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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, BIODIVERSIDADE E
CONSERVAÇÃO
ESTOQUE DE DIVERSIDADE GENÉTICA, PATERNIDADE E MATERNIDADE
DOS MACHOS EM Melipona mondury (HYMENOPTERA: MELIPONINI)
Marcus Vinicius Canário Viana
Jequié-BA
2013
PPGGBC
MARCUS VINICIUS CANÁRIO VIANA
ESTOQUE DE DIVERSIDADE GENÉTICA, PATERNIDADE E MATERNIDADE
DOS MACHOS EM Melipona mondury (HYMENOPTERA: MELIPONINI)
Dissertação de mestrado apresentada ao programa
de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e
Conservação da Universidade Estadual do
Sudoeste da Bahia para a obtenção do título de
Mestre em Genética, Biodiversidade e
Conservação.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Maria Waldschmidt.
Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Alfredo Lopes de
Carvalho
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Karina de
Francisco
Jequié-BA
2013
PPGGBC
MARCUS VINICIUS CANÁRIO VIANA
ESTOQUE DE DIVERSIDADE GENÉTICA, PATERNIDADE E MATERNIDADE
DOS MACHOS EM Melipona mondury (HYMENOPTERA: MELIPONINI)
Aprovada em ____/_____/____
Comissão Examinadora:
Prof.ª Dr.ª Ana Maria Waldschmidt
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia-UESB/Campus de Jequié-BA
(Orientadora)
Prof. Dr. Juvenal Cordeiro Silva Jr.
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia-UESB/Campus de Jequié-BA
Prof. Dr. Carlos Alfredo Lopes de Carvalho
Universidade Federal do Recôncavo da Bahia – UFRB / Campus de Cruz das Almas-BA
(Co-orientador)
PPGGBC
AGRADECIMENTO
Agradeço à minha mãe, Sonia Maria Canário Viana, pelo amor, cuidado e apoio às
minhas escolhas. Ao meu pai, Adauto da Silva Viana, já falecido, que foi um exemplo de
profissional a ser seguido. A este casal eu devo a minha vida.
Ao meu padrasto, Itamar Cerqueira, por ter me aceitado como filho e ter influenciado
minha escolha profissional e meus hobbies, mesmo se dar conta.
À Profª Drª Ana Maria Waldschmidt por contribuir diretamente com a minha
formação como pesquisador, aos Co-orientatores Profª Drª Ana Karina de Francisco e Prof.
Dr. Carlos Alfredo Lopes de Carvalho pelo apoio acadêmico e por acreditarem no meu
potencial.
Aos meus colegas Bruno Santos Almeida e Elder Assis Miranda pelo auxílio e bom
humor, durante estes quatro anos de laboratótio.
E, finalmente, agradeço à Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia pela estrutura
oferecida e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia pela bolsa de mestrado.
PPGGBC
BIOGRAFIA
Marcus Vinicius Canário Viana, filho de Adauto da Silva Viana e Sônia Maria
Canário Viana, nasceu em Vitória da Conquista-BA em 1987. Concluiu o Ensino Médio no
Centro Federal de Educação Tecnológica da Bahia (CEFET-BA) em 2004. Interessado em
estudar o funcionamento dos sitemas biológicos, ingressou em 2006 no curso Ciências
Biológicas da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB) e obteve o título de
Bacharel em 2010, aos 24 anos de idade. Durante a graduação foi bolsista de iniciação
científica em projetos de genética molecular de abelhas sem ferrão, orientado pela Profª Drª
Ana Maria Waldschmidt. Dando continuidade a estes trabalhos, ingressou no Programa de
Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação em 2011.
PPGGBC
RESUMO
As abelhas sem ferrão são distribuídas pela região neotropical e sua maior importância
está na polinização de plantas nativas e cultivadas. Apesar de sua importância suas
populações naturais vêm sendo reduzidas por ações antrópicas, como o desmatamento e uso
excessivo de agrotóxicos. O monitoramento das populações naturais pode ser realizador por
meio de marcadores moleculares. Este estudo avaliou a transferabilidade de 49 marcadores
microssatélites em quatro espécies de abelha sem ferrão, a diversidade genética de Melipona
mondury mantida em um meliponário na sua área de ocorrência, a ocorrência de
acasalamentos múltiplos, a diversidade genética intracolonial e a maternidade dos machos
desta espécie. Como resultado pode-se colocar que: A maioria dos locos foi amplificada nas
quatro espécies, aumentando o número de locos que podem ser utilizados em estudos
genéticos; A baixa estruturação encontrada entre amostras do meliponário e amostras naturais
indica que a diversidade genética local está sendo mantida no meliponário, justificando a
criação de outros meliponários e discutir aspectos importantes de meliponário para estoque
genético natural; Em M. mondury, o número de acasalamentos variou entre um e sete, e a
maior diversidade genética está presente em colônias poliândricas. O parentesco médio entre
operárias variou entre 0,53 e 0,98, indicando que os acasalamentos múltiplos foram
endogâmicos. A proporção média de filhos de operárias foi de 50%, valor similar ao
encontrado para outras espécies do gênero. O parentesco médio nas colônias poliândricas
(0,53 a 0,90) não foi suficiente para gerar conflitos entre as operárias pela postura dos ovos,
resultado de acordo com a teoria do fitness inclusivo.
Palavras-chave: Microssatélite, conservação, meliponário, poliandria.
PPGGBC
ABSTRACT
The stingless bees are distributed throughout the Neotropics and its greatest
importance lies in the pollination of native and cultivated plants. Despite its importance they
are an understudied group in the ecological and genetic and natural populations have suffered
due to reduced anthropogenic actions such as deforestation and overuse of pesticides. This
study evaluated the transferability of 49 microsatellite markers in four species of stingless
bee, the genetic diversity maintained in a Melipona mondury meliponary in their area of
occurrence, the occurrence of multiple matings, intracolonial genetic diversity and maternity
of males of this species. As a result, most loci were amplified in all species, increasing the
number of loci that can be used in genetic studies. The low structuring found between
meliponary and samples of the State of Bahia indicates that the local genetic diversity is
maintained in meliponary, justified the creation of other meliponaries and suggested a model
of meliponary for natural genetic stock. In M. mondury, the number of matings was between
one and seven and greater genetic diversity is present in polyandrous colonies. The average
relatedness between workers ranged from 0.53 to 0.98, indicating that multiple matings were
inbred. Approximately 50% of all males are sons of workers, the expected value for stingless
bees. The average relatedness in polyandrous colonies (0.53 to 0.90) was not sufficient to
generate conflicts between workers by laying eggs, a result in accordance with the theory of
inclusive fitness.
Keywords: Microsatellite, conservation, meliponary, polyandry.
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LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1. Operárias de M. mondury na entrada de uma caixa racional (Fonte: ASF -
UESB)................................................................................................................................... 20
CAPÍTULO 2
Figura 1. Meliponário e localidades amostradas no Estado da Bahia. 1 – Meliponário, 2
– Itiúba, 3 – Jaguaquara, 4 – Piraí do Norte, 5 – Jequié, 6 – Apuarema, 7 – Itacaré, 8 –
Itabuna, 9 - Caatiba, 10 - Teixeira de Freitas....................................................................... 49
Figura 2. Colônias de Melipona mondury no meliponário da fazenda Outro Fino,
município de Jaguaquara, Bahia, Brasil, instaladas sobre cavaletes individuais (A) ou em
dupla (B), dentro da mata, no município de Jaguaquara-BA (Fonte: ASF -
UESB)................................................................................................................................... 49
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LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Resultados obtidos com o teste dos 49 locos microssatélites heterólogos........ 34
Tabela 2. Porcentagem de sucesso na amplificação dos locos.......................................... 35
CAPÍTULO 2.
Tabela 1. Temperatura de anelamento dos primers, número de alelos encontrados,
número de alelos exclusivos e heterozigosidades observada e esperada totais da
população de Melipona mondury no meliponário e nas colônias naturais......................... 50
Tabela 2. Heterozigosidades médias observada (Ho) e esperada não enviesada (He) para
as populações de Melipona mondury do meliponário e do Estado da
Bahia................................................................................................................................... 50
Tabela 3 Análise de variância molecular (AMOVA) para seis locos microssatélites no
meliponário e nas colônias naturais.................................................................................... 51
CAPÍTULO 3
Tabela 1. Data da coleta, peso da rainha (wq), número de operárias (nw) e zangões (nm)
amostrados e número de locos analisados nas dez colônias de Melipona mondury...................... 62
Tabela 2. Número de patrilíneas, acasalamento efetivo (me), coeficiente de parentesco (R),
heterozigosidade oservada (Ho), diversidade alélica (A) e percentual de locos polimórficos em
colônias de Melipona mondury.............................................................................................. 63
Tabela 3. Número de machos amostrados (n), número de locos informativos (Iloc), número de
machos cuja maternidade pode ser atribuída (Na), número estimado de filhos de operárias
detectados (nwm), proporção estimada de filhos de operária (Pwm) em colônias de Melipona
mondury................................................................................................................................ 63
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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
csd – Loco complementar de determinação do sexo
PCR – Reação em cadeia da polimerase
μL – Microlitro
mM – Milimolar
ng – Nanograma
U – Unidade
ºC – Grau ceusius
Ta - Temperatura original de anelamento do par de primers
A – Número de alelos ou diversidade alélica
t.d. – Touchdown
n.a. – Não amplificado
in. – Bandas inespecíficas
[ ] – Temperatura testada
n – Número de locos
Amp (%) – porcentagem do sucesso de amplificações para os pares de primers desenhados
para a respectiva espécie
Ho – Heterozigosidade média observada
He – Heterozigosidade média esperada
AMOVA – Análise de variância molecular
Fst – Índice de estruturação genética populacional
Fis – Índide de endogamia a nível de indivíduo
Φst - Índice de estruturação genética populacional baseado em análise de variância molecular
ASF – Grupo de pesquisa Abelhas Sem Ferrão
T – Temperatura de anelamento do par de primers
AM – Alelos exclusivos ao meliponário
AN – Alelos exclusivos às colônias naturais
Melip. – Meliponário
GL – Graus de liberdade
me – número de acasalamentos efetivos
dp - Probabilidade a nível populacional de não detecção de dois pais com o mesmo genótipo
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Na – Número de machos cuja maternidade pode ser atribuída Nj – Número de machos amostrados
wq – Peso da rainha
g – Grama
nw – número de operárias amostradas
nm – número de zangões amostrados
Patril. – Patrilínea
R – Coeficiente de parentesco
SD – Desvio padrão
Polim. – Polimorfismo
Iloc – Número de locos informativos
nwm – N número estimado de filhos de operárias detectados
Pwm – Proporção estimada de filhos de operária
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 13
2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 14
2.1. ASPECTOS GERAIS SOBRE ABELHAS........................................................ 14
2.1.1. Origem das abelhas e classificação das abelhas sem ferrão.......................... 14
2.1.2. Importância....................................................................................................... 15
2.1.3. Reprodução........................................................................................................ 15
2.1.4. Declínio populacional........................................................................................ 17
2.2. Meliponicultura.................................................................................................... 18
2.3. Microssatélites e estudos de estrutura genética intracolonial.......................... 18
2.4. Melipona mondury................................................................................................ 19
3. OBJETIVOS............................................................................................................ 20
3.1. OBJETIVO GERAL............................................................................................ 20
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................. 21
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 21
5. CAPÍTULO 1 - Transferabilidade de primers microssatélites desenvolvidos
para abelhas sem ferrão em quatro outras espécies do gênero Melipona............. 28
6. CAPÍTULO 2 – Meliponário como estoque de diversidade genética................. 36
7. CAPÍTULO 3 – Frequência de acasalamento, maternidade dos machos e
diversidade genética intracolonial em M. mondury (HYMENOPTERA:
MELIPONINI) Smith 1863........................................................................................ 52
8. CONCLUSÕES GERAIS...................................................................................... 64
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1. INTRODUÇÃO
As abelhas sem ferrão são insetos de grande importância pelo seu papel ecológico de
polinizadoras da flora brasileira, além da polinização de culturas agrícolas, produção de mel,
pólen e geoprópolis. No entanto, suas populações sofrem declínio pela perda de habitat e
destruição de ninhos.
