UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS

PROCESSAMENTO E APRESENTAÇÃO ANTIGÊNICA E

POSSÍVEIS INTERFERÊNCIAS VIRAIS

Duanne Alves da Silva

Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis

Goiânia

2011

ii

DUANNE ALVES DA SILVA

PROCESSAMENTO E APRESENTAÇÃO ANTIGÊNICA E

POSSÍVEIS INTERFERÊNCIAS VIRAIS

Seminário apresentado à disciplina de

Seminários Aplicados do Programa de

Pós-Graduação em Ciência Animal da

Escola de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás

Nível: Doutorado

Área de Concentração:

Sanidade Animal e Higiene e Tecnologia de Alimentos

Orientador (a):

Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis

Comitê de Orientação:

Profa. Dra. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito – EV/UFG

Profa. Dra Liliane Borges de Menezes – IPTSP/UFG

Goiânia

2011

iii

SUMÁRIO

1-INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1

2-REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 3

2.1- Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) ................................... 3

2.2- Células apresentadoras de antígenos (APCs) ............................................ 5

2.3- Processamento e apresentação de antígenos endógenos ......................... 6

2.4- Processamento e apresentação de antígenos exógenos............................ 9

2.5- Apresentação cruzada .............................................................................. 12

2.6- Interferências virais no processamento e apresentação antigênicos ........ 16

2.6.1- Inibição do transportador associado ao processamento de antígenos .. 16

2.6.2- Evasão da macroautofagia ..................................................................... 24

3-CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 27

REFERÊNCIAS ................................................................................................ 28

iv

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Estrutura das moléculas de MHC classes I e II................................4 FIGURA 2: Micrografia eletrônica de uma célula dendrítica................................6 FIGURA 3: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos endógenos via MHC classe I para linfócitos TCD8+............................................8 FIGURA 4: Os quatro processos de digestão celular mediada por lisossomos...........................................................................................................9 FIGURA 5: Síntese do MHC classe II evidenciando a remoção do CLIP pela molécula HLA-DM..............................................................................................11

FIGURA 6: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos exógenos via MHC classe II para linfócitos TCD4+...........................................12 FIGURA 7: Mecanismos de proteólise lisossomal.............................................14 FIGURA 8: A macroautofagia regula a apresentação cruzada e as vias de apresentação de antígenos intra e extracelulares nas moléculas de classe II do MHC.......................................................................................................................15

FIGURA 9: Regulação do MHC I de camundongos pelas proteínas UL49.5, US3, US6, BNFL2a e ICP47................................................................................19

FIGURA 10: Expressão dos níveis de inibidores virais em células de camundongos..........................................................................................................21

FIGURA 11: Expressão das proteínas UL49.5 dos herpesvírus de ruminantes.........................................................................................................22

FIGURA 12: Citometria de fluxo evidenciando a expressão de moléculas de MHC-I na superfície de células MDBK e MJS, e de MHC-II em células MJS......................................................................................................................23

FIGURA 13: A atividade de transporte do TAP foi analisada nas células MDBK e MJS expressando as proteínas UL49.5 homólogas........................................24 FIGURA 14: Níveis de TAP1 e TAP2 expressos nas células MJS....................24

1

1-INTRODUÇÃO

O organismo dos animais e humanos está exposto a constantes

ataques de microrganismos, podendo sofrer as mais variadas injúrias. No

entanto, existem mecanismos competentes no combate a essas invasões

visando responder a esses ataques de uma forma eficiente.

Um patógeno, para estabelecer-se com sucesso no organismo,

precisa ultrapassar barreiras e ser capaz de driblar as defesas do hospedeiro

que pretende infectar. Por sua vez, o organismo infectado necessita

reconhecer o agente invasor para definir as ações a serem tomadas no intuito

de restabelecer o equilíbrio. Esse ponto é crucial quando ocorre uma injúria,

pois uma resposta exacerbada pode eliminar a infecção, mas por ser tão

intensa, pode levar a morte do hospedeiro, assim como uma resposta fraca

pode não ser suficiente para eliminar o agente.

O sistema imunológico é, portanto, um vigilante do organismo, pois

sua função não é apenas proteger e defender o indivíduo frente a invasão de

agentes estranhos, mas principalmente de manter a homeostase corporal.

Diversas substâncias, ao entrarem no organismo de um indivíduo,

podem ser reconhecidas como antígenos, tais como: proteínas, carboidratos,

lipídeos e ácidos nucléicos. Para que o sistema imune responda a essas

substâncias estranhas desenvolvendo suas funções eficientemente, elas

precisam ser processadas e apresentadas a células específicas.

A célula do sistema imunológico responsável por esse

processamento e posterior apresentação de antígenos, sejam eles próprios ou

não próprios, é conhecida como célula apresentadora de antígeno (APC).

Macrófagos, linfócitos B, neutrófilos, células endoteliais e células dendríticas

(DC) atuam como APCs, sendo que as DCs são consideradas APCs

profissionais, por serem mais eficientes no processamento e apresentação

antigênicos (THÉRY & AMIGORENA, 2001; LYN et al., 2008; VYAS et al.,

2008).

Apesar de o processamento e a apresentação de antígenos serem

mecanismos complexos que envolvem diferentes fases, muitos microrganismos

conseguem subverter etapas distintas desses processos. Dentre os agentes

que interferem nesses mecanismos de forma eficiente encontram-se os

2

herpesvírus (KWUN et al., 2011; MARIEKE et al., 2011a, MARIEKE et al.,

2011b, MARIEKE et al., 2011c;). A infecção causada por esses patógenos, que

se estabelece por toda a vida do hospedeiro, se deve a um balanço

estabelecido entre o sistema imunológico do indivíduo infectado e as

estratégias de evasão da resposta imune utilizadas pelos vírus.

Diante do exposto, pretende-se com esta revisão de literatura

abordar os aspectos referentes ao processamento e a apresentação de

antígenos e possíveis interferências dos herpesvírus nesses mecanismos.

3

2-REVISÃO DE LITERATURA

2.1- Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC)

O MHC (Major Histocompatibility Complex) é um locus amplo com

genes altamente polimórficos que codifica as moléculas classes I e II, assim

como outras proteínas. Essas moléculas têm a função de se ligar a peptídeos

antigênicos e apresentá-los aos linfócitos T específicos. As moléculas MHC

foram originariamente reconhecidas pelo seu papel no desencadeamento de

resposta das células T que causavam a rejeição de transplantes (BODMER,

1987; KLEIN & SATO, 2000).

As duas classes de MHC apresentam características estruturais

semelhantes, no entanto, diferem quanto a apresentação dos antígenos a

determinado tipo de linfócito. O MHC de classe I é uma molécula composta por

duas cadeias polipeptídicas distintas ligadas de forma não covalente; a cadeia

pesada (ou cadeia α) e um polipeptídeo não polimórfico que não é codificado

pelo MHC, a β2-microglobulina (ABBAS et al., 2008). Já nas moléculas de

classe II do MHC, as duas cadeias polipeptídicas (α e β), que também estão

ligadas de forma não covalente, são codificadas por genes do MHC

polimórficos (VILLADANGOS, 2001).

Ambas as classes apresentam uma fenda extracelular de ligação de

antígenos, uma região não polimórfica semelhante a imunoglobulina (Ig), uma

região transmembrana e uma região citoplasmática. A fenda é constituída de α-

hélices nas laterais e uma base de oito lâminas β-pregueadas antiparalelas. A

fenda das moléculas de classe I é formada pelos domínios α1 e α2 da cadeia α,

enquanto que a da classe II é formada pelos domínios α1 e β1 das duas

cadeias (Figura 1) (VILLADANGOS, 2001; ABBAS et al., 2008).

4

FIGURA 1: Estrutura das moléculas de MHC classes I e II. Fonte: ABBAS et al., 2008.

