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AFLP: uma nova tcnica para DNA fingerprinting Pieter Vos, et al. Nucleic Acids Research. V. 23, N 21 (1995) 4407-4414

RESUMO Uma moderna tcnica de DNA fingerprinting chamada AFLP descrita.

A tcnica AFLP est baseada na seletiva amplificao por PCR de fragmentos de restrio de uma digesto total do DNA genmico. A tcnica envolve 3 etapas: (i) restrio do DNA e ligao de oligonucleotdeos adaptadores, (ii) amplificao seletiva dos grupos de fragmentos de restrio, e (iii) anlise em gel dos fragmentos amplificados. Amplificaes por PCR dos fragmentos de restrio conseguido usando adaptadores e seqncias stio-restritivas como stios alvo para anelamento dos primers. A amplificao seletiva conseguida pelo uso de primers que se estendem dentro dos fragmentos de restrio, amplificando somente esses fragmentos os quais a extenso do primer emparelha nos nucleotdeos que flanqueiam o stio de restrio. Usando este mtodo, grupos de fragmentos de restrio podem ser visualizados por PCR sem conhecimento da seqncia dos nucleotdeos. O mtodo permite a especfica co-amplificao de um alto nmeros de fragmentos de restrio. O nmero de fragmentos que podem ser analisados simultaneamente, porm, dependente da resoluo do sistema de deteco. Tipicamente 50-100 fragmentos de restrio so amplificados e detectados em gel de poliacrilamida. A tcnica de AFLP promove uma moderna e muito poderosa tcnica de DNA fingerprinting para DNAs de qualquer origem ou complexidade.

INTRODUO DNA fingerprinting envolve a exposio de um conjunto de fragmentos

de DNA de uma amostra especfica. Uma variedade de tcnicas de DNA fingerprinting est atualmente disponvel, das quais a maior parte usam PCR para deteco dos fragmentos. A escolha de qual tcnica usar, dependente da aplicao por exemplo de DNA typing, mapeamento de marcadores e o organismo sob investigao, por exemplo procariontes, plantas, animais, humanos. Idealmente, uma tcnica fingerprinting no deve exigir previamente investimentos em termos de anlises de seqncias, sntese de primers ou caracterizao de sondas de DNA. Numerosos mtodos fingerprinting, os quais satisfazem estes requerimentos tem sido desenvolvidos nos ltimos anos, incluindo random amplified polymorphic DNA (RAPD), DNA amplified fingerprinting (DAF) e arbitrarily primed PCR (AP-PCR). Estes mtodos so todos baseados na amplificao ao acaso de fragmentos de DNA pela seleo arbitrria de primers. Padres de fragmentos de DNA podem ser gerados de qualquer DNA sem conhecimento prvio de sua seqncia. Os padres gerados dependem da seqncia dos primers da natureza dos modelos de DNA. A PCR executada em baixas temperaturas de anelamento para permitir o anelamento dos primers em mltiplos loci do DNA. Fragmentos de DNA so gerados quando os primers ligam stios que esto dentro de uma distncia que permitem amplificaes. Em princpio, um nico primer suficiente para gerar padres de bandas. Estes novos mtodos de fingerprinting baseados em PCR tem a maior desvantagem por serem muito sensveis s condies de reao, qualidade do DNA e perfis de temperatura na PCR, que limitam sua aplicao.

Este trabalho descreve uma nova tcnica para DNA fingerprinting, chamada AFLP. A tcnica de AFLP est baseada na deteco de fragmentos

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de restrio pela amplificao por PCR, e pode ser usada para DNAs de qualquer origem ou complexidade. Fingerprints so produzidos sem conhecimento prvio da seqncia usando um limitado grupo de primers genricos. O nmero de fragmentos detectados em uma nica reao podem ser afinados pela seleo de grupos especficos de primers. A tcnica de AFLP robusta e confivel porque condies de reao estritas so usadas para anelamento dos primers: a confiabilidade da tcnica RFLP est combinada com a fora da tcnica de PCR. Este trabalho descreve vrias caractersticas da tcnica AFLP e ilustra como a tcnica pode ser melhor usada em fingerprinting de DNAs genmicos.

