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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS

RENATA SANTOS DE SOUZA MASSONI

Cuiabá 2018

AVALIAÇÃO PERIODONTAL E MICROBIOLÓGICA, EM DIFERENTES TRIMESTRES DA GESTAÇÃO, CORRELACIONADA COM OS NÍVEIS

SÉRICOS DE ESTRADIOL E PROGESTERONA


AVALIAÇÃO PERIODONTAL E MICROBIOLÓGICA, EM DIFERENTES TRIMESTRES DA GESTAÇÃO, CORRELACIONADA COM OS NÍVEIS SÉRICOS DE ESTRADIOL E PROGESTERONA

Dissertação apresentada à UNIC, como requisito parcial

para a obtenção do título de Mestre em Ciências

Odontológicas Integradas.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Alessandra Nogueira Porto.

Cuiabá

2018

FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP)

Bibliotecária Elizabete Luciano /CRB1-2103

M419a Massoni, Renata Santos de Souza.

Avaliação Periodontal e Microbiológica, em Diferentes Trimestres da Gestação,

correlacionada com os Níveis Séricos de Estradiol e Progesterona./ Renata Santos de Souza Massoni.

73p. Inclui Lista de Figuras e Tabelas

Dissertação de Mestrado apresentada à UNIC – Universidade de Cuiabá, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Área de concentração: Biociências.

Orientador: Profª. Drª.Alessandra Nogueira Porto

1.Doenças Periodontais. 2.Gravidez. 3.Estradiol. 4.Progesterona. CDU 616.314




















AVALIAÇÃO PERIODONTAL E MICROBIOLÓGICA, EM DIFERENTES

TRIMESTRES DA GESTAÇÃO, CORRELACIONADA COM OS NÍVEIS

SÉRICOS DE ESTRADIOL E PROGESTERONA

Dissertação apresentada à UNIC, no Mestrado em Ciências Odontológicas

Integradas, área de concentração em Biociências, como requisito parcial para a

obtenção do Título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos

professores:

_________________________________________

Profa. Dra. Alessandra Nogueira Porto

(Orientadora)

UNIC

_________________________________________

Profa. Dra. Andreza Maria Fábio Aranha

UNIC

_________________________________________

Prof. Dr. José Meirelles Filho

UNIC

Cuiabá, 08 de março de 2018

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus filhos João Lucca e Pedro, frutos do mais sincero

amor; ao meu esposo Adilson, perfeita resposta de Deus às minhas preces; aos

meus pais, perenes apoiadores e fonte de inspiração para os estudos e à tia Celuta,

com eterna gratidão por seu amor.

AGRADECIMENTOS

A Deus que em seu infinito amor me concedeu força de vontade para encarar os desafios e humildade para aprender com eles.

Ao meu esposo por sua (quase) infindável paciência ao longo deste percurso, pela compreensão e apoio durante as dificuldades, mas principalmente por me mostrar todos os dias o que realmente importa em nossas vidas.

Aos meus filhos por terem tolerado os momentos de ausência e a falta de férias, ao João Lucca agradeço a torcida e acompanhamento constante de cada etapa, ao Pedroca agradeço por cada abraço apertado que recebi quando retornava para casa.

Aos meus pais, Renato e Maria Celeste, por terem se tornado pai e mãe dos meus pequenos, por terem cultivado meu o amor pela ciência desde pequena e por nunca medirem esforços para que eu vá mais além.

Aos meus sogros, Ruy e Edy que, enquanto eu estudo, edificam com as próprias mãos nossa casa no Rancho, onde em breve iremos todos gozar do tesouro da convivência familiar e do ar puro da Chapada.

Aos amigos Alice Ludke, Ana Amélia Rosa, Candice Taques, Darlan Nascimento, Gisele Leite, Guilherme Bessa, Paulo Leite, Regina Von Kirchenheim e Renata Teixeira; pela certeza de poder contar com vocês não importa para que, nem o dia, nem a hora.

Aos amigos do Rancho da Chapada que acolheram nossa família e fizeram parte dos raros, mas valiosos momentos de lazer.

Às queridas Locinar Domingas e Josefina Gavazzoni, anjos que cuidam da minha casa, sempre atenciosas aos meus pedidos.

Aos colegas de trabalho, Profa. Denise Abech, Prof. José Meireles Filho, Prof. Arestides Nachi, Prof.a Cristina Pizarro, Prof. Pedro Crotti, Prof.a Gisley, Prof.a Rosa e a querida Beth, pelo imensurável apoio durante o curso, sem o qual este período dedicado aos estudos não seria viável.

Aos colegas de curso: Ana Carolina, Andrei, Cláudio, Deise, Keylla, Layssa, Lauro, Lya Carla, Simony e Rodrigo; por teremos embarcado juntos nesta jornada, partilhando bons e maus momentos, mas principalmente ensinando uns aos outros.

À minha Orientadora Prof.a Dr.a Alessandra Nogueira Porto, pelas inúmeras palavras tranquilizadoras e pelo empenho em tornar viável este projeto. Agradeço por ter encarado o desafio de orientar uma “não dentista” ampliando meus horizontes.

À Prof.a Ms.a Fernanda Zanol por sua contribuição fundamental, mas principalmente por termos construído laços de amizade que transcendem o ambiente acadêmico.

