Upload
vohuong
View
216
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Universidade Federal de São João Del-Rei (UFSJ)
Campus Alto Paraopeba (CAP)
Programa de Pós-Graduação em Tecnologias para o
Desenvolvimento Sustentável (PPGTDS)
Produção de pigmentos fúngicos e seu uso no tingimento de tecidos
Aluno: Wesley Santiago da Silva
Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas
Ouro Branco – MG,
Agosto de 2013
i
Wesley Santiago da Silva
Produção de pigmentos fúngicos e seu uso no tingimento de tecidos
Dissertação apresentada ao programa de Pós Graduação em Tecnologias para o Desenvolvimento Sustentável da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito para obtenção de título de Mestre. Linha de pesquisa: Processos e Produtos para Redução de Impactos Ambientais Área de Concentração: Microbiologia Aplicada Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas
Ouro Branco, 2013
ii
Programa de Pós-Graduação para o Desenvolvimento Sustentável
Dissertação de Mestrado
Produção de pigmentos fúngicos e seu uso no tingimento de tecidos
Autor: Wesley Santiago da Silva Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas
Banca examinadora composta pelos membros abaixo:
Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas
Universidade Federal de São João Del-Rei
Dra. Silvana de Queiroz Silva
Universidade Federal de Ouro Preto
Dr. Marcel Otávio Cerri
Universidade Federal de São João Del-Rei
Ouro Branco, 27 de Agosto de 2013
iii
Dedico este trabalho aos meus pais e irmãos.
iv
Agradecimentos
Agradeço a Deus pela oportunidade de andar mais uma etapa em meus estudos.
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Juliano L. Bicas pela dedicação
destinada ao meu desenvolvimento acadêmico, e por todo aprendizado, que levarei não
apenas para a vida profissional, pois certamente me proporcionou um grande crescimento
pessoal, sendo colega de trabalho, professor e amigo.
Agradeço ao Prof. Dr. Marcel Otávio Cerri pelo auxílio na manipulação do
Biorreator, uma das mais importantes etapas deste trabalho.
Agradeço ao Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de
Viçosa, pela caracterização do micro-organismo em estudo, ao Prof. Dr Marcos Tótola que
prontamente recebeu as culturas.
Agradeço ao Prof. Dr. José Carlos de Magalhães, por importantes
conhecimentos partilhados, um deles, a técnica do microcultivo de fungos.
Agradeço aos amigos técnicos de laboratório do Campus Alto Paraopeba,
Andréa Faria, Gicele de Oliveira Andrade, José Luiz Souza, Paula Vieira de Faria e Robinson
Souza Marinho, por toda contribuição.
Agradeço aos bolsistas atividade e iniciação científica pela contribuição.
Agradeço aos professores do Programa de Mestrado em Tecnologias para o
Desenvolvimento Sustentável.
Por fim, agradeço a todos que contribuíram direta ou indiretamente, para a
realização deste trabalho.
v
LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Molécula de β-caroteno com o grupamento cromóforo destacado em vermelho (NELSON & COX, 2001). ......................................................................................................... 8
Figura 2 - Estrutura química de corantes com uso na indústria têxtil. a) Corante sintético vermelho congo, b) corante sintético índigo carmim, c) cristal violeta, e) corante natural anil. 8
Figura 3 - Estrutura química de corantes sintéticos com aplicação industrial. a) amaranto, b) Ponceau 4R, c) vermelho 40, d) amarelo crepúsculo; e) amarelo tartrazina, f) azul brilhante. . 9
Figura 4 - Espectro eletromagnético da luz, com variada gama de comprimentos de onda ..... 10
Figura 5 - Estrutura química de corantes naturais produzidos por micro-organismos (BICAS et al., 2013; DUFOSSÉ, 2006). ................................................................................................ 17
Figura 6 - As transformações no processamento têxtil. Cada uma das etapas é descrita em maiores detalhes no texto. ........................................................................................................ 20
Figura 7- Fluxograma resumindo o processo experimental para a produção dos pigmentos e tingimento de materiais. ........................................................................................................... 23
Figura 8 - Método de diluições seriadas para monitoramento do crescimento microbiano (número de viáveis). ................................................................................................................. 27
Figura 9 - Processo experimental para avaliar a cinética de crescimento e produção de pigmentos em Erlenmeyers. ..................................................................................................... 28
Figura 10 - Fungo produtor de biopigmento isolado a partir do meio ambiente. A) fungo crescido em placa com ágar PDA; B) fungo em tubo inclinado contendo meio PDA. ............ 32
Figura 11 - Estruturas do fungo F. oxysporum CCT7620 observadas em microscópio (aumento de 400 vezes) após microcultivo. ............................................................................. 32
Figura 12 - Crescimento e produção de pigmentos em meio arroz sólido granulometria ABNT/ASTM 16 (1180µm). .................................................................................................... 36
Figura 13 - Extração dos pigmentos fúngicos. (a) Etanol comercial 92% e (b) Acetato de etila e agitação por vortex durante 1 min. ........................................................................................ 38
Figura 14 - Varredura no visível do sobrenadante da cultura de F. oxysporum CCT7620 após extração com etanol 92%. ......................................................................................................... 40
Figura 15 - Resultados da alteração na cor do caldo arroz fermentado variando-se o percentual (0, 25, 50, 75 ou 100%) de recomposição de “pasta de arroz” após centrifugação do meio.... 41
Figura 16 - Cinética de crescimento (■) e produção de pigmentos (absorbância do sobrenadante da cultura a 485nm) (▲) por F. oxysporum CCT7620 em Erlenmeyers de 250mL. ...................................................................................................................................... 42
Figura 17 - Fermentação do fungo Fusarium oxysporum CCT7620 em biorreator de bancada do tipo air lift após cerca de 72h de processo. ......................................................................... 43
Figura 18 - Condições operacionais do biorreator air lift durante a o experimento de cinética de crescimento e produção dos pigmentos por F. oxysporum CCT7620 (Figura 13). ............. 44
Figura 19 - Cinética de crescimento microbiano (■) e de produção do pigmento (), em termos de absorbânica a 485nm. As barras de erro correspondem ao desvio padrão das medidas. .................................................................................................................................... 44
Figura 20 - Cinética de crescimento do fungo F. oxysporum CCT7620 em air lift com controle de pH, e temperatura. A figura apresenta como variaram o oxigênio dissolvido (linha contínua negra), a temperatura (linha contínua cinza), o pH (linha tracejada cinza) e a contagem microbiana (■) ao longo do processo. ...................................................................... 47
Figura 21 - Produção de pigmento roxo por fungo Fusarium oxysporum CCT7620 em biorreator de bancada do tipo air lift. ....................................................................................... 48
Figura 22 - Tecidos corados em meio líquido. A) Tecidos de poliéster; B) algodão; C) poliestireno; D) plástico polipropileno. .................................................................................... 49
vi
Figura 23 - Tecidos corados com o fungo crescendo sobre a fibra. A) Poliéster suspenso; B) algodão suspenso; C) algodão em contato com meio de cultivo. ............................................. 50
Tabela 1. Segmento da biotecnologia e suas aplicações: ........................................................... 6
Tabela 2. Alguns exemplos de micro-organismos envolvidos na produção de pigmentos microbianos: ............................................................................................................................. 16
Tabela 3. Crescimento microbiano e produção dos biopigmentos em meios de cultivo distintos, (+) indicando presença e (-) a ausência: ................................................................... 34
Tabela 4. Percepção visual quanto a crescimento e dispersão dos pigmentos em meio a base de arroz quebrado e peneirado em diferentes tamanhos. .......................................................... 35
Tabela 5. Extração dos pigmentos da biomassa com variados solventes: ................................ 38
vii
SUMÁRIO RESUMO ......................................................................................................................... 1
ABSTRACT ..................................................................................................................... 2
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 3
1.1. Objetivo geral .................................................................................................... 4
1.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 4
2.1. Biotecnologia ..................................................................................................... 4
2.2. Corantes e pigmentos ......................................................................................... 7
2.3. Cor ................................................................................................................... 10
2.4. Corantes para tecidos ....................................................................................... 12
2.5. Biocorantes ...................................................................................................... 14
2.6. Processamento têxil e o tingimento de tecidos ................................................ 19
2.7. Biotingimento .................................................................................................. 21
3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 23
3.1. Micro-organismo ............................................................................................. 24
3.1.1. Caracterização morfológica ...................................................................... 24
3.2. Produção de pigmentos em Fermentação no Estado Sólido ............................ 24
3.2.1. Escolha do meio de cultivo ....................................................................... 24
3.2.2. Avaliação da granulometria no meio a base de arroz ............................... 25
3.2.3. Recuperação dos pigmentos ..................................................................... 25
3.3. Produção de pigmentos em cultivo submerso .................................................. 26
3.3.1. Preparo do meio de cultivo ....................................................................... 26
3.3.2. Quantificação dos pigmentos produzidos ................................................. 26
3.3.3. Quantificação do crescimento microbiano ............................................... 27
3.4. Cinética de produção dos pigmentos em Erlenmeyers .................................... 28
3.5. Cinética de produção dos pigmentos em biorreator air lift .............................. 28
3.5.1. Biorreator .................................................................................................. 28
3.5.2. Inóculo ...................................................................................................... 29
3.5.3. Experimento sem controle de temperatura e pH ...................................... 29
3.5.4. Experimento com controle de temperatura e pH ...................................... 29
3.5.5. Extração e quantificação dos pigmentos .................................................. 30
3.6. Tingimento de materiais .................................................................................. 30
3.6.1. Tingimento com o caldo fermentado (vermelho) ..................................... 30
3.6.2. Tingimento de tecidos in situ.................................................................... 31
3.7. Análise estatística dos dados ............................................................................ 31
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 31
4.1. Características do Fungo .................................................................................. 31
4.2. Produção dos pigmentos microbianos em Fermentação no Estado Sólido ..... 33
4.2.1. Separação e recuperação dos pigmentos .................................................. 36
4.3. Produção dos pigmentos microbianos em Fermentação Submersa ................. 39
4.4. Cinética de Produção do Pigmento em Biorreator de Bancada Air Lift .......... 42
4.4.1. Cultivo sem controle do pH e Temperatura e meio a 50g/L .................... 42
4.4.2. Cultivo em air lif controlando pH e temperatura ..................................... 46
4.5. Tingimento de materiais .................................................................................. 48
5. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 51
5.1. Conclusões ....................................................................................................... 51
5.2. Sugestões Para Trabalhos Futuros ................................................................... 51
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 52
1
RESUMO
Os processos biotecnológicos têm sido aplicados desde os tempos mais remotos,
por meio da utilização de organismos vivos, sejam eles micro-organismos ou plantas para a
obtenção de bens e serviços, geralmente surgindo como alternativa menos danosa ao meio
ambiente em comparação aos métodos tradicionais de produção. Neste contexto, a
biotecnologia surge como uma alternativa para suprir a crescente demanda por pigmentos
naturais e ambientalmente corretos. O presente estudo teve como objetivos a seleção de
linhagens de micro-organismos com potencial para produção de biopigmentos, o
desenvolvimento de métodos de recuperação do pigmento da biomassa, estudos relativos a
cinética de crescimento microbiano e produção dos pigmentos, além da aplicação dos mesmos
no tingimento de materiais plásticos e tecidos (algodão, poliéster, polipropileno e
poliestireno). Os biopigmentos fúngicos vermelhos e azuis foram sintetizados por Fusarium
oxysporum CCT7620 em meio de cultivo sólido e líquido a base de arroz, e a extração dos
mesmos foi testada com diferentes solventes: etanol, álcool iso-propílico, acetato de etila,
clorofórmio acidificado, água e acetona. Foi realizado um estudo cinético em shaker com
meio a 50g/L, T a 28ºC e 150rpm até 96 horas de cultivo, e dois estudos em biorreator air lift:
um sem controle do pH ou T e meio a 50 g/L; e outro mantendo o pH entre 6 e 7, meio a
20g/L e T a 28ºC, ambos com aproximadamente, uma semana de cultivo. Experimentos de
cinética em Erlenmeyers e em biorreator air lift revelaram que o crescimento exponencial
deste fungo ocorre até cerca de 48h de cultivo e que a produção dos pigmentos está associada
ao crescimento. Tanto para o experimento em Erlenmeyers quanto nos experimentos em
biorreator, a coloração variou com pH e concentração do meio. Ao controlar o pH, mantendo-
o na faixa entre 6 e 7, observou-se uma coloração roxa com forte associação dos pigmentos a
biomassa, sem sucesso no processo de extração e diminuição na taxa de crescimento
microbiano em comparação com o processo sem controle do pH, onde foi observada
coloração vermelha intensa. Os produtos obtidos revelaram-se adequados para o tingimento
de tecidos e plásticos. Dois métodos foram empregados no tingimento, um aquecendo tecidos
ou plásticos em presença do sobrenadante da cultura e outro, inovador, baseado no
crescimento fúngico e produção do pigmento diretamente no tecido com tingimento em azul
marinho.
Palavras-chave: biopigmentos, Fusarium oxysporum, tecidos, tingimento.
2
ABSTRACT The biotechnological processes have been applied since ancient times, through the
use of living organisms, whether micro-organisms or plants to obtain goods and services,
typically arising as alternative less harmful to the environment compared to traditional
methods of production. In this context, biotechnology is an alternative to supply the growing
demand for natural and environmentally friendly pigments. The present study aimed to the
selection of strains of micro-organisms with the potential to produce biopigments, the
development of methods for recovery of pigment biomass, studies on the kinetics of microbial
growth and production of pigments, in addition to implementing them in dyeing of plastics
and fabrics (cotton, polyester, polypropylene and polystyrene). The fungal biopigment red and
blue were synthesized by Fusarium oxysporum CCT7620 in culture medium liquid and solid
rice-based, and their removal was tested using different solvents: ethanol, isopropyl alcohol,
ethyl acetate, chloroform acidified water and acetone. We performed a kinetic study in a
shaker with half a 50g/L, T at 28°C and 150rpm up to 96 hours of cultivation, and two studies
in bioreactor air lift: one without pH control or T and middle to 50 g/L, and another
maintaining the pH between 6 and 7, the middle 20g/L and T at 28°C, both with
approximately one week of cultivation. Kinetic experiments in flasks and airlift bioreactor
revealed that the exponential growth of this fungus occurs until approximately 48 hours of
cultivation and the production of pigment is associated with growth. So much for the
experiment in flasks as well as in the bioreactor experiments, the staining varied with pH and
the concentration of the medium. By controlling the pH, maintained it in the range between 6
and 7, there was a strong association with purple coloring pigments biomass, with no success
in the extraction process, and a decrease in the rate of microbial growth in comparison with
the case without pH control, which was observed deep red color. The products obtained
proved suitable for the dyeing of fabrics and plastics. Two methods were used to dye a fabric
or plastics, by heating them in the presence of culture supernatant and another, an innovative
one, based on the fungal growth and production of the pigment directly into the fabric dyeing
it of navy blue.
