PPGVS/INCQS FIOCRUZ 2003 · Desenvolvimento e Validação da Metodologia de Análise do Teor de Lamivudina e do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189 em Comprimidos de Lamivudina

Teresa Cristina Raposo Löwen

Desenvolvimento e Validação da Metodologia de Análise do Teor de

Lamivudina e do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189 em

Comprimidos de Lamivudina.

PPGVS/INCQS

FIOCRUZ

2003

Desenvolvimento e Validação da Metodologia de Análise do Teor de

Lamivudina e do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189 em

Comprimidos de Lamivudina.


Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Orientadores: Dra. Elizabeth Moreira dos Santos

Dra. Tereza Cristina dos Santos

Rio de Janeiro

2003

ii

Desenvolvimento e Validação da Metodologia de Análise do Teor de Lamivudina e

do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189 em Comprimidos de Lamivudina.


Dissertação submetida à Comissão Examinadora composta pelo corpo docente do

Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de

Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz e por professores convidados de outras

instituições, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre.

Aprovado:

Prof. _______________________________________

Dra. Elizabeth Moreira dos Santos

Prof. _______________________________________

Dra. Elizabete Pereira dos Santos

Prof. _______________________________________

Dra. Sheila Garcia

Orientador: ________________________________________

Dra. Elizabeth Moreira dos Santos

Orientador: ________________________________________

Dra. Tereza Cristina dos Santos

Rio de Janeiro

2003

iii

Löwen, Teresa Cristina Raposo

Desenvolvimento e Validação da Metodologia de Análisedo Teor de Lamivudina e do Ensaio Limite do Enantiômero(+)BCH-189 em Comprimidos de Lamivudina./ Teresa CristinaRaposo Löwen. Rio de Janeiro: INCQS/ FIOCRUZ, 2003. xiv, 81 p., il., tab. Dissertação em Vigilância Sanitária, Prog. Pós-Graduação emVigilância Sanitária/ INCQS, 2001. Orientadores: Dra. ElizabethMoreira dos Santos; Dra. Tereza Cristina dos Santos. 1. Lamivudina e (+)BCH-189. 2. Antiretroviral. 3. Validação.4. Cromatografia líquida de alta eficiência.

I. Desenvolvimento e Validação da Metodologia de Análise doTeor de Lamivudina e do Ensaio Limite do Enantiômero(+)BCH-189 em Comprimidos de Lamivudina.

iv

Aos meus Pais, Avelina Raposo Löwen e Manoel

Antonio de Almeida Löwen “ in memoriam”

e ao meu irmão Luiz Claudio Raposo Löwen.

v

“ Em relação a todos os atos de iniciativa e de criação existe uma

verdade elementar: no momento em que nos compromissamos a

Providência também se põe em movimento. Todo um fluir de

acontecimentos surge a nosso favor. Como resultado da decisão,

seguem todas as formas de coincidências, encontros e ajuda que

nenhum homem jamais poderia ter sonhado encontrar. Qualquer

coisa que você possa fazer ou sonhar, você pode começar .

A coragem contém, em si mesma, o poder, o gênio e a magia.”

Goethe

vi

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer em primeiro lugar à minha orientadora Dra. Elizabeth Moreira dos

Santos, por ter lançado a semente, colocando a minha qualificação como uma condição

para o meu crescimento profissional, e sobretudo pelo carinho e afeto com o qual sempre

fui tratada durante todo o nosso convívio.

Agradeço especialmente à minha orientadora e amiga Dra. Tereza Cristina dos Santos

pelo estimulo, confiança, paciência e muitas vezes pela cobrança.

À Dra. Paula Fernandes de Aguiar, por sempre ter encontrado tempo para solucionar as

minhas dúvidas relativas a cálculos estatísticos, o meu muitíssimo obrigada.

À minha amiga e companheira de mestrado Antonia Maria Cavalcanti de Oliveira, pelas

muitas e proveitosas discussões, o incentivo e acima de tudo pela sua preciosa amizade.

À Andréia Nilza Diogo, amiga conseguida ao longo do curso de mestrado, com a qual

também compartilhei as dificuldades e as alegrias desta jornada.

Às secretárias da pós-graduação Simone e Gisele pela atenção, ajuda e principalmente

pelo carinho.

Aos meus amigos e colegas de trabalho do Instituto Vital Brazil, que sempre me

apoiaram e incentivaram, especialmente ao Rosemberg Bernardes Moure, Iara Coutinho e

Flávia Willi pelo auxilio como analistas, e a toda a equipe do Controle da Qualidade em

especial a Isabella Piazza, Celina Filgueiras e Joseane Zaja Almada que me substituíam no

trabalho quando necessitava me ausentar.

Enfim a todos os meus amigos sem o apoio dos quais eu não teria conseguido.

vii

RESUMO

O crescimento do número de casos de aids no Brasil, obrigou o governo a

desenvolver uma política de medicamentos que possibilitasse melhorar e prolongar a

qualidade de vida dos indivíduos infectados pelo HIV. Esta política inclui, entre várias

outras iniciativas, um programa de acesso universal e gratuito aos medicamentos

antiretrovirais. O principal objetivo da terapia antiretroviral é retardar a progressão da

imunodeficiência e/ou restaurar, tanto quanto possível, a imunidade, aumentando o tempo e

a qualidade de vida da pessoa infectada.

Ao mesmo tempo na Política Nacional de Medicamentos, que visa "garantir a

necessária segurança, eficácia e qualidade destes produtos, a promoção do uso racional e o

acesso da população àqueles considerados essenciais", estão destacadas as seguintes

diretrizes:

1) o incentivo ao desenvolvimento científico e tecnológico na área de produção de

fármacos;

2) o incentivo a produção nacional utilizando a capacidade instalada dos laboratórios

oficiais para atender as demandas do SUS;

3) destaca-se também o importante papel desenvolvido pelos laboratórios oficiais no que

tange ao domínio tecnológico de processos de produção de medicamentos de interesse

em saúde pública e como uma das instâncias favorecedoras do monitoramento de

preços no mercado.

Sendo um dos objetivos da Política Nacional de Medicamentos do Ministério da

Saúde assegurar o acesso da população a medicamentos seguros, eficazes e de qualidade,

fundamentando-se no cumprimento da regulamentação sanitária e nas boas práticas de

fabricação e controle, a validação de métodos analíticos, parte integrante das boas práticas

de laboratório surge como uma peça chave para assegurar a confiabilidade dos resultados

obtidos e assim garantir a qualidade aos produtos e serviços.

O presente trabalho propôs uma metodologia padrão para a validação do método

analítico de controle da qualidade do produto Lamivudina comprimidos, com enfoque na

dosagem do principio ativo Lamivudina e no ensaio limite do enantiômero (+)BCH-189

comprovadamente mais citotóxico em linfócitos não infectados, que a Lamivudina.

viii

ABSTRACT

The raise of the number of AIDS cases in Brazil, obliged the government to develop

a medicine policy which make possible improve and length the life quality of HIV infected

individual. This policy includes, among a variety of other initiatives, a universal and free

access program to antiretroviral medicine. The main objective of the antiretroviral therapy

is to retard the immunodeficiency progression and/or repair, as soon as possible, the

immunity, raising the time and the quality of life of the infected person.

At the same time at the Medicine National Policy, that look at “warrant the

necessary security, effectiveness and quality of these products, the promotion of the rational

use and the access of the population to the ones considered essentials”, are detached the

following purpose:

1) the incentive to the scientific and technological development in drugs production

area;

2) the incentive to the national production using the installed capacity of the official

laboratories to attend the SUS needs;

3) the important role developed by the official laboratories is also detached referring to

the technological domain of production processes of interest medicine in public health and

with one of the favour instances of the market prices monitoring.

Being one of the objectives of the Medicine National Policy from the Health

Ministry assert the access of the population to secure, effective and quality medicines,

founding in the accomplishment of the sanitary regulation and in the good manufacture

practices and control, the validation of analytical methods, an integrant part of the good

laboratory practices, surges as a principal tool to assert the trustworthy of obtained results

and thus guarantee the quality to products and services.

The present work proposes a pattern methodology to the validation of the analytical

method of Lamivudine tablets quality control, focusing the dosage of Lamivudine active

principle and the limit assay of the enatiomer (+)BCH-189 proved to be more cytotoxic in

non-infected lymphocytes than Lamivudine.

ix

SIGLAS E ABREVIATURAS

a: Coeficiente linear

α: Nível de significância

ABIA: Associação Brasileira Interdisciplinar de aids

aids: Acquired immune deficiency syndrome ou síndrome da imunodeficiência adquirida

ANOVA: Análise de variância

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ARV: Antiretrovirais

AZT: Zidovudina

b: Coeficiente angular

(+)BCH-189: Enantiômero dextrorotatório da lamivudina

BCH-189: Mistura racêmica

β-L(-): Configuração levorotatória do enantiômero β

β-D(+): Configuração dextrorotatória do enantiômero β

º C: Graus Celcius

CDC: Center for Disease Control and Prevention ou Centro de Controle e Prevenção de

Doenças

CD4: Linfócitos T ou células CD4

CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência

CMP/dCMP-K: Citidilato/2' desoxicitidilato quinase

D(+): Configuração dextrorotatória

DAD: Detector de arranjo de fotodiodos

dCK-2': Desoxicitidina quinase

ddC: Zalcitabina

ddI: Didanosina

DNA: Ácido desoxiribonucleico

DP: Desvio padrão

DPR: Desvio padrão relativo

d4T: Estavudina

DOU: Diário Oficial da União

x

DST: Doenças Sexualmente Transmissíveis

E: Exponencial

EUA: Estados Unidos da América

Fcalc. : F estatístico calculado (Teste de F de Snedecor)

Fcrit. : F estatístico tabelado (Teste de F de Snedecor)

FDA: Food and Drug Administration

Gcalc. : G estatístico calculado (Teste de Grubbs)

Gcrit. : G estatístico tabelado (Teste de Grubbs)

gl: Graus de liberdade

h: Hora

H0: Hipótese nula

H1: Hipótese alternativa

HBV: Vírus da hepatite B

HCl: Ácido clorídrico

HIV-1: Human Immunodeficiency Virus ou Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1

HIV-2: Human Immunodeficiency Vírus ou Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 2

H2O2: Peróxido de hidrogênio

HTLV-III: Human T-Lymphotrophic Virus ou Vírus T- Limfotrópico Humano tipo III

IC: Intervalo de confiança

ICH: International Conference on Harmonization ou Conferencia Internacional de Harmonização INCA: Instituto Nacional do Câncer

INCQS: Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

IP: Inibidor da protease

ITRN: Inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeo

ITRNN: Inibidor da transcriptase reversa não-análogo de nucleosídeo

IVB: Instituto Vital Brazil

k': Fator de capacidade

L(-): Configuração levorotatória

LAV: Lymphadenopathy Associated Virus ou Vírus Associado à Linfadenopatia

M: Concentração molar

µ: Micra

xi

mcg: Micrograma

min: Minuto

mL: Mililitro

µL: Microlitro

MQ: Média quadrática

MS: Ministério da Saúde

N: Número de pratos teóricos

N: Concentração normal

n: Número de replicatas

NaOH: Hidróxido de sódio

NDP-K: Nucleosídeo 5' difosfato quinase

ng: Nanograma

nm: Nanometro

OMS: Organização Mundial da Saúde

OPAS: Organização Pan-americana da Saúde

pH: Potencial de hidrogênio iônico

PI: Precisão intermediária

Poli γ: Polimerase gamma

r: Coeficiente de correlação

R: Resolução

% R - Porcentagem de recuperação

RE: Resolução (legislação)

RNA: Ácido ribonucleico

S2: Variância

SQ : Soma quadrática

SQR: Substância química de referencia

SUS: Sistema Único de Saúde

T: Fator de cauda ou assimetria

3TC: Lamivudina, (-)BCH-189

3TC-DP: Lamivudina-difosfato

3TC-MP: Lamivudina-monofosfato

xii

3TC-TP: Lamivudina-trifosfato

TR: Tempo de retenção

TRIPS: Trade-related Aspects of Intellectual Property Rights ou Aspectos dos direitos de

propriedade intelectual

USA: United States of America ou Estados Unidos da América

USP 24: The United States Pharmacopeia ou Farmacopeia Americana

UV/Vis: Ultravioleta / visível

v/v: Volume por volume

VISA: Vigilância Sanitária

X: Média

xiii

ESQUEMAS

Pág.

Esquema 1: Mecanismo de ativação da Lamivudina (KEWN, 1997)........................ 18

GRÁFICOS

Pág.

Gráfico 1: Evolução do número de casos de aids no Brasil de 1982 a 2000 segundo

dados do Boletim Epidemiológico..............................................................................

07

Gráfico 2: Evolução do número de óbitos por aids no Brasil de 1982 a 2000

segundo dados do Boletim Epidemiológico...............................................................

07

Gráfico 3: Evolução do número de casos de aids em mulheres no Brasil de 1982 a

2000 segundo dados do Boletim Epidemiológico......................................................

08

Gráfico 4: Evolução do número de óbitos de Mulheres por aids no Brasil de 1982

a 2000 segundo dados do Boletim Epidemiológico....................................................

08

xiv

FIGURAS

Pág.

Figura 1: Esquema simplificado do ciclo de vida do vírus. (The HIV Life Cycle,

2001)............................................................................................................................

5

Figura 2: Estrutura química da ddC e do BCH-189....................................................

16

Figura 3: Estrutura química da Lamivudina e do (+)BCH-189..................................

17

Figura 4: Exemplo de cromatograma do método de análise do teor de Lamivudina.

27

Figura 5: Espectro Ultravioleta da Lamivudina - Máximo de absorção a 270nm......

27

Figura 6: Exemplo de cromatograma do ensaio limite do (+)BCH-189....................

28

Figura 7: Amostra de Lamivudina, padrão secundário, submetida a estresse com

H2O2 3% por 24 h........................................................................................................

37

Figura 8: Amostra de Lamivudina, padrão secundário, submetida a estresse

com HCl 0,1 M por 24 h............................................................................................

37


NaOH 0,1 M por 24 h................................................................................................

38


temperatura de 1500C por 24 h....................................................................................

38

xv

Figura 11: Curva de calibração – Linearidade............................................................

42

Figura 12: Plotagem de resíduos..................................................................................

45

Figura 13: Plotagem de ajuste de linha........................................................................

45

Figura 14: Especificidade do método de ensaio limite do enantiômero

(+)BCH-189.................................................................................................................

60

Figura 15: Especificidade do método de ensaio limite do enantiômero (+)BCH-189

na concentração de trabalho.........................................................................................

61

Figura 16: Cromatograma do produto ( Princípio ativo + Excipientes)......................

61

Figura 17: Cromatograma da amostra de Lamivudina submetida ao estresse com

HCl 0,1 N por 24h......................................................................................................

62


H2O2 3% por 24h.........................................................................................................

62


NaOH 0,1 N por 24h...................................................................................................

63

Figura 20: Cromatograma da amostra de Lamivudina submetida ao estresse com a

temperatura de 150°C por 24 h....................................................................................

63

Figura 21: Cromatograma do limite de detecção conc. 1 = 862,4 ng/mL...................

64

Figura 22: Cromatograma do limite de detecção conc. 2 =86,2 ng/mL.....................

65

Figura 23: Cromatograma do limite de detecção conc. 3A = 17,2 ng/mL................. 65

xvi

Figura 24: Cromatograma do limite de detecção conc. 3 = 8,6 ng/mL......................

66

Figura 25: Conc.5 - 0,53% de (+)BCH-189 em relação ao pico da

Lamivudina, R = 3,99..................................................................................................

67


Lamivudina, R = 3,98..................................................................................................

67


Lamivudina, R = 4,24..................................................................................................

68

Figura 28: Conc.2 - 0,06 % de (+)BCH-189 em relação ao pico da

Lamivudina, R = 4,24..................................................................................................

68

Figura 29: Conc.1 - 0,03 % de (+)BCH-189 em relação ao pico da

Lamivudina, R= 4,22...................................................................................................

69

xvii

TABELAS

pág.

Tabela 1: Características requeridas para a validação pela USP..............................

20

Tabela 2: Características requeridas para a validação pelo ICH..............................

20

Tabela 3: Parâmetros e recomendações para o teste de verificação da

adequação do sistema..............................................................................................

35

Tabela 4: Resultados do teste de adequação do sistema para o método de análise

do teor de Lamivudina..............................................................................................

36

Tabela 5: Resultados do teste de adequação do sistema para o ensaio limite para

o (+)BCH-189.........................................................................................................

36

Tabela 6: Dados de concentração e área para o cálculo da Linearidade..................

39

Tabela 7: Repetitividade das injeções da Concentração 100%...............................

40

Tabela 8: Verificação da Homocedasticidade..........................................................