À Prof.a Dr.a Evanice pelo convite e incentivo inicial para a realização do curso de mestrado, resgatando meu amor e interesse pela odontologia.

À Andressa Ricci pela compreensão e dedicação ao projeto durante o momento mais difícil e ao Heitor pela prestação de auxílio mesmo abrindo mão de seus dias de folga.

Às pacientes que aceitaram participar desta empreitada, doando seu tempo e seu próprio “EU” em benefício da ciência, a elas os meus mais sinceros agradecimentos.

Aos Professores Doutores do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Alex Semenoff Segundo, Alexandre Meireles Borba, Álvaro Henrique Borges, Andreza Maria Fábio Aranha, Cynthia Rodrigues de Araújo Estrela, Fábio Luís Miranda Pedro, Luiz Evaristo Ricci Volpato, Mateus Rodrigues Tonetto, Matheus Coelho Bandéca, Orlando Aguirre Guedes e Tereza A. Delle Vedove Semenoff.

Ao Coordenador do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges.

Ao Diretor da Faculdade de Odontologia da Universidade de Cuiabá – UNIC, Fábio Luís Miranda Pedro.

Ao Reitor da Universidade de Cuiabá – UNIC, Fernando Ciríaco Dias Neto.

Ao Pró Reitor Acadêmico da Universidade de Cuiabá – UNIC, José Cláudio Perecin.

Ao Diretor de Pós-Graduação Stricto Sensu da Kroton, Prof. Dr. Helio Suguimoto.

À Coordenadora de Pesquisa e Pós-Graduação - Stricto Sensu da Universidade de Cuiabá – UNIC, Lucélia de Oliveira Santos.

À secretaria do Programa de Mestrado/Doutorado da Universidade de Cuiabá nas pessoas de Jonielson Souza Dias e Ana Rita Borssari.

“Ainda que eu falasse as línguas dos

homens e dos anjos, e não tivesse amor, seria como o metal que soa ou como o

címbalo que retine. E ainda que tivesse o dom de profecia e conhecesse todos os

mistérios e toda a ciência, ainda que tivesse toda fé, de maneira tal que

transportasse os montes, e não tivesse amor, eu nada seria”

1 Coríntios 13:1-2

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Níveis de estradiol e progesterona nas diferentes fases do ciclo menstrual, durante a gestação e menopausa, adaptada a partir de Speroff, Glass e Kase, 1995.

31

Tabela 2 – Sequência de primers e sondas de DNA para cada um dos microrganismos estudados.

38

Tabela 3 – Descrição de dados epidemiológicos - frequência absoluta e relativa, média e desvio padrão (teste Qui-quadrado; p<0,05).

41

Tabela 4– Comparação do diagnóstico clínico periodontal nos grupos (teste Qui-quadrado; p<0,05).

42

Tabela 5– Comparação dos parâmetros clínicos de avaliação periodontal nos grupos (teste de ANOVA; p<0,05).

42

Tabela 6 – Quantificação de periodontopatógenos, total e por espécie, nos diferentes grupos (teste de Kruskal-Wallis; p<0,05).

43

Tabela 7 – Associação entre quantificação bacteriana total e diagnóstico clínico periodontal (teste ANOVA; p<0,05).

44

Tabela 8 – Associação entre a quantidade de Tf e o diagnóstico clínico periodontal (teste ANOVA; p<0,05).

45

Tabela 9 –

Associação entre diagnóstico clínico e os níveis séricos de estradiol e progesterona (teste de ANOVA; p<0,05).

46

Tabela 10 –

Correlação dos níveis séricos de estradiol e progesterona com a quantificação bacteriana por espécie, nos diferentes grupos (Correlação de Pearson; p<0,05).

47

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Figura demonstrativa dos complexos microbianos de Socransky et al., 1998.

22

LISTA DE ABREVIATURAS

SUS Sistema Único de Saúde 17

OMS Organização Mundial de Saúde 17

DAC Doenças ateroscleróticas cardiovasculares 18

qPCR Reação em cadeia da polimerase em tempo real 19

Fn Fusobacterium nucleatum 22

NIC Nível de inserção clínica 24

PS Profundidade de sondagem 24

IPV Índice de placa visível 25

ISG Índice de sangramento gengival 25

DNA Ácido desoxirribonucleico 26

TBRAS Thiobarbituric acid-reactive substances 27

FISH Fluorescence in situ hybridization 28

LDL Low density lipoprotein 29

LH Hormônio luteinizante 30

ng/mL Nanograma por mililitro 30

pg/mL Picograma por mililitro 31

MT Mato Grosso (estado) 34

NIH National Institute of Health 34

ABEP Associação Brasileira de Empresas de Pesquisa 34

Nº Número 34

Marca registrada 35

RJ Rio de Janeiro (estado) 35

Mfg Manufacturing 35

Co Company 35

Inc Incorporation 35

IL Illinois (estado) 35

EUA Estados Unidos da América 35

CA Califórnia (estado) 36

4PLC Curva logística de quatro parâmetros ponderada 36

nmol/mL Nanomol por mililitro 36

pmol/mL Picomol por mililitro 36

ºC Graus Celsius 36

mL Mililitro 37

L Microlitro 37

rpm Rotações por minuto 37

LTDA Limitada 38

SP São Paulo (estado) 38

NCBI National Center for Biotechnology Information 38

Aa Aggregatibacter actinomycetemcomitans 38

Pg Porphyromonas gingivalis 38

Tf Tannerella forsythia 38

So Streptococcus oralis 38

Un Universal 38

BLAST Basic Local Alignment Search Tool 38

nm Nanômetro 39

g/L Micrograma por microlitro 39

CT Cycle Treshold 39

SPSS Statistical package for the social sciences 39

EPM Erro padrão da média 40

K Kappa 40

ANOVA Análise de variância 40

RESUMO

Objetivo: identificar quantitativa e qualitativamente a flora subgengival de gestantes