Keywords: biopigments, Fusarium oxysporum, tissues, dyeing.
3
1. INTRODUÇÃO
O principal atributo que salta aos olhos do consumidor é a cor dos objetos, sendo
assim considerado de suma importância para o sucesso comercial dos produtos, é fator
determinante para aceitação de produtos como tecidos e alimentos. Um bom corante deve
possuir estabilidade a luz, à lavagem e à transpiração, além de possuir elevado grau de fixação
para ser usado com eficiência no processo de fabricação (GUARATINI & ZANONI, 2000).
Na antiguidade, os corantes usados eram extraídos obrigatoriamente de fontes
naturais, sejam elas plantas ou animais, contudo a partir da descoberta dos corantes sintéticos
em 1856 pelo químico Willian Perkin, os corantes naturais foram gradativamente sendo
substituídos (GUARATINI & ZANONI, 2000). Dentre os principais problemas associados ao
uso e descarte dos corantes sintéticos, seja na indústria de alimentos ou tecidos, destacam-se
as propriedades toxicológicas, principalmente relacionadas aos corantes com grupamento azo-
aromático, que atua como grupo cromóforo em boa parte dessas moléculas (KUNZ; DE
MORAES & DURÁN, 2002). Além disso, as moléculas de corantes sintéticos são, em sua
maioria, substâncias xenobióticas, ou seja, substâncias estranhas aos seres vivos e, portanto,
os micro-organismos e demais seres vivos podem não dispor de enzimas capazes de
eficientemente degradar tais moléculas. Assim, estes corantes podem apresentar uma taxa de
degradação demasiadamente lenta (baixa biodegradabilidade). Segundo ROSOLEN et al.
(2004), os corantes sintéticos apresentam estrutura aromática complexa, formando compostos
extremamente estáveis e de difícil biodegradação. Além disso, este tipo de substância tem
propriedades recalcitrantes e com tendência a se acumular nos organismos vivos e na cadeia
alimentar (BERTAZZOLI & PELEGRINI, 2002).
Já os corantes naturais apresentam inúmeras vantagens, sendo biodegradáveis e de
baixa toxicidade, possuem maior valor comercial frente aos produtos sintéticos, além de
apresentarem atividades antioxidantes, antibióticas, atuando também na prevenção do cancer
(VOLP; RENHE & STRINGUETA, 2009). Alguns exemplos de pigmentos naturais são
carmim, produzido pelo inseto Dactylopius coccus, a curcumina, obtida a partir da planta
Curcuma longa, e os pigmentos de Monascus, sendo o ultimo, produzido em escala industrial
em países orientais (VOLP; RENHE & STRINGUETA, 2009).Os corantes naturais obtidos
por via biotecnológica apresentam vantagens frente aos corantes naturais de fontes
convencionais (vegetais e animanis), pois não estão sujeitos à sazonalidade, podem ser
4
produzidos ininterruptamente em condições controladas e com rendimentos previsíveis e
otimizáveis.
Com recentes manifestações da sociedade em busca da preservação dos recursos
ambientais e hábitos mais saudáveis, um novo estilo de vida tem surgido. Neste contexto,
produtos naturais adquirem maior valor de mercado em relação aos produtos sintéticos como
relatado por DUFOSSÉ (2006). Diante do exposto, o presente trabalho foi idealizado de forma
a desenvolver processos biotecnológicos para a produção de corantes microbianos em
processos fermentativos tradicionais (“biotecnologia clássica”). Tais produtos representam
potencial interesse para as indústrias de alimentos e tecidos, dado que o primeiro setor
industrial utiliza grande quantidades de corantes sintéticos, alguns deles tóxicos e com pouco
apelo mercadológico; já o segundo setor tem como um dos principais desafios encontrar
substitutos ambientalmente mais amigáveis para os corantes tradicionalmente empregados.
1.1. Objetivo geral
Produzir pigmentos microbianos com potencial aplicação na indústria de tecidos,
de forma a evitar os problemas toxicológicos e ambientais comumente associados aos
corantes sintéticos.
1.2. Objetivos específicos
i. Selecionar, dentre linhagens isoladas do meio ambiente, uma capaz de
produzir pigmentos microbianos;
ii. Produzir os pigmentos microbianos empregando a fermentação no estado
sólido analisando o potencial de determinados substratos;
iii. Produzir os pigmentos microbianos por fermentação submersa em meio
líquido a base de arroz;
iv. Testar diferentes métodos de separação e recuperação dos pigmentos;
v. Efetuar a cinética de produção do pigmento em biorreator de bancada;
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Biotecnologia
A biotecnologia é uma ferramenta que acompanha a humanidade desde seus
primórdios. O termo biotecnologia, este sim mais recente (cunhado no século XX),
5
originalmente descrevia processos de produção de pães, vinhos e derivados lácteos, mas
atualmente evoluiu para incluir outros processos de produção de bens e serviços como as
variadas técnicas de manipulação do DNA (BORÉM, 2005). Mais especificamente, a
chamada “engenharia genética” engloba técnicas de transferência e modificação genética
direta que originaram a “biotecnologia moderna”. A “biotecnologia clássica”, por outro lado,
vale-se de técnicas tradicionais de manipulação dos seres vivos, sem fazer uso da modificação
genética direta, como os já citados processos fermentativos convencionais (SILVEIRA;
BORGES & BUAINAIN, 2005). Dessa forma, a biotecnologia envolve um conjunto de
tecnologias que possibilitam a utilização, alteração e otimização de organismos vivos ou
somente partes deles, suas células, organelas e moléculas gerando produtos, processos e
serviços de interesse econômico visando à saúde humana, saúde animal, agricultura e meio
ambiente (JUDICE & BAÊTA, 2005).
Dentre os pontos positivos da biotecnologia moderna, podemos citar o aumento da
produtividade, a contribuição na redução dos custos de produção, a produção de alimentos de
melhor qualidade e o desenvolvimento de práticas mais favoráveis ao meio ambiente
(SILVEIRA; BORGES & BUAINAIN, 2005). Mais especificamente, os efeitos desejados
com uso da modificação genética de organismos e bens alimentícios incluem a resistência a
herbicidas e pesticidas, as mais variadas pragas, amadurecimento tardio, busca-se a alterar
determinadas propriedades, sendo a cor uma das principais. Apesar dos possíveis efeitos
adversos associados ao consumo destes produtos, tanto para os ecossistemas quanto para a
saúde humana, sua demanda tem aumentado, de modo que atualmente constituem uma parte
significativa das culturas agrícolas em todo o mundo (GARCIA, 2006).
Porém, a biotecnologia ainda remete muitos temores à sociedade, sendo os
principais deles relativos ao desconhecimento de possíveis efeitos adversos nos organismos e
a disseminação descontrolada dos organismos geneticamente modificados, que em contato
com as espécies naturais levariam à perda de variabilidade genética. Outros fatores que
frequentemente entram em discussão são referentes a questões éticas nos processos de
experimentação envolvendo humanos e animais.
Segundo JUDICE & BAÊTA (2005), a biotecnologia é constituída de variados e
importantes segmentos, como a saúde humana, animal e o meio ambiente, a tabela 1, mostra o
segmento da biotecnologia e sua respectiva aplicação.
6
Tabela 1. Segmento da biotecnologia e suas aplicações: Segmento da Biotecnologia Aplicação
Saúde Humana Diagnósticos, medicamentos, vacinas, utilização
de biodiversidade
Saúde animal Veterinária, vacinas, probióticos, nutrição animal,
aquacultura
Agribusiness Genética de plantas, transgênicos, produtos
florestais, ornamentais, medicinais, bioinseticídas,
biofertilizantes; inoculantes
Meio ambiente Biorremediação, tratamento de resíduos, análises
Instrumental complementar Software, internet, bioinformática, e-commerce,
P&D, consultorias
Insumos industriais Química fina, enzimas, alimentos
Em sinergia Biomateriais, biomedicina, nanobiotecnologia
Fornecedores Equipamentos; insumos e matérias primas
Fonte: JUDICE & BAÊTA, 2005.
Em relação ao meio ambiente, a biotecnologia fornece importantes alternativas
para o tratamento de resíduos e recuperação de áreas degradadas com o uso dos mais variados
micro-organismos e plantas, fornecendo assim, importantes alternativas para o
desenvolvimento sustentável, como é o caso dos mais variados processos de biorremediação.
Um exemplo interessante é a remoção de cádmio por Pseudomonas aeruginosa, onde a
remediação microbiológica mostrou elevado potencial para o tratamento in situ ou ex situ de
resíduo industrial (SINHA & MUKHERJEE, 2009).
Além disso, os processos biotecnológicos são mais ambientalmente amigáveis,
quando comparados aos processos químicos tradicionais, dado que na maioria dos casos eles
7
ocorrem em condições mais brandas (menor demanda energética), não utilizam produtos
tóxicos e seus resíduos são facilmente biodegradáveis. Tal fato possui considerável relevância
no contexto atual para a redução dos impactos ambientais e a manutenção do
desenvolvimento sustentável, uma vez que contribui para a redução da geração de produtos
nocivos à saúde e ao meio ambiente.
2.2. Corantes e pigmentos
Corantes e pigmentos são nomes genéricos dado aos aditivos responsáveis por
conferir cor aos materiais. A diferença entre os dois se dá basicamente pelo tamanho da
partícula e o grau de solubilidade no meio em que estão inseridos (SARON & FELISBERTI,
2005). Geralmente os pigmentos possuem maior tamanho em relação aos corantes sendo
insolúveis no polímero; em contrapartida, os corantes apresentam maior solubilidade. Podem
também ser diferenciados de acordo com a forma de cobertura: o pigmento promove
simultaneamente a cobertura, a opacidade, o tingimento e a cor nos materiais; o corante
promove apenas o tingimento, não conferindo a cobertura. De modo que o corante mantém a
propriedade de transparência do objeto tingido; o pigmento por sua vez, confere cor e retira a
transparência (MENDA, 2011). Por conveniência, estes dois termos serão considerados
sinônimos no texto da presente dissertação.
Os corantes possuem elevada capacidade de captar radiação luminosa e permitem
aos polímeros transparentes a manutenção da propriedade de transparência. Em determinados
aspectos, a solubilidade dos corantes pode ser considerada um ponto negativo, fazendo com
que os mesmos migrem para a superfície do material, provocando mudanças na cor dos
produtos. Podem também sublimar e apresentar toxicidade e são mais caros em relação aos
pigmentos. Os pigmentos, por sua vez, não migram, não apresentam sublimação, são
geralmente mais baratos e sua toxicidade é menor ou ausente. Possuem a desvantagem de ser
geralmente abrasivos, de difícil dispersão e quando são incorporados ao polímero fazem com
que o material se torne opaco (SARON E FELISBERTI, 2005).
As moléculas de corantes naturais ou sintéticos, possuem em sua estrutura um
sistema de duplas ligações alternadas (conjugadas), que confere a propriedade de absorção de
determinados comprimentos de onda de radiações eletromagnéticas na região do espectro da
luz visível, promovendo a deslocalização dos elétrons e proporcionando a capacidade da
molécula manifestar a cor. Esse grupamento particular recebe o nome de cromóforo,
conforme destacado no exemplo apresentado para o β-caroteno na Figura 1 (NELSON &
COX, 2001). Alguns exemplos de corantes com importância
são apresentados nas Figuras 2 e
ligações conjugadas (cromóforos) que conferem cor a estes elementos.
Figura 1 Molécula de β-caroteno com o g
a)
c)
Figura 2 - Estrutura química de corantes
corante sintético
Alguns exemplos de corantes com importância na indústria têxtil e de
são apresentados nas Figuras 2 e 3, respectivamente. É interessante observar as duplas
ligações conjugadas (cromóforos) que conferem cor a estes elementos.
caroteno com o grupamento cromóforo destacado em vermelho2001).
b)
d)
ímica de corantes com uso na indústria têxtil. a) Corante sintético sintético índigo carmim, c) cristal violeta, e) corante natural
8
na indústria têxtil e de alimentos
É interessante observar as duplas
vermelho (NELSON & COX,
sintético vermelho congo, b) natural anil.
a)
c)
Figura 3 - Estrutura química de corantes vermelho 40, d) amarelo crepúsculo; e
b)
d)
e)
f)
Estrutura química de corantes sintéticos com aplicação industrial. a) amaranto,
, d) amarelo crepúsculo; e) amarelo tartrazina, f) azul brilhan
9
) amaranto, b) Ponceau 4R, c) ) azul brilhante.
10
2.3. Cor
Segundo PEDROSA (1982) e MELCHIADES & BOSCHI (1999), a cor pode ser
definida como uma sensação ou um aspecto de aparência, de característica subjetiva, em
resposta a um estímulo recebido por células da visão e transmitido ao cérebro. A cor está
diretamente relacionada com a fonte de luz, o objeto a ser observado e com o observador,
considerados os três elementos primordiais para a distinção da cor.
Somente podem ser vistos objetos luminosos ou iluminados por uma fonte de luz,
que é o elemento determinante para a manifestação das cores de qualquer objeto. São
exemplos de fontes de luz: o sol, as lâmpadas incandescentes, lâmpadas fluorescentes e de
sódio. Cada uma delas possui uma composição espectral diferente, o que faz com que um
mesmo objeto possa apresentar diferentes colorações diante de diferentes iluminantes. Assim
sendo, a cor é uma propriedade não imutável dos objetos (PEDROSA, 1982).
A luz, por sua vez, é o nome dado à radiação eletromagnética com comprimentos
de onda na faixa de aproximadamente 400 a 700 nm, o que corresponde ao chamado espectro
visível, de forma que cada intervalo representa a uma cor diferente (MELCHIADES &
BOSCHI, 1999). O espectro de radiações eletromagnéticas da luz é ilustrado na Figura 4, na
qual se pode verificar que a luz visível compreende apenas uma estreita faixa do espectro.
Além disso, o espectro visível situa-se entre as radiações eletromagnéticas altamente
energéticas, como as radiações gama e os raios X, que tem potencial de causar danos as
células vivas, e as radiações de baixa intensidade, como as ondas de radio e TV
(MELCHIADES & BOSCHI, 1999).
Figura 4
Figura 4 - Espectro eletromagnético da luz, com variada gama de comprimentos de onda.
Os estímulos responsáveis pelas sensações cromáticas se dividem em dois grupos
de acordo com a teoria da cor: o princípio da composição aditiva de cores (cor luz) indica que
qualquer cor do espectro visível pode ser obtida mesclando-se ou sobrepondo-se as três cores
primárias, que são o vermelho, o verde e o azul. Tais misturas aditivas são evidenciadas nas
Espectro Eletromagnético da Luz
Radio Microondas Infravermelho Visível Ultravioleta Raio X Raios Gama
11
cores de imagens projetadas em telas, sendo que a sobreposição de luzes vermelhas, verdes e
azuis gera uma luz branca. A cor descrita como pigmento ou substância material é oriunda da
difusão da luz sobre a substância, que ao absorver, refratar e refletir os raios luminosos; sendo
uma substância com capacidade de absorver todas as faixas coloridas da luz, teoricamente
preta, sendo este o princípio da mistura subtrativa das cores, como observado em uma mistura
de tintas vermelha, verde e azul (PEDROSA, 1982).