MATERIAIS E MTODOS DNAs, enzimas e materiais DNA do vrus Lambda foi adquirido da Pharmacia (Pharmacia LKB

Biotechnology AB, Uppsala, Sweden). DNA do vrus Autographa californica (AcNPV) foi uma doao (Agricultural University of Wageningen). DNA de levedura foi isolado da cepa AB138 como descrito por Green e Olson com pequenas modificaes. DNA de tomate variedade Moneymaker foi obtido da University of Wageningen. DNA de Arabidopsis (recombinante congnito linha 240, foi obtido de John Innes Center, UK), DNA de milho (cepa B73, obtido do Instituto Sperimentale per La, Italy), DNA de pepino (variedade Primera, obtido de De Ruiter Seeds C.V., The Netherlands), DNA de cevada (variedade Ingrid, foi obtida da University of Aachen, Germany), DNA de alface (variedade Calmar, foi obtida do UC Davis, Davis, CA, USA) e DNA de [brassica] (leo da semente arrebentada, variedade Major, obtida da University of Wisconsin, WI, USA) foram isolados usando um procedimento CTAB modificado descrito por Stewart e Via. DNA humano foi preparado como descrito por Miller et al, de 100mL de sangue do Mrs Marjo Bleeker, um dos co-autores deste trabalho. Todas enzimas de restrio foram adquiridas da Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden), exceto a enzima de restrio MseI, a qual foi adquirida da New England Biolabs Inc. T4 DNA ligase e T4 polinucleotdeo kinase tambm foram obtidas da Pharmacia. Todos os reagentes para PCR e materiais de consumo foram obtidos da Perkin Elmer Corp. todos reagentes radioativos foram adquiridos da Amershan ou da Isotopchim.

AFLP primers e adaptadores Todos oligonucleotdeos foram fabricados na Biotronic Synostat DNA-

synthesizer (Eppendorf Gmbh, Maintal, Germany) ou Milligen Expedite 8909 DNA-synthesizer (Millipore Corp. Bedford, MA, USA). A qualidade dos oligonucleotdeos brutos foi determinada por marcao final com polynucleotide kinase e [32P]ATP e subseqente eletroforese em gel de poliacrilamida 18%. Oligonucleotdeos foram geralmente usados como adaptadores e primers para anlises AFLP sem mais purificaes.

Adaptadores AFLP consistem de uma seqncia central e uma seqncia enzima-especfica. A estrutura do adaptador EcoRI :

5-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5

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A Estrutura do adaptador MseI :

5-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5

Adaptadores de outras enzimas de corte raro foram idnticas para o adaptador EcoRI com a exceo que finais coesivos foram usados, quais so compatveis com estas outras enzimas. O adaptador TaqI foi idntico para o adaptador MseI com a exceo que um final coesivo foi usado compatvel com TaqI.

Primers AFLP consistem de 3 partes, uma seqncia central, uma seqncia enzima-especfica (ENZ) e uma extenso seletiva (EXT). Isso ilustrado abaixo para primers EcoRI e MseI com 3 nucleotdeos seletivos (nucleotdeos seletivos so mostrados como NNN):

Centro ENZ EXT EcoRI 5-GACTGCGTACC AATTC NNN-3 MseI 5-GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3

Primers AFLP para outras enzimas de corte raro foram similares para os EcoRI-primers, e TaqI-primers foram similares para os MseI-primers, mas tinham partes enzima-especficas correspondendo s respectivas enzimas.

Modificao do DNA e preparao do modelo O protocolo abaixo descreve a gerao de modelos para reaes AFLP

usando a combinao de enzimas EcoRI/MseI. Modelos de DNA com outras enzimas de restrio foram preparadas usando essencialmente o mesmo protocolo, exceto no uso de diferentes enzimas de restrio e correspondendo [double-stranded] adaptadores.

DNA genmico (0,5g) foi incubado por 1h a 37C com 5U de EcoRI e 5U de MseI em 40L de 10mM Tris-Hac pH 7,5, 10mM MgAc, 50mM Kac, 5mM DTT, 50ng/L BSA. Posteriormente, 10L de uma soluo contendo 5pMol de adaptador EcoRI, 50pMol de adaptador MseI, 1U de T4 DNA ligase, 1mM ATP em 10mM Tris-HAc pH 7,5, 10mM MgAc, 50mM KAc, 5mM DTT, 50ng/L BSA foi adicionado, e a incubao continuou por 3h a 37C. Adaptadores foram preparados pela adio equimolar, equivalendo para ambos [strands]; adaptadores no foram fosforilados. Aps a ligao, a mistura da reao foi diluda para 500L com 10mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA pH 8,0 e estocado a 20C.

Reaes AFLP Reaes de amplificao esto descritas usando modelos de DNA para

a combinao de enzimas EcoRI/MseI. AFLP fingerprints com outras combinaes de enzimas foram executados com primers apropriados.

Reaes AFLP geralmente empregam 2 primers de oligonucleotdeos, 1 correspondendo ao final EcoRI e outro correspondendo ao final MseI. Um dos 2 primers foi radioativamente marcado, preferencialmente o primer EcoRI. Os primers foram marcadosl usando [33P]ATP e T4 polyonucleotide kinase. A reao de marcao xecutada em 50L 25mM Tris-HCl pH 7,5, 10mM MgCl2,

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5mM [permidine]-3HCl usando 500ng de primer, 100Ci[33P]ATP e 10U T4 polynucleotide kinase. Vinte L PCRs foram executados contendo 5ng de primers marcados EcoRI (0,5L da mistura da reao de marcao), 30ng de primer MseI, 5L de DNA modelo, 0,4U de Taq polimerase, 10mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5mM MgCl2, 50mM KCl, 0,2mM de todos 4 dNTPs.

