PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM … · PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS

FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECIOSAS

PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE

REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA

ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA

MANAUS 2017

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PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES

SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA

AMAZÔNIA BRASILEIRA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Profº Drº Marcelo Cordeiro dos Santos

Co-orientador (a): Profª Dra. Maria Lucia Rosa Rossetti

MANAUS

2017

Ficha catalográfica

D278p de Lima, Ana Carolina de Oliveira Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira: Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira / Ana Carolina de Oliveira de Lima. Manaus: [s.n], 2017. 114 f.: il.; 297 cm. Dissertação - PGSS - Doenças Tropicais e Infecciosas (Mestrado) - Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, 2017. Inclui bibliografia Orientador: Marcelo Cordeiro dos Santos Coorientador: Maria Lúcia Rosa Rossetti 1. Prevalência. 2. Micobacterias não tuberculosas.

1. 3. Técnicas moleculares. 4. HIV/AIDS. 5. Região Norte. I. Marcelo Cordeiro dos Santos (Orient.). II. Maria Lúcia Rosa Rossetti (Coorient.). III. Universidade do Estado do Amazonas. IV. Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira

Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a)

autor(a). Sistema Integrado de Bibliotecas da Universidade do Estado do Amazonas.

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FOLHA DE JULGAMENTO

PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM

PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE

REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA


“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças

Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em

Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de

Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.

Banca Julgadora:

______________________________________ Presidente

______________________________________ Membro

______________________________________ Membro

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus familiares e amigos que me apoiaram nos momentos difíceis, ao meu pai Miquéias Oliveira de Lima e irmãos Marcos e Miquéias Júnior, com todo meu amor e gratidão pela força e incentivo, por tudo que fizeram por mim nessa trajetória. Em memória de Anira de Lima, mãe e amiga, dedico este trabalho fruto de um sonho nosso e com imensa saudade, por todo exemplo de superação e amor que me foi passado.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela força e sabedoria concedida para que eu pudesse alcançar essa

conquista.

À minha família por terem sido alicerce inabalável na trajetória até aqui. À querida Ms. Rossicléia Lins Monte pelo carinho e pelas instruções dadas para o

desenvolvimento deste trabalho. Ao professor Drº Marcelo Cordeiro dos Santos, meu orientador, pelos ensinamentos e pela

oportunidade de crescimento profissional. À professora Drª Maria Lúcia Rossetti, minha co-orientadora, que me possibilitou

aprendizagens únicas, sempre me incentivando. Muito obrigada pela confiança e por acreditar em meu potencial.

Ao professor Drº Afrânio Kritski, pela contribuição na construção deste trabalho, incentivo

e ensinamentos incansáveis À equipe do laboratório do Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CDCT da

Fundação de Produção e Pesquisa em Saúde – FEPPS, pelo apoio e ensinamentos oferecidos.

À equipe do laboratório da Gerência de Bacteriologia pelos anos que me acolheram me

disponinilizando conhecimento e maturidade profissional o que me fez chegar até aqui. À equipe do laboratório da Gerência de Tuberculose e Virologia pelo apoio no

desenvimento das técnicas laboratoriais necessárias nesse trabalho. A todos os professores Universidade do Estado do Amazonas/Programa de Pós-

graduação em Medicina Tropical, por todo aprendizado e atenção dispensado no repasse dos conhecimentos durante as aulas.

À Fundação de Amparo à pesquisa do Amazonas (FAPEAM) pelo apoio e bolsa de estudo. Aos membros da secretaria acadêmica da Pós-graduação em Medicina Tropical e a todos

os funcionários da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, pelo incentivo e cordialidade.

Aos colegas da turma de Mestrado ano 2015, por todos os momentos maravilhosos juntos,

pela sincera amizade durante esta jornada e por todo apoio, em especial às colegas Cynthia Pessoa e Maria Francisca Rodrigues. Muito obrigada!

DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS

O auxílio de passagens aéreas para a participação em treinamentos e capacitações

necessários para realização das técnicas moleculares foram financiados Universidade

do Estado do Amazonas (UEA). Os recursos laboratoriais e materiais de consumo

para execução dos procedimentos foram disponibilizados pelo Centro de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CDCT) da Fundação Estadual de

Produção e Pesquisa em Saúde (FEEPS) e pela empresa bioMérieux Brasil. O projeto

foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM)

por meio de bolsa de estudo, durante os 24 meses de execução do projeto.

[...] Não importa o quão estreito seja o portão e quão repleta de castigos seja a sentença, eu sou o dono do

meu destino, eu sou o capitão da minha alma [...]

Invictus.

RESUMO

Em países industrializados, com a queda da incidência de tuberculose (TB) ocorreu um aumento esporádico dos casos de infecções por micobactérias não tuberculosas (MNT). O uso de métodos de detecção laboratorial de MNT baseado em testes moleculares tem sido valorizado, pois a ausência de diagnóstico adequado em pacientes suspeitos de infecção por micobactérias pode levar ao tratamento inadequado, promover resistência medicamentosa, falência terapêutica e o óbito. Em países de alta carga de TB, são escassos os dados sobre a prevalência dos casos de infecção por MNT em pacientes suspeitos de TB com HIV/AIDS, como na região Norte do Brasil. Estima-se uma subnotificação dos casos por se tratar de uma doença sem notificação obrigatória. O objetivo desse estudo foi descrever os casos de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), referência para HIV/Aids, no período de 2011 a 2014. Dos pacientes atendidos, 758 tiveram amostras clínicas positivas para micobactérias, destes 153 (20,2%) foram positivas para MNT. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (66%), infectados por HIV (77%) em uso de terapia antiretroviral (26,7%), com mediana de CD4 de 244 cels/mm3. Entre essas amostras foi possível recuperar da criogenia 56 (36,6%) isolados para identificação molecular da espécie. A identificação da espécie de MNT foi obtida pelos testes GenoType® Mycobacterium CM/AS, PRA hsp65 (PRA) e sequenciamento respectivamente em 50 (89,3%), 37 (66%) e em 43 (76,8%) das amostras analisadas. A concordância entre a técnica PRA e o GenoType foi de 81%, entre o GenoType e o sequenciamento de 76% e entre o PRA e o sequenciamento de 74%. As espécies identificadas em maior frequência foram: Mycobacterium gordonae em 17 (30,4%), M. fortuitum em 11 (19,6%), M. avium/intracellulare em 10 (17,9%), M. abscessus em 6 (10,7%) M. kansasii em 3 (5,3%). Entre os 56 pacientes com MNT, 13 (23,2%) receberam tratamento inapropriado para TB e foram notificados no SINAN. Óbito foi identificado em 5 (9%) pacientes. Com base nesses achados, observou-se: a) uma elevada prevalência de MNT de importância clínica acometendo em sua maioria pacientes soropositivos; b) que cerca de 25% dos pacientes com MNT foram tratados como TB, e c) o kit comercial Genotype® Mycobacterium CM/AS detectou a espécie de MNT em 89% das amostras. Torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV. Palavras-Chaves: Prevalência, micobacterias não tuberculosas, tuberculose, técnicas moleculares, Região Norte, HIV/AIDS.

ABSTRACT

In industrialized countries, with the decline in the incidence of tuberculosis (TB), there has been an increase in cases of non-tuberculous mycobacterial (NTM) infections. The use of laboratory-based methods of NTM based on molecular tests has been valued, since the absence of adequate diagnosis in patients suspected of mycobacterial infection can lead to inadequate treatment, promote drug resistance, failure of therapy and death. In countries with high TB burden, data on the prevalence of NTM infection in HIV / AIDS TB patients are scarce, as in the Northern region of Brazil. It is estimated that underreporting of cases is a non-notifiable disease. The objective of this study was to describe cases of NTM in patients suspected of TB treated at the Heitor Vieira Dourado Tropical Medicine Foundation (FMT-HVD), a reference for HIV / AIDS, from 2011 to 2014. Of the patients treated, 758 clinical samples positive for mycobacteria, of these 153 (20.2%) were MNT positive. The majority of patients were male (66%), HIV infected (77%) receiving antiretroviral therapy (26.7%), with a median CD4 count of 244 cells / mm3. Among these samples it was possible to recover from the cryogenic 56 (36.6%) isolates for molecular identification of the species. The identification of MNT species was obtained by GenoType® Mycobacterium CM / AS, PRA hsp65 (PRA) and sequencing, respectively, in 50 (89.3%), 37 (66%) and 43 (76.8%) samples analyzed. Agreement between the PRA technique and the GenoType was 81%, between the GenoType and the 76% sequencing and between the PRA and the 74% sequencing. The species most frequently identified were: Mycobacterium gordonae in 17 (30.4%), M. fortuitum in 11 (19.6%), M. avium / intracellulare in 10 (17.9%), M. abscessus in 6 (10.7%) M. kansasii in 3 (5.3%). Among the 56 patients with NTM, 13 (23.2%) received inappropriate treatment for TB and were notified at SINAN. Death was identified in 5 (9%) patients. Based on these findings, we observed: a) a high prevalence of NTM of clinical importance, most of them being seropositive; b) that about 25% of the NTM patients were treated as TB, and c) the Genotype® Mycobacterium CM / AS commercial kit detected the MNT species in 89% of the samples. It is urgent to implement molecular techniques for the diagnosis of NTM in patients suspected of TB seen in reference to HIV.