em diferentes trimestres, comparadas com mulheres fora do ciclo grávido-puerperal;

avaliando as correlações entre características epidemiológicas, diagnóstico clínico,

achados microbiológicos e níveis de estradiol e progesterona. Metodologia: foram

avaliadas 52 gestantes, divididas em 3 grupos, conforme o trimestre gestacional e 15

pacientes não gestantes, sem uso de contraceptivos hormonais, representando o

grupo controle. A avaliação clínica periodontal registrou o índice de placa visível (IPV),

índice de sangramento gengival (ISG), profundidade de sondagem (PS) e o nível de

inserção clínica (NIC). Amostras do biofilme subgengival foram processadas pela

técnica de qPCR e os níveis séricos de estradiol e progesterona avaliados por

quimioluminescência. Resultados: O diagnóstico clínico durante a gestação se

correlacionou com a contagem bacteriana total, sendo identificada uma maior

prevalência de Tannerella forsythia (Tf) no primeiro trimestre da gravidez, havendo

correlação deste periodontopatógeno com diagnóstico de gengivite entre as

gestantes. Porphyromonas gingivalis (Pg) apresentou correlação positiva com os

níveis de progesterona no primeiro trimestre. O estudo apontou ainda alta prevalência

de periodontopatógenos nesta população. Conclusão: o diagnóstico clínico na

gestação se correlacionou positivamente com a quantidade de bactérias, não havendo

influência dos níveis hormonais ou dos fatores epidemiológicos avaliados. A presença

de Tf favoreceu a ocorrência de gengivite durante a gestação e os níveis de

progesterona no primeiro trimestre beneficiaram o crescimento de Pg. A alta

prevalência de bactérias agressivas ao periodonto indica a necessidade de

implementação de estratégias preventivas nesta população.

Palavras – chaves: doenças periodontais, estradiol, gravidez, progesterona,

qPCR.

ABSTRACT

Objective: to identify quantitatively and qualitatively the subgingival flora of pregnant

women in different trimesters, compared to women outside the pregnant-puerperal

cycle; evaluating the correlations between epidemiological characteristics, clinical

diagnosis, microbiological findings and levels of estradiol and progesterone.

Methodology: 52 pregnant women, divided into 3 groups, were evaluated according to

the gestational trimester and 15 non-pregnant patients, without hormonal

contraceptives, representing the control group. The periodontal clinical evaluation

recorded plaque index (PI), bleeding on probe (BOP), probing depth (PD) and clinical

attachment level (CAL). Subgingival biofilm samples were processed by the qPCR

technique and the serum levels of estradiol and progesterone were evaluated by

chemiluminescence. Results: The clinical diagnosis during gestation was correlated

with the total bacterial count. A higher prevalence of Tannerella forsythia (Tf) was

noticed in the first trimester of pregnancy and was correlated with gingivitis among

pregnant women. Porphyromonas gingivalis (Pg) showed a positive correlation with

progesterone levels in the first trimester. The study also pointed out a high prevalence

of periodontopathogens in this population. Conclusion: the clinical diagnosis in

gestation was positively correlated with the amount of bacteria, without influence of the

hormonal levels or the epidemiological factors evaluated. The presence of Tf favored

the occurrence of gingivitis during pregnancy and the progesterone levels in the first

trimester benefited the growth of Pg. The high prevalence of aggressive bacteria in the

periodontium indicates the need to implement preventive strategies in this population.

Key Words: estradiol, periodontal diseases, pregnancy, progesterone, qPCR

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 17

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Biofilme bacteriano

2.2 Doença periodontal

2.3 Doença periodontal X gestação

2.4 Estradiol & progesterona

2.5 Influência dos hormônios esteroides no periodonto

21

23

25

29

31

3 PROPOSIÇÃO

3.1 Geral

3.2 Específicas

33

33

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 População

4.2 Exame clínico periodontal

4.3 Avaliação dos níveis séricos de estradiol e progesterona

4.4 Coleta microbiológica

4.5 Extração e quantificação do DNA

4.6 Confecção dos primers, detecção e quantificação microbiana (qPCR)

4.7 Análise estatística

34

35

36

36

37

38

39

5 RESULTADOS

5.1 População estudada

5.2 Resultados clínicos

5.3 Resultados microbiológicos

5.4 Resultados hormonais

41

42

43

46

6 DISCUSSÃO 48

7 CONCLUSÕES 56

8 REFERÊNCIAS 57

ANEXOS 65

17

1 INTRODUÇÃO

O Sistema Único de Saúde (SUS), criado em 1988, apresenta como pilares

fundamentais os princípios da universalidade, integralidade e equidade da atenção

em saúde (1). Estes pilares incentivam a substituição da lógica curativa até então

vigente, por um modelo mais afeito aos princípios de promoção de saúde e qualidade

de vida; trazendo novos paradigmas para nortear as políticas de saúde e a conduta

dos profissionais envolvidos na assistência atualmente. Um dos focos de atenção

envolve o atendimento adequado e humanizado do período gestacional, rebatendo-

se o conceito de que saúde corresponda à ausência de doenças, mas valorizando a

qualidade de vida (1,2).