As condies da PCR diferiram dependendo da natureza das extenses seletivas dos primers AFLP usados para amplificao. Reaes AFLP com primers tendo nenhum ou 1 nucleotdeo seletivo foram executadas para 20 ciclos com o seguinte perfil: etapa de 30s para desnaturao do DNA a 94C, etapa de 1 min de anelamento a 56C e uma etapa de 1 min para a extenso a 72C. reaes AFLP com primers contendo 2 ou 3 nucleotdeos seletivos foram executados por 36 ciclos com o seguinte perfil: uma etapa de 30s para desnaturao do DNA a 94C, uma etapa de 1 min para anelamento (veja abaixo) e uma etapa de 1 min para extenso a 72C. A temperatura de anelamento no primeiro ciclo foi de 65C, foi subseqentemente reduzido em cada ciclo em 0,7C para os prximos 12 ciclos, e continuou a 56C pelos 23 ciclos remanescentes. Todas reaes de amplificao foram executadas em um termociclador PE-9600 (Perkin Elmer Corp, USA).

AFLP fingerprinting de genomas complexos geralmente envolvem uma amplificao em 2 etapas. A primeira etapa desta amplificao, chamada de pr-amplificao, foi executada com 2 primers AFLP tendo 1 nico nucleotdeo seletivo como descrito acima, com a exceo que 30ng de ambos primers AFLP foram usados, e que estes primers no foram radioativamente marcados. Aps esta etapa de pr-amplificao, a mistura da reao foi diluda 10 vezes, com 10mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA pH 8,0 e usado como modelo para a segunda reao de amplificao. A segunda reao de amplificao foi executada conforme descrito acima por reaes AFLP com primers tendo extenses seletivas longas.

Figura 1. Representao esquemtica da tcnica AFLP.

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Anlise em gel Seguindo, os produtos das reaes de amplificao foram misturados com um igual volume (20L) de formamide dye (98% formamide, 10mM EDTA pH 8,0 e azul bromo fenol e xylene cyanol como [tracking dyes]). A mistura resultante foi aquecida por 3 min a 90C, e ento rapidamente colocado em gelo. Cada amostra (2L) foi carregada em um gel (5%) de poliacrilamida denaturing (usado para sequenciamento). A matriz do gel foi preparada usando 5% de acrilamida, 0,25% de methylene bisacril, 7,5M de uria em 50mM Tris/50mM de cido brico/1mM EDTA. Para 100mL de soluo de gel 500L de 10% de APS e 100L de TEMED foi adicionado e gis foram lanados usando umaparato gel SequiGen 38 X 50cm (BioRad Laboratories, USA). 100mM Tris/100mM cido brico/2mM EDTA foi usado como tampo de corrida. A eletroforese foi executada em fora constante, 110W por 2h. Aps a eletroforese, os gis foram fixados por 30 min em 10% de cido actico secado em uma placa de vidro e exposto ao Fuji phosphoimage no escuro por 16h. Padres fingerprint foram visualizados usando um sistema de anlise Fuji BAS-2000 phosphoimage (Fuji Photo Film Company Ltd, Japan).

RESULTADOS E DISCUSSO Princpio do mtodo A tcnica AFLP baseada na amplificao de subconjuntos de fragmentos de restrio genmicos usando PCR. O DNA clivado com enzimas de restrio, e [stranded-duplamente] (ds) adaptadores so ligados nos finais dos fragmentos de DNA para gerar modelos para amplificao. A seqncia dos adaptadores e dos stios adjacentes de restrio servem como stios de ligao para os primers para subseqente amplificao dos fragmentos (Fig. 1). Nucleotdeos seletivos so includos no final 3 dos primers os quais conseqentemente podem iniciar a sntese de DNA de um subconjunto dos stios de restrio. Qualquer fragmento de restrio no qual o nucleotdeo seletivo flanqueia e for complementar com o stio de restrio poder ser amplificado. Os fragmentos de restrio para amplificao so geralmente por 2 enzimas de restrio, uma de corte raro e outra de corte freqente. O procedimento AFLP resulta em amplificaes predominantes destes fragmentos, os quais tem uma seqncia de corte raro num final e uma seqncia de corte freqente no outro (isto ser explicado abaixo). A razo para usar 2 enzimas de restrio pelo seguinte. (i) o corte freqente ir gerar pequenos fragmentos de DNA, quais sero bem amplificados e esto em timo tamanho para separao em gel para sequenciamento. (ii) O nmero de fragmentos para serem amplificados reduzido pelo uso da enzima de corte raro, desde que somente os fragmentos corte raro/freqente sejam amplificados. Isto limita o nmero de nucleotdeos seletivos necessrios para a amplificao seletiva. (iii) o uso de 2 enzimas de restrio faz isto possvel para marcar um [strand] dos ds produtos de PCR, quais previnem a ocorrncia de dobras no gel devido a desigual mobilidade dos dois [strands] dos fragmentos amplificados. (iv) usando 2 diferentes enzimas de restrio d a maior flexibilidade em afinao do nmero de fragmentos que sero amplificados.