Keywords: Prevalence, non-tuberculous mycobacteria, tuberculosis, molecular techniques, Northern Region, HIV / AIDS

RESUMO LEIGO

Em alguns países muitas pessoas adoeceram por micobactérias não tuberculosas (MNT), aquelas que não causam a tuberculose (TB), mas os sintomas e o exame são parecidos. Para saber mais rápido se a pessoa está realmente doente por elas verifica-se o DNA dessa bactéria, mas a falta desse tipo de exame por ser caro e ainda não disponível a todos pode levar ao tratamento errado (remédio para o tratamento da tuberculose), a pessoa não curar e até mesmo à morte. Nos lugares onde há muita gente doente com tuberculose, são poucas as informações sobre as pessoas doentes por MNT, acredita-se que pela falta de notificação desses casos como na região Norte do Brasil. O objetivo desse estudo foi descrever os casos de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), referência para HIV/Aids, no período de 2011 a 2014. Foram analisadas 758 amostras positivas para micobactérias, destes 153 (20,2%) foram positivas para MNT. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (66%), infectados por HIV (77%), estavam em tratamento para o HIV (26,7%). Desses casos foi possível recuperar do congelamento, 56 (36,6%) amostras para análise. A identificação da espécie de MNT foi através da análise do DNA. As espécies identificadas em maior frequência foram: Mycobacterium gordonae em 17 (30,4%), M. fortuitum em 11 (19,6%), M. avium/intracellulare em 10 (17,9%), M. abscessus em 6 (10,7%) M. kansasii em 3 (5,3%). Entre os 56 pacientes com MNT, 13 (23,2%) receberam tratamento errado e foram notificados no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) como doentes com tuberculose, 5 (9%) desses pacientes morreram. Torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV. Palavras-Chaves: Prevalência, micobacterias não tuberculosas, tuberculose, técnicas moleculares, Região Norte, HIV/AIDS.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Baciloscopia – Bacilos em esfregaço de amostra de escarro corado por técnica Ziehl-Neelsen ...................................................................................................................16

Figura 2. Esfregaços de cultura de micobactérias ...........................................................33

Figura 3. Colônias cepas MNT positivas fotocromógenas, acromógenas e escotocromógenas ...........................................................................................................34

Fluxograma 1. Informações de positividade em cultura e identificação laboratorial por método convencional (teste fenotípico e bioquímico) no período de 2011 a 2014............58 Fluxograma 2. Etapas do procedimento laboratorial .........................................................59 Gráfico 1 Distribuição dos casos de HIV em pacientes suspeitos de TB com amostra positiva para MNT..............................................................................................................59

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Distribuição de isolados respiratórios de micobactérias não tuberculosas (NTM)..............25

Tabela 2. Definição de caso de infecção por MNT ...............................................................30

Tabela 3. Diagnóstico de doença pulmonar por MNT ..........................................................32

Tabela 4. Classificação das MNT segundo o sistema de Runyon .......................................35

Tabela 5. Informações sobre os resultados de baciloscopia, Xpert MTB/RIF e testes moleculares de identificação de espécie realizados .............................................................60

Tabela 6. Análise de Kappa entre as técnicas moleculares .................................................60

Tabela 7. Distribuição das espécies de MNT identificadas e sorologia para HIV.................61

Dados complementares

Tabela 1 Características basais dos indivíduos com isolados positivos para MNT .............62 Tabela 2 Informação sobre tratamento anti-TB e MNT ........................................................62

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA

AIDS – Síndrome da imunodeficiência humana adquirida

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BCG - Bacillus Calmette-Guérin

BAAR – Bacilo álcool-ácido resistente CTAB – Brometo de cetrimônio DPOC - Doença pulmonar crônica DNA - Ácido desoxirribonucleico EUA - Estados Unidos

HIV - Vírus da imunodeficiência humana

LJ - Lowenstein Jensen LACEN - Laboratório Central de Saúde Pública

MgCl2 – Cloreto de magnésio

MNT - Micobactérias não causadoras de tuberculose

M.tb - Mycobacterium tuberculosis MCR -Micobactérias de crescimento rápido MCL - Micobactérias crescimento lento

OMS - Organização Mundial de Saúde

PPD - Prova tuberculínica

PCR – Reação da cadeia da polimerase PRA-hsp65 – Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65 PCT - Programa de Controle da Tuberculose PNB - Ácidop-nitrobenzóico PAS - Ácido p-aminosalicílico RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism RIF - Rifampicina

SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação

SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde

TB – Tuberculose

TB/HIV – Coinfecção TB/HIV

TB-XDR - Tuberculose extensivamente resistente

ZN - Ziehl-Neelsen

μm - Micrometro

mol – Molaridade/mole

mm³ - Milímetro cúbico

mL - Microlitro

pmol - Picomol

u – Unidade de massa atômica

pb – Pares de base

mM – Milimol

μl - Microlitro

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 16

1.1. Classificação do gênero Mycobacterium........................................................... 16 1.2. Relação clínica entre as Micobactérias e o HIV/AIDS.......................................17 1.3. História e evolução das Micobactérias não tuberculosas .................................18 1.4. Doença causada pelas Micobactérias não tuberculosas (MNT) ....................... 19 1.5. Transmissão e formas clínicas da doença por MNT .......................................... 21 1.6. Epidemiologia das micobactérias não tuberculosas ........................................ .23

1.6.1. Dados mundiais .......................................................................................... 23 1.6.2. Dados da América Latina e Brasil ............................................................... 25 1.6.3. Dados da região Norte do Brasil ................................................................. 27

1.7. Diagnóstico clínico e epidemiológico das MNT ................................................ 29 1.8. Diagnóstico laboratorial das MNT .................................................................... 30

1.8.1. Separação das espécies do Complexo M. tuberculosis das micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT): .................................................................... 32

1.8.2. Identificação fenotípica das espécies de MNT: ........................................... 33 1.8.3. Identificação genotípica das MNT: ............................................................ 35

2. OBJETIVO.............................................................................................................39 2.1. Geral:................................................................................................................ 39 2.2. Específicos: .......................................................................................................39

3. MATERIAIS E MÉTODOS. ............................................................................... 40

3.1. Modelo e período de estudo: ............................................................................ 40

3.2. Amostras clínicas: ............................................................................................ 40 3.3. População de referência: .................................................................................. 40 3.4. Critérios de elegibilidade: ................................................................................. 41 3.5. Definições para confirmação laboratorial dos casos de Micobactéria não tuberculosa: ............................................................................................................. 41 3.6. Critérios de não inclusão: ................................................................................. 41 3.7. Procedimento laboratorial: ................................................................................ 42

3.7.1 Identificação fenotípica:................................................................................ 42 3.7.2. Identificação genotípica:.............................................................................. 42

3.8. Coleta e análise de dados ................................................................................. 44 3.9. Considerações éticas: ....................................................................................... 45

4. RESULTADOS .....................................................................................................45 5. DISCUSSÃO .........................................................................................................62 6. CONCLUSÃO .......................................................................................................63 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................ .................................................. 65

APÊNDICE.................................................................................................................71 Apêndice A - Equipe...................................................................................................72 Apêndice B - Cronograma..........................................................................................73 Apêndice C - Orçamento............................................................................................74 Apêndice D – Procedimento operacional para extração de DNA de Micobactérianão tuberculosa por CTAB.................................................................................................76

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Apêndice E - Procedimento operacional padrão para o congelamento e recuperação de cepa de Micobactéria não tuberculosa ............................................................. ..79 Apêndice F - Procedimento operacional padrão para a identificação fenotípica das Micobactérias não tuberculosas por tempo de crescimento e pigmentação ........... 82 Apêndice G - Procedimento operacional padrão para inativação e extração de DNA por termobloco de Micobactéria não tuberculosa .................................................... 86 Apêndice H - Procedimento operacional padrão para identificação molecular pelo método PRA-hsp65 ..................................................................................................88 Apêndice I - Procedimento operacional para técnica de purificação de DNA para sequenciamento utilizando PED 8000/ 2,5 M NaCl ................................................. 95 Apêndice J – Procedimento operacional padrão para teste de genética molecular para identificação a partir de material de cultura de espécies de Micobactérias (GenoType Mycobacterium CM/AS) .......................................................................................... 97 ANEXO ...................................................................................................................103 Anexo A - Parecer consubstanciado do CEP.........................................................104 Anexo B - Modelo da ficha de notificação da Tuberculose ...................................105 Anexo C - Termo de Dispensa do Consentimento Livre e Esclarecido (TDCLE) .................................................................................................................................106 Anexo D - Termo de Compromisso de Utilização de Dados (TCUD) .....................107 Anexo E - Carta de Anuência .................................................................................108

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Classificação do gênero Mycobacterium

As micobactérias são classificadas no gênero Mycobacterium com base na sua

característica ácido resistente, na presença de ácidos micólicos e no alto conteúdo de

guanina e citosina no seu DNA. Sua característica álcool-ácido resistente é

visualizada por meio da técnica de coloração Ziehl-Neelsen (ZN), onde um esfregaço

da amostra biológica em lâmina é confeccionado, corado e visualizado em

microscópio óptico (Figura 1) (1,2).

Figura 1: Baciloscopia – Bacilos em esfregaço de amostra de escarro corado por técnica Ziehl-

Neelsen.

Fonte: Gerencia de Tuberculose – FMT/HVD.

Taxonomicamente, pertencem à família Mycobacteriaceae, ordem

Actinomycetales, subordem Corynebacterineae, classe e filo Actinobacteria. É

composto por 165 espécies divididas em três grupos: Mycobacterium leprae;

micobactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis e outras que não pertencem

a esse complexo, denominadas micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT)

(1,25). O gênero Mycobacterium também é classificado de acordo com sua

capacidade de produzir doença no homem ou grupo de risco, como raramente

patogênicas, potencialmente patogênicas e patogênicas.