41

Tabela 9: Representação das médias da concentração real em cada nível de

concentração.............................................................................................................

41

Tabela 10: Confirmação da linearidade por ANOVA.............................................

43

Tabela 11: Dados para o cálculo do intervalo de confiança dos coeficientes da

reta............................................................................................................................

43

xviii

Tabela 12: Resultado dos resíduos...........................................................................

44

Tabela 13: Resultados da exatidão expressos em concentração...............................

46

Tabela 14: Resultados da Repetitividade .................................................................

48

Tabela 15: Precisão intermediária do laboratório A por analistas diferentes..........

49

Tabela 16: Resultados do teste de F entre os analistas 1 e 2 do laboratório A........

49

Tabela 17: Precisão intermediária do laboratório B por analistas diferentes...........

50

Tabela 18: Resultados do teste de F entre os analistas 2 e 1 do laboratório B.........

50

Tabela 19: Precisão intermediária do Laboratório C por analistas diferentes.........

51

Tabela 20: Resultados do teste de F entre os analistas 2 e 1 do laboratório C.........

51

Tabela 21: Precisão intermediária do laboratório A com equipamentos diferentes.

53

Tabela 22: Resultados do teste de F do laboratório A - equipamentos diferentes...

53

Tabela 23: Precisão intermediária do laboratório B com equipamentos diferentes.

54

Tabela 24: Resultados do teste de F do laboratório B - equipamentos diferentes...

54

Tabela 25: Precisão intermediária do laboratório C com equipamentos diferentes.

55

Tabela 26: Resultados do teste de F do laboratório C - equipamentos diferentes ..

55

Tabela 27: Precisão intermediária lab. A - analistas e equipamentos diferentes..... 56

xix

Tabela 28: Resultados do teste de F lab. A - analistas e equipamentos diferentes..

56

Tabela 29: Precisão intermediária lab. B - analistas e equipamentos diferentes.....

57

Tabela 30: Resultados do teste de F lab. B - analistas e equipamentos diferentes..

57

Tabela 31: Precisão intermediária lab. C - analistas e equipamentos diferentes.....

58

Tabela 32: Resultados do teste de F lab. C - analistas e equipamentos diferentes..

58

xx

SUMÁRIO

pág.

1. INTRODUÇÃO

1

1.1. Apresentação

1

1.2. Breve Histórico da Evolução da Legislação e dos Sistemas de Regulação Sanitária

1

1.3. Breve Histórico da aids no Brasil

4

1.4. Evolução da Política de Medicamentos Antiretrovirais do Ministério da Saúde

9

1.5. Fármacos Antiretrovirais

12

1.6. A Terapia Tríplice

13

2. HISTÓRICO DA LAMIVUDINA

15

2.1. Propriedades Físico-químicas

17

2.3. Mecanismo de Ação da Lamivudina

18

3. VALIDAÇÃO NO CONTROLE DA QUALIDADE

19

3.1. Linearidade

21

3.2. Exatidão

21

3.3. Especificidade

22

3.4. Limite de Detecção e Quantificação

22

3.5. Precisão 3.5.1. Repetitividade 3.5.2. Precisão Intermediária 3.5.3. Reprodutibilidade

22

23

23

23

xxi

3.6. Faixa

23

3.7. Teste de verificação da adequação do sistema (System Suitability Testing)

23

4. OBJETIVOS

25

4.1. Objetivo geral

25

4.2. Objetivos específicos

25

5. PARTE EXPERIMENTAL

26

5.1. Metodologia de Análise

26

5.1.1. Materiais e Reagentes

28

5.2. Ensaio do Teor de Lamivudina

29

5.2.1. Sistema Cromatográfico

29

5.2.2. Preparo da Solução Tampão de Acetato de Amônio 0,1 M

29

5.2.3. Preparo da Fase Móvel

29

5.2.4. Preparo da Solução Padrão

30

5.2.5. Preparo da Solução Amostra

30

5.3. Ensaio Limite para a Impureza Enantiomérica (+) BCH-189

30


30

5.3.2. Preparo da Solução de Acetato de Amônia 0,1M

31


31

5.3.4. Preparo da Solução para a Avaliação da Resolução

31

5.3.5. Preparo da Amostra

31

5.4. Metodologia para a Validação da Analise de Teor da Lamivudina.

32

5.4.1. Teste de Verificação da Adequação do Sistema (System Suitability Testing)

32

xxii

5.4.2. Especificidade

32

5.4.3. Linearidade

32

5.4.4. Exatidão

33

5.4.5. Precisão

33

5.5. Metodologia para a Validação do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH 189

33


33

5.5.2. Limite de Detecção

34

5.6. Metodologia para a Pesquisa Bibliográfica sobre a Toxicidade do (+)BCH-189

34

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

35

6.1. Resultado do Teste de Adequação do Sistema (System Suitability Testing)

35

6.2. Resultados da Especificidade para o Método de Análise do Teor

36

6.3. Resultados da Linearidade

39

6.4. Resultados da Exatidão

46

6.5. Resultados da Precisão

47

6.5.1. Resultados da Repetitividade

47

6.5.2. Resultados da Precisão Intermediária

48

6.6. Resultados da Faixa

59

6.7. Discussão da Validação do Método de Análise do Teor da Lamivudina Comprimidos

59

6.8. Resultados da Especificidade do Ensaio Limite para o Enantiômero (+)BCH 189

60

6.9. Resultados do Limite de Detecção para o Enantiômero (+)BCH 189

64

6.10. Discussão da Validação do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189

69

6.11. Resultado da Pesquisa Bibliográfica sobre a Toxicidade do (+)BCH-189

70

xxiii

7. CONCLUSÃO

71

8. BIBLIOGRAFIA

73

xxiv

1. INTRODUÇÃO

1.1. Apresentação

A Lamivudina (3TC) é uma droga quiral, com atividade antiretroviral, inibidora da

transcriptase reversa, que faz parte da terapia tríplice utilizada no tratamento da aids

(síndrome da imunodeficiência adquirida).

Dentre todos os antiretrovirais (ARV), análogos de nucleosídeos, aprovados pelo

Food and Drug Administration (FDA) para o uso na clínica, a Lamivudina é o único que

possui a configuração não natural β-L(-). Esta configuração parece ser a responsável pela

baixa toxicidade em cultura de células, quando comparada a do seu enantiômero β-D(+),

também conhecido como (+)BCH-189.

Este estudo apresenta um método de análise, validado, para o produto Lamivudina

comprimido, no que se refere ao ensaio de teor e ao ensaio limite para o seu enantiômero

(+)BCH-189. É importante salientar que, tendo em vista a necessidade de fornecer

medicamentos seguros e de qualidade é necessário dispor de metodologias de Controle da

Qualidade atualizadas e validadas de acordo com parâmetros fornecidos pelos órgãos

reguladores.

Na fase final desta dissertação foi publicada a RDC 150 de 17 de junho de 2003

que aprova o fascículo 4 da parte II, da 4ª edição da Farmacopéia Brasileira (FB), onde

encontra-se a monografia da Lamivudina comprimido (BRASIL, 2003b).

Realizando uma comparação entre a monografia proposta nesta dissertação e a

apresentada pela Farmacopéia Brasileira verificou-se que a segunda não preconiza nenhum

ensaio de pureza para o comprimido de Lamivudina. Este estudo ressalta a importância da

realização do ensaio limite para o (+)BCH-189 em comprimidos de Lamivudina, tendo em

vista que este enantiômero é citotóxico.

1.2. Breve Histórico da Evolução da Legislação e dos Sistemas de Regulação Sanitária

Para contextualizar a situação atual do Brasil frente a pandemia da aids, e enfatizar

a importância de dispor de metodologias de análise atualizadas e validadas para garantir a .

qualidade dos medicamentos fornecidos a população, será necessário uma retrospectiva de

alguns fatos que tiveram importância para a formação do quadro atual.

Historicamente fatos negativos tendem a impulsionar o desenvolvimento científico

e tecnológico no sentido de procurar soluções preventivas para evitar que estes tornem a

ocorrer. No caso dos medicamentos podemos destacar alguns acontecimentos trágicos. O

primeiro ocorreu nos anos 30 nos Estados Unidos da América (EUA) e ficou conhecido

como o caso da sulfanilamida, quando foi utilizado dietilenoglicol como excipiente na

preparação de xarope o que ocasionou mais de 100 mortes. Este fato levou a alterações na

legislação norte americana que passou a exigir estudos de segurança e eficácia para o

registro de medicamentos (COSTA, 2001). O segundo episódio foi a tragédia da

talidomida, nos anos 60 esta droga foi produzida e comercializada como uma mistura

racêmica. Infelizmente, tarde demais foi descoberto que o efeito farmacológico desejado,

sedativo e hipnótico, só é encontrado no enantiômero D(+), o enantiômero L(-) é

teratogênico, o que ocasionou um número expressivo de casos de focomegalia em muitos

países, exceto nos EUA onde a legislação já estava mais restritiva no que diz respeito ao

registro de medicamentos (GUIMARÃES, 2002).

Este fato promoveu, em diversos países, o desenvolvimento de novas leis, a

exemplo dos EUA, exigindo que a segurança e a eficácia dos medicamentos fosse

demonstrada por ensaios não clínicos e clínicos antes do registro, além de ter sido

determinante para o desenvolvimento de duas áreas muito importantes a estereoquímica,

mais especificamente o estudo dos fármacos quirais (BEESLEY, 1998) e a

farmacovigilância, que é o conjunto de métodos e técnicas que tem por objetivo a

identificação e a avaliação dos efeitos do uso, agudo ou crônico, do tratamento

farmacológico no conjunto da população ou em subgrupos de pacientes expostos a

tratamentos específicos (ROZENFELD apud TOGNONI, 1989 ; GUIMARÃES, 2002).

Em relação as drogas quirais, atualmente são realizados estudos de toxicidade dos

isômeros individualmente antes do registro pois os mesmos podem possuir ações

farmacológicas diferentes e até opostas (FDA, 1992).

Com isso ficou evidente a necessidade do acompanhamento dos eventos adversos

dos medicamentos após o registro para determinar a freqüência e os fatores de risco além

da detecção precoce de reações novas e graves. Os estudos realizados antes do registro

envolvem um número limitado de pacientes, aqueles com complicações ou em uso de

2

outras terapias são excluídos bem como os muito idosos ou muito jovens que não

participam. Portanto, certos efeitos menos comuns ou restritos a um certo grupo podem

não ser detectados, pois tais condições não correspondem ao cotidiano da terapia

farmacológica. A partir do momento que o medicamento é liberado para o uso e

consumido por um grande número de pacientes o gerenciamento da informação de seus

eventos adversos pode evidenciar efeitos até então desconhecidos (ROSENFELD, 1998).

No Brasil, além dos fatos citados anteriormente, outros eventos também geraram

reações importantes. Podemos citar a crise do sistema de saúde e o derrame de

medicamentos falsificados como fatos que impulsionaram a edição de muitas normas e a

mudança do sistema de regulação sanitária com a criação em 26 de janeiro de 1999, pela

Lei 9.782, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (COSTA, 2001). A

ANVISA, tem por finalidade institucional promover a proteção da saúde da população, por

intermédio do controle sanitário da produção e da comercialização de produtos e serviços

submetidos à vigilância sanitária, inclusive dos ambientes, dos processos, dos insumos e

das tecnologias a eles relacionados, bem como o controle dos portos, aeroportos e

fronteiras (BRASIL, 1999a).

O derrame de medicamentos falsificados também motivou a criação dos genéricos e

de toda a sua legislação especifica, que busca garantir a eficácia, a segurança e a qualidade

destes produtos através de estudos de equivalência farmacêutica, bioequivalência e

biodisponibilidade, realizados por instituições credenciadas e com metodologias analíticas

validadas (BRASIL, 1999b).

Para que a ANVISA cumpra sua atribuição de proteção da saúde da população

através da avaliação da qualidade dos medicamentos disponíveis no mercado é necessário,

entre outras providências, a atualização e validação das metodologias de análise dos

medicamentos.

Por último deve-se citar a pandemia da aids que vem demonstrando a fragilidade da

situação de acesso aos antiretrovirais. Entre as alternativas para viabilizar o acesso,

destaca-se a inadiável necessidade de fortalecer os laboratórios nacionais produtores de

insumos farmacêuticos. Os laboratórios farmacêuticos oficiais devem ser apoiados devido

ao seu papel estratégico em relação ao desenvolvimento tecnológico de processos de

produção de medicamentos de interesse em saúde pública bem como, ao seu papel como

regulador de mercado no que se refere a custos e principalmente ao seu papel social como

3

fornecedor de medicamentos essenciais para o Sistema Único de Saúde (SUS), que

possuam eficácia, segurança e qualidade (BERMUDEZ, 2002 ; SILVA, 2003).

1.3. Breve Histórico da aids no Brasil

A síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) é causada por um retrovírus com

genoma RNA, da família Lentiviridae. Pertencente ao grupo dos retrovírus citopáticos e

não-oncogênicos que necessitam, da enzima transcriptase reversa para sua multiplicação.

Os primeiros casos de aids foram descritos no ano de 1981, nos Estados Unidos da

América, e em 1982, no Brasil, a partir da identificação de homossexuais masculinos

adultos que apresentavam sarcoma de Kaposi, pneumonia por Pneumocystis carinii e

comprometimento do sistema imune. (MS, 2002a)

O Vírus da Imunodeficiência Humana tipo1 (HIV-1) foi isolado pelos

pesquisadores Luc Montaigner na França e Robert Gallo nos Estados Unidos da América

em 1983, recebendo respectivamente os nomes de Vírus Associado à Linfadenopatia

(LAV) e Vírus T- Linfotrópico Humano tipo III (HTLV-III). Em 1986 foi identificado um

segundo agente etiológico, denominado HIV-2. Em 1986 um comitê internacional

recomendou o termo HIV para denominá-los reconhecendo-os capazes de infectar seres

humanos (MS, 2002A).

O HIV age ligando-se aos receptores CD4 da célula hospedeira (Fig.1-item 1,

pág. 5) através dos quais consegue, fundindo o seu envelope com a parede celular,

introduzir o seu material genético, RNA, na célula hospedeira. O seu principal alvo são os

linfócitos T. O RNA viral sofre a ação da enzima transcriptase reversa e é convertido em

DNA, o filamento simples de DNA é duplicado pela ação da DNA polimerase (Fig.1-item

2, pág. 5). O DNA resultante entra no núcleo da célula e através da ação da enzima

integrase se incorpora ao genoma celular (Fig.1-item 3, pág. 5). Nesta fase é possível ao

HIV permanecer em estado latente por vários anos. A ativação da célula hospedeira resulta

na transcrição do DNA viral em RNA mensageiro (Fig.1-item 4, pág.5) o qual é traduzido

em proteína viral (Fig.1-item 5, pág. 5). O RNA viral produzido será o material genético da

nova geração de vírus (Fig.1-item 6, pág. 5) (THE HIV Life Cycle, 2001).

4

Figura 1 : Esquema simplificado do ciclo de vida do vírus (The HIV Life Cycle, 2001).

O perfil da aids no Brasil modificou-se com o tempo. No seu início, anos 80,

retratava um fenômeno restrito aos grandes centros urbanos, tendo como categorias de

exposição preponderantes os homossexuais masculinos, os hemofílicos e as demais

pessoas que receberam sangue ou hemoderivados. Em meados da década, já surgia outro

segmento que passou a ocupar lugar de destaque, os usuários de drogas injetáveis. No final

dos anos 90 a freqüência dos casos entre mulheres decorrente de transmissão heterossexual

cresceu substancialmente, assumindo um importante papel. Atualmente o perfil da

epidemia é de uma doença na qual há o predomínio da transmissão heterossexual, que não

está mais restrita a segmentos populacionais e vai se disseminando na população em geral

com predominância entre municípios pequenos e mais pobres (SZWARCWALD, 2000;

GUIMARÃES, 2000).

As tendências atuais da pandemia de aids no Brasil são a heterossexualização, a

feminização, a interiorização e a pauperização.

"A heterossexualização é, evidentemente, um reflexo do comportamento

sociossexual da população, que em sua grande maioria é heterossexual. Já a

5

feminização da aids parece envolver, além da maior vulnerabilidade

biológica da mulher ao HIV, uma desigualdade claramente observável na

distribuição de poder entre os gêneros. (...) Quanto ao processo de

pauperização, a escolaridade é uma das variáveis indiretas utilizadas para

mostrar o crescimento neste grupo de baixa renda. Até 1982, 100% dos

casos entre pessoas com escolaridade conhecida eram daquelas que tinham

nível superior ou até 11 anos de estudo. De lá para cá, a situação se

inverteu. Hoje, mais de 60% dos casos de aids são registrados entre

analfabetos ou pessoas com até 8 anos de estudo" (GRANGEIRO, 2002).