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(v) grande nmero de diferentes fingerprints podem ser gerados por varias combinaes de um baixo nmero de primers.

AFLP fingerprinting de genomas simples A tcnica de AFLP feita com uso de adaptadores ds ligados nos finais dos fragmentos de restrio para criar stios alvo para anelamento de primers na amplificao dos fragmentos. Um subconjunto dos fragmentos de restrio especificamente amplificado pelo uso de nucleotdeos seletivos no final 3 dos primers. Este princpio foi demonstrado pelo fingerprinting de 4 diferentes DNAs genmicos simples, variando de 48,5 a 16.000Kb de tamanho do genoma. Os seguintes DNAs genmicos foram selecionados e fingerprinted usando a combinao de enzimas EcoRI/MseI: DNA do fago (48.451pb), DNA do vrus AcNPV (129.981pb), DNA de Acinetobacter ( 3.000Kb) e DNA de levedura ( 16.000Kb). Para o DNA do fago e AcNPV, a seqncia completa dos nucleotdeos conhecida, e por isso todos fragmentos EcoRI/MseI puderam ser exatamente previstos. Realmente, todos fragmentos previstos foram detectados. Tambm para DNA de Acinetobacter e levedura, o nmero de fragmentos corresponderam bem com o tamanho do genoma destes organismos. Acrescentando nucleotdeos seletivos nos primers se reduz o nmero de bandas, 4 vezes com cada base seletiva adicional. Alm disso, a adio de um nucleotdeo seletivo extra sempre resulta em um fingerprint, que foi um subconjunto do fingerprint original. Isto indica que nucleotdeos seletivos so um preciso e eficiente caminho para selecionar um grupo especfico de fragmentos de restrio para amplificao. Os AFLP fingerprints mostraram que grande nmeros de fragmentos de restrio foram amplificados simultaneamente, e que em princpio o nmero de bandas detectadas limitada somente pelo poder do sistema de deteco, i.e. gis de poliacrilamida. Em geral, as amplificaes simultneas de fragmentos de DNA usando grupos de primers especficos para cada fragmento PCR (PCR multiplex) parece ser algo dificultoso. Nossos resultados sugerem que a amplificao de multi-fragmentos eficiente contanto que todos fragmentos usem o mesmo grupo de primers para sua amplificao. Isto significa que as diferenas na eficincia da amplificao dos fragmentos de DNA na PCR so principalmente associados aos primers e no aos fragmentos especficos. Os adaptadores ds usados para ligao nos fragmentos de restrio no so forforilados, o que causa somente 1 [strand] para ser ligado nos finais dos fragmentos de restrio. Conseqentemente fragmentos no foram amplificados se os modelos de DNAs foram desnaturados antes amplificao PCR (resultados no mostrados), exceto quando Taq polimerase e dNTPs estavam presentes antes da desnaturao. O [filling-in] do final 3 encaixado pela Taq polimerase segue a dissociao do [strand] no ligado durante a etapa de aquecimento parece uma matria de somente segundos ou menos. Alternativamente, a Taq polimerase pode imediatamente deslocar o [strand] no ligado em baixas temperaturas no processo de juntar as misturas da reao. Estes resultados demonstraram que: (i) a tcnica de AFLP promoveu um eficiente caminho para amplificar grande nmero de fragmentos simultaneamente, (ii) os fragmentos amplificados so fragmentos de restrio, (iii) o nmero de fragmentos obtidos aumentou com o aumento do tamanho do