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1.2. Relação clínica entre as Micobactérias e o HIV/AIDS

As espécies de micobactérias que apresentam elevada importância clínica por

causar doença pulmonar, extrapulmonar e disseminada são as pertencentes ao

complexo Mycobaterium tuberculosis e as MNT (2). Ambas apresentam alta

relevância clínica, conferem ao hospedeiro infecção potencialmente grave, possuem

diagnóstico clínico e laboratorial semelhantes e apresentam mecanismos de

transmissão e tratamento distintos (17).

Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) cerca de 10,4 milhões

de pessoas tiveram tuberculose em 2016, cerca de 1,2 milhões de pessoas

apresentam coinfecção TB/HIV e 1 milhão morreram por conta da doença. No ano de

2016, foram diagnosticados e registrados 66.796 casos novos de tuberculose no Brasil

com coeficiente de incidência de 32,4/100.000 habitantes. O Estado do Amazonas

registrou coeficiente de incidência de 67,2/100.000 hab. e ultrapassando o Amazonas,

a capital Manaus apresentou coeficiente de incidência de 93,2/100.000 hab. chegando

a ultrapassar os valores regionais e nacionais para o mesmo período. Os resultados

de testagem para HIV entre os casos novos de TB no Brasil, apontaram para a

existência de 9,7% de pessoas com a coinfecção TB-HIV. Cerca de 73,2% dos casos

novos de tuberculose realizaram testagem para o HIV no Brasil, seguido do Amazonas

com 68,8% e em Manaus com 71,8% (89).

O HIV continua sendo um grande problema de saúde pública mundial, em 2016

foram registrados 2,1 milhões de novas infecções. No Brasil, neste ano, estima-se que

tenham ocorrido 48.000 [35.000 – 64.000] novas infecções por HIV, com prevalência

de 0,4% a 0,7% em pessoas de 15 a 49 anos – em 2014 (97).

De 2007 até junho de 2016, foram notificados no SINAN 6.868 casos de infecção

por HIV na Região Norte (6,3%). A taxa de detecção de HIV/AIDS na Região Norte

do Brasil tem apresentado uma tendência linear de crescimento significativo; em 2006

a taxa registrada foi de 15,0 casos para cada 100 mil habitantes, enquanto que no

último ano a taxa foi de 24,0 representando um aumento de 61,4% (98).

Isoladamente, as infecções por TB e HIV são as principais causas de mortes por

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doenças infecciosas. A TB é responsável por um terço das mortes relacionadas com

o HIV/AIDS a cada ano (24).

Até o surgimento da HIV/AIDS não se atribuia grande importância às infecções

por MNT, os relatos de doenças pulmonares causadas por esse grupo eram

esporádicos (28). Em países industrializados, com uma alta carga de TB, onde o foco

tem sido a realização apenas da baciloscopia, a prevalência de MNT em sujeitos com

HIV permanece desconhecida, é relatada a baixa realização de cultura para

micobactéria na rotina e a dificuldade na elucidação devido a coinfecção MNT/TB,

com isso é frequente o uso do tratamento de probabilidade (empírico, sem

confirmação), e portanto, uma proporção desconhecida de pacientes podem, de fato,

estar infectada com MNT. Mesmo com a introdução do Xpert MTB Rif a partir de 2014,

nos resultados positivos, confirma-se TB, mas nos resultados negativos não se afasta

a ocorrência de MNT (67).

O impacto das MNT na morbidade e mortalidade dos doentes com HIV/AIDS,

estimulou o início de estudos relacionados à epidemiologia, ecologia, genética,

biologia molecular e fisiologia das MNT. Além, disso a rápida ascensão das doenças

provocadas pelas MNT estimulou o desenvolvimento de métodos rápidos para o seu

isolamento e identificação (72).

1.3. História e evolução das Micobactérias não tuberculosas

Estudos revelam que a doença por micobactéria acomete a população humana há

milhares de anos, sendo as primeiras evidências referem-se ao estudo de 44 múmias

egípcias de faraós jovens, datando de 3.700 a 1.000 A.C. (31). A primeira descrição

das micobactérias causando doença no homem ocorreu em 1873, quando o físico

norueguês Gerhard Armauer Hansen descreveu alguns “corpos em forma de hastes”

a partir de biópsia de paciente com hanseníase (32).

A maioria das espécies de MNT foi descrita no século passado. A designação de

micobactérias “atípicas” foi utilizada pela primeira vez por Pinner, em 1935, referindo-

se às características distintas que apresentavam em relação ao complexo M. tb e a

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M. leprae, em particular ao fato de não serem agentes patogênicos obrigatórios e de

se encontrarem habitualmente no meio ambiente (17).

No Brasil, a importância clínica das MNT foi reconhecida na década de 1938

quando Costa Cruz descreveu o primeiro caso de M. fortuitum isolado de um abscesso

cutâneo (29). Após uma década, MacCallum descreveu uma doença de pele causada

por uma nova espécie de micobactéria, classificada mais tarde como M. ulcerans. Em

1949, Cuttino e McCabe descreveram um novo microrganismo causando infecção

disseminada em uma criança, logo nomearam como ″Nocardia intracellularis”, porém

mais tarde foi classificada como M. intracellulare por Runyon (30).

Em 1951, Norden e Linell descreveram “Mycobacterium balnei″ presente em

granuloma, posteriormente reconhecido como M. marinum (29). O termo

“micobactérias não tuberculosas” foi utilizado pela primeira vez em 1954 por Timpe e

Runyon para identificar e diferenciar todas as micobactérias não pertencentes ao

complexo M. tuberculosis e M. leprae (30). Com o avanço dos métodos e técnicas de

identificação, muitas outras espécies de micobactérias foram descobertas e

classificadas.

1.4. Doença causada pelas Micobactérias não tuberculosas (MNT)

Os mais importantes complexos de espécies de MNT causadoras de doença no

homem são: o complexo M. avium (MAC), o complexo M. fortuitum, complexo M.

celatum, complexo M. abscessus, complexo M. kansasii, complexo M. terrae,

complexo M. simiae e o complexo M. smegmatis (25,37).

Complexo MAC: É composto por espécies capazes de causar doenças em animais

e seres humanos, incluem as espécies M. avium, M. intracellulare, M. colombiense,

M. chimaera, M. yongonense (101). Nos hospedeiros imunocompetentes, o MAC afeta

os pulmões em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), podendo

causar fibrose pulmonar ou doença pulmonar cavitária (DPC). Em hospedeiros

imunodeprimidos, no caso do HIV/AIDS, pode originar infecção sistêmica, causando

sobretudo doença disseminada. A espécie M. avium normalmente é isolado de

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ambientes como água potável, que se acredita ser uma fonte de infecção para os

doentes soropositivos para HIV (37,38).

Complexo M. fortuitum: O complexo M. fortuitum compreende as espécies M.

fortuitum, M. peregrinum, M. mageritense (101). Essas espécies são de crescimento

rápido, geralmente habitam o solo, poeira e água. A identificação dessas

micobactérias é importante para estabelecer a terapêutica adequada, visto que

possuem diferentes padrões de resistência aos farmacos. As doenças causadas por

essas espécies incluem raramente as formas pulmonares (56).

Complexo M. abscessus: O complexo M. abscessus é constituído por três espécies:

M. chelonae, M. abscessus e M. immunogenum (101). São frequentemente

resistentes a fluorquinolonas, sulfametoxazol, doxiciclina e sensíveis a claritromicina,

amicacina, tigeciclina e imipenem. Em 2001, M. immunogenum foi descrita e isolada

pela primeira vez de fluídos utilizados para a lubrificação e arrefecimento de máquinas

industriais (41). Causa doença pulmonar em indivíduos com comprometimento

pulmonar prévio como TB anterior e fibrose cística além de causar infecções pós-

operatórias e pós-procedimentos causando doenças de pele e tecidos moles,

infecções do sistema nervoso central, bacteremia e infecções oculares (42).

Complexo M. terrae: O complexo M. terrae é composto pelas espécies M. terrae,

M. nonchromogenicum, M. hiberniae, M. sinense, M. senuense, M. engbaekii (101). A

colonização do epitélio humano por estas micobactérias é rara e geralmente são

consideradas como não patogênicas, no entanto em casos de imunossupressão, M.

nonchromogenicum pode ocasionalmente causar doença no homem, tais como

infecções pulmonares e tendinopatia. Nos últimos anos um número crescente de

infecções causadas por estes organismos foi associado à coinfecção com HIV/AIDS

(48).

Complexo M. kansasii: O complexo M. kansasii inclui as espécies M. gastrii e M.

kansasii (101). O M. kansasii é uma micobactéria não tuberculosa que pode causar

colonização ou doença pulmonar (100).

21

Complexo M. simiae: O complexo M. simiae é composto por várias espécies

filogeneticamente relacionadas, as quais incluem: M. interjectum, M. florentinum, M.

sherrisii, M. triplex, M. palustre, M. bohemicum, M. nebraskense, M. europaeum (101).

Este complexo pode apresentar manifestações clínicas e imagens pulmonar no

radiograma torácico semelhantes ao da TB e resistência aos fármacos anti-TB

associada a indivíduos com TB anterior (99).