O MHC de classe I é um receptor para antígenos endógenos

(intracelulares) e está presente na maior parte das células nucleadas. Já o

MHC de classe II é um receptor para antígenos exógenos (extracelulares) e é

encontrado nas principais células apresentadoras de antígenos (células

dendríticas, macrófagos e linfócitos B). É importante ressaltar que ambas as

classes são receptores de antígenos protéicos (VILLADANGOS, 2001; ABBAS

et al., 2008).

QUADRO 1: características das moléculas de MHC classes I e II

Características MHC classe I MHC classe II

Cadeias Polipeptídicas α (44-47 kD) β2-microglobulina (12 kD)

α ( 32 kD) β (29 – 32 kD)

Localização dos resíduos polimórficos

Domínios α1 e α2 Domínios α1 e β1

Local de ligação para correceptor de célula T

Região α3 liga CD8 Região β2 liga CD4

Tamanho da fenda de ligação de peptídeo

Acomoda peptídeos de 8-11 resíduos

Acomoda peptídeos de 10- 30 resíduos ou mais

Fonte: ABBAS et al., 2008.

5

2.2- Células apresentadoras de antígenos (APCs)

Diferentes tipos celulares podem processar e apresentar antígenos

com diversos níveis de eficiência (SCHNEIDER & SERCARZ, 1997; MELLMAN

et al., 1998). Algumas células, no entanto, possuem atividade mais efetiva

como apresentadoras como as células B, os macrófagos e, especialmente as

células dendríticas (DC) (Figura 2), que são consideradas APCs profissionais

(TROMBETTA & MELLMAN, 2005).

Algumas características inerentes as células dendríticas fazem

dessa classe celular a mais eficiente apresentadora de antígenos. Diferente do

macrófago e do linfócito B, a DC tem como função primária a apresentação

antigênica. Tanto o macrófago como a DC completam sua diferenciação

quando se estabelecem em um tecido periférico após a saída da corrente

sanguínea. Quase todos os tecidos contêm DCs e macrófagos num estado

estacionário, apesar dos dois tipos celulares diferirem quanto a sua importância

(TROMBETTA & MELLMAN, 2005).

As DCs apresentam uma distribuição única nos órgãos linfóides,

secundários acumulando-se em regiões onde, geralmente, não existem

macrófagos e linfócitos B. As áreas onde os linfócitos T naive são ativados são

ricas em DCs, uma posição ótima para que um grande número de células T

possa explorar continuamente essas APCs em busca de complexos peptídeo-

MHC específicos (ITANO & JENKINS, 2003; MEMPEL et al., 2004).

As células dendríticas apresentam propriedades de vigilância e de

migração únicas (RANDOLPH et al., 2001), o que lhes permite capturar

antígenos na periferia e carreá-los até os órgãos linfóides secundários ou

internalizá-los diretamente da linfa (ITANO et al., 2003).

6

FIGURA 2: Micrografia eletrônica de uma célula dendrítica. Fonte:http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_dendr%C3%ADtica

2.3- Processamento e apresentação de antígenos endógenos

Todas as células nucleadas podem apresentar peptídeos associados

ao MHC classe I, pois todas elas expressam essa molécula em sua superfície.

Antígenos protéicos presentes no citosol como, proteínas virais ou proteínas

que sofreram mutação em células tumorais são, em sua maioria, sintetizados

endogenamente. Esses antígenos protéicos são degradados pelo

proteassoma, um grande complexo catalítico de proteases presente no

citoplasma e no núcleo da célula para, posteriormente, serem apresentados

aos linfócitos TCD8+ via MHC classe I (PEAPER et al., 2008).

O proteassoma degrada proteínas em peptídeos contendo de três a

20 aminoácidos. A forma ativa do proteassoma é o complexo 26S, o qual

reconhece e se liga a proteínas ubiquitinadas. A ubiquitina é um pequeno

polipeptídeo que funciona como uma chaperonina, sendo responsável pela

checagem estrutural das proteínas que são sintetizadas pela célula. Quando

ocorre algum erro na síntese protéica, a ubiquitina se liga de forma covalente a

proteína, permitindo o reconhecimento desta pelo proteassoma. O complexo

26S é composto pela subunidade catalítica 20S e pela subunidade reguladora

19S. Em todas as células eucariotas, o complexo 26S é formado por uma

estrutura anelar que apresenta regiões não catalíticas (subunidades α) e

catalíticas (subunidades β). Três subunidades β, que são expressas

7

constitutivamente, são substituídas por subunidades induzíveis chamadas

LMP2 (iβ1), MECL1 (iβ2) e LMP7 (iβ5) quando há estímulo do IFN-γ sobre as

células. Essas subunidades constituem o chamado imunoproteassoma e são

importantes na geração dos peptídeos de ligação a classe I do MHC, pois

alteram a especificidade do substrato do proteassoma que passa a produzir

peptídeos contendo de seis a 30 aminoácidos (MURATA et al., 2009). O

imunoproteassoma apresenta uma elevada capacidade de clivar regiões com

aminoácidos hidrofóbicos ou que contenham terminal carboxila básico, os quais

são freqüentemente encontrados na porção C- terminal dos peptídeos ligados

ao MHC classe I (VAN DEN EYNDE & MOREL, 2001).

Os peptídeos antigênicos gerados no citosol precisam ser

encaminhados ao retículo endoplasmático, pois é nessa organela que ocorre a

síntese das moléculas de MHC classe I. Os genes do MHC codificam as duas

cadeias de um heterodímero chamado transportador associado a

processamento de antígenos (TAP). Esse transportador está localizado na

membrana do retículo endoplasmático e medeia o transporte ativo dependente

de ATP dos peptídeos citosólicos para o interior do retículo. A síntese da

proteína TAP também é estimulada pelo IFN-γ e os genes TAP1 e TAP2 (que

codificam as proteínas formadoras do canal de entrada dos peptídeos no

retículo) estão próximos aos genes que codificam LMP2 e LMP7 no MHC

(MURATA et al., 2009). Além disso, apesar da proteína TAP apresentar uma

ampla especificidade de substrato, assim como o imunoproteassoma, ela

possui um transporte ótimo de peptídeos que contenham de seis a 30

aminoácidos e que possuem terminais carboxilas básicos (no homem) ou

resíduos hidrofóbicos (no homem e nos camundongos), que são as

características dos peptídeos gerados no imunoproteassoma permitindo a

ligação às moléculas do MHC (ABBAS et al., 2008).

A proteína TAP é altamente conservada entre diversas espécies. A

TAP1 e a TAP2 de humanos, suínos, bovinos e roedores apresentam 70 a 80%

de similaridade de aminoácidos (McCLUSKEY et al., 2004; GARCIA-BORGES

et al., 2006). Acredita-se que este transportador esteja envolvido na

apresentação antigênica mediada pelo MHC I em diferentes espécies (OHTA et

al., 2003).

8

Existe um controle durante o transporte desses peptídeos que é feito

por várias moléculas chaperoninas presentes no retículo. O transporte ocorre

por meio de um complexo formado pela cadeia pesada do MHC I (cadeia α),

pela β2 microglobulina e pelas chaperoninas tapasina, calnexina, calreticulina e

ERp57. Enquanto a calnexina, a calreticulina e a ERp57 estabilizam o

complexo MHC recém formado, a tapasina e a ERp57 mantém o mesmo fixado

a TAP e facilitam a aquisição de peptídeos com alta afinidade (VERWEIJ et al.,

2011a). Quando o peptídeo entra no retículo endoplasmático por meio do TAP,

ele é aparado por aminopeptidases residentes no retículo (ERAP) para que

apresente o tamanho apropriado de ligação à fenda do MHC (HAMMER et al.,

2007). Após essa ligação, o complexo peptídeo- MHC classe I é liberado da

tapasina, podendo sair do retículo e ser transportado para a superfície celular

apresentando o antígeno para as células TCD8+ (Figura 3) (GANNAGE &

MÜNZ, 2010).

FIGURA 3: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos endógenos via MHC classe I para linfócitos TCD8+. Fonte: ABBAS et al., 2008.