Portanto, podemos manipular a cor desejada de um objeto ao alterar suas
propriedades de absorção de cores pela adição de determinadas substâncias químicas, as quais
são chamadas de pigmentos e corantes. Desta forma, o que determina a cor de um objeto é sua
capacidade de refletir ou absorver a radiação eletromagnética em um dado comprimento de
onda. Ou seja, um objeto é branco ao refletir todas as cores do espectro enquanto que algo
preto não reflete nenhuma luz incidente (MELCHIADES & BOSCHI, 1999).
Existem equipamentos que permitem a caracterização das cores, chamados
colorímetros e espectrofotômetros, sendo a caracterização das cores mais completa com o
emprego dos espectrofotômetros, por realizarem um número maior de subdivisões quanto a
luz refletida por um objeto em intervalos de comprimento de onda (MELCHIADES &
BOSCHI, 1999).
12
2.4. Corantes para tecidos
Segundo GUARATINI & ZANONI (2000), o processo de tingimento é de vital
importância para o sucesso comercial dos produtos têxteis. Assim, para apresentar
propriedade de tingimento, os corantes para tecidos devem apresentar dois componentes-
chaves: o grupo cromóforo, o responsável pela cor, e o grupo funcional, capaz de se ligar às
fibras do tecido. A literatura descreve grande quantidade de corantes, que podem ser
classificados de acordo com a natureza química ou sua aplicação a um dado tipo de fibra
(SOARES, 1998). As principais categorias são:
- Corantes ácidos: são conhecidos como corantes aniônicos. Boa parte destes
corantes são sais de ácido sulfônico. Os corantes ácidos se associam a fibra por meio de troca
iônica. Quimicamente, os corantes ácidos são classificados em azo, antraquinona,
trimetilmetano, xanteno, nitro e nitroso, quinolina (GUARATINI & ZANONI, 2000).
- Corantes diretos: denominados corantes substantivos, são corantes aniônicos
solúveis em água e sua principal diferença em relação aos corantes ácidos e básicos é a
elevada afinidade por fibras celulósicas. São caracterizados pela presença de mais de um
grupo azo na molécula, são similares aos corantes ácidos, sendo aplicados em fibras
celulósicas, viscose e polinósica. Seu elevado grau de exaustão contribui para uma menor
liberação de rejeitos nas águas (GUARATINI & ZANONI, 2000).
- Corantes ao enxofre: sua característica de maior relevância é presença de
compostos macromoleculares com pontes dissulfeto. São inicialmente insolúveis em água,
mas dissolvem em solução de sulfito de sódio ou hidrossulfito de sódio que podem atuar
como agente redutor (GUARATINI & ZANONI, 2000).
- Corantes a cuba: são corantes insolúveis em água baseados nos índigos,
tioindigóides e antraquinonas, formam compostos leuco-solúveis em meio alcalino (NaOH) e
agente redutor como, por exemplo, o hidrossulfito de sódio. Amplamente utilizados para corar
algodão, são absorvidos pela fibra e subseqüentemente oxidados na presença de ar
(GUARATINI & ZANONI, 2000).
- Corantes azóicos: são sintetizados sobre as fibras, é necessária a adição de um
agente de acoplamento como o naftol e um sal diazônio. O mecanismo de produção sobre a
fibra no momento da reação de tingimento resulta na produção de um corante com elevado
grau de fixação, resistência a luz e umidade. Esses corantes podem ser aplicados em fibras
celulósicas, seda, viscose e poliamida (GUARATINI & ZANONI, 2000).
- Corantes dispersos: suspensões de compostos orgânicos insolúveis em água,
também denominados corantes não-iônicos. O processo de tingimento acorre na presença de
13
agentes dispersivos de cadeia longa. São usados em fibras sintéticas como acetato de celulose,
poliéster, nylon e poliacrilonitrila (GUARATINI & ZANONI, 2000).
- Corantes reativos: são compostos que contém um ou mais grupos reativos
capazes de formarem ligações covalentes com os grupos hidroxilas, nitrogênio, aminas ou
enxofre das fibras celulósicas, fibras de proteínas e poliamidas. Os principais corantes da
classe possuem como grupo cromóforo a antraquinona ou azo (GUARATINI & ZANONI,
2000).
- Corantes pré-metalizados: estes corantes possuem um grupamento hidroxila ou
carbonila na posição orto em relação ao grupo cromóforo azo, o que torna possível a
formação de complexos com íons metálicos. São usados no tingimento de fibras protéicas e
poliamidas. Tais corantes possuem uma considerável desvantagem ecológica devido a
elevadas concentrações de metais nas águas de rejeito (GUARATINI & ZANONI, 2000).
Além dos corantes citados acima, SOARES (1998) considera de grande relevância
para o setor têxtil, os seguintes tipos de corantes:
- Corantes básicos: também conhecidos como corantes catiônicos, eles apresentam
solubilidade em água e estão distribuídos em várias classes químicas como azo, antraquinona,
triarilmetano, triazina, oxima, acridina e quinolina.
- Mordentes: o corante liga-se à fibra têxtil através de um mordente, podendo o
mesmo ser uma substância orgânica ou inorgânica, naturais ou sintéticos. O cromo é o
mordente inorgânico mais utilizado, estando na forma de óxido; já o mordente orgânico mais
utilizado é o ácido tânico. São aplicados a fibras celulósicas, protéicas e poliamida.
De forma geral, os corantes têxteis são os grandes responsáveis pelo aumento da
turbidez das águas onde são lançados de modo que a passagem de luz torna-se comprometida,
afetando negativamente o equilíbrio dos ecossistemas aquáticos por interferir no processo
fotossintético de diversas espécies de plantas e micro-organismos fotossintetizantes. Segundo
GUARATINI & ZANONI (2000), devido a sua natureza colorida, os corantes podem ser
detectados sem dificuldade a olho nu, podendo ser notados em concentrações tão baixas
quanto 1ppm. Além disso, mesmo presentes em pequena quantidade nos efluentes, estes
corantes são capazes de ocasionar grande impacto ambiental devido a propriedades inerentes
como dispersão, baixa biodegradabilidade e toxicidade, sendo que nos processos de
tingimento são lançadas grandes quantidades de agentes dispersivos como hidrossulfito de
sódio e íons metálicos (GUARATINI & ZANONI, 2000).
14
Geralmente, os corantes não são facilmente removíveis através de processos
convencionais de tratamento de efluentes e alguns deles apresentam potencial mutagênico e
carcinogênico. Muitos desses corantes, principalmente os derivados da função azo,
apresentam atividade pró-carcinógena ao serem metabolizados por micro-organismos
intestinais (GUARATINI & ZANONI, 2000).
Como exemplo de métodos de tratamento de efluentes têxteis usados atualmente,
podemos citar: a ozonização, a adsorção por carvão ativado e a degradação microbiológica.
Segundo KUNZ; DE MORAES & DURÁN (2002), as novas tendências no tratamento de
corantes e resíduos têxteis são: a biodegradação, o tratamento com ozônio, a fotocatálise
heterogênea, os processos físicos e os processos combinados.
2.5. Biocorantes
Para o setor têxtil, a cor possui elevada importância na comercialização dos
produtos, de modo que atributos como a solidez, resistência a luz, temperatura, extremos de
pH e dispersão, são indispensáveis para a qualidade do produto GUARATINI & ZANONI
(2000), de modo que um bom biocorante deve exibir as características relatadas
anteriormente. No que se refere a indústria de alimentos, a cor é um dos principais atributos
inerentes aos bens alimentícios, estando diretamente relacionada à aceitação ou rejeição de
um produto por parte da sociedade. Logo, é muito comum a associação da cor ao sabor dos
alimentos, por tal motivo, parece lógica a associação de um aditivo vermelho ao sabor de
morango (ABEROUMAND, 2011).
Segundo CHATTOPADHYAY; CHATTERJEE & SEN (2008) a aplicação dos
corantes, data de 2.600 aC na China. O carmin, um corante natural derivado do inseto
Dactylopius coccus, era usado pelos povos astecas na América Central já no século IV dC.
Considerando o uso tradicional e o apelo mercadológico dos corantes naturais, a demanda por
tais materiais tem aumentado substancialmente nos últimos anos, especialmente após a
segunda metade do século XX, devido a mudanças de atitudes por parte da sociedade e a
associação generalizada que tem sido feita entre os termos “corantes sintéticos”, “tóxicos” e
“contaminantes” (CHATTOPADHYAY; CHATTERJEE & SEN, 2008).
Os corantes naturais podem apresentar diferentes origens: são oriundos de plantas,
a Curcuma longa, que sintetiza a curcumina (corante presente no açafrão-da-terra);
provenientes de animais, como já citado para o inseto Dactylopius coccus; ou também
derivados do metabolismo de diferentes micro-organismos, sendo os últimos chamados
15
“biocorantes”(PINTEA, 2008). Os biocorantes, além do atributo da cor, podem atuar como
conservantes naturais de alimentos, os corantes produzidos por Monascus ruber ao
metabolizar o arroz constituem um bom exemplo, influenciando ainda no “flavour” desses
produtos (VIDYALAKSHMI et al., 2009). O caráter antimicrobiano dos biocorantes é um
atributo desejável também para o setor têxtil, ALIHOSSEINI et al. (2008) descreve o
tingimento de diversos materiais a partir de corante produzido pela bactéria Vibrio sp.
exibindo atividade antimicrobiana contra E.coli e S.aureus.
Assim, os biocorantes são corantes sintetizados biologicamente a partir de micro-
organismos, normalmente como metabólitos secundários (CHAVEZ et al., 2008). Bactérias,
fungos e microalgas são amplamente descritos na literatura como produtores de diversas
moléculas de pigmentos naturais (Tabela 2). Tais substâncias são produzidas pelo micro-
organismo como forma de defesa a ataques de outros organismos ou radiações
eletromagnéticas danosas, proteção contra agentes oxidantes, proteção contra frio e calor
extremos, aquisição de nutrientes como ferro, aquisição de energia por processo fotossintético
estando associados em alguns casos, a funções vitais e reprodutivas dos micro-organismos
(LIU E NIZET, 2009).
16
Tabela 2. Alguns exemplos de micro-organismos envolvidos na produção de pigmentos microbianos: Micro-organismo produtor Pigmento Cor
Streptomyces coelicolor Actinorhodina Azul, vermelho
Monascus sp. Monascorubrina,
Ancaflavina;
Rubropuctatina
Amarelo ao vermelho
Fusarium oxysporum Antraquinonas Vermelho
Fusarium sp. Bicaverina Vemelho
Blakeslea trispora, Dunaliella sp. β-caroteno Amarelo, laranja
Chromobacterium violaceum Violaceína Violeta
Dermocybe sanguinea Antraquinonas Vermelho
Agrobacterium aurantiacum Astaxantina Rosa, vermelho
Xanthophyllomyces dendrorhous Astaxantina Rosa, vermelho
Serratia marcescens Prodigiosina Vermelho
Penicillium oxalicum Arpink RedTM
(antraquinona)
Vermelho
Penicillium sp. Outros Amarelo,
vermelho,
azul e verde.
Cordyceps unilateralis Naftoquinona Vermelho sangue
Mucor circinelloides β-caroteno Laranja, Amarelo
Spirulina Ficocianina Azul
Fonte: BICAS et al., 2013; NAGIA & MOHAMEDY, 2007; RETTORI & DURÁN, 1998; RÄISÄNEN, 2009 &
DUFOSSÉ, 2006.
Bicaverina
Monascina
Figura 5. Estrutura química de corantes naturais produzidos por micro
OO O
O
OO OH
OH
O
HO
OO
O
O
OR
Actinorhodina
Astaxantina
Rubropunctatina
Zeaxantina
Estrutura química de corantes naturais produzidos por micro-organismosDUFOSSÉ, 2006).
O
O O
OO O
O O
OH OH
OHOH
O
OH
OO
O
O
OR
17
organismos (BICAS et al., 2013;
O
O
O
18
Muitos desses micro-organismos produtores de corantes naturais sintetizam
substâncias tóxicas, como micotoxinas, o que pode limitar o uso destes produtos,
principalmente na indústria de alimentos e na indústria têxtil, já que a presença de substâncias
tóxicas pode levar a reações alérgicas quando em contato com a pele humana. Dessa forma, é
interessante que o micro-organismo produza elevadas concentrações de pigmento e o mínimo
ou nenhuma toxina (CARVALHO et al., 2005). Em experimentos realizados com quatro
linhagens do fungo Monascus sp. para a avaliação da produção de pigmentos, uma das
linhagens mostrou-se vantajosa, tanto para obtenção do bioproduto a partir de arroz cozido
quanto para a baixa produção da micotoxina citrinina. No estudo em questão, o crescimento
celular foi quantificado pelo método da determinação do crescimento radial, os pigmentos e a
toxina citrinina foram extraídos com etanol e avaliados por espetrofotometria e HPLC,
concluindo ser o pigmento instável em pHs baixos e temperaturas elevadas (CARVALHO et
al., 2005).
Em contrapartida, alguns organismos produzem pigmentos com atividade
antimicrobiana e antitumoral, como é o caso da violaceína, produzida pela bactéria
Chromobacterium violaceum, da actinorrodina, produzida pela bactéria filamentosa
Streptomyces coelicolor, e da bicaverina, produzida por linhagens do fungo Fusarium,
(RETTORI & DURÁN, 1998; BYSTRYKH et al.,1996; LIMÓN; RODRÍGUES-ORTIZ &
AVALOS, 2010).
O fungo Monascus sp. é talvez o mais antigo exemplo de micro-organismo
produtor de corante alimentício, pois tem sido tradicionalmente usado em países orientais
desde a antiguidade como aditivo alimentar (CARVALHO et al., 2005). Outros pigmentos
microbianos com relevância comercial são: astaxantina oriunda de Haematococcus pluvialis
ou Xanthophyllomyces dendrorhous, Arpink Red obtido do fungo Penicillium oxalicum,
riboflavina obtida de Ashbya gossypii, β-caroteno a partir de Dunaliella salina, D. bardawil
ou Blakeslea trispora, e ficolibiproeínas de Spirulina sp. e Porphyridium sp. (DUFOSSÉ et
al., 2005). Uma série de pigmentos de relevância comercial e respectivos organismos
produtores são listados na Tabela 2.