1.5. Transmissão e formas clínicas da doença por MNT

Existem poucos relatos sobre a transmissão direta de pessoa para pessoa, por

meio de tosse ou espirro. Há relatos de infecção adquirida a partir do meio ambiente,

pela ingestão ou inalação de água e por meio de inoculação provocada pela

inadequada desinfecção e manuseio de equipamentos médicos em procedimentos

cirúrgicos, vacinação e videocirurgias (6). Procedimentos invasivos como acupuntura,

tatuagens e piercings também são relatados como possíveis focos de transmissão

(33). Por meio da análise de DNA verificou-se que estripes de várias espécies

recuperadas a partir de amostras ambientais de água, solo e aerossóis, eram idênticas

às isoladas de vários doentes (22).

Indivíduos com doenças cardiovasculares, hepatite C, HIV/AIDS, transplantes,

diabetes, alterações estruturais pulmonares como a Doença pulmonar obstrutiva

crônica (DPOC), câncer, imunossupreção genética, artrite reumatóide e doença do

refluxo gastroesofágico (DRGE) apresentam predisposição a desenvolver infecção

por MNT. As manifestações clínicas da infecção por MNT compreendem as formas

pulmonar, extrapulmonar e disseminada, pois acomete pele, órgãos, trato respiratório,

sangue, medula e ossos (68).

Forma pulmonar: A partir dos anos 80, começaram a surgir relatos de grandes

séries de doenças pulmonares causadas por MNT, em sua maioria associada à

imunossupressão (28). A infecção pulmonar por MNT, foi descrita pela primeira vez

em fumantes idosos do sexo masculino com alterações estruturais pulmonares

(doença pulmonar cavitária ou enfisema). A DPOC, a bronquiectasia, o enfisema, a

pneumoconiose, a tuberculose anterior, a silicose, a proteinose alveolar pulmonar e a

deficiência de α-1-antitripsina são alguns dos principais determinantes do

22

desenvolvimento de infecção pulmonar por MNT no início da fase adulta. Embora a

fibrose cística, causada por mutações no regulador da condutância

transmembrana na fibrose cística (CFTR) e a discinesia ciliar primária (doença

autossômica recessiva), geralmente presentes na infância ou adolescência, também

causem susceptibilidade, nos casos de alguns pacientes com mutações hipomórficas

as infecções podem ter apresentação tardia ou atípica (8,69). Os casos da doença

pulmonar por MNT em imunocompetentes estão em sua maioria associados ao

trabalho em condições de constante exposição a poeira. Nestas situações clínicas, as

características da doença pulmonar por MNT é muito semelhante as da TB (36).

Existem casos onde ocorre a repressão habitual da tosse favorecendo o

desenvolvimento de infecção pulmonar por MNT, esses casos são associados a

doenças neuromusculares, sequelas de acidente vascular cerebral e a síndrome de

Lady Windermere. Essa síndrome ocorre principalmente em mulheres, não-fumantes

e na pós-menopausa, sem qualquer fator predisponentes conhecido, as pacientes,

tendem a apresentar escoliose, depressão do esterno, costelas na frente do tórax

(Pectus Excavatum) e prolapso da válvula mitral (9). O lobo médio e língula estão

predispostos a inflamação crônica por causa de suas estruturas anatômicas

específicas e incapacidade para limpar as secreções das vias respiratórias devido à

supressão da tosse, predispondo a bronquiectasia e infecção (8, 70).

Forma extrapulmonar: Em indivíduos adultos e imunocompetentes, as infecções

causadas pelas MNT na pele, articulações, tendões e nos ossos estão

frequentemente associadas com traumatismos e feridas cirúrgica (73, 30). Em

crianças, os locais de infecção mais frequentes são a pele e os nódulos linfáticos. As

infecções causadas por M. haemophilum ou M. chelonae são geralmente

caracterizadas por nódulos subcutâneos ou abcessos.

Forma disseminada: Em doentes soropositivos para HIV, a doença provocada

pelas MNT é geralmente disseminada (71). Nos casos de pacientes soronegativos

para HIV, déficit na resposta celular Th1 associados a defeitos imuno genéticos, como

mutações autossômicas das interleucinas (IL), interferon (IFN) e seus receptores

específicos (IL12, IL12RB1, ISG15, IFNGR1, IFNGR2, STAT1 e IRF8), mutações no

cromossomo X (IKBKG e CYBβ), deficiência GATA2 e auto-anticorpos anti-IFN-γ,

23

predispõem susceptibilidade, tanto na infância quanto na idade adulta, levando a óbito

quando não tratada precocemente e/ou de maneira correta (8).

1.6. Epidemiologia das micobactérias não tuberculosas

1.6.1. Dados mundiais

A frequência das descrições dos casos de infecções por MNT vem aumentando

juntamente com o declínio significativo da taxa de incidência de TB em países

industrializados. Em contraste com o M. tuberculosis, cuja notificação é obrigatória no

mundo, as infecções por MNT ainda não geram notificação, fora os casos de MNT pós

cirúrgia. A ausência de vigilância epidemiológica resulta na escasses de dados sobre

a sua incidência, prevalência incidência, morbi/mortalidade, e os fatores associados

(52). Os sintomas gerais causados pelas MNT não podem ser distinguidos de

sintomas observados em casos de TB, e as aparências das bactérias não podem ser

diferenciadas quando examinadas por microscopia de luz (78). Portanto, há consenso

entre os autores de que é fundamental o diagnóstico laboratorial das MNT, pois a

sintomatologia, imagens no radiograma torácico e resultados da baciloscopia não

permite dinstingui-las de infecção por TB.

A não realização de cultura para micobactéria ou a não identificação das espécies

de micobactéria nos exames de cultura positiva para micobactéria podem levar a

resultados falso-positivos para diagnóstico de TB e tratamento medicamentoso

inadequado para o controle micobacteriano (77).

Na detecção das espécies pertencentes às MNT, um estudo na Ásia, revelou que

MAC foi a principal causa de infecção pulmonar, correspondendo à 68% dos casos

(50). Em 2002, avaliando a prevalência de doença pulmonar por MNT no mundo, foi

observado uma predominância de MAC entre os agentes causadores de doença

pulmonar também na Ásia (51).

A infecção pulmonar por MNT pode estar associada à mortalidade em Unidades

de Terapia Intensiva (UTI), o tratamento anti-MNT é a solução adequada para

melhores resultados de terapia. Em um estudo retrospectivo na UTI de um centro

24

médico em Taiwan, de janeiro de 1999 a junho de 2007, foi descrito que as infecções

pulmonares por MNT estavam relacionadas, em sua maioria, as espécies do

complexo M. avium e M. abscessus. A proporção de mortalidade em 5 anos foi em

torno de 34-69% (53).

Numa revisão sistemática e meta- análise realizada em 2015, foi relatada uma

prevalência relativamente alta de infecções por MNT (10,2%) entre os casos positivos

para TB, isso demonstrou a necessidade de uma maior aplicação de estratégias de

controle da infecção, estabelecimento de critérios de diagnóstico apropriados e

diretrizes para o manuseio de doenças por MNT além de expandir a qualidade dos

laboratórios de referência regionais facilitando mais a prevenção e controle dessas

infecções (3).

Num estudo mais recente, com a colaboração mundial de 62 laboratórios, realizado

pelo MNT-Network European TrialsGroup (MNT-NET) junto ao Tuberculosis Network

European TrialsGroup (TB-NET) avaliou-se em 30 países e em 6 continentes (Europa,

Ásia, América do Norte, América do Sul, África do Sul e Austrália) 20.182 pacientes

positivos para MNT, cultivadas em meio de cultura sólido provenientes de amostras

respiratórias de escarro. Nesse estudo os membros do complexo MAC predominaram

na maioria das regiões embora M. xenopi na Hungria e M. kansasii na Polônia e na

Eslováquia. A distribuição relativa dos membros do complexo MAC revelou diferenças

geográficas, enquanto M. avium predominava nos centros da América do Norte,

América do Sul e na Europa, M intracellulare foi frequentemente isolada na África do

Sul e Austrália. Na América do Sul o complexo MAC correspondeu a 31% dos

isolados, seguido de M. abscessus e M. fortuitum com 16%, M. kansasii foi a segunda

espécie mais isolada na América do Sul e M. gordonae a terceira mais isolada (Tabela

1).

25

Tabela 1. Distribuição de isolados respiratórios de micobactérias não tuberculosas (NTM).

Distribuição de MNT Distribuição de MAC

Europa MAC (37%), MCR (16%), M. gordonae

(17%), M. kansasii (5%), M. xenopi (14%),

M. malmoense (1%), MCL (10%)

M. avium (47%), complexo M.

avium (22%), M. intracellulare

(8%).

América

do Norte

MAC (52%), MCR (20%), M. xenopi (12%),

M. gordonae (12%), MCL (3%), M. kansasii

(1%).



(8%).

América

do Sul

MAC (31%), MCR (21%), M. kansasii

(20%), M. gordonae (17%), MCL (11%).



(13%).

Autrália MAC (71%), MCR (15%), MCL (8%), M.

kansasii (4%), M. gordonae (1%).

M. intracellulare (80%), M.

avium (20%).

Ásia MAC (54%), MCR (31%), MCL (6%), M.

gordonae (6%), M. kansasii (3%).



(16%).

África do

Sul

MAC (50%), MCL (33%), MCR (7%), M.

gordonae (5%), M. kansasii (3%), M. xenopi

(1%).

M. intracellulare (77%), M.

avium (21%), complexo M.

avium (2%).