O crescimento do número de casos de aids, no Brasil, obrigou o governo a

desenvolver uma política de medicamentos que possibilitasse melhorar e prolongar a

qualidade de vida dos indivíduos infectados pelo HIV.

Os gráficos 2 e 4, páginas 7 e 8, mostram o impacto da introdução da terapia

antiretroviral para a diminuição dos óbitos devido a aids.

No item 1.4, Evolução da Política de Medicamentos Antiretrovirais do Ministério

da Saúde, os eventos relevantes relacionados com a epidemia de aids no Brasil são

enumerados cronologicamente.

6

Gráfico 1: Evolução do número de casos de aids no Brasil de 1982 a 2000 segundo dados do

Boletim Epidemiológico (GALVÃO, 2002)

05 0 0 0

1 0 0 0 01 5 0 0 02 0 0 0 02 5 0 0 0

n º d e c a s o s

1982

1985

1988

1991

1994

1997

2000

a n o

E vo lu ção d o n º d e caso s d e a id s n o B ras il d e 1982 a 2000 .

Gráfico 2: Evolução do número de óbitos por aids no Brasil de 1982 a 2000 segundo dados do

Boletim Epidemiológico (GALVÃO, 2002)

02000400060008000

1000012000

Nº de óbitos

1982

1984

1986

1988

1990

1992

1994

1996

1998

2000

anos

Número de Óbitos por aids no Brasil de 1982 a 2000

7

Gráfico 3: Evolução do número de casos de aids em mulheres no Brasil de 1982 a 2000

segundo dados do Boletim Epidemiológico (GALVÃO, 2002)

010002000300040005000600070008000

Nº de Casos19

82

1984

1986

1988

1990

1992

1994

1996

1998

2000

anos

Número de Casos de aids em Mulheres no Brasil de 1982 a 2000

Gráfico 4: Evolução do número de óbitos de Mulheres por aids no Brasil de 1982 a 2000

segundo dados do Boletim Epidemiológico (GALVÃO, 2002)

0500

10001500200025003000

Nº de óbitos

1982

1984

1986

1988

1990

1992

1994

1996

1998

2000

anos

Número de Óbitos de Mulheres por aids no Brasil de 1982 a 2000

8

1.4. Evolução da Política de Medicamentos Antiretrovirais do Ministério da Saúde

Como citado anteriormente os primeiros casos de aids no Brasil foram descritos

em 1982, neste mesmo ano foram relatados dez casos de aids e dez óbitos, todos em

indivíduos do sexo masculino. No ano seguinte já eram trinta e nove casos e trinta e oito

óbitos. Foram relatados ainda os dois primeiros casos em mulheres (GALVÃO, 2002).

Em 1984 o número de casos já chegava a cento e quarenta, o crescimento

acelerado levou o governo a tomar algumas medidas (GALVÃO, 2002).

A partir deste ano o Ministério da Saúde começou a obrigar os hospitais a

informar todos os casos de aids e a incidência de todas as condições associadas.

Em 1985, a portaria do Ministério da Saúde n° 236 de 02 de maio, estabelece

diretrizes para o programa da aids (BRASIL, 1985). Em 1986 a aids passa a ser uma

doença de notificação compulsória.

Em 1988 é criado o programa de aids no âmbito do Ministério da Saúde e devido a

elevada incidência, de infeções oportunistas, neste mesmo ano tem início a distribuição,

pelo sistema público de saúde, de medicamentos para tais infeções. Ainda neste ano a

Constituição estabelece a saúde como direito fundamental, destaca as atribuições da

Vigilância Sanitária como obrigação do estado e é criado o Sistema Único de Saúde (SUS).

Em 1990 são editadas as Leis 8.078 de 11 de setembro de 1990, código de defesa

do consumidor, que reforça a legislação de proteção e defesa da saúde, reafirmando a

responsabilidade do produtor pela qualidade do produto e do serviço e lhe impondo

atividades de informação ao consumidor (BRASIL, 1990a). Ainda é promulgada a Lei

8.080 de 19 de setembro de 1990, Lei orgânica da saúde, que destaca a abrangência das

ações de vigilância, ao incluir no SUS a vigilância de produtos, de serviços, dos

ambientes e dos processos de trabalho além de atribuir a vigilância o papel de coordenar

a rede nacional de laboratórios para a qualidade da saúde. No seu artigo 6° estabelece

como campo de atuação do SUS a formulação da política de medicamentos de interesse

para a saúde (BRASIL, 1990b).

Em 1991 o número de casos de aids registrados já ultrapassava dez mil. Tem

início então a distribuição da Zidovudina (AZT). Em 1993 o AZT começa a ser fabricado

no Brasil e a Didanosina (ddI) começa a ser distribuída (GALVÃO, 2002).

9

Em 14 de maio de 1996 é assinada a Lei 9.279 de propriedade industrial que

coloca a legislação brasileira em concordância com a “Trade-related aspects of

intellectual Property rights” (TRIPS) (BRASIL, 1996a). Em 13 de novembro do mesmo

ano é emitida a Lei 9.313, de acordo com a qual é da responsabilidade do Governo, a

disponibilização do tratamento mais adequado aos pacientes infectados pelo HIV, dentro

de parâmetros técnicos e científicos definidos pelo Ministério da Saúde, por intermédio

da Coordenação Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e aids (Coordenação

Nacional de DST e AIDS) (BRASIL, 1996b). Assim, neste ano tem início, na rede

pública de saúde, a implementação nacional da distribuição universal e gratuita dos ARV

(GALVÃO, 2002).

A política do Ministério da Saúde para a assistência aos indivíduos infectados

pelo HIV inclui, entre várias outras iniciativas, a disponibilização de modalidades de

assistência que visam à redução das internações hospitalares, além de estabelecer

recomendações técnicas consensuais para utilização de medicamentos antiretrovirais

além de um programa de acesso universal e gratuito aos mesmos. Estas iniciativas

determinaram um impacto semelhante ao verificado nos países desenvolvidos no que diz

respeito à redução das mortes causadas pela aids, da ocorrência de infeções oportunistas e

das internações hospitalares (MS, 2002b). Neste período são distribuídos além do AZT e

da ddI, a Lamivudina (3TC), o Saquinavir e o Ritonavir.

A partir do início da distribuição gratuita do "coquetel anti-aids", associação, de

três antiretrovirais, o número de óbitos começou a diminuir, como podemos observar nos

gráficos 2 e 4, páginas 7 e 8.

Em 1997 o Brasil começa a produzir a Zalcitabina (ddC) e a Estavudina (d4T) e

inicia-se a distribuição do Indinavir e da d4T.

Em 30 de outubro de 1998 é emitida a portaria 3.916 do Ministério da Saúde, que

aprova a Política Nacional de Medicamentos, visando "garantir a necessária segurança,

eficácia e qualidade destes produtos, a promoção do uso racional e o acesso da população

àqueles considerados essenciais". Estão destacados nas diretrizes desta política:

a) o incentivo ao desenvolvimento científico e tecnológico na área de

produção de fármacos;

b) o incentivo a produção nacional utilizando a capacidade instalada dos

laboratórios oficiais para atender as demandas do SUS;

10

c) destaca-se também o importante papel desenvolvido pelos laboratórios

oficiais no que tange ao domínio tecnológico de processos de produção de

medicamentos de interesse em saúde pública e como uma das instâncias

favorecedoras do monitoramento de preços no mercado (BRASIL, 1998).

Em 1998 os laboratórios oficiais iniciam a produção de ddI e o sistema público

inicia a distribuição de Nelfinavir, Nevirapina e da Delavirdina. Ainda neste ano a

IVB-Lamivudina é desenvolvida no Instituto Vital Brazil, por pesquisa interna sendo

posteriormente comparada às formulações de outros laboratórios. O seu registro no

Ministério da Saúde foi concedido em agosto de 1998.

Em 1999 a Lei 9.782 dispõe sobre o Sistema Nacional de Vigilância Sanitária e

cria a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 1999a).

A resolução 391 de 9 de agosto de 1999 detalha o procedimento para a implantação

dos medicamentos genéricos, uma prioridade da política de medicamentos do Ministério da

Saúde. O objetivo da Política de Genéricos visa o oferecimento de medicamentos

intercambiáveis com os de marca com qualidade, segurança e eficácia comprovadas

através de estudos de equivalência farmacêutica e bioequivalência. Os medicamentos

genéricos surgiram para facilitar o acesso da população aos medicamentos e funcionar

como reguladores de mercado (BRASIL, 1999b).

Também neste ano tem início a produção da 3TC pelo Instituto Vital Brazil e do

AZT + 3TC por outro laboratório nacional.

Em 6 de outubro o decreto presidencial n.º 3201 "dispõe sobre a concessão de

ofício de licença compulsória nos casos de emergência nacional e de interesse público de

que trata o artigo 71 da Lei n.º 972, de 14 de maio de 1996" (BRASIL, 1999c).

Em 2000 teve início a produção nacional de Indinavir e Nevirapina.

Em fevereiro de 2001 o governo ameaçou quebrar a patente dos medicamentos

Nelfinavir, fabricado pela Roche, e Efavirenz, fabricado pela Merck. Inicia-se, também, a

distribuição do Amprenavir pelo sistema público de saúde. Em agosto, o Ministério da

Saúde anunciou a licença compulsória da patente do medicamento Nelfinavir e em seguida

a Merck fez um acordo baixando o preço do Efavirenz para evitar o licenciamento

compulsório. A partir da produção nacional e da política de negociação de preços com os

laboratórios detentores das patentes, alguns antiretrovirais tiveram seus preços reduzidos

em mais de 80% entre 1996 e 2001 (GALVÃO, 2002).

11

"A produção de muitas drogas utilizadas no coquetel anti-aids permite ao

Brasil continuar o controle da disseminação da aids. A industria

farmacêutica vê isso como um ato de guerra. Nós vemos isso como um ato

de vida." (MS, 2003).

Também em 2001 a IVB-Lamivudina foi aprovada no ensaio de equivalência

farmacêutica, realizado pela Universidade Federal de Minas Gerais, e em 2002 foi

aprovada no teste de bioequivalência realizado no Instituto Nacional do Câncer (INCA).

Atualmente, o Brasil produz sete dos quinze antiretrovirais que fazem parte do

consenso de tratamento brasileiro. Assumindo-se que todos os antiretrovirais fossem

importados o programa de distribuição gratuita e universal se tornaria inviável devido ao

alto custo (MS, 2002c; MS, 2002d).

Tal fato evidencia a necessidade de fomento à industria nacional de insumos e aos

laboratórios farmacêuticos nacionais, em especial aos oficiais devido ao seu importante

papel como facilitadores da internalização por transferência de tecnologia, reguladores de

mercado, como referência de custos e qualidade.

1.5. Fármacos Antiretrovirais

O impacto social da pandemia da aids levou a um aumento das pesquisas a cerca

de fármacos que possam atuar inibindo ou bloqueando a replicação do HIV. Diante da

urgência da situação a aprovação por parte do FDA realizou-se através de um

procedimento abreviado (FDA, 2002b).

O desafio da industria farmacêutica é desenvolver fármacos que consigam

bloquear as atividades do vírus sem lesionar a célula hospedeira. Com o conhecimento do

ciclo de replicação do vírus foi possível determinar os prováveis alvos para a atuação

destes fármacos, a interferência em qualquer um dos passos deste ciclo impede a

multiplicação e/ou a liberação de novos vírus.

Existem duas classes principais de antiretrovirais aprovados para o uso, os

inibidores da transcriptase reversa e os inibidores da protease.

12

Os inibidores da transcriptase reversa são fármacos que inibem a replicação do

HIV bloqueando a ação da enzima transcriptase reversa que age convertendo o RNA viral

em DNA, eles dividem-se em análogos de nucleosídeos, que possuem similaridade

estrutural com os 2’-desoxinucleotideos naturais com os quais competem, e os não

análogos de nucleosídeos, que não requerem ativação prévia e atuam diretamente sobre a

transcriptase reversa (FLORES, 1997; SILVA, 1998).

A transcriptase reversa é um alvo importante para ação dos antiretrovirais pois é

uma enzima crucial para a replicação do vírus e não é conhecida nenhuma enzima similar

na célula hospedeira (GRAY, 1995).

Os inibidores da protease são drogas que agem impedindo a ação da enzima

protease que é fundamental para a clivagem das cadeias protéicas produzidas pela célula

infectada em proteínas virais estruturais e enzimas que formarão o novo HIV.

Existem outros fármacos, ainda em fase de estudos, que deverão agir nas demais

etapas do ciclo de reprodução do HIV.

O processo de desenvolvimento de novos fármacos antiretrovirais está em contínuo

desenvolvimento. A partir da descoberta de que a configuração não natural β-L(-) da

Lamivudina pode ser a responsável por sua baixa toxicidade em células hospedeiras não

infectadas, novas pesquisas vem sendo realizadas utilizando esta configuração como

modelo para o desenvolvimento de novos fármacos mais potentes e menos tóxicos.

1.6. A Terapia Tríplice

O principal objetivo da terapia antiretroviral é retardar a progressão da

imunodeficiência e/ou restaurar, tanto quanto possível, a imunidade, aumentando o tempo

e a qualidade de vida da pessoa infectada. Entretanto, a evolução natural da infeção pelo

HIV caracteriza-se por intensa e contínua replicação viral, que resulta, principalmente, na

destruição e/ou disfunção de células CD4 e de outras células do sistema imune levando à

imunodeficiência, que em sua forma mais grave manifesta-se por meio da ocorrência de

infeções oportunistas e neoplasias que caracterizam a Síndrome de Imunodeficiência

Adquirida. Dessa forma, a supressão da intensa e continuada replicação viral é

fundamental para que seja possível diminuir ou reverter o dano imunológico (MS, 2002b).

13

No Consenso sobre Terapia Antiretroviral em Adultos (MS, 1996), a Lamivudina

foi incluída como alternativa para a combinação com o AZT devido a sua baixa toxicidade.

No Consenso sobre Terapia Antiretroviral para Adultos e Adolescentes infectados pelo

HIV (MS, 1997), foi introduzida a terapia tríplice para pacientes que faziam uso da terapia

dupla e que apresentavam critérios de falha terapêutica. Já o consenso sobre a Infeção pelo

HIV em Adultos e Adolescentes (MS, 1999), indica que a terapia inicial deve ser

composta por dois inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN),

associado a um inibidor da transcriptase reversa não-análogo de nucleosídeo (ITRNN) ou a

um inibidor da protease (IP) em situações específicas.

Estudos demonstraram que com a utilização do "coquetel anti-aids", terapia

combinada de antiretrovirais, havia um aumento na atividade antiretroviral, com elevação

dos níveis de linfócitos T e redução nos títulos plasmáticos de RNA-HIV e redução da

replicação viral por potencializar o efeito terapêutico ou por sinergismo de ação em sítios

diferentes do ciclo de replicação viral. Além de evidenciar a redução da incidência de

cepas multirresistentes (MS, 2002a).

A terapia antiretroviral é uma área complexa, sujeita a constantes mudanças para

incorporar os novos conhecimentos gerados pelos ensaios clínicos, por isso as

recomendações preconizadas pelos consensos são revistas periodicamente.

A utilização do "coquetel anti-aids", vem mostrando resultados positivos em todos

os países nos quais os pacientes infectados pelo HIV têm tido acesso a esses

medicamentos. Estudos realizados por vários pesquisadores nos E.U.A, Europa e Brasil

têm demonstrado uma redução significativa nos óbitos secundários à aids e na ocorrência

de infeções oportunistas.

O impacto da terapia antiretroviral no Brasil de 1995 a 2001 pode ser resumido

com os seguintes dados: Redução da mortalidade de 40 a 70%, redução da morbidade de

60 a 80%, Redução de hospitalização 358.000 internações evitadas, economia de U$ 1,1

bilhão de dólares (GRANGEIRO, 2002).

14

2. HISTÓRICO DA LAMIVUDINA

A Lamivudina, também conhecida como 3TC ou (-)-BCH-189, e um nucleosídeo

análogo sintético; inibidor da transcriptase reversa, com atividade contra os vírus 1 e 2 da

imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) e o vírus da hepatite B (HBV) (SOUDEYNS,

1991; BENHAMOU, 1995; BLANEY, 1995).

Esta molécula foi desenvolvida pelo Dr. Bernard Belleau, em cooperação com os

pesquisadores da Universidade McGill (Montreal, Quebec, Canada) e da BiChem Pharma.