A produção de pigmentos microbianos azuis é mais rara. No caso do micro-
organismo Streptomyces coleicolor esta cor está associada a uma substância descrita como
actinorrodina (BRYSTRYKH et al., 1996). Este pigmento azul mostrou boas características
para a utilização como aditivo alimentício, não sendo tóxico e apresentando boa estabilidade,
apesar de sua coloração poder variar de vermelho (pH ácido) a azul (pH alcalino) em função
19
do pH do meio em que estão inseridos (ZHANG et al. (2006). Cianobactérias produzem uma
substância de coloração azul fluorescente chamada ficocianina, a qual possui propriedades
antioxidantes e com potencial para utilização na indústria farmacêutica, indústria de
cosméticos e indústria de alimentos (ERIKSEN, 2008; DUFOSSÉ et al., 2005). Em
experimentos para a recuperação do pigmento azul ficocianina, a partir de biomassa fresca de
Spirulina sp. bons resultados foram obtidos, sendo que os pigmentos apresentaram boa
estabilidade a pH’s próximos a neutralidade e temperatura ambiente por longo período de
tempo, contudo, ao elevar a temperatura acima dos 45ºC, a cor desaparece e o perfil de
absorbância a 615nm é drasticamente alterado (SARADA; PILLAI & RAVISHANKAR,
2008). Além disso, uma série de microalgas são descritas como produtoras de carotenóides,
tais como as do gênero Rhodophyta ou Dunaliella, com destaque para o último (DUFOSSÉ et
al., 2005).
NAGIA & MOHAMEDY (2007), obtiveram êxito na produção de biocorantes e
tingimento de tecidos de lã a partir do fungo Fusarium oxysporum, posteriormente
conduzindo estudos para avaliar a influência da concentração de sais, pH e temperatura no
banho de tingimento.
2.6. Processamento têxil e o tingimento de tecidos
O setor têxtil constitui um importante mercado de consumo de produtos químicos
necessários para a fabricação de fibras sintéticas, naturais e produtos auxiliares de relevância
para o beneficiamento (ALCÂNTARA & DALTIN, 1996). Segundo ALCÂNTARA &
DALTIN (1996), as transformações no processamento têxtil ocorrem de modo subsequente,
começando com a obtenção das fibras, naturais ou não, chegando ao processo de fiação,
tecelagem e o beneficiamento têxtil (Figura 6). O processo é descrito adiante em maiores
detalhes segundo ALCÂNTARA & DALTIN (1996):
- Fiação: é o processo de produção dos fios, ocorrendo a partir de fibras naturais
ou não naturais, como o algodão, a seda, a lã e o poliéster. É comum a utilização de fibras
mistas, como algodão e nylon, para se aumentar a elasticidade dos fios.
- Tecelagem: consiste no cruzamento de dois sistemas distintos de fios paralelos,
onde um sistema de fios já paralelizados entra no tear e recebe o nome de fio de urdume. O
processo de paralelização dos fios gera os rolos de urdume. Os fios de urdume sofrem grande
atrito devido a repetidas batidas dos pentes dos teares contra a trama, podendo ocasionar
rompimento dos fios levando a atrasos no processo. Para diminuir a possibilidade de
rompimento, os fios de urdume recebem um tratamento denominado engomagem.
20
Fiação Engomagem Tecelagem
Beneficiamento
primário
Degomagem Malha
Purga Mercerização Tingimento
Secagem Amaciamento Lavagem
Figura 6 - As transformações no processamento têxtil. Cada uma das etapas é descrita em maiores detalhes no
texto.
- Fiação: o processo de fiação consiste na obtenção dos fios a partir da matéria
prima, seja ela de origem natural, como as lãs, o algodão ou a seda, seja ela sintética como o
poliéster ou o nylon.
- Engomagem: é a impregnação e revestimento de fios com substâncias adesivas,
que ao formar um filme em sua superfície, aumentam a resistência mecânica dos fios
diminuindo as tensões e os atritos. A substância comumente usada no processo de
engomagem é a goma sintetizada a partir de amido de milho ou batata.
- Tecelagem: consiste no processo de entrelaçamento dos fios, que ocorre no
teares, para obtenção das malhas ou tecidos.
- Desengomagem: o procedimento tem por objetivo, a remoção da goma de amido
impregnada a fibra têxtil. A degomagem ocorre pela ação de enzimas amilolíticas ou por
oxidação.
- A purga é a fervura do tecido na presença de compostos tensoativos, que
melhoram a penetração do corante aplicado subsequentemente, além de promover a limpeza
dos tecidos.
- A mercerização é o tratamento com hidróxido de sódio para promover brilho,
maior afinidade ao corante aplicado subsequentemente, toque mais macio, maior resistência,
aumenta a capacidade de absorção de água e promove o pré-encolhimento.
- Beneficiamento primário: consiste na aplicação dos três processos anteriores
junto a fibra têxtil (degomagem, purga e a mercerização) e envolve a preparação do tecido
para outros tratamentos químicos.
21
- Tingimento: É a modificação da cor original dos tecidos pela adição de
substâncias que podem ser corantes ou pigmentos. Ocorre em três fases distintas: i)
montagem, que é a transferência do corante em solução para a superfície da fibra; ii) fixação,
que ocorre pela reação do corante com a fibra por insolubilização do corante ou alteração da
fibra por elevação da temperatura; iii) tratamento final, que consiste na lavagem com água
quente na presença de detergentes para a remoção do excesso de corante, geralmente
realizado em água corrente.
- A lavagem acontece em água corrente e temperaturas mais elevadas, e na
presença de detergentes, como descreve GUARATINI & ZANONI (2000), trata-se da etapa
mais problemática do processo têxtil com relação a questões ambientais, uma vez que todo o
corante não fixado, estimado em 15% da produção total, sai nos banhos de lavagem, sendo
lançado diretamente no ambiente.
- As etapas finais são o amaciamento, com a adição de agentes químicos que
causam repulsão entre as fibras e a secagem dos tecidos, e os mesmos estão aptos a
comercialização.
2.7. Biotingimento
Os micro-organismos podem ser explorados como fontes naturais e virtualmente
inextinguíveis de corantes têxteis, sendo capazes de se multiplicar rapidamente a partir de
variadas matérias-primas, além de poderem ser cultivados ininterruptamente (sem efeitos
sazonais) em condições controladas e otimizáveis e sem os impactos ambientais comumente
associados aos processos puramente químicos. Porém, a exploração do potencial de
pigmentos microbianos para o tingimento de tecidos é uma abordagem relativamente recente
e pouco explorada. Dentre os poucos trabalhos encontrados nesta área, todos foram efetuados
há menos de uma década.
Os fungos Trichoderma virens, Curvularia lunata e Alternaria alternata são
exemplos de produtores de pigmentos com boas caracteristicas para tingimento de lã e seda,
podendo ser considerados não tóxicos para a pele humana. O pigmento oriundo do fungo
Trichoderma virens possui ainda atividade antifúngica devido a síntese de substâncias
antimicrobianas. O processo pode ser facilmente adaptado para escalas maiores de forma a
obter o produto de maneira ambientalmente correta, ou com baixo impacto ambiental
negativo (SHARMA et al., 2012).
22
Linhagens da espécie Fusarium oxysporum isoladas previamente de raízes de
plantas cítricas acometidas pela murcha e podridão radicular foram utilizadas por NAGIA &
MOHAMEDY (2007) para o cultivo em meio PDA, exibindo coloração roxa e rósea, e para
produção de antraquinonas em cultivo submerso, onde o pigmento gerado demonstrou
elevado potencial para utilização no biotingimento de tecidos de lã com bom rendimento e
boas propriedades de fixação e solidez da cor. Os pigmentos produzidos foram ainda
analisados por cromatografia após extração e purificação. O banho de tingimento foi
acrescido de cloreto de sódio em diferentes concentrações, sendo que a adição do sal não foi
favorável ao processo, variando-se a temperatura de 30 a 100ºC no intervalo de tempo de 12 a
120 min, os autores observaram que as maiores temperaturas propiciam um melhor
tingimento, a fixação foi testada após limpeza dos tecidos com solução de detergente não
iônico na concentração de 3g/L a temperatura de 50ºC por 30 min, mantendo-se a solidez da
cor (NAGIA & MOHAMEDY, 2007).
RÄISÄNEN (2009), em estudos com o fungo ectomicorrízico Dermocybe
sanguinea, obteve êxito na produção de pigmentos naturais da classe das antraquinonas
(emodina e dermocibina) com tons brilhantes e boas propriedades de estabilidade da cor, e
aplicando-os como licor de tingimento têxtil de lã, poliester e poliamida.
ALIHOSSEINI et al. (2008), investigando a produção de pigmentos naturais por
processos fermentativos com micro-organismo identificado como Vibrio sp. isolado
previamente de sedimentos marinhos, testou a aplicação dos pigmentos microbianos no
tingimento de diversas fibras têxteis, obtendo sucesso no tingimento de tecidos de lã, seda,
nylon e acrílico, concluindo ser a molécula responsável pela coloração vermelha, a
prodigiosina. Foi constatada ainda, atividade antimicrobiana desta molécula.
O tingimento de algodão a partir de biopigmentos oriundos de cinco fungos
diferentes (Monascus purpureus, Isaria farinosa, Emericella nidulans, Fusarium
verticillioides e Penicillium purpurogenum) em temperatura de 80ºC por 90 minutos, foi
avaliado bem como a utilização de mordentes por dois diferentes métodos de fixação,
mostrando boa eficiência e comprovando o potencial dos biopigmentos para suprir a demanda
do mercado têxtil (Velmurugan et al., 2010).
DE SANTIS et al., (2005), em experimentos com Monascus purpureus C322,
produziu pigmentos vermelho e laranja e realizando testes de tingimento em amostras de lã,
obteve sucesso tanto na aplicação dos pigmentos nas fibras, quanto para a aplicação dos
23
mordentes alúmen e cloreto estânico. O pigmento laranja mostrou-se mais estável em relação
aos testes de solidez e fixação dos pigmentos.
3. MATERIAL E MÉTODOS
O fluxograma a seguir (Figura 7) mostra de forma esquemática a sequencia de
procedimentos experimentais adotados no presente estudo.
Figura 7. Fluxograma resumindo o processo experimental para a produção dos pigmentos e tingimento de materiais.
Suspensão de solo
Seleção Isolamento
Slants de PDA
Fermentação em estado sólido com arroz moído em
moinho de bolas.
Testes com diferentes granulometrias de arroz.
Cinética em Erlenmeyers
Fermentação submersa com meio
líquido a base de arroz
Cinética em Air Lift
Tingimento de materiais
Testes de extração com solventes
24
3.1. Micro-organismo
O micro-organismo utilizado foi isolado a partir de suspensão de solo em água
estéril coletado nas proximidades do Campus Alto Paraopeba – CAP/UFSJ no município de
Ouro Branco-MG. Em béquer estéril foram adicionados aproximadamente 5g de solo e 50 mL
de água estéril. Este material passou por sucessivas diluições seriadas, transferindo-se 1 mL
da solução inicial para um tubo de ensaio previamente esterilizado contendo 9 mL de água
peptonada. Cem microlitros da diluição 10-3 foram transferidos para a superfície de uma placa
de Petri contendo meio PDA (ágar dextrose de batata), seguido de espalhamento com alça de
Drigalsky (spread plate). As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 28°C por uma
semana. Dentre as colônias que cresceram, culturas de fungos pigmentadas de vermelho
foram isoladas por meio do método de esgotamento por estrias em meio nutritivo PDA. As
culturas escolhidas com base na coloração das colônias foram inoculadas em tubo com ágar
PDA inclinado, sendo mantidas à temperatura de 4°C e repicadas periodicamente para o
mesmo meio nutritivo. Algumas réplicas foram estocadas em tubo inclinado contendo glicerol
estéril a -18°C e outras foram liofilizadas.
3.1.1. Caracterização morfológica
O micro-organismo previamente isolado foi enviado para identificação junto ao
Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa – UFV, que gentilmente
realizou a caracterização morfológica do mesmo, concluindo ser o fungo fusiforme Fusarium
oxysporum. Esta linhagem foi depositada na Coleção de Culturas Tropicais da Fundação
André Tozello (Campinas – SP) sob o número Fusarium oxysporum CCT7620.
3.2. Produção de pigmentos em Fermentação no Estado Sólido
3.2.1. Escolha do meio de cultivo
Em testes preliminares, alguns meios de cultivo sólidos foram testados para
avaliar o crescimento e a produção de pigmento pelo fungo F. oxysporum CCT7620, entre
eles o meio PDA, ágar Sabouraud (peptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, glicose 20g/L,
ágar 15g/L, pH 6,5), ágar amido (1% amido solúvel; 0,2% extrato de levedura; 0,5% peptona;
0,1% NaCl; 0,02% CaCl2 e 1,7% agar), além de meios a base de farinha de mandioca e arroz,
como será detalhado adiante.
25
Como inóculo utilizou-se uma suspensão de esporos preparada pela adição de 20
mL em de água estéril em tubo com meio PDA inclinado contendo micro-organismo
esporulado (crescimento por sete dias a 28°C) com subseqüente raspagem da cultura com
auxílio de uma alça de platina devidamente flambada. Esta suspensão continha, em média, 8,0
x 107 esporos/mL. Nos três primeiros meios mencionados, placas de Petri estéreis contendo os
meios PDA, ágar sabouraud e ágar amido foram inoculadas 0,1 mL da suspensão de esporos e
espalhados, seguindo o método spread plate. Nos dois últimos casos, os meios a base de
farinha de mandioca e arroz foram preparados em placa de Petri adicionando-se 15g de uma
mistura arroz e água ou farinha de mandioca e água na proporção de uma parte de material
sólido para cada parte de água. Após autoclavagem (121°C/15min), o que proporcionou o
cozimento do material amiláceo, 1 mL da suspensão de esporos foi adicionada o mais
homogeneamente possível sobre a superfície do meio. Todas as placas foram incubadas por
uma semana em estufa bacteriológica a 28°C.
3.2.2. Avaliação da granulometria no meio a base de arroz
Aproximadamente 1 Kg de arroz foi moído com auxílio de moinho de bolas
durante 10 minutos. O farelo obtido foi peneirado em agitador de peneiras com os seguintes
tamanhos de poros: ABNT/ASTM 16 (Mach 14, 1,18mm), ABNT/ASTM 30 (Match 28,
600µm), ABNT/ASTM 40 (Match 35, 425µm) e ABNT/ASTM 50 (Match 48, 300µm). As
frações retidas em cada uma das peneiras, assim como o pó (F) obtido na bandeja final, foram
usadas para preparo de meio de cultivo e crescimento microbiano, em triplicata, da mesma
forma como descrito acima (item 3.3.1). De forma resumida, cada uma das frações retidas em
cada peneira, bem como o produto da bandeja final (“fundo de peneira”), foi adicionada (15g)
em placas de Petri, sendo umidificadas (15g de água) e esterilizadas em autoclave antes da
inoculação.