Sob esta mesma perspectiva, a Organização Mundial da Saúde (OMS),

através de seu Programa Global de Saúde Oral, destacou a importância da saúde

bucal como fator determinante para que os indivíduos tenham uma boa qualidade de

vida (3). A realização de avaliações e higienizações profissionais regulares são

componentes chave para esta conquista, já estando estabelecido que estes cuidados

são seguros, inclusive durante a gravidez, devendo ser recomendados para melhorar

a saúde bucal e geral da mulher como um todo (4).

O atendimento odontológico pré-natal além de melhorar a saúde bucal

materna, possui o benefício adicional de atuar sobre pacientes motivadas a adotar

comportamentos saudáveis que poderiam ser transmitidos à prole (4,5). Dentro deste

contexto, há a necessidade de um atendimento multidisciplinar para a manutenção

integral da saúde durante a gestação. Entretanto, mesmo em países desenvolvidos o

atendimento odontológico é um grande problema de saúde pública; nos Estados

Unidos um extenso levantamento, envolvendo 35.267 mulheres, demonstrou que 60%

delas não realizaram procedimentos de higienização profissional de seus dentes

durante a gravidez (4).

Apesar de ser infrequente o atendimento odontológico rotineiro no período

gestacional, percebe-se clinicamente que a gravidez, através de alterações

fisiológicas, afeta a saúde bucal. Um aumento gradual da gengivite foi observado em

diversos trabalhos, sendo interrogado o papel dos níveis ascendentes dos esteroides

sexuais frente a estas manifestações clínicas e ao biofilme bacteriano (6–10).

18

O controle inadequado do biofilme bucal, associado às características

evolutivas do mesmo, têm importância capital na progressão das doenças orais, mas

em sua complexidade, a doença periodontal influencia e sofre a influência de diversos

fatores sistêmicos. Evidências apontam para a contribuição da periodontite nas

doenças cardiovasculares ateroscleróticas (DAC), pois a translocação da microbiota

oral pode induzir, direta ou indiretamente, inflamação sistêmica relacionada ao

desenvolvimento da placa aterosclerótica, gerando aumento do risco para a doença.

O tratamento periodontal, por sua vez, promove redução da inflamação sistêmica, mas

seus efeitos na prevenção primária das DAC ainda são desconhecidos (11). Por outro

lado, o hábito do tabagismo é um grave fator de risco para a doença periodontal, sendo

responsável por 41,9% dos casos de periodontite em adultos, com efeitos persistentes

mesmo após a interrupção do hábito de fumar (12). Dentre as influências hormonais,

além das alterações relacionadas aos esteroides sexuais, podemos citar a relação

entre periodontite e diabetes, demonstrada na metanálise realizada por Papanou,

1996 (13), que evidenciou uma condição periodontal mais severa em indivíduos

portadores desta endocrinopatia.

O caráter transitório das alterações bucais encontradas no período

gestacional tem incentivado a realização de pesquisas com o objetivo de investigar a

relação entre estes achados e as variações hormonais fisiológicas da gravidez (6,8,14).

A produção de hormônios esteroidais pela placenta eleva progressivamente os níveis

de estrogênios e progesterona sendo que os estrogênios alcançam de forma

progressiva valores 1000 vezes acima dos níveis pré-gravídicos, enquanto a

progesterona atinge seu pico poucas semanas antes do parto (15). Ambos são

essenciais para a manutenção da gravidez e afetam os diversos sistemas orgânicos

promovendo alterações que viabilizem o desenvolvimento fetal (16).

São quatro os mecanismos relatados na literatura que possivelmente

contribuem com a exacerbação da inflamação gengival na presença de altos níveis

de estradiol e progesterona (8). O primeiro seria o efeito vasodilatador dos estrogênios

gerando aumento do aporte sanguíneo ao tecido gengival, com consequente

exacerbação da resposta inflamatória; também são apontadas: supressão do sistema

imune, alterações quantitativas e qualitativas da flora supra e subgengival, além de

alterações fenotípicas da gengiva. Estes relatos buscaram esclarecer a influência dos

19

esteroides sexuais na interação entre biofilme e hospedeiro, entretanto, ainda existe

um longo caminho a ser percorrido neste sentido (6,8,17,18).

Este é um assunto de abordagem multidisciplinar, pois o aparecimento de

resposta inflamatória exuberante, traduzida clinicamente como gengivite, pode

progredir para formas mais avançadas da doença, expressas pela periodontite; sendo

tal evolução relacionada com a ocorrência de partos prematuros e/ou nascimentos de

baixo peso por diversos pesquisadores (16,19,20). O levantamento realizado pela OMS

em 2010, afirma que a prematuridade de forma geral é responsabilizada por 35% das

mortes neonatais. Este mesmo estudo estima que aproximadamente 14,9 milhões de

bebês nascem prematuramente, o que corresponde há 11,1% de todos os partos no

mundo (21). Estes números instigam um pronto reconhecimento e a elaboração de

estratégias de combate contra todo e qualquer fator de risco modificável que possa

contribuir com tal ocorrência, o que inclui uma averiguação minuciosa do perfil bucal

das gestantes.