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genoma e correspondeu bem com o que foi teoricamente esperado, (iv) os nucleotdeos seletivos nos finais dos primers reduziram o nmero de bandas precisamente como foi de se esperar. A restrio do DNA genmico com EcoRI e MseI ir resultar em 3 classes de fragmentos de restrio, fragmentos MseI-MseI, fragmentos EcoRI-MseI e fragmentos EcoRI-EcoRI. A vasta maioria (>90%) so esperados para ser MseI-MseI; os fragmentos EcoRI-MseI iro ser aproximadamente 2 vezes o nmero de stios de restrio EcoRI e um pequeno nmero de fragmentos sero EcoRI-EcoRI. Em experimentos anteriores o primer EcoRI foi marcado e, conseqentemente somente os fragmentos de restrio com stios EcoRI puderam ser detectados. Para investigar a amplificao dos fragmentos MseI-MseI um grupo de reaes AFLP de DNA de levedura foi executada com primer MseI ligado no lugar do primer EcoRI. Isto esperado para mostrar os fragmentos EcoRI-MseI bem como os fragmentos MseI-MseI. Fingerprints similares de levedura foram obtidos com a marcao de qualquer dos EcoRI ou MseI primers (Fig. 3, compare as linhas A e B). Porm, a maior parte das bandas mostrou uma significativa mudana na mobilidade, devido ao fato de que outros [strand] de fragmentos foram detectados. Isto foi surpreendente para achar que quase no fragmentos adicionais, i.e. fragmentos MseI-MseI, foram detectados marcando no primer MseI no lugar do primer EcoRI. Conseqentemente, reaes adicionais foram executadas mas quais somente o primer MseI foi adicionado, que teoricamente ir permitir somente a amplificao dos fragmentos MseI-MseI (Fig. 3, linha C). Realmente, estas reaes mostraram produtos de amplificao no observados na presena de primers EcoRI. Estas observaes implicam que amplificaes dos fragmentos MseI-MseI ineficiente na presena de primer EcoRI, i.e. que h amplificao preferencial dos fragmentos EcoRI-MseI comparados com fragmentos MseI-MseI na reao de AFLP. Isto pode ser explicado de 2 maneiras, (i) o primer MseI tinha uma temperatura menor de anelamento que o primer EcoRI, fazendo amplificaes MseI-MseI menos eficiente comparado com fragmentos EcoRI-MseI sob as condies usadas. Ns tnhamos realmente observado poderosa amplificao de fragmentos MseI-MseI usando longos ou alternativos primers MseI e adaptadores. (ii) os fragmentos MseI-MseI tem uma repetio invertida nos finais, devido ao fato de que eles esto amplificados por um primer simples. Conseqentemente, uma estrutura de origem de ala pode ser formada pelo pareamento de bases dos finais dos fragmentos, que ser completado com anelamento do primer. Isto tambm confirmado pela observao de que somente grandes fragmentos foram amplificados em reaes AFLP quando somente o primer MseI foi adicionado. A formao de uma estrutura de origem de ala ir ser mais difcil nestes fragmentos grandes. Ns temos realmente demonstrado que amplificaes de fragmentos grandes (>1Kb) com um primer simples bastante eficiente (resultados no mostrados). Primers cuidadosamente projetados crucial para o sucesso da amplificao por PCR. Primers AFLP consistem de 3 partes: a parte 5 corresponde ao adaptador, a seqncia do stio de restrio e na parte 3 os nucleotdeos seletivos. Conseqentemente, o design dos primers AFLP principalmente determinado pelo design dos adaptadores, quais so ligados nos fragmentos de restrio. Vrios designs de adaptadores foram testados (resultados no mostrados), todos com bons resultados contanto que as regras

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gerais para bons primers PCR projetados forem seguidos. Um adaptador diferente projetado ir demandar diferentes condies na PCR, e isto conseqentemente importante para selecionar um design especfico para os adaptadores, e para otimizar as condies para este design. Uma importante caracterstica dos primers AFLP que todos primers comeam com um 5 resduo de guanina (G). ns achamos que uma 5 G-resduo no primer no marcado crucial para prevenir o fenmeno de bandas duplas. As bandas duplas aparecem em resultado de adio incompleta de um nucleotdeo extra para os [strands] sintetizados (resultados no mostrados). Esta atividade transferase terminal da Taq polimerase bastante forte, e havia sido freqentemente informada. Ns tambm temos achado que o nucleotdeo 3 adicionado foi influenciado pela concentrao de dNTPs, e que bandas duplas ocorrem em baixas concentraes de dNTPs indiferentemente do resduo 5 dos primers PCR (resultados no mostrados). Ns conclumos de nossos resultados que esta atividade transferase terminal mais forte (quase 100% dos [strands] sintetizados) quando o nucleotdeo 3 do [strand] sintetizado uma citosina (C). Nos experimentos descritos to longe, primers AFLP foram usados com 1 ou 2 nucleotdeos 3 seletivos. Este baixo nmero de nucleotdeos seletivos foram mostrados para promover um caminho efetivo para selecionar o nmero desejado de fragmento para amplificao. Posteriormente, primers com [(...onger)] extenses 3 foram testados para determinar o nmero mximo de nucleotdeos 3 seletivos que iria reter alta seletividade nas reaes AFLP. Para este propsito, fingerprints foram gerados de DNA de levedura usando primers com mais de 4 nucleotdeos seletivos. Uma nico primer EcoRI foi selecionado com 1 nucleotdeo seletivo e combinado com 4 diferentes primers MseI com 1, 2, 3 ou 4 nucleotdeos seletivos, respectivamente. As extenses seletivas MseI foram escolhidas em um caminho que com cada nucleotdeo seletivo adicional um fingerprint iria ser gerado que o subconjunto do fingerprint precedente, e.x. extenses +C, +CT, +CTC, +CTCA. O aparecimento de bandas que no ocorrem no fingerprint precedente um indicador que fragmentos so amplificados os quais no correspondem para a seqncia das bases seletivas, e conseqentemente que a seletividade incompleta (Fig. 4). Os fingerprints mostrados na Figura 4 e os fingerprints dos experimentos anteriores demonstraram que a seletividade dos primers boa para primers com 1 ou 2 nucleotdeos seletivos. A seletividade ainda aceitvel com primers contendo 3 nucleotdeos seletivos, mas isto perdido com a adio do quarto nucleotdeo. A perda da seletividade com primers contendo 4 bases seletivas ilustrada pela amplificao de numerosas bandas no detectadas nos fingerprints correspondentes com primers contendo 3 bases seletivas (compare a linha D com a linha C). Isto indica a tolerncia de [mismatches] na amplificao dos fragmentos usando primers AFLP com 4 bases na extenso. Isto mais provvel que [mismatches] iro ser tolerados na primeira base seletiva, porque este nucleotdeo est posicionado mais distante do final 3, e porque a seletividade da base seletiva 3 ainda foi adequada. Outros pesquisadores tambm tem investigado a seletividade dos nucleotdeos 3 de primers PCR. Eles tem achado que [mismatches] foram tolerados em ambos o ltimo e penltimo 3 nucleotdeo dos primers PCR, que est em conflito com outros resultados. Em outros experimentos, ns temos achado que a seletividade dos primers relativo e tambm depende do nmero de