3.2.3. Recuperação dos pigmentos
Após crescimento e pigmentação dos meios de cultivo, os mesmos foram
esterilizados em autoclave a 121°C por 15 minutos e, posteriormente, os meios sólidos
fermentados e já pigmentados foram secos em estufa a 50°C por 48 horas. O material sólido
estéril foi pulverizado em almofariz e tratado com variados solventes como tentativa de
extração e purificação. Os solventes acetato de etila, acetona, etanol, álcool isopropílico,
clorofórmio/HCl e água foram testados. Cerca de 2g do material seco foi disposto em seis
26
tubos de ensaio, cada qual contendo um dos solventes (4 mL) mencionados. Após mistura por
60s em vórtex, a possível extração dos pigmentos foi avaliada visualmente e, quando fosse o
caso, em espectrofotômetro (varredura no visível).
Para avaliar a possível extração de pigmentos associados à biomassa, foram
realizados testes para rompimento da parede celular do fungo. As técnicas consideradas nesta
etapa foram: i) o material sólido foi triturado em moinho de bolas durante 10 min; ii)
aplicação de Tween 20 (polissorbato) (1%, v/v).
3.3. Produção de pigmentos em cultivo submerso
3.3.1. Preparo do meio de cultivo
Considerando que os melhores resultados da Fermentação no Estado Sólido foram
obtidos com meio a base de arroz, em comparação com os demais meios testados, o meio de
cultivo utilizado nesta etapa também empregou este material e foi denominado “caldo arroz”.
Este meio foi preparado adicionando-se 50g de arroz comercial (arroz polido tipo 1, adquirido
em mercado local) em 1L de água destilada com posterior cozimento durante 10 min em
forno de micro-ondas operando na potência máxima. O material cozido foi então
homogeneizado em homogeneizador tipo Turrax operando a aproximadamente 35.000 rpm
por 5 min.
Para os testes com variação no conteúdo de arroz na formulação do meio, o caldo
arroz foi centrifugado (10.000 rpm/10min) e o sobrenadante foi recomposto com 0, 25, 50, 75
ou 100% da “pasta de arroz” (material sólido obtido durante a centrifugação).
3.3.2. Quantificação dos pigmentos produzidos
O produto (pigmento de coloração avermelhada) foi quantificado
espectrofotometricamente (espectrofotômetro de varredura Biochrom Libra S60), em termos
da absorbância a 485 nm (pico de máxima absorbância) do sobrenadante da cultura, obtido
após centrifugação (10.000 rpm/10min). Foram considerados apenas valores de absorbância
entre 0,1 e 1,0, o que garantiu linearidade entre os valores de absorbância e a concentração de
pigmentos (lei de Beer-Lambert). Amostras mais concentradas foram diluídas até atingir a
faixa de leitura.
3.3.3. Quantificação do crescimento microbiano
O crescimento
ilustrado na Figura 8. Este método foi escolhido
apresentaria interferência do material insolúvel (amido) presente no “caldo arroz”. Dessa
forma, 100µL de diluições seriadas (razão 10) das amostras foram plaq
com posterior incubação a 28°C.
delimitados, originados a partir de um único esporo ou micélio fúngico após espalhamento de
100 µL da diluição seriada em placa de meio PDA.
48h), estas foram quantificadas, sendo consideradas apenas as placas contendo entre 30 e 300
UFC (Figura 8).
Figura 8 - Método de diluições seriadas
10-1 10
1mLL
1mLL
Quantificação do crescimento microbiano
O crescimento fúngico foi efetuado pelo método de diluição seriad
. Este método foi escolhido pois a determinação da massa seca (g/L)
apresentaria interferência do material insolúvel (amido) presente no “caldo arroz”. Dessa
ções seriadas (razão 10) das amostras foram plaq
com posterior incubação a 28°C. Foram consideradas colônias, contornos arredondados e bem
delimitados, originados a partir de um único esporo ou micélio fúngico após espalhamento de
ção seriada em placa de meio PDA. Após crescimento das colônias (cerca de
48h), estas foram quantificadas, sendo consideradas apenas as placas contendo entre 30 e 300
diluições seriadas para monitoramento do crescimento microbiano (número de viáveis)
10-2 10-3 10-4 10-5
1mLL
1mLL
1mLL
0,1mL
27
pelo método de diluição seriada, como
pois a determinação da massa seca (g/L)
apresentaria interferência do material insolúvel (amido) presente no “caldo arroz”. Dessa
ções seriadas (razão 10) das amostras foram plaqueados em meio PDA
Foram consideradas colônias, contornos arredondados e bem
delimitados, originados a partir de um único esporo ou micélio fúngico após espalhamento de
rescimento das colônias (cerca de
48h), estas foram quantificadas, sendo consideradas apenas as placas contendo entre 30 e 300
para monitoramento do crescimento microbiano (número de viáveis).
28
3.4. Cinética de produção dos pigmentos em Erlenmeyers
Mantendo-se a mistura de arroz moído em Turrax constantemente homogeneizada
com auxílio de agitador magnético, 30 mL de meio “caldo arroz” foi distribuído em 20
Erlenmeyers de 125mL, posteriormente os frascos foram esterilizados em autoclave (121°C
por 15 min). Os frascos foram inoculados em condições assépticas pela adição de 1 mL da
suspensão de esporos (vide item 3.2.1) e incubados em a 28°C e 150 rpm. Amostras foram
retiradas em 24, 48, 72, 96 e 120 h de fermentação para monitorar o crescimento microbiano
(vide item 3.3.3) e a formação do produto (item 3.3.2). Este procedimento encontra-se
resumido na Figura 9.
O caldo fermentado preparado conforme este procedimento (72h de processo) foi
utilizado nos ensaios para tingimento de tecidos e plásticos (item 3.6.1)
50g 1000mL H2O
Turrax e
Esterilização10mL H2O
30 ml
1ml
24h, 48h, 72h, 96h
150rpm, 28°C10.000rpm
5min
Absorbância 485 nm
UFC/ml
Figura 9 - Processo experimental para avaliar a cinética de crescimento e produção de pigmentos em
Erlenmeyers.
3.5. Cinética de produção dos pigmentos em biorreator air lift
3.5.1. Biorreator
Neste experimento foi utilizado o Biorreator Pneumático (agitação por bolhas) air
lift Tecnal TEC-BIO com 5L de volume operacional, com entrada para sensores de
temperatura, pH, O2 e entradas para dosagem, amostragem e condensador de refluxo;
29
termostatização através de jaqueta de água com auxílio de Banho Termostatizado Tecnal
TEC-BIO, bomba peristáltica Tecnal TEC-BIO para injeção de ácido, base, nutrientes.
3.5.2. Inóculo
A partir de uma cultura do fungo Fusarium oxysporum CCT7620 crescida durante
uma semana a 28°C em tubo com meio PDA inclinado, foi feita uma suspensão de esporos,
conforme mencionado acima (item 3.2.1). Em um Erlenmeyer de 125mL contendo 30mL de
“caldo arroz” foram inoculados 100µL da suspensão de esporos e subsequentemente este
frasco foi incubado a 28°C e 150 rpm por 48 horas. Este “caldo arroz” fermentado nas
condições descritas foi utilizado como inóculo nos ensaios em biorreator air lift.
Para efeito de padronização, este inóculo foi quantificado em triplicata por meio
do plaqueamento de 100µL de diluições seriadas (razão 10) do mesmo. Após crescimento em
estufa bacteriológica (48h/28°C) as culturas foram quantificadas, sendo consideradas apenas
as placas contendo entre 30 e 300 colônias.
3.5.3. Experimento sem controle de temperatura e pH
Neste primeiro ensaio a fermentação foi conduzida com monitoração constante do
pH, temperatura, oxigênio dissolvido, contagem de células (item 3.3.3) e quantidade de
pigmentos (item 3.5.5). Contudo a temperatura e o pH não foram controlados durante o
processo. Assim, o biorreator operou a temperatura ambiente, com aeração de 1 vvm (5
L/min) e um volume total de 5L, sendo 4,5L de “caldo arroz” (na concentração de 250g de
arroz em 4,5L, mantendo uma concentração final de 50g/L, preparado conforme descrito em
3.3.1) e 500mL de inóculo (vide item 3.5.2). Periodicamente foram retiradas amostras para
monitorar o crescimento microbiano e a formação do produto.
3.5.4. Experimento com controle de temperatura e pH
Foi realizado um segundo estudo cinético em air lift, porém em condições
modificadas para avaliar qual seria o comportamento do fungo quanto ao crescimento celular
e produção de pigmento. Neste caso, o meio de cultivo “caldo arroz” foi preparado conforme
mencionado no item 3.3.1, porém empregando-se uma concentração menor (20g de arroz para
1L de água). O inóculo foi preparado conforme mencionado anteriormente (3.5.2), mas com o
“caldo arroz” na concentração de 20g de arroz por L de água. O tamanho do inóculo também
sofreu redução: foram utilizados 60 mL.
30
Com relação às condições operacionais, empregou-se temperatura (mantida a
28°C) e pH (mantido a 6,5±0,5, controlado automaticamente com adição de NaOH 1M ou
H2SO4 1M) controlados e uma aeração inicial de 1,5 vvm (7,5L/min), que decaiu ao longo do
processo (aeração final de 0,5 vvm) devido ao aumento na perda de carga do sistema. Os
valores de pH, temperatura e oxigênio dissolvido foram monitorados e registrados a cada 10
minutos. Já o crescimento microbiano foi avaliado pela retirada periódica de amostras, que
foram utilizadas para a determinação da contagem microbiana (item 3.3.3).
3.5.5. Extração e quantificação dos pigmentos
A produção de pigmentos foi determinada pela quantificação em termos da
absorbância a 485 nm (pico de máxima absorbância) de um extrato orgânico. Tal extrato foi
preparado misturando-se, em um tubo de ensaio, 5 mL de caldo fermentado e 5 mL de
acetado de etila. Após agitação por 1min em vórtex, a mistura foi mantida em repouso para
separação das fases ou, alternativamente, efetuou-se a centrifugação (10.000rpm por 5 min)
da mesma. Observou-se que a última proposta resultava em dados mais padronizados. A
fração orgânica (superior) foi utilizada para as análises espectrofotométricas. Foram
considerados apenas valores de absorbância entre 0,1 e 1,0, o que garantiu linearidade entre os
valores de absorbância e a concentração de pigmentos (lei de Beer-Lambert). Amostras mais
concentradas foram diluídas até atingir a faixa de leitura.
3.6. Tingimento de materiais
3.6.1. Tingimento com o caldo fermentado (vermelho)
Foram realizados testes preliminares relacionados ao tingimento de materiais
plásticos e tecidos, sendo utilizados fragmentos de tecidos de algodão, poliéster, poliestireno e
plástico polipropileno. Pequenas frações dos materiais de aproximadamente 5 x 5 cm foram
aquecidos a cerca de 80°C por 5min no caldo fermentado. Para avaliar a estabilidade da cor, o
material tingido foi fervido em água durante 5 e 10 minutos e posteriormente lavados com
solução de detergente (lava-roupas comercial) durante 30 minutos com agitação constante em
shaker rotatório (100rpm). Os resultados foram avaliados de forma subjetiva com relação à
perda de cor. Metodologia semelhante foi empregada por NAGIA & MOHAMEDY (2007)
para o tingimento de lã.
31
3.6.2. Tingimento de tecidos in situ
Este trabalho também considerou o tingimento de tecidos pelo crescimento
fúngico e produção do pigmento in situ. Neste caso, o material a ser tingido (fragmento com
cerca de 5 x 5 cm de tecido de algodão ou poliéster) foi embebido em uma massa amilácea
(“pasta de arroz” descrita no item 3.3.1), que atuou como substrato para o desenvolvimento
microbiano. Após autoclavagem (121°C/15min), o tecido recebeu o inóculo por meio da
atomização de uma suspensão de esporos (vide item 3.2.1) do fungo F. oxysporum CCT 7620.
Este material foi levado à estufa bacteriológica a 28°C até crescimento fúngico. Após cerca de
72h de crescimento, o tecido tingido foi autoclavado (121°C/15min) e lavado para remoção da
biomassa e do amido aderidos à trama.
3.7. Análise estatística dos dados
Os dados apresentados neste estudo foram tratados no programa Excell, por meio
do qual se efetuou o cálculo das médias e do desvio padrão além de ter sido utilizado como
ferramenta para construção de todos os gráficos.
Para a cinética em Erlenmeyers, foram utilizados três cultivos independentes e,
em cada tempo de amostragem, foram retirados 1.000 µL de cada um dos frascos para a
contagem microbiana (item 3.3.3), que foi efetuada em duas replicatas independentes para
cada amostra. Dessa forma, os dados relativos à média e desvio padrão referem-se às
variações entre diferentes experimentos (em princípio idênticos) e os desvios ocorridos são
referentes aos erros analíticos e inerentes aos processos.
Já no experimento em airlift, apenas um cultivo foi efetuado em cada caso, mas
para cada um dos tempos de amostragem foi efetuada a coleta de três amostras, que seguiram
para as análises de absorbância (uma replicata por amostra) e contagem microbiana (duas
contagens independentes por diluição da amostra). Neste caso, os dados relativos à média e
desvio padrão referem-se às variações entre amostras de um mesmo processo e os desvios
ocorridos são referentes aos erros das análises.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Características do Fungo
Com base no isolamento dos micro-organismos, surgiram inúmeras colônias nas
placas de Petri, sendo que uma delas, isolada a partir de amostras de solo, chamou a atenção
devido a coloração vermelha intensa em meio PDA. O fungo utilizado neste estudo foi
32
depositada na na Coleção de Culturas Tropicais da Fundação André Tozello (Campinas – SP)
sob o número Fusarium oxysporum CCT7620. Conforme apresentado na Figura 10, colônias
deste fungo mostraram-se vermelhas com aspecto aveludado que em meio PDA.
Figura 10 - Fungo produtor de biopigmento isolado a partir do meio ambiente. A) fungo crescido em placa com ágar PDA; B) fungo em tubo inclinado contendo meio PDA.
As características morfológicas são típicas de fungos do gênero Fusarium, com
hifas septadas e esporos ovalados e falciformes quando observados em microscópio (Figura
11). Estas características levaram os especialistas do Departamento de Microbiologia da
Universidade Federal de Viçosa – UFV a concluir que este fungo é da espécie Fusarium
oxysporum.
Figura 11 - Estruturas do fungo F. oxysporum CCT7620 observadas em microscópio (aumento de 400 vezes)
após microcultivo.
POLETTO et al. (2006) relata que o gênero Fusarium é amplamente distribuído
nos mais variados ambientes, sendo classificado no reino Eumycota, divisão Ascomycota,
A B
33
classe Euascomycetes, ordem Hipocreales, família Hypocreaceae, inclui-se as espécies que
são capazes de formar macroconídios hialinos, septados, que se destacam pela presença de
células basais e apicais distintas, de considerável relevância na taxonomia das espécies. Os
mesmos autores observaram ainda que a formação de macroconídios e microconídios, além
de clamidósporos, é abundante em estirpe de Fusarium oxysporum crescido em meio ágar
dextrose de batata (PDA).