Esta é uma tarefa bastante difícil, pois, as amostras de biofilme bucal

contemplam uma diversidade de espécies bacteriana muito ampla, mais de 500 já

foram reconhecidas e com a evolução das técnicas de pesquisa este número

progrediu. A microscopia ótica, microscopia eletrônica e os métodos de cultura

bacteriana, tem perdido espaço para estudos que aplicam técnicas de biologia

molecular. Estes superam as dificuldades de cultivo de determinados microrganismos,

tendo por vantagens a especificidade, sensibilidade e capacidade de quantificar as

espécies do biofilme (22).

Levando-se em consideração que a doença periodontal tem sido

amplamente pesquisada, em virtude de sua capacidade de gerar ou interferir em

nascimentos prematuros e/ou de baixo peso, justifica-se a busca de dados que

possam aprimorar o conhecimento sobre estas interações. A proposta do presente

estudo consiste em investigar as condições periodontais clínicas e microbiológicas

nos diferentes trimestres da gestação, comparando estes dados com pacientes fora

do ciclo grávido puerperal.

Propusemos a combinação de rigorosos critérios clínicos para identificar a

presença da doença periodontal, avaliando sua gravidade e correlacionando estes

achados com a identificação e quantificação dos principais elementos patogênicos da

flora bacteriana subgengival, através de PCR em tempo real (qPCR), em paralelo com

20

a dosagem dos níveis séricos de estradiol e progesterona. A hipótese nula testada

verificou se ocorreram modificações clínicas e/ou microbiológicas relacionadas à

gestação e à elevação dos hormônios esteroides avaliados.

21

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 BIOFILME BACTERIANO

O termo biofilme caracteriza uma forma de aglomeração bacteriana com

características peculiares, contendo três componentes: as bactérias, uma superfície

para fixação e um fluido circulante. Este último tem o papel de carrear nutrientes e

produtos de excreção, realizando também o transporte de células inteiras para novos

locais de colonização. Desta forma o biofilme é um ecossistema que inclui

constituintes orgânicos e inorgânicos no qual uma matriz de substâncias poliméricas

extracelulares envolve as bactérias, fornecendo a elas um ambiente no qual múltiplas

espécies podem interagir de forma sinérgica ou competitiva, refletindo a mútua

interação entre as espécies hospedeiras e colonizadoras (22).

Durante o desenvolvimento do biofilme, inicialmente glicoproteínas e

anticorpos salivares criam uma película condicionante sobre a superfície dentária que

viabiliza a adesão das bactérias. A capacidade de adesão, entretanto, varia entre as

diferentes espécies sendo feita primariamente por cocos Gram positivos anaeróbios

facultativos, sendo o principal representante o Streptococcus sanguis. Na fase

seguinte estão envolvidos os bastonetes Gram positivos, como o Actinomyces spp.

Usufruindo dos receptores fornecidos por estes dois grupos de colonizadores iniciais,

a seguir, aderem-se ao biofilme microrganismos Gram negativos, sendo os mais

comumente associados à doença periodontal a Porphyromonas gingivalis, Prevotella

intermedia, Bacteroides forsythus, Campylobacter rectus e Aggregatibacter

actinomycetemcomitans, assim como os treponemas (23).

Socransky et al., 1998 (24) e Socransky e Haffajee, 2002 (25) descreveram

seis complexos microbianos que se instalam de forma evolutiva no biofilme

subgengival durante a história natural de evolução das doenças periodontais. Os

complexos amarelo, azul, verde e violeta são os colonizadores iniciais, capazes de

aderir a superfície dental, mas que não se relacionam com a doença periodontal.

Entretanto, estes agentes fornecem os receptores e condições ecológicas

necessárias para a implantação das bactérias do complexo laranja envolvidas na

patogênese das doenças periodontais.

22

FIGURA 1 – Complexos microbianos, Socransky et al. 1998 (24).

Zee et al.,1996 (26) realizaram estudo avaliando dois grupos de indivíduos,

classificados em grupo rápido ou lento, conforme a velocidade de acúmulo do biofilme.

Uma única amostra de placa foi retirada de cinco indivíduos do grupo rápido e em seis

do grupo lento nos dias 1, 3, 7 e 14. As bactérias Gram-positivas predominaram em

ambos os grupos, com aumento das espécies Gram-negativas ao longo do tempo,

sendo encontradas na proporção de 38% no grupo rápido, contra 17% no grupo lento,

no 14º dia. Houve diminuição da proporção de cocos gram-positivos de 50-60% no dia

1 para <15% no dia 14, acompanhada por um aumento na proporção de Actinomyces

sp. e bacilos Gram-negativos. Estas modificações refletiram a evolução de um

ambiente inicialmente aeróbio que progressivamente evoluiu para anaerobiose,

resultado do processo de amadurecimento do biofilme.