A redução de suas populações aumenta a probabilidade de acasalamentos endogâmicos
e a ocorrência de machos diplóides, indivíduos improdutivos homozigotos no loco de
determinação do sexo, levando a perda de fitness e posterior morte da colônia.
Algumas espécies de meliponíneos são criadas em cortiços ou em caixas racionais,
atividade chamada meliponicultura, que representa uma importante fonte de renda para
agricultura familiar. A criação racional de uma espécie de abelha dentro da sua área de
ocorrência também pode servir como estoque de diversidade genética desde que o seu manejo
seja realizado corretamente, principalmente, diminuindo o nível de endogamia e a
probabilidade da ocorrência de machos diplóides.
Os estudos realizados com espécies eussociais de abelhas sem ferrão demonstram um
conflito reprodutivo entre rainha e operárias pela maternidade dos machos. O acasalamento da
rainha com apenas um macho, predominante no grupo, torna mais vantajoso para uma
operária cuidar de seus filhos e seus sobrinhos do que seus irmãos. Assim, estudar reprodução
das operárias contribui para o entendimento da evolução do comportamento eussocial em
abelhas sem ferrão.
O conhecimento sobre o sistema de acasalamento e parentesco é importante do ponto de
vista ambiental e econômico, pois embasa estudos de genética populacional, e pode ser
aplicado em programas de conservação e melhoramento genético.
Diante deste quadro, este estudo visou avaliar o quanto da diversidade genética da
espécie de abelha sem ferrão Melipona mondury está sendo mantida em um meliponário
dentro da sua área de ocorrência natural, a ocorrência de acasalamento múltiplos da rainha e
reprodução pelas operárias nessa espécie e a transferabilidade de marcadores moleculares
microssatélite em quatro espécies do gênero Melipona. Para isso, foram utilizados marcadores
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moleculares microssatélites, apropriados para a análise diversidade genética, paternidade e
parentesco por serem marcadores codominantes, de alto polimorfismo e reprodutibilidade.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Aspectos gerais sobre abelhas
2.1.1 Origem das abelhas e classificação das abelhas sem ferrão
As abelhas são insetos da Ordem Hymenoptera, Superfamília Apoidea, em que a
maioria das espécies tem como principal fonte de energia e proteínas o néctar e o pólen,
respectivamente (Nogueira-Neto, 1997). As abelhas pertencem a um grupo monofilético
descendente de vespas apóideas. Entre suas sinapomorfias estão a alimentação das larvas por
pólen misturado com néctar ou óleos florais, pêlos plumosos ou ao menos ramificados, garras
fendadas e basitarso posterior mais largo que os tarsômeros seguintes, relacionado à coleta de
pólen (Michener, 2007). Abelhas assemelham-se às vespas apóideas pelo comportamento de
construção de um ninho em que vão aprovisionar, ovipositar e suas larvas vão se desenvolver
(Silveira et al., 2002).
A Família Apidae possui os hábitos sociais mais avançados e constrói células de cria e
de alimento com cerume, uma mistura de cera secretada pelas abelhas com própolis retirado
das plantas (Nogueira-Neto, 1997). As tribos Apini e Meliponini contêm as espécies
eusociais, isto é, que vivem em uma colônia onde existem operárias que forrageiam, cuidam
da cria e fazem guarda, não podendo fundar colônias, e uma rainha morfológica e
geneticamente diferente responsável pela reprodução e incapaz de sobreviver sem a ajuda das
operárias (Michener, 2007).
A tribo Meliponini reúne abelhas de ferrão atrofiado ou “abelhas indígenas sem ferrão”,
representadas por 391 espécies, em de 33 gêneros (Moure et al., 2007), com distribuição nas
regiões tropicais do mundo e subtropicais das Américas do Sul, Central, África, Índia,
Malásia e Austrália (Camargo e Pedro, 1992). O gênero Melipona possui 65 espécies descritas
(Moure et al., 2007).
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A tribo Meliponini é composta de dois grupos compostos pelo gênero Melipona e os
trigoníneos. As melíponas não constroem células reais e a entrada da colônia localiza-se em
geral no centro de uma estrutura crateriforme e raiada feita de terra ou geoprópolis. Os
trigoníneos são um grupo diversificado, com dezenas de gêneros, que constroem células reais,
maiores que as outras, de onde emergem as rainhas (Nogueira-Neto, 1997).
2.1.2. Importância
As abelhas são os principais polinizadores. A polinização determina a formação de
frutos e sementes férteis, além da manutenção da diversidade genética da flora (Kerr et al.,
2001). As flores de jardim, a maioria das frutas e vegetais utilizados na alimentação animal e
humana, e as produtoras de fibras como linho e algodão são polinizadas por abelhas
(Michener, 2007). Sem as abelhas a capacidade reprodutiva das plantas floríferas seria
reduzida (Kerr et al., 2001).
O equivalente a 70% das culturas experimentariam perdas de produção por limitação da
polinização, entretanto, o serviço da polinização foi negligenciado até recentemente (Klein et
al., 2007). O valor da polinização para a produção de culturas para a alimentação humana foi
estimado em 153 bilhões de euros em 2005, representando 9,5% do valor total da produção
(Gallai et al., 2009). Em um estudo de 41 sistemas de cultura mundiais foi demonstrado que
uma maior riqueza de polinizadores selvagens, entre eles as abelhas sem ferrão, têm grande
potencial para aumentar o rendimento na produção agrícola mundial e devem ser
considerados insumos agrícolas (Garibaldi et al., 2013).
2.1.3. Reprodução e conflitos
Em abelhas a determinação do sexo envolve haplodiploidia e o loco de determinação do
sexo complementar (csd). Ovos não fecundados dão origem a machos e ovos fecundados dão
origem a fêmeas quando heterozigotas no loco csd ou a machos estéreis quando homozigotos
(Beye et al., 2003).
Durante o processo de enxameamento ou de substituição da rainha, a rainha virgem sai
da colônia para o vôo nupcial, que dura aproximadamente de dois minutos e meio a oito
(Sommeijer et al., 2003), onde o macho realiza a monta, insere seu endofalo e ejacula no
PPGGBC
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oviduto seu sêmen, que posteriormente será armazenado na espermateca durante a vida da
rainha. Durante a ejaculação o macho se desprende da rainha e seu endofalo é arrancado
(Winston, 1991), sendo a inseminação da rainha virgem o principal papel dos machos. Após o
início da postura dos ovos, a rainha de abelhas sem ferrão não mais sairá da sua colônia e as
rainhas virgens excedentes são mortas ou expulsas (Sommeijer et al., 2003). As operárias
transpotam cerume, mel e geoprópolis da colônia mãe para a nova colônia filha por dias, até
mesmo meses (Nogueira-Neto, 1997).
A presença de mais de uma rainha fisogástrica na mesma colônia, poliginia, é
temporária para a maioria das espécies de Melipona, porém é facultativa para Melipona
bicolor, com a coabitação de duas rainhas ou mais não só por situações transitórias, mas por
um período de tempo considerável (Velthuis et al., 2006). O primeiro caso de poliginia em M.
scutellaris foi descrito por Carvalho et al. (2011), onde cinco rainhas fisogástricas faziam
postura e não houve conflitos após 90 dias em observação.
A monoandria, acasalamento com apenas um macho, contribuiu para a evolução e
manutenção da eussociabilidade em insetos haplodiplóides devido ao alto parentesco médio
entre irmãs (r=0,75) em comparação com o da própia prole (r=0,5), tornando vantajosa a
reprodução indireta por meio do investimento em irmãs (Hamilton, 1964a). No entanto, se
uma rainha acasala com um macho portador de um mesmo alelo no loco de determinação do
sexo, metade da prole será de machos diplóides e inviáveis, diminuindo o crescimento da
colônia (Tarpy & Page, 2001).
A poliandria, acasalamento da rainha com mais de um macho, evolui em espécies
sociais após as operárias alcançarem a esterilidade e o comportamento social se tornar
irreversível (Hammilton, 1964b; Huges et al., 2008). A poliandria aumenta a diversidade
genética intracolonial, aumentando a probabilidade de combinações favoráveis nos genótipos
das operárias (Palmer & Oldroyd, 2000), como a resistência a parasitas (Baer & Schmid-
Hempel, 1999) e a redução da probabilidade da ocorrência de machos haplóides (Tarpy &
Page, 2001). A poliandria é comum para o gênero Apis (Palmer & Oldroyd, 2000).
Rainhas de abelhas sem ferrão pertencentes à tribo Meliponini, em geral acasalam-se
com apenas um macho (Alves et al., 2011a, Alves et al., 2009; Palmer et al., 2002; Peters et
al., 1999). Geralmente resultados que indicam poliandria (Palmer et al., 2002; Paxton et al.,
1999) são explicados como efeito de alelos nulos, inclusão acidental de machos na
amostragem, substituição recente da rainha, abelhas de outra colônia, ou conexão entre os
PPGGBC
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ninhos mãe e filho (Paxton et al., 2001; Peters et al., 1999). Alelos nulos são causados por
mutações no genoma que impedem a detecção de alelos e podem causar a interpretação errada
da paternidade (Callen et al., 1993).
A teoria da seleção por parentesco prevê conflitos reprodutivos entre indivíduos,
causados por diferenças nos valores de parentesco (Hamilton, 1964b). Em geral, as operárias
podem pôr ovos que servem de alimento para a rainha ou contribuir com machos para a
próxima geração com seus ovos não fertilizados (Bourke, 1988). O parentesco entre uma
operária e um filho da rainha é de 0,25. Em colônias em que a rainha se acasala com um único
macho as operárias preferem seus próprios filhos (0,5) e de suas irmãs (0,375) do que os da
rainha e disputam com esta a postura dos ovos não fertilizados. Quando a rainha se acasala
com mais de um macho o parentesco de uma operária com o filho de sua meia-irmã é de
0,125. Nesta situação, as operárias policiam as outras destruindo seus ovos ou sendo
agressivas com as que põem ovos, preferindo os machos produzidos pela rainha (Ratnieks,
1988).
Obter apenas o valor de parentesco não é suficiente para explicar a variação encontrada
na proporção de filhos de operárias em caso de monandria (Toth et al., 2004). Fatores como o
custo para a criação de um macho no lugar de uma operária (Palmer et al., 2002), o
policiamento da rainha (Ratnieks et al., 2006), dominância entre operárias (Heinze et al.,
1997) e a filogenia (Hammond & Keller, 2004) devem ser analisados.
Operárias podem ovopositar antes da rainha e fechar a célula de cria, depois da rainha
ou através de um pequeno orifício, após o fechamento da célula de cria. Os diferentes
métodos que as operárias usam para se reproduzir são consistentes com uma corrida
armamentista entre rainha e operárias (Toth et al., 2004). A ocorrência de reprodução das
operárias em diferentes espécies indica que não devemos considerar este comportamento uma
aberração, mas uma das opções reprodutivas disponíveis (Beekman & Oldroyd, 2008).
2.1.4. Declínio populacional
Os meliponíneos nidificam em ocos de árvores vivas, de árvores secas, em cipós, em
raízes secas de aráceas, em ninhos aéreos, em buracos, em canos plásticos subterrâneos, semi-
aéreos, em tomadas de luz, em alturas diversas das árvores e até em ocos que, por pouco
tempo, ficam submersos (Kerr et al., 2001).
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No Brasil, os meliponíneos vêm sofrendo declínio populacional por causa de ações
antrópicas como destruição e fragmentação de seus habitats, uso inadequado de inseticidas e
extrativismo provocado meleiros que matam as colônias para retirar mel (Kerr et al., 1996).
Em populações reduzidas ou isoladas a endogamia e deriva genética torna as abelhas
altamente susceptíveis à extinção pelo aumento da ocorrência de machos diplóides, indivíduos
inviáveis, homozigotos no loco complementar de determinação do sexo (csd). Como
consequência, as populações diminuem em uma taxa maior e se recuperam mais lentamente
do que o esperado apenas por efeito da diminuição populacional e depressão endogâmica
(Zayed, 2009).
2.2. Meliponicultura
A meliponicultura é a criação de abelhas sem ferrão em caixas racionais ou em cortiços
(Nogueira-Neto, 1997). Esta prática pode fornecer de maneira sustentável mel, pólen,
geoprópolis, enxames para comercialização, serviço de polinização racional e material
biológico para estudos científicos. Entre outras aplicações estão o paisagismo, lazer,
ecoturismo e educação ambiental (Carvalho et al., 2003).
Deve-se escolher uma espécie de manejo conhecido (Carvalho-Zilse et al., 2011) e que
ocorra naturalmente no local em que será montado o meliponário, pois os meliponíneos são
estreitamente adaptados as condições ecológicas locais (Nogueira-Neto, 1997). Para evitar a
redução das populações naturais os criadores devem adquirir suas colônias de outros
meliponicultores ou retirar da natureza em árvores mortas, áreas em risco de desmatamento
ou queimadas (Carvalho-Zilse et al., 2011) ou ninhos armadilha (Oliveira et al., 2009).
No Brasil, a maioria dos meliponicultores tem pouco nível técnico e equipamentos.
Atualmente vêm sendo instruídos por programas sociais e governamentais, na internet por
blogs e sites, e participam de cooperativas e associações (Cortopassi-Laurino et al., 2006).
2.3. Microssatélites e estudos de estrutura genética intracolonial
Técnicas moleculares são poderosas na análise de paternidade por terem maior poder de
resolução em revelar diferenças genéticas entre indivíduos relacionados e estimar suas
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relações de parentesco. Utilizando-se estas técnicas, o número de acasalamentos da rainha
pode ser determinado a partir dos genótipos da progênie (Palmer et al., 2002).
Entre os marcadores moleculares estão os microssatélites, constituídos de sequências de
um a quatro nucleotídeos repetidas em tandem, altamente polimórficos pela variação no
número de repetições, dispersos no genoma de eucariotos e codominantes. Estas sequências
podem ser amplificadas individualmente pela técnica de PCR por um par de primers que as
flanqueiam (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Dentre as espécies de abelhas para as quais foram desenvolvidos primers estão: Apis
mellifera (Rowe et al., 1997), Melipona bicolor (Peters et al., 1998), M. mondury (Lopes et
al., 2010), M. seminigra merrillae (Francini et al., 2009a), M. interrupta manaosensis
(Francini et al., 2009b), M. quadrifasciata (Tavares et al., 2012), Trigona carbonaria (Green
et al., 2001) e Eulaema meriana (Lopez-Uribe et al., 2010).
Em abelhas, esses marcadores são utilizados em estudos de diversidade genética (Alves
et al., 2011b), bem como de estrutura intracolonial (Alves et al., 2011a), incluindo
paternidade, diferenciando operárias filhas de pais diferentes (patrilineas) dentro de colônias
(Palmer et a.l, 2002).
Entre as espécies do gênero Apis o número de acasalamentos detectados foram 10 a 28
para Apis mellifera (Kraus et al., 2005), 21 a 23 para A. laboriosa (Takahashi & Nakamura,
2003) e 42 a 69 para A. nigrocincta (Palmer et al., 2001).
Por meio de marcadores microssatélites foi verificada monoandria para as espécies de
abelhas sem ferrão Scaptotrigona mexicana, S. pectoralis, Austroplebeia symei, Trigona
clypearis, T. hockingsi, T. mellipes and T. sapiens (Palmer et al, 2002), Melipona
quadrifasciata (Alves et al.,2011a). Acasalamentos múltiplos foram encontrados nas espécies
Melipona beecheii (1 a 3) Scaptotrigona postica (1 a 7) (Paxton et al., 1999), Melipona
scutellaris (1 a 2) (Carvalho, 2001), o que sugere que o mesmo pode ocorrer também em
outros meliponíneos (Paxton et al., 1999).
2.4. Melipona mondury
A abelha sem ferrão Melipona mondury (Figura 1) pertence ao complexo rufiventris
ocorre no domínio morfoclimático Mata Atlântica nos Estados da Bahia a Santa Catarina
PPGGBC
20
(Melo, 2003), em florestas de umidade elevada e principalmente abaixo de 400m de altitude
(Sousa et al., 2012). Por ter sido elevada a espécie por Melo (2003), pesquisas sobre a sua
bionomia são escassas (Souza et al., dados não publicados).
Seu habitat vem sendo reduzido e fragmentado (INPE e Fundação SOS Mata Atlântica,
2011) e populações naturais estão diminuindo (Tavares et al., 2007). Além disso, é uma
espécie pouco conhecida e criada por meliponicultores, principalmente na Bahia, o que
dificulta a obtenção de amostras para estudos populacionais e justifica a criação de
meliponários para a conservação da espécie.
Figura 1. Operárias de M. mondury na entrada de uma caixa racional (Fonte: ASF -
UESB).
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
O objetivo deste trabalho foi avaliar o quanto de diversidade genética de populações
naturais de Melipona mondury está sendo mantida em um meliponário dentro da área de
ocorrência da espécie, a ocorrência de acasalamentos múltiplos de rainhas e a reprodução das
operárias.
PPGGBC
21
3.2. Objetivos específicos
1- Padronizar a técnica de microssatélites e testar a transferabilidade de 49 locos;
2- Avaliar e comparar as diversidades genéticas intercoloniais das colônias do
meliponário e as de ocorrência natural;
3- Avaliar a frequência de acasalamentos das rainhas e diversidade genética
intracolonial e, por consequência, melhor entende sua estrutura populacional;
4- Avaliar o nível de reprodução das operárias, contribuindo para o entendimento
da evolução do comportamento eussocial; e
5- Aumentar o conhecimento sobre a reprodução da espécie, subsidiando projetos
de conservação e melhoramento genético informações
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5. CAPÍTULO 1
Transferabilidade de primers microssatélites desenvolvidos para abelhas sem ferrão em
quatro outras espécies do gênero Melipona.*
Palavras-chave: Microssatélites; Transferabilidade; Abelha; Melipona; Conservação.
*Artigo publicado de acordo com as normas da Revista Genetics and Molecular
Research.
PPGGBC
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Transferabilidade de primers microssatélites desenvolvidos para abelhas sem ferrão em
quatro outras espécies do gênero Melipona
M. V. C. Viana1; E. A. Miranda
1; A. K. de Francisco
1; C. A. L. Carvalho
2; A. M.
Waldschmidt1
1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié,
BA, Brasil 2 Núcleo de Estudo dos Insetos, Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Cruz das
Almas, BA, Brasil
Autor correspondente: A. K. de Francisco
E-mail: [email protected]
Transferabilidade de primers de microssatélite em Melipona
Marcadores microssatélites são úteis para monitoramento ecológico de populações naturais e
manejadas. A limitação da técnica está no custo para o desenvolvimento de novos
marcadores, o que torna os marcadores heterólogos uma alternativa. Em abelhas, estes
marcadores têm sido usados em estudos genéticos populacionais e intracoloniais. O gênero
Melipona possui o maior número de espécies, cerca de 70, e ocorre na região Neotropical. No
entanto, somente cinco espécies do gênero possuem marcadores microssatélites específicos,
um número não representativo. A transferabilidade de 49 locos microssatélites foi avaliada
para quatro espécies do gênero Melipona (M. scutellaris, M. mondury, M. mandacaia e M.
quadrifasciata). Marcadores desenvolvidos para cinco espécies de Melipona e Trigona
carbonaria foram testados em quatro indivíduos de cada espécie, de diferentes localidades.
Entre os 49 locos, 22 amplificaram com sucesso nas quatro espécies, três tiveram bandas
inespecíficas e cinco não foram amplificados. O padrão de amplificação dos demais locos
variou entre as espécies. O número de alelos variou entre um e seis. Os resultados
demonstram a possibilidade de uso destes marcadores em outras espécies de Melipona,
aumentando o número de locos que podem ser analisados e contribuindo para estudos
posteriores de genética populacional e intracolonial, necessários para programas de
conservação, melhoramento genético e resolução de incertezas taxonômicas.
Palavras-chave: Microssatélites; Transferabilidade; Abelhas; Melipona; Conservação
Introdução
Microssatélites são marcadores moleculares codominantes baseados em sequências repetidas
simples e frequentes nos genomas eucariotos. Cada loco microssatélite é altamente variável,
multialélico e de alto conteúdo informativo (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Estes marcadores
são uma ferramenta útil para monitoramento ecológico de populações naturais, populações de
estoque e melhoramento genético (Bech et al., 2010). A limitação da técnica está no
investimento necessário para o desenvolvimento dos primers. A utilização de primers já
desenvolvidos em espécies relacionadas denominada transferabilidade, pode prover uma
alternativa para o desenvolvimento de novos marcadores (Patel et al., 2010). Diversos
trabalhos demonstraram a possibilidade de uso dos marcadores heterólogos em plantas
(Guidugli et al., 2009; Chu et al., 2010), vertebrados (Bech et al., 2010; Mantellato et al.,
2010) e invertebrados (Daly et al., 2002). Em abelhas, estes marcadores já foram utilizados
em análises populacionais (Carvalho-Zilse et al., 2009) e de estrutura genética intracolonial
(Alves et al., 2009, Alves et al., 2010).
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30
As abelhas são insetos da ordem Hymenoptera, cujo papel ecológico mais importante é a
polinização, necessária para a reprodução em plantas e/ou diminuição da depressão por
endogamia, estando associada com o aumento da produção e conservação de habitats
(Michener, 2007). O gênero Melipona abrange o maior número de espécies, cerca de 70
(Moure et al., 2007), ocorrendo em toda região neotropical, distribuindo-se desde o México
até Missiones, na Argentina, sendo mais diversificado na bacia amazônica (Camargo e Pedro,
1992; Silveira et al., 2002). Até o momento, foram descritos primers microssatélites para
apenas cinco espécies deste gênero, sendo elas: Melipona bicolor (Peters et al., 1998),
Melipona rufiventris (Lopes et al., 2009), Melipona seminigra merrillae (Francini et al.,
2009a), Melipona interrupta manaosensis (Francini et al., 2009b) e Melipona mondury
(Lopes et al., 2010).
Com o intuito de aumentar o número de espécies de Melipona a ser estudado com essa
metodologia, este estudo teve como objetivo a análise da transferabilidade de 49 locos
microssatélites em quatro espécies do gênero Melipona.
Material e métodos
As espécies estudadas foram Melipona (Michmelia) scutellaris, M. (Michmelia) mondury, M.
(Melipona) mandacaia, e M. (Melipona) quadrifasciata. Quatro indivíduos de cada espécie,
de diferentes localidades, foram usados para os testes de amplificação. O DNA genômico foi
isolado de acordo com o protocolo descrito por Waldschmidt et al. (1997).
Foi testado um total de 49 pares de primers descritos na literatura para as espécies Melipona
(Eomelipona) bicolor (Peters et al., 1998), Melipona (Michmelia) rufiventris (Lopes et al.,
2009), Melipona (Michmelia) mondury (Lopes et al., 2010), Melipona (Melikerria) interrupta
manaosensis (Francini et al., 2009b), Melipona (Michmelia) seminigra merrillae (Francini et
al., 2009a) e Trigona carbonaria (Green et al., 2001) (Tabela 1).
A mistura padronizada da reação de 10μL consistiu em: 0,1mM de cada
desoxirribonucleosídeo trifosfatado (dATP, dNTP, dGTP, dTTP); 0,4μM de cada primer;
1,5mM de MgCl2, 0,5 unidade de Taq polimerase em tampão 1X e 20ng de DNA genômico
total. A mistura foi incubada em termociclador modelo ATC201 (Nyx Technik). O programa
de amplificação teve uma etapa de 94ºC por 3 minutos, 40 ciclos com uma primeira etapa a
92°C (desnaturação) por 30 segundos, uma segunda etapa de temperatura de anelamento
específica do primer por 1 minuto, uma terceira etapa de 72ºC (extensão) por 30 segundos, e
ao final uma etapa de 72°C por 5 minutos.
Os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida não
desnaturante a 8%, e visualizados através de coloração com nitrato de prata a 0,2%.
Os resultados das amplificações foram avaliados como amplificados quando bandas do
tamanho esperado foram detectadas, não amplificados quando não houve produto de PCR, ou
inespecífico quando ocorreram bandas fora do tamanho esperado (Gao et al., 2005).
Resultados
A Tabela 1 mostra os resultados obtidos, incluindo número de alelos e temperaturas de
anelamento originais e padronizadas.
Os locos Mbi28, Mbi32, Mbi33, Mbi215, Mbi218, Mbi232, Mbi233, Mbi254, Mbi259,
Mbi305, Mbi522, Mru14, Mmo15, Mim05, Msm03, Msm04, Msm05, Tc1-20, Tc3-155, Tc3-
302, Tc4-214, Tc4-287 foram amplificados para todas as espécies testadas (45% do total dos
locos). O loco Mim11 foi amplificado com bandas inespecíficas, enquanto que os locos
PPGGBC
31
Mbi221, Mim01, Msm12, Msm13 e Tc3-349 não apresentaram produto de amplificação (10%
do total). Os demais locos variaram no padrão de amplificação de acordo com a espécie
analisada. O número de alelos encontrados variou de um a seis.
As porcentagens de sucesso e polimorfismo, respectivamente, nas amplificações para cada
espécie foram: Melipona scutellaris 71 e 33%; Melipona mondury 59 e 24%; Melipona
mandacaia 65 e 37%; Melipona quadrifasciata 69 e 37%.
Discussão
Devido ao baixo número de primers específicos desenvolvidos para meliponíneos até o
momento, primers heterólogos vêm sendo utilizados em estudos populacionais, de
acasalamentos e de estrutura genética colonial em abelhas sem ferrão. Carvalho-Zilse & Kerr
(2006) testaram dez primers microssatélites heterólogos, desenhados para Melipona bicolor e
Apis mellifera, para estudos populacionais em Melipona scutellaris. Apenas os primers
desenhados para M. bicolor foram tranferidos com sucesso. Para estudar a variação genética
de colônias de M. scutellaris em um meliponário fundado por apenas duas colônias e
multiplicadas por um período de dez anos, fora da área de ocorrência da espécie, Alves et al.
(2010) utilizaram três marcadores microssatélites desenhados para Melipona bicolor e
Scaptotrigona postica. No estado de Minas Gerais, Tavares et al. (2007) diferenciaram
populações de Melipona rufiventris: Melipona mondury, que ocorre na Mata Atlântica, e M.
rufiventris, que ocorre no Cerrado, por meio de marcadores microssatélites desenvolvidos
para Melipona bicolor, isoenzimas e RAPD; propondo que duas populações estudadas do
Cerrado, Brasilândia de Minas e Dom Bosco, pertencem a uma nova espécie. Para análise de
acasalamentos múltiplos e parentesco de operárias Takahashi e Nakamura (2003) utilizaram
primers desenhados para Apis mellifera para amplificar quatro locos microssatélites em
operárias de duas colônias de Apis laboriosa. Palmer et al. (2002) utilizaram marcadores
microssatélites desenhados para A. mellifera, Scaptotrigona postica, Melipona bicolor,
Trigona carbonaria em sete espécies dos gêneros Scaptotrigona, Trigona e Austrophlebeia
oriundas do México e da Austrália para a avaliação de acasalamentos múltiplos e maternidade
dos machos das abelhas australianas. Alves et al., (2009) avaliaram a maternidade de machos
produzidos em colônias de M. scutellaris por meio de três primers microssatélites desenhados
para M. bicolor e S. postica.
Como demonstrado por Carvalho-Zilse & Kerr (2006) que utilizaram marcadores para A.
mellifera em M. scutellaris e Lopes et al. (2009) que utilizaram marcadores de M. rufiventris
em Partamona helleri, o sucesso no uso de primers heterólogos é menor em espécies
filogeneticamente mais distantes. Neste estudo, os resultados obtidos para as quatro espécies
do gênero Melipona (sugêneros Michmelia e Melipona) com o uso de marcadores
desenvolvidos para outras espécies do mesmo gênero (subgêneros Eomelipona, Michmelia e
Melikerria) e para T. carbonaria evidenciam que a distância evolutiva nem sempre impede a
transferência de marcadores microssatélites (Tabela 2), pelo menos para espécies da mesma
tribo (Meliponini).
Segundo Lopes et al. (2010) apesar do uso de marcadores heterólogos ser possível, o
resultado obtido deve ser analisado com cuidado devido a alelos nulos oriundos de mutações
em sítios de anelamento. Porém, até o momento, apenas cinco espécies do gênero Melipona
possuem marcadores microssatelites específicos. Este é um número pouco representativo
considerando as cerca de 70 espécies descritas para o gênero (Moure et al., 2007). É
necessário mais informação sobre suas estruturas genéticas populacionais para estudos de
conservação.
PPGGBC
32
Devido ao grande número de espécies de abelhas e ao alto custo necessário para o
desenvolvimento de marcadores microssatélites, o uso de primers heterólogos torna-se uma
alternativa viável. Os resultados obtidos demonstram a possibilidade de utilização destes
marcadores heterólogos nas espécies estudadas, aumentando o número de locos que podem
ser analisados e contribuindo para futuras análises genéticas de diversidade, estrutura intra e
intercolonial necessárias para projetos de conservação, melhoramento e resolução de
incertezas taxonômicas.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro do Programa Nacional de Pós-Doutorado /
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (PNPD/CAPES), da
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), da Universidade Estadual do
Sudoeste da Bahia (UESB) e da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB).
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PPGGBC
34
Tabela 1 – Resultados obtidos com o teste dos 49 locos microssatélites heterólogos.
Locos Ta (°C) M. scutellaris
(A)
M. mondury
(A)
M. mandacaia
(A)
M. quadrifasciata
(A)
Mbi11 55 1 n.a. 2 2
Mbi28 57.5 2 3 1 1
Mbi32 57.5 1 [60°C*] 1 2 3
Mbi33 60 1 [57,5°C] 1 [57,5°C] 1 [57,5°C] 1
Mbi 88 57.5 1 n.a. 2 3
Mbi 103 50 n.a. n.a. 1 1
Mbi 215 57.5 2 [60°C] 1 2 [62,5°C] 2
Mbi218 60 2 4 [63°C**] 3 2
Mbi 219 57.5 n.a. [60°C] n.a. [60°C] 2 [60°C] 1
Mbi221 60 n.a. n.a. n.a. n.a.
Mbi232 50 5 [53°C] 2 2 4
Mbi233 57.5 5 [53°C] 3 5 4
Mbi254 55 4 [53°C] 6 [64°C**] 3 3
Mbi256 57.5 5 [53°C] in. 2 2
Mbi259 57.5 1 [53°C] 1 1 1
Mbi278 60 1 2 1 [65ºC***] n.a.
Mbi305 60 1 1 2 1
Mbi522 60 1 1 2 1
MRU 03 63 2 [53°C] 1 [53°C] in. [53°C] 3
MRU 14 62.5 2 [60°C] 2 [60°C] 3 [60°C] 3
MMO 08 59 1 [58°C] - n.a. n.a.
MMO 15 54 2 - 1 1
MMO 21 57 1 [56°C] - in. [56°C] in.
MMO 22 61,5 4 [59°C] - in. [59°C] in.
MMO 24 52 1 - n.a. n.a.
MIM 01 t.d. [62-52] n.a. [54°C] n.a. [54°C] n.a. [54°C] n.a. [54°C]
MIM 05 t.d. [62-52] 1 [54°C] 1 [54°C] 2 [54°C] 2 [54°C]
MIM 07 t.d. [62-52] n.a. [54°C] n.a. [54°C] n.a. [54°C] in. [54°C]
MIM 08 t.d. [62-52] 2 [54°C] 1 [54°C] n.a. [54°C] n.a. [54°C]
MIM 09 t.d. [62-52] n.a. [54°C] n.a. [54°C] n.a. [54°C] 1 [54°C]
MIM 11 t.d. [62-52] in. [54°C] in. [54°C] in. [54°C] in. [54°C]
MIM 12 t.d. [62-52] in. [55°C] in. [55°C] in. [55°C] 4 [55°C]
MSM02 t.d. [62-52] n.a. [60°C] n.a. [60°C] n.a. [60°C] n.a. [60°C]
MSM03 t.d. [62-52] 1 [60°C] 1 [60°C] 1 [60°C] 1 [60°C]
MSM04 t.d. [62-52] 2 [60°C] 2 [60°C] 2 [60°C] 1 [60°C]
MSM05 t.d. [62-52] 1 [60°C] 1 [60°C] 1 [60°C] 1 [60°C]
MSM07 t.d. [62-52] 2 [60°C] n.a. [60°C] 1 [60°C] n.a. [60°C]
MSM08 t.d. [62-52] in. [60°C] in. [60°C] in. [60°C] 2 [62°C]
MSM 09 t.d. [62-52] 1 [55°C] 1 [55°C] 4 [55°C] in. [55°C]
MSM12 t.d. [62-52] n.a. [59°C] n.a. [59°C] n.a. [59°C] n.a. [59°C]
MSM13 t.d. [62-52] n.a. [59°C] n.a. [59°C] n.a. [59°C] n.a. [59°C]
Tc1-20 55 1 1 1 2
Tc3-155 58 1 1 1 2
PPGGBC
35
Tc3-302 56 2 2 2 3
Tc4-63 58 1 n.a. 1 1
Tc4-214 55 1 2 1 1
Tc4-287 58 2 1 2 4
Tc4-349 55 n.a. n.a. n.a. n.a.
Tc7-13 58 n.a. n.a. 1 n.a.
Ta - temperatura original de anelamento do par de primers; A – número de alelos; t.d. –
touchdown; n.a.- não aplificado; in. – bandas inespecíficas; [] temperatura testada; *Carvalho-
Zilse e Kerr 2006; **Lopes, 2004; ***Werneck, 2008.
Tabela 2 – Porcentagem de sucesso na amplificação dos locos.
Locos n
Amp
(%)
M.
(Michmelia)
scutellaris
M.
(Michmelia)
mondury
M.
(Melipona)
mandacaia
M.
(Melipona)
quadrifasciata
M. (Eomelipona)
bicolor 18 83,3 83,3 66,6 94,4 88,8
M. (Michmelia)
rufiventris 2 87,5 100 100 50 100
M. (Michmelia)
mondury
5 46,6 100 - 20 20
M. (Melikerria)
interrupta
manaoensis
7 28,5 28,5 28,5 14,28 42,85
M. (Michmelia)
seminigra
merrilae
9 50 55,5 44,4 55,5 44,4
Trigona
carbonaria 8 75 75,5 62,5 87,5 75,5
n – número de locos, Amp (%) – porcentagem do sucesso de amplificações para os pares de
primers desenhados para a respectiva espécie.
PPGGBC
36
6. CAPÍTULO 2
Importância do meliponário como estoque de diversidade genética para a
conservação*
Palavras-chave: Abelhas; Melipona; Microssatélites; Conservação.
*Artigo escrito de acordo com as normas da Revista Animal Conservation.
PPGGBC
37
Importância do meliponário como estoque de diversidade genética para a conservação
Estoque genético de abelhas sem ferrão
M. V. C. Viana1; C. A. L. Carvalho
2; H. A. C. Sousa
1; A. K. de Francisco
1& A. M.
Waldschmidt1
1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié,
BA, Brasil
2 Núcleo de Estudo dos Insetos - INSECTA, Universidade Federal do Recôncavo da Bahia,
Cruz das Almas, BA, Brasil
Correspondente
Marcus. V. C. Viana
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Av. José
Moreira Sobrinho s/n, Jequiezinho, CEP 45206 -190, Jequié, BA, Brasil.
E-mail: [email protected]
Resumo
A meliponicultura, criação de abelhas sem ferrão, possui importância econômica, científica e
cultural, porém o manejo inadequado pode causar efeitos genéticos negativos como gargalo,
depressão endogâmica e exogâmica. Este estudo avaliou o potencial do meliponário, como
unidade de criação das abelhas sem ferrão, para estoque de diversidade genética, com o
intuito de discutir os aspectos necessários para a conservação de espécies de meliponíneos e
matrizes para melhoramento genético. Foram avaliadas e comparadas 37 colônias instaladas
em um meliponário e 33 colônias em condições naturais. O DNA genômico foi amplificado
nos locos microssatélites Mmo15, Mmo21, Mmo24, Mru14, Mbi233 e Mbi254, obtendo-se
respectivamente 2, 2, 1, 3, 11 e 11 alelos, nove destes exclusivos. Não foram detectados
desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg, tanto nas colônias do meliponário, como nas
colônias em condiçõesnaturais. Os dois grupos (meliponário e colônias naturais) encontram-se
em baixa estruturação e apenas 3% da variação genética foram encontradas entre o
meliponário e as colônias naturais. Os resultados obtidos demonstram a importância do
meliponário como estoque da diversidade genética de meliponíneos.
Palavras-chave: abelhas, Melipona, microssatélites, conservação
PPGGBC
38
Introdução
Abelhas sem ferrão pertencem à subfamília Apinae, tribo Meliponini, estão presentes
em regiões tropicais e subtropicais do mundo. São as mais comuns em muitas áreas tropicais
da América e presume-se que são as principais polinizadoras da vegetação nativa (Michener,
2007). A polinização é o seu papel ecológico mais importante e fundamental para a produção
de frutos e sementes e manutenção da variabilidade genética de plantas nativas e cultivadas
(Silveira et al., 2002).
O meliponário é uma unidade formada por um conjunto de colônias de abelhas sem
ferrão criadas em caixas racionais ou em cortiços, normalmente próximo às residências. A
meliponicultura tem como função a produção de mel, pólen, geoprópolis, comercialização de
enxames, polinização racional, uso em paisagismo, lazer, ecoturismo, educação ambiental e,
também, na conservação das espécies e fornecimento de material biológico para estudos
científicos (Carvalho et al., 2003). O meliponicultor deve escolher espécies cujo manejo é
conhecido (Carvalho-Zilse et al., 2011) e que são nativas da região onde o meliponário está
situado, pois os meliponíneos são estreitamente adaptados às condições ecológicas locais
(Nogueira-Neto, 1997). Deste modo, é possível beneficiar espécies vegetais nativas e nortear
programas de reflorestamento por meio da polinização por espécies de abelhas escolhidas por
análises palinológicas (Kerr et al., 1996). No Brasil, a maior parte dos meliponicultores ainda
possui um baixo nível técnico, embora vêm se aprimorando por meio de cursos oferecidos por
universidades e órgãos governamentais (Souza et al., 2009). Muitos criadores são membros
de associações e cooperativas e frequentam blogs de discussões, facilitando a divulgação das
técnicas de criação. As produções de mel e de novas colônias são os principais objetivos da
meliponicultura brasileira (Cortopassi-Laurino et al., 2006).
Os habitats das abelhas sem ferrão vêm sendo destruídos por desmatamento, ações de
meleiros e uso indiscriminado de inseticidas (Silveira et al., 2002; Kerr et al., 1996), tornando
a criação de meliponários um meio de conservação, oferecendo abrigo principalmente para as
espécies que necessitam de ocos em troncos de árvores para nidificar. Recomenda-se que os
ninhos para criação devem ser adquiridos de outros criadores ou em áreas de risco,
preferencialmente em árvores mortas (Carvalho-Zilse et al., 2011) e por ninhos armadilha
(Oliveira et al., 2009).
O monitoramento de populações naturais e de estoque pode ser realizado por meio de
marcadores moleculares (Bech et al., 2010). Microssatélites são sequências neutras de
PPGGBC
39
repetição simples de nucleotídeos, codominantes e com alto grau de polimorfismo (Ferreira e
Grattapaglia, 1998). Marcadores microssatélites são utilizados em abelhas para estudos de
estrutura genética de populações (Alves et al., 2011; Borges et al., 2010), maternidade e
paternidade (Palmer et al., 2002) e resoluções taxonômicas (May-Itzá et al., 2010; Tavares et
al., 2007).
A espécie de abelha sem ferrão Melipona mondury, conhecida popularmente como
uruçu amarela, ocorre na Mata Altântica brasileira nos Estados da Bahia a Santa Catarina
(Melo, 2003). Pesquisas sobre a sua biologia ainda são escassas (Souza et al., in press). No
Estado da Bahia a espécie ocorre principalmente em altitudes abaixo de 400m (Sousa et al.,
2012). Seu hábitat vem sofrendo redução e fragmentação (INPE e Fundação SOS Mata
Atlântica, 2011) e suas populações encontram-se reduzidas e com baixa diversidade genética,
como demonstrado por Tavares et al. (2007) em Minas Gerais. Estes fatores dificultam a
obtenção de colônias e, consequentemente, de amostras para estudos populacionais.
Assim, este estudo tem como objetivo avaliar o potencial de meliponários para estoque
de diversidade genética natural e discutir aspectos necessários para tal função, visando
estudos de conservação e melhoramento genético.
Material e Métodos
O meliponário analisado neste estudo está localizado no domínio morfoclimático Mata
Atlântica, na fazenda Outro Fino (13°43'29.82"S, 39°47'24.72"W, 292m), município de
Jaguaquara, Estado da Bahia, dentro da área de ocorrência natural da espécie M. mondury. A
área no entorno é um pasto com predominância de gramíneas, reflorestado a partir de 1994.
As colônias do meliponário M. mondury foram retiradas de árvores mortas ou derrubadas por
madeireiros e de áreas de risco de queimadas, em um raio de cerca de 15Km que inclui os
municípios de Jequié, Apuarema e Jaguaquara. As colônias são mantidas em caixas racionais,
espalhadas ao redor da residência num raio de 100m, em cavaletes individuais ou em duplas
(Fig. 2). As colônias são mantidas há mais de 20 anos sem manejo ou divisões artificiais
como seleção para produção.
Para avaliar a diversidade genética foram coletadas operárias de 37 colônias do
meliponário que foram comparadas com operárias de outras 33 colônias naturais, amostradas
nas localidades de Teixeira de Freitas (6 colônias), Jequié (5), Apuarema (4), Jaguaquara (4),
PPGGBC
40
Itacaré (4), Itabuna (3), Caatiba (3), Piraí do Norte (2), e Itiúba (2) (Fig. 1). O DNA total de
uma operária por colônia foi extraído segundo o protocolo de Waldschmidt et al. (1997).
Após teste de polimorfismo com 49 locos, os locos específicos Mmo15, Mmo21, Mmo24
(Lopes et al., 2010) e os locos heterólogos Mru14 (Lopes et al., 2009) e Mbi232 (Peters et al.,
1998) foram amplificados segundo o protocolo de Schuelke (2000). A reação de amplificação
de 10µL consistiu em 0,4µM de primer F, 0,1µM de primer F com cauda M13, 0,4µM de
primer R, 1,5mM de MgCl2, 0,1mM de cada desoxirribonucleosídeo trifosfatado (dATP,
dNTP, dGTP, dTTP), 1X de tampão, 0,5U de Taq DNA polimerase e 20ng de DNA total. O
programa de amplificação teve uma etapa inicial de desnaturação a 94ºC por 3 minutos; 30
ciclos de 92ºC por 30 segundos, temperatura padronizada para cada loco por 1 minuto (Tabela
1), 72º por 30 segundos; 8 ciclos de 92ºC por 30 segundos, 53ºC por 45 segundos, 72º por 45
segundos; e uma extensão final a 72ºC por 10 minutos. Os amplificados foram genotipados
em sequenciador modelo ABI 3500 (Applied Biosystems) e analisados pelo programa Gene
Mapper v.5.0.
A correção de alelos nulos foi feita utilizando o programa FreeNA (Chapuis e Estoup,
2007) com o algoritmo de Maximização de Expectativa de Dempster et al (1977). A
diversidade alélica (A), porcentagem de locos polimórficos, heterozigosidades médias
observada (Ho) e esperada (He), desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg com correção
sequencial de Bonferroni, a distância genética de Nei (1972), estatística F e a análise de
variância molecular (AMOVA) com dois níveis hierárquicos (entre grupos e dentro dos
grupos) foram calculados pelo programa GeneAlEx 6.5 (Peakall e Simouse, 2012). Os
resultados foram comparados entre o meliponário e colônias naturais de M. mondury.