As pesquisas foram iniciadas em 1987 e visavam descobrir novos fármacos com ação na

transcriptase reversa. Uma análise da estereoquímica e de parâmetros eletrônicos levou a

conclusão de que a atividade e a especificidade dos nucleosídeos análogos como inibidores

da transcriptase reversa eram dependentes da forma do anel desoxiribose tanto quanto do

ambiente eletrônico na região do carbono 3’. Por esta razão, os pesquisadores planejaram e

sintetizaram nucleosídeos análogos com um anel pentose isostérico no qual o carbono 3’

foi substituído por um heteroátomo. O resultado desta modificação foi que o par de

elétrons disponível no heteroátomo participaria da formação de pontes de hidrogênio entre

átomos do centro catalítico da enzima, logo a ligação entre o nucleosídeo e a enzima seria

mais forte. Este tipo de modificação simularia o efeito do grupo hidroxila presente no

desoxinucleosideo natural na formação da cadeia (DIONNE, 1999).

Entre os novos compostos sintetizados o racêmico BCH-189 foi considerado

potente como inibidor da replicação do HIV “in vitro”, ele foi obtido pela substituição do

carbono 3' do anel ribose da 2',3'-didesoxicitidina (ddC) por um átomo de enxofre.

O BCH 189 possui dois centros quirais, localizados nos carbonos 1' e 4' do anel

oxatiolan, portanto possui quatro isômeros óticos sendo um par de diasteroisômeros (α e

β) com dois enantiômeros cada.

15

O BCH-189

dois foram conside

polimerase humana

portanto muito imp

(COATES, 1992; S

Em contrap

uma surpresa que

nucleosídeos biolo

possuíam a configu

A causa da

a inibição ou pert

adquirida pode ser

a) Inibição

b) Termino

mitocon

c) Alteraçã

d) A persi

ineficien

e) Alguma

Dados cient

análogos esta relac

3’

ddC BCH-189

Figura 2: Estrutura química da ddC e do BCH-189

é a mistura dos enantiômeros β-D(+) natural e o β-L(-) não natural, os

rados equipotentes contra o HIV, mais apenas o β-L(+) inibe a DNA-

, fato associado com a toxicidade dos fármacos nucleosídeos, sendo

ortante a realização do ensaio limite para determinar a sua presença.

CHINAZI, 1992; SOMMADOSSI, 1992; BLANEY, 1995)

artida a Lamivudina ou β-L(-) é livre desta toxicidade associada. Foi

o enantiômero β-L(-) apresentasse atividade biológica pois todos os

gicamente ativos anteriormente conhecidos como agentes terapêuticos

ração natural β-D(+).

toxicidade mitocondrial dos antiretrovirais análogos de nucleosídeos é

urbação da síntese de DNA mitocondrial. A toxicidade mitocondrial

causada por:

direta da DNA polimerase gamma (poli γ) sem incorporação.

da cadeia pela incorporação do nucleosídeo análogo no DNA

drial pela poli γ.

o da fidelidade da síntese de DNA pela poli γ.

stência do nucleosídeo análogo no DNA mitocondrial devido a

te remoção, ou

das combinações anteriores

íficos indicam que o aumento da toxicidade celular dos nucleosídeos

ionada com a facilidade da sua incorporação ao DNA mitocondrial pela

16

DNA polimerase humana e a dificuldade da sua remoção, a Lamivudina trifosfato

(3TC-TP) é um dos nucleosídeo análogo menos freqüentemente incorporados a DNA

polimerase humana e um dos mais eficientemente removidos. Estes dois fatos combinados

podem explicar a baixa toxicidade mitocondrial induzida pela Lamivudina in vivo. A baixa

incorporação da Lamivudina também pode ser atribuída a sua forma isomérica (-)

(HART,1992; JOHNSON, 2001; LIM, 2001).

A Lamivudina foi aprovada em 1995 pelo Food and Drug Administration para o

uso no tratamento da aids (FDA, 1995).

2.1. Propriedades Físico-químicas

A Lamivudina é um sólido cristalino branco ou quase branco com ponto de fusão

entre 160 e 162º C, solubilidade de aproximadamente 70 mg/mL em água a 20ºC. Seu

nome químico é (2R,cis)-4-amino-1-(2-hidroximetil-1,3-oxatiolan-5-il)-(1H)-pirimidin-2-

ona, também citada como (-)2',3'-didesoxi-3'-tiocitidina. Sua fórmula molecular é

C8H11N3O3S, seu peso molecular é 229,26 (THE MERCK INDEX, 1996).

As estruturas químicas da Lamivudina e do seu enantiômero (+)BCH-189 são

mostradas na figura 3, pág. 17.

É importante lembrar que o (+)BCH-189 apesar de também possuir atividade

inibitória contra o HIV-1 e HIV-2 é significativamente mais citotóxico em linfócitos não

infectados ( COATES,1992; BLANEY, 1995).

' 4'

Figura 3: Estrutura

Lamivudina

química da Lam

1

(+) BCH-189

ivudina e do (+)BCH-189

17

2.2. Mecanismo de Ação da Lamivudina

Os nucleosídeos análogos inibidores da transcriptase reversa são drogas que

compõe uma classe de antiretrovirais, na qual se inclui a Lamivudina, que necessitam ser

fosforilados intracelularmente mediante a ação das enzimas celulares que atuam nos

nucleotídeos naturais, dando origem a forma ativa 5' trifosfato que possui similaridade

estrutural com os 2' desoxinucleotídeos naturais com os quais compete.

No caso da Lamivudina, após a fosforilação a forma lamivudina-trifosfato

(3TC-TP) atua tanto como inibidora competitiva da transcriptase reversa, competindo com

os nucleotídeos naturais para se unir a transcriptase reversa, quanto como finalizador da

cadeia ao se incorporar ao DNA pró-viral, já que não possui o grupo hidroxila na posição

3' para formar ponte diester e assim prolongar a cadeia (FLORES, 1997).

3TC 3TC-MP 3TC-DP 3TC-TP Inibição competitiva da dCK-2' CMP/dCMP-K NDP-K transcriptase reversa e incorporação induzindo ao termino da cadeia. dCK-2'- desoxicitidina quinase

CMP/dCMP-K - citidilato/2' desoxicitidilato quinase

NDP-K - nucleosídeo 5' difosfato quinase

Esquema 1: Mecanismo de ativação da Lamivudina (KEWN, 1997)

18

3. VALIDAÇÃO NO CONTROLE DA QUALIDADE

Como citado anteriormente, um dos objetivos da Política Nacional de

Medicamentos do Ministério da Saúde é assegurar o acesso da população a medicamentos

seguros, eficazes e de qualidade, fundamentando-se no cumprimento da regulamentação

sanitária e nas boas práticas de fabricação e controle. A validação de métodos analíticos,

parte integrante das boas práticas de laboratório surge como uma peça chave para

assegurar a confiabilidade dos resultados obtidos e assim garantir a qualidade aos produtos.

No Brasil só foi dado à validação a devida importância a partir da edição, pela

Agência Nacional de Vigilância Sanitária, da resolução 391 de 9 de agosto de 1999. Esta

resolução normatiza, disciplina e regulamenta critérios para registro de medicamentos

genéricos no Ministério da Saúde, qualificando a validação de métodos analíticos como um

dos pré-requisito para o registro (BRASIL, 1999b). Desde então foram emitidas e

revogadas varias legislações sempre com o intuito de complementar e aprofundar as

legislações anteriores. A legislação atualmente em vigor no Brasil é a resolução -

RE n° 899, de 29 de maio de 2003, segundo a qual a validação deve garantir, por meio de

estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,

assegurando a confiabilidade dos resultados (BRASIL, 2003a).

Como este estudo foi iniciado antes da emissão desta resolução ele baseou-se nos

parâmetros de validação especificados na Farmacopéia Americana (USP 24, 2000) e na

Comissão Internacional de Harmonização (ICH, 1994; ICH, 1996) apresentados nas

tabelas 1 e 2 pág. 20.

19

Tabela 1: Características requeridas para a validação pela USP

Parâmetros analíticos de

performance

Dosagem

categoria I

Dosagem categoria II

Quantitativa Ensaio limite

Dosagem

categoria III

Dosagem

categoria IV

Exatidão Sim Sim * * Não

Precisão Sim Sim Não Sim Não

Especificidade Sim Sim Sim * Sim

Limite de detecção Não Não Sim * Sim

Limite de quantificação Não Sim Não * Não

Linearidade Sim Sim Não * Não

Faixa Sim Sim * * Não

* Pode ser requerido dependendo da natureza do teste especificado.

Categoria I - Quantificação do maior componente ou do ingrediente ativo.

Categoria II - Determinação de impurezas ou produtos de degradação.

Categoria III - Determinação de características de performance (dissolução etc.).

Categoria IV - Teste de identificação.

Tabela 2: Características requeridas para a validação pelo ICH

Características analíticos de

performance

Identificação Teste de Impureza

Quantitativa Ensaio limite

Dosagem

Exatidão Não Sim Não Sim

Precisão

Repetitividade Não Sim Não Sim

Precisão intermediária Não Sim Não Sim

Especificidade Sim Sim Sim Sim

Limite de detecção Não Não Sim Não

Limite de quantificação Não Sim Não Não

Linearidade Não Sim Não Sim

Faixa Não Sim Não Sim

20

De acordo com as tabelas 1 e 2, diferentes métodos de análise requerem diferentes

esquemas de validação, e estão divididos em quatro categorias. No presente trabalho

utilizamos as categorias I e II que se referem a métodos analíticos para quantificação do

maior componente da substância ou ingrediente ativo em produtos farmacêuticos acabados

e a métodos analíticos para determinação de impurezas da substância ou compostos de

degradação em produtos farmacêuticos acabados; respectivamente.

Na categoria I é recomendada a avaliação dos seguintes parâmetros: especificidade,

linearidade, exatidão, precisão, e faixa (range).

Na categoria II (ensaio limite) os parâmetros recomendados são os seguintes:

especificidade e limite de detecção.

3.1. Linearidade

A linearidade de um método analítico é a capacidade de obter resultados

diretamente proporcionais a concentração da substância de interesse, dentro de uma faixa

definida. Para determinação da linearidade é recomendado o uso de no mínimo 5

concentrações abrangendo a faixa especificada. No caso da determinação quantitativa do

maior componente ou substância ativa estas concentrações devem ter o alcance mínimo de

80 a 120% da concentração teórica do teste (ICH, 1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

3.2. Exatidão

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos

experimentalmente, em relação ao valor verdadeiro ou de referência. É medido como a

porcentagem de substância recuperada na análise, ao se contaminar a matriz, mistura dos

excipientes da formulação, com diferentes quantidades conhecidas da substância em

estudo, em níveis acima e abaixo do valor normal esperado na amostra.

A International Conference on Harmonization (ICH) recomenda que sejam

efetuadas pelo menos 9 determinações com no mínimo três concentrações, em triplicata,

cobrindo a faixa especificada.

A exatidão de um método analítico é normalmente expressa como a media das

porcentagem de recuperação (ICH, 1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

21

3.3. Especificidade

A especificidade de um método analítico é a habilidade de determinar com exatidão

e especificamente a substância de interesse na presença de outros componentes tais como:

impurezas, produtos de degradação e excipientes.

A especificidade de um método analítico para determinação de impurezas (ensaio

limite) é avaliada contaminando a matéria-prima ou produto com quantidades apropriadas

de impureza e demonstrando que estas impurezas podem ser isoladas dos demais

componentes (ICH, 1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

A especificidade de um método analítico para determinação quantitativa do maior

componente da substância ou ingrediente ativo é avaliada demonstrando que os resultados

da análise não são afetados pela presença de impurezas e/ou produtos de degradação.

Para métodos cromatográficos a especificidade é demonstrada através do próprio

cromatograma que deve apresentar resolução maior ou igual a dois entre os sinais da

substância ativa e o da impureza (SHABIR, 2003).

3.4. Limite de Detecção e Quantificação

O limite de detecção de um método analítico é a menor quantidade da substância de

interesse na amostra que pode ser detectada mas não necessariamente quantificada como

um valor exato.

O limite de quantificação de um método analítico é a menor quantidade da

substância de interesse que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis (ICH,

1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

3.5. Precisão

A precisão de um método analítico é o grau de concordância de uma série de

resultados obtidos de múltiplas análises, de uma mesma amostra homogênea.

Para a análise deste parâmetro devemos levar em consideração a repetitividade, a

precisão intermediária e a reprodutibilidade, sendo que este último item só é necessário

quando o método for submetido a avaliação com vistas a inclusão na Farmacopéia (ICH,

1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

22

3.5.1 - Repetitividade (precisão entre ensaios) refere-se ao uso do procedimento analítico

em um laboratório durante um curto período de tempo usando o mesmo analista e o mesmo

equipamento, isto é, nas mesmas condições.

O ICH recomenda que sejam efetuadas no pelo menos 9 determinações com no

mínimo três concentrações, em triplicata, cobrindo a faixa especificada ou 6

determinações a 100% da concentração do teste (ICH, 1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

3.5.2 - Precisão intermediária refere-se a variações dentro do mesmo laboratório tais

como: Método executado em dias diferentes, por analistas diferentes, com equipamentos

diferentes (ICH, 1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

3.5.3 - Reprodutibilidade (ensaio interlaboratorial) refere-se ao uso do procedimento

analítico em diferentes laboratórios (ICH, 1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

A precisão de um método analítico é normalmente expressa como a estimativa do

desvio padrão ou o desvio padrão relativo (coeficiente de variação) de uma série de

medidas e deve incluir os estudos da media, do desvio padrão, desvio padrão relativo e

intervalo de confiança.

3.6. Faixa

A faixa de um método analítico é o intervalo entre as concentrações inferior e

superior da substância de interesse na amostra para o qual o método tem um adequado

nível de precisão, exatidão e linearidade (ICH, 1994; ICH, 1996; USP 24, 2000).

3.7. Teste de Verificação da Adequação do Sistema (System Suitability Testing)

O teste de verificação da adequação do sistema pode ser descrito como um sistema

de avaliação do equipamento, partes eletrônicas, operações analíticas e amostras a serem

analisadas como um todo. Em cromatografia líquida de alta eficiência pode ser verificada

através do desvio padrão relativo das áreas obtidas por varias injeções do padrão,

23

calculando a reprodutibilidade das injeções calcula-se também resolução, fator de

capacidade, eficiência da coluna e fator de cauda.

24

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo Geral

Este projeto tem por objetivo propor uma metodologia padrão para a validação do

método analítico de controle da qualidade do produto Lamivudina comprimido, com

enfoque na dosagem do principio ativo Lamivudina (-)2',3'-didesoxi-3'-tiocitidina e no

ensaio limite do enantiômero (+)BCH-189 comprovadamente mais citotóxico em

linfócitos não infectados, que a forma L(-).

4.2. Objetivos Específicos

a) Propor e validar a metodologia para análise do teor do comprimido de Lamivudina

segundo os parâmetros do International Conference on Harmonization (ICH) e da

Farmacopéia Americana (USP 24).

b) Propor e validar a metodologia para ensaio limite para o enantiômero (+) BCH-189

segundo os parâmetros do ICH e da USP 24.

c) Efetuar pesquisa bibliográfica sobre a ação farmacológica e a toxicidade do

enantiômero (+)BCH-189.

25

5. PARTE EXPERIMENTAL

5.1. Metodologia de Análise

O método utilizado foi a análise por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) com detecção por ultravioleta tanto para a quantificação do maior componente,

Lamivudina, quanto para o ensaio limite do enantiômero (+)BCH-189.

A metodologia para análise do teor do produto IVB-Lamivudina foi previamente

avaliada através de um estudo preliminar realizado em 2000, usando como referência a

resolução n° 391 de 9 agosto de 1999.

Para este estudo foram selecionadas varias metodologias de análise, fornecidas

pelos fabricantes da matéria-prima, por laboratórios oficiais e retiradas de artigos

científicos, estas foram testadas e escolhida a metodologia que apresentou os melhores

resultados nos parâmetros de adequação do sistema, este método foi validado através da

verificação dos seguintes parâmetros: linearidade, especificidade, precisão (repetitividade)

e exatidão.

Posteriormente verificou-se a necessidade de complementar este estudo de acordo

com os requisitos do ICH e da USP 24 além de realizar a validação do ensaio limite para o

enantiômero (+)BCH-189.

Na otimização do método de análise do teor de Lamivudina foram avaliados alguns

parâmetros de robustez tais como: variação de pH, proporção da fase móvel, fluxo, lotes

das colunas e concentração da amostra, sendo escolhido o método que apresentou os

melhores resultados nos parâmetros de adequação do sistema.

O cromatograma obtido está representado na figura 4, pág. 27, e , apresentou os

seguintes resultados T = 1,48 ; N = 2286 e k’ = 657.

Foi efetuada a confirmação do comprimento de onda máximo de absorção

utilizando espectrofotometria UV/Vis, com detector de arranjo de fotodiodos (DAD).

O espectro obtido esta representado na figura 5, pág. 27. Nesta fase também foram

avaliadas a estabilidade da solução padrão e do eluente considerando-se estáveis por 24 h e

sete dias respectivamente.

