Princípios de análise da

expressão gênica

Desenvolvimento de tecnologias que

possibilitem uma análise detalhada

tanto dos estados normais e anormais

dos genes, quanto da expressão de

milhares de genes nos estados normal

e patológico

Northern blot

• Técnica utilizada para analisar a expressão gênica de umgene em particular pela detecção do mRNA de umaamostra (diferentes tecidos, estágios de desenvolvimento,infecção por patógeno)

• Se um gene é observado como sendo super expressopela sua abundância de mRNA, em um estado de doençaem comparação com o estado normal, ele seria um genealvo de estudo

• Uso de uma sonda específica complementar à sequênciaalvo a ser analisada

Western blot

• Análise da função genética frequentemente

requer o exame da proteína codificada pelo

gene normal ou mutante de interesse

• Saber como o defeito no DNA altera a proteína

codificada para produzir o fenótipo clínico

• Técnica utilizada para detectar proteínas em

uma dada amostra de tecido ou extrato celular

Aplicar extrato proteico

total em gel de

poliacrilamida

Transferência para

membrana de

nitrocelulose

Incubação

anticorpos

ELETROFORESE

REVELAÇÃO

Proteínas

separadas

por

tamanho

Western blot

demonstrando a

presença ou ausência

da proteína muscular

distrofina nos extratos

proteicos de pacientes

com a Duchene ou

Becker (forma mais

branda)

Hibridação em tecido

Utiliza de sondas de DNA marcadas para

um determinado gene para ver os

locais no tecido onde ocorre a

expressão;

Por hibridação a sonda se liga no RNA

mensageiro transcrito no tecido;

Ex. MMP 2 localizada em ligamento

periodontal;

Imunohistoquímica

Utiliza de anticorpos específicos para

determinadas proteínas para a

localização dos locais onde estão

presentes as proteínas no tecidos;

Estes anticorpos permitem a ligação de um

composto fluorescente para

visualização em microscópio

apropriado;

Ex. MMP 2 localizada em ligamento

periodontal;

• Arranjos conhecidos de milhares

de pequenas sequências de DNA

(SONDAS) em spots microscópicos

ligação a uma lâmina de vidro ou

chip de silicone

Microarray (micro-arranjos)

Sondas hidridizarão com amostras de

DNA alvo complementaridade de

bases FLUORESCÊNCIA

• Técnica utilizada para a análise da

expressão gênica de milhares de

genes SIMULTANEAMENTE

A – T

G - C

Maceração do tecido

em N2 líquido

Extração de

RNA total e

síntese de cDNA

Vermelho: cDNA paciente pré operatório

Verde: cDNA paciente pós operatório

Marcar DNA com

corantes fluorescentes

MICROARRAY

Síntese de cDNA

Scanner de

fluorescência

reconhece DNAs

marcados

Vermelho: cDNA paciente pré operatório

Verde: cDNA paciente pós operatório

Amarelo: expresso nas 2 condições de forma semelhante

Lâmina com 55.000 genes humanos

Identificação de 62 genes diferencialmente

expressos nas condições pré e pós-operatórias

Registration

Spots são lidos e o background é normalizado

RT-PCR vs. Microarray

Affymetrix GeneChips

PCR em Tempo Real

• Técnica para amplificar (aumentar quantidade) e, simultaneamente,

QUANTIFICAR uma molécula de DNA alvo

•Altamente sensível e específica

• Uso de fluoróforos que se intercalam em

DNA dupla fita à medida que ocorrem as

amplificações durante cada ciclo

• Fluorescência detectada por um

equipamento conectado a um computador

Quanto mais cópias de DNA (gene) presentes na

amostra (pré ou pós), maior será a fluorescência

detectada EXPRESSÃO AUMENTADA DO

GENE NAQUELA CONDIÇÃO

SYBR® Green

• Intercalante de DNA dupla fita

• Fluoróforo em suspensão

• Inespecífico

• Não permite multiplex

• A emissão de fluorescência é

proporcional ao número de

moléculas e ao tamanho do

amplicon

Sistema TaqMan