O Fusobacterium nucleatum (Fn) parece ser essencial durante este

processo de maturação, estando presente nas colonizações supragengivais e

23

subgengivais. Esta bactéria garante diversidade, pois, os colonizadores tardios em

geral não interagem com a flora inicial do biofilme e nem com outras bactérias de

ingresso tardio, mas agregam-se ao Fn (27). Após a instalação do quadro de gengivite,

foi documentado que as espécies dos complexos vermelho e laranja são mais

prevalentes e encontradas em maior número (22). Os trabalhos de Cortelli e Cortelli,

2003 (28), Mayanagi et al., 2004 (29) e posteriormente a revisão realizada por How et

al., 2016 (30) identificaram a Porphyromonas gingivalis como um dos principais agentes

etiológicos das periodontites crônicas, enquanto que nas periodontites agressivas a

presença do Aggregatibacter actinomycetemcomitans foi observada em 72% dos

casos (31).

Do ponto de vista estrutural, a região supragengival apresenta o dente

como única superfície para colonização pelo biofilme, enquanto que na área

subgengival estão presentes as superfícies dentárias e o epitélio do sulco gengival ou

bolsa periodontal. Outra diferença ocorre devido ao fluido que banha o biofilme, sendo

constituído pela saliva, na região supragengival, e pelo fluido crevicular na área

subgengival. A mudança de dois componentes do biofilme afeta a composição do

terceiro, constituído pelas bactérias em si. Em indivíduos saudáveis, a contagem

média da maioria das espécies é maior na região supragengival do que na

subgengival, havendo aumento do carga bacteriana em ambos os sítios nos

portadores de periodontite, nestes últimos notam-se taxas mais elevadas de

microrganismos dos complexos laranja e vermelho no biofilme subgengival (22).

2.2 DOENÇA PERIODONTAL

De acordo com Armitage, 2004 (32), o status de saúde periodontal pode se

alterar mediante a presença de gengivite ou de periodontite. Ambas estão mais

frequentemente relacionadas à presença do biofilme bacteriano, mas a etiologia

multifatorial da doença periodontal envolve determinantes relacionados ao

hospedeiro, tais como hereditariedade e tabagismo, podendo se manifestar em

consequência de diversas doenças sistêmicas, particularmente as que afetam o

sistema imunológico, ou que de alguma forma aumentam a sensibilidade local

mediante alterações inflamatórias com degradação tecidual concomitante.

24

Por outro lado, um pequeno grupo de bactérias predominantemente gram-

negativas, anaeróbias ou microaerófilas que colonizam a área subgengival, tem sido

regularmente associadas às patologias periodontais (33). O conceito de gengivite

induzida pelo biofilme reflete a presença de inflamação gengival sem perda do tecido

conjuntivo, enquanto que o quadro de periodontite, apresenta maior severidade. Nesta

segunda situação detecta-se a perda de tecido conectivo e do osso alveolar,

observando-se a migração apical da inserção epitelial nas superfícies radiculares (32).

Nas periodontites crônicas, a Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e o

Treponema denticola, pertencentes ao complexo vermelho de Socransky, se

estabelecem levando a cronificação da doença (24,25).

Uma classificação sistematizada e de fácil entendimento por parte dos

profissionais é essencial para a correta identificação e manejo de qualquer afecção,

sendo assim, em 1999 foi criado um comitê, presidido por Gary Armitage, que revisou

e atualizou sistema de classificação das doenças periodontais. O escopo consistia em

viabilizar uma melhor identificação da etiologia e patogênese destas doenças, de

forma a garantir maior sucesso nas ações terapêuticas; baseando-se na identificação

do tipo de doença periodontal, gravidade das alterações detectadas e na extensão do

problema (34).

No caso das periodontites a classificação da gravidade da doença foi

diretamente relacionada com o nível de inserção clínica (NIC), sendo considerada

doença leve enquanto o NIC permanece entre 1±2mm, moderada para NIC variando

entre 3±4 mm e severa quando o NIC for maior ou igual a 5 mm. O quadro é

considerado localizado quando compromete menos de 30% dos dentes e

generalizado se afetar uma proporção superior a esta (32).

A profundidade de sondagem (PS) não foi elencada como critério primário

para categorizar a intensidade da doença, porque a altura da margem gengival pode

se alterar, por exemplo, durante os processos inflamatórios com edema gengival.

Nesta situação a margem encontrar-se-ia e posição mais coronal, o que afetaria o

resultado de sua aferição. Ainda assim, este parâmetro permanece útil na avaliação

das doenças periodontais, pois é capaz de discriminar a presença de sítios que

apresentem bolsas periodontais, habitat usual das bactérias subgengivais

patogênicas (32).

25

Outros critérios adotados durante a investigação das doenças periodontais

incluem o índice de placa visível (IPV) e o índice de sangramento gengival (ISG). O

IPV reflete o efeito dos procedimentos diários de higiene bucal, enquanto que o

sangramento durante a sondagem é um dos sinais mais precoces para o diagnóstico

de gengivite. Trata-se de um exame de fácil realização que produz resultado objetivo

e de fácil verificação. A ausência de sangramento tem sido correlacionada com baixo

risco para a perda de inserção clínica futura, enquanto que a sua ocorrência reflete

lesão inflamatória do epitélio e tecido conjuntivo, em geral antecedendo as alterações

de coloração nas gengivas. Sua detecção permite ao clínico indicar a instituição de

tratamentos em fase iniciais da doença evitando a progressão do quadro (35).