9

2.4- Processamento e apresentação de antígenos exógenos

A geração de moléculas do complexo peptídeo- MHC classe II e sua

expressão na superfície celular são essenciais para a ativação de linfócitos

TCD4+ (ROCHA & NEEFJES, 2008). A geração de peptídeos que se ligarão as

moléculas de MHC II pode ocorrer por diversos mecanismos de endocitose que

diferem em importância de acordo com a APC. Eles podem acessar a via

endocítica por pinocitose, fagocitose, endocitose mediada por receptor e

autofagocitose (ou autofagia) (Figura 4) (WATTS, 1997).

FIGURA 4: Os quatro processos de digestão celular mediada por lisossomos. (i) endocitose mediada por receptores específicos; (ii) pinocitose (englobamento de gotículas contendo líquido extracelular); (iii) fagocitose (partículas extracelulares); (iv) autofagia (micro- e macro- de proteínas e organelas intracelulares). Fonte: CIECHANOVER, 2005.

A formação do complexo peptídeo- MHC é resultado do encontro de

duas vias: o transporte de antígenos por meio de endossomos; e a síntese do

10

MHC II no retículo endoplasmático seguida do envio da molécula ao

compartimento endocítico para que haja a ligação ao antígeno. Três estruturas

principais estão envolvidas nesse processo: os endossomos precoces (ou

primários), os endossomos tardios (ou secundários) e os lisossomos. Os

endossomos precoces são as primeiras vesículas que entram em contato com

o material endocitado, apresentam um pH ligeiramente ácido e não possuem

boa capacidade proteolítica. Já os endossomos tardios são mais ácidos e

contêm alguns dos componentes característicos de compartimentos

lisossômicos, como proteases e glicoproteínas. Enquanto os lisossomos

apresentam pH baixo e são ricos em enzimas hidrolíticas sendo uma das

principais estruturas eliminadoras de resíduos da célula (VILLADANGOS,

2001).

A via endocítica é interceptada por uma rota que se origina nos

últimos componentes do complexo de Golgi, a rede trans-Golgi (TGN). Essa

rede é um meio de comunicação onde as moléculas recém sintetizadas

provenientes do retículo são direcionadas para a via endocítica, caso

apresentem sinais específicos (como manose 6-fosfato, por exemplo). Se

essas moléculas se destinarem a secreção ou expressão na membrana

plasmática elas também podem entrar na via endocítica (VILLADANGOS,

2001).

As cadeias α e β do MHC de classe II são sintetizadas

coordenadamente e se associam no retículo endoplasmático formando um

heterodímero. Este se liga a uma proteína chamada cadeia invariante (Ii) que

ocupa as fendas de ligação de peptídeos da molécula de classe II. Os dímeros

recém formados são instáveis e suas dobras e agregação também são

auxiliadas por chaperoninas residentes no retículo como a calnexina, assim

como ocorre na formação do MHC classe I. Logo, com a cadeia Ii ocupando a

fenda de ligação, o MHC classe II não consegue se ligar e apresentar os

antígenos que encontra no retículo, deixando tais peptídeos se associarem as

moléculas de classe I. Além disso, a cadeia invariante também promove o

dobramento e agregação das moléculas classe II recém formadas e direciona o

complexo classe II- cadeia Ii para a via endocítica de modo que ocorra o

encontro com os peptídeos interiorizados e processados nas vesículas

(HASTINGS & CRESSWELL, 2011).

11

Um conjunto de endossomos ricos em moléculas classe II

desempenha um importante papel na apresentação de antígenos. Esses

endossomos são chamados de compartimento do MHC classe II (MIIC) e

contém todos os componentes necessários para a associação dos peptídeos

ao MHC II, além de uma molécula chamada de antígeno de leucócitos

humanos DM (HLA-DM). No MIIC a cadeia invariante é removida para que

ocorra a ligação dos peptídeos antigênicos na fenda. Essa remoção ocorre pela

ação das mesmas chaperoninas já citadas, como a catepsina, enzima

responsável pela degradação de proteínas interiorizadas em endossomos,

lisossomos e fagossomos (HASTINGS & CRESSWELL, 2011). Após essa

proteólise resta apenas um resíduo de 24 aminoácidos chamado de peptídeo

de cadeia invariante associado à classe II (CLIP), que é removido pela ação da

molécula HLA-DM (Figura 5). Essa molécula atua como um trocador, auxiliando

a retirada do CLIP e o acréscimo de outros peptídeos. (GANNAGE & MÜNZ,

2010).

FIGURA 5: Síntese do MHC classe II evidenciando a remoção do CLIP pela molécula HLA-DM. Fonte: ABBAS et al., 2008.

Uma vez removido o CLIP, os peptídeos que foram gerados pela

proteólise dos antígenos protéicos interiorizados nas vesículas, podem se ligar

a fenda do MHC classe II, estabilizando a molécula. A HLA-DM também atua

12

nessa etapa como uma chaperonina, assegurando a ligação de peptídeos de

elevada afinidade ao MHC classe II. Como as extremidades da fenda de

ligação do MHC II estão abertas (Figura 1), pode ocorrer a ligação de grandes

peptídeos ou até proteínas inteiras desdobradas. As enzimas proteolíticas são

as responsáveis por aparar essas proteínas até que tenham o tamanho

apropriado para o reconhecimento das células T. Assim, os peptídeos

apresentados na superfície celular em moléculas de classe II do MHC,

geralmente, apresentam um tamanho que varia de 10 a 30 aminoácidos (Figura

6) (ABBAS et al., 2008; GANNAGE & MÜNZ, 2010; HASTINGS &

CRESSWELL, 2011).

FIGURA 6: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos exógenos via MHC classe II para linfócitos TCD4+. Fonte: ABBAS et al., 2008.

2.5- Apresentação cruzada

Originalmente, acreditava-se que as moléculas de MHC classe I

seriam apresentadoras, principalmente, de antígenos endógenos. No entanto,

notou-se que certos tipos celulares, principalmente APCs profissionais como as

células dendríticas, eram capazes de exibir antígenos extracelulares nas

13

moléculas de classe I por meio de um mecanismo de apresentação cruzada

(AMIGORENA & SAVINA, 2010). Tal mecanismo também ocorre com as

moléculas de classe II, que podem ligar-se a antígenos endógenos e exibí-los

na superfície das células apresentadoras (MARRACK et al., 1993; DENGJEL et

al., 2005) inclusive, após o processamento intracelular desses antígenos

(JARAQUEMADA et al., 1990; MÜNZ et al., 2000). Alguns antígenos ganham

acesso a degradação lisossômica nos compartimentos carreadores de MHC II

por meio do processo de autofagia (NIMMERJAHN et al., 2003; PALUDAN et

al., 2005; JAGANNATH et al., 2009).

A autofagia é uma via catabólica que leva a degradação proteolítica

dos compartimentos celulares por lisossomos (Figura 4). Este mecanismo

permite o contato de antígenos intracelulares com o MHC de classe II e sua

posterior apresentação por essas moléculas. Além disso, já se tem evidências

de que a autofagia pode auxiliar a apresentação de antígenos extracelulares

tanto pelo MHC I quanto pelo MHC II (Figura 7) (DENGJEL et al., 2005;

HAYASHI- NISHINO et al., 2009; MÜNZ, 2010).

Um tipo particular de autofagia, a macroautofagia, tem sido

implicado na apresentação de antígenos intracelulares via MHC classe II para

os linfócitos TCD4+. Durante esse processo componentes celulares, como

organelas danificadas, agregados protéicos ou mesmo antígenos, são

englobados por vesículas originárias do retículo endoplasmático, do complexo

de Golgi ou da membrana mitocondrial (Figuras 4 e 7) (ENGLISH et al., 2009;

HAYASHI-NISHINO et al., 2009).