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fragmentos amplificados em uma nica reao, as condies de PCR e o design dos primers (resultados no mostrados). Ns cremos que alguns nveis de amplificaes [mismatches] iro sempre ocorrer, mas que as condies de reao podem prever estas bandas [mismatches] para alcanar os nveis de deteco. Isto, presumidamente, a maior diferena com experimentos anteriormente descritos.

AFLP fingerprinting de genomas complexos Experimentos iniciais com AFLP fingerprinting de numerosos DNAs de plantas e animais indicaram que primers AFLP com pelo menos 3 nucleotdeos seletivos em ambos EcoRI e MseI primers foram requeridos para gerar padres de bandas teis. Por causa dos primers com 3 nucleotdeos seletivos tolerarem um baixo nvel de amplificaes [mismatch], uma segunda etapa de amplificao estratgica foi desenvolvida para fingerprinting de DNAs complexos. Na primeira etapa, chamada de pr-amplificao, o DNA genmico foi amplificado com ambos primers tendo um nico nucleotdeo seletivo. Posteriormente os produtos da PCR da reao de pr-amplificao foram diludos e usados como modelos para a segunda reao AFLP usando ambos primers com 3 nucleotdeos seletivos. Ns comparamos esta estratgia de amplificao com a amplificao direta de DNAs genmicos complexos sem o uso da etapa de pr-amplificao. A segunda etapa da amplificao estratgica resultou em 2 importantes diferenas em relao amplificao direta. (i) fundos sujeiras nos padres fingerprint foram reduzidos, e (ii) fingerprints com primers de combinaes particulares faltaram 1 ou mais bandas comparado com fingerprints gerados sem pr-amplificao. Isto melhor explicado assumindo que a amplificao direta com primers contendo 3 nucleotdeos seletivos resulta em um baixo nvel de produtos de amplificao [mismatch], que causou o fundo sujo e deu discretos fragmentos amplificados correspondendo a fragmentos de restrio repetidos. Uma vantagem adicional da segunda etapa de amplificao estratgica que ela promove virtualmente quantia ilimitada de modelos de DNA para reaes AFLP. A Figura 5 mostra um nmero tpico de fingerprints AFLP obtidos com a segunda etapa de amplificao estratgica usando DNAs de 3 espcies de plantas, Arabidopsis thaliana, tomate (Lycopersicon esculentum) e milho (Zea mays), e DNA humano. Para o DNA de Arabidopsis combinao de primers com um total de 5 nucleotdeos seletivos foram usados, por causa do pequeno genoma desta espcie de planta (145Mb). Pra o DNA de tomate, milho e humano, 6 nucleotdeos seletivos foram usados, 3 bases seletivas para ambos primers EcoRI e MseI. Mtodos de DNA fingerprinting baseados na amplificao de fragmentos de DNA genmico por primers ao acaso tem sido encontrado para ser bastante suscetvel na concentrao de DNA modelos. Quantidades de DNA podem variar consideravelmente entre amostras individuais isoladas por procedimentos padres de extrao. Preferivelmente, a tcnica de DNA fingerprinting mostrou ser insensvel na variao da concentrao de DNA modelo. Conseqentemente, a sensibilidade da tcnica AFLP para a concentrao de DNA modelo foi investigada. AFLP fingerprints foram executados usando DNA de tomate e combinao de enzimas EcoRI/MseI. Quantidade de DNA modelo foram variadas de 2,5pg a 25ng. Na segunda etapa de amplificao o protocolo