Total MAC (47%), MCR (16%), MCL (14%), M.

gordonae (11%), M. xenopi (8%), M.

kansasii (3%), M. malmoense (1%).

M. avium (47%), M.

intracellulare (38%), complexo

M. avium (15%).

*MCR: micobactérias de crescimento rápido; MCL: micobactérias de crescimento lento.

Fonte: MNT-Network European TrialsGroup (MNT-NET).

A distribuição das espécies de MNT em um país pode ter profundo impacto sobre

as frequências e manifestações da doença pulmonar por MNT em cada região sendo

necessários estudos futuros para abordar os diferentes nichos ambientais específicos

de cada espécie (96).

1.6.2. Dados da América Latina e Brasil

Na prática clínica diária é observado um número crescente de cirurgias cosméticas

realizadas principalmente na América Latina e Caribe associado com o aumento no

número de casos de infecções por MNT (55). Houve relatos de focos de infecções por

26

M. abscessus em feridas cirúrgicas resultantes de procedimentos de abdominoplastia

na República Dominicana e Colômbia (54). O envolvimento da espécie M. fortuitum

em infecções de sítio cirúrgico é bem documentado, pode ocorrer em ferida esternal

após cirurgia cardiotorácica ou após cirurgia de aumento de mama devido a

contaminação da ferida com água da torneira contaminada, no ato do banho (56,57).

Recentemente tem sido descrito infecções por MNT em idosos após uso da banheira

“escalda-pés” em salões de manicure e pedicure (58,59).

Na América Latina,um estudo realizado em 2014 em um hospital na Colombia,

descreveu a prevalência dos casos de MNT em 9,1%, onde o principal fator de risco

foi a infecção pelo HIV sendo a forma clínica pulmonar a mais predominante (56,6%)

(52).

No Brasil são escassos os casos publicados de infecções por MNT, as

publicações em sua maioria referen-se a ceratite por M. chelonae, após cirurgia para

correção de miopia, infecções cutâneas por M. abscessus e M. fortuitum após

aplicações em mesoterapia ou cirurgia plástica e publicações sobre o risco crescente

de infecções por essas espécies de micobactérias em pacientes submetidos a

procedimentos médicos invasivos. Em razão da não obrigatoriedade da notificação,

estima-se que no Brasil ocorra subnotificação de MNT associada às cirurgias (33).

No Estado do Rio de Janeiro, entre 1993 e 2011 as espécies de MNT mais foram

M. kansassi (33,9%) e complexo MAC (30,4%) destes 9,8% eram soropositivos para

o HIV (61). Em um estudo no estado de São Paulo, foram estudadas 1.892 cepas de

MNT entre os anos de 1991 a 1997, desse estudo foi possível estabelecer as

manifestações clínicas ocorridas naquele período, 48% foram de origem pulmonar,

29,3% sangue e medula óssea e 15,8% de outras formas extrapulmonares, a

associação desses casos com o HIV não foi descratada (28).

Segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), no período

de 1998 a 2009,foram notificados cerca de 2.520 casos de infecção por micobactérias

de crescimento rápido (MCR), sendo 1.107 casos relatados no estado do Rio de

Janeiro, 363 no Espírito Santo, 327 no Pará,193 em São Paulo,149 no Paraná,115 no

Rio Grande do Sul, 95 em Goiás, 50 no Mato Grosso, 33 no Distrito Federal,31 em

27

Minas Gerais,11 no Piauí,11 na Bahia, 9 no Ceará,6 em Santa Catarina, 5 em Sergipe,

5 em Pernambuco, 3 em Alagoas, 2 no Tocantins, 1 em Roraima, 1 no Rio Grande do

Norte, 1 na Paraíba, 1 no Amazonas e1 no Acre (6,63).

Entre as micobactérias de crescimento rápido o agente etiológico prevalente na

maioria das cidades brasileiras foi a M. massiliense, exceto nas infecções secundárias

a mamoplastias, nas quais a maior prevalência foi de M. fortuitum. Outras espécies

de MCR foram identificadas: M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae, M. smegmatis e

M. wolinskyi (62,63). Mesmo com o número elevado de casos notificados de infecção

por MCR, entre as espécies potencialmente patogênicas, as micobactérias de

crescimento lento (MCL) pertencentes ao complexo MAC e M. kansasii são as mais

comumente isoladas no Brasil, ambas causam principalmente infecção pulmonar (63).

1.6.3. Dados da região Norte do Brasil

Um estudo realizado na Região Norte do Brasil, mais precisamente no estado de

Roraima, avaliou no período de dois anos, 1.812 casos suspeitos de TB pulmonar.

Nesse estudo foi possível identificar causando doença pulmonar 369 (20%) casos

positivos para TB e 75 (4%) casos positivos para MNT. Dentro do último grupo foi

possível identificar 14 espécies por meio de métodos de diagnóstico molecular: M.

abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. gilvum, M. gordonae, M.

asiaticum, M. tusciae, M. porcinum, M. novocastrense, M. simiae, M. szulgai, M. phlei

e M. holsaticum. Nesse estudo 13 isolados não puderam ser identificados a nível de

espécie devido as limitações de reprodutibilidade que o método de cultura sólida

impõe (65).

No Estado do Pará, em dados coletados nos anos de 1999 a 2010, observou-se

que a espécie predominante nas formas clínicas pulmonares foi a M. massiliense. No

período de janeiro de 2010 a dezembro de 2011, M. massiliense foi novamente a

espécie mais encontrada, com 44,8% dos casos (66).

Em 2013, outro estudo, realizado em Belém do Pará, 64,2% dos pacientes que

manifestaram doença por MNT tinham acesso a um abastecimento de água por meio

de sistemas de tubulações. Esta informação é importante porque, mesmo em zona

28

urbana, o abastecimento de água ainda é precário, cerca de 75% dos lares tem acesso

a um abastecimento de água, sendo menor a cobertura em áreas urbanas periféricas,

de acordo com o Censo Brasil 2010 (67).

Na cidade de Manaus, em 2009, num outro estudo investigou-se a presença de

MNT em águas de torneira, soluções e luvas cirúrgicas, utilizadas nas etapas dos

procedimentos cirúrgicos executados no centro cirúrgico do Hospital Universitário

Getúlio Vargas (HUGV). Foram coletadas e analisadas 105 amostras sendo: 24 de

águas (coletadas das 2 torneiras existentes no centro cirúrgico), 8 de solução de

povidine e 7 de solução de clorhexidina, que servem para a higienização das mãos

dos cirurgiões; 39 de luvas cirúrgicas (superfícies internas e externas); e 27 de

soluções que foram efetivamente utilizadas durante o ato cirúrgico. Obteve-se 41

isolados micobacterianos apenas de águas das torneiras. O não isolamento de MNT

nas soluções utilizadas para higienização das mãos e luvas dos cirurgiões bem como

nos procedimentos cirúrgicos, indica que essas soluções têm sido eficazes na

eliminação de micobactérias. Entretanto, a presença de M. mucogenicum nas águas

das torneiras do centro cirúrgico, espécie já associada a surtos pós-cirúrgicos, indica

que devem ser efetuados procedimentos de limpeza e monitoramento em todos os

pontos de distribuição de águas, visando à prevenção de surtos de micobacterioses

nosocomiais (91).

Na Região Amazônica, a predominância de pessoas da cor parda está

relacionada a alta heterogenia, essa diversidade genética pode estar associada ao

aumento da susceptibilidade a desenvolver infecção por MNT, porém são necessários

mais estudos para comprovação. Sabe-se que pescadores e outras pessoas expostas

aos peixes estão em risco de desenvolver infecções de pele causadas por M.

marinum. Em crianças de 18 meses a 5 anos de idade o risco de desenvolver

linfadenite cervical por M. avium está associado a exposição a viveiros de aves. A

imunodeficiência, também é um fator de risco para a população dessa região, devido

à infecção pelo HIV ou imunossupressão nos casos de câncer e quimioterapia (67).

29

1.7. Diagnóstico clínico e epidemiológico das MNT

Os sintomas da doença pulmonar por MNT são variáveis e não específicos em

alguns casos, nos quais o diagnóstico laboratorial não pode ser realizado, o médico

pode confirmar o caso pelo critério clínico-epidemiológico. No entanto, praticamente

todos os pacientes tem tosse crônica ou recorrente como na TB. Outros sintomas

incluem tosse com expectoração, fadiga, mal-estar, dispneia, febre, hemoptise, dor no

peito e perda de peso. Nesses casos o curso da doença é progressivo, causando

sintomas persistentes, declínio da função pulmonar e uma piora na qualidade de vida.

Além disso, pode também seguir um curso fulminante com insuficiência respiratória

aguda (64).

O estabelecimento de um diagnóstico de doença por MNT não é simples, o seu

isolamento em amostras pulmonares e extrapulmonares não é por si só, diagnóstico

de doença, devido contaminação transitória, exigindo o cumprimento dos critérios

clínicos e microbiológicos, tais como a presença de sintomas clínicos, evidência

radiográfica de lesões compatíveis com doença para as definições de caso sejam

feitas. Na tabela 2 estão descritos os critérios de patogenicidade das MNT de

crescimento rápido proposto pela ANVISA (63,74).

30

Tabela 2. Definição de caso de infecção por MNT:

Suspeito Possível Provável Confirmado

Paciente

submetido a

procedimentos

invasivos que

apresente dois

ou mais sinais

referidos como

clínica

compatívele

achados

radiológicos.