26

2.71

3.12

6.58

, LA

MIVU

DINA

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Retention Time (min)

0

200

400

600

800

Intensity (mV)

Figura 4: Exemplo de cromatograma do método de análise do teor de Lamivudina.

Figura 5: Espectro Ultravioleta da Lamivudina - Máximo de absorção a 270nm.

27

A metodologia de análise desenvolvida para o ensaio limite do enantiômero

(+)BCH-189, fig.6 pág.28, foi selecionada testando metodologias de análise, fornecidas

pelos fabricantes da matéria-prima e por laboratórios oficiais, considerando a metodologia

que apresentou os melhores resultados nos parâmetros de adequação do sistema, onde a

Lamivudina apresentou N = 4385 ; T = 1,82 ; k’= 804 e o (+)BCH-189 apresentou

N = 5697 ; T = 1,05 ; k’ = 1031 e a resolução entre os picos (R) foi igual a 4,39.

8.05

, La

mivu

dina

10.3

2, (

+) B

CH 1

89

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 6: Exemplo de cromatograma do ensaio limite do (+)BCH-189

Após a definição das condições analíticas os métodos foram submetidos a

validação.

5.1.1. Materiais e Reagentes

A substância química de referência (Lamivudina) utilizada no estudo preliminar

pertence ao lote 981010, Teor – 100,0%, sintetizada na Universidade da Geórgia - USA.

No estudo complementar a substância química de referência utilizada foi a

Lamivudina - controle L1, Teor – 100,2%, fornecida pelo INCQS e com ela foi

padronizada uma matéria-prima que foi utilizada como padrão secundário nas análises.

A mistura racêmica utilizada foi fornecida pelo laboratório Cristália, constituída,

segundo o fabricante, por 51% de Lamivudina e 49% de (+)BCH-189.

28

Os comprimidos de Lamivudina utilizados para a avaliação da precisão foram

fabricados por laboratórios oficiais.

Todos os reagentes utilizados eram de grau pró análise ou cromatográfico e todos

os equipamentos estavam devidamente qualificados e/ou calibrados.

A balança analítica utilizada foi da marca Sartórius e possui quatro casas decimais.

Para a execução das analises foram utilizados dois Sistema LaChrom (Merck-

Hitachi) para cromatografia líquida de alta eficiência, cada um composto por uma bomba

modelo L-7100, um detector UV modelo L-7400 e um injetor Rheodyne manual modelo

L-7725i, acoplados a um computador Pentium.

Para obter o espectro da Lamivudina foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta

eficiência da marca Shimadzu série LC-10 A, equipado com detector de arranjo de

fotodiodo.

5.2. Ensaio do Teor de Lamivudina


A cromatografia foi executada nas seguintes condições: coluna fase reversa

C-18 (5µm), 250 x 4mm, temperatura ambiente, fluxo de 1,0 mL/min detecção no

comprimento de onda de 270 nm, o volume de injeção foi de 20,0 µL, utilizando como fase

móvel a mistura da solução de acetato de amônio 0,1 M e metanol na proporção de 85:15

v/v, com pH ajustado a 5,0 com ácido acético glacial PA.

5.2.2. Preparo da Solução Tampão de Acetato de Amônio 0,1 M

A solução tampão foi preparada, pesando 7,67 g de acetato de amônio transferindo

para balão volumétrico de 1000,0 mL acrescentando 500 mL de água purificada,

adicionando 1,0 mL de ácido acético glacial, levando ao ultra-som por 15 minutos e

completando o volume.


A fase móvel foi preparada misturando 850 mL do tampão de acetato de amônio

0,1 M com 150 mL de metanol grau CLAE , corrigindo o pH para 5,0 com ácido acético

29

glacial, filtrando por membrana 0,45 µ e desaerando por 15 minutos, utilizando o ultra-

som.

5.2.4. Preparo da Solução Padrão

O padrão foi preparado pesando cuidadosamente cerca de 20,0 mg de Lamivudina

padrão secundário, transferindo para balão volumétrico de 50,0 mL, adicionando 25 mL da

fase móvel e colocando no banho de ultra-som por aproximadamente 15 minutos. Após

esfriar, completando o volume com a fase móvel, homogeneizando e filtrando através de

membrana 0,45 µ.

5.2.5. Preparo da Solução Amostra

Inicialmente foi determinado o peso médio de no mínimo 20 comprimidos que em

seguida foram triturados.

A solução da amostra foi preparada pesando o equivalente a 20,0 mg de

Lamivudina e transferindo para balão volumétrico de 50,0 mL, dissolvendo com 25 mL de

fase móvel e colocando no banho de ultra-som por aproximadamente 15 minutos, após


membrana 0,45 µ. Foram preparadas triplicatas da amostra.

O procedimento seguinte foi a injeção no cromatógrafo, de 20,0 µL de cada solução

(padrão e amostra) sendo efetuadas no mínimo 3 injeções de padrão.

O cálculo de teor do comprimido foi executado a partir da comparação das médias

das áreas dos cromatogramas dos padrões com as áreas dos cromatogramas das amostras.

5.3. Ensaio Limite para a Impureza Enantiomérica (+) BCH-189


A cromatografia foi executada nas seguintes condições: coluna quiral (fase

estacionária β ciclodextrina) - 5µm, 250 x 4,6mm., a temperatura ambiente, fluxo de

1,0 mL/min, detecção no comprimento de onda de 270 nm, o volume de injeção foi de 20,0

µL, utilizando como fase móvel a mistura da solução de acetato de amônio 0,1 M e

metanol na proporção de 91:9 v/v.

30

5.3.2. Preparo da Solução de Acetato de Amônio 0,1M

A solução de acetato de amônio 0,1 M foi preparada, pesando 7,67 g de acetato de

amônio transferindo para balão volumétrico de 1000,0 mL, acrescentando 500 mL de água

purificada, levando ao ultra-som por 15 minutos e completando o volume.


A fase móvel foi preparada misturando 910 mL da solução de acetato de amônio

0,1 M com 90 mL de Metanol grau CLAE, filtrando por membrana 0,45µ e desaerando por

15 minutos, utilizando o ultra-som.

5.3.4. Preparo da Solução para a Avaliação da Resolução

Foi preparada uma solução da mistura racêmica de (+)BCH-189 e Lamivudina em

fase móvel, onde a concentração dos enantiômeros era cerca de 75,0 mcg/mL Procedeu-se

a injeção no cromatógrafo de 20 µL desta solução e verificou-se que a resolução entre a

Lamivudina e o (+)BCH-189 foi maior que 1,5.

5.3.5. Preparo da Amostra

Inicialmente foi determinado o peso médio de no mínimo 20 comprimidos que em

seguida foram triturados.

A solução da amostra foi preparada pesando o equivalente a 25,0 mg de

Lamivudina e transferindo para balão volumétrico de 100,0mL, dissolvendo com 50 mL de

fase móvel e colocando no banho de ultra-som por aproximadamente 15 minutos. Após


membrana 0,45 µ. Foram preparadas triplicatas da amostra.

O procedimento seguinte foi a injeção no cromatógrafo, 20 µL da solução amostra.

O cálculo do ensaio limite de (+)BCH-189 no comprimido foi executado

relacionando a área do picos de (+)BCH-189 com a área do pico de Lamivudina no

cromatograma da amostra.

31

Segundo a Pharmacopeia Forum o limite máximo permitido de (+)BCH-189 na

matéria-prima Lamivudina é de 0,3% em relação ao pico principal, portanto este mesma

especificação foi utilizada para o ensaio limite de (+)BCH-189 no comprimido de

Lamivudina, já que não há especificação de limite de (+)BCH-189 neste produto em

nenhum compêndio oficial (PHARMACOPEIAL Forum, 2001).

5.4. Metodologia para a Validação da Análise de Teor da Lamivudina

Foram avaliados o teste de verificação da adequação do sistema e os seguintes

parâmetros: especificidade, linearidade, exatidão, precisão e faixa.

5.4.1.Teste de Verificação da Adequação do Sistema (System Suitability Testing)

O teste de verificação da adequação do sistema foi executado para assegurar a

performance do sistema de cromatografia líquida de alta eficiência antes e durante a

realização das análises provendo assim dados de qualidade aceitável.

O teste é baseado no conceito de que o equipamento, partes eletrônicas, operações

analíticas e amostras constituem um sistema integral que pode ser avaliado como um todo.

O teste de verificação da adequação do sistema foi executado avaliando os

seguintes parâmetros: número de pratos teóricos, fator de cauda e repetitividade das

injeções. O parâmetro repetitividade das injeções foi avaliado na concentração 100% do

valor rotulado através do cálculo do desvio padrão relativo da área de seis injeções de

padrão.


Para a determinação da especificidade do método amostras de Lamivudina padrão

secundário, foram submetidas a condições de estresse tais como: exposição a solução de

HCl 0,1 N por 24 h, a solução de NaOH 0,1 N por 24 h, a solução de H2O2 3% por 24 h e

a temperatura de 150° C por 24 h. Foi analisada também uma solução com todos os

excipientes.

Os cromatogramas foram avaliados quanto a interferência dos produtos de

degradação e dos excipientes, utilizando os mesmos parâmetros de comprimento de onda,

fluxo, temperatura e fase móvel especificados para a Lamivudina.

5.4.3. Linearidade

Para a verificação da linearidade, foi preparada uma solução mãe de Lamivudina

padrão secundário e a partir desta, diluições a fim de obtermos soluções em cinco níveis

32

de concentração, como recomendado em literatura. As concentrações utilizadas no estudo

foram 50 %, 75 %, 100 %, 125 % e 150 %, do valor rotulado.

A análise foi conduzida com triplicata de injeção em cada nível de concentração.

5.4.4. Exatidão

A Exatidão foi avaliada, efetuando-se nove determinações em triplicata de injeção

em cada nível de concentração, 75%, 100% e 125% do valor rotulado de Lamivudina.

Foi preparada uma matriz, mistura dos excipientes da formulação, e calculada a quantidade

a ser adicionada ao principio ativo para se obter comprimidos de peso médio constante nas

concentração preestabelecidas.

A analise foi realizada pelo mesmo analista no mesmo dia.

5.4.5. Precisão

A precisão foi verificada nos níveis repetitividade e precisão intermediária

efetuando 6 (seis) determinações com duplicata de injeção a 100% do valor rotulado,

através da analise de 3 (três) amostras produzidas por diferentes laboratórios.

No nível repetitividade as seis análises, de cada uma das amostras, foram analisadas

no mesmo dia e pelo mesmo analista, com duplicata de injeção.

Para o parâmetro precisão intermediária foram executados três tipos de

comparação. No primeiro, as mesmas três amostras de laboratórios diferentes foram

analisadas da mesma forma descrita acima por dois analistas diferentes. Além disso elas

também foram analisadas pelo mesmo analista utilizando dois equipamentos diferentes e

finalmente a terceira comparação foi realizada entre analistas diferentes com equipamentos

diferentes, esta última comparação pode ser usada para sugerir a resistência do método.

5.5. Metodologia para a Validação do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189

Além dos parâmetros teste de adequação do sistema e da especificidade, descritos

anteriormente também foi determinado o limite de detecção.


Para a determinação da especificidade do ensaio limite do enantiômero

(+)BCH-189 foram utilizadas as mesmas amostras que para a especificidade do método de

análise do teor, item 5.4.2, pág. 32.

33

5.5.2. Limite de Detecção

O limite de detecção foi avaliado experimentalmente analisando-se soluções com

baixas concentrações de (+)BCH-189 e determinando a concentração mínima em que este

pode ser detectado.

Com a mistura racêmica fornecida pelo laboratório Cristália foi preparada uma

solução mãe e a partir desta foram preparadas soluções de concentrações decrescentes.

Como a especificação do limite de (+)BCH-189, é dada em relação a concentração

de Lamivudina, foi avaliada a detecção de (+)BCH-189 em presença de Lamivudina, na

concentração de 250 mcg/ml, que é a concentração do ensaio. Nestas condições foi

avaliada também a resolução entre os picos (Pharmacopeial Forum, 2001).

5.6. Metodologia para a Pesquisa Bibliográfica sobre a Toxicidade do (+)BCH-189

A pesquisa bibliográfica sobre a farmacologia e a toxicidade do enantiômero

(+)BCH-189 foi realizada nos bancos de dados medline e science direct. A análise dos

artigos buscava informações sobre a farmacologia; estudos experimentais do tipo "in vivo"

"in vitro"; toxicidade de antiretrovirais em células do hospedeiro; mecanismo molecular

de inibição e toxicidade dos nucleosídeos análogos; toxicidade mitocondrial;

citotoxicidade e estudos comparativos da toxicidade das drogas antiretrovirais, mais

especificamente do (+)BCH-189. Foram utilizadas as seguintes palavras chave na

pesquisa: (+) 3TC toxicity; (+)BCH-189; toxicity; mitochondrial toxicity; cytotoxicity.

34

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise estatística dos dados foi realizada usando o software Excel.

6.1. Resultados do Teste de Adequação do Sistema (System Suitability Testing)

O teste de adequação do sistema foi realizado antes de todas as corridas

cromatográficas e todos os resultados obtidos para os critérios: número de pratos teóricos,

assimetria, fator de capacidade e resolução; foram considerados satisfatórios segundo as

especificações apresentadas na tabela 3, pág.35.

Tabela 3: Parâmetros e recomendações para o teste de verificação da adequação do

sistema (SHABIR, 2003)

Parâmetros Recomendações

Fator de capacidade ( k') O pico deve estar bem resolvido de outros

picos e do volume morto k' > 2,0.

Repetitividade É desejável um DPR ≤ 1% para N ≥ 5

Tempo de retenção relativo Não é essencial se a resolução é declarada

Resolução ( R ) R > 2 entre o pico de interesse e o potencial

interferente que elui mais próximo

Fator de cauda ( T ) T ≤ 2

Número de pratos teóricos ( N ) Em geral deve ser > 2000

Os resultados do teste de adequação do sistema para o método de análise do teor de

Lamivudina, tabela 4 pág.36 referem-se ao cromatograma apresentado na fig. 4 pág. 27.

35

Tabela 4: Resultados do teste de adequação do sistema para o método de análise do teor de

Lamivudina

Nome TR k’ T N

Lamivudina 6,58 657 1,48 2286

Os resultados do teste de adequação do sistema para o ensaio limite para o

(+)BCH-189, tabela 5 pág.36 referem-se ao cromatograma apresentado na fig. 6 pág. 28.

Tabela 5: Resultados do teste de adequação do sistema para o ensaio limite para o

(+)BCH-189

Nome TR k’ T N R

Lamivudina 8,05 804 1,82 4385 -

(+)BCH-189 10,32 1031 1,05 5697 4,39

6.2. Resultados da Especificidade para o Método de Análise do Teor

Os cromatogramas obtidos com as amostras submetidas a condições de estresse e com a

solução contendo os excipientes, item 5.4.2 pág. 32, foram avaliados e verificado que

nenhum dos componentes, sejam eles produtos de degradação, impurezas ou excipientes,

possui o mesmo tempo de retenção da Lamivudina. Portanto os resultados obtidos não são

afetados pela presença destas substâncias.

A amostra de Lamivudina na concentração de trabalho, isto é 20,0 mg para 50,0 mL

(400mcg/mL), estressada com H2O2 3% por 24 h não sofre interferência dos produtos de

degradação, como observa-se na figura 7 pág. 37.

36

2.13

2.61

3.24

6.98

, LA

MIVU

DINA

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9


0

200

400

600

800

1000

1200Intensity (mV)

Figura 7: Amostra de Lamivudina, padrão secundário, submetida a estresse com H2O2 3%

por 24 h.

Verifica-se na figura 8 pág. 37 que a amostra de Lamivudina na concentração de

trabalho, estressada com HCl 0,1M por 24 h, não sofreu interferência dos produtos de

degradação.

2.09

2.82

3.20

7.00

, LA

MIVU

DINA

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9


0

200

400

600

800

Intensity (mV)

Figura 8: Amostra de Lamivudina, padrão secundário, submetida a estresse com HCl

0,1 M por 24 h.

A amostra de Lamivudina na concentração de trabalho, estressada com NaOH

0,1 M por 24 h não sofre interferência dos produtos de degradação como verifica-se na

figura 9 pág. 38.

37

2.18

2.65

3.29

7.00

, LA

MIVU

DINA

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9


0

200

400

600

800Intensity (mV)

Figura 9: Amostra de Lamivudina, padrão secundário, submetida a estresse com NaOH

0,1 M por 24 h.

Verificou-se que a amostra de Lamivudina, na concentração de trabalho, estressada

com temperatura de 1500 C por 24 h não sofreu interferência dos produtos de degradação,

figura 10 pág. 38.