14

FIGURA 7: Mecanismos de proteólise lisossomal. Microautofagia- invaginação da superfície lisossomal que leva a produção de vesículas cujo conteúdo protéico sofre degradação no interior do lisossoma. Macroautofagia- fusão de lisossomas com vacúolos originários de organelas celulares (Golgi ou mitocôndria). Fonte: adaptado de CUERVO & DICE, 1998.

LI et al., (2008) e UHL et al., (2009) verificaram que antígenos virais

e de tumores são apresentados de maneira mais eficiente quando a célula

processadora consegue realizar macroautofagia. Esses estudos sugerem que a

macroautofagia auxilia no acondicionamento do antígeno para uma

apresentação cruzada eficiente.

Outra assistência do mecanismo de macroautofagia (Figuras 7 e 8)

refere-se ao transporte do antígeno endocitado para ser degradado nos

lisossomos, facilitando o carreamento do mesmo pelas moléculas de classe II

(MÜNZ, 2010).

15

FIGURA 8: A macroautofagia regula a apresentação cruzada e as vias de apresentação de antígenos intra e extracelulares nas moléculas de classe II do MHC. Fonte: MÜNZ, 2010.

Durante o processamento de partículas endocitadas ou que estejam

presentes no citosol, é formado o autofagossomo, uma vesícula que apresenta

uma membrana isoladora ao redor dessas partículas ou de constituintes do

citoplasma celular. O autofagossomo se funde com o MIIC gerando os corpos

multivesiculares (MVBs). Os autofagossomos podem fundir-se diretamente com

os MVBs ou após a fusão com endossomos (formando o anfissomo). As

partículas internalizadas pelo autofagossomo também podem escapar dos

MVBs por exocitose, sendo apresentadas pelas células dendríticas via MHC I

(MÜNZ, 2010).

16

2.6- Interferências virais no processamento e apresentação antigênicos

2.6.1- Inibição do transportador associado ao processamento de

antígenos (TAP)

Os herpesvírus conseguem escapar da eliminação dos linfócitos T

citotóxicos por meio de interferências específicas na função de apresentação

antigênica das moléculas do MHC I. Muitos vírus, especialmente os

herpesvírus, codificam moléculas que bloqueiam a função do TAP. Atualmente,

quatro genes codificados pelos herpesvírus já foram identificados como

inibidores desta proteína transportadora (VERWEIJ et al., 2011a).

Os herpesvírus de animais, pertencentes ao gênero Varicellovirus,

como o herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), o vírus da Doença de Aujeszky ou

pseudoraiva (PRV ou SuVH-1) e os herpesvírus de eqüinos tipos 1 e 4 (EHV 1

e 4), são capazes de inibir o TAP por meio de uma proteína chamada UL49.5,

codificada por esses patógenos. A UL49.5 do BoHV-1 bloqueia mudanças

conformacionais no complexo TAP, impedindo os rearranjos estruturais

necessários para o transporte do antígeno. Ademais, o TAP é direcionado para

degradação pelo proteassoma (KOPPERS-LALIC et al., 2005; VERWEIJ et al.,

2008).

As proteínas UL49.5 codificadas pelos herpesvírus bovino tipo 5

(BoHV-5), herpesvírus bubalino tipo 1 (BuHV-1), herpesvírus cervídeo tipo 1

(CvHV-1) e herpesvírus felídeo tipo 1 (FeHV-1), também já foram identificadas

como potentes inibidores do TAP (VERWEIJ et al., 2011b). Outros herpesvírus

de animais como os herpesvírus de galídeos tipos 1 e 2 (vírus da

laringotraqueíte infecciosa (ILTV) e vírus da Doença de Marek (MDV),

respectivamente), pertencentes aos gêneros Iltovírus e Mardivirus, também já

foram alvo de estudos com relação as prováveis proteínas inibidoras da

apresentação pelo MHC I. Apesar de VERWEIJ et al., (2011b) terem observado

que as proteínas UL49.5 desses vírus falharam na inibição do TAP, ainda não

está esclarecido se o ILTV possui outro tipo mecanismo e se o MDV codifica

alguma proteína que tenha ação inibidora.

17

Homólogos da proteína UL49.5 são codificados por muitos

herpesvírus (McGEOCH et al., 2006; DAVISON et al., 2009). Em muitos

herpesvírus já foi demonstrado que a UL49.5 está envolvida na maturação e

infectividade do agente, pois ela forma um heterodímero com a glicoproteína M

(gM), que é necessário para a glicosilação e maturação do complexo (KLUPP

et al., 2000; FUCHS & METTENLEITER, 2005; LIPINSKA et al., 2006). Logo,

para alguns herpes, a UL49.5 possui um duplo papel, funcionando como uma

chaperonina e como uma proteína de evasão da resposta imune (VERWEIJ et

al., 2011b).

Dentre alguns varicelovírus de humanos, essa atividade inibidora do

TAP não é tão eficiente. A proteína UL49.5 do herpesvírus humano tipo 3 ou

Varicela Zoster (VZV), não apresenta nenhuma atividade inibidora. Já a UL49.5

do herpesvírus canino tipo 1 (CaHV-1), apresenta pouca inibição do TAP.

Apesar desses vírus também pertencerem ao gênero Varicellovirus, eles

diferem dos outros herpesvírus supracitados quanto a atividade da UL49.5,

indicando que a capacidade de inibição do TAP por essa proteína é encontrada

apenas em alguns membros do gênero (VERWEIJ et al., 2011b).

O primeiro inibidor do TAP a ser relatado foi a proteína ICP47 do

herpes simplex tipo 1, verificando-se mais tarde que a ICP47 do herpes simplex

tipo 2 também apresentava a mesma função (AHN et al., 1996; TOMAZIM et

al., 1998) A ICP47 obstrui o sítio de ligação do peptídeo no TAP, impedindo o

transporte do mesmo para o interior do retículo (AHN et al., 1996; TOMAZIM, et

al., 1996; AISENBREY et al., 2006). O citomegalovírus humano (HCMV)

também possui atividade inibidora do TAP, pois codificada a proteína US6 que

previne a ligação do ATP ao TAP, retirando o suprimento de energia

necessário para o transporte do antígeno.

Outra proteína envolvida na inibição do TAP é a BNFL2a, codificada

pelo vírus Epstein Barr (EBV). Essa proteína é capaz de impedir tanto a ligação

do ATP quanto do antígeno ao complexo TAP (HISLOP et al., 2007; HORST et

al., 2009).

Em 2011(a), VERWEIJ e colaboradores desenvolveram um estudo

com vistas ao entendimento da inibição do TAP por proteínas codificadas pelos

herpesvírus não murinos expressas em diferentes linhagens de células de

camundongos. A atividade das proteínas UL49.5, BNFL2a, US3 (inibidora de

18

tapasina), US6 e ICP47 foi avaliada por meio de citometria de fluxo.

Primeiramente os autores notaram que os diversos alótipos de MHC de

camundongos foram afetados de forma diferente pelas proteínas inibidoras.

Todas as linhagens celulares de camundongos apresentaram níveis diminuídos

de expressão de MHC I, com exceção das que expressavam as proteínas

BNFL2a e ICP47. Em contraste, a linhagem de células de melanoma humano,

MJS, sofreu regulação negativa pelas proteínas inibidoras BNFL2a e ICP47,

diferente das células de camundongo (Figura 9A e B).

Em todas as linhagens celulares testadas, o efeito da expressão do

MHC I na superfície das células foi marcadamente mais reduzido na presença

da UL49.5 do que na presença da US6, indicando que a UL49.5 é um potente

inibidor viral da TAP nessas células de camundongos (Figura 9A e B).

19

FIGURA 9: Regulação do MHC I de camundongos pelas proteínas UL49.5, US3, US6, BNFL2a e ICP47. (A) Expressão das moléculas de MHC I na superfície de células L, 3T3, MC38 e MJS (gráfico 2) e células expressando UL49.5, BNLF2a, ICP47, US6 ou US3 (gráfico 3). As células foram coradas usando os anticorpos específicos para cada alelo indicado. Gráfico1: coloração padrão na presença somente do anticorpo secundário. (B) Níveis de MHC I nas células que expressaram as proteínas inibidoras; a expressão é relativa aos níveis de MHC I das células controle (100%). Fonte: VERWEIJ et al., 2011a.

20

A expressão das proteínas UL49.5, BNFL2a e US6 foi avaliada por

meio de Western Blot (Figura 10A- superior). Para as proteínas ICP47 e US3,

os níveis de RNA mensageiro foram determinados utilizando-se RT-PCR

(Figura 10A- inferior). Apesar de terem sido observadas algumas diferenças,

esses resultados confirmam a expressão das proteínas UL49.5, BNFL2a, US6,

ICP47 e US3 nas linhagens celulares de camundongos.

Neste estudo também foram avaliados os níveis de expressão das

subunidades protéicas TAP1 e TAP2 e a influência da tapasina na regulação

negativa do MHC I. Os níveis de TAP1, TAP2 e tapasina foram

consistentemente baixos nas células 3T3 quando comparados com as células L

e MC38 (Figura 10B). A diminuição do nível de tapasina nas células 3T3 pode

ter contribuído para a forte inibição do MHC I mediada pela US3.

Nos resultados obtidos pode-se confirmar a atividade de degradação

do TAP mediada pela UL49.5 previamente relatada por outros autores

(KOPPERS-LALIC et al., 2005; VAN HALL et al., 2007) Comparando-se os

níveis de TAP1 no estado estacionário do controle e a expressão da UL49.5

pelas células, confirma-se as observações anteriores de que a proteína UL49.5

do BoHV-1 é capaz de induzir a degradação do TAP de camundongos (Figura

10C). A redução observada nos níveis de TAP1 foi específica, já que o nível de

tapasina no estado estacionário não diminuiu na presença de UL49.5 (Figura

10C).

21

FIGURA 10: Expressão dos níveis de inibidores virais em células de camundongos. (A) Expressão da UL49.5, BNLF2a e US6 em células L, 3T3 e MC38 foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot (WB) usando os anticorpos indicados. β-actina foi utilizada como controle. Após a extração do RNA total das células L, 3T3 e MC38, a expressão de ICP47 e US3 foi verificada por meio de RT-PCR usando primers específicos. Legenda: −= controle, + = células expresssando inibidores. (B) Os níveis de TAP1, TAP2 e tapasina no estado estacionário expressos nas linhagens celulares de camundongos foram determinados por SDS-PAGE e Western blot (WB). (C) A indução da degradação do complex TAP pela UL49.5 foi estudada pela determinação dos níveis de TAP 1 e tapasina no controle (−) e nas células que expressavam a UL49.5 (+) por SDS-PAGE e WB. Fonte: VERWEIJ et al., 2011a.

Ainda em 2011, outro estudo foi desenvolvido buscando elucidar o

grau de conservação da atividade inibidora do TAP da proteína UL49.5, entre

quatro membros do gênero Varicellovirus que infectam ruminantes, a saber:

BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1, CvHV-1 (VERWEIJ et al, 2011b). A sequência de

aminoácidos das proteínas UL49.5 codificadas pelo BoHV-5, BuHV-1 e CvHV-1

apresentam 79, 80 e 74% de identidade com a UL49.5 do BoHV-1,

respectivamente (VERWEIJ et al., 2011b).

Estes autores tiveram como objetivo a determinação do grau de

conservação existente entre as proteínas codificadas pelos herpesvírus de

22

ruminantes em sua capacidade de inibição do TAP. As UL49.5 codificadas por

esses vírus foram expressadas em células de rim de bovino (MDBK) e de

melanoma humano (MJS). A expressão das UL49.5 homólogas foi verificada

com o auxílio de anticorpos específicos contra a UL49.5 do BoHV-1. Estes

anticorpos foram capazes de detectar a proteína do BoHV-1, BoHV-5 e CvHV-1

em células MDBK e MJS (Figura 11). Já a UL49.5 do BuHV-1 não foi detectada

segundo os autores, devido a possíveis diferenças existentes na região C-

terminal da proteína, que é o alvo do anticorpo que foi utilizado.

FIGURA 11: Expressão das proteínas UL49.5 dos herpesvírus de ruminantes. Lisados derivados do controle e das células MDBK e MJS que expressaram a UL49.5 foram corados com GFP; anticorpos específicos foram utilizados contra a UL49.5 e a análise foi feito por SDS-PAGE e imunoblot (IB).A β-actina foi usada como controle.

Fonte: VERWEIJ et al. 2011b.

Análises da expressão das moléculas de MHC I na superfície celular

revelaram que as UL49.5 do BoHV-5, BuHV-1 e CvHV-1 causaram uma forte

regulação nas células MDBK e MJS (Figura 12, primeiro e segundo painéis). A

redução nessa expressão pode ser comparada a causada pela UL49.5 do

BoHV-1. Essa redução foi específica para moléculas MHC I, já que a

expressão das moléculas MHC II não foi afetada pelas UL49.5 homólogas

(Figura 12, terceiro painel).

23

FIGURA 12: Citometria de fluxo evidenciando a expressão de moléculas de MHC-I na superfície de células MDBK e MJS, e de MHC-II em células MJS. Gráfico 2- células não transfectadas. Gráfico 3- células expressando proteínas UL49.5 homólogas do BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 e CvHV-1 utilizando os anticorpos indicados. Gráfico 1- coloração padrão na presença somente de anticorpo secundário. Fonte: VERWEIJ et al., 2011b.

A função do TAP foi avaliada nas células MDBK e MJS expressando

as UL49.5 homólogas dos herpes de ruminantes. O transporte dos peptídeos

foi reduzido de 70 a 90% tanto nas células de humanos quanto de bovinos,

indicando que isso ocorreu devido a inibição do TAP (Figura 13).

KOPPERS-LALIC et al., (2005) e KOPPERS-LALIC et al., (2008)

observaram que a UL49.5 do BoHV-1 induzia a degradação do TAP de

humanos e bovinos. VERWEIJ et al., (2011b) buscando analisar se as

proteínas homólogas codificadas pelo BoHV-5, BuHV-1 e CvHV-1

apresentavam a mesma capacidade, avaliaram os níveis de TAP1 e TAP2

expressos nas células MJS (Figura 14). Os níveis do TAP foram reduzidos

consideravelmente na presença dos homólogos da UL49.5 testados, sugerindo

24

que essas proteínas também induzem a degradação do complexo TAP, sendo

uma característica conservada entre os herpesvírus que infectam ruminantes.

FIGURA 13: A atividade de transporte do TAP foi analisada nas células MDBK e MJS expressando as proteínas UL49.5 homólogas. O transporte de peptídeos foi avaliado na presença de ATP (preto) ou EDTA (branco). Fonte: VERWEIJ et al., 2011b.

FIGURA 14: Níveis de TAP1 e TAP2 expressos nas células MJS. Os níveis TAP1 e TAP2 em células MJS no estado estacionário foram determinados utilizando anticorpos específicos. A β-actina foi usada como um controle. Fonte: VERWEIJ et al., 2011b.

2.6.2- Evasão da macroautofagia

O papel da macroautofagia durante a resposta imune é ainda mais

enfatizado pela sua importante ação reguladora nas infecções virais. Três

25

sistemas in vivo ligaram a macroautofagia ao controle imune de infecções

víricas. Estes estudos incluíram o herpesvírus simplex (HSV), o vírus Sindbis

(um arbovírus que tem como hospedeiros vertebrados os pássaros e o homem)

e o vírus da estomatite vesicular (VSV) (GANNAGE & MÜNZ, 2010).

LIANG et al., (1998) e OVERDAHL et al., (2007) verificaram que a

neurovirulência do HSV e do Sindbis foi atenuada devido ao elevado nível de

macroautofagia durante a infecção por esses vírus. SHELY et al., (2009),

verificaram que a infecção pelo VSV em Drosophila induziu a macroautofagia e

restringiu a infecção viral nesse modelo experimental.

Estes estudos não implicam o processamento do antígeno para

apresentação pelo MHC, via macroautofagia, na proteção contra a infecção

viral. No entanto, durante a infecção pelo HSV esse mecanismo nas células

dendríticas foi necessária para ativar de forma eficiente a resposta protetora

das células TCD4+ (LEE et al., 2010). Segundo GANNAGE & MÜNZ (2010)

estes resultados indicam que este tipo de autofagia pode restringir a infecção

viral in vivo.

Outra indicação que a macroautofagia pode limitar a replicação viral

de forma significativa é a capacidade que os vírus desenvolveram de escapar

dessa via. Nesse sentido, dois pontos desse mecanismo podem ser inibidos

pelos vírus: a formação do autofagossomo e a fusão deste com o lisossomo.

Vírus que tem genoma DNA parecem comprometer, primeiramente, a formação

do autofagossomo, enquanto os vírus RNA bloqueiam a degradação das

moléculas internalizadas pelos lisossomos (GANNAGE & MÜNZ, 2010).

Com respeito a inibição da formação do autofagossomo, os

alfaherpesvírus apresentam várias proteínas inibidoras da macroautofagia. O

HSV codifica a ICP34.5, uma proteína que é capaz de bloquear a formação do

autofagossomo (TALLOCZY et al., 2002; ALEXANDER et al., 2007) ao se ligar

ao domínio de interação do Atg6/Beclin-1 (gene relacionado a formação do

autofagossomo). ORVEDAHL et al., (2007) observaram que um HSV que

apresentava a ICP34.5 mutante e tinha o domínio de interação do Atg6/Beclin-

1, demonstrou aumento da neurovirulência após injeção intracerebral em

camundongos.

Os betaherpesvírus também apresentam atividade inibidora da

macroautofagia (CHAUMORCEL et al., 2008). Sabe-se que o HCMV pode

26

escapar dessa via, contudo os mecanismos moleculares dessa regulação ainda

não estão claros. O grupo dos gamaherpesvírus apresentam muitos membros

que comprometem a formação do autofagossomo, como o herpesvírus humano

tipo 8 (HHV-8: agente etiológico do sarcoma de Kaposi) e o herpesvírus murino

68 (MHV-68).

O HHV-8 e o MHV-8 codificam proteínas homólogas (Bcl-2 e M11,

respectivamente) capazes de interagir com o Atg6/Beclin-1, impedindo a

formação do autofagossomo (PATTINGRE et al., 2005; KU et al., 2008). Além

disso, o HHV-8 também age por meio da proteína inibidora v-FLIP, que

prejudica a formação do autofagossomo dependente de Atg8/LC3 (moléculas

responsáveis pela fusão e alongamento das membranas do autofagossomo,

sendo um marcador do autofagossomo) (LEE et al., 2009).

Para GANNAGE & MÜNZ (2010) esses dados sugerem que os

herpesvírus impedem a formação do autofagossomo a fim de inibir a restrição

da infecção e a apresentação dos antígenos virais.

27

3-CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os mecanismos de processamento e apresentação de antígenos

são bastante complexos e o entendimento dos mesmos é de grande valia no

estudo de inúmeras enfermidades do homem e de animais, sejam elas de

causa infecciosa ou não.

Muitos vírus, em especial os herpesvírus, são capazes de escapar

da resposta imune dos seus hospedeiros fazendo uso de estratégias efetivas e

muito específicas. Geralmente, por essa ação viral ser potente e apresentar

elevado nível de especificidade, as proteínas codificadas por esses patógenos

são ferramentas valiosas no estudo da biologia celular da apresentação

antigênica, incluindo as vias alternativas de processamento.

Para o desenvolvimento destes estudos, pesquisas utilizando

camundongos são muito importantes, haja vista que o modelo murino já está

estabelecido na experimentação científica, sendo simples de se trabalhar

quando comparado com a maioria dos modelos in vivo. Nesse sentido, também

é indispensável que sejam verificadas as prováveis diferenças existentes nas

análises feitas in vivo e in vitro, quando possível.

Em certos agentes, como foi demonstrado para os herpesvírus, a

barreira entre as espécies foi ultrapassada nas respostas referentes aos

mecanismos de evasão. Esse é outro ponto crucial no entendimento da

biologia desses agentes, pois os resultados encontrados nos animais muitas

vezes podem ser extrapolados para a espécie humana.

Assim, fica evidente a aplicabilidade das proteínas envolvidas na

evasão da resposta imune codificadas pelos herpesvírus. Elas podem atuar

como poderosos imuno-moduladores, com aplicações potenciais no tratamento

como no diagnóstico das mais variadas infecções virais até doenças complexas

como o câncer e as doenças autoimunes.

28

REFERÊNCIAS

1. ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e

molecular. Ed.Elsevier Brasil, 2008. 576 p.

2. ALEXANDER, D. E.; WARD, S. L.; MIZUSHIMA, N.; LEVINE, B.; LEIB,

D. A. Analysis of the role of autophagy in replication of herpes simplex virus in

cell culture. Journal of Virology, v. 81, n. 22, p.12128–12134, 2007.

3. AHN, K.; MEYER, T. H.; UEBEL, S.; SEMPE, P.; DJABALLAH, H.;

YANG, Y.; PETERSON, P. A.; FRUH, K.; TAMPE, R. Molecular mechanism

and species specificity of TAP inhibition by herpes simplex virus ICP47. The

Embo Journal, v. 15, p. 3247–3255, 1996.

4. AISENBREY, C.; SIZUN, C.; KOCH, J.; HERGET, M.; ABELE, R.;

BECHINGER, B.; TAMPE, R. Structure and dynamics of membrane-associated

ICP47, a viral inhibitor of the MHC I antigen-processing machinery. The

Journal of Biology Chemistry, v. 281, p. 30365–30372, 2006.

5. AMIGORENA, S.; SAVINA, A. Intracellular mechanisms of antigen cross

presentation. Current Opinion in Immunology, v. 22, n. 1, p. 109-117, 2010.

6. BODMER, W. F. The HLA system: structure and function. Journal of

Clinical Pathology, v. 40, p. 948-958, 1987.

7. CIECHANOVER, A. From the lysosome to ubiquitin and the proteasome.

Nature Review Molecular Cell Biology, v. 6, p. 79–86, 2005.

8. CUERVO A. M.; DICE, J. F. Lysosomes, a meeting point of proteins,

chaperones, and proteases. Journal of Molecular Medicine, v. 76, p. 6-12,

1998.

29

9. DAVISON, A. J.; EBERLE, R.; EHLERS, B.; HAYWARD, G. S.;

McGEOCH, D. J.; MINSON, A. C.; PELLETT, P. E.; ROIZMAN, B.;

STUDDERT, M.; THIRY, E. The order Herpesvirales. Archives of Virology, v.

154, p. 171-177, 2009.

10. DENGJEL, J.; SCHOOR, O.; FISCHER, R.; REICH, M.; KRAUS, M.;

MÜLLER, M.; KREYMBORG, K.; ALTENBEREND, F.; BRANDENBURG, J.;

KALBACHER, H.; BROCK, R.; DRIESSEN, C.; RAMMENSEE, H. G.;

STEVANOVIC, S. Autophagy promotes MHC class II presentation of peptides

from intracellular source proteins. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, v. 102, n. 22, p. 7922-7927, 2005.

11. ENGLISH, L.; CHEMALI, M.; DURON, J.; RONDEAU, C.; LAPLANTE,

A.; GINGRAS, D.; ALEXANDER, D.; LEIB, D.; NORBURY, C.; LIPPE, R.;

DESJARDINS, M. Autophagy enhances the presentation of endogenous viral

antigens on MHC class I molecules during HSV-1 infection. Nature

Immunology, v. 10, p. 480-487, 2009.