Paciente que preenche os

critérios de caso suspeito,

mas sem investigação

laboratorial, e que

respondeu ao tratamento

específico para

micobactérias.

Paciente que

preenche os

critérios de caso

suspeito, que

apresente

manifestações

clínicas

compatíveis com

baciloscopia

positiva, mas

cultura negativa

para micobactéria.

Paciente que

preenche os

critérios de

caso suspeito

e apresenta

mais de uma

cultura positiva

para

micobactéria e

baciloscopia.

Fonte: Brasil, ANVISA 2010. Relatório descrito de investigação de casos de infecções por micobactérias

não tuberculosas de crescimento rápido (MCR) no Brasil no período de 1998 a 2009.

Os achados radiológicos auxiliam nas definições de casos de infecção por MNT,

mas não diferenciam dos casos de TB. Os achados mais comuns nas infecções

pulmonares por MNT são a bronquiolite, bronquiectasias, nódulos, consolidação, e

menos frequentemente cavidades (10). Porém, um estudo em Israel, relacionou

achados radiológicos de duas espécies de MNT, M. kansasii estava associada à

achados radiológicos com mais cavidades e M. simiae à infiltrados pulmonares. Esses

achados revelaram que para M. kansasii existe uma predileção para a doença de lobo

superior ao passo que a infecção por M. simiae maior probabilidade de doença lobo

médio e inferior. Os derrames pleurais e linfadenopatia foram encontradas apenas na

presença de infecção por M. simiae (75).

1.8. Diagnóstico laboratorial das MNT

O número elevado de espécies circulantes de MNT e de seu isolamento ser

possível na maioria dos espécimes biológicos e ambientais leva os laboratórios a

desenvolver e/ou aplicar métodos mais eficientes e rápidos para a detecção e

31

caracterização das micobactérias, incluindo métodos de cultura mais sensíveis,

melhoramento das técnicas de identificação e dos testes de susceptibilidade aos

antibióticos. É importante que os laboratórios recebam as amostras coletadas

corretamente, evitando falsos diagnósticos resultantes de amostras contaminadas

(26,36). Os tipos de amostras para diagnóstico de MNT são: escarro, escovado ou

lavado broncoalveolar (LBA), biópsia pulmonar, peças cirúrgicas (ósseas, linfáticas,

pele), secreções de feridas, sangue e medula óssea (57).

A presença de MNT numa amostra clínica pode ter três significados:

1. A micobactéria é o agente etiológico, e neste caso o diagnóstico microbiológico

deve ter como base os sinais clínicos e isolamento repetido da micobactéria em uma

segunda amostra, ou por um único isolamento no caso das amostras colhidas de

forma asséptica;

2. A micobactéria colonizou a amostra, mas não tem significado clínico. Isto

resulta frequentemente da utilização de equipamento contaminado, geralmente

provenientes de água canalizada. Casos assim não são raros e causam o que é

designado de ″pseudoinfecção″;

3. A detecção de micobactéria na amostra clínica teve origem numa contaminação

do laboratório (soluções de descontaminação contaminadas ou contaminação devido

a outra amostra positiva), sendo fácil de verificar, caso a mesma micobactérias seja

isolada a partir de outras amostras analisadas no mesmo dia (19,20);

4. Micobacteria isolada sem significância clínica – não sendo causa real de

infecção, significância clínica (3 amostras) isoladas de locais diferentes CUIDADO*

ligação com a clínica – valorização clínica – mais de uma amostra; dias consecutivos

e isoldadas de locais diferentes.

Na tabela 3 estão descritos os critérios clínicos, radiológicos e laboratoriais para

definir caso de infecção pulmonar por MNT de crescimento rápido ou tardio, segundo

a ANVISA:

Tabela 3. Diagnóstico de doença pulmonar por MNT:

32

Critérios clínicos e radiológicos:

1. Sintomas respiratórios associados a opacidade nodulares ou cavidades e/ou

na radiografia e/ou bronquiectasias e múltiplos pequenos nódulos na

tomografia computadorizada de tórax.

e

2. Exclusão de outros diagnósticos, especialmente tuberculose.

Critérios microbiológicos:

1. Cultura positiva em duas amostras de escarro.

ou

2. Uma cultura positiva por escovado ou lavado broncoalveolar (LBA).

ou

3. Biópsia pulmonar: processo inflamatório granulomatoso crônico e/ou BAAR no

tecido associado à cultura positiva em tecido, escarro ou LBA.

Fonte: Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA 2010). Relatório descrito de

investigação de casos de infecções por micobactérias não tuberculosas de crescimento rápido (MCR)

no Brasil no período de 1998 a 2009.

1.8.1. Separação das espécies do Complexo M. tuberculosis

das micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT):

As características culturais (morfologia das colônias e pigmentação), temperatura,

taxa de crescimento e testes bioquímicos diferem entres as espécies do complexo M.

tb e as MNT (21). Os métodos de cultura e os testes bioquímicos são morosos e

laboriosos, podem levar várias semanas, além disso não são totalmente elucidáveis,

deixando lacunas de diagnósticos quando ocorre a falta de reprodutibilidade da cepa

em meio de cultura (25). A variabilidade de estirpes presentes numa mesma espécie,

pode levar a uma variabilidade nos resultados dos testes bioquímicos, podendo

também ocorrer espécies diferentes com morfologias e perfis bioquímicos

indistinguíveis ou muito idênticos (63,64).

Apesar das dificuldades enfrentadas, os laboratórios que realizam cultura para

micobactérias devem ser capazes de primeiramente separar espécies do complexo

M.tb das MNT através de testes fenotípicos, do contrário terão que reportar o resultado

das culturas positivas, como Mycobacterium sp., ou encaminhar a cultura a um

33

laboratório de referência para realização da identificação da espécie por método

molecular (1).

A separação das espécies do complexo M. tuberculosis das MNT pode ser

realizada por meio de quatro testes fenotípicos partindo do primo-cultivo: análise

microscópica da cultura, inibição de crescimento em meio de cultura LJ-PNB

(Lowenstein Jensen – ácido p-nitrobenzóico) e teste da Niacina.

A análise microscópica da cultura consiste na confecção de um esfregaço de uma

alçada da colônia, que é corada com fucsina de ZN. Esse teste avalia a pureza da

cultura, a presença de BAAR e a formação de corda (Figura 2). A maioria das MNT

não formam fator corda, exceto M. kansasii, M fortuitum e M. chelonae (1,21).

a. Complexo M.tb b. MNT

Figura 2: Esfregaços de cultura de micobactérias.

Fonte: Gerência de Tuberculose – FMT/HVD

O teste de inibição de crescimento em meio com ácidop-nitrobenzóico 500 µg/ml

(PNB) é um teste utilizado na separação das espécies do complexo M.tb das MNT

através da cultura, todas as espécies do complexo M.tb não crescem nesse meio ao

contrário da maioria das MNT. As espécies de MNT que eventualmente podem não

crescer em presença de PNB é o M. kansasii, M. xenopi e M. gastri (79).

1.8.2. Identificação fenotípica das espécies de MNT:

Após a separação das MNT do complexo M.tb, é necessário a realização do

34

teste de identificação fenotípico das espécies de MNT, as diferentes espécies inclusas

a esse grupo também possuem diferenças terapêuticas (1,21). Os testes de

identificação fenotípico tem como base as características culturais e bioquímicas, tais

como: tempo e temperatura de crescimento, pigmentação e testes bioquímicos (1,35).

Em 1958, Runyon propôs a classificação das MNT em quatro grupos, baseando-

se na pigmentação e tempo de crescimento das colônias em meio de cultura sólido

(OK e/ou LJ). As espécies que apresentam crescimento após sete dias são

classificadas como micobactérias de crescimento lento (MCL) e aquelas que

apresentam crescimento em menos de sete dias, micobactérias de crescimento rápido

(MCR). As micobactérias pigmentadas produzem intensamente carotenoides

amarelos (Figura 3), que podem ser estimulados pela exposição à luz, estes são

denominados organismos fotocromogênios ou quando produzidos na ausência de luz,

organismos escotocromogênicos, além das micobactérias não pigmentadas (43).

Figura 3: Colônias cepas MNT positivas fotocromógenas, acromógenas e escotocromógenas.

Fonte: Gerência de Tuberculose – FMT/HVD

Esse esquema de identificação auxilia a elucidar possíveis lacunas de

diagnóstico, todavia, uma micobactéria pigmentada ou de crescimento rápido não

deve ser confundida com M. tuberculosis (Tabela 4) (1,4).

Tabela 4. Classificação das MNT segundo o sistema de Runyon. São apresentadas

algumas espécies exemplificativas de cada um dos grupos:

35

Grupo Característica da cultura

I Fotocromógenas: Crescimento lento das colônias; Culturas desenvolvem

pigmento amarelo somente quando expostas à luz. Exemplo: M. kansasii,

M. marinum.

II Escotocromógenas: Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias;

Culturas desenvolvem pigmento tanto na luz como no escuro. Exemplo:

M. gordonae, M. szulgai.

III Acromógenas: Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias;

Culturas não produzem pigmento. Exemplo: M. avium, M. terrae.

IV Crescimento rápido: Caracteriza-se pelo crescimento rápido das colônias;

Colônias podem ser pigmentadas ou não. Exemplo: M. fortuitum, M.

chelonae, M. abscessos.

Fonte: Leão SC, Martin A, Mejia GI, Palomino JC, Robledo J, Telles MA da S, Portaels F. 2005. Practical

Handbook for the phenotypic and genotypic identification of Mycobacteria.