2.75

3.18

6.76

, LA

MIVU

DINA

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9


0

100

200

300

400

500

600

700

800

Intensity (mV)


temperatura de 1500 C por 24 h.

Verificou-se também que nenhum constituinte da mistura dos excipientes do fármaco

de Lamivudina comprimido elui no mesmo tempo de retenção que o princípio ativo,

portanto não houve interferência na dosagem do teor.

38

6.3. Resultados da Linearidade

A linearidade foi verificada traçando-se a curva de calibração (gráfico das

respostas, eixo y, em função da concentração, eixo x), onde x corresponde à concentração

da Lamivudina padrão e y é a área da Lamivudina obtida no cromatograma, em cinco

concentrações da solução padrão: 50, 75, 100, 125 e 150 %.

Os resultados obtidos para as cinco concentrações da solução padrão estão contidos

na tabela 6, pág. 39.

Tabela 6: Dados de concentração para o cálculo da Linearidade

Amostra

1

Concentração

2

3

Média

DP

DPR

Am.1 – 50% 50,09 50,02 50,09 50,07 0,04 0,08

Am.2 – 75% 75,13 75,05 75,11 75,10 0,04 0,05

Am.3 – 100% 100,03 99,94 100,03 100,00 0,05 0,05

Am.4 – 125% 124,00 123,99 123,93 123,97 0,04 0,03

Am.5 – 150% 148,91 148,67 148,80 148,79 0,12 0,08

Inicialmente suspeitou-se que o valor 148,67, referente a amostra 5 – 150%, era

aberrante, isto é não pertencia a população, portanto aplicou-se o teste de Grubbs, para o

nível de significância de 0,05.

G = (yij - y) / sij

Onde :

yij = valor suspeito de ser aberrante

yi = média dos valores obtidos para uma determinada concentração i

sij = desvio padrão dos valores obtidos

G calculado = 148,67 – 148,79 / 0,12 = -1,00

Em função do número de replicatas (n)

Se G calculado < G tabelado ou crítico, o valor suspeito não é considerado aberrante.

Se G calculado > G tabelado ou crítico, o valor suspeito é considerado aberrante.

Para n = 3 ; G crítico = 1,155

G calculado é menor que o G crítico, logo o valor suspeito não é aberrante.

39

Na concentração de 100% foram realizadas 6 injeções para verificar a

repetitividade.

Tabela 7: Repetitividade das injeções da concentração 100%

Concentração 100% Concentração das seis injeções

de padrão a 100 %

Injeção A 100,03

Injeção B 99,95

Injeção C 100,04

Injeção D 99,94

Injeção E 100,00

Injeção F 100,04

Média 100,00

DP 0,05

DPR 0,05

Para um número de injeções maior ou igual a cinco, é recomendável um

DPR < 1% (SHABIR, 2003). O desvio padrão relativo encontrado entre as seis injeções da

concentração 100% foi 0,05 sendo portanto considerado satisfatório.

Foi verificada a homocedasticidade do método, isto é, que as respostas (leituras do

equipamento) são independentes da variância da concentração da substância de interesse,

através do método de Cochran. A curva de calibração foi calculada pelo método dos

mínimos quadrados, que estima qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos

experimentalmente a partir da curva de calibração. Foram calculados os valores dos

coeficientes linear, (a) e angular (b) da reta e o coeficiente de correlação (r), e os intervalos

de confiança para os coeficientes da reta.

40

Tabela 8: Verificação da Homocedasticidade

Injeção Conc.1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5

1 50,09 75,13 100,03 124,00 148,91

2 50,02 75,05 99,94 123,99 148,67

3 50,09 75,11 100,03 123,93 148,80

Média 50,07 75,10 100,00 123,97 148,79

S2 0,0016 0,0017 0,0027 0,0014 0,0144

S2 = Variância

C calc. = S2 maior Onde: S2 maior = Maior variância

Σ S2 j Σ S2 j = Somatório das variâncias

Se C calculado < C tabelado ou crítico, o método é considerado Homocedástico

Se C calculado > C tabelado ou crítico, o tabelado ou crítico, o método é considerado

Heterocedástico

Para o método em questão a maior variância é 0,0144 e o somatório das

variâncias é 0,0218; C calculado = 0,661 e C crítico = 0,684.

O C calculado é menor que o C crítico, logo o método é considerado

Homocedástico e a equação da reta pode ser calculada pelo método dos mínimos

quadrados.

Tabela 9: Representação das médias da concentração real em cada nível de concentração

Nível de Concentração

Teórica

Concentração (mcg / mL) Concentração Real (%)

50% 199,84 50,07

75% 299,76 75,10

100% 399,68 100,00

125% 499,60 123,97

150% 599,52 148,79

41

Curva da Calibração - Linearidadey = 0,2465x + 1,054

r = 0,9999

050

100150200

0 200 400 600 800

mcg / ml

%

Figura 11: Curva de calibração – Linearidade

A equação de reta é y = 0,2465 x + 1,054 e o coeficiente de correlação r = 0,9999.

O coeficiente de correlação (r) expressa a relação x e y na curva, cujos valores

podem estar compreendidos entre -1 e +1, onde os valores ideais são os mais próximos da

unidade. O critério mínimo aceitável para o coeficiente de correlação, segundo a RE 899, é

de 0,99 (BRASIL, 2003a).

Como o valor determinado para o coeficiente de correlação foi 0,9999 pode-se

dizer que existe uma relação linear definida (BOHRNSTED, 1982; MILLER, 1988).

A análise de variância (ANOVA) na regressão é utilizado para confirmar a

regressão, a partir da distribuição F, utilizada para realizar o teste de hipótese da equação

da reta de regressão, onde a hipótese nula (H0) é de que o coeficiente angular b = 0 e a

hipótese alternativa (H1) é de que b ≠ 0, pode-se assim representar:

H0 : b = 0

H1 : b ≠ 0

Se o F-calculado é maior que F-crítico a hipótese nula deve ser rejeitada e a

hipótese alternativa, b ≠ 0, aceita. Logo pode-se confirmar e aceitar a regressão.

Observando a tabela 10, pág. 43 , verifica-se que F-calculado é maior F-crítico ou

de significação, portanto confirma-se a regressão (LAPPONI, 2000).

42

Como as concentrações utilizadas para a avaliação da linearidade variaram de 200

a 600 mcg / mL pode-se afirmar que o método é linear neste intervalo.

Tabela 10: Confirmação da linearidade por ANOVA

ANOVA

gl SQ MQ F F de significação

Regressão 1 18203,54 18203,54 235729,04 4,53E-29

Resíduo 13 1,00 0,08

Total 14 18204,54

gl = graus de liberdade; SQ = soma quadrática; MQ = média quadrática; F = F calculado; E =.exponencial

A tabela 11, pág. 43 contém os coeficientes da reta e os seus valores máximo e

mínimo para um nível de significância (α) igual a 0,05%, a partir dos quais foram

calculados os intervalos de confiança para os coeficientes da reta .

IC (a) = 1,52 - 1,05 = 0,47

IC (b) = 0,25 - 0,25 = 0

Tabela 11: Dados para o cálculo do intervalo de confiança dos coeficientes da reta

Coeficientes 95% inferiores 95% superiores

Interseção 1,05 0,59 1,52

Variável X 0,25 0,25 0,25

Foram calculados os resíduos, tabela 12, pág. 44, e com eles traçado um gráfico,

fig.12, pág.45, que mostra a sua distribuição. A população dos resíduos normalmente

distribuídos apresenta média igual a zero (MILLER, 1988).

43

Tabela 12: Resultado de resíduos

Concentração Y previsto Resíduos

1 50,32 -0,23

2 50,32 -0,30

3 50,32 -0,23

4 74,95 0,18

5 74,95 0,10

6 74,95 0,16

7 99,59 0,44

8 99,59 0,35

9 99,59 0,44

10 124,22 -0,22

11 124,22 -0,23

12 124,22 -0,29

13 148,85 0,06

14 148,85 -0,18

15 148,85 -0,05

44

Variável X 1 Plotagem de resíduos

-0.50

0.00

0.50

0 200 400 600 800

Variável X 1

Res

íduo

s

Figura 12: Plotagem de resíduos

Também foi traçado o gráfico de ajuste de linha, fig.13, pág.45, pode-se observar

que as retas estão sobrepostas, o que demostra o quanto a reta experimental se aproxima da

ideal.

Variável X Plotagem de ajuste de linha

0100200

0 200 400 600 800

Variável X

Y

Y previstoY

Figura 13: Plotagem de ajuste de linha

45

6.4. Resultados da Exatidão

A análise foi conduzida em triplicata de injeção em cada nível de concentração e a

avaliação estatística foi executada através cálculo do percentual recuperado, ou seja, a

relação percentual entre a concentração de Lamivudina encontrada, em cada nível de

concentração, e a concentração esperada. Foi incluído ainda o cálculo do intervalo de

confiança para cada nível.

A porcentagem de recuperação (%R) da substância de interesse é calculada

segundo a fórmula.

% R = X x 100 Onde: % R = Porcentagem de recuperação

Y X = média dos resultados (valor encontrado)

Y = concentração teórica (valor esperado)

Tabela 13: Resultados da exatidão expressos em concentração

Concentração da

amostra

75% 100% 125%

Replicata A1 98,02 99,34 99,26

Replicata A2 98,31 99,48 99,18

Replicata A3 98,35 99,51 99,14

Replicata B1 100,71 98,32 99,44

Replicata B2 100,51 98,40 99,36

Replicata B3 100,56 98,39 99,42

Replicata C1 98,63 99,12 99,36

Replicata C2 98,68 99,38 99,38

Replicata C3 - 99,21 99,46

Média 99,22 99,02 99,33

DP 1,16 0,50 0,11

DPR 1,16 0,51 0,12

% Recuperação 99,22 99,02 99,33

IC +0,89 +0,33 +0,07

46

Suspeitou-se que o valor 96,24; referente a replicata C3 da concentração 75%, era

aberrante, portanto foi aplicado o teste de Grubbs:

G = (yij - y) / sij

G = 99,22 - 96,24 / 1,16 = 1,158

Foi utilizado o n = 3 pois se trata de triplicata de injeção;

G crítico = 1,155

G calculado é maior que o G crítico, logo o valor suspeito é aberrante e foi retirado dos

cálculos. Os resultados apresentados na tabela 13, pág.46 já não consideram o valor da

replicata C3 da concentração 75%.

De acordo com a bibliografia, as médias dos valores de recuperação do método

analítico devem ser iguais a 100 % + 2 do valor rotulado (SHABIR, 2003). Portanto podem

variar de 98 a 102 %. Na tabela 13, pág.46 estão representadas as médias obtidas para cada

nível de concentração 75, 100 e 125%. Os valores obtidos foram respectivamente 99,22 %;

99,02 % e 99,33 %, sendo assim os valores de recuperação do método analítico foram

considerados satisfatórios.

6.5. Resultados da Precisão

A Precisão foi avaliada nos níveis Repetitividade e Precisão intermediária.

6.5.1. Resultados da Repetitividade

Os resultados foram avaliados através da análise dos desvios padrões relativos para

cada determinação, sendo considerado satisfatório o desvio padrão relativo menor ou igual

a 2 % pois segundo a literatura o valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com

a metodologia empregada, a concentração da amostra, o tipo de matriz e a finalidade do

método, não se admitindo valores superiores a 5% (BRASIL, 2003a).

47

Tabela 14: Resultados da Repetitividade

Amostra Laboratório A Laboratório B Laboratório C

A1 101,84 100,16 96,97

A2 102,61 100,52 97,32

B1 101,54 98,05 96,55

B2 101,71 98,26 96,78

C1 100,58 99,27 98,27

C2 100,57 99,31 98,46

D1 101,85 98,56 96,41

D2 101,74 98,72 95,80

E1 101,18 98,52 96,35

E2 101,19 98,78 96,15

F1 100,54 99,00 96,83

F2 100,58 99,06 96,83

Média 101,33 99,02 96,89

DP 0,67 0,73 0,79

DPR 0,66 0,74 0,82

IC +0,70 +0,76 +0,83

Observando a tabela 14, pág.48, verificou-se que os valores dos desvios padrões

relativos encontrados são inferiores a 2% portanto, os resultados da repetitividade foram

considerados satisfatórios.

6.5.2. Resultados da Precisão Intermediária

A primeira avaliação da precisão intermediária foi executada variando o analista e

mantendo constante todos os demais parâmetros. As análises foram conduzidas por dois

analistas diferentes. Os resultados estão expressos nas tabelas 15 a 20 págs. 49 a 51.

A avaliação dos resultados foi realizada através da comparação das variâncias,

usando o teste F de Snedecor, onde a hipótese nula (H0) é de que não há diferença

significativa entre as variâncias, indicando que não há diferença significativa entre as

análises realizadas pelos dois analistas.

48

Tabela 15: Precisão intermediária do laboratório A por analistas diferentes.

Amostras - Laboratório A Analista 1 – Equip. 2 Analista 2 – Equip. 2

A1 101,84 100,36

A2 102,61 100,54

B1 101,54 99,46

B2 101,71 99,55

C1 100,58 101,53

C2 100,57 99,89

D1 101,85 100,24

D2 101,74 100,39

E1 101,18 100,05

E2 101,19 100,02

F1 100,54 100,85

F2 100,58 100,84

Média 101,33 100,31

DP 0,67 0,58

DPR 0,66 0,58

Tabela 16: Resultados do teste de F entre os analistas 1 e 2 do laboratório A

Teste-F: duas amostras para variâncias

Variável 1 = Analista 1 Variável 2 = Analista 2

Média 101,33 100,31

Variância 0,44 0,34

Observações 12,00 12,00

gl 11,00 11,00

F 1,29

F crítico bi - caudal 3,43

gl = Graus de liberdade; F = F estatístico calculado

F crítico maior que o F calculado, logo H0 é aceito, isto é não há diferença

significativa entre as análises realizadas pelos dois analistas do Laboratório A.

49

Tabela 17: Precisão intermediária do laboratório B por analistas diferentes.

Amostras - Laboratório B Analista 1 – Equip. 2 Analista 2 – Equip. 2

A1 100,16 100,80

A2 100,52 100,84

B1 98,05 98,15

B2 98,26 98,14

C1 99,27 99,75

C2 99,31 99,78

D1 98,56 99,36

D2 98,72 99,20

E1 98,52 99,39

E2 98,78 99,56

F1 99,00 99,20

F2 99,06 99,17

Média 99,02 99,44

DP 0,73 0,83

DPR 0,74 0,83

Tabela 18: Resultados do teste de F entre os analistas 2 e 1 do laboratório B


Variável 1 = Analista 2 Variável 2 =Analista 1

Média 99,45 99,02



gl 11,00 11,00

F 1,30




significativa entre as análises realizadas pelos dois analistas do Laboratório B.

50

Tabela 19: Precisão intermediária do laboratório C por analistas diferentes

Amostras - Laboratório C Analista 1 – Equip. 2 Analista 2 – Equip. 2

A1 96,97 94,49

A2 97,32 94,48

B1 96,55 94,44

B2 96,78 94,52

C1 98,27 96,31

C2 98,46 96,32

D1 96,41 95,36

D2 95,80 95,39

E1 96,35 95,88

E2 96,15 96,60

F1 96,83 95,96

F2 96,83 96,29

Média 96,89 95,50

DP 0,79 0,84

DPR 0,82 0,88

Tabela 20: Resultados do teste de F entre os analistas 2 e 1 do laboratório C


Variável 1 = Analista 2 Variável 2 = Analista 1

Média 95,50 96,89



gl 11,00 11,00

F 1,11




significativa entre as análises realizadas pelos dois analistas do Laboratório C. 51

A avaliação dos resultados da precisão intermediária, para comparar os resultados

das análises realizadas pelo mesmo analista em equipamentos diferentes e por analistas

diferentes em equipamentos diferentes, foi executada através da comparação das

variâncias, usando o teste F de Snedecor, onde a hipótese nula (H0) é de que não há

diferença significativa entre as variâncias, indicando que não há diferença significativa

entre as análises realizadas. Os resultados estão expressos nas tabelas 21 a 32 págs. 53 a

58.

52

Tabela 21: Precisão intermediária do laboratório A com equipamentos diferentes

Amostras - Laboratório A Analista 2 - Equip.2 Analista 2 - Equip.1

A1 100,36 99,21

A2 100,54 98,80

B1 99,46 100,41

B2 99,55 100,83

C1 101,53 99,50

C2 99,89 99,64

D1 100,24 100,41

D2 100,39 100,07

E1 100,05 99,02

E2 100,02 99,03

F1 100,85 99,02

F2 100,84 98,80

Média 100,31 99,56

DP 0,58 0,70

DPR 0,58 0,70

Tabela 22: Resultados do teste de F do Laboratório A - equipamentos diferentes


Variável 1 = Equip. 1 Variável 2 = Equip. 2

Média 99,56 100,31



gl 11,00 11,00

F 1,47

F crítico bi-caudal 3,43

gl = graus de liberdade; F = F estatístico calculado; F crítico bi-caudal = F estatístico tabelado


significativa entre as análises realizadas nos dois equipamentos do Laboratório A.