O fungo Fusarium oxysporum, como relata EDEL et al. (1997), trata-se de um
importante integrante da microflora que compõe o solo em todo o mundo. Algumas cepas são
descritas como fitopatogênicas, estando elas relacionadas com a murcha foliar nas mais
variadas espécies de plantas. Os solos também podem abrigar populações de Fusarium
oxysporum que não são patogênicos. Ambas as cepas, patogênicas e não patogênicas podem
coesistir em uma forma de crescimento saprofítica a base de matéria orgânica do solo (EDEL
et al., 1997).
EDEL et al. (1997), em experimentos incluindo sessenta isolados de Fusarium
oxysporum, três espécies de plantas foram inoculadas com o referido fungo, mas nenhum
sintoma de murcha foi observado em qualquer planta cultivada. Assim sendo, todos os
isolados incluídos no estudo foram considerados não fitopatogênicos.
Determinados fungos do gênero Fusarium são reconhecidamente produtores de
colônias com pigmentação avermelhada. Em alguns casos, coloração mais intensa, tendendo
ao violeta, também pode ser evidenciada. POLETTO et al. (2006), por exemplo, observaram
que colônias de Fusarium oxysporum apresentaram-se com coloração violeta no centro e
esbranquiçadas nas bordas em meio PDA. As moléculas responsáveis por tal coloração são
descritas como sendo da classe das antraquinonas (NAGIA & MOHAMEDY, 2007) ou mais
especificamente um composto chamado bicaverina (RETTORI & DURÁN, 1998). Já no caso
dos pigmentos vermelhos associados a culturas de Monascus, as moléculas
monascorubramina e monascopunctatina se destacam como principais responsáveis
(CARVALHO et al., 2005; DUFOSSÉ, 2006).
4.2. Produção dos pigmentos microbianos em Fermentação no Estado Sólido
Os meios a base de arroz mostraram-se efetivos tanto para o crescimento
microbiano quanto para a produção dos pigmentos, cuja coloração variou do vermelho ao
roxo. O meio de cultivo a base de arroz, também empregado por VIDYALAKSHMI et al.
34
(2009) para produção dos biopigmentos a partir de Monascus ruber, pode ser sintetizado a
partir de um arroz de refugo, denominado arroz quebrado, esse material, geralmente usado
como suplemento para ração animal, possui baixo valor comercial, o que evitaria a
competição com a indústria de alimentos.
Os meios ágar-amido e PDA também resultaram em crescimento e produção de
coloração avermelhada, o que também foi evidenciado por POLETTO et al., (2006) . O meio
o ágar Sabouraud resultou em crescimento satisfatório, mas não propiciou produção de
pigmentos. Algo semelhante ocorreu com o meio a base de mandioca, que possibilitou
crescimento sem produção do pigmento. Isso ocorreu possivelmente pela granulometria fina
da farinha de mandioca, causando uma consistência pastosa no meio e pouca aeração. Em
relação ao meio agar sabouraud, a falta de produção dos pigmentos pode estar associada a
ausência de algum nutriente específico presente tanto no meio a base de arroz quanto no meio
PDA, necessitando-se de estudos subseqüentes para elucidação. A tabela 3 trás a produção de
pigmentos e crescimento microbiano em meios de cultivo distintos.
Tabela 3. Crescimento microbiano e produção dos biopigmentos em meios de cultivo distintos, (+) indicando presença e (-) a ausência:
Meio de cultivo Crescimento Produção de pigmento
Ágar sabouraud + -
Mandioca + -
Ágar amido + +
Arroz + +
PDA + +
Tal observação levantou algumas dúvidas com relação à influência do tamanho
das partículas do meio no crescimento e produção dos pigmentos. Na verdade, sabe-se que a
granulometria é fator determinante em uma Fermentação no Estado Sólido, pois grãos muito
finos se compactam em demasia, evitando uma eficiente aeração do meio. Já grânulos muito
grandes apresentam baixa superfície de contado, minimizando a disponibilidade de nutrientes
para o crescimento microbiano. Portanto, realizou-se um experimento com substratos
apresentando diferentes tamanhos de partículas.
No meio a base de arroz, a influência da granulometria do arroz moído no
crescimento e produção do corante foi avaliada visualmente. De forma geral, notou-se uma
relação direta entre tamanho do grânulo de arroz e crescimento/pigmentação, sendo que as
35
granulometrias maiores mostraram visualmente uma maior produção e dispersão dos
pigmentos. Quando cultivados em arroz moído retido na peneira ABNT/ASTM 16 (1,18 mm),
o crescimento dos micélios mostrou-se mais difuso e homogêneo, bem como a pigmentação
avermelhada. Desempenhos semelhantes foram observados para cultivos com arroz retidos
nas peneiras ABNT/ASTM 30 (600 µm) e ABNT/ASTM 40 (425 µm), que mostraram tanto
crescimento como pigmentação equivalentes entre si, mas em menor grau quando comparados
ao resultado anterior (ASTM/ABNT 16) e em maior grau em comparação com o crescimento
em arroz retido na peneira ANBNT/ASTM 50 (300 µm). Tanto no último caso
(ABNT/ASTM 50) como no cultivo com arroz do fundo (<300 µm), o crescimento fúngico
ficou limitado à superfície e houve pouca dispersão dos pigmentos, que em relação aos
demais se manifestaram em quantidade inferior e em pontos isolados nas placas. Tais
resultados indicam que há uma relação direta entre a produção dos pigmentos e o contato das
culturas fúngicas com o ar, visto que cultivos em grânulos maiores, onde a superfície de
contato com ar é maior, mostraram-se mais eficientes para produção e tonalidade das cores
dos pigmentos.
Tabela 4 Percepção visual quanto a crescimento e dispersão dos pigmentos em meio a base de arroz quebrado e peneirado em diferentes tamanhos.
Peneira Poro Crescimento Pigmentação do arroz
ABNT/ASTM 16 1180 µm + + + + + + + + + +
ABNT/ASTM 30 600 µm + + + + + +
ABNT/ASTM 40 425 µm + + + + + +
ABNT/ASTM 50 300 µm + + +
Fundo - + + +
A figura 12 ilustra o crescimento fúngico e produção de pigmentos a partir do
meio a base de arroz moído e peneirado com granulometria ABNT/ASTM 16 (1180µm),
considerado o melhor tamanho de partícula tanto para o crescimento quanto produção de
pigmentos em meio sólido.
36
Figura 12. Crescimento e produção de pigmentos em meio arroz sólido granulometria ABNT/ASTM 16
(1180µm).
A produção de pigmentos vermelhos em Fermentação no Estado Sólido utilizando
arroz como substrato não é novidade. O processo de produção do Anka por fungos do gênero
Monascus tem sido tradicionalmente empregado em países orientais como o Japão, Índia e
China, sendo que a produção dos pigmentos e tonalidade da cor varia entre diferentes
linhagens de Monascus, e função das condições de cultivo e do meio empregado
(CARVALHO et al., 2005). Uso de arroz quebrado, por exemplo, foi utilizado em um
processo de produção de pigmentos vermelhos por Monascus ruber para aplicação em
produtos lácteos (VIDYALASKSHMI et al., 2009). CARVALHO et al. (2007) em seus
experimentos, utilizaram uma série de substratos ricos em amido, dentre eles o arroz quebrado
e o bagaço de mandioca para o cultivo de Monascus sp., com resultados satisfatórios quanto a
produção de pigmentos microbianos. Apesar de o arroz apresentar os melhores resultados,
estes autores concluíram que o bagaço de mandioca suplementado poderia ser uma opção
mais viável, por se tratar de um resíduo de baixo valor agregado.
4.2.1. Separação e recuperação dos pigmentos
Ao longo do processo experimental observou-se que o pigmento produzido não
era lançado no ambiente extracelular quando o cultivo se dava por Fermentação no Estado
37
Sólido. Assim sendo, foi possível deduzir que o pigmento produzido caracteriza-se por um
metabólito intracelular ou associado à parede celular. Tal característica impõe determinados
desafios à separação, pois torna necessária a adoção de técnicas de rompimento de células.
Porém, as técnicas testadas neste estudo (moinho de bolas, uso de surfactantes) não se
mostraram eficientes em liberar o pigmento da biomassa.
Com intuito de extrair os compostos responsáveis pela pigmentação microbiana,
diferentes solventes foram empregados. No entanto, algo curioso relacionado a alterações na
coloração dos pigmentos foi observado durante os ensaios de extração, como será descrito
adiante.
O material de partida foi o arroz fermentado, que originalmente apresentava
coloração vermelho-roxo, mas depois de autoclavado passava a azul. Quando a extração foi
testada com arroz fermentado autoclavado (azul), apenas o solvente acetato de etila extraiu
quantidades significativas de pigmento (Figura 13), mas o extrato apresentou coloração
vermelho intensa enquanto que o arroz manteve-se azul. O solvente etanol gerou resultados
qualitativos equivalentes, mas com eficiência de extração muito menor. No caso dos solventes
acetona e álcool isopropílico não foi evidenciada qualquer extração de coloração, seja de
coloração azul ou vermelha. Já quando a extração foi efetuada com arroz fermentado não
autoclavado (vermelho-roxo), o acetato de etila mais uma vez mostrou boa capacidade de
extração, gerando um extrato vermelho e uma biomassa também avermelhada. A água e o
clorofórmio acidificado (HCl) gerou resultados qualitativos semelhantes, mas com eficiência
de extração muito menor. Os solventes, álcool isopropílico e acetona não conferiram extração
de cor aparente nem alteração na cor da biomassa. O etanol, porém, extraiu corantes
vermelhos (extrato vermelho) e alterou a cor da biomassa para azul. A tabela 5 mostra a
eficiência dos solventes testados para o processo de extração e alteração na cor da biomassa.
Até onde se sabe este foi o primeiro relato de pigmentos azuis oriundos da fermentação
fúngica e, portanto, tal processo gerou um pedido de patente junto ao INPI (BR 10 2013
015305 2 – Processo de produção e aplicação de pigmento oriundo do fungo Fusarium
oxysporum).
38
Figura 13. Extração dos pigmentos fúngicos. (a) Etanol comercial 92% e (b) Acetato de etila e agitação por
vortex durante 1 min.
O baixo desempenho da água como solvente deve-se provavelmente a polaridade
da molécula de corante, dado que as prováveis moléculas (antraquinonas ou bicaverina)
apresentam caráter apolar. CARVALHO et al. (2007), em experimentos de extração
semelhantes, não conseguiram aplicação efetiva da água no processo de recuperação dos
pigmentos de Monascus ruber. O etanol, todavia, apresentou uma extração intermediária
(entre acetato de etila e clorofórmio acidificado) de cor vermelha, mas a biomassa resultante
da extração teve sua coloração modificada para azul. CARVALHO et al., (2007) também
empregou uma série de solventes orgânicos (metanol, etanol, DMSO, éter etílico e hexano)
com o intuído de extrair pigmentos vermelhos da biomassa do fungo Monascus, relatando
elevada eficiência no processo de extração com metanol, DMSO e etanol.
Tabela 5. Extração dos pigmentos da biomassa com variados solventes:
Solvente Extração de pigmentos vermelhos Alteração na cor da biomassa para azul
Etanol + +
Acetona - -
Álcool isopropílico - -
Água + -
Acetato de etíla + -
Clorofórmio+HCl + -
Diante do exposto, associadas às observações com a biomassa autoclavada
oriunda das fermentações submersas, formulou-se a hipótese de que a coloração vermelha e
azul são resultados da mesma molécula, a qual em estado livre ou ligada à proteína nativa
a b
39
apresenta-se com coloração avermelhada; já quando ligada a proteína desnaturada (calor,
solventes) apresenta-se com coloração azulada. Seria justamente esta ligação pigmento-
proteína que garantiria que a coloração permanecesse associada à célula. A hipótese de que há
dois corantes sendo produzidos (um vermelho e outro azul) foi descartada já que todos os
procedimentos de extração do pigmento azul geraram um extrato de cor vermelha, exceto com
o solvente DMSO. Além disso, análises químicas preliminares (HPLC-EM) indicaram que as
moléculas responsáveis pela manifestação da cor no extrato roxo (DMSO) e no extrato
vermelho (acetato de etila) apresentavam possivelmente a mesma estrutura química.
4.3. Produção dos pigmentos microbianos em Fermentação Submersa
A fermentação submersa foi utilizada para estudo cinético preliminar, tendo como
parâmetros o crescimento celular, avaliado por contagem de micro-organismos em placa
(UFC/mL), e a quantidade de pigmentos produzidos, determinada pela absorbância a 485nm
em função do tempo de crescimento das culturas. Este valor de absorbância foi definido após
a avaliação do perfil de absorbância do sobrenadante da cultura em diferentes comprimentos
de onda na região do visível, como é mostrado no gráfico a seguir (Figura 14). Em
experimentos semelhantes para a quantificação de pigmento vermelho, CARVALHO et al.
(2007) monitoraram a absorbância no intervalo entre 400 e 500 nm, faixa esta responsável
pela manifestação da coloração vermelha. VIDYALAKSHMI et al. (2009), por sua vez,
determinaram os pigmentos de Monascus por espectrofotometria de varredura no intervalo de
410 a 510 nm, após extração com etanol a 80% para análise dos pigmentos vermelhos e
amarelos; posteriormente separando-os e analisando por HPLC após extração com acetato de
etila.
40
Figura 14 - Varredura no visível do sobrenadante da cultura de F. oxysporum CCT7620 após extração com
etanol 92%.
O meio escolhido para este estudo foi uma mistura de arroz e água, dado que este
material propiciou os melhores resultados de crescimento e produção de pigmentos na
Fermentação no Estado Sólido. Como o meio em questão apresentava grande quantidade de
material em suspensão (amido), a quantificação de biomassa por massa seca (g/L) mostrou-se
uma técnica inapropriada, por isso optou-se pela determinação de micro-organismos viáveis
para determinar a curva de crescimento microbiano. Outra maneira de se quantificar o
crescimento celular seria a determinação do crescimento radial das colônias fúngicas, através
de medições diretas do diâmetro das colônias, como feito por CARVALHO et al. (2005).
Porém, a técnica escolhida neste estudo apresenta maior precisão e reprodutibilidade.
O meio a base de arroz usado no presente estudo foi capaz de gerar uma diferente
gama de cores ao caldo fermentado quando se alterava a proporção de arroz de sua
formulação (Figura 15). Tal fato comprova que a quantidade de arroz na formulação do meio
é fundamental não apenas para a coloração como para a intensidade da coloração da
biomassa.
0
0,5
1
1,5
2
380 440 500 560 620 680 740 800
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
41
Figura 15 - Resultados da alteração na cor do caldo arroz fermentado variando-se o percentual (0, 25, 50, 75 ou
100%) de recomposição de “pasta de arroz” após centrifugação do meio.