1.8.3. Identificação genotípica das MNT:

Devido a demora no diagnóstico de infecções provocadas pelas MNT, tornou-se

necessário o desenvolvimento de métodos de identificação molecular, com uma boa

relação custo-benefício e que acima de tudo sejam mais eficazes quando comparados

aos métodos convencionais. Estes métodos incluem testes baseados na reação em

cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism), sequenciamento de DNA, sondas genéticas, entre outros (1).

O atraso de diagnóstico tem um impacto importante na escolha do tratamento

mais adequado do doente, quanto mais precoce o diagnóstico mais eficaz o

tratamento com uma maior chance de cura. O diagnóstico molecular consiste na

análise do material genético do microrganismo através de regiões específicas do

genoma de cada espécie, esta metodologia é específica e tem sido empregada na

maioria dos laboratórios, estes métodos têm cada vez mais importância, porque são

36

mais rápidos e precisos que os métodos convencionais e na maioria dos casos,

produzem resultados mais confiáveis (82).

Para esse tipo de metodologia é necessário que seja realizado previamente a

extração do DNA, que pode ser realizado através de vários métodos de digestão de

membrana como: método enzimático por brometo de cetil trimetilamonio (CTAB),

extração por choque térmico e banho ultrasônico (1).

Kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS:

Estão disponíveis no mercado o sistema da linha GenoType® (Hain Lifescience,

Nehren, Alemanha). O kit comercial GenoType® Mycobacterium CM (do inglês

“Common Mycobacteria”) e o GenoType® Mycobacterium AS (do inglês “Additional

Species”), juntos são um teste molecular que se baseia em uma técnica de PCR por

segmentação de uma região do gene 23S rRNA, seguida de hibridização reversa para

uma fita de nitrocelulose, permitindo a identificação genética molecular simultânea

de M. complexo de tuberculosis e 24 das espécies de MNT mais comuns a partir das

culturas positivas. O procedimento completo é dividido em três passos: extração do

DNA de cepa cultivada em meio de cultura sólido, amplificação através de técnica de

PCR multiplex com primers biotinilados e hibridização reversa, realizado no prazo

máximo de 2 dias. A determinação da espécie é realizada com a ajuda de uma tabela

de interpretação (83).

O GenoType® Mycobacterium CM permite a identificação do complexo M. avium,

M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M.

scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum-M. ulcerans,

M. peregrinum, M. xenopi e o complexo M. tuberculosis. O GenoType®

Mycobacterium AS permite a identificação de espécies adicionais de MNT,

nomeadamente M. simiae, M. mucogenicum, M. goodie, M. cellatum, M. smegmatis,

M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai, M. phlei, M.

hemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum e M. shimoidei (85).

PRA-hsp65 (Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene

hsp65).

37

O PRA-hsp65 (do inglês Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the

gene hsp65) é uma técnica não comercial, “in house” que tem apresentado uma boa

eficácia na identificação de espécies das MNT, se baseia na amplificação do gene

hsp65 e posterior análise de seu polimorfismo mediante a digestão com as enzimas

de restrição BstEII e HaeIII. Foi descrito por Telenti e col. em 1993. Esse método

diferencia amaioria das espécies MNT, mas não as do complexo M. tuberculosis. As

variações na sequência do gene hsp65 podem ser exploradas para a identificação ao

nível da espécie tanto em micobactérias de crescimento lento como em espécies de

crescimento rápido (1).

Resumidamente, um fragmento de 441 pares de base (pb) do gene hsp65 é

amplificado por reação de PCR e digerido por duas enzimas de restrição, BstE II e

Hae III. O produto dessa reação é submetido a análise através de eletroforese em gel

de agarose e a determinação das espécies é feita através da leitura desse gel, de

acordo com o perfil dos pares de base obtidos a partir da digestão de cada enzima

específica. A determinação dos perfis eletrosféricos são comparados aos padrões de

restrição de vários algoritmos encontrados no sistema on-line PRASITE através da

página eletrônica: http://app.chuv.ch/prasite/index.html (84).

Ambos os testes acima descritos são os mais utilizados e tem mostrado bons

resultados na identificação das espécies das MNT bem como amostras mistas (MNT

e TB) (83). Porém é importante lembrar que o método PRA-hsp65, não permite a

diferenciação entre algumas espécies de micobactérias, devido a superposição de

perfis de várias espécies distintas, necessitando o sequenciamento para

complementação do resultado nessas situações (92). Apesar dessas limitações, o

método PRA-hsp65 pode ser utilizado para a identificação preliminar das espécies de

MCR mais frequentes (85).

Sequenciamento de genes:

As definições de espécies, inicialmente baseadas em testes fenotípicos,

atualmente estão sendo baseadas no sequenciamento de vários genes essenciais ao

metabolismo da célula bacteriana (48). O sequenciamento é a técnica molecular mais

sensível, considerada padrão-ouro dos métodos da biologia molecular e é

constantemente utilizada em estudos de identificação das espécies de micobactérias

38

(92). A identificação é feita através da comparação das sequências de nucleotídeos

obtidas com as sequências de referência presentes em várias bases de dados.

Geralmente é necessário apenas uma única reação de sequenciamento para uma

identificação definitiva (93).

Este método permite também a detecção direta de espécies de micobactérias que

não cresceram em meios de cultura além de identificar diversas espécies

possivelmente não conhecidas. Porém o sequenciamento, no entanto é um método

dispendioso e necessita de técnicos e equipamento especializados, ou na ausência

dos mesmos, de se recorrer a empresas especializadas (93).

Essa técnica utiliza fragmentos de regiões específicas do genoma das

micobacterias: hsp65, rpoB e 16S rRNA. Dentre estas regiões gênicas, o

sequenciamento do gene hsp65 é o mais utilizado a nível de espécie e subespécie

(92).

O sequenciamento do gene rpoB é usado como alternativa não só para identificar,

mas também diferenciar as MNT entres os grupos de crescimento lento e crescimento

rápido (93).

O impacto na magnitude exata das infecções por MNT em países onde a TB é

endêmica ainda não são conhecidos. A Região Norte do Brasil é endêmica para os

casos de TB e está em constante processo de expansão devido à industrialização

gerada pela Zona Franca de Manaus, é detentora da maior bacia hidrográfica e é o

berço da maior parte da biodiversidade existente do mundo, possivelmente abrigue

em seu ecossistema a maior parte das micobatérias. Além disso, segundo dados do

Ministério da Saúde, em 2014, está no ranking das unidades da Federação com as

maiores taxas de detecção e mortalidade para o HIV/AIDS. Esses fatores apontam

para a necessidade de estudos mais detalhados na população da Região Norte

elucidando a relação entre TB/MNT/HIV.

Devido à escassez de dados de incidência, prevalência e mortalidade nos casos de

MNT/HIV na Região Amazônica são necessários estudos a fim de estabelecer critérios

clínicos e bacteriológicos para que se possa notificar e tratar de maneira mais eficaz.

39

Como as técnicas de identificação de MNT ainda não estão bem estabelecidas,

aumenta a necessidade do desenvolvimento de métodos de diagnóstico laboratorial,

bem como a avaliação das técnicas existentes. Dessa forma, é recomendável que a

identificação em nível de espécie seja realizada por sequenciamento de DNA para a

confirmação dos resultados obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares,

como o kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS (86).

Considerando que ainda não foram elucidadas as questões epidemiológicas das

MNT nessa região e nem sua interação com os pacientes que soropositivos, esse

estudo cooperará para o andamento da formulação dos critérios de controle,

diagnóstico e tratamento de MNT na Região Amazônica.

Visando priorizar a adequação terapêutica e obter dados que possam ser revisados

a qualquer momento, é recomendável que a identificação em nível de espécie seja

realizada por sequenciamento de DNA. Portanto, a confirmação dos resultados

obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, como o kit comercial

GenoType® Mycobacterium CM-AS, é realizada através do sequenciamento genético

(86).

Com aumento de casos de infecções por MNT aumenta a necessidade da inovação

dos métodos de diagnostico laboratorial bem como a criação de técnicas mais

precisas para a identificação das espécies de MNT, que hoje são laboriosos e

dispendiosos.

2. OBJETIVO

2.1. Geral:

Descrever e caracterizar as espécies de micobactérias não tuberculosas isoladas de

amostras clínicas de pacientes com suspeita de TB atendidos em uma unidade de

referência no Estado do Amazonas.

40

2.2. Específicos:

Descrever os achados microbiológicos dos pacientes com suspeita de TB e amostra

clinica positiva para MNT;

Identificar as espécies de MNT por meio de testes moleculares;

Comparar as técnicas moleculares PRA hsp65, GenoType® Mycobacterium CM/AS e

sequenciamento genômico das regiões hsp65 e rpoB;

Descrever a frequência de coinfecção MNT/TB/HIV.

3. MATERIAIS E MÉTODOS.

3.1. Modelo e período de estudo:

Trata-se de um estudo de coorte retrospectivo de casos suspeitos de TB no

período de 2011 a 2014, na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira

Dourado (FMT-HVD).

3.2. Amostras clínicas:

As amostras foram obtidas através das buscas em livros de registros laboratoriais

da Gerência de Tuberculose, foi realizado teste molecular das cepas criopreservadas

positivas para MNT do período de 2011 a 2014. Os achados clínicos foram obtidos

por meio do sistema de prontuário eletrônico on-line I-Doctor e no Sistema de

Informação de Agravos de Notificação (SINAM).