53

Tabela 23: Precisão intermediária do laboratório B com equipamentos diferentes

Amostras - Laboratório B Analista 2 - Equip.2 Analista 2 - Equip.1

A1 100,80 97,07

A2 100,84 97,31

B1 98,15 98,07

B2 98,14 98,23

C1 99,75 96,25

C2 99,78 96,70

D1 99,36 95,16

D2 99,20 95,19

E1 99,39 96,29

E2 99,56 96,03

F1 99,20 96,01

F2 99,17 96,18

Média 99,44 96,54

DP 0,83 0,98

DPR 0,83 1,02

Tabela 24: Resultados do teste de F do laboratório B - equipamentos diferentes


Variável 1 = Equip. 1 Variável 2 = Equip. 2

Média 96,54 99,45



gl 11,00 11,00

F 1,41




significativa entre as análises realizadas nos dois equipamentos do Laboratório B.

54

Tabela 25: Precisão intermediária do laboratório C com equipamentos diferentes

Amostras - Laboratório C Analista 2 - Equip.2 Analista 2 - Equip.1

A1 94,49 95,24

A2 94,48 95,36

B1 94,44 95,21

B2 94,52 95,65

C1 96,31 96,63

C2 96,32 96,53

D1 95,36 95,92

D2 95,39 96,29

E1 95,88 96,33

E2 96,60 96,61

F1 95,96 96,33

F2 96,29 95,78

Média 95,50 95,99

DP 0,84 0,53

DPR 0,88 0,55

Tabela 26: Resultados do teste de F do laboratório C - equipamentos diferentes


Variável 1 = Equip.2 Variável 2 = Equip.1

Média 95,50 95,99



gl 11,00 11,00

F 2,41




significativa entre as análises realizadas nos dois equipamentos do Laboratório C.

55

Tabela 27: Precisão intermediária lab. A com analistas e equipamentos diferentes

Amostras - Laboratório A Analista 2 - Equip.1 Analista 1 - Equip.2

A1 99,21 101,84

A2 98,80 102,61

B1 100,41 101,54

B2 100,83 101,71

C1 99,50 100,58

C2 99,64 100,57

D1 100,41 101,85

D2 100,07 101,74

E1 99,02 101,18

E2 99,03 101,19

F1 99,02 100,54

F2 98,80 100,58

Média 99,56 101,33

DP 0,70 0,67

RSD 0,70 0,66

Tabela 28: Resultados do teste de F lab. A para analistas e equipamentos diferentes


Variável 1 = Ana.2/Equip.1 Variável 2 = Ana.1/Equip.2

Média 99,56 101,33



gl 11,00 11,00

F 1,14




significativa entre as análises realizadas com analistas e equipamentos diferentes.

56

Tabela 29: Precisão intermediária lab. B - analistas e equipamentos diferentes

Amostras - Laboratório B Analista 1 - Equip.2 Analista 2 - Equip.1

A1 100,16 97,07

A2 100,52 97,31

B1 98,05 98,07

B2 98,26 98,23

C1 99,27 96,25

C2 99,31 96,70

D1 98,56 95,16

D2 98,72 95,19

E1 98,52 96,29

E2 98,78 96,03

F1 99,00 96,01

F2 99,06 96,18

Média 99,02 96,54

DP 0,73 0,98

DPR 0,74 1,02

Tabela 30: Resultados do teste de F lab. B - analistas e equipamentos diferentes


Variável 1 = Ana.2/Equip.1 Variável 2 = Ana.1/Equip.2

Média 96,54 99,02



gl 11,00 11,00

F 1,83





57

Tabela 31: Precisão intermediária lab. C - analistas e equipamentos diferentes

Amostras - Laboratório C Analista 1 - Equip.2 Analista 2 - Equip.1

A1 96,97 95,24

A2 97,32 95,36

B1 96,55 95,21

B2 96,78 95,65

C1 98,27 96,63

C2 98,46 96,53

D1 96,41 95,92

D2 95,80 96,29

E1 96,35 96,33

E2 96,15 96,61

F1 96,83 96,33

F2 96,83 95,78

Média 96,89 95,99

DP 0,79 0,53

DPR 0,82 0,55

Tabela 32: Resultados do teste de F lab. C - analistas e equipamentos diferentes


Variável 1 Variável 2

Média 96,89 95,99



gl 11,00 11,00

F 2,17





58

6.6. Resultados da Faixa

Foi determinado como faixa de trabalho o intervalo de 75 a 125% do valor

rotulado, pois o mesmo apresentou resultados satisfatórios nos parâmetros precisão,

exatidão e linearidade.

6.7. Discussão da Validação do Método de Análise do Teor da Lamivudina

Comprimidos

Os resultados da validação provaram que o método de análise do teor da

Lamivudina é:

a) Específico, isto é, os resultados não foram afetados pela presença de produtos de

degradação, impurezas ou excipientes;

b) Linear, apresentando a seguinte equação da reta: y = 0,2465 x + 1,0545 e um

coeficiente de correlação (r) igual a 0,9999;

c) Exato, já que os valores da recuperação para cada nível de concentração foram: para

75% - 99,22 + 0,89 ; para 100% - 99,02 + 0,33 e para 125% - 99,33 + 0,07 ;

d) Preciso, nos itens:

Repetitividade todos os desvios padrões encontrados para cada determinação foram

abaixo de 2%;

Precisão intermediária, variando apenas o analista, somente o equipamento e ao

mesmo tempo analista e equipamento; usando o teste de F de Snedecor para cada tipo de

comparação, não houve diferença significativa entre as variâncias em nenhuma das

comparações realizadas, portanto não houve diferença significativa entre as análises.

Foi então determinado como faixa de trabalho o intervalo de 75 a 125 % do valor

rotulado, pois o mesmo apresentou resultados satisfatórios nos parâmetros precisão,

exatidão e linearidade.

Portanto a validação do método de análise do teor de Lamivudina comprimidos foi

considerada satisfatória.

59

6.8. Resultados da Especificidade do Ensaio Limite para o Enantiômero

(+) BCH-189

As amostras utilizadas na especificidade do ensaio limite para o enantiômero

(+)BCH-189, foram estressadas da mesma forma que as utilizadas na especificidade para o

método de análise de teor, item 6.2 pág. 36.

Os cromatogramas obtidos foram avaliados e verificou-se que nenhum dos

componentes, sejam eles produtos de degradação ou excipientes, possui o mesmo tempo de

retenção do (+)BCH-189 e que a resolução obtida entre os sinais dos picos foi sempre

maior que dois, portanto os resultados obtidos não são afetados pela presença destas

substâncias.

A figura 14, pág. 60, refere-se a mistura racêmica de (+)BCH-189 e Lamivudina na

concentração de 44 mcg/mL.

O cromatograma apresentou uma resolução de 4,09 entre os picos e os tempos de

retenção da Lamivudina e do (+)BCH-189 foram respectivamente 8,30 min e 10,29 min.

8.30

, La

mivu

dina

10.2

9, (

+) B

CH 1

89

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 14: Especificidade do método de ensaio limite do enantiômero (+)BCH-189

A figura 15, pág. 61, refere-se a uma amostra que contém 250 mcg de Lamivudina

e 0,75 mcg de (+)BCH-189 por mililitro, que corresponde ao limite máximo permitido de

(+)BCH-189 em Lamivudina matéria-prima. Os tempos de retenção obtidos para a

60

Lamivudina e (+)BCH-189 foram respectivamente 8,05 min e 10,32 min, a resolução entre

os picos foi 4,39.

8.

05,

Lami

vudi

na

10.3

2, (

+) B

CH 1

89

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 15: Especificidade do método de ensaio limite do enantiômero (+)BCH-189 na

concentração de trabalho.

A figura 16, pág. 61, refere-se a uma amostra contendo 250 mcg de Lamivudina e

todos os excipientes que entram na formulação do produto em suas respectivas

concentrações.

8.04

, La

mivu

dina

10.3

7, (

+) B

CH 1

89

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 16: Cromatograma do produto ( Princípio ativo + Excipientes)

A figura 17, pág.62 demonstra que a amostra de Lamivudina na concentração de

trabalho, isto é 400 mcg/mL, estressada com HCl 0,1 N por 24 h não sofre interferência

dos produtos de degradação.

61

7.73

, La

mivu

dina

9.90

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 17: Cromatograma amostra de Lamivudina submetida ao estresse com HCl 0,1 N

por 24h.

A figura 18, pág. 62, demonstra que a amostra de Lamivudina na concentração de

trabalho, isto é 400mcg/mL, estressada com H2O2 3% por 24 h não sofre interferência dos

produtos de degradação.

Intensity (mV)

8.01

, La

mivu

dina

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Figura 18: Cromatograma amostra de Lamivudina submetida ao estresse com H2O2 3% por

24h.

A amostra de Lamivudina na concentração de trabalho, isto é 400 mcg/mL,

estressada com NaOH 0,1 N por 24 h não sofre interferência dos produtos de degradação,

como verifica-se na figura 19 pág. 63.

62

Intensity (mV)

Figura 19: Cromatograma amostra de Lamivudina submetida ao estresse com NaOH 0,1 N

por 24h.

7.99

, La

mivu

dina

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

A amostra de Lamivudina na concentração de trabalho, isto é 400 mcg/mL,

estressada com a temperatura de 150°C por 24 h não sofre interferência dos produtos de

degradação, como observa-se na figura 20 pág. 63.

7.73

, La

mivu

dina

9.91

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 20: Cromatograma amostra de Lamivudina submetida ao estresse com a

temperatura de 150°C por 24 h.

Nenhum constituinte da mistura dos excipientes do fármaco de Lamivudina elue no

mesmo tempo de retenção do (+)BCH-189, portanto não interfere com a análise do ensaio

limite.

63

6.9. Resultados do Limite de Detecção para o Enantiômero (+) BCH-189

Foram preparadas soluções da mistura racêmica contendo as seguintes

concentrações de (+)BCH-189:

conc.1 = 862,4 ng/mL , conc.2 = 86,2 ng/mL e conc.3 = 8,6 ng/mL.

Os cromatogramas estão apresentados nas figuras 21 a 26 págs. 64 a 66.

Como na concentração 3 não foi obtida detecção, preparou-se uma solução de

concentração intermediária 17,2 ng/mL na qual pôde ser detectada a substância de

interesse sendo portanto considerado como o limite de detecção experimental.

7.88

, La

mivu

dina

9.75

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 21: Cromatograma do limite de detecção conc.1 = 862,4 ng/mL

64

7.86

, La

mivu

dina

9.74

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)


7.90

, La

mivu

dina

9.78

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 23: Cromatograma do limite de detecção conc.3 A = 17,2 ng/mL

65

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)


Foi avaliada a interferência da concentração de Lamivudina na detecção de

pequenas concentrações de (+)BCH-189, preparando cinco soluções contendo uma

concentração constante de cerca de 250,0 mcg/mL de Lamivudina e concentrações

decrescentes de (+)BCH-189 (1,32; 0,8; 0,4; 0,16 e 0,08 mcg/mL), que correspondem

respectivamente a 0,53%; 0,32%; 0,16%; 0,06%; 0,03% de (+)BCH-189 em relação a

Lamivudina.

A partir dos cromatogramas obtidos foi determinada a resolução entre os picos e

verificou-se que apesar da baixa concentração de (+)BCH-189 em relação a Lamivudina a

sua detecção não foi afetada, até a concentração de 0,03%.

Os cromatogramas estão apresentados nas figuras 25 a 29 págs. 67 a 69.

66

7.46

, La

mivu

dina

9.42

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0Intensity (mV)

Figura 25: Conc.5 - 0,53% de (+)BCH-189 em relação ao pico da Lamivudina, R= 3,99

7.50

, La

mivu

dina

9.48

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Intensity (mV)

Figura 26: Conc.4 - 0,32% de (+)BCH-189 em relação ao pico da Lamivudina, R = 3,98

67

Intensity (mV) 7.51

, La

mivu

dina

9.50

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


Intensity (mV) 7.49

, La

mivu

dina

9.48

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


68

7.53

, La

mivu

dina

9.56

, (+

) BC

H 18

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0Intensity (mV)

Figura 29: Conc.1 - 0,03 % de (+)BCH-189 em relação ao pico da Lamivudina, R = 4,22

6.10. Discussão da Validação do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189

Na validação do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189, o método provou ser

específico, isto é os resultados não foram afetados pela presença de produtos de

degradação, impurezas ou excipientes; e o limite de detecção calculado foi de 17,2 ng/mL.

Tendo em vista que o ensaio limite para o enantiômero (+)BCH-189 atendeu aos

parâmetros de especificidade e limite de detecção, necessários para a sua validação e

lembrando que se trata de um enantiômero citotóxico, reafirma-se a importância da

realização deste ensaio nos comprimidos de Lamivudina.

69

6.11. Resultado da Pesquisa Bibliográfica sobre a Toxicidade do (+)BCH-189

A pesquisa bibliográfica sobre a ação farmacológica e a toxicidade do enantiômero

(+) BCH-189 revelou que a causa da toxicidade mitocondrial dos antiretrovirais análogos

de nucleosídeos é a inibição ou perturbação da síntese de DNA mitocondrial. E também

que o aumento da toxicidade celular dos nucleosídeos análogos esta relacionada com a

facilidade da sua incorporação ao DNA mitocondrial pela DNA polimerase humana e a

dificuldade da sua remoção (LIM, 2001).

A Lamivudina e o (+)BCH-189 são equipotentes contra o HIV, mais apenas o

(+)BCH-189 inibe a DNA-polimerase humana, fato associado com a toxicidade dos

fármacos nucleosídeos. A Lamivudina trifosfato (3TC-TP) é um dos nucleosídeo análogo

menos freqüentemente incorporados a DNA polimerase humana e um dos mais

eficientemente removidos. Estes dois fatos combinados podem explicar a sua baixa

toxicidade mitocondrial in vivo. A baixa incorporação da Lamivudina também pode ser

atribuída a sua forma isomérica β-L (-) (FENG, 1999; FENG, 2001; JOHNSON, 2001;

LIM, 2001; ANDERSON, 2002).

Devido ao fato do (+)BCH-189 ser significativamente mais citotóxico em linfócitos

não infectados é muito importante a realização do ensaio limite para determinar a sua

presença em comprimidos de Lamivudina.

70

7. CONCLUSÃO

É relevante ressaltar a importância da validação dos métodos analíticos como forma

de assegurar a confiabilidade dos resultados obtidos e assim garantir que os medicamentos

distribuídos são seguros e de qualidade; capazes de retardar a progressão da

imunodeficiência, melhorar e prolongar a qualidade de vida dos indivíduos infectados.

Os resultados da validação provaram que o método de análise do teor da

Lamivudina é específico, linear, exato e preciso, na faixa de trabalho de 75 a 125 % do

valor rotulado. E a validação do ensaio limite do enantiômero (+)BCH-189, provou que o

método é específico, e o limite de detecção foi determinado em 17,2 ng/mL. Sendo as

validações do método de análise do teor de Lamivudina e do ensaio limite do enantiômero

(+)BCH-189 consideradas satisfatórias.

A validação das metodologias de análise dos medicamentos é importante para que

o Ministério da Saúde através das VISAS cumpra sua atribuição de proteção da saúde da

população avaliando a qualidade dos medicamentos disponíveis no mercado.

A Lamivudina e o (+)BCH-189 são equipotentes contra o HIV, mas apenas o

(+)BCH-189 inibe a DNA-polimerase humana, fato associado com a toxicidade dos

fármacos nucleosídeos. Devido ao fato do (+)BCH-189 ser significativamente mais

citotóxico em linfócitos não infectados que a Lamivudina é muito importante a realização

do ensaio limite para determinar a sua presença em comprimidos de Lamivudina.

Na fase final desta dissertação foi publicada a RDC 150 de 17 de junho de 2003

que aprova o fascículo 4 da parte II, da 4ª edição da Farmacopéia Brasileira (FB), onde

encontram-se as monografias da Lamivudina matéria-prima e Lamivudina comprimido. Ao

comparar a monografia para Lamivudina comprimido proposta nesta dissertação com a

apresentada na Farmacopéia Brasileira verificou-se que esta não preconiza nenhum teste

de pureza em comprimidos de Lamivudina.