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padro foi usado, com a exceo de uma etapa de pr-amplificao estendida para 2,5 e 25pg de DNA das amostras modelo. Em tomate 2,5pg de DNA modelo corresponde a aproximadamente 4 molculas para cada fragmento de DNA no incio da reao AFLP. Padres AFLP fingerprint foram muito similares usando quantidades de modelo que alcanou 1000 vezes, i.e. de 25ng a 2,5pg (Fig. 6). Fingerprints gerados somente com 2,5pg de DNA modelo foram similares para os outros fingerprints, embora bandas variaram significativamente em intensidade e algumas bandas estavam ausentes. Os resultados demonstram que o procedimento AFLP insensvel para a concentrao do DNA modelo, embora fingerprints aberrantes iro ser observados em diluies muito altas de DNA modelo dando somente umas poucas molculas modelo no incio da reao. Muito provavelmente os fragmentos de restrio individuais no esto distribudos ao acaso como baixas concentraes de DNA explicando as diferenas observadas na intensidade das bandas. Esta hiptese sustentada pelos nossos achados que comparaes de um nmero de AFLP fingerprints individuais obtidos somente com 2,5pg de DNA modelo mostrou alta variao na intensidade das bandas individuais (resultados no mostrados). Uma caracterstica notvel das reaes AFLP que geralmente o primer marcado completamente consumido (o primer no ligado est em excesso), e que conseqentemente a parada da reao de amplificao quando o primer marcado est esgotado. Ns tambm achamos que ciclos adicionais na amplificao no afeta o modelo de bandas desde que o primer marcado consumido (resultados no mostrados). Esta caracterstica elegantemente utilizada no protocolo AFLP, que usa um excesso de ciclos PCR, que ir resultar em fingerprints de igual intensidade apesar da variao na concentrao do modelo. Ns tambm temos notado que DNA fingerprints tende a ser incerto se a concentrao do modelo foi abaixo de certa concentrao absoluta ( 1pg) indiferentemente da complexidade do DNA (resultados no mostrados). Em um caso posterior, bandas foram observadas quais foram modelos independentes e que tambm estavam se DNA no foi adicionado. O uso de outras combinaes de enzimas de restrio para AFLP fingerprinting de genomas complexos tambm foi investigado (resultados no mostrados). Estas combinaes de enzimas incluem EcoRI, HindIII, PstI, BglII, XbaI e Sse8387I (corte de 8 bases) em combinao com 8 MseI ou TaqI. Fingerprints foram gerados em uma variedade de DNAs de plantas e animais. O uso de TaqI como um corte de 4 bases no lugar da MseI resulta em uma distribuio desigual dos fragmentos amplificados, que estavam presentes principalmente na parte superior do gel. A maioria dos DNAs eucariticos so ricos em AT, e como resultado MseI (reconhecimento da seqncia TTAA) geralmente ir produzir muitos fragmentos de restrio pequenos comparado com TaqI (reconhecimento da seqncia TCGA). MseI conseqentemente preferida para AFLP fingerprinting porque ela corta muito freqentemente na maioria dos genomas eucariticos rendendo fragmentos que esto no tamanho timo para ambas amplificaes PCR e separao em gel de poliacrilamida desnaturante. Outras enzimas de corte raro geralmente executaram o mesmo para EcoRI em AFLP fingerprinting, e o nmero de bandas obtidas refletiram freqncia de clivagem de vrias enzimas de restrio. Porm, EcoRI preferida porque ela uma enzima de corte de 6 bases confivel (e baixo

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custo), que limita problemas associados com restries parciais em AFLP fingerprinting (veja abaixo). Restrio incompleta do DNA ir causar problemas no AFLP fingerprinting, porque fragmentos parciais iro ser gerados, que ir ser detectado pelo procedimento AFLP. Quando vrias amostras de DNA so comparadas com AFLP fingerprinting, a restrio incompleta ir resultar na deteco de diferenas em padres de bandas, que no refletem verdadeiramente polimorfismos do DNA, i.e. quando uma amostra clivada parcialmente e os outros no so. Restrio incompleta somente se tornar clara quando diferentes amostras de DNA do mesmo organismo so comparados. Ela caracterizada pela presena de bandas adicionais nas linhas, predominantemente de alto peso molecular.

