU

ST

O

PUREZAA

BC

A = 99,995 % (4.5)B = 99,999 % (5.0)C = 99,9999 % (6.0)

LINHA DE GÁS

Componentes necessários à linha de gás:controladores de vazão / pressão de gásdispositivos para purificação de gás (“traps”)

1

2

34

5

6

1 - Cilindro de Gás2 - Regulador de Pressão Primário

3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás4 - Regulador de Pressão Secundário

5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo)6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)

Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre

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Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica

Injeção instantânea:

Injeção lenta:

t = 0

t = x

t = 0

t = x

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12

3

4

1 - Septo (silicone)2 - Alimentação de gás de arraste)3 - Bloco metálico aquecido4 - Ponta da coluna cromatográfica

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2 3

1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna.2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna.3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

1

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TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil

VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra

COLUNAAmostrasGasosas

AmostrasLíquidas

empacotada∅ = 3,2 mm (1/4”)

0,1 ml ... 50 mL0,2 µL ... 20 µL

capilar∅ = 0,25 mm

0,001 ml ... 0,1 mL0,01 µL ... 3 µL

Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

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LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL

êmbolo

corpo (pirex)

agulha (inox 316)

Microseringa de 10 µµµµ L:

Microseringa de 1 µµµµ L (seção ampliada):

corpo

guiaêmbolo (fio de aço soldado ao guia)

agulha

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EMPACOTADA∅∅∅∅ = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 m

CAPILAR∅∅∅∅ = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m

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PRESSÃO DE VAPOR (p0).

p0 = fEstrutura química

do analitoTemperatura

da coluna

Temperaturada

coluna

Pressãode

vapor

Velocidadede

migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE

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TEM

PE

RATU

RA

DA

C

OLU

NA

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Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA:

TCOL ALTA:

*��,��$���� ���� �� 1�$��������

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:

TEMPO

TE

MP

ER

ATU

RA

tINI tFIM

TINI

TFIM

R

Parâmetros de uma programação de temperatura:

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Possíveis problemas associados à PLT:VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidadede um gás aumenta com a temperatura.

viscosidade vazão

DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido ao aumentode volatilização de FE líquida

����������

Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não a Fase Móvel

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece

como um PICO no cromatograma.

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����������������

LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas

capilares)

FElíquida

SUPORTESólido inerte

poroso

Tubo capilar de material inerte

Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é:

Entrecruzada Quimicamente ligadas

����������������

SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.

a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar,

aromático ...)

FE Seletiva: separação adequada dos

constituintes da amostra

FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com

coluna de boa eficiência

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����������������

S u b s t i t u i n t e s N o m e s C o m e r c i a is O b s e r v a ç õ e s- - S E -3 0 O V -1 O V -1 0 1 S P -2 1 0 0 m a is a p o la r e s d a s é r ie

p o u c o s e le t iv a sc a r b o r a n o ? - D e x s il 3 0 0 G C s i m ila r a P D M S

e s tá v e l a té > 4 0 0 o C

fe n il 5 % - S E -5 2 S E -5 4 O V -3 O V -5O V -7 3

p o u c o p o la r

c ia n o p r o p il 7 % fe n il 7 % O V -1 7 0 1 S P B -7 C P -S il 1 9 C B m o d e r a d a m e n te p o la r

fe n il 5 0 % - O V -1 7 S P -2 2 5 0 H P -5 0 +S P B -5 0

m o d e r a d a m e n te p o la rr e té m a r o m á t ic o s

t r if lu o r o p r o p i l 5 0 % - O V -2 1 0 Q F -1 m o d e r a d a m e n te p o la rr e té m c o m p o s to s c a r b o n í lic o s

c ia n o p r o p il 5 0 % fe n il 5 0 % O V -2 2 5 S P -2 3 0 0 C P -S il4 3 C B

p o la rr e te m d o a d o r e s d e e lé t r o n s

c ia n o p r o p il 1 0 0 % - S P -2 3 4 0 S P -2 3 3 0 S ila r -9 C P a lta m e n te p o la r

Diferenças entre FE de composição similar provenientes de fornecedores diferentes: pureza, viscosidade.

����������������Famílias de FE Líquidas

Separação de pesticidas - FE = 100 % PDMS

1 - TCNB2 - Dichloram3 - Lindano4 - PCNB5 - Pentacloroanilina6 - Ronilano7 - Antor8 - pp’-DDE9 - Rovral10 - Cypermetrin11 - Decametrin

Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 µµµµm)

TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)Gás de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FIDAmostra: 2µµµµL de solução dos pesticidas “on-column”

17 min

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����������������Famílias de FE Líquidas

Separação de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone1 - piridina2 - 2-metilpiridina3 - 2,6-dimetilpiridina4 - 2-etilpiridina5 - 3-metilpiridina6 - 4-metilpiridina

3 minColuna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 µµµµm)TCOL:110oC (isotérmico)

Gás de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FIDAmostra: 0,1µµµµL de solução 1-2% das piridinas em 3-

metilpiridina

����������������Famílias de FE Líquidas

Separação de fenóis - FE = fenilmetilsilicones

50% Ph

50% Me

5% Ph

95% Me

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����������������FE Quirais

Separação de isômeros óticos:

FÁRMACOS Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.