2.3 DOENÇA PERIODONTAL X GESTAÇÃO

Dados levantados pela pesquisa pós-parto do Sistema de Monitoramento

de Avaliação de Risco de Gravidez, realizada em dez estados americanos e

envolvendo 35.267 mulheres, retratam a carência de atendimento odontológico

durante o pré-natal. O levantamento evidenciou que, durante sua última gravidez, 56%

das gestantes não receberam cuidados dentários e 60% não realizaram profilaxia

profissional. Apenas 24% das mulheres negras e 25% das hispânicas foram

examinadas, enquanto que entre as pacientes brancas, 44% receberam atendimento

(36).

No Brasil, um estudo observacional realizado em 2012, entrevistou 200

pacientes com filhos de até 5 anos de idade. Não houve atendimento odontológico

durante a gestação em 57% delas e a maioria (88,84%) alegou não ter necessitado

de tratamento (37). Entretanto, mesmo na ausência de sintomas, a American Dental

Association recomenda que o intervalo de visitas para atendimento odontológico

ocorra a cada seis meses e que tais cuidados devem se manter durante o período

gestacional (4).

Embora a gestação seja um acontecimento fisiológico, ela envolve uma

série de modificações adaptativas no organismo materno. Tais alterações orgânicas

impõem aos profissionais de saúde a aquisição de conhecimentos que permitam uma

abordagem diferenciada. As alterações gengivais durante a gravidez foram descritas

pela primeira vez por volta de 1800 (17). A exacerbação da inflamação gengival,

26

observada em particular entre o 2º e 3º trimestres, já foi clínica e histologicamente

bem documentada (6–8,10,38) e diversos autores têm relatado a hipótese de que a

significativa elevação dos níveis de hormônios esteroides durante a gestação,

promoveria aumento da resposta inflamatória gengival (6,8,39).

No início da década de oitenta, Kornman e Loesche, 1980 (6) foram os

pioneiros na investigação microbiológica da flora subgengival em mulheres grávidas,

utilizando a caraterização de colônias em culturas anaeróbias cultivadas em meios

seletivos e não seletivos. Os autores dosaram a incorporação de esteroides,

marcados com Carbono-14, pelos microrganismos do biofilme bacteriano, com

objetivo de traçar um paralelo entre os níveis hormonais das gestantes e sua flora

periodontal. Foi observada, ao longo da gestação, alteração da flora subgengival, com

o desenvolvimento de um perfil mais anaeróbio. Os microrganismos anaeróbios

atingiram uma proporção de 39% no segundo trimestre, superando as taxas

previamente observadas nas gengivites crônicas, de aproximadamente 26-29% (40,41)

e os 20% observados na gengivite experimental (42). Concomitantemente, os níveis

séricos de estradiol e progesterona mostraram, até o final da gravidez, uma correlação

positiva com os níveis de B. melaninogenicus ss. Intermedius (posteriormente

denominado Prevotella nigrescens).

Mais recentemente, uma revisão de literatura listou as evidências que a

ciência havia encontrado até então a respeito da influência da variação dos hormônios

sexuais femininos sobre a placa bacteriana. Foram elencadas pesquisas que

avaliaram diferentes etapas da vida, incluindo a adolescência, gravidez e climatério.

O estudo considerou que a metodologia utilizada para a investigação destes tópicos

foi muito variada, o que poderia contribuir para a falta de homogeneidade das

conclusões. Com a evolução das técnicas de biologia molecular, a precisão na

quantificação e determinação dos agentes bacterianos determinou avanços em

relação aos estudos previamente realizados com a utilização de culturas. As bactérias

periodontais, caracteristicamente anaeróbias, são sensíveis e de difícil cultivo,

problema superado pelas técnicas que utilizam o estudo de DNA, mas que por outro

lado não são capazes de diferenciar os organismos viáveis daqueles já inviáveis. O

autor ainda interroga se os esteroides exercem influencia direta sobre os

microrganismos periodontais ou se a reação inflamatória, exacerbada em sua

presença, é que influencia o ecossistema (14).

27

Partindo da relação positiva entre níveis hormonais e inflamação, Gumus

et al., 2015 (43) conduziu pesquisa com o objetivo de avaliar a associação dos

parâmetros clínicos de inflamação periodontal e gravidade da doença com os níveis

salivares de marcadores de estresse oxidativo. O estudo envolveu 115 gestantes,

reavaliadas 6 meses após o parto e 72 mulheres não grávidas. O aumento do stress

oxidativo durante a gestação foi evidenciado pela elevação na concentração de

TBRAS (thiobarbituric acid-reactive substances). No período puerperal, de forma

contrária, elevaram-se as substâncias antioxidantes, mas não foi encontrada

associação da doença periodontal com estes marcadores.

Além de alterações na resposta inflamatória e no sistema imunológico,

outros mecanismos potenciais têm sido propostos na tentativa de esclarecer a relação

entre as bactérias patogênicas periodontais e seu papel durante a gravidez. A

contribuição dos esteroides sexuais femininos neste microbioma envolve teorias que

incluem alterações da permeabilidade vascular e das características do biofilme

subgengival (7). No entanto, existem poucos dados sobre a composição da microbiota

subgengival durante a gravidez e acredita-se que a variação hormonal possa

promover aumento da patogenicidade (6,9).