Resultados
Os locos Mmo15, Mmo21, Mmo24, Mru14, Mbi233 e Mbi254 apresentaram 2, 2, 1, 3,
11 e 11 alelos, respectivamente. Alelos nulos foram detectados no meliponário nos locos
Mmo15, Mbi233 e Mbi254 e na colônias naturais nos locos Mmo21 e Mbi233. Quatro alelos
foram exclusivos ao meliponário e cinco às colônias naturais (Tabela 1). A diversidade alélica
foi de 4,17 para o meliponário e 4,33 para as colônias naturais. As heterozigosidades médias
observada (Ho) e esperada não enviesada (He) foram 0,49 e 0,49 para o meliponário e 0,46 e
0,46 para amostras do Estado (Tabela 2). O percentual de locos polimórficos foi de 83,33%
para o meliponário e para as colônias naturais. Em conjunto, as amostras apresentaram valores
PPGGBC
41
de heterozigosidade média observada e esperada de 0,48 e 0,47, diversidade alélica (A) de
5,00 e percentual de locos polimórficos de 83,33%. Desvios no equilíbrio de Hardy-Weinberg
não foram detectados (p>0,05). A distância genética de Nei (1972) entre os dois grupos
(meliponário e colônias naturais) foi de 0,035. O valor de Fst foi de 0,015 e o valor de Fis foi
de 0,00 para todas as amostras, sendo os dois valores não significantes (p>0,05). Para a
AMOVA 97% de toda a variação estão dentro dos grupos e 3% entre os grupos. O valor de
Φst foi de 0,032 (p<0,05) (Tabela 3).
Discussão
O número médio de alelos nos marcadores específicos (1,66) foi menor do que o dos
heterólogos (8,33), indicando que, uma vez que o loco é amplificado, a origem do marcador
não foi fator determinante de polimorfismo e, assim, marcadores heterólogos podem ser
utilizados em conjunto com os específicos.
Os valores de diversidade alélica (A) e a heterozigosidade média esperada (He)
analisando os dois grupos (meliponário e colônias naturais) em conjunto ou separadas foram
maiores do que as encontradas no Estado de Minas Gerais por Tavares et al. (2007) utilizando
cinco marcadores microssatélites heterólogos (A=2,56 e He=0,12) e Lopes et al. (2010b) por
nove marcadores microssatélites específicos (A=3,3 e He=0,22). Esta diferença
provavelmente se deve à menor amostragem e/ou genotipagem dos locos microssatélites em
gel de acrilamida dos estudos em Minas Gerais e diferenças no padrão da degradação da mata
entre os dois Estados. Minas Gerais possuía maior área de mata original (27.235.854 ha) em
comparação com o Estado da Bahia (18.875.009 ha), atualmente reduzidas a 9,64 e 8,38%,
respectivamente (INPE e Fundação SOS Mata Atlântica, 2011). Embora este estudo não tenha
objetivo de estimar a estrutura genética da espécie no Estado da Bahia, pode-se sugerir que a
qualidade e a distância entre os fragmentos florestais remanescentes no Estado da Bahia
podem suportar populações maiores e oferecer menor impedimento ao fluxo gênico para M.
mondury em comparação ao Estado de Minas Gerais.
A presença de alelos exclusivos e 3% da variação entre os grupos (meliponário e
colônias naturais) são consistentes com a baixa estruturação encontrada (Fst=0,015 e
Φst=0,032) e indica que existe fluxo gênico entre o meliponário e populações naturais, e que a
PPGGBC
42
diversidade genética local está sendo mantida. Este resultado pode ser explicado pela origem,
localização, número e manejo das colônias do meliponário.
Parte da diversidade encontrada no meliponário pode ser explicada pela origem natural
das colônias, transportadas num raio 15Km do meliponário. O transporte de colônias pode
aumentar ou diminuir frequências alélicas (Carvalho-Zilse et al., 2009) e não deve mudar a
estrutura genética natural de uma população, para evitar a perda de adaptações locais (Kraus
et al., 2011). A introgressão, o cruzamento de populações geneticamente diferentes, pode
originar híbridos não adaptados aos ambientes das populações parentais, processo conhecido
como depressão exogâmica (Frankhan et al., 2008).
Um número mínimo de 44 colônias é necessário para se manter viável uma população
de meliponíneo com seis diferentes alelos sexuais e consequente diminuição da ocorrência de
machos diplóides, indivíduos homozigotos no loco de determinação do sexo, que não
contribuem para a manutenção da colônia (Kerr, 1985). Apesar da degradação ambiental, é
provável que as distâncias entre as áreas de mata remanescentes não sejam uma barreira
efetiva para a espécie e permita o fluxo gênico com as colônias naturais. Deste modo, o
número necessário para se manter o meliponário geneticamente viável é reduzindo. Estudos
sobre a capacidade de dispersão dos machos e enxameamento entre fragmentos de mata são
necessários para dar suporte a esta hipótese.
Após evidenciar a diferenciação e a baixa diversidade alélica das populações de uruçu
amarela no Estado de Minas Gerais, Tavares et al. (2007) afirmaram que é necessário se
preservar o maior número de colônias possível, de preferência na sua área de ocorrência.
Carvalho-Zilse et al. (2009) estudaram a diversidade genética de M. scutellaris em
meliponários dos Estados da Bahia, Pernambuco, Sergipe e Alagoas e observaram que nos
Estados da Bahia e Pernambuco as heterozigosidades médias observadas foram maiores
comparadas aos Estados de Alagoas e Sergipe, porém as diversidades alélicas foram menores.
Esta diferença se deve à intensa atividade de criação da espécie associada ao transporte e
seleção de colônias nos estados da Bahia e Pernambuco. Os valores baixos ou não
significativos de estruturação populacional encontrados foram explicados como transporte
artificial de material biológico, devido às grandes distâncias entre os meliponários. Este
resultado demonstra que as técnicas de manejo e seleção artificial são capazes de modificar
frequências alélicas.
PPGGBC
43
Na Europa os produtores apícolas translocam subespécies de Apis mellifera mais dóceis
e produtivas para fora de sua área de ocorrência histórica, causando introgressão e extinções
regionais de outras subespécies nativas, levando a perda de polinizadores generalistas
adaptados aos seus ambientes. O sucesso de futuros programas de proteção dependerá de
políticas de criação de larga escala orientadas a conservação de subespécies nativas, além da
valorização e subsídios de seus produtos. As duas principais medidas são a restrição da
introdução de subespécies “superiores” em regiões ocupadas por outras nativas e a
manutenção da diversidade destas (De La Rúa et al., 2009).
Um número maior de colônias pode aumentar o tamanho efetivo e comportar maior
diversidade genética (Alves et al., 2011). Atualmente a maioria dos meliponários possui entre
10 e 15 colônias (Carvalho-Zilse e Kerr, 2006), podem sofrer melhoramento pela eliminação
de rainhas menos produtivas (Silva-Barros, 2006) ou até são fundados fora da área de
ocorrência da espécie criada (Nogueira-Neto, 2002). Em populações reduzidas ou isoladas as
abelhas são altamente susceptíveis à extinção, pois o aumento da endogamia e a deriva
genética favorecem a ocorrência de machos diplóides, homozigotos no loco de determinação
do sexo, e reduz o fitness das colônias (Zayed, 2009).
Alves et al. (2011) monitoraram um meliponário de M. scutellaris localizado fora da
área de ocorrência e fundado a partir de duas colônias. O gargalo genético artificial reduziu
severamente o número de alelos sexuais e em locos microssatélites bem como aumentou em
cerca de dez vezes a proporção de colônias com ocorrência de machos diplóides quando
comparada com a população de origem. O meliponário foi mantido com sucesso com uma
taxa de cinco divisões de colônias por ano devido ao manejo com fornecimento de recursos
florais abundantes, alimentação artificial, transferência de favos de cria para colônias fracas e
a reposição natural de rainhas que produzem machos diplóides.
Os resultados obtidos por Alves et al. (2011) concordam com Nogueira-Neto (2002) por
demonstrar a possibilidade de se manter pequenas populações de meliponíneos viáveis por
meio de intenso manejo. Esta estratégia será útil para manejo de espécies criticamente
ameaçadas de extinção. No entanto, esforços de conservação devem manter populações
geneticamente viáveis ao longo do tempo (Frankhan et al., 2008), como no meliponário
proposto por Kerr (1985), que necessitem do mínimo possível de intervenção humana dentro
das colônias. A aplicação de uma das duas estratégias depende do nível de risco da espécie
que se vai conservar.
PPGGBC
44
Os meliponíneos são estritamente adaptados aos seus ambientes (Nogueira-Neto, 1997)
e sua baixa diversidade em comparação a Apis tem uma provável relação com genes de
adaptação aos ecossistemas ocupados que tendem a fixação de alelos pelo comportamento de
enxameagem a curtas distâncias e baixo nível de poliandria (Carvalho-Zilse & Kerr, 2006). A
genética da conservação tem o objetivo de preservar as espécies nativas como entidades
capazes de responder a mudanças ambientais e evoluir. Para tanto, é necessário o
reconhecimento de declínio populacional por ação antrópica, resolução de incertezas
taxonômicas, conhecimento da estrutura genética e adaptações locais, fluxo gênico histórico e
manejo visando populações geneticamente viáveis (Frankhan et al., 2008).
Além de fatores populacionais e genéticos, a conservação da espécie envolve a
conservação de seu hábitat (Silveira et al., 2008). Várias espécies do gênero Melipona são
dependentes de ambientes florestais e não sobrevivem em ambientes abertos nativos ou
antropogênicos (Silveira et al., 2002).
A M. mondury foi descrita recentemente (Melo, 2003), é pouco conhecida e criada e o
estudo sobre sua bionomia foi realizado por Sousa et al. (in press). A espécie deve ter seu
manejo conhecido e divulgado através de cursos e publicações para a qualificação do
meliponicultor. É fundamental que o meliponicultor conheça a maneira correta de se obter
colônias, tornando-se um aliado na conservação. A baixa estruturação e presença de alelos
exclusivos justificam a criação de novos meliponários com função de estoque genético em
outras localidades, além de um estudo populacional mais abrangente no Estado da Bahia.
Assim, pode-se concluir que os meliponários, como unidade de criação das abelhas sem
ferrão, têm potencial para conservação como estoque de diversidade genética e que este pode
ser criado em paralelo aos meliponários de produção, inclusive fornecendo material para o
melhoramento. Para tanto, é necessário que a criação racional seja dentro da área de
ocorrência da espécie, permitindo o fluxo gênico com as colônias naturais, e que a origem das
colônias deve ser de localidades próximas, para manter a estrutura genética local. É
importante que o esforço do manejo seja realizado por criadores qualificados e esteja
acompanhado da conservação do seu hábitat.
PPGGBC
45
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro do Programa Nacional de Pós-Doutorado /
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (PNPD/CAPES), Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Proc. 303237/2010-4), Universidade
Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB) e Universidade Federal do Recôncavo da Bahia
(UFRB).
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PPGGBC
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Figura 1 Meliponário e localidades amostradas no Estado da Bahia. 1 – Meliponário, 2 –
Itiúba, 3 – Jaguaquara, 4 – Piraí do Norte, 5 – Jequié, 6 – Apuarema, 7 – Itacaré, 8 –
Itabuna, 9 - Caatiba, 10 - Teixeira de Freitas.