12. FUCHS, W.; METTENLEITER, T. C. The nonessential UL49.5 gene of

infectious laryngotracheitis virus encodes an O-glycosylated protein which

forms a complex with the non-glycosylated UL10 gene product. Virus

Research, v. 112, p. 108–114, 2005.

13. GANNAGE, M.; MÜNZ, C. MHC presentation via autophagy and how

viruses escape from it. Seminars in Immnunophatology, v. 32, p. 373-381,

2010.

14. GARCIA-BORGES, C. N.; PHANAVANH, B.; CREW, D. Characterization

of porcine TAP genes: alternative splicing of TAP1. Immunogenetics, v. 58, p.

374–382, 2006.

15. HAMMER, G. E.; KANASEKI, T.; SHASTRI, N. The final touches make

perfect the peptide-MHC class I repertoire. Immunity, v. 26, n. 4, p. 397-406,

2007.

30

16. HASTINGS, K. T.; CRESSWELL, P. Disulfide reduction in the endocytic

pathway: immunological functions of gamma-interferon-inducible lysosomal thiol

reductase. Antioxidants & Redox Signaling, v. 15, n. 3, p. 657-668, 2011.

17. HAYASHI-NISHINO, M.; FUJITA, N.; NODA, T.; YAMAGUCHI, A.;

YOSHIMORI, T.; YAMAMOTO, A. A subdomain of the endoplasmic reticulum

forms a cradle for autophagosome formation. Nature Cell Biology, v. 11, p.

1433-1437, 2009.

18. HISLOP, A. D.; RESSING, M. E.; VAN LEEUWEN, D.; PUDNEY, V. A.;

HORST, D.; KOPPERS-LALIC, D.; CROFT, N. P.; NEEFJES, J. J.;

RICKINSON, A. B.; WIERTZ, E. J. A CD8+ T cell immune evasion protein

specific to Epstein–Barr virus and its close relatives in Old World primates.

Journal of Experimental Medicine, v. 204, p. 1863–1873, 2007.

19. HORST, D.; VAN LEEUWEN, D.; CROFT, N. P.; GARSTKA, M. A.;

HISLOP, A. D.; KREMMER, E.; RICKINSON, A. B.; WIERTZ, E. J.; RESSING,

M. E. Specific targeting of the EBV lytic phase protein BNLF2a to the

transporter associated with antigen processing results in impairment of HLA

class I-restricted antigen presentation. Journal of Immunology, v. 182, p.

2313–2324, 2009.

20. ITANO, A. A.; JENKINS, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells

in the lynph node. Nature Immunology, v. 4; p. 733-739, 2003.

21. ITANO, A. A.; MCSORLEY, S. J.; REINHARDT, R. L.; EHST, B. D.;

INGULLI, E. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to

CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity.

Immunity, v. 19, p. 47-57, 2003

22. JAGANNATH, C.; LINDSEY, D. R.; DHANDAYUTHAPANI, S.; XU, Y.;

HUNTER, R. L.; ELISSA, N. T. Autophagy enhances the efficacy of BCG

31

vaccine by increasing peptide presentation in mouse dendrítica cells. Nature

Medicine, v. 15, p. 267-276, 2009.

23. JARAQUEMADA, D.; MARTI, M.; LONG, E. O. Na endogenous

processing pathway in vacccinia vírus-infected cells for presentation of

cytoplasmic sntigens to class II-restricted T cells. Journal of Experimental

Medicine, v. 172, p. 947-954, 1990.

24. KWUN, H. J.; SILVA, S. R.; QIN, H.; FERRIS, R. L.; CHANG, R. T. Y.;

MOORE, P., S. The central repeat domain 1 of Kaposi's sarcoma-associated

herpesvirus (KSHV) latency associated-nuclear antigen 1 (LANA1) prevents cis

MHC class I peptide presentation. Virology, v. 412, p. 357-365, 2011.

25. KLEIN, J.; SATO, A. The HLA system. The New England Journal of

Medicine, v. 343, p. 702-709, 2000.

26. KLUPP, B. G.; NIXDORF, R.; METTENLEITER, T. C. Pseudorabies vírus

glycoprotein M inhibits membrane fusion. Journal of Virology, v. 74, p. 6760–

6768, 2000.

27. KOPPERS-LALIC, D.; REITS, E. A. J.; RESSING, M. E.; LIPINSKA, A.

D.; ABELE, R.; KOCH, J.; REZENDE, M. M.; ADMIRAAL, P.; VAN LEEUWEN,

D.; BIENKOWSKA-SZEWCZYK, K.; METTENLEITER, T. C.; RIJSEWIJK, F. A.

M.; TAMPÉ, R.; NEEFJES, J.; WIERTZ, E. J. H. J. Varicelloviruses avoid T cell

recognition by UL49.5-mediated inactivation of the transporter associated with

antigen processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America, v. 102, p. 5144-5149, 2005.

28. KOPPERS-LALIC, D.; VERWEIJ, M. C; LIPINSKA, A. D.; WANG, Y.;

QUINTEN, E. Varicellovirus UL49.5 proteins differentially affect the function of

the transporter associated with antigen processing, TAP. Plos Pathogens, v. 4,

n. 5, e1000080, 2008.

32

29. KU, B.; WOO, J.S.; LIANG, C. Structural and biochemical bases for the

inhibition of autophagy and apoptosis by viral BCL-2 of murine gamma-

herpesvirus 68. Plos Pathogens, v. 4, n. 2, e25, 2008.

30. LEE, J. S.; LI, Q.; LEE, J. Y. FLIP-mediated autophagy regulation in cell

death control. Nature Cell Biology, v. 11, n.11, p. 1355–1362, 2009.

31. LEE, H. K.; MATTEI, L. M.; STEINBER, B. E. In vivo requirement for

Atg5 in antigen presentation by dendritic cells. Immunity, v. 32, n. 2, p.227–

239, 2010.

32. LI, Y.; WANG, L. X.; YANG, G.; HAO, F.; URBA, W. J.; HU, H. M:

Efficient cross-presentation depends on autophagy in tumor cells. Cancer

Research, v. 68, p. 6889-6895, 2008.

33. LIANG, X.H.; KLEEMAN, L. K.; JIANG, H. H. Protection against fatal

Sindbis virus encephalitis by beclin, a novel Bcl-2-interacting protein. Journal

of Virology, v. 72, n. 11, p. 8586–8596, 1998.

34. LIN, M. L.; ZHAN, Y.; VILLADANGOS, J. A.; LEW, A. M. The cell biology

of cross presentation and the role of dendritic cell subsets. Immunology & Cell

Biology, v.86, p. 353–362, 2008.

35. LIPINSKA, A. D.; KOPPERS-LALIC, D.; RYCHLOWSKI, M.; ADMIRAAL,

P.; RIJSEWIJK, F. A. M.; BIENKOWSKA-SZEWCZYK, K.; WIERTZ, E. J. H. J.

Bovine herpesvirus 1 UL49.5 protein inhibits the transporter associated with

antigen processing despite complex formation with glycoprotein M. Journal of

Virology, v. 80, p. 5822–5832, 2006.

36. MARRACK, P.; IGNATOWICZ, L.; KAPPLER, J. W.; BOYMEL, J.;

FREED, J. H. Comparison of peptides bound to spleen and thymus class II. The

Journal of Experimental Medicine, v. 178, p. 2173-2183, 1993.

33

37. McCLUSKEY, J.; ROSSJOHN, J.; PURCELL, A. W. TAP genes and

immunity. Current Opinion in Immunology, v. 16, p. 651–659, 2004.

38. McGEOCH, D. J.; RIXON, F. J.; DAVISON, A. J. Topics in herpesvirus

genomics and evolution. Virus Research, v. 117, p. 90–104, 2006.

39. MELLMAN, I.; TURLEY, S. J.; STEINMAN, R. M. Antigen processing for

amateurs and professionals. Trends in Cell Biology, v. 8, p. 231–37, 1998.