Variações na cor da biomassa também puderam ser evidenciadas após
autoclavagem (121°C/15min) do meio fermentado. O material que tinha originalmente a cor
vermelho-roxo passou para azul marinho quanto submetido ao tratamento térmico
mencionado. Conforme mencionado anteriormente, esta observação corrobora a hipótese de
que o pigmento em questão pode estar associado à célula via ligação com proteínas.
No ensaio de cinética de crescimento microbiano em Erlenmeyers de 250 mL
(Figura 16) foi possível observar que o crescimento microbiano atinge valor máximo após
48h de cultivo e depois deste período entra em fase estacionária. De forma geral, a produção
do pigmento (DO485) vermelho acompanha a curva de crescimento. Isso indica que a
produção do pigmento está associada ao crescimento celular. Há relatos que associam que a
quantidade de pigmento acumulado é diretamente dependente da concentração de biomassa,
mesmo que muitas vezes os pigmentos são metabólitos secundários produzidos após a fase
logarítmica de crescimento (CHAVEZ et al., 2005).
0% 25% 50% 75% 100%
42
Figura 16 -. Cinética de crescimento (■) e produção de pigmentos (absorbância do sobrenadante da cultura a
485nm) (▲) por F. oxysporum CCT7620 em Erlenmeyers de 250mL.
Em relação ao monitoramento da produção dos pigmentos, um dos pontos foi
retirado das análises por apresentar desvio muito elevado em relação aos demais. Optou-se
por repetir o ensaio de cinética em biorreator de bancada (air lift), onde as condições de
cultivo seriam mais homogêneas, principalmente quanto ao fornecimento de oxigênio, tendo
ainda como vantagens, maior facilidade no monitoramento do pH e temperatura durante o
processo fermentativo. Os resultados deste estudo serão apresentados na sequência.
A cinética em Erlenmeyers, mesmo se tratando de um estudo preliminar, forneceu
importantes informações e estimativas precisas que foram amplamente aplicadas nos
processos subseqüentes em air lift, principalmente com relação a estimativas do tamanho do
inóculo, o tempo de cultivo e as faixas de diluições que deveriam ser consideradas para a
quantificação de células.
4.4. Cinética de Produção do Pigmento em Biorreator de Bancada Air Lift
4.4.1. Cultivo sem controle do pH e Temperatura e meio a 50g/L
A condução do processo fermentativo em biorreator de bancada possibilitou a
produção de biopigmento em maior escala comparativamente ao processo realizado em
Erlenmeyers. A coloração do meio fermentado foi semelhante ao processo em Erlenmeyer,
um vermelho-roxo (Figura 17).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100 120
Con
tage
m (
UF
C/m
L),
DO
485
Tempo de fermentação (h)
43
Figura 17 - Fermentação do fungo Fusarium oxysporum CCT7620 em biorreator de bancada do tipo air lift após
cerca de 72h de processo.
Foi efetuada a adição de 300 mL de água nos tempos 44 e 78 horas, a fim de
completar o volume operacional do biorreator, sendo que nos tempos citados as amostras
foram coletadas antes da adição para que não ocorresse a diluição do material e conseqüente
alteração dos parâmetros cinéticos avaliados.
Os parâmetros operacionais pH, temperatura e oxigênio dissolvido foram
monitorados (Figura 18), enquanto que a retirada de amostras ao longo do tempo permitiu
determinar os parâmetros cinéticos de crescimento microbiano e produção de pigmentos
(Figura 19).
44
Figura 18 - Condições operacionais do biorreator air lift durante a o experimento de cinética de crescimento e
produção dos pigmentos por F. oxysporum CCT7620 (Figura 13).
Figura 19 - Cinética de crescimento microbiano (■) e de produção do pigmento (), em termos de absorbânica a
485nm. As barras de erro correspondem ao desvio padrão das medidas.
Pode-se observar um crescimento acentuado (fase log) nas primeiras 30 horas de
crescimento, com crescimento exponencial (de aproximadamente 1.107 UFC/mL para 5.107
UFC/mL) e paralela depleção no oxigênio dissolvido (cai de pouco mais de 80% para
praticamente zero), que permanece praticamente nulo entre 18 e 35h, e produção de ácidos
2
3
4
5
6
7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100
pH
Tem
pera
tura
(°C
), o
xigê
nio
diss
olvi
do
(%)
Tempo (h)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
6
7
8
0 20 40 60 80 100
Abs
orbâ
ncia
a 4
85nm
Con
tage
m (
Log
UF
C/m
L)
Tempo (h)
pH
Temperatura
Oxigênio dissolvido
45
(abaixamento do pH de cerca de 6 para cerca de 3,8) (Figuras 18 e 19). A partir de
aproximadamente 35h de cultivo o fungo entrou na fase estacionária, o que pode ser
observado pela estabilização na contagem microbiana, pelo aumento no oxigênio dissolvido
(menor taxa de crescimento equivale a menor demanda por O2) e pela estabilização do pH,
por volta de 3,5, pelo interrupção na produção de ácidos (Figuras 18 e 19). É possível concluir
que a produção do pigmento acompanha o crescimento celular, mas se estende até a fase
estacionária e, com aproximadamente 60 h de fermentação, a pigmentação permanece estável
até o fim do cultivo. É importante destacar que a absorbância inicial, apesar da ausência de
produção de pigmentos microbianos, pode ser explicada pela adição de 10% de inóculo já
pigmentado (equivalente ao cultivo de 48h que é mostrado no ensaio em Erlenmeyers na
Figura 16).
De forma geral, o comportamento do fungo em Erlenmeyers (Figura 16) e em air
lift (Figuras 18 e 19) foi equivalente. Apesar das evidentes diferenças entre os dois sistemas,
pode-se observar que nos dois casos o crescimento celular cessou entre 24 e 48h e que a
produção do pigmento cessou logo após a fase log. Tanto para os experimentos em air lift,
quanto para o experimento em Erlenmeyers, pode-se observar que o cultivo poderia ser
interrompido antes mesmo das 96 horas, sem comprometer as conclusões obtidas, visto que a
fase estacionária encontrava-se consolidada.
Em experimentos com biorreator de bancada air lift para estudo cinético da
produção de biopigmentos a partir de quatro linhagens de Monascus purpureus,
KONGRUANG (2011) obteve uma mistura de pigmentos amarelo, laranja e vermelho, cujo
monitoramento, determinado por leituras de absorbância a 400, 460 e 500nm,
respectivamente, indicou um máximo de produção após cerca de 4 dias de cultivo. No
presente experimento por outro lado, em cerca de dois dias e meio de cultivo, o fungo
Fusarium oxysporum foi capaz de atingir seu pico máximo de produção de pigmentos
microbianos vermelhos. Outro experimento em air lift foi efetuado para produção de
bicaverina e ácido giberélico por culturas de Fusarium fujikuroi. Operando em volume de
trabalho de 3,5 litros com aeração de 1,6 vvm, pH 3, temperatura de 29ºC e 0,3 litros de
inóculo, a produção máxima de biomassa e de pigmento bicaverina foi obtida por volta de 60
horas de fermentação. Logo após este tempo o fungo alcançou a fase estacionária e a
produção de bicaverina também foi interrompida (CHAVEZ et al., 2008). Estes autores,
trabalhando em condições semelhantes às utilizadas no presente experimento, obtiveram
resultados equivalentes na cinética de produção do pigmento vermelho bicaverina.
46
Em síntese, o processo em air lift, mostra-se mais versátil para o controle dos
parâmetros durante o processo, visto que permite a incorporação de agentes controladores do
pH (ácidos e bases), permite a manutenção constante do oxigênio dissolvido no sistema com
distribuição homogênea em todo o meio de cultivo, possibilita o monitoramento constante em
curtos intervalos de tempo, além da facilidade para coletas periódicas de amostras que pode
ser feita com o auxílio de uma seringa comum. Por outro lado, o processo realizado com altas
concentrações de material particulado, gera grumos que não podem ser metabolizados pelo
fungo, o que não é observado no processo em Erlenmeyers. Este, por sua vez, também
mostrou-se eficiente para o cultivo do Fusarium oxysporum e produção dos seus
biopigmentos, apesar da limitação quanto a possibilidade de controle dos parâmetros de
processo.
4.4.2. Cultivo em air lif controlando pH e temperatura
Como relatado na Metodologia, pH e temperatura não foram controlados durante
os cultivos em Erlenmeyers e no ensaio em air lift anterior. Buscando conhecer como o
controle desses parâmetros poderia interferir no processo, um segundo experimento em
biorreator air lift foi realizado, agora diminuindo a concentração de substrato de 50 g/L para
20 g/L, uma vez que no cultivo anterior, boa parte do material sólido encontrou-se aderido ao
aspersor do air lift, tornando parte do meio de cultivo indisponível ao fungo. O inóculo
também foi diminuído (de 10% para 1% do volume), pois a contagem inicial havia se
mostrado muito elevada, com pouco crescimento microbiano durante a fase exponencial. O
pH foi controlado automaticamente pelo sistema, exceto no intervalo entre 12 e 24 horas de
cultivo, em que o estoque de NaOH se esgotou, sendo completado subsequentemente. A
temperatura foi mantida aproximadamente a 28ºC durante todo o cultivo com auxílio de
banho ultratermoestatizado sem variação alguma durante o processo. A aeração, inicialmente
em 1,5 vvm, diminuiu até cerca de 0,5 vvm devido ao aumento na perda de carga do sistema.
Infelizmente, como será discutido adiante, houve uma significativa alteração no processo e
nas características do fungo. A Figura 20 apresenta como variaram os parâmetros crescimento
celular, oxigênio dissolvido, pH e temperatura ao longo do processo.
47
Figura 20 - Cinética de crescimento do fungo F. oxysporum CCT7620 em air lift com controle de pH, e
temperatura. A figura apresenta como variaram o oxigênio dissolvido (linha contínua negra), a temperatura (linha contínua cinza), o pH (linha tracejada cinza) e a contagem microbiana (■) ao longo do processo.
É possível notar que o controle do pH e temperatura, estenderam a fase log até
cerca de 40 horas de fermentação. Algo curioso pôde ser observado no ponto de 24h, que
apresentou contagem microbiana pouco acima da tendência até então observada. Tal fato
ocorreu pois, conforme citado anteriormente, a solução de NaOH 1M foi completamente
consumida, causando queda acentuada do pH (de 6,0 para menos de 4,5) em cerca de 18h de
cultivo. Neste momento, foi identificada a geração de espuma vermelha no vidro do reator
(vide Figura 21) e aumento da taxa específica de crescimento, dado que bolores tendem a
preferir valores de pH mais baixos, o que também gerou um maior consumo de O2 (queda no
oxigênio dissolvido, Figura 20). A partir das 40h de cultivo, concentração de biomassa
permaneceu estável até o fim do processo, mantendo-se aproximadamente constante em 8.107
UFC/mL. O oxigênio dissolvido foi gradualmente sendo diminuído, apesar do crescimento ter
sido interrompido, devido a já mencionada queda na aeração ao longo do processo.
Conforme pode ser observado (Figura 21), os pigmentos produzidos neste
segundo cultivo em biorreator air lift manifestaram coloração roxa intensa, principalmente
após 48 horas de cultivo, de forma diferente ao cultivo anterior, que produziu apenas
pigmentos vermelhos (Figura 17). Esta observação de que a composição do meio de cultivo
foi capaz de alterar a coloração do meio fermentado não foi surpreendente, pois algo
semelhante já havia sido relatado para os experimentos em Erlenmeyer (Figura 15). Porém, os
pigmentos roxos, contrariamente ao observado no cultivo anterior, não puderam ser extraídos
4
5
6
7
8
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
Con
tage
m (
Log
UF
C/m
L),
pH
Tem
pera
tura
(°C
), o
xigê
nio
diss
olvi
do (%
)
Tempo (h)
48
com o solvente acetato de etila, e nenhum outro testado até o momento, por tal motivo, a
quantificação dos pigmentos ficou seriamente comprometida. Uma hipótese para o insucesso
na extração seria a associação dos pigmentos roxos e azuis a parede celular do fungo, fazendo
com que a recuperação dessas moléculas seja mais problemática. Apesar deste fato, este
ensaio foi bastante útil por mostrar a relação entre condições de cultivo e
crescimento/produção de metabólitos.
Figura 21 - Produção de pigmento roxo por fungo Fusarium oxysporum CCT7620 em biorreator de bancada do
tipo air lift.
4.5. Tingimento de materiais
Pedaços (5 x 5 cm) de tecidos de algodão, poliéster, poliestireno e de plástico
polipropileno foram testados como material de partida no processo de tingimento com o
pigmento do F. oxysporum 7620 presente no sobrenadante da cultura. Os resultados indicaram
que não houve fixação do pigmento sobre a fibra de poliestireno (Figura 22c), provavelmente
devido à ausência de grupos funcionais específicos tanto no corante quanto na fibra têxtil,
necessitando estudo específico para elucidação dos mecanismos de ligação do biopigmento
produzido à fibra. Já o algodão (Figura 22a) e o poliéster (Figura 22b) foram tingidos em
vermelho, sendo o último com uma coloração mais intensa. Estes tecidos tingidos mantiveram
a cor mesmo após fervura em água por 10 min ou após lavagem com detergente e sabão em
49
pó. Quanto ao material plástico polipropileno, este também passou por tingimento efetivo
assumindo uma coloração rósea (Figura 22d).
Figura 22 - Tecidos corados em meio líquido. A) Tecidos de poliéster; B) algodão; C) poliestireno; D) plástico
polipropileno.
Estudos semelhantes foram efetuados por NAGIA & MOHAMEDY (2007), que
eficazmente tingiram tecidos de lã a partir de pigmentos da classe das antraquinonas
produzidas por Fusarium oxysporum. Em seu experimento, estes pesquisadores monitoraram
a influência do pH, temperatura, concentração de sais, tempo de tingimento nas propriedades
de solidez da cor. No presente trabalho, até o momento não foram realizados estudos
considerando tais parâmetros como a influência da concentração de sais no banho de
tingimento ou pH. Todavia, os testes preliminares apontam resultados convergentes com os
encontrados por NAGIA & MOHAMEDY (2007), como a influência positiva da temperatura
(por volta de 100°C) e o tempo de tingimento.
DE SANTIS et al. (2005), trabalhando com Monascus pupureus, obteve sucesso
no tingimento de lã com cores vermelho e laranja, e de forma análoga, o tingimento de
vermelho apresentou coloração rósea pálida na fibra. A aplicação de pigmento prodigiosina,
produzido por culturas de Vibrio sp., no tingimento de lã, nylon, acrílico e seda mostrou ainda
ação antimicrobiana, além de boas propriedades no processo de tingimento em vermelho dos
materiais (ALIHOSSEINI et al., 2008). Propriedades antimicrobianas (antifúnbgica) também
foram evidenciadas para tecidos (lã e seda) tingidos com pigmentos de Trichoderma virens
(SHARMA et al., 2012). Tais propriedades antimicrobianas também podem ocorrer para os
pigmentos do F. oxysporum CCT7620, visto que a bicaverina, pigmento vermelho produzida
por algumas espécies de Fusarium, apresenta atividade antibiótica contra protozoários e
fungos como verificado por LIMÓN et al. (2010).