Figura 2 Colônias de Melipona mondury no meliponário da fazenda Outro Fino,
município de Jaguaquara, Bahia, Brasil, instaladas sobre cavaletes individuais (A) ou em
dupla (B), dentro da mata, no município de Jaguaquara-BA (Fonte: ASF - UESB).
PPGGBC
50
Tabela 1 Temperatura de anelamento dos primers, número de alelos encontrados, número
de alelos exclusivos e heterozigosidades observada e esperada totais da população de
Melipona mondury no meliponário e nas colônias naturais.
Loco T (°C) Alelos AM AN Ho He
Mmo15 54 2
0,47 0,46
Mmo21 52 2
0,29 0,28
Mmo24 52 1
0,00 0,00
Mru14 60 3
1 0,51 0,51
Mbi233 57 11
2 2 0,73 0,78
Mbi254 60 11 1 3 0,86 0,82
T – temperatura de anelamento, AM – alelos exclusivos ao meliponário, AN – alelos
exclusivos às colônias naturais, Ho – heterozigosidade observada, He – heterozigosidade
esperada.
Tabela 2 Heterozigosidades médias observada (Ho) e esperada não enviesada (He) para as
populações de Melipona mondury no meliponário e nas colônias naturais.
Ho He
Melip. Naturais Melip. Naturais
Mmo15 0,55 0,55 0,49 0,43
Mmo21 0,24 0,16 0,29 0,28
Mmo24 0,00 0,00 0,00 0,00
Mru14 0,53 0,53 0,51 0,50
Mbi233 0,67 0,62 0,83 0,73
Mbi254 0,79 0,79 0,82 0,81
Média 0,49 0,46 0,49 0,46
Melip. – Meliponário.
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51
Tabela 3 Análise de variância molecular (AMOVA) para seis locos microssatélites das
populações de Melipona mondury no meliponário e nas colônias naturais.
Fonte de variação
GL % Estatística F
Entre grupos 1 3% Φst 0,032*
Dentro dos grupos 138 97%
Total 139 100%
*valor significativo (p<0,05)
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7. CAPÍTULO 3
Frequência de acasalamentos, maternidade dos machos e diversidade genética
intracolonial em Melipona mondury (Hymenoptera: Apidae) Smith 1863.*
Palavras-chave: Abelha sem ferrão; Melipona; Microssatélites; Poliandria.
*Artigo escrito de acordo com as normas da Revista PLOS ONE.
PPGGBC
53
Frequência de acasalamento, maternidade dos machos e diversidade genética
intracolonial em Melipona mondury (Hymenoptera: Apidae) Smith 1863
Marcus V. C. Viana1, Carlos A. L. de Carvalho
2, Henrique de A. C. Sousa1
, Ana Karina de Francisco1,
Ana M. Waldschmidt1
1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié, Bahia,
Brasil, 2 Núcleo de Estudo dos Insetos (Insecta), Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Cruz
das Almas, Bahia, Brasil
Resumo
A paternidade, a diversidade genética e a maternidade de machos em Melipona mondury foram
avaliadas em dez colônias por meio de seis locos microssatélites. As rainhas se acasalaram de uma a
sete vezes e a diversidade genética foi maior em colônias poliândricas. As colônias poliândrias tiveram
maior valor de heterozigosidade e diversidade alélica. O parentesco entre irmãs variou entre 0,53 e
0,90 nas colônias poliândricas, o que indica que os diferentes pais eram aparentados e vieram de uma
ou poucas colônias, provavelmente por diferenças entre colônias na produção de machos. A produção
de machos pelas operárias variou entre 0 e 100%,com média de 50%, resultado que corrobora com a
literatura para abelhas sem ferrão, principalmente para o gênero Melipona. Os valores de parentesco
em colônias poliândricas não foram suficientes para causar redução na reprodução pelas operárias. Os
resultados dão suporte a estudos de genética populacional e a teoria do fitness inclusivo.
Introdução
Segundo a teoria do fitness inclusivo, o alto valor de parentesco médio entre irmãs resultante
da monandria em insetos haplodiplóides aumentou o custo-benefíco da reprodução indireta por meio
de irmãs (r=0,75) em comparação à própria prole (r=0,5) e contribuiu para a evolução do
comportamento social, segundo a teoria do fitness inclusivo [1]. A monoandria é ancestral em oito
linhagens de Hymenoptera em que o comportamento eussocial evoluiu independentemente [2].
O comportamento eussocial reduz a variabilidade genética por meio da redução do tamanho
efetivo [3](Graur, 1985). Já o acasalamento múltiplo pode aumentar o tamanho efetivo [4], diminuindo
a probabilidade da ocorrência de machos haplóides [5] e aumentando o valor adaptativo da colônia [6],
[7].
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54
Informações sobre frequência de acasalamento da rainha e parentesco intracolonial auxiliam
os estudos de genética de populações a avaliar o impacto do declínio populacional em uma espécie. As
abelhas são altamente suscetíveis a extinção quando em pequenas populações isoladas, devido à
ocorrência de machos diplóides [8]. Rainhas de abelhas sem ferrão e do gênero Bombus normalmente
se acasalam uma única vez [9] dos Reis et al, 2011; [10], [11], [12] ou poucas vezes [13], enquanto a
poliandria é comum para o gênero Apis [14], [6].
Em muitas espécies de himenópteros as operárias podem fazer a postura de ovos por
paternogênese que podem alimentar a rainha ou darem origem a machos. A reprodução de uma
operária desvia parte dos recursos da colônia para a criação de seus filhos, caracterizando um
parasitismo social [15], [16] que ocorre na própria colônia [16], entre gerações ([17], entre colônias da
mesma espécie [18] e entre subespécies [19]. Em uma análise comparativa entre 109 espécies de
himenópteros eusociais foi demonstrado que o parentesco intracolonial, apesar de não ser o único
aspecto a ser considerado, tem um papel importante na determinação da maternidade dos machos [20].
Em caso de monoginia e poliandria as operárias são em média mais aparentadas com irmãos
(r=0,25) do que seus sobrinhos (r=0,125), gerando um conflito social entre operárias, resolvido
coletivamente através do policiamento, que consiste em ações capazes de suprimir a postura de uma
operária pelas demais, como de agressão ou destruição de seus ovos, aumentando assim a proporção
do número de filhos da rainha [21], [22]. Em caso de monoandria e monoginia, o parentesco entre uma
operária e seu irmão (r=0,25) é menor comparado com seu sobrinho (r=0,375) e a postura das
operárias se torna vantajosa coletivamente [21]. Em uma análise de 75 espécies em que o parentesco
favorece a produção de machos pelas operárias estas produziram uma média de 14% dos machos em
comparação com 0,14% na situação inversa, em 15 espécies [20].
Fatores além do parentesco contribuem para a variação na ocorrência de reprodução das
operárias [20]. Alguns estão ligados à produtividade da colônia, como o custo da substituição de uma
nova operária por um macho [11], [21], produtividade menor de operárias que se reproduzem [15] e
diminuição da produção de machos para aumentar a proporção de fêmeas [23]. Entre outros fatores
estão o policiamento da rainha [21], a dominância da reprodução entre operárias reprodutivas [24], a
reprodução somente após matricídio [25] e filogenia [26]. Em insetos sociais comportamentos
altruístas como se reproduzir apenas indiretamente sofrem influência de outros indivíduos, ou
“coerção”, [27], sendo o policiamento um meio de coerção.
A abelha sem ferrão Melipona mondury ocorre na Mata Atlântica dos Estados brasileiros
Bahia até Santa Catarina [28]. No Estado da Bahia a espécie é encontrada em florestas de umidade
elevada e baixas altitudes [29] e é uma espécie pouco conhecida pelos meliponicultores e pouco
estudada biológica e geneticamente. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a frequência de
PPGGBC
55
acasalamento das rainhas, a diversidade genética intracolonial e a maternidade dos machos em M.
mondury.
Material e métodos
Para estimar a frequência de acasalamento das rainhas e maternidade dos machos em dez
colônias foram amostradas a rainha, pupas de dez operárias e cerca de dez machos em cada (Tabela 1).
As colônias foram oriundas do meliponário da Fazenda Ouro Fino, no município de Jaguaquara
(13°43'29.82"S, 39°47'24.72"W, 292m), Estado da Bahia, área de ocorrência da espécie.
As freqüências alélicas polulacionais foram estimadas em 38 colônias do meliponário. O DNA
total foi extraído pelo protocolo de Waldschmidt et al [30]. Após testes de polimorfismos com 49
locos microssatélites, seis foram amplificados segundo o protocolo de Schuelke [31] por meio dos dois
pares de primers específicos Mmo15 e Mmo21 e dos quatro heterótogos Mru14, Mbi232, Mbi233 e
Mbi254 descritos por Lopes et al [32], Lopes et al [33] e Peters et al [34]. As temperaturas de
anelamento dos pares de primers foram 54°C, 52°C, 60°C, 50°C, 57°C e 60°C, respectivamente. Os
produtos das amplificações foram genotipados em seqüenciador modelo ABI 3500 (Applied
Biosystems) e analisados pelo software GeneMapper v.5.0.
Os genótipos paternos foram deduzidos por subtração, a partir do genótipo materno e das
operárias. A frequência de acasalamento efetivo, dependente da proporção da prole de cada pai, foi
calculada como me = 1/(Σyi2), onde yi é a proporção da patrilínea i em uma colônia [35]. O coeficiente
de parentesco entre as operárias foi calculado pelo software KINGROUP 2.09 [36] com o algorítimo
de Queller and Goodnight [37]. A probabilidade de não detecção de dois pais com o mesmo genótipo
foi calculada a nível populacional como dp = Π(Σqi2), onde qi é a freqüência do alelo i em um loco. A
soma para cada loco é multiplicada entre os locos [38]. A diversidade alélica, a heterozigosidade
observada e o percentual de locos polimórficos foram calculados pelo software GenAlex 6.5 [39].
Filhos de operárias foram detectados por herdarem um alelo do macho que acasalou com a
rainha, em um loco informativo [40]. A probabilidade de um macho herdar este alelo é 0,5, logo a
proporção de machos que podem ser detectados é Pj = (1 - 0,5i), onde i é o número de locos
informativos [11].
A proporção de machos filhos de operária que podem ser detectados com determinado número
amostral (Na) foi calculada como Na = (Pj.Nj) onde Nj é o número de machos amostrados em uma
colônia. O percentual de machos filhos de operária é estimado dividindo-se o número detectado por
Na e multiplicando por 100 [23].
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56
Resultados e discussão
Paternidade
O número de alelos detectados para os locos Mmo15, Mmo21, Mru14, Mbi232, Mbi233 e
Mbi254 foi 2, 2, 3, 4, 9 e 10, respectivamente. Pupas que não compartilharam alelos com a rainha
foram detectadas na colônia c11 (loco Mbi233), c24-F2 e c25 (loco Mru14). Este resultado pode ser
explicado na colônia c11 como sobreposição de gerações pela idade jovem da rainha, indicada pelo
seu tamanho reduzido e coloração clara do abdômen e compartilhamento de alelos nos outros cinco
locos. Nas colônias c24-F2 e c25 a rainha e as operárias que não herdaram seus alelos no loco Mru14
são homozigotas. Na colônia c26 as operárias são homozigotas para um dos alelos maternos. Nos
demais locos os alelos são herdados como esperado. Isto sugere a presença de alelos nulos, causados
por mutações no sítio de anelamento dos primers, neste loco [41]. Assumindo a presença de alelos
nulos, as rainhas das colônias c24-F2 e c25 se acasalaram com dois machos cada, e as operárias
tiveram somente o alelo materno ou paterno detectados. Com exceção da colônia em que houve
sobreposição de gerações (c11), não foram encontrados mais de três alelos em um loco.