40. MEMPEL, T. R.; HENRICKSON, S. E.; VON ANDRIAN, U. H. T-cell

priming by dendrítica cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.

Nature, v. 427, p. 154-159, 2004.

41. MÜNZ, C.; BICKHAM, K. L.; SUBKLEWE, M.; TSANG, M. L.;

CHAHROUDI, A.; KURILLA, M. G.; ZHANG, D.; O’DONNELL, M.; STEINMAN,

R. M. Human CD4+ T lymphocytes consistently respond to the latent Epstein-

Barr virus nuclear antigen EBNA1. Journal of Experimental Medicine, v. 191,

p. 1649-1660, 2000.

42. MURATA, S.; YASHIRODA, H.; TANAKA, K. Molecular mechanisms of

proteasome assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 10, p. 104-

115, 2009.

43. NIMMERJAHN, F.; MILOSEVIC, S.; BEHRENDS, U.; JAFFEE, E. M.;

PARDOLL, D. M.; BORNKAMM, G. W.; MAUTNER, J. Major histocompatibility

complex class II-restricted presentation of a cytosolic antigen by autophagy.

European Journal of Immunology, v. 33, p. 1250-1259, 2003.

44. OHTA, Y.; POWIS, S. J.; LOHR, R. L. Two highly divergent ancient allelic

lineages of the transporter associated with antigen processing (TAP) gene in

Xenopus: further evidence for co-evolution among MHC class I region genes.

European Journal of Immunology, v. 33, p. 3017–3027, 2003.

34

45. ORVEDAHL, A.; ALEXANDER, D.; TALLOCZY, Z. HSV-1 ICP34.5

confers neurovirulence by targeting the Beclin 1 autophagy protein. Cell Host &

Microbe, v. 1, p. 23–35, 2007.

46. PALUDAN, C.; SCHMID, D.; LANDTHALER, M.; VOCKERODT, M.;

KUBE, D.; TUSCHI, T.; MÜNZ, C. Endogenous MHC class II processing of a

viral nuclear antigen after autophagy. Science, v. 307, p. 593-596, 2005.

47. PATTINGRE, S.; TASSA, A.; QU, X. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit

Beclin 1-dependent autophagy. Cell, v. 122, n. 6, p. 927–939, 2005.

48. PEAPER, D. R.; CRESSWELL, P. Regulation of MHC class I

assemblyand peptide binding. Annual Review Cell Development Biology, v.

24, p. 343–368, 2008.

49. RANDOLPH, G. J. Dendritic cell migration of lunph nodes: cytokines,

chemokines, and lipid mediators. Seminars in Immunology, v. 13, p. 267-274,

2001.

50. ROCHA, N.; NEEFJES, J. MHC class II molecules on the move for

successful antigen presentation. The Embo Journal, v. 27, p. 1-5, 2008.

51. SHELLY, S.; LUKINOVA, N.; BAMBINA, S.; BERMAN, A.; CHERRY, S.

Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular

stomatitis virus. Immunity, v. 30, n. 4, p.588–598, 2009.

52. SCHNEIDER, S. C.; SERCARZ, E. E. Antigen processing differences

among APC. Human Immunology, v. 54, p. 148–58, 1997.

53. TALLOCZY, Z.; JIANG, W.; VIRGIN, H. W. Regulation of starvation- and

virus-induced autophagy by the eIF2alpha kinase signaling pathway.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, v. 99, n.1,

p.190–195, 2002.

35

54. THÉRY, C.; AMIGORENA, S. The cell biology of antigen presentation in

dendritic cells. Current Opinion in Immunology, v. 13, p. 45-51, 2001.

55. TOMAZIN, R.; HILL, A. B.; JUGOVIC, P.; YORK, I.; VAN ENDERT, P.;

PLOEGH, H. L.; ANDREWS, D. W.; JOHNSON, D. C. Stable binding of the

herpes simplex virus ICP47 protein to the peptide binding site of TAP. The

Embo Journal, v. 15, p. 3256–3266, 1996.

56. TOMAZIN, R.; VAN SCHOOT, N. E. G.; GOLDSMITH, K.; JOGOVIC, P.;

SEMPE, P.; FRUH, K.; JOHNSON, D. C. Herpes simplex virus type 2 ICP47

inhibits human TAP but not mouse TAP. Journal of Virology, v. 72, n. 3, p.

2560-2563, 1998.

57. TROMBETTA, E. S.; MELLMAN, I. Cell biology of antigen processing in

vitro and in vivo. Annual Review of Immunology, v. 23, p. 975-1028, 2005.

58. UHL, M.; KEPP, O.; JUSFORGUES-SAKLANI, H.; VICENCIO, J. M.;

KROEMER, G; ALBERT, M. L: Autophagy within the antigen donor cell

facilitates efficient antigen cross-priming of virus-specific CD8+ T cells. Cell

Death & Differentiation, v. 16, p. 991-1005, 2009.

59. VAN DEN EYNDE, B. J.; MOREL, S. Differential processing of class-I-

restricted epitopes by the standard proteasome and the immunoproteasome.

Current Opinion in Immunology, v. 3, p. 147-153, 2001.

60. VAN HALL, T.; WOLPERT, E. Z.; VAN VEELEN, P.; LABAN, S.; VAN

DER VEER, V.; ROSEBOOM, M.; BRES, S.; GRUFMAN, P.; DE RU, A.;

MEIRING, H.; DE JONG, A.; FRANKEN, K.;TEIXEIRA, A.; VALENTIJN, R.;

DRIJFHOUT, J. W.; KONING, F.; CAMPS, M.; OSSENDORP, F.; KARRE, K.;

LJUNGGREN, H. G.; MELIEF, C. J.; OFFRINGA, R. Selective cytotoxic T-

lymphocyte targeting of tumor immune escape variants. Nature Medicine, v.

12, p. 417–424, 2006.

36

61. VERWEIJ, M. C.; KOPPERS-LALIC, D.; LOCH, S.; KLAUSCHIES, F.;

DE LA SALLE, H.; QUINTEN, E.; LEHNER, P. J.; MULDER, A.; KNITTLER, M.

R.; TAMPE, R.; KOCH, J.; RESSING, M. E.; WIERTZ, E. J.The varicellovirus

UL49.5 protein blocks the transporter associated with antigen processing (TAP)

by inhibiting essential conformational transitions in the 6 + 6 transmembrane

TAP core complex. Journal of Immunology, v. 181, p. 4894–4907, 2008.

62. VERWEIJ, M. C.; RESSING, M. E.; KNETSCH, W.; QUINTEN, E.;

HALENIUS, A.; VAN BEL, N.; HENGEL, H.; DRIJFHOUT, J. W.; VAN HALL, T.

Inhibition of mouse TAP by immune evasion molecules encoded by non murine

herpesviruses. Molecular Immunology, v. 48, p. 835-845, 2011a.

63. VERWEIJ, M. C.; LIPINSKA, A. D.; KOPPERS-LALIC, D.; VAN

LEEUWEN, W. F.; COHEN, J. I.; KINCHINGTON, P. R.; MESSAOUDI, I.;

BIENKOWSKA-SZEWCYK, K.; RESSING, M. E.; RIJSEWIJK, F. A. M.;

WIERTZ, E. J. H. J. The capacity of UL49.5 proteins to inhibit TAP is widely

distributed among members of the genus Varicellovirus. Journal of Virology, v.

85, n. 5, p. 2351-2363, 2011b.

64. VILLADANGOS, J. A. Presentation of antigens by MHC class II

molecules: getting the most out of them. Molecular Immunology, v. 38, p. 329-

346, 2001.

65. VYAS, J. M.; VAN DER VEEN, A. G.; PLOEGH, H. L. The known

unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews

Immunology, v. 8, p. 607–618, 2008.

66. WATTS, C. Capture and processing of exogenous antigens for

presentation on MHC molecules. Annual Review of Immunology, v. 15, p.

821–850, 1997.