A especificação para o ensaio limite do (+)BCH-189 sugerida nesta dissertação,

0,3% em relação a Lamivudina, foi baseada na especificação para o ensaio limite do

(+)BCH-189 em Lamivudina matéria-prima constante na Farmacopeial Forum, vol.27, jan-

fev 2001. Na Farmacopéia Brasileira o ensaio de pureza preconizado para a Lamivudina

matéria-prima é o de substâncias relacionadas onde é avaliado o somatório das impurezas,

sem identificar o (+)BCH-189, e cujo limite máximo é 1,0% em relação a Lamivudina. 71

Sendo assim, o ensaio de pureza, substâncias relacionadas, apresentado na

Farmacopéia Brasileira pode aprovar uma matéria-prima com limite de (+)BCH-189

superior a 0,3% em relação a Lamivudina, ou seja uma matéria-prima reprovada pelos

parâmetros da Farmacopeial Forum.

É importante lembrar a metodologia preconizada na Farmacopéia Brasileira deve

contemplar todos os testes necessários para assegurar a qualidade do produto, no caso a

Lamivudina comprimidos.

Sendo assim, quando a análise é realizada por um laboratório que não possui as

informações a respeito da qualidade da matéria-prima utilizada na fabricação do produto,

torna-se indispensável a realização de um ensaio de pureza que identifique e determine um

limite máximo para o (+)BCH-189 nos comprimidos de Lamivudina.

72

8. BIBLIOGRAFIA

ANDERSON, K. S. Perspectives on the molecular mechanism of inhibition and toxicity of

nucleoside analogs that target HIV-1 reverse transcriptase. Biochimica et Biophisica

Acta. v.1587, p 296-299, 2002.

BEESLEY, T.E. et al. Chiral Chromatography, Chichester, 1998.

BENHAMOU,Y. E. et al. Efficacy of lamivudine on replication of hepatitis B virus in

HIV-infected patients. The Lancet, v. 345, n. 8, p. 396 - 397, 1995.

BERMUDEZ, J. A. Z. Formulação, Implementação e Componentes de uma Política de

Medicamentos. SEMINÁRIO INTERNACIONAL ACESSO A MEDICAMENTOS:

DIREITO FUNDAMENTAL E PAPEL DO ESTADO. Rio de Janeiro Outubro de 2002.

Disponível em: http://www.opas.org.br/medicamentos/seminar/apresent/bermude1.pdf

Acesso em: 25 de junho de 2003.

BLANEY, S. M. et al. Pharmacokinetis of lamivudine and BCH-189 in plasma and

cerebrospinal fluid of no human primates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.

39, n.12, p. 2779-2782, 1995.

BOHRNSTEDT, G.W.; KNOKE, D. Statistics for Social Data Analysis, Itasca Illinois:

F.E. Peacock Publishers, Inc. 1982.

BRASIL 1990a. Lei n° 8.078 de 11 de setembro de 1990. Código de Defesa do

Consumidor : dispõe sobre a proteção do consumidor e dá outras providências. Diário

Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, Disponível em:

http://www.anvisa.gov.br/legis/leis/index.htm. Acesso em: 20 de set. de 2002.

73

http://www.anvisa.gov.br/legis/leis/index.htm

BRASIL 1990b. Lei n° 8.080 de 19 de setembro de 1990. Dispõe sobre as condições para a

promoção, proteção e recuperação da saúde, a organização e o funcionamento dos serviços

correspondentes, e dá outras providências. Diário Oficial [da] República Federativa do

Brasil, Brasília, DF, Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/legis/leis/index.htm. Acesso

em: 20 de set. de 2002.

BRASIL, Portaria nº 236 de 02 de maio de 1995. Estabelece as diretrizes para o programa

de controle da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida, SIDA ou AIDS, no âmbito do

território nacional, atribui à divisão de Dermatologia Sanitária, da Secretaria Nacional de

Programas Especiais de Saúde, a coordenação do mesmo. Diário Oficial [da] Republica

Federativa do Brasil, Brasília, DF, Disponível: www.aids.gov.br/c_geral/eciv03.htm .

Acesso em: 03 de jun. de 2003.

BRASIL 1996a. Lei n0 9.279 de 14 de maio de 1996. Regula direitos e obrigações

relativos à propriedade industrial. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil,

Brasília, DF, Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/legis/lei9279.htm. Acesso em: 27

de dez. de 2000.

BRASIL 1996b. Lei n0 9.313 de 13 de novembro de 1996. Dispõe sobre a distribuição

gratuita de medicamentos aos portadores do HIV e doentes de Aids. Diário Oficial [da]

República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 14 de novembro de 1996. Disponível em:

http://www.aids.gov.br/assistencia/lei9313.htm . Acesso em: 27 de dez. de 2000.

BRASIL 1998. Portaria n0 3.916 de 30 de outubro de 1998. Aprova a Política Nacional de

Medicamentos. Diário Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, 10 de

novembro de 1998. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/index98.htm

Acesso em: 20 de set. de 2002.

74


http://www.aids.gov.br/c_geral/eciv03.htm

http://www/

http://www/

http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/index98.htm

BRASIL 1999a. Lei n° 9.782 de 26 de janeiro de 1999. Define o Sistema Nacional de

Vigilância Sanitária, cria a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, e dá outras

providências. Diário Oficial [da] Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, (*)Tem

dispositivos alterados pela Medida Provisória n° 2.190/01. Disponível em:

http://www.anvisa.gov.br/legis/leis/index.htm . Acesso em: 20 de set. de 2002.

BRASIL 1999 b. Portaria n0 391 de 9 de agosto de 1999. Aprova o regulamento técnico

para medicamento genérico. Diário Oficial [da] Republica Federativa do Brasil,

Brasília, DF, (*) Revogada pela RDC n.º 10 de 2 de janeiro de 2001, que por sua vez foi

revogada pela Resolução nº 475 de 19 de março de 2002, que por sua vez foi

revogada pela Resolução n.º 899 de 29 de maio de 2003. Disponível em:

http://www.anvisa.gov.br/legis/resolução/index_99.htm Acesso em: 20 de set. de 2002.

BRASIL 1999 c. Decreto n° 3.201 de 06 de outubro de 1999. Dispõe sobre a concessão, de

ofício, de licença compulsória nos casos de emergência nacional e de interesse público de

que trata o art. 71 da Lei n° 9.279, de 14 de maio de 1996. Diário Oficial [da] República

Federativa do Brasil, Brasília, DF, Disponível em:

http://www.anvisa.gov.br/legis/decretos/index.htm. Acesso em: 20 de set. de 2002.

BRASIL 2003a. Resolução (RE) n0 899, de 29 de maio de 2003. Determina a publicação

do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos". Diário Oficial [da]

Republica Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 de junho de 2003. Disponível em:

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/index_re_mai.htm. Acesso em: 03 de jun. de

2003.

BRASIL 2003b. Resolução (RDC) n° 150, de 17 de junho de 2003. Aprova o “Fascículo 4

da Parte II, da 4ª Edição da Farmacopéia Brasileira”. Diário Oficial [da] Republica

Federativa do Brasil, Brasília, DF, 20 de junho de 2003. Disponível em:

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/index_rdc_jun.htm. Acesso em: 04 de agosto

de 2003.

75


http://www.anvisa.gov.br/legis/resolu��o/index_99.htm

http://www.anvisa.gov.br/legis/decretos/index.htm

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/index_re_mai.htm

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/index_rdc_jun.htm

COATES, J.A. et al. The separated of 2', 3'-dideoxy-3'-thiacytidine (BCH-189) both inhibit

human immunodeficiency virus replication in vitro. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, v. 36, n.1, p. 202-205, 1992.

COSTA, E. A.; ROSENFELD, S. Constituição da Vigilância Sanitária no Brasil

Fundamentos da Vigilância Sanitária. Rio de Janeiro, v. 1, p. 15-40, 2000.

COSTA, E. A. Vigilância Sanitária - saúde e cidadania. Cadernos de Saúde; Belo

Horizonte, v.4, p. 15-27. 2001.

DIONE, G. 3TC: A Canadian Scientific Success. McGill Journal of Medicine, v. 5, n.1,

p. 60-65, 1999. Disponível em: http;//www.Mjm.mcgill.ca. Acesso em: 02 de março de

2003.

FDA 1992 (FOOD AND DRUGS ADMINISTRATION). FDA's Policy statement for the

development of new stereoisomeric drugs. Data de publicação 5/1/92

[on-line], Disponível em: http:/www.fda.gov/cder/guidance/stereo.htm . Acesso em: 26 de

abril de 2002.

FDA 1995 (FOOD AND DRUGS ADMINISTRATION). FDA grants accelerated approval

for 3TC with AZT to treat AIDS. [on-line], Disponível em: http://www.fda.gov . Acesso

em: 8 de maio de 2002.

FENG, J.Y.; ANDERSON, K. S., Mechanistic studies comparing the incorporation of (+)

and (-) isomers of 3TC-TP by HYV reverse transcriptase. Biochemistry. v. 38, p. 55-63,

1999.

FENG, J.Y. et al. Insights into the Molecular Mechanism of Mitochondrial Toxicity by

AIDS Drugs. The Journal of Biological Chemistry. v. 276, n. 26, p. 23832-23837, 2001.

FLORES, Jesuz. Farmacologia Humana: 3 ed. Barcelona: Masson, 1997, p. 1187-1211.

76

GALVÃO, J. 1980-2001 Uma cronologia da epidemia de HIV/AIDS no Brasil e no

mundo. Coleção ABIA. Políticas Públicas, n.2, 2002.

GRANGEIRO, A. Aids in Brazil - National Response. Ministério da Saúde, Secretaria de

Políticas de Saúde Coordenação Nacional de DST/ Aids. 2002.

GRAY, N.M. et al, The intracellular phosphorylation of (-)-2’-deoxy-3’-thiacytidine (3TC)

and the incorporation of 3TC 5’-monophosphate into DNA by HIV-1 reverse transcriptase

and human DNA polimerase γ. Biochemical Pharmacology, v. 50, n.7, p.1043-1051,

1995.

GUIMARÃES, M.D.C. et al. Estudo temporal das doenças associadas à AIDS no Brasil

1980-1999. Cadernos de Saúde Pública, Rio de Janeiro, v.16, s.1, p.21-36, 2000.

GUIMARÃES, M.C.L et al. O Registro Sanitário do Medicamento Similar no Brasil e

suas Implicações na Saúde Pública: A Responsabilidade do Estado Frente à

Vulnerabilidade da População. Pharmacia Brasileira, Brasília, n.34, p.76-81, out./nov.

2002.

HART, G. J., et al. Effects of (-)- 2- deoxy-3-thiacytidine (3TC) - 5- triphosphate on

human immunodeficiency virus reverse transcriptase and mammalian DNA polymerase

alpha, beta and gamma. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 36, p.1688-1694,

1992.

ICH (INTERNATIONAL Conference on Harmonization) Harmonized Tripartite

Guidelines. Text on Validation of Analytical Procedures, October 1994. [on-line],

Disponível em: http://www.ich.org/pdfICH/Q2A.pdf Acesso em: 05 de janeiro de 2001.

ICH (INTERNATIONAL Conference on Harmonization) Harmonized Tripartite

Guidelines. Validation of Analytical Procedures: Methodology, November 1996. [on-line],

Disponível em: http://www.ich.org/pdfICH/Q2B.pdf Acesso em: 05 de janeiro de 2001.

77

http://www.ich.org/pdfICH/Q2A.pdf

http://www.ich.org/pdfICH/Q2B.pdf

JOHNSON, A. A. et all, Toxicity of Antiviral Nucleoside Analogs and the Human

Mitochondrial DNA polymerase. The Journal of Biological Chemistry, v. 276, ed. 44, p.

40847-40857, 2001.

KEWN, S. et al, Lamivudine (3TC) Phosphorylation and Drug Interactions In Vitro.

Biochemical Pharmacology, v. 54, p. 589-595, 1997.

LAPPONI, J.C. Estatística usando Excel. São Paulo: Lapponi treinamento e editora,

2000.

LIM, S.E.; COPELAND, W.C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral

Deoxynucleotides by Human DNA polimerase γ. The Journal of Biological Chemistry,

v.276, ed. 26, p. 23616-23623, 2001.

MILLER, J.C.; MILLER, J.N. Statistics for Analytical Chemistry. 2 ed. Chichester: Ellis

Horwood Limited, 1988.

MS (MINISTÉRIO DA SAÚDE), Secretaria de Assistência à Saúde. Programa Nacional

de DST e Aids. Consenso sobre Terapia antiretroviral em Adultos. Brasília, 1996.


de DST e Aids. Consenso sobre Terapia antiretroviral para Adultos e Adolescentes

infectados pelo HIV. Brasília, 1997.


de DST e Aids. Infeção pelo HIV em Adultos e Adolescentes. Brasília, 1999.

MS (MINISTÉRIO DA SAÚDE), Secretaria de Assistência à Saúde, Programa Nacional

de DST e Aids, Recomendações para Terapia antiretroviral em Adultos e Adolescentes.

Brasília, 2001.

78

MS (MINISTÉRIO DA SAÚDE) 2002a, Secretaria de Assistência à Saúde, Coordenação

Nacional de DST e Aids, Unidade de assistência. "Aids: Etiologia, clínica, diagnóstico e

tratamento", 2002. [on line] Disponível em: http://www.aids.gov.br. Acesso em 10 de abr.

de 2002.

MS (MINISTÉRIO DA SAÚDE) 2002b , Secretaria de Assistência à Saúde, Coordenação

Nacional de DST e Aids, Unidade de assistência. Acesso Universal e gratuito. [on line]

Disponível em: http://www.aids.gov.br . Acesso em 10 de abr. de 2002.

MS (MINISTÉRIO DA SAÚDE) 2002c, Programa Nacional de DST/AIDS, National

AIDS Drug Policy. Special Edition, Brasília, jun. 2002.

MS (MINISTÉRIO DA SAÚDE) 2002d, Coordenação Nacional de DST/AIDS, A

Experiência do Programa Brasileiro de Aids. Brasília. 2002.

MS (MINISTÉRIO DA SAÚDE), Coordenação Nacional de DST/AIDS, Resposta + (A

Experiência do Programa Brasileiro de Aids). [on line] Disponível em:

http://www.aids.gov.br. Acesso em: 02 de setembro de 2003.

PHARMACOPEIAL Forum. USP Monographs, v. 27, n. 1, Jan-Feb, 2001.

ROSENFELD, S. Farmacovigilância: Elementos para a discussão e perspectivas. Caderno

de Saúde Pública, Rio de Janeiro, v.14, n.2, abr-jun, 1998.

SCHINAZI, R. F. et al. A. Activities of the four optical isomers of 2’, 3’-dideoxy-3’-

thiacytidine (BCH-189) against human immunodeficiency virus type 1 in human

lymphocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 36, n. 3, p. 672-676, 1992.

79

SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for

pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between validation

requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopoeia and the

International Conference on Harmonization. Journal of Chromatography A, 987, p. 57-

66, 2003. Disponível em http://www.sciencedirect.com , Acesso em: 16 de abril de 2003.

SILVA, J. C. EDITORIAL ABIQUIF 2003. Disponível em: http://www.abquif.org.br

Acesso em 03 de abril de 2003.

SILVA, P. Farmacologia Humana. 5ed. p.1187-1211. Rio de Janeiro. Guanabara

Koogan, 1998.

SOMMADOSSI, J. P., et al. Comparison of cytotoxity of the (-)- and (+)-enantiomer of 2’,

3’-dideoxy- 3’-thiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells. Biochemical

Pharmacology, v. 44, n.10, p.1922-1925, 1992.

SOUDEYNS, H., et al. Anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and in vitro

toxicity of 2’-deoxy-3’-thiacytidine (BCH-189), a novel heterocyclic nucleoside analog.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 35, n. 7, p. 1386-1390, 1991.

SWARTZ, M. E. , KRULL, I. S. Validação de Métodos Cromatográficos. Pharmaceutical

Technology, São Paulo, jun., 1998.

SZWARCWALD, C.L. et al. A Disseminação da epidemia de AIDS no Brasil, no período

de 1987-1996: Uma análise espacial. Cadernos de Saúde Pública, Rio de Janeiro, v.16,

s.1, p.7-19, 2000.

THE HIV Life Cycle. [on line] Disponível em:

http://www.aidsmeds.com/lessons/LifeCycleIntro.htm Acesso em 30 de agosto de 2001.

80

http://www.abquif.org.br/

http://www.aidsmeds.com/lessons/LifeCycleIntro.htm

THE MERCK Index an encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals. 12 ed., p.914,

Merck Research Laboratories Division of Merck & Co., Inc. Whitehouse Station, U.S.A.

1996.

THE UNITED States Pharmacopoeia. 24 ed. Rockville, 2000. CD-ROM.

81

Documents

PPGVS/INCQS FIOCRUZ 2003 · Desenvolvimento e Validação da Metodologia de Análise do Teor de Lamivudina e do Ensaio Limite do Enantiômero (+)BCH-189 em Comprimidos de Lamivudina