A B
C D
50
O uso de mordentes, quando necessário, para fixação dos corantes a fibra têxtil é
muito comum, DE SANTIS et al. (2005) verificou o desempenho de diversos mordentes
como por exemplo o sulfato de ferro, sulfato de cobre e o ácido tânico nos banhos de
tingimento com pigmentos oriundos de Monascus purpureus, entretanto, no presente trabalho
não foi aplicado nenhum mordente até o momento.
Neste trabalho também descrevemos um procedimento original de tingimento, que
foi proposto baseando-se na observação de que fungos filamentosos crescem em tecidos
úmidos, provocando manchas muito persistentes e difíceis de serem removidas. Portanto,
idealizou-se o crescimento fúngico e produção do pigmento diretamente no tecido. Assim, o
tecido (algodão ou poliéster) foi enriquecido com substrato para o crescimento fúngico e
inoculado de forma mais homogênea possível com uma suspensão de esporos. Após
crescimento microbiano, o tecido apresentou uma coloração vermelho-roxo. Da mesma forma
como a fermentação no estado sólido e na fermentação submersa, a biomassa entremeada no
tecido, e consequentemente o tecido, tornou-se azul marinho após tratamento térmico
(autoclavagem) (Figura 23). Esta cor se manteve mesmo após a remoção da biomassa e do
tecido. A heterogeneidade do tingimento ainda permanece um desafio a ser vencido em
futuros estudos. Uma alternativa pode ser o tingimento do fio antes da tecelagem, conforme
efetuado por VELMURUGAN et al., (2010).
Figura 23 - Tecidos corados com o fungo crescendo sobre a fibra. A) Poliéster suspenso; B) algodão suspenso;
C) algodão em contato com meio de cultivo.
É importante ressaltar, que não foram encontrados até o momento, trabalhos
relacionados ao tingimento de tecidos com o fungo crescendo sobre a fibra, sendo também
inédita a pigmentação em azul de tecidos com os biopigmentos. Por este motivo, um pedido
de patente para este processo já está em fase final de redação.
A B C
51
5. CONCLUSÃO
5.1. Conclusões
O presente trabalho demonstrou a capacidade do fungo Fusarium oxysporum para
a produção de pigmentos vermelhos e roxos aplicando-se dois métodos distintos de cultivo,
em meio sólido e em meio líquido, tendo ambos, o arroz cozido como substrato. O processo
pode ser conduzido em shaker rotatório e em maior escala no Biorreator Airlift, que oferece a
possibilidade de controle de diversos parâmetros como o pH, temperatura e oxigênio
dissolvido. A matéria prima pode ser um arroz de refugo denominado arroz quebrado, com
baixo valor de mercado. De forma original, foi demonstrada a possibilidade de se produzir
pigmentos azuis a partir da biomassa fúngica após processo de extração com etanol.
Adicionalmente, um processo inovador para o tingimento de tecidos foi proposto. Apesar das
importantes conquistas até o momento, ainda resta avaliar a biodegradabilidade e a toxicidade
dos pigmentos obtidos, procedimentos estes que estão sendo avaliados.
5.2. Sugestões Para Trabalhos Futuros
No futuro, espera-se desenvolver protocolos eficazes para produzir pigmentos e
tecidos tingidos de forma viável em escala comercial. É fundamental conhecer a molécula
responsável pela manifestação das cores e sua estrutura química, bem como o mecanismo de
associação dos pigmentos e azuis a biomassa fúngica. Da mesma forma, torna-se
imprescindível conhecer a toxicologia, verificar a possibilidade de ocorrência de reações
alérgicas e a biodegradabilidade destes corantes, pois sugere-se avaliar seu uso como
potencial ingrediente para a indústria de alimentos. Por fim, sabe-se que os fungos da espécie
F. oxysporum são extremamente versáteis, com potencial produção de enzimas (ex.: lípases) e
bioaromas por biotransformação de terpenos. Portanto, seria apropriado explorar mais a fundo
o arsenal metabólico do F. oxyposrum CCT7620, monitorando seu metabolismo e como ele se
relaciona com a produção dos corantes, para possivelmente ser considerada sua utilização em
bioprocessos integrados para a produção de diferentes produtos de interesse comercial.
52
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABEROUMAND, Ali. A review article on edible pigments properties and sources
as natural biocolorants in foodstuff and food industry. World Journal of Dairy Food
Science, v. 6, n. 1, p. 71-78, 2011.
ALCÂNTARA, M. R.; DALTIN, D. A química do processamento têxtil. Química
Nova, v. 19, n. 3, p. 320-330, 1996.
ALIHOSSEINI, F., Ju, K. S., LANGO, J., HAMMOCK, B. D., & SUN, G.
Antibacterial colorants: characterization of prodiginines and their applications on textile
materials. Biotechnology progress, v. 24, n. 3, p. 742-747, 2008.
BERTAZZOLI, Rodnei; PELEGRINI, Ronaldo. Descoloração e degradação de
poluentes orgânicos em soluções aquosas através do processo fotoeletroquímico. Química
Nova, v. 25, n. 3, p. 477-482, 2002.
BICAS, J.L.; MARÓRSTICA JR, M.R.; BARROS, F.F.C.; MOLINA, G.;
PASTORE, G.M. Bioadditives Produced by Fermentation. In: SOCCOL, C.R.; PANDEY,
A.; LARROCHE, C. (Eds.) Fermentation Processes Engineering in the Food Industry. CRC
Press. 2013. 510 pp).
BORÉM, A. A história da biotecnologia. Biotecnologia Ciência &
Desenvolvimento, v. 34, p. 347, 2005.
BYSTRYKH, L.V., FERNÁNDEZ-MORENO, M.A., HERREMA, J.K.,
MALPARTIDA, F., HOPWOOD, D.A. and DIJKHUIZEN, L. Production of actinorhodin-
related ‘‘blue pigments’’ by Streptomyces coelicolor A3(2). Journal of Bacteriology,
178:2238-2244, (1996).
CARVALHO, J.C., OISHI, B.O., PANDEY, A. and SOCCOL, C.R. Biopigments
from Monascus: strains selection, citrinin production and color stability. Brazilian Archives
of Biology and Technology, 48:885-894, 2005.
53
CHAVEZ-PARGA, M. D. C., GONZALEZ-ORTEGA, O., NEGRETE-
RODRÍGUEZ, M. D. L. L. X., VALLARINO, I. G., ALATORRE, G. G., & ESCAMILLA-
SILVA, E. M. Kinetic of the gibberellic acid and bikaverin production in an air lift bioreactor.
Process Biochemistry, v. 43, n. 8, p. 855-860, 2008.
CHATTOPADHYAY, Pritam; CHATTERJEE, Sandipan; SEN, Sukanta K.
Biotechnological potential of natural food grade biocolorants. African Journal of
Biotechnology, v. 7, n. 17, 2008.
CHOUDHARI, Sheetal M.; ANANTHANARAYAN, Laxmi; SINGHAL, Rekha
S. Use of metabolic stimulators and inhibitors for enhanced production of β-carotene and
lycopene by Blakeslea trispora NRRL 2895 and 2896. Bioresource technology, v. 99, n. 8,
p. 3166-3173, 2008.
DE MORAES, C. M. Estudo da difusão de corantes reativos em tecido de
algodão. 87 f. (Mestrado em Engenharia Química) – Faculdade de Engenharia Química,
Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2010.
DE SANTIS, D., MORESI, M., GALLO, A. M., & PETRUCCIOLI, M.
Assessment of the dyeing properties of pigments from Monascus purpureus. Journal of
Chemical Technology and Biotechnology, v. 80, n. 9, p. 1072-1079, 2005.
DUFOSSÉ, L. Microbial production of food grade pigments. Food Technology
and Biotechnology, v. 44, n. 3, p. 313-323, 2006.
DUFOSSÉ, L., GALAUP, P., YARON, A., ARAD, S. M., BLANC, P.,
CHIDAMBARA MURTHY, K. N., & RAVISHANKAR, G. A. Microorganisms and
microalgae as sources of pigments for food use: a scientific oddity or an industrial reality?
Trends in Food Science & Technology, v. 16, n. 9, p. 389-406, 2005.
EDEL, V., STEINBERG, C., GAUTHERON, N., & ALABOUVETTE, C.
Populations of nonpathogenic Fusarium oxysporum associated with roots of four plant species
compared to soilborne populations. Phytopathology, v. 87, n. 7, p. 693-697, 1997.
54
ERIKSEN, Niels T. Production of phycocyanin a pigment with applications in
biology, biotechnology, foods and medicine. Applied microbiology and biotechnology, v.
80, n. 1, p. 1-14, 2008.
GARCIA, José Luís, “Biotecnologia e biocapitalismo global”, Análise Social,vol.
XLI, 181: 981-1009, 2006.
GUARATINI, Cláudia CI; ZANONI, Maria Valnice B. Corantes têxteis. Química
Nova, v. 23, n. 1, p. 71-78, 2000.
JUDICE, Valéria Maria Martins; BAÊTA, Adelaide Maria Coelho. Modelo
empresarial, gestão de inovação e investimentos de venture capital em empresas de
biotecnologia no Brasil. Revista de Administração Contemporânea, v. 9, n. 1, p. 171-191,
2005.
KUNZ, A., Peralta-Zamora, P., DE MORAES, S. G., & DURÁN, N. Novas
tendências no tratamento de efluentes têxteis. Química Nova, v. 25, n. 1, p. 78-82, 2002.
LIMÓN, M. Carmen; RODRÍGUEZ-ORTIZ, Roberto; AVALOS, Javier.
Bikaverin production and applications. Applied microbiology and biotechnology, v. 87, n.
1, p. 21-29, 2010.
LIU, George Y.; NIZET, Victor. Color me bad: microbial pigments as virulence
factors. Trends in microbiology, v. 17, n. 9, p. 406-413, 2009.
MELCHIADES, Fabio G.; BOSCHI, Anselmo O. Cores e tonalidades em
revestimentos cerâmicos. Cerâmica Industrial, v. 4, n. 1-6, p. 1-6, 1999.
MENDA, M. Corantes e pigmentos. Disponível em:
<http://www.crq4.org.br/quimicaviva_corantespigmentos>. Acesso em: 15 junho de 2013.
55
NAGIA, F. A.; EL-MOHAMEDY, R. S. R. Dyeing of wool with natural
anthraquinone dyes from Fusarium oxysporum. Dyes and pigments, v. 75, n. 3, p. 550-555,
2007.
NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger princípios de bioquímica.
Omega, 2001.
PEDROSA, I.; Da cor à cor inexistente, 3a. ed., Ed. Léo Christiano, Co-editora
Univ. Brasília: Rio de Janeiro, 1982.
PINTEA, A.M. (2008) Food colorants derived from natural sources by
processing. In: C. Socaciu (ed.) Food colorants: chemical and functional properties, Boca
Raton: CRC Press, pp. 101-124.
POLETTO, I., MUNIZ, M. F. B., CECONI, D. E., SANTIN, D., WEBER, M. N.
D., & BLUME, E. Zoneamento e identificação de Fusarium spp. causadores de podridão de
raízes em plantios de erva-mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) na região do vale do Taquarí,
RS. Ciência Florestal, 16(1), 2006.
RÄISÄNEN, R. Anthraquinones from the Fungus Dermocybe sanguine as
Textile Dyes. 2002. 113 f. (Ph.D. Thesis, University of Helsinki) - Department of Home
Economics and Craft Science Research Report 10. Vantaa: Dark. 2002.
RETTORI, D.; DURÁN, N. Production, extraction and purificationof violacein:
an antibiotic pigment producedby Chromobacterium violaceum. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, v. 14, n. 5, p. 685-688, 1998.
ROSOLEN, L. A., MONTEIRO, R. T., DELLAMATRICE, P. M., & KAMIDA,
H. M. Biodegradação de efluente têxtil e nove corantes técnicos utilizando fungos
basidiomicetos. Química Têxtil, n. 76, p. 44-52, 2004.
SARADA, R.; PILLAI, Manoj G.; RAVISHANKAR, G. A. Phycocyanin from
Spirulina sp: influence of processing of biomass on phycocyanin yield, analysis of efficacy of
56
extraction methods and stability studies on phycocyanin. Process Biochemistry, v. 34, n. 8,
p. 795-801, 1999.
SARON, Clodoaldo; FELISBERTI, Maria Isabel. Ação de colorantes na
degradação e estabilização de polímeros. Química Nova, v. 29, n. 1, p. 124, 2006.
SHARMA1A, D., GUPTA, C., AGGARWAL, S., & NAGPAL, N. Pigment
extraction from fungus for textile dyeing. Indian Journal of Fibre & Textile Research, v.
37, p. 68-73, 2012.
SILVEIRA, J. M. F. J. D., BORGES, I. D. C., & BUAINAIN, A. M.
Biotecnologia e agricultura: da ciência e tecnologia aos impactos da inovação. São Paulo em
Perspectiva, 19(2), 101-114, 2005.
SINHA, S., & MUKHERJEE, S. K. Pseudomonas aeruginosa KUCd1, a possible
candidate for cadmium bioremediation. Brazilian Journal of Microbiology, v. 40, n. 3, p.
655-662, 2009.
SOARES, José Luciano. Remoção de corantes têxteis por adsorção em carvão
mineral ativado com alto teor de cinzas. Diss. Dissertação de Mestrado-Universidade
Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 1998.
VELMURUGAN, P., KIM, M. J., PARK, J. S., KARTHIKEYAN, K.,
LAKSHMANAPERUMALSAMY, P., LEE, K. J., ... & OH, B. T.. Dyeing of cotton yarn
with five water soluble fungal pigments obtained from five fungi. Fibers and Polymers, v.
11, n. 4, p. 598-605, 2010.
VIDYALAKSHMI, R., PARANTHAMAN, R., MURUGESH, S., &
SINGARAVADIVEL, K. Microbial bioconversion of rice broken to food grade pigments.
Global Journal of Biotechnology and Biochemistry, v. 4, p. 84-87, 2009.
57
ZHANG, H., ZHAN, J., SU, K., & ZHANG, Y. A kind of potential food additive
produced by Streptomyces coelicolor: Characteristics of blue pigment and identification of a
novel compound, λ-actinorhodin. Food Chemistry, v. 95, n. 2, p. 186-192, 2006.
VOLP, Ana Carolina Pinheiro; RENHE, Isis Rodrigues Toledo; STRINGUETA,
Paulo César. Pigmentos naturais bioativos. Alimentos e Nutrição Araraquara, v. 20, n. 1, p.
157-166, 2009.