PRODUTOS BIOLÓGICOS Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).

Propriedades físico-químicas de isômeros óticos são MUITO SIMILARES

FE convencionais não interagem diferencialmente com isômeros óticos

Separação de misturas de isômeros óticos só é possível com FE oticamente ativas

=

FE Quirais

������������� �Conceitos Gerais

Fontes de Informações Qualitativas

RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para suaidentificação

DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre assubstâncias eluídas

Identificação individual das espécies contidas na amostra

Determinação da identidade da amostra propriamente dita

Aplicações Qualitativas de

CG

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������������� �Tempos de Retenção

t’R = fInterações analito / FE

Pressão de vapor do analitoCondições operacionais (TCOL, FC ...)

Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante

AMOSTRA

PADRÃO

������������� �Tempos de Retenção

Identificação por t’R é muito pouco confiável:

Dependência com FC e TCOL Variações nestas condições afetam sensivelmente os t’R

VARIAÇÃO DE ±±±± 1% NO t’R

∆∆∆∆TCOL = ±±±± 0,1%

∆∆∆∆FC = ±±±± 1%

Sobrecarga na coluna Aumento excessivo na massa de material eluido deforma o pico cromatográfico e altera o seu tR

MA

SS

A

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������������� �Tempos de Retenção

Comparação de t’R usando dopagem (“spiking”) da amostra com o analito suspeito: aumento da confiabilidade de identificação.

������������� �Métodos de Detecção Qualitativos

Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV)

Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica de Massas (CG-EM)

Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)

Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção

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������������� �Espectrometria de Massas

1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact =EI) ou íons (chemical ionization = CI):

ABCDE + e- →→→→ ABCDE.+ + 2 e-

2 O íon formado se fragmenta:ABCDE.+ →→→→ AB. + CDE+

ABCDE.+ →→→→ AB+ + CDE.ABCDE.+ →→→→ A+ + BCDE.

3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente deacordo com suas massas moleculares e contados:

AB

UN

NC

IA

MASSA / CARGA

������������� �Espectrômetro de Massas

1

2

3

41 Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecidobombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos peloeletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético.

2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo (natm).

3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons comdeterminada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento.

4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou umfotodiodo gera um sinal elétrico proporcional aonúmero de íons que incide sobre o elemento.

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������������� �Espectro de Massas

m/Z = 118

m/Z = 80

m/Z = 79

- CO

- (CO + H)

m/Z = 90

20 40 60 80 100 1200m / Z

������������� �CG-EM: TIC x SIM

Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME

TICAparecem os picos

correspondentes a todas substâncias eluídas

SIM (m/z = 149)Cromatograma construido a

partir dos mesmos dados acima, mas apenas usando

fragementos com massa = 149 (ftalatos: plastificante)

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!���������Detector por Condutividade Térmica

PRINCÍPIO Variação na condutividade térmica do gás quando da eluição de um analito.

Cela de Detecção do DCT:

12

35

4

i1 Bloco metálico (aço)

2 Entrada de gás de arraste

3 Saída de gás de arraste

4 Filamento metálico (liga W-Re) aquecido

5 Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento

DCT: Aplicações

Coluna: CP Sil 5CB(50 m x 0.32 mm x 5 µm)

Gás de Arraste: He @ 3 ml.min-1

TCOL: 40�C Detector: DCT

1 N2 2 CH4

3 CO2 4 n-C2

5 NH3 6 n-C3

7 i-C4 8 n-C4

Separação de Gases e Hidrocarbonetos:

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Detector por Ionização em Chama

O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 +

O2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica.

Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica

Detector por Captura de Eletrons

Um fluxo contínuo de eletrons lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte radioativa β β β β -emissora) e um catodo.

Na passagem de uma substância eletrofílica alguns eletrons são

absorvidos, resultando uma supressão de corrente elétrica.

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Características Operacionais do DCE

SENSIBILIDADE :QMD = 0,01 pg a 1 pg (organoclorados),

10 fg Lindano (C6H6)µµµµ-ECD HP-6890

PESTICIDAS1 tetracloro-m-xileno2 α α α α - BHC3 Lindano4 Heptachlor5 Endosulfan6 Dieldrin7 Endrin8 DDD9 DDT10 Metoxychlor10 decaclorobifenila

~250 fg cada analito

DCE: Aplicações

Contaminantes em ar atmosférico - detecção paralela DIC + DCE

DIC

DCE

1, 2, 3 - Hidrocarbonetos aromáticos4, 5, 6 - Hidrocarbonetos clorados

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Situação Atual da Produção de Alimentos

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8:8:

Desenvolvimento e validação de métodos multirresíduo de pesticidas em alimentos

Preparo da Amostra

GC-MS/MS LC-(ESI)MS/MS

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8;8;

Cromatogramas dos 50 pesticidas analisados por GC-MS NCI, modo SIM,soluções padrão preparadas no extrato “branco” de tomate,A) 10 µg L-1, B) 50 µg L-1 e C) 100 µg L-1.