3.3. População de referência:

Amostras clínicas de pacientes admitidos com suspeita clínica de TB, com

amostra encaminhada ao laboratório de tuberculose da FMT-HVD e cultura positiva

para MNT no período de 2011 a 2014.

41

3.4. Critérios de elegibilidade:

Análise clínica e epidemiológica: Amostras clínicas de pacientes com suspeita

clínica e epidemiológica de tuberculose independente de idade, sexo e procedência

(ambulatório, enfermaria, UTI e/ou pronto atendimento), caracterizados por apresentar

sintomas respiratórios, achado radiológico ou tomográfico compatível com doença

pulmonar por micobactéria, solicitação de exame de escarro e resultado da cultura.

Análise molecular para identificação de espécie de MNT: Amostras clínicas de

pacientes com achados clínico-epidemiológicos sugestivos de TB e que possuam

cepa criopreservada em condições viáveis de armazenamento (quantidade, aspecto

e temperatura -70ºC).

3.5. Definições para confirmação laboratorial dos casos de Micobactéria não

tuberculosa:

Infecção pulmonar por MNT confirmada laboratorialmente: Todo paciente que

apresentou exame de escarro com resultado de baciloscopia negativa ou positiva

variando em +/++ ou +++, teste molecular Xpert MTB/RIF® não detectável e cultura

em meio sólido com crescimento confluente para MNT identificada por meio de teste

fenotípico (análise de coloração e tempo de crescimento) e bioquímico (PNB, TCH e

Niacina).

Infecção pulmonar por MNT não confirmada laboratorialmente: Todo paciente

que apresentou exame de escarro com resultado de cultura negativo, ou seja, com

ausência de unidade formadora de colônia (UFC) e/ou cultura contaminada.

3.6. Critérios de não inclusão:

Análise clínica e epidemiológica: Não foram incluídos no estudo pacientes que

não tiverem amostra clínica coletada e encaminhada ao laboratório de tuberculose

e/ou que não possuam resultado do exame de baciloscopia e/ou Xpert MTB/RIF e/ou

cultura.

42

Análise molecular para identificação de espécie de MNT: Amostras clínicas que

tiveram o material perdido com o tempo, que não apresentaram concentração

satisfatória para análise (0,5 mL) e que após repique apresentaram contaminantes

não foram submetidas aos testes moleculares e sequenciamento de DNA.

3.7. Procedimento laboratorial:

Foi realizado o levantamento das informações laboratoriais referentes aos

pacientes do estudo primeiramente através de livros de registro da Gerência de

tuberculose e posteriormente buscas das cepas criopreservadas em geladeira -70ºC

situada na Gerência de Bacteriologia da FMT- HVD. Para determinação e identificação

de espécie as cepas rastreadas foram submetidas aos seguintes procedimentos:

3.7.1 Identificação fenotípica:

As culturas criopreservadas foram semeadas em meio de cultura sólido Ogawa

Kudoh e incubadas em estufa bacteriológica à 37ºC (APÊNDICE E) para análise

fenotípica através da constatação do tempo de crescimento e a presença de

pigmentação conforme protocolo (APÊNDICE F).

Foram submetidas a teste molecular (identificação genotípica) as cepas de

isolados de espécimes cultivadas de amostras biológicas caracterizadas como

Micobactéria não tuberculose que apresentaram crescimento em meio de cultura sem

contaminantes.

3.7.2. Identificação genotípica:

a) Etapa 1: extração de DNA

Foram utilizados dois métodos: um método de extração de DNA enzimático

através de CTAB (APÊNDICE D) conforme técnica descrita por van Soolingen et al

(1994) e outro por sonicação (banho ultra-sônico).

43

Resumidamente a técnica consistia em:

Inativação de cepa e extração de DNA por termobloco: As cepas crescidas foram

submetidas à inativação de sua potencialidade contaminante e posterior lise de

membrana através de choque térmico (APÊNDICE G), foi retirada de 2 a 3 alçadas do

crescimento micobacteriano da cultura e suspensas em um microtubo contendo água

ultra-pura (Gibco®), logo após a suspensão foi submetida à banho maria por 20

minutos a 99ºC.

b) Etapa 2: As cepas foram submetidas a dois testes moleculares, um através de

método não comercial “in house” e outro através de kit comercial.

PCR – Restriction Enzyme Analysis (PRA-hsp65): Foi realizada a amplificação

deum fragmento de 441 pb do gene hsp65, comum entre as micobactérias e posterior

análise de seu polimorfismo mediante a digestão com as enzimas de restrição BstEII

e HaeIII (APÊNDICE H). A determinação da espécie foi realizada através da análise

do gel de eletroforese, as bandas de DNA encontradas foram comparadas a padrões

descritos de restrição algoritmas encontrados na página eletrônica PRASITE:

http://app.chuv.ch/prasite/index.html.

Kit Comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS:

O DNA extraído submetido à técnica PRA-hsp65 também foi submetido a

segmentação da região do gene 23S rRNA e hibridização reversa em fita de

nitronucleose. Nesta fita, sondas específicas imobilizadas (tecnologia Hain

LifeScience - DNA-STRIP), permitiram a identificação das seguintes espécies de

micobactérias: Mycobacterium avium spp, M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum,

M. gordonae, M. intracellulare, M. scrafulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M.

malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, M. xenopi e CMTB (complexo

M.tb). O procedimento é a partir do material cultivado. A determinação da espécie é

realizada através de uma tabela de interpretação.

44

Os resultados obtidos das duas técnicas foram analisados e comparados entre si e

por fim confirmados através da técnica de sequenciamento.

c) Etapa 3: Sequenciamento do gene hsp65 e rpoB.

As técnicas de sequenciamento foram realizadas de acordo com os procedimentos

descritos por Adekambi et al., 2003 e Selvaraju et al., 2005.

Foi realizada a PCR utilizando primers específicos para a região do gene hsp65,

com os oligonucleotídeo hsp667F 5’ GGCCAAGACAATTGCGTACG e hsp667R 5’

GGAGCTGACCAGCAGGAT e outro para a região do gene rpoB, com os

oligonucleotídios MycoF 5’ GGCAAGGTCACCCCGAAGGG e MycoR 5’

AGCGGCTGCTGGGTGATCATC. Os produtos amplificados foram purificados

utilizando Polietilenoglicol (PEG) 8000/2.5 M NaCl antes do sequenciamento

(APÊNDICE I). As reações de amplificação foram realizadas através de termociclador

com etapa de desnaturação inicial de 96ºC por 15 segundos, 50ºC por 15 segundos

e 60ºC por 4 minutos. Os produtos da PCR foram submetidos a eletroforese em gel

de 1%.

A reação de sequenciamento foi realizada através do equipamento ABI 3500

Genetic Analyzer com capilares de 50 cm e polímero POP7 (Applied Biosystems).

Depois de marcadas foram novamente purificadas através de precipitação e

desnaturação através do kit comercial BigDye XTerminator Purification Kit (Applied

Biosystems) e eletroinjetadas no analisador genético.

Os produtos da reação de sequenciamento (conting) foram alinhados e analisados

através do programa DNASTAR – Lasergene7 SeqMan. Essas sequencias depois de

alinhadas foram submetidas a análise comparativa utilizando o banco de dados

mundial Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), essa ferramenta de

bioinformática contém uma quantidade gigantesca de informação, retornando

sequências mais similares e de significância estatística, encontrado no National

Center for Biotechnology Information (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

3.8. Coleta e análise de dados

45

Coleta de dados: A coleta de dados seguiu de acordo com o instrumento de coleta de

dados (APÊNDICE C). Foi criado um banco de dados no software Excel, para

organização de dados clínicos e laboratoriais coletados.

Análise estatística dos dados: Para os dados demográficos e clínicos foram calculadas

média, mediana e intervalo interquantil (IQR). A normalidade dos dados será

verificada por meio do teste Kolmogorov-smirnov. Foi aplicado o teste Kappa para

análise da concordância entre as técnicas moleculares utilizadas na identificação das

espécies de MNT através da escala de Landis onde a concordância é classificada

como: pobre (abaixo de 0), discreta (0-0,2), fraca (0,21-0,4), moderada (de 0,41-0,6),

substancial (0,61-0,8), quase perfeita (0,81-1) (Landis & Koch, 1977).

3.9. Considerações éticas:

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMT-HVD,

preservando os direitos dos sujeitos da pesquisa conforme os requisitos da Resolução

do Conselho Nacional de Saúde 466/12 e suas complementares.

4. RESULTADOS

Artigo a ser submetido BioMed Central Infectious Diseases (BMC Infectious

Diseases).

Caracterização de Micobactérias não tuberculosas isoladas de amostras

biológicas de pacientes suspeitos de tuberculose atendidos em uma Unidade de

Referência no Estado do Amazonas

Characterization of non-tuberculous mycobacteria isolated from biological samples of

patients suspected of tuberculosis treated at a Reference Unit in the State of Amazonas

Ana Carolina de O. de Lima 1, Karen B. Schmid 2, Hilda F. de Melo 3, Rafaella Christine

C. Athayde5, Afrânio L. Kritski 4, Maria Lúcia R. Rossetti 2, Marcelo Cordeiros-Santos 1.

46

1. Universidade do Estado do Amazonas (UEA), AM, Brasil; Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), AM, Brasil. 2. Fundação Estadual de

Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS), RS, Brasil; Centro de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CDCT), RS, Brasil. 3. Centro Universitário do Norte

(UNINORTE

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PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM … · PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA