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TÉCNICAS MOLECULARES DEL ADN
24 de junio
2010
SEMINARIO II
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ÍNDICE
ENZIMAS DE LA RESTRICCIÓN (O ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN).......................................................4
SONDAS DE ADN........................................................................................................................................12
REACCIÓN DE LA CADENA DE LA POLIMERASA (PRC)................................................................................13
TIPOS DE PCR.............................................................................................................................................17
PCR CON TRANSCRIPTASA REVERSA (RT-PCR)...................................................................................17
PCR ANIDADA (NESTED-PCR).............................................................................................................18
PCR MÚLTIPLE (MULTPLEX-PCR)........................................................................................................19
PCR DE AMPLIO RANGO (BROAD RANGE PCR)..................................................................................20
OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN.......................................................................................................22
SISTEMA DE AMPLIFICACIÓN BASADO EN LA TRANSCRIPCIÓN.........................................................22
REACCIÓN EN CADENA DE LA LIGASA................................................................................................23
NORTHERN BLOT......................................................................................................................................23
CONCEPTO.........................................................................................................................................26
PROCEDIMIENTO...............................................................................................................................26
VENTAJAS Y DESVENTAJAS................................................................................................................31
APLICACIONES...................................................................................................................................32
WESTERN BLOT..........................................................................................................................................32
CONCEPTO.........................................................................................................................................32
PROCEDIMIENTO...............................................................................................................................32
APLICACIONES...................................................................................................................................34
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................................37
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HERRAMIENTAS PARA LAS TÉCNICAS MOLECULARES
ENZIMAS DE LA RESTRICCIÓN (O ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN)
INTRODUCCIÓNLAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, se descubrieron a partir de los trabajos del suizo WERNER ARBER
quien, en la década de 1960, estudiaba la especificidad de la infección de bacterias por parte de un FAGO llamado LAMBDA.
En 1970, el estadounidense HAMILTON O. SMITH purificó las primeras ENZIMAS DE RESTRICCIÓN y apenas un año más tarde, el estadounidense DANIEL NATHANS utilizó una ENZIMA DE RESTRICCIÓN para cortar y analizar el DNA del VIRUS SV-40.
ARBER, SMITH, y D. NATHANS, compartieron el PREMIO NOBEL en 1978 por el DESCUBRIMIENTO de la ENZIMAS DE RESTRICCIÓN y el desarrollo de sus aplicaciones.
El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.
Las bacterias contienen nucleasas capaces de reconocer secuencias cortas de nucleótidos en el ADN doble y desdoblar el esqueleto principal de la molécula en sitios muy específicos sobre ambas cadenas del doblete.
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CONCEPTO Endonucleasas de Restricción, Enzimas de Restricción o Restrictasas. La denominación se debe a
que las bacterias (Son extraídas de organismos procarióticos), las emplean para destruir el ADN
viral capaz de penetrar a la célula, y por lo tanto restringen el potencial de crecimiento de los virus.
El propio ADN de la bacteria se encuentra protegido de ataques nucleolíticos por metilación de los
sitios susceptibles sobre las bases (protegidas por Enzimas De Modificación).
En otras palabras actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño
que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para
distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. La mayor parte de secuencias de DNA, que son reconocidas por estas enzimas son PALÍNDROMOS
(Es decir, ambas cadenas de DNA poseen la misma secuencia de bases en la dirección 5´ - 3´) Con estas Enzimas de Restricción, se pueden aislar del genoma celular un fragmento de DNA que
contenga un gen específico Estas enzimas de origen bacteriano, reconocen secuencias específicas en el ADN e hidrolizan el
enlace pentosa-fosfato (fosfodiéster), produciendo así un corte en la molécula de ADN. El
esqueleto pentosa-fosfato se rompe entre dos bases en una hebra y en otras dos bases
equivalentes en la otra hebra lo que puede generar un corte a distinta altura en cada hebra y al
cortar ADN pueden producir dos tipos de cortes: Cohesivos o Romos.
Cohesivos o pegajosos o escalonado: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes.
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Abruptos o romos o lisos: cortan en un sólo punto.
- Al cortar una molécula de ADN con distintas enzimas de restricción se obtienen una mezcla de
fragmentos de distinto tamaño. Los fragmentos obtenidos se pueden separar por electroforesis.
Después se tiñen con un colorante y se obtiene un patrón d bandas. Cada banda corresponde a
un tamaño medido en pares de bases.
- El tamaño de los fragmentos se suele expresar en KILOBASES (1000 nucleótidos) si son cadenas
monocatenarias, o 1000 pares de bases si se habla de bicatenarias. Si el tamaño es inferior a
1000 bases se habla de bases o pares de bases.
- Casi todas las secuencias nucleolíticas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen
un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es
la misma, lo que recibe el nombre de palíndromos. La rotura se produce en ambas hebras de
ADN siendo ésta simétrica respecto al eje binario.
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- Las endonucleasas hidrolizan los enlaces internucleotídicos del interior de la cadena (partes
centrales de la cadena), mientras que las exonucleasas hidrolizan los enlaces internucleotídicos
del exterior de la membrana (actúan en los extremos de la cadena).
Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la actividad de las mismas:
Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad.
DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++
Contaminantes con carga (-).
DNA contaminado con otro DNA.
Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima).
Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones óptimas.
NOMENCLATURALas Endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está
dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:
Eco RI E = género Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
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CLASIFICACIÓNTIPO I:
Fueron los primeros en ser descritos. Lo característico de los sistemas de tipo I es que
las actividades de modificación (ruptura de ADN no metilado) y las de restricción están
producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades.
Algunas características son:
Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetrías.
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La actividad de restricción (de las subunidades R) corta lejos del sitio de
reconocimiento (del orden de unos 1000 pb.), y en lugares inespecíficos.
La restricción requiere de ATP.
La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como
donador de los grupo metilo.
Tipo II:
Poseen sólo actividad de restricción (ruptura). Aquí cada subunidad del dímero
reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes especulares del
palíndromo, y realiza un corte en un lugar específico, que obviamente tiene su
correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palíndromo. Más de la tercera
parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas
de ellas son codificadas a partir de genes situados en plásmidos. Algunas
características que tiene este mecanismo son:
Las dos actividades las realizan dos proteínas distintas que no formas complejos
multiproteicos.
No utilizan ATP. Sólo necesitan iones Mg2+ para funcionar. La metilasa usa SAM como
donador de metilos.
Cada miembro de la pareja de modificación y restricción reconoce la misma secuencia
específica de ADN.
El sitio de reconocimiento consta de 4 o 8 pb. que constituyen una secuencia que se
lee en forma igual en ambas direcciones palindrómica.
La metilasa suele ser una proteína monomérica, que introduce grupos metilo en una A
o en una G (según la metilasa en cuestión), en ambas cadenas, dentro del sitio de
reconocimiento.
La restrictasa suele ser una proteína formada por dos subunidades del mismo tipo,
ensambladas simétricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o extremos romos.
Algunas restrictasas dejan extremos protuberantes 5', mientras que otras dejan
extremos protuberantes 3'.
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Tipo III:
Poseen actividad de restricción (ruptura) y modificación (mutilación). Cortan fuera de
la secuencia que reconocen. Requieren dos secuencias de reconocimiento en
orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Son ATP-dependientes.
Las de más utilidad en los métodos de manipulación del ADN, son las del Tipo II, debido
a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la
de ruptura, todas las enzimas de restricción comerciales son de esta categoría.
APLICACIONESUno de los campos en los que el uso de enzimas de restricción ha tenido mayor implicación ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.
SONDAS DE ADN: CONCEPTO, CLASIFICACIÓN
Las sondas de ADN se pueden utilizar de manera semejante a los anticuerpos, como herramientas sensibles y específicas para detectar, localizar y cuantificar secuencias de ácidos nucleicos específicos en muestras clínicas. La especificidad y la sensibilidad de las técnicas basadas en sondas de ADN permiten detectar especies o cepas de un agente infeccioso, incluso en ausencia de proliferación o replicación.
Las sondas de ADN se sintetizan a través de métodos químicos o bien se obtienen por clonación de fragmentos genómicos específicos o de un genoma vírico completo en vectores bacterianos (plásmidos, cósmidos). Las copias de ADN de los virus de ARN se fabrican por medio de una transcriptasa inversa retrovírica y luego se clonan en estos vectores. Tras llevar a cabo tratamientos químicos o térmicos para «fundir» (separar) las cadenas de ADN de la muestra, se agrega la sonda de ADN y se permite su hibridación (unión) a la secuencia idéntica o casi idéntica de la muestra. Es posible modificar la exactitud (la necesidad de una correspondencia exacta de la secuencia) de la interacción con el fin de detectar secuencias relacionadas o distinguir cepas diferentes (mutantes). Las sondas de ADN se marcan con nucleótidos radiactivos o modificados por métodos químicos (p. ej., uridina biotinilada) con el objeto de detectarlas y cuantificarlas. La aplicación de una sonda de ADN marcada con biotina permite emplear un nucleótido fluorescente o una molécula de avidina o estreptavidina (una proteína que se
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une fuertemente a la biotina) marcada enzimáticamente para detectar ácidos nucleicos víricos en una célula de manera similar a la localización de un antígeno por inmuno-fluorescencia indirecta o enzimo-inmunoanálisis. Las sondas de ADN son capaces de detectar secuencias genéticas específicas en muestras tisulares de biopsia fijadas y permeabilizadas por hibridación in situ. La localización de células infectadas por citomegalovirus (figura 17-3) o por papilomavirus por hibridación in situ es una opción más conveniente que los medios inmunológicos de detección y representa el único sistema comercializado de detección de papilomavirus. Actualmente se dispone en los comercios de un gran número de sondas víricas y de equipos de reactivos para detectar partículas víricas. Se pueden detectar secuencias de ácidos nucleicos específicos en extractos de una muestra clínica aplicando un pequeño volumen del extracto en un filtro de nitrocelulosa (transferencia puntual) y después aplicando una sonda de ADN vírico específico marcado sobre el filtro. Otra posibilidad es la transferencia del patrón de restricción por endonucleasas de restricción separado electroforéticamente a un filtro de nitrocelulosa (transferencia de Southern: hibridación de sonda ADN: ADN) para después identificar la secuencia específica por hibridación con una sonda genética específica y su movilidad electroforética característica. Se puede detectar de forma semejante el ARN separado mediante electroforesis (transferencia de Northern: hibridación de sonda ARN: ADN) y fijado a un filtro de nitrocelulosa.
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TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DEL ADN
REACCIÓN DE LA CADENA DE LA POLIMERASA (PRC)Concepto
La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean.
Su copiado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN.
La PCR es una técnica de biología molecular altamente específica, rápida, sensible y versátil para detectar cantidades ínfimas de un cierto ADN específico, posibilitando su fácil identificación y prescindiendo del uso de radioisótopos, indispensables antes de su invención.
Al principio, su inventor enfrentó dos problemas fundamentales: uno era que en cada ciclo había que añadir la enzima ADN polimerasa, ya que ésta se inactivaba con las temperaturas tan altas demandadas para desnaturalizar el ADN y exponer las bases nitrogenadas de sus nucleótidos. Otro inconveniente era que había que hacerlo manualmente en tres baños mantenidos a las diferentes temperaturas requeridas, pasando rápidamente la muestra de un baño al otro y luego al último, repitiendo esto varias decenas de veces.
El descubrimiento de una bacteria (Thermus aquaticus) que vive en aguas termales junto a geissers a 75°C, la cual tiene una ADN polimerasa que funcionaba bien a altas temperaturas (72°C) e incluso es estable a 94°C, supuso un gran avance, ya que sólo tenía que ser añadida al principio y se mantenía activa durante todo el proceso. Esto, junto con el diseño de los termocicladores o aparatos que consisten en un bloque que puede ser programado para calentarse y enfriarse rápidamente en determinados tiempos, condujo a la automatización total del proceso.
Fundamento
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue descrita por primera vez en 1983 por Kary B. Mullis como ya lo mencionamos anteriormente.
Esta invención lo hizo acreedor en 1993 del Premio Nobel en Química, debido al gran impacto que ha tenido esta técnica en el área de la bioquímica. Su objetivo y función es la de obtener mediante amplificación in vitro cantidades “masivas” de ADN incluso a partir de muestras de ADN muy pequeñas.
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Para realizar el PCR más sencillo, se requiere conocer las secuencias que rodean la región a amplificar, luego se producen oligonucleótidos complementario a estas secuencias mediante síntesis química automatizada y estos son utilizados como cebadores (primers) en una reacción de polimerización cíclica catalizada por la ADN polimerasa.
En primer lugar el ADN que contiene la secuencia que se quiere amplificar se desnaturaliza mediante calor y luego se alinea con los cebadores, los cuales se encuentran presentes en exceso. A continuación, la ADN polimerasa realiza la extensión de la cadena de ADN a partir de los extremos del cebador, incorporando deoxinucleótidos trifosfato que se añaden a la reacción. Luego se aplica un segundo ciclo de desnaturalización por calor, alineado y extensión del cebador.
Se utiliza una ADN polimerasa resistente a la temperatura, la Taq polimerasa, procedente de una bacteria llamada Thermus aquaticus que vive en aguas termales. Sin embargo esta polimerasa no presenta actividad 3´ exonucleasa de corrección de pruebas, por lo que la síntesis es relativamente inexacta. Este ciclo se repite unas 30 veces o más en un dispositivo de regulación automática de temperatura conocido como termociclador.
Después de 32 ciclos se producen alrededor de 1X 109 copias del ADN molde original, o 2n-1, donde n es el número de ciclos.
Procedimiento
Tres son los pasos a seguir y a repetir por cada ciclo de la PCR. A éstos comúnmente se les refiere como desnaturalización, alineamiento y extensión.
Si de trabajar con ADN genómico se trata, regularmente se agrega una etapa previa de desnaturalización a 94°C, para relajar las posibles estructuras secundarias y de otros tipos.
Después de concluida ésta, se repiten los diferentes ciclos en los que tanto la temperatura como el tiempo serán específicos del producto a amplificar y del origen del ácido nucleico que servirá, como ya se mencionó, de plantilla o molde a copiar por la polimerasa utilizada.
- Desnaturalización
El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de simple cadena que actúa como molde para la síntesis de su nueva cadena complementaria. Mediante un calentamiento a 94°C, el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se separen o desnaturalicen.
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Ésta es una etapa crítica, ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente, lo que se consigue a temperaturas de 94ºC, durante por lo menos un minuto. Si la muestra tiene alto contenido de G+C, se recomienda aumentar de preferencia el tiempo.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a partir de los 95ºC (vida media a 92.5ºC =2h, a 95ºC = 40 min. y a 97.5ºC = 5 min.), por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación.
En la práctica se suele empezar con un período de desnaturalización prolongado (cinco minutos a 94ºC), para asegurarse que la desnaturalización se lleve a cabo a lo largo de toda la molécula del ADN.
- Alineamiento
La enzima, como todas las ADN polimerasas, necesita del grupo OH- libre en el extremo 3´ del iniciador ya apareado al sitio blanco de la amplificación, a partir de donde iniciar la síntesis. Este punto constituye el sitio de crecimiento de la cadena complementaria al molde.
Mientras que un cebador (referido como el 5´ o sentido) es complementario a la secuencia del extremo 5´ de la región del ADN molde a amplificar, el otro es al extremo 3´ de la misma, pero en la cadena opuesta.
El alineamiento específico de ambos cebadores se produce a una temperatura determinada por composición de bases y oscila entre 40 y 72°C. Ambas cadenas originales del ADN sirven simultáneamente como moldes para sintetizar sus respectivas cadenas complementarias nuevas.
Un aumento de temperatura favorece la especificidad, ya que disminuye las uniones incorrectas de los cebadores con sitios apócrifos del ADN molde.
- Extensión
Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en los sitios donde los iniciadores se aparean, la polimerasa empieza a copiar la hebra, incorporando desoxirribonucleósidos monofosfatos en dirección5´a 3´.
Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que es la que coincide con la máxima actividad de la polimerasa (72°C) para evitar alineamientos inespecíficos de los iniciadores.
El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación, debiendo estimar 1 min. para alargar 1000 nucleótidos.
Es común que al finalizar todos los ciclos se realice un último alargamiento por 5 min. a 72ºC, para asegurarse que todos los productos de amplificación estén completamente terminados y tengan, por ende, exactamente la misma longitud.
Naturaleza exponencial de los ciclos
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Al final del primer ciclo, ambas hebras de una molécula bicatenaria de ADN a las que se les hayan apareado los iniciadores han sido copiadas para generar dos nuevas cadenas bicatenarias.
Cuando se repite por segunda ocasión el ciclo de tres pasos, las dos moléculas del primer ciclo se copian para producir ahora cuatro moléculas.
El tercer ciclo genera ocho moléculas. En teoría, 20 ciclos producirán aproximadamente un millón de copias de la molécula molde de ADN, y 30 ciclos generarán alrededor de mil millones de copias de ésta.
Pero en la práctica, el proceso no es tan eficiente. El número de ciclos que se utiliza adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR.
Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera empírica).
Es importante evitar un número alto de ciclos, ya que pueden dar lugar a la amplificación de productos no deseados originados por hibridaciones inespecíficas.
Hay que tener en cuenta que la enzima sufre el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación del producto, reflejándose esto en que después de un número determinado de ciclos la amplificación deja de comportarse de manera exponencial, volviéndose aritmética, y finalmente llega a una fase estacionaria. Afortunadamente, cuando el efecto meseta se presenta, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilización.
Aplicaciones
Las aplicaciones de esta técnica son innumerables y su aporte al avance del conocimiento y manipulación del material genético es invaluable. Dentro de las aplicaciones más importantes se pueden mencionar: los análisis forenses, identificación de sospechosos con pequeñas muestras de sangre, semen o pelo, identificación de padres en litigios de paternidad, en la antropología molecular, en la arqueología molecular, en microbiología ambiental, en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, en el diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas, diagnóstico de cáncer, en técnicas de clonaje y secuenciación de ADN genómico entre otros.
TIPOS DE PCR
PCR CON TRANSCRIPTASA REVERSA (RT-PCR)DefiniciónReacción de transcripción inversa en cadena de la polimerasa (RT-PCR) se basa en la reacción en
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cadena de la polimerasa (PCR). Más importante aún, se basa en el proceso de transcripción inversa, que invertir transcribe el ARN en ADN y fue aislado inicialmente de los retrovirus. Las técnicas de RT-PCR permite la formación de ADNc (complementario o de copias de ADN) de ARN, que almacena la secuencia de ARN (como el ARN mensajero, ARNm) en forma más estable de ácido nucleico, el ADN. Esta transcripción inversa del ARN en su reverso complemento de ADN (ADNc) es el primer paso de un proceso por lo general en dos etapas de RT-PCR. Por otra parte, copiando el ARN en ADN, se puede entonces amplificar la secuencia del ADNc utilizando iniciadores específicos para la secuencia de ADN. Esta amplificación es el último segundo paso importante del proceso en dos etapas de RT-PCR.
Su procesoRT-PCR utiliza un par de cebadores que son complementarios a una secuencia definida en cada una de las dos hebras del ADN. Estos cebadores son luego extendidos por una ADN polimerasa y se hace una copia de la cadena después de cada ciclo, lo que lleva a una amplificación logarítmica.
RT-PCR incluye tres pasos principales.
1. Transcripción reversa (RT), donde el ARN es inversamente transcrito en ADN complementario (ADNc) por una transcriptasa inversa. Este paso es muy importante para llevar a cabo la polimerización en cadena de la polimerasa de ADN, ya que sólo puede actuar sobre plantillas de ADN. La transcripción reversa se puede realizar en el mismo tubo de PCR (PCR de un solo paso) o en uno por separado (PCR en dos etapas), usando una temperatura entre 40 y 50°C, dependiendo de las propiedades de la transcriptasa reversa usada.
2. Desnaturalización del ADN de doble cadena a 95 °C, por lo que las dos hebras se separan y los cebadores pueden nuevamente unirse a temperaturas más bajas y comenzar una reacción en cadena nuevamente. Luego, la temperatura disminuye hasta alcanzar la temperatura de recocido, la cual puede variar dependiendo de los cebadores usados, su concentración, la sonda y su concentración (si se usa) y la concentración de cationes. La principal consideración al elegir la temperatura de recocido óptima e la temperatura de fusión de los cebadores y sondas (si se usan). La temperatura de recocido elegida para una PCR depende directamente de la duración y composición de los cebadores. Este es el resultado de la diferencia de los puentes de hidrógeno entre A=T (2) y C≡G (3). Usualmente se usa una temperatura de recocido a unos 5 grados por debajo del punto de fusión más bajo de los dos cebadores usados.
3. Extensión del ADN de los cebadores. Esto se hace con Taq ADN polimerasa termoestable, usualmente a 72°C, temperatura a la cual la enzima funciona óptimamente. La duración de la incubación a cada temperatura, los cambios de temperatura y el número de ciclos son controlados por un termociclador programable.
Sus aplicacionesLa amplificación exponencial de la secuencia complementaria de ARNm o de secuencias de ARN a través de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa permite una técnica de alta sensibilidad de detección, donde el número de copias bajo o menos abundantes moléculas de ARN pueden ser detectados. También se utiliza para clonar secuencias de ARNm en forma de ADN complementarios. Además, permite la creación de ADNc, construcciones que fueron clonados por RT-PCR y permitir la expresión de genes en el ARN y proteínas para estudios posteriores.
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PCR ANIDADA (NESTED-PCR)DefiniciónVariante de la PCR convencional que comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción con los iniciadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el segmento diana. Después, con este producto de amplificación, se ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos para amplificar la región específica.
Su proceso1. El ADN diana sufre el primer paso de reacción de polimerasa en cadena con la primera serie de
cartillas, que se muestra en verde. La selección de imprimación alternativas y similares los sitios de unión da una selección de productos, sólo uno que contiene la secuencia prevista.
2. El producto de la primera reacción se somete a una segunda vuelta con el segundo conjunto de cebadores, que se muestra en rojo. Es muy poco probable que alguno de los productos de la PCR no deseados contienen sitios de unión tanto para las cartillas nuevas, asegurando que el producto de la PCR segunda poca contaminación de los productos no deseados de los dímeros de cebadores, horquillas, y otros tipos de secuencias diana de imprimación.
Esta modificación consiste en una amplificación de una parte de un producto de una reacción de PCR realizada con anterioridad. El producto obtenido está comprendido dentro de la secuencia del producto de la primera ronda. Esta modificación permite aumentar significativamente la sensibilidad y la especificidad de la reacción de la PCR.
A veces 1 ronda de PCR no da un producto único debido a que partimos de un templado complejo, o queremos mejorar la sensibilidad. Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros, realizando una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera.
Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios de hibridación para el segundo par de primers.
PCR MÚLTIPLE (MULTPLEX-PCR)Definición
PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción, todos los pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de base de datos.
Procedimiento
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Aplicaciones
Multiplex PCR es una variante del PCR que permite la amplificación simultánea de muchos objetivos de interés en una reacción mediante el uso de más de un par de iniciadores. Desde su primera descripción en 1988 por Chamberlain et al, este método se ha aplicado en muchas áreas de las pruebas de ADN, incluidos los análisis de delecciones, mutaciones y polimorfismos o análisis cuantitativos y PCR de transcripción
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inversa. Normalmente, se utiliza para la genotipificación de aplicaciones donde se requiere el análisis simultáneo de múltiples marcadores, la detección de agentes patógenos o los organismos genéticamente modificados (OGM), o cuando los análisis de microsatélites. Ensayos Multiplex puede ser tedioso y lleva mucho tiempo para establecer, que requieren largos procedimientos de optimización.
Con esta metodología es posible la detección de la presencia de dos o más microorganismos en forma simultánea en una sola reacción. Esta modificación permite descartar rápidamente la infección por los patógenos habitualmente responsables de los cuadros que se quiere diagnosticar. Para poder aprovechar todas las ventajas de esta técnica, es necesario respetar cuidadosamente las instrucciones de toma de muestra, conservación y condiciones para el envío al laboratorio ya que es una reacción muy sensible a la presencia de inhibidores y contaminantes. Describe una PCR en la cual hay presentes múltiples pares de primers lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa.
- Multiplex PCR es frecuentemente usada en diagnóstico médico- Ahorra muestra, tiempo y gastos- Requiere una cuidadosa optimización
PCR DE AMPLIO RANGO (BROAD RANGE PCR)Definición
La tecnología PCR puede ser usada para investigar la amplitud de la diversidad microbiana en un ambiente determinado. En PCR de amplio rango, los cebadores son diseñados de tal manera que son complementarios a regiones conservadas de un gen en particular, compartido por un grupo de microorganismos. Por ejemplo, los cebadores que son complementarios a regiones conservadas del gen del ARNr 16S, han sido usados con la intención de explotar las variadas regiones internas de la secuencia amplificada para secuenciación y más allá de eso, identificación.
Procedimiento
- Inicialmente, el ADN bacteriano es extraído directamente de las muestras, y el gen del ARNr 16S es aislado por medio de amplificación por PCR con cebadores de oligonucleótidos específicos para regiones conservadas del gen ("universales" o cebadores de amplio rango).
- La amplificación con cebadores universales resulta en una mezcla de genes del ARNr 16S amplificados de virtualmente todas las bacterias presentes en la muestra. En infecciones mixtas, la secuenciación directa de los productos de la PCR no puede ser hecha porque hay productos mezclados de las diferentes especies que componen el consorcio.
- Los productos de la PCR son luego, clonados en un plásmido vector, que es usado para transformar células de Escherichia coli, estableciendo una biblioteca de clones del gen del ARNr 16S de la muestra.
- Los genes clonados son secuenciados individualmente, y la identificación preliminar puede ser hecha usando búsquedas de similitud en bases de datos públicas.
- El análisis filogenético podría también ser hecho para identificación exacta. La PCR de amplio rango puede detectar diversidad bacteriana inesperada en una muestra, y en lo que respecta a esto, es muy efectiva y precisa.
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Aplicaciones
- Para la detección general de bacterias en la sangre, se han desarrollado varios ensayos llamados PCR de amplio rango, los que se basan en la amplificación del gen del ARNr de 16S o 23S, el cual está presente en todas las bacterias. Sin embargo, la interpretación clínica de estos estudios es dificultosa; en primer lugar, una señal de PCR "positiva" con cultivos negativos podría ser falsa, pero también verdadera, como resultado de la elevada sensibilidad del método, y puede deberse a la detección de un número bajo de microorganismos, de gérmenes exigentes o al escaso crecimiento bacteriano debido al uso previo de antibióticos. Por definición, una prueba diagnóstica nueva no puede demostrar ser superior al criterio estándar de referencia, en este caso los hemocultivos. El valor del resultado de la PCR debe ser analizado dentro del contexto clínico del paciente. Un segundo problema es que detecta no solo a las bacterias vivas, sino a las que están muertas o en proceso de degradación. Esta característica, posiblemente, aporta una mayor sensibilidad. Además, puede detectarse una cantidad mínima de ADN bacteriano en la sangre de personas sin una bacteriemia verdadera o aun en la sangre de individuos sanos. Por último, otro problema es el riesgo aumentado de contaminación del laboratorio con estos tipos de pruebas.
- Detección de erhlichiosis, erhlichiosis granulotrópica, etc.- PCR de amplio espectro en meningitis: una nueva arma diagnóstica. ¿Ciencia ficción o realidad?
Estudio para determinar la utilidad de una técnica rápida (2 horas) de amplificación del DNA bacteriano mediante PCR de amplio espectro (broad-range bacterial PCR o BRB-PCR) en casos de meningitis bacteriana. La PCR se realizó utilizando una secuencia de primer derivada de regiones altamente conservadas del gen bacteriano 16S RNA, conocido como primer "universal" por su capacidad de amplificar productos de 241-bp procedentes de cualquier especie bacteriana. Se estudiaron 74 muestras de LCR, agrupadas en tres categorías: LCR normal (20), LCR con >100 células pero con microbiología negativa (37) y LCR con tinción de Gram y/o cultivo positivos (17). Todas las BRB-PCR fueron negativas en los LCR normales y positivas en todos los infectados. En tres casos que habían recibido antibióticos previamente la BRB-PCR mostró mayor sensibilidad que el cultivo y la tinción de Gram. En conjunto y utilizando el cultivo como patrón, la BRB-PCR mostró sensibilidad del 100%, especificidad del 98,2%, VPP 94,4% y VPN 100%.
Comentario: Hasta ahora conocíamos la utilización de técnicas diagnósticas mediante amplificación de DNA bacteriano por PCR con primers específicos. Se han empleado para la detección individual de S. pneumoniae resistente a penicilina, N. meningitidis, Estreptococos del grupo B, L. monocytogenes y M. tuberculosis. Su uso no esta generalizado y muestra evidente complejidad, costo y consumo de tiempo. Sin embargo, la PCR rápida de amplio-espectro podría convertirse en un método de ayuda diagnostica rápido y muy fiable para determinar la presencia de una meningitis bacteriana y, como consecuencia, decidir sobre la utilización de antibioterapia. Si la BRB-PCR es negativa, sería razonable no utilizar antibióticos. Probablemente, donde mas utilidad podría tener la BRB-PCR es en aquellos casos con pleocitosis elevada, quizás con predominio polimorfonuclear y microbiología negativa; en tales casos (donde se incluirían muchas meningitis decapitadas) la BRB-
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PCR podría ser determinante para decidir sobre la necesidad de indicar la antibioterapia. Jesús María Gómez Mateos.
Saravolatz LD, Manzor O, VanderVelde N et al. Broad-range bacterial polymerase chain reaction for early detection of bacterial meningitis. Clin Infect Dis 2003; 36:40-45.
OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN
SISTEMA DE AMPLIFICACIÓN BASADO EN LA TRANSCRIPCIÓNTMA es un sistema de amplificación basado en la transcripción del ARN con dos enzimas para producir la reacción: la ARN polimerasa y transcriptasa inversa (o reversa). TMA es isotérmica, toda la reacción se lleva a cabo a la misma temperatura en un baño de agua o bloque de calor. Esto está en contraste con otras reacciones de amplificación como la PCR o LCR que requieren un instrumento termociclador para cambiar rápidamente la temperatura para producir la reacción.
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TMA puede amplificar AND o ARN, y produce amplicón de ARN (amplición: pieza de ADN que ha sido sintetizada usando técnicas de amplificación), en contraste con la mayoría de los otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos que sólo producen AND. TMA tiene una cinética muy rápida que resulta en una amplificación de mil millones de veces a los 15-30 minutos. TMA se ha combinado con la hibridación de Gen-Probe de Protección de ensayo (HPA) técnica de detección en un formato único tubo. No existen pasos de lavado, y el amplicón no es transferido fuera del tubo cada vez, que simplifica el procedimiento y reduce las posibilidades de contaminación.
TMA es la próxima generación de tecnologías de amplificación de ácido nucleico, y está disponible hoy con el GEN-PROBE ® ™ AMPLIFICADO productos - APTIMA ® Combo 2 ™ para Chlamydia trachomatis y Neisseria gonnorhoeae, Amp CT ensayo para Chlamydia trachomatis y prueba de MTD para Mycobacterium tuberculosis.
REACCIÓN EN CADENA DE LA LIGASAEl método de reacción en cadena de la ligasa utiliza una ligasa termoestable. En la figura se presenta el proceso esquemáticamente. Se utilizan cuatro cebadores que se alinean en regiones inmediatamente adyacentes al molde. Dos de ellos se alinean con la cadena superior. El segundo par de cebadores es complementario del primero y se alinea con la cadena opuesta. La hibridación entre los cebadores se evita incluyendo ADN portador
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y una cola 3' en cebadores opuestos. Estos cebadores se mezclan con el molde y la ligasa termoestable, y se incuban a 95 °C durante 1 minuto para la desnaturalización, y a continuación a 65 °C durante 4 minutos, para la alineación del cebador y la ligazón. Los pasos de desnaturalización y alineación/ligazón se repiten 10-20 ciclos.
La amplificación se produce sólo tras la ligazón de los oligonucleótidos adyacentes. El cebador de adelante debe estar fosforilado en el extremo 5', ya que la ADN ligasa requiere como sustrato un 5' fosforilado y un 3' libre. El cebador 5' está marcado en su extremo con P-32, y los productos amplificados se observan tras la electroforesis en gel y la autorradiografía. Alternativamente, para la detección no radiactiva de estos productos pueden sintetizarse cebadores que lleven biotina.
La técnica de la ligasa no está tan desarrollada y es más compleja que la de la polimerasa, además requiere mínimo 1000 fragmentos para poder amplificar, pero este mínimo es suficiente para su aplicación en el diagnóstico prenatal. En la reacción en cadena por la ligasa también pueden aparecer falsos positivos, producidos por contaminación. La técnica se utiliza principalmente para el diagnóstico de enfermedades víricas y genéticas.
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TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN: SOUTHERN BLOT
CONCEPTO
Es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de restricción específicos de ADN en una mezcla compleja de fragmentos de restricción, mediante la electroforesis en gel; es decir en otras palabras, es una forma de visualizar un fragmento específico de ADN, de entre los muchos miles de moléculas “contaminantes”.
Se le denominó Southern Blot en honor al biólogo británico Edward Southern, quien la desarrolló en la utilización de segmentos de ADN clonados, separados por electroforesis transferidos a filtros y rastreados con sondas. Las demás técnicas fueron nombradas en relación a la primera técnica (ejemplo: Northern, Western).
Para el desarrollo de esta técnica se hace uso de dos herramientas: Las endonucleasas de restricción y las sondas o rastreadores moleculares.
Las enzimas de restricción son enzimas que cortan la doble cadena del ADN en sitios que contengan una secuencia de bases específicas o sitios de restricción y generan fragmentos de diversos tamaños denominados fragmentos de restricción (RFLP, del inglés, Restriction fragment lengh polymorphism). Existen muchas enzimas de restricción y cada una reconoce una secuencia diferente, de tal modo que con cada enzima se obtiene distintos tipos de fragmentos.
Las sondas son fragmentos de ADN de localización cromosómica conocida. Se obtienen de tres fuentes: Las sondas de ADN genómico se extraen de preparaciones cromosómicas; las sondas de ADN complementario (ADNc), se sintetizan a partir del ARNm del gen de interés o en estudio; por último, algunos tipos de sondas oligo-alelo-especificas (sondas OAE) que rastrean directamente a los alelos mutados, se sintetizan químicamente. Para que sean identificables, las sondas se marcan mediante una síntesis in vitro, en la que uno de los cuatro nucleótidos utilizados que contiene un átomo que emite radiaciones es incorporado en la sonda producida.
Los insertos de ADN clonados en vectores pueden utilizarse en experimentos de hibridación para caracterizar la identidad de genes específicos, para localizar regiones codificantes en secuencias clonadas y para investigar la organización molecular de secuencias genómicas.
PROCEDIMIENTO
Para realizar la técnica de Southern, el ADN genómico se expone a la acción de las enzimas de restricción (endonucleasas), y los fragmentos de restricción producidos se separan de acuerdo al tamaño en una placa de gel por efecto de un campo electroforético, moviéndose los fragmentos más grandes más lentamente que los pequeños.
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3.1. ACCION DE LAS ENDONUCLEASA DE RESTRICCIÓN
Las nucleasas son enzimas que van a hidrolizar los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos. Las endonucleasas de restricción tienen la función de limitar la entrada de ADN extraño mediante el corte o escisión de unas secuencias identificadas específicas del ADN, llamadas secuencias de restricción o de identificación. Las endonucleasas de restricción tienen tres tipos:
- TIPO I: Catalizan la mutilación del ADN y la ruptura del ADN no metilada.- TIPO II: Sólo posee actividad nucleolítica.- TIPO III: Mutilan y rompen.
El tipo más útil es el tipo II, debido a su especificad de secuencia absoluta para la reacción de unión y la ruptura, además solo necesitan de Hg++ y no necesitan de ATP como el tipo I y tipo III.
Otro aspecto importante es que, en casi en todas las secuencias nucleótidos reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, por lo que la lectura de las secuencias es la misma en ambas direcciones, por lo cual recibe el nombre de palíndromos. La ruptura se produce en ambas hebras de ADN y es simétrica con respecto al eje de simetría binario. Las endonucleasas de restricción al cortar el ADN generan extremos de 3’ a 5’ monocatenarios, de unos cuatro nucleótidos de longitud, que bien pueden ser extremos ramos o cohesivos.
Las endonucleasas de restricción que nos interesan en este procedimiento son las que dejan extremos cohesivos son muy útiles para la donación del ADN, dado que pueden aparearse con los extremos complementarios de ADN vector tratados con la misma enzima de restricción.
3.2. DESNATURALIZACIÓN DEL ADN Y TRANSFERENCIA A UN FILTRO
Mediante el proceso de desnaturalización química (pH alcalino) se rompe la unión entre las dos cadenas de cada fragmento y luego éstos se exponen a una transferencia por capilaridad a una membrana de nitrocelulosa (inicialmente se utilizó la nitrocelulosa y en la actualidad el nylon), obteniéndose así una réplica exacta del gel, al adherirse los fragmentos transferidos (de cadena simple) a la membrana.
Para la transferencia de los fragmentos de ADN del gel al soporte sólido, generalmente se emplea un tratamiento ácido que elimina las purinas y fragmenta los trozos de ADN separados, haciéndolos más pequeños y más fáciles de eludir del gel. La transferencia se hace colocando la hoja de la membrana encima del gel, y provocando que el tampón pase por el gel y por la hoja de nitrocelulosa o de nylon por capilaridad. En la actualidad, se emplean sistemas de vacío o de presión para acelerar este proceso. El tampón pasa por el gel y por la membrana, arrastrando al ADN fuera del gel e inmovilizándolo en la membrana.
En la práctica, esto se hace poniendo el gel con el ADN desnaturalizado sobre una gruesa esponja que actúa de mecha. La esponja está parcialmente sumergida en una cubeta con tampón. Se pone una membrana encima del gel, y se cubre con hojas de papel secante o absorbente y un peso. La acción capilar arrastra el tampón de la cubeta a través de la esponja, del gel, de la membrana, y del montón de papel secante. Al pasar el tampón por el gel, los fragmentos de ADN se transfieren a la membrana, a la
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que se unen. Después de la transferencia, el ADN de cadena sencilla se fija a la membrana calentándola a 80ºC o exponiéndola a luz ultravioleta para que se hagan uniones entre los fragmentos y la membrana.
3.3. HIBRIDACIÓN DEL FILTRO CON UNA SONDA RADIACTIVA
Posteriormente se realiza la hibridación. En esta etapa, se incuba la membrana con la solución que contiene a la sonda marcada y previamente desnaturalizada, para que ésta se una, por complementariedad de bases nitrogenadas, a uno o varios de los fragmentos de restricción que contiene gen detectable por la sonda. Transcurrido el tiempo suficiente para que se produzca el proceso de fijación, se extrae la membrana de la solución de hibridación y se lava para eliminar exceso de sonda que no hibridó. La membrana lavada se coloca sobre una película radiográfica que capta la radiactividad; así, se produce patrón de bandas que revela al gen que se debe analizar.
El método original para detectar los productos que se separan, se base en el marcaje radiactivo de la muestra. Un marcador es un átomo o molécula que permite visualizar otra molécula. El isótopo del fósforo con número de masa 32 era muy usado con anterioridad para este fin. Más recientemente el isótopo de azufre con masa 35 ha sido empleado más extensamente. Las moléculas de ADN experimentan una reacción que incorpora el isótopo radiactivo al ADN. Cuando los oligonucleótidos se han separado, el gel se pone en contacto con una placa radiográfica. Los oligonucleótidos radiomarcados producen exposiciones en las posiciones de la placa con las cuales entran en contacto.
Al revelar dicha placa, las posiciones de las sustancias marcadas se observan como bandas oscuras. Esta técnica se llama autorradiografía y la placa resultante es una autorradiograma. La interpretación se realiza mediante la observación de las bandas, por autorradiografía o colorimetría, que indican la presencia de ácido nucleico en la muestra híbrida con la sonda aplicada. La ausencia de bandas señala la ausencia de secuencias complementarias.
METODO SOUTHERN BLOT PASO A PASO
PASO 1
Se realiza la separación del ADN de alto peso molecular en pequeños fragmentos, mediante la acción de una enzima de restricción (endonucleasas), que es específica para cada tipo de fragmento.
PASO 2
Tras la acción de la enzima de restricción los fragmentos se separan de acuerdo a su tamaño molecular mediante un proceso de electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio.
En la electroforesis las moléculas de ADN, que están cargadas negativamente, se dirigen hacia el electrodo positivo, sin embargo, su velocidad de migración es
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interrumpida por el el gel de agarosa. De manera que las moléculas de menor peso se viene más deprisa que las de mayor peso. En consecuencia, se produce la separación de los fragmentos del ADN de acuerdo a su tamaño (los fragmentos más pequeños avanzan más distancia con respecto al punto de aplicación de la muestra).
PASO 3
Los fragmentos generados son transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa). Este proceso se lleva a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en una solución llamada de transferencia (solución salina concentrada). A continuación se sitúa la membrana sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca, y por capilaridad la solución de transferencia es atraida a la pila de papel filtro, arrastrando consigo al ADN hacia la membrana donde queda inmovilizado conservando la misma posición relativa que ocupaba en el gel.
PASO 4.
Posteriormente se realiza la hibridación bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que la favorezcan. En esta etapa se incuba la membrana con la solución que contiene a la sonda marcada y previamente desnaturalizada, para que ésta se una, por complementariedad de bases nitrogenadas, a uno o varios de los fragmentos de restricción que contienen el gen detectable por la sonda.
Luego de la hibridación, se lava la membrana para eliminar el exceso de sonda que no hibridó.
PASO 5
La localización de los fragmentos que han hibridado se realiza por autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva, si la sonda estaba marcada radiactivamente, o mediante otras técnicas, si se han usado sondas marcadas o compuestos no radioactivos.
La interpretación se realiza mediante la observación de las bandas, por autorradiografía o colorimetría, que indican la presencia de ácido nucleico en la muestra que hibrida con la sonda aplicada. La ausencia de bandas señala la ausencia de secuencias complementarias.
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Esquema simplificado del Southern Blot
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS
La principal ventaja de Southern Blot es su alta especificidad y su reproducibilidad, además de permitir la valoración del estado físico del ADN, y así poder valorar si el ADN viral está integrado en el genoma del huésped o permanece como episoma en el huésped. Es un método excelente para detectar pérdidas homocigóticas.
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DESVENTAJAS
Su utilización tiene algunos inconvenientes derivados de su complejidad, costo y requerimientos de tiempo y esfuerzo. Por otro lado, no permite determinar en forma precisa secuencias repetitivas de tamaño pequeño, lo que resulta extremadamente importante cuando necesitamos distinguir secuencias normales y premutadas. Además, no es posible identificar delecciones o rearreglos pequeños ubicados en la región que rodea la secuencia repetitiva. Otro inconveniente en el uso de esta metodología es que, en ocasiones, el sitio de restricción específico de la enzima (EcoRI), se muestra refractario a la digestión, lo cual genera fragmentos adicionales que dan lugar al diagnóstico de falsos positivos para la mutación completa en estos pacientes. De todas maneras, a pesar de su complejidad y de los potenciales riesgos cuando se usa el marcaje radiactivo, este procedimiento sigue siendo utilizado en todos los laboratorios que disponen de la infraestructura adecuada. Además, precisa que una cantidad relativamente alta de ADN, sólo permite estudiar una pequeña región del genoma con cada sonda y la mayoría de las sondas son poco informativas (heterecigosidad baja).
APLICACIONES
1. Usos en la criminología o medicina forense
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2. Identificación de secuencias relacionadas en otras especies: Sonda→ cADN del gen NF2 de ratón (neurofibromatosis type 2) hibridizado en un Southern Blot contra muestras de ADN genómico de diferentes especies.
3. El análisis de la "huella dactilar de ADN" se basa en la técnica de transferencia e hibridación de Southern: La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano.
4. Diagnóstico y caracterización de inmunodeficiencias5. Localiza una secuencia particular de la ADN dentro de una mezcla compleja6. En cuanto a los organismos genéticamente modificados, Southern Blot, se utiliza como una prueba
definitiva para garantizar que una determinada sección de la ADN de la secuencia genética conocida se ha incorporado en el genoma del organismo huésped.
7. Determinar desajustes de genes.8. Nos ha permitido identificar muchos de los constituyentes estructurales de los ácidos nucleicos.9. Diagnóstico y caracterización de diversas inmunodeficiencias.
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10. Es importante para analizar mutaciones de genes en células B de leucemia linfoblástica crónica, así como también detectar enfermedades génicas como la anemia falciforme, la fibrosis quística y la corea de huntington gracias al análisis del polimorfismo de los segmentos de longitud.
11. 11.Útil para determinar la herencia de genes específicos.12. Para determinar la herencia de determinados genes.13. La técnica Southern Blot también es utilizada para diagnosticar lesiones génicas en los pre-natales
analizando muestras de liquido amniótico que es extraído a través de sondas.14. Enfermedades genéticas como ANEMIA FALCIFORME, LAFIBOSISQUISTICA Y LA COREA DE
HUNTINGTON pueden ser detectadas por el análisis del polimorfismo de longitud de los segmentos de restricción.
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TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN: NORTHERN BLOT Y WESTERN BLOT
NORTHERN BLOT
CONCEPTOLa técnica de Northern Blot constituye una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.
La técnica consiste en extraer el ARN de las células pertinentes y su posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de ARN son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern Blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la ubicación de los tipos de ARN que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de ARN de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los ARN que se han identificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso de un ARNm, luego del empalme transcripcional. Además, sirve para identificar diferentes tipos de ARNm codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra un ARNm específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período definido de la vida, o después de haber sido sometido a los organismos a diferentes estímulos fisiológicos (Russel, 1998).
PROCEDIMIENTO
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El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa mediante una separación inicial de las moléculas en base a su peso molecular mediante electroforesis, luego se trasfiere capilarmente estas moléculas a un filtro de papel o de nylon, ya mencionada.
La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente de ADNc (ADN complementario) o ARNr del gen de interés.
Se le considera como una transferencia en punto y un tipo de hibridación denominada directa. A continuación se mostrará más detalladamente cual es el procedimiento a realizar para esta técnica.
1. EXTRACCION DEL ARN
Se extrae una muestra de ARN, “debe tenerse mucho cuidado para impedir la degradación por las ribonucleasas (ARNasas) para esto las células y tejidos que contienen ARN se homogenizan en una solución que contenga inhibidores de ARNasas, como el agente enofropico isotiacianato de guanidinio, Luego se separa el ADN del ARN y finalmente el ARN purificado se precipita con etanol. Para el caso del ARN mensajero se aprovecha la propiedad de que posea cola de poli-A; en el primer paso el ARN celular total se pasa por una columna que posee poli-dT unido a una fase sólida quedando el ARN retenido en fase sólida cuando se únela poli-dT quedando excluido el resto de ARN celular.
Se desnaturalizan la muestra, a menudo la totalidad del ARN celular, mediante tratamiento con un agente que puede ser formamida o glioxal, que impide unión por puente de hidrógeno entre los pares de bases, lo cual asegura que todas las moléculas de ARN presenten una conformación lineal no plegado.
2. ELECTROFORESIS
Se separan los ARN de acuerdo con su tamaño, mediante electroforesis en gel.
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas
según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Se usa la electroforesis en gel de agarosa; el de agarosa para la separación (fraccionamiento de una mezcla) de moléculas de DNA o de RNA, luego se cargan las muestras en los pocillos de una caja de gel horizontal, se conecta la corriente eléctrica para comenzar la electroforesis. Los fragmentos de RNA
migran a través del gel de acuerdo con su tamaño (de los fragmentos). Se forma la calle o el carril de patrones, estos Patrones se pueden observar de acuerdo a su tamaño lo cual está determinado en Kb.
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Se representa el tamaño de los patrones de DNA (en kilo bases) frente al inverso de la distancia migrada (x) para crear una curva de calibrado.
3. TRANSFERENCIA DEL ARN A UNA MENBRANA
Los fragmentos de ARN se traspasan a un tipo de membrana mediante capilaridad
Existen 2 tipos de membranas
a. NITROCELULOSA- baja capacidad de unión de ácidos nucleicos (80 μg/ cc2)- frágil- carga negativa
b. NYLON- mayor capacidad de unión (400-500 μg/cc2)- mayor resistencia- carga neutra o positiva
Es necesario inmovilizar el RNA en la membrana y esto se puede conseguir a través de dos maneras:
a. Horno de vacío
Aplicable sólo a membranas de nitrocelulosa
La membrana es tratada por 2 horas a 80 ºC. Al parecer el RNA forma enlaces hidrofóbicos con la membrana.
b. Irradiación UV
Aplicable sólo a membranas de nylon
La exposición a la luz UV activa las bases T/U haciéndolas altamente reactivas con los grupos amino de la superficie de la membrana y formando enlaces covalentes. Aumenta la estabilidad y permanencia de los ácidos nucleicos en la membrana.
4. HIBRIDACION
Éste es un proceso de complementación de pares de bases entre dos hebras sencillas de ADN y ARN, o ARN pero cuyo origen es distinto; cuyo fin principal es conseguir la máxima interacción entre la sonda y la molécula de ácido nucleico que se quiere detectar.
Las sondas son fragmentos monocatenarios de DNA o RNA marcados con una molécula reporter, que pueden ser enzimas, sustratos antigénicos, radioisótopos, los que se pueden unirse con una alta especificidad a una secuencia complementaria de ácido nucleico de cadena sencilla (diana), a fin de hacer posible su posterior detección y de esta manera la identificación de la secuencia de ARN de interés.
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Las sondas de menos de 50 pares de bases son denominadas oligonucleótidos y puede ser sintetizadas y purificadas con relativa facilidad.
Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos:
- Fragmentos de ADN de doble hebra- Fragmentos de ADN complementario- Fragmentos de ARN o ribosomas
Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.
La actividad de la sonda depende exclusivamente del marcaje que se le realice y de la densidad del marcaje utilizado. El isótopo más utilizado en el marcaje radiactivo es el 32P el cual posee una semivida corta, pero existen otras como radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina, etc.), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa, etc.) y quimioluminiscentes (ésteres de acridina).
Los factores que intervienen en esta hibridación son:
- La sensibilidad de la reacción o afinidad de la sonda por la molécula de ARN.- La concentración de la sonda.- La longitud y complementariedad de la sonda y la actividad de ella.- También es importante le concentración de ARN que se va a identificar.
PROCEDIMIENTO
La hibridación se lleva a cabo en tres etapas:
a. Pre –HibridaciónLa membrana une ácidos nucleicos, la sonda marcada puede unirse de forma inespecífica y aumentar el ruido.La membrana es incubada con una solución de pre-hibridación a la temperatura de hibridación. La solución de pre-hibridación contiene compuestos que se unen inespecíficamente a la membrana previniendo la unión de la sonda a regiones de la membrana que no contienen su hebra complementaria.
b. HibridaciónSe expone el filtro a una zona de ADN con marca radiactiva con la cual se produce una hibridación ya que dicha sonda es complementaria al ARN. La cadena de ARNm que se quiere cuantificar se une con la sonda complementaria se hibridizan de forma anti paralela, para forman una molécula de doble cadena.Esto se logra sumergiendo la membrana de fijación en un buffer que contiene la sonda.
c. Lavado sAl final del período de hibridización, se debe retirar el buffer de hibridización y lavar los filtros para remover la sonda que está en exceso, unida de manera inespecífica o unida con poca complementariedad. Esto se lleva a cabo incubando la membrana en una solución que carece de sonda marcada y utilizando condiciones que minimizan la hibridación inespecífica (Estrictez)
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ESTRICTEZ
- Una medida de la habilidad de un ac.nucleico de hebra simple (sonda) de discriminar entre moléculas con las que comparte un alto o un bajo grado de complementariedad
- Para lograr una mayor estrictez se debe aumentar la T°, incluir formamida, bajal la sal, etc
5. DETECCIÓN
Es la captura de la radiación ionizante por una emulsión fotográfica. La membrana se expone a un film por tiempos variables y finalmente el film es revelado y analizado.
Autoradiografía: Técnica fotoquímica simple y sensible, usada para grabar la distribución espacial de los componentes radiomarcados en un especimen u objeto.
Película de rayos X: La escogencia del tipo de película depende de los emisores usados como marca son de alta o baja energía.
Fluorografía: Es un proceso mediante el cual algo de la energía asociada con el decaimiento del isótopo es convertida en luz por una interacción de las partículas radio-decayentes, usando un compuesto conocido como flúor, el cual se expone a la película de rayos X.
Quimioluminiscencia: Proceso en el cual al luz visible es generada por modificación enzimática de sustratos convenientes. Esa emisión de luz es grabada en una película de rayos X. Procedimiento no isotópico.
Detección Cromogénica (colorimétrica): La actividad enzimática causa precipitación de color que se va a depositar directamente en el filtro en el sitio de reacción. Resultados determinados por la examinación directa del precipitado en la superficie del filtro. Procedimiento no isotópico.
Con esta técnica se estudia el tamaño y la cantidad de ARN mensajero de un gen específico a una muestra de ARNt total. A diferencia de ADN, el ARN no es cortado por las enzimas de restricción. La diferenciación entre los ARN de los distintos genes, se establece por la diferente longitud que tienen los segmentos de trascripción de cada gen. Por este principio, los diferentes ARNm de una muestra de tejido se separaran en un gel de agarosa de acuerdo a su tamaño y posteriormente se transfiere a un filtro de nylon o nitrocelulosa.
Siguiendo el mismo principio que en la técnica de Southern, el filtro se encuba con una zona marcada, la que se une a la ARN de interés. Posteriormente el filtro se expone a una placa de rayos x que revelará la ubicación y abundancia del ARN de estudio. La posibilidad de detectar la cantidad de ARN presente en la muestra de tejido en estudio aportará información sobre la expresión del gen en estudio (número de copias del mismo).
Por todo lo anteriormente mencionado podemos decir que la técnica de Northern Blot nos permite estudiar la expresión de un gen ya que nos permite medir el nivel de un trascrito (ARNm, ARNr, ARNt, pre–ARNm, etc.). Y el principio de dicha medición radica en el apareamiento de bases (hibridación) entre la muestra y una sonda marcada (un ADN u otro ARN) de secuencia conocida. De
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esta manera se puede determinar si se produce la cantidad necesaria de ARN para algunas determinada proteínas o si el ARN fabricado es demasiado corto, lo que haría imposible que se manifieste dicha proteína, esto se evidenciaría en la autoradiografía ya que los ARN más cortos se desplazarían mucho más rápido a través del gel.
Esta técnica también es usada para observar cómo reacciona los genes de una célula ante un estímulo hormonal, por ejemplo: las células de hígado en presencia en ausencia de insulina.
Esquema simplificado del Northern Blot
VENTAJAS Y DESVENTAJASVentajas
- La muestra de ARN requiere un mínimo de procesamiento.- La técnica puede ser fácilmente evaluada (degradación, límite de detección).- Nos permite reconocer el análisis de mutaciones y alteraciones del ARNm de enzimas, y en la
regulación de la expresión génica de marcadores moleculares de células leucémicas humanas y moléculas del reconocimiento inmunológico.
Desventajas
- El costo elevado de su elaboración.
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- La reproducibilidad de los datos no siempre es consistente. Este problema se ha resulto parcialmente haciendo mediciones por duplicado (dos puntos en la matriz que corresponden al mismos gen).
- Su resultado depende de la sonda que se utilice, de las propiedades químicas de esta.- Se requiere mucha masa de ARN (se requieren aproximadamente 20ug de ARN total).- No tolera muestras parcialmente degradadas.- Los datos cuantitativos requieren mucho procesamiento de imágenes (hibridaciones inespecíficas).
APLICACIONES1. Se utiliza para detectar la presencia de moléculas específicas de ARN en una muestra específica.2. Proporciona información sobre moléculas que hibridan. Por ejemplo, su tamaño molecular.3. Se usan generalmente para caracterizar la identidad de genes específicos, para localizar regiones
codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias clonadas. Por ende, sirve para investigar la organización molecular de las secuencias genómicas.
4. Se utiliza para examinar patrones de expresión génica en tejidos embrionarios y en adultos.5. En la detección de cortes y empalmes alternativos del ARNm.6. También se aplica en la detección de múltiples tipos de transcritos proveniente de un solo gen.7. La transferencia de NORTHERN se utiliza también para caracterizar y cuantificar la actividad
transcripcional de un gen determinado en distintas células, tejidos u organismos.8. Es de suma importancia en el estudio de la modulación de la síntesis de interleucina 6 en pacientes
con artritis reumatoide.9. De su análisis se rescata la secuencia y organización molecular.10. Es indispensable en el análisis de expresión de receptores que participan en la síntesis de moléculas
en cultivos celulares.
WESTERN BLOT
CONCEPTOEl Western Blot es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas con base en su capacidad para unirse a anticuerpos específicos. El término “Blotting” hace referencia a la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma.
Este proceso es necesario ya que todas estas macromoléculas están embebidas dentro de la matriz que forma el gel, lo que imposibilita realizar su detección, mientras que en la membrana, se encuentran accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma.
PROCEDIMIENTO1. Separar las proteínas
Las proteínas se someten a desnaturalización a través de su incubación con un detergente iónico (sulfato de dodecilo sódico o SDS) a 100°C, seguida por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). Debido a que el detergente cubre de manera uniforme a todas las proteínas, negativizando la carga de la superficie de la proteína, las proteínas migran dentro del campo
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eléctrico con base en la cantidad de moléculas de SDS unidas a ellas, cantidad que depende a su vez del tamaño de la proteína. Al cabo de la corrida obtendremos un patrón de bandas que dependerá del número de proteínas presentes en la muestra y de su tamaño. Por lo tanto este método separa proteínas conforme a su peso molecular.
2. Colocar una membrana de nitrocelulosa en el gel
Posteriormente las proteínas se transfieren de modo electroforético a una pieza de papel filtro (nylon o nitrocelulosa) al cual se adherirán a través de interacciones no polares. Luego de poner en íntimo contacto el gel con una membrana de nitrocelulosa o PVC, los colocaremos en un aparato para que se produzca una electrotransferencia de las bandas de proteína del gel a la membrana. En ese proceso se logra una transferencia cuantitativa, manteniendo además el mismo patrón del gel.
3. Diferenciación de proteínas
Se revelan por el agregado de un anticuerpo específico. De esta forma se visualizarán las bandas de proteínas y se podrá calcular la concentración de cada una en la muestra original. Recuerden que el uso de anticuerpos le otorga a la reacción una especificidad que de otro modo no tiene. Por otra parte, los anticuerpos pueden usarse para revelar antígenos presentes directamente en muestras de células o tejidos mediante las técnicas conocidas como inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.
- Incubar la membrana de la nitrocelulosa con un anticuerpo primario.
- Incubar la membrana de la nitrocelulosa con un anticuerpo secundario.
4. Para ver realmente la enzima en acción, se necesitara incubarla en una mezcla de la reacción que sea específica para tu enzima.
5. Poner la película de radiografía en gel, para detectar un flash de la luz, que es emitida por la enzima
Como muchas proteínas funcionales están compuestas de dos o más subunidades, los polipéptidos individuales se separan por electroforesis en presencia del detergente dodecilsulfato de sodio, que desnaturaliza las proteínas. Después de la electroforesis, las proteínas se detectan comúnmente por tratamiento con azul de coomasie o solución de colorante de plata. Sin embargo, los polipéptidos separados en el gel son transferidos a una membrana de nitrocelulosa, y las proteínas individuales pueden ser detectadas usando anticuerpos
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específicos. Esta transferencia de proteínas de geles de poliacrilamidas a membranas de nitrocelulosa y se realiza usando una corriente eléctrica. Después de la transferencia, la proteína de interés específica se identifica colocando la membrana con las proteínas inmovilizadas en una solución que contiene un anticuerpo para la proteína.
Los anticuerpos no unidos se eliminan luego de la membrana por lavado, y la presencia del anticuerpo primario se detecta colocando la membrana en una solución que contiene un anticuerpo secundario. Este anticuerpo secundario reacciona con las inmunoglobulinas (el grupo de proteínas que contienen todos los anticuerpos) en general. El anticuerpo secundario se conjuga ya sea con un isótopo radiactivo o una enzima que produce un producto visible cuando se agrega el sustrato adecuado.
APLICACIONES- En la medicina diagnóstica de las enfermedades virales (SIDA)
El Western Blot es una de las técnicas de mayor uso en el diagnóstico de infección por el virus HIV aunque no se trata de una aplicación única, se la usa en diagnóstico clínico y en investigación. Este ensayo también permite determinar el peso molecular de una proteína y medir la concentración relativa de una proteína en una muestra.
Por ejemplo para el caso de las infecciones con el virus HIV es una de las técnicas usuales para detectar la presencia de anticuerpos circulantes contra las proteínas del virus que es una indicación muy fuerte de que la persona se encuentra infectada por este virus. Debido a lo complejo que es este virus desde el punto de vista de su composición proteica es de esperar que una persona infectada tenga circulando en su sangre anticuerpos contra las proteínas glicosiladas o no señaladas en la partícula viral o virión.
El test del Western Blot para el virus HIV se basa en la presencia de anticuerpos contra las proteínas virales mencionadas. Para ello:
Primero: a partir del virus purificado y tratado adecuadamente se puede correr un gel de proteínas (PAGE) en el que aparecerán las bandas correspondientes a las proteínas del virus como se ve en el control positivo.
Segundo: la membrana se incuba (se pone en contacto), por ejemplo sumergiéndola, con una solución diluida del suero de una persona que se sospecha que pueda estar infectada. Luego de un tiempo, los anticuerpos contra las proteínas del virus van a reaccionar produciéndose la unión antígeno-anticuerpo, para verlos se hace luego un lavado de la tira, si los anticuerpos no están pegados se van con el lavado, los pegados quedan.
Por último para revelar la presencia de la unión específica antígeno-anticuerpo un método eficaz es el método indirecto del esquema de revelado de las proteínas en un Western Blot. Supongamos que P1, P2 y P3 son proteínas del virus HIV a las que se les pegó el anticuerpo respectivo presente en el suero del paciente. Para revelar la presencia de ese complejo lo que se hace es incubar con un segundo anticuerpo que está dirigido contra la IgG humana. Ya que si
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inoculamos inmunoglobulina humana (IgG) en un conejo, el animal va a fabricar anticuerpos contra ella, a la que se va a unir si se los incuba juntos. Pero estos anticuerpos fabricados en el conejo se pueden marcar o con un colorante o con un fluorocromo de modo que expuestos a la luz permitirá visualizar la presencia original de la proteína del virus presente en el suero.
- En el diagnóstico serológico de la infección por Tripanosoma cruzi
La Enfermedad de Chagas es una infección causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. En el hombre esta infección puede ser congénita o adquirida y afecta principalmente el corazón y tubo digestivo. El Western Blot es una técnica que se utiliza para la detección de anticuerpos contra antígenos de T. cruzi. Para ello se hizo un estudio en el cual se utilizó un extracto soluble de antígeno a partir de epimastigotes de T. cruzi cepa Tulahuén.
Se estudiaron 269 muestras, de las cuales 110 pertenecieron a pacientes con la infección confirmada serológicamente, 100 muestras de donantes de sangre seronegativos, 37 muestras de pacientes con otras parasitosis y 22 muestras de pacientes con patologías no parasitarias. El WB tuvo una sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo, y concordancia del 100%. De acuerdo a estos resultados se pudo concluir que el uso de esta, mejorará el diagnóstico de laboratorio serológico de la infección por T.Cruzi.
- Especifica los anticuerpos relacionados con la enfermedad de Lyme
Western Blot especifica los anticuerpos relacionados con la enfermedad de Lyme que están presentes en el sistema sanguíneo y es usado rutinariamente para confirmar, o en algunos casos para contradecir los resultados positivos de Elisa. Un examen positivo de Elisa seguido por uno negativo de Western Blot usualmente indica que la enfermedad de Lyme no existe. De todas maneras, el Lyme sin ser acompañado por la evidencia de los síntomas. La practica de los exámenes Elisa y Western Blot es considerada una de las combinaciones mas confiables actualmente disponibles
- En el diagnostico de la cisticercosis
Recientes avances en la purificación de antígenos han permitido mejorar la eficiencia de las técnicas inmunológicas o adaptar otras como la inmunotransferencia (EITB o Western Blot) para el diagnostico de la cisticercosis. Considerando las limitaciones tecnológicas, la carencia de una técnica serológica sensitiva y especifica y el elevado costo de los exámenes radiológicos en nuestro medio, se estandarizo la técnica del Wester Blot para el diagnostico de neurocisticercosis, utilizando como fuente de antígenos el fluido vesicular de la larva de taenia solium. Los cisticercos fueron obtenidos de cerdos naturalmente infectados; la preparación de antígenos, la electroforesis, la transferencia y el revelado enzimático se realizaron de acuerdo a la descripción original de la técnica. Se encontraron nueve bandas que corresponden a componentes antigénicos del fluido vesicular de la larva de T.solium. Con pesos moleculares de 42, 35, 31, 24, 23, 18, 17, 14 y 13 kDa. Dos sueros de pacientes con hidatidosis y el suero de un paciente con fascioliasis reaccionaron con la banda de 42 kDa; ninguno de los sueros de pacientes con himenolepiasis o de individuos sanos reacciono con los antígenos de fluido
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vesicular. La sensibilidad de la técnica de Wester Blot con antígenos de fluido vesicular de T.solium fue de 91%; y la especificidad mediada como respuesta negativa en ocho bandad especificas, de 100%.La prueba de Wester Blot con antígenos de fluido vesicular puede constituir una buena alternativa para el diagnostico de la neurocisticercosis en zonas endémicas y de ser utilidad en estudios epidemiológicos, debido a su eficacia, fácil implementación y bajo costo.
- Para el diagnóstico de brucelosis humana; la técnica de Western Blot utilizando proteínas totales de Brucella melitensis como antígeno, ofrece un test alternativo para el diagnóstico de brucelosis humana, logrando una sensibilidad del 90%.
- En la identificación de inmunógenos de Fasciola hepatica; el análisis de Western Blot se emplea en la identificación de inmunógenos de Fasciola hepatica, reconocidos por los sueros de ratas infectadas experimentalmente.
Por lo tanto, este método nos permite encontrar en una mezcla compleja, esta técnica es muy utilizada para detectar la presencia de anticuerpos en pacientes cuando hay indicios de una infección viral, en estos casos el antígeno es conocido y se analiza si el paciente tiene anticuerpos contra ese antígeno, como desventajas de este método se podrían señalar su complejidad y costo.
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