As rainhas das nove colônias analisadas acasalaram entre uma e sete vezes, com o
acasalamento efetivo variando entre 1 e 6,25, considerando a hipótese de alelo nulo nas colônias c24-
F2, c25 e c26. A colônia c33 não teve locos informativos e foi assumida como monândrica. A
probabilidade de não detecção de dois pais de mesmo genótipo a nível populacional foi dp<0,002. A
diversidade alélica, a heterozigosidade observada e o percentual de locos polimórficos foram maiores
em colônias poliândricas (Tabela 2).
Sete de nove colônias exibiram poliandria, um resultado incomum para abelhas sem ferrão
[10], [11]. A amostragem de pupas para a dedução de freqüência de acasalamentos garantiu a análise
de indivíduos que nasceram na colônia amostrada [11]. Erro humano por mistura de amostras foi
descartado, pois os genótipos consistentes com mais de um pai são incompatíveis com outras colônias.
Obter o genótipo da rainha [17], [40] foi fundamental na dedução dos genótipos parentais, pois, na
ausência desta esta informação, o número de acasalamentos estimado teria sido apenas um, com
exceção das colônias c24-F2 e c25, com dois acasalamentos. Também não seria possível identificar a
sobreposição de gerações na colônia c11 e o valor de parentesco médio entre as colônias de 0,74 ±0,16
poderia ter sido interpretado como uma confirmação de suposta monandria. É provável que este
método aumente o nível de poliandria encontrado para abelhas sem ferrão em novos estudos.
O valor de parentesco para colônias com mais de um acasalamento variou de 0,53 a 0,89.
Provavelmente, os pais vieram de uma mesma colônia, se não a mesma colônia que a rainha,
mantendo o alto valor de parentesco. A contribuição na produção de machos entre diferentes colônias
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pode variar de acordo com condições internas e externas das colônias, principalmente em nas regiões
tropicais, onde fatores sazonais possuem impacto sobre o período de reprodução [42].
Rainhas de Apis apresentam maior freqüência de acasalamento, o que diminui a probabilidade
de ocorrência de machos diplóides na colônia e têm o fitness aumentado pela maior viabilidade da
prole, com maior população e melhor sobrevivência [5].
Rainhas de Bombus terrestris com acasalamento efetivo manipulado para um valor próximo a
quatro tiveram colônias com menor quantidade de parasitas e maior produção de machos e rainhas
virgens em comparação com as de acasalamento efetivo próximo a um. Sugere-se que a poliandria não
tenha se tornado comum na espécie pelas estratégias que os machos usam para monopolizar a
paternidade da prole do que pelo tempo, energia e risco de predação exigidos para a rainha durante o
vôo nupcial [7].
O sistema de enxameamento a curta distância e acasalamento efetivo abaixo de um favorece a
endogamia, restringe a diversidade genética e a adaptação a ambientes diversificados [4], justificando
a estreita adaptação às condições ecológicas locais [43]. A poliandria pode evoluir em espécies
eussociais após as operárias perderem a capacidade de se reproduzirem sexualmente e o
comportamento eussocial for irreversível [2], [1]. O acasalamento múltiplo em abelhas sem ferrão
pode ter o papel de manter da diversidade genética, que é reduzida por características da biologia do
grupo, como baixo número de acasalamentos e reduzida capacidade de dispersão do grupo.
Maternidade dos machos
Não foram encontrados machos na colônia c11 e nenhum dos locos analisados foi informativo
para a colônia c33. As operárias desta espécie são capazes de se reproduzir, com variação na
proporção de sua prole entre 0 e 100% entre colônias. A reprodução das operárias ocorreu em colônias
poliândricas e monândricas (Tabela 3). Não foram encontrados machos diplóides e a maternidade de
todos pôde ser atribuída às operárias ou à rainha fisogástrica.
O nível de reprodução de operárias em colônias poliândricas pode ser explicado pelos valores
de parentesco entre operárias [21]. Mesmo com o menor valor encontrado (0,53) o parentesco médio
de uma operária com seu sobrinho (0,265) é maior do que o esperado com seu irmão (0,25), e criação
de sobrinhos continua vantajosa para as operárias e não causa pressão para policiamento.
A variação na produção de machos por operárias entre colônias da mesma espécie pode ser
causada por efeito de amostragem [26] e período de coleta [17]. A ausência de machos na colônia c11
se deveu, provavelmente, por escassez de alimento no período da coleta, indicado pelo menor número
de operárias adultas e de discos de cria que as demais colônias [42]. Estudos mostram que adição
artificial de pólen na colônia estimula operárias e a rainha de Melipona subnitida a produzir machos
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[44]. É provável que coletas com maior número amostral ou em diferentes épocas e mais locos
informativos revelassem filhos de operárias nas colônias em que estes não foram encontrados.
Em uma análise de 31 espécies de abelhas sem ferrão foi demonstrado que existe uma corrida
armamentista evolucionária pela maternidade dos machos entre operárias e rainha. Tal hipótese é
sugerida por agressões da rainha a operárias poedeiras, diferentes estratégias de postura e variação no
desenvolvimento dos ovários das operárias e na postura na presença da rainha entre colônias e entre
espécies. A resolução do conflito depende da dinâmica do custo benefício da reprodução das operárias,
resultando entre 0 e 100% de machos produzidos por operárias. Existe um fator filogenético associado,
pois operárias de Melipona se reproduzem frequentemente enquanto as de Plebeia e espécies
australianas se reproduzem raramente ou nunca. Além disso, não foram encontradas correlações com o
tamanho da população da colônia, processo de aprovisionamento das células de cria e diferença entre o
tamanho da rainha e as operárias [26].
Em Melipona a reprodução de operárias é maior provavelmente pela substituição das rainhas
virgens produzidas em excesso por um macho [45]. A proporção de machos filhos de operária para M.
mondudry neste estudo (0 a 100%, Tabela 3) foi significante, similar a encontrada para as espécies M.
scutellaris (0 a 100%), M. quadrifasciata (55 a 70%), M. marginata (15 a 85%) [26], M.subnitida (0 a
61%) [44], M. bicolor (27 a 82%) [46], M. favosa (94,5%) [47].
A ocorrência de reprodução das operárias deve ser considerada não uma aberração, mas uma
das opções reprodutivas disponíveis [48]. Estudos de comportamento devem ser realizados para
esclarecer a estratégia de postura utilizada por operárias desta espécie.
Conclusão
O nosso estudo sugere que a poliandria encontrada em colônias de M. mondury aumentou a
diversidade genética, porém os acasalamentos múltiplos foram endogâmicos e mantiveram valores de
parentesco intracolonial próximos aos alcançados com monoandria. As operárias da espécie são
capazes de reproduzir e sua postura é promovida pelos valores de parentesco.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro do Programa Nacional de Pós Doutorado /
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (PNPD/CAPES), Fundação de
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Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
(UESB) e Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB).
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Tabela 1. Data da coleta, peso da rainha (wq), número de operárias (nw) e zangões (nm) amostrados e
número de locos analisados nas dez colônias de Melipona mondury
Colônia Data wq (g) nw nm locos
c09 17/04/2012 0,251 10 10 6
c11 07/05/2012 0,160 10 0 6
c13 17/04/2012 0,265 10 10 6
c16 17/04/2012 0,275 10 10 6
c24 18/10/2012 0,332 10 10 6
c24f2 21/12/2012 - 10 6 6
c25 18/10/2012 0,237 10 4 6
c26 08/08/2012 0,317 10 10 6
c29 17/04/2012 0,262 10 10 6
c33 08/08/2012 0,258 10 10 6
Média 0,262 10 8,88
Total 100 80
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Tabela 2. Número de patrilíneas, acasalamento efetivo (me), coeficiente de parentesco (R),
heterozigosidade oservada (Ho), diversidade alélica (A) e percentual de locos polimórficos em colônias
de Melipona mondury.
Colônia Patril. me R R (SD) Ho A Polim.
%
c09 7 6,25 0,53 0,22 0,82 15 100,00
c11 - - 0,63 0,21 0,82 14 100,00
c13 4 3,57 0,89 0,07 0,33 9 50,00
c16 1 1,00 0,75 0,16 0,62 12 66,67
c24 2 1,72 0,90 0,07 0,28 9 33,33
c24f2 2 1,72 0,81 0,18 0,20 9 50,00
c25 2 1,92 0,57 0,31 0,60 12 83,33
c26 2 1,92 0,55 0,30 0,60 12 83,33
c29 5 3,85 0,75 0,13 0,48 11 66,67
c33 1 1,00 0,98 0,03 0,15 7 16,67
média 2,89 2,55 0,74 0,49 11,00 65,00
SD 2,03 1,71 0,16 0,24 2,49 27,72
monoand. 1,00 1,00 0,87 0,38 9,50 41,67
SD 0,00 0,00 0,16 0,33 3,54 35,36
poliand. 3,43 2,99 0,71 0,47 11,00 66,67
SD 1,99 1,69 0,16 0,22 2,24 23,57
Tabela 3. Número de machos amostrados (Nj), número de locos informativos (Iloc), número de machos
cuja maternidade pode ser atribuída (Na), número estimado de filhos de operárias detectados (nwm),
proporção estimada de filhos de operária (Pwm) em colônias de Melipona mondury.
Colônia Nj Iloc Na nwm Pwm (%)
c09 10 4 9,38 10 100,00
c13 10 2 7,50 8 100,00
c16 10 3 8,75 0 0,00
c29 10 3 8,75 9 100,00
c26 10 2 7,50 0 0,00
c33 10 0 0,00 0 0,00
c24 10 2 7,50 4 53,33
c25 4 4 3,75 2 53,33
c24-F2 6 2 4,50 2 44,44
Total 80 57,63 35 50,17
Média 8,88 2,4 6,40 3,89 50,12
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8 . CONCLUSÕES GERAIS
Os resultados apresentados no presente estudo sugerem que:
Entre 69 e 73% dos 49 marcadores microssatélites foi transferida para as espécies
Melipona scutellaris, M. mondury, M. mandacaia e M. quadrifasciata. Estes marcadores
podem ser utilizados em conjunto com marcadores específicos e aumenta o número de locos
disponíveis para estudo.
O sucesso obtido com marcadores desenvolvidos para Trigona carbonaria indicam
que a distância filogenética nem sempre é um fator determinante para a transferência de
marcadores, pelo menos na tribo Meliponini.
As colônias de Melipona mondury do meliponário estão mantendo a diversidade
genética local e o fluxo gênico com as populações naturais, demonstrando potencial da
meliponicultura para estoque genético e conservação.
Rainhas de Melipona mondury acasalaram de uma a sete vezes, porém os
acasalamentos foram endogâmicos.
Foi demonstrado que a reconstrução dos genótipos parentais apenas por meio do
genótipo das filhas pode subestimar a frequência de acasalamento da rainha. Sugere-se a
utilização do genótipo da rainha em conjunto com o das operárias filhas como o método mais
adequado.
A proporção detectada de filhos de operárias variou entre 0 e 100%, resultado de
acordo com alto valor de parentesco entre operárias e variações nas condições internas das
colônias.
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