CONCLUSES AFLP uma tcnica de DNA fingerprinting que detecta fragmentos de restrio genmicos e se assemelha a tcnica RFLP (restriction fragment length polymorfims), com a maior diferena que a amplificao PCR ao invs da Southern Hybridisation usada na deteco dos fragmentos de restrio. A semelhana com a tcnica RFLP foi a base para escolher o nome AFLP. O nome AFLP, porm, mostrou no ser usado como uma sigla, porque a tcnica ir mostrar presena ou ausncia de fragmentos de restrio em lugar de diferenas compridas. Em nosso protocolo AFLP inicial uma etapa adicional de purificao foi incorporada na preparao do modelo. Adaptadores EcoRI [biotinylated] foram usados para ligao e subseqentemente [biotinylated] fragmentos de DNA (fragmentos EcoRI-MseI e EcoRI-EcoRI) foram [substracted] da mistura da ligao usando [streptavidin beads]. Esta etapa reduziu a complexidade do modelo DNA pela remoo de todos os fragmentos MseI-MseI, que provou ser importante para gerar alta qualidade de fingerprints de DNAs complexos. O protocolo descrito neste trabalho omitiu a etapa de purificao, porque as condies de amplificao so usadas que resultam em amplificao preferencial dos fragmentos EcoRI-MseI em relao aos fragmentos MseI-MseI (Fig. 3). Este o resultado de um design cuidadoso dos adaptadores e dos primers e caractersticas inerentes das reaes de amplificao AFLP. A tcnica AFLP ir gerar fingerprints de qualquer DNA, indiferentemente da origem ou complexidade, e neste trabalho ns temos apresentado AFLP fingerprints de DNAs diferindo em tamanho de genoma em 100.000 vezes. Ns temos descrito que o nmero de fragmentos amplificados pode ser controlado pela freqncia de clivagem da enzima de corte raro e o nmero de bases seletivas. Adicionalmente o nmero de bandas amplificadas pode ser controlado pela natureza das bases seletivas; extenses seletivas com di ou trinucleotdeos raramente ir resultar na reduo dos fragmentos amplificados. Em geral, h uma correlao linear entre nmero de fragmentos amplificados e tamanho do genoma. Esta correlao linear perdida em genomas complexos de plantas superiores, quais contm alto nmero de seqncias repetidas e, por isso, multicpias dos fragmentos de restrio. Fingerprints destes DNAs complexos consistem predominantemente de fragmentos AFLP nicos, mas so caracterizados pela presena de pequenos nmeros ou maior intensidade de fragmentos repetidos.

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Em genomas complexos o nmero de fragmentos de restrio que podem ser detectados pela tcnica de AFLP virtualmente ilimitado. Uma nica combinao de enzimas (uma combinao de uma enzima de restrio que reconhece 6 bases e outra que reconhece 4 bases) j ir permitir a amplificao de 100.000s de fragmentos AFLP nicos, dos quais geralmente 50-100 so selecionados para cada reao. A maioria dos fragmentos correspondem a uma nica posio no genoma, e, por isso, pode ser explorado como marcos em mapas genticos e fsicos, cada fragmento sendo caracterizado pelo seu tamanho e seus primers requeridos para amplificao. Adicionalmente, a tcnica de AFLP permite deteco de fragmentos de restrio em qualquer [background] ou complexidade, incluindo agrupamentos de amostras de DNA e clonagem (e agrupamento) de segmentos de DNA. Conseqentemente, a tcnica de AFLP no simplesmente uma tcnica de fingerprinting, ela uma tecnologia de marcao em pesquisa genmica, porque ela pode atravessar a lacuna entre mapas genticos e fsicos. Primeiro, a tcnica AFLP uma ferramenta muito eficiente para revelar polimorfismos em fragmentos de restrio. Estes fragmentos polimrficos, i.e. marcadores AFLP, podem ser usados para construir mapas genmicos ou de segmentos de alta densidade. Na maioria dos organismos AFLP ir demonstrar para ser o caminho mais eficiente para construir mapas de marcadores genticos de DNA comparados com outras tecnologias de marcadores existentes. Segundo, os marcadores AFLP podem ser usados para detectar correspondentes clones genmicos, por exemplo, cromossomos artificiais de levedura (YACs). Isto mais eficazmente alcanado pelo trabalho com bibliotecas, quais esto agrupados para permitir um rpido screening PCR e identificao subseqente de clones. Um marcador AFLP ir detectar um nico clone YAC correspondendo em grupos muito como 100 clones YAC. Finalmente, a tcnica AFLP pode ser usada para fingerprinting de segmentos de DNA clonados tal como cosmdeos, clones P1, cromossomos bacterianos artificiais (BACs) ou YACs (resultados no mostrados). Por simplesmente usar ou no poucos nucleotdeos seletivos, fingerprints de fragmentos de restrio iro ser produzidos, quais subseqentemente podem ser usados para alinhar clones individuais e fazer [contigs].

Nota: a tcnica AFLP coberto por patente pela Keygene N.V.