Com a persistência de lacunas a respeito da interação entre microbiota

periodontal e gestação, Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8) desenvolveu um estudo

longitudinal incluindo avaliação clínica periodontal, cultura de amostra microbiológica

e dosagem dos níveis salivares de estradiol e progesterona. Os autores detectaram

que concomitantemente à piora clínica, o perfil bacteriano das gestantes tornava-se

realmente mais patogênico. O aumento nos níveis de progesterona e estradiol

influenciou positivamente a proporção de Porphyromonas gingivalis encontradas nas

amostras. Esta bactéria, assim como Prevotella intermedia foram associadas com

aumento do índice gengival (8).

Xie et al., 2013 (44), também descrevem alterações clínicas, reportando uma

redução do ISG de 6,5% durante a gestação, para 4,3% (± 5,3%) 22 meses após o

parto (p <0,05). Estes autores observaram redução da PS e do NIC no mesmo

intervalo, relatando ainda que a presença de periodontite diminuiu de 66,7% para

33,3% (p <0,01). Jensen, Liljemark e Bloomquist (45), por sua vez, observaram que

pacientes portadoras de gengivite e/ou periodontite apresentaram piora no período

28

gestacional e Tilakaratne et al., 2000 (46) relatou aumento das medidas clínicas de

inflamação durante a gravidez, sem perda de inserção.

Também no Brasil foram conduzidos, em gestantes, alguns trabalhos

avaliando as condições gengivais, perfil bacteriano e associação destas variáveis com

desfechos adversos na gravidez. Machado et al., 2012 (47) realizaram o primeiro

estudo utilizando a técnica de fluorescence in situ hybridization (FISH) para avaliação

da microbiologia periodontal durante a gravidez. Foram comparadas 20 gestantes no

segundo trimestre e 20 mulheres não grávidas com o objetivo de investigar diferenças

quantitativas e qualitativas de 8 periodontopatógenos. Não houve diferença entre os

grupos, sendo observado um nível mais elevado Prevotella intermedia entre as

gestantes, porém sem diferença estatística. A pesquisa apontou mínima influência das

variações hormonais na colonização e crescimento dos periodontopatógenos

estudados (47).

Lima et al., 2013 (48) identificou as bactérias pertencentes ao complexo

vermelho de Socransky em 33,3% das gestantes com periodontite, contra 3,7% no

grupo de gestantes com gengivite. Borgo et al.,2014 (9), por sua vez, observou piora

dos parâmetros clínicos entre o segundo e terceiro trimestre. Os autores identificaram

ISG de 52% e níveis mais elevados de Aggregatibacter actinomycetemcomitans neste

período, além de gengivite severa no terceiro trimestre. Esta informação é relevante

para a instituição de tratamentos dadas as características de maior resistência desta

bactéria, bem como devido ao seu envolvimento em casos de periodontite agressiva

(9,49).

Mais uma vez utilizando a técnica de fluorescence in situ hybridization

(FISH), Machado et al., 2016 (50) descreveram estudo longitudinal avaliando pacientes

entre 14-24 semanas de gravidez, no período puerperal com 48h e novamente 8

semanas após o parto. Não houve diferença estatística entre os parâmetros clínicos

nas três avaliações, assim como na contagem bacteriana total durante a gravidez e

após o parto. Observou-se, todavia, redução significativa na contagem de Prevotella

nigrescens comparando o segundo trimestre gestacional com as duas avaliações pós-

parto. O estudo faz ressalva ao pequeno tamanho da amostra.

Ao longo dos anos, além de investigar a piora clínica dos sinais indicativos

de gengivite durante a gravidez, os estudos começaram a apontar uma provável

correlação entre a doença periodontal com alguns desfechos adversos na gravidez.

29

Surgiram evidências de que a deterioração do status periodontal acarretava aumento

na incidência de trabalho de parto prematuro e de baixo peso ao nascer (51).

Em uma pesquisa realizada com 189 puérperas africanas, nas primeiras

24h após o parto, demonstrou correlação entre a presença de inflamação gengival e

a ocorrência de trabalho de parto prematuro e de baixo peso ao nascer. A associação

entre estes desfechos e a presença de doença periodontal ocorria quando eram

detectadas na mesma paciente espécies diferentes de bactérias

periodontopatogenicas, em associação de dois ou mais tipos, aparentemente sendo

necessária a presença do Aggregatibacter actinomycetemcomitans (49).

Estudos de intervenção clínica, por sua vez, demonstraram que a adoção

de raspagem e alisamento radicular durante a gestação se mostrava eficaz na

redução do número de bactérias periodontais patogênicas. Entretanto, a confirmação

da correlação entre esta infecção e os desfechos obstétricos encontrou resultados

conflitantes em relação à redução da incidência de trabalho de parto prematuro após

a realização de terapia periodontal (19,52).

Embora ainda não esteja clara a associação entre a doença periodontal e

os desfechos obstétrico, estudos inicialmente conduzidos em animais demonstraram

a capacidade de translocação das bactérias periodontais para a cavidade amniótica

(53). Este fato foi posteriormente confirmado em humanos, com o agravante de que

tais bactérias foram imputadas como responsáveis por casos de óbito fetal em pelo

menos dois episódios, sendo um em feto prematuro envolvendo a translocação de

Bergeyella sp e outro em feto a termo, com 39 semanas de gestação, envolvendo o

Fusobacterium nucleatum. Neste último a bactéria isolada do pulmão e do estômago

do natimorto não foi encontrada na placa supragengival, microflora vaginal ou retal,

correspondendo apenas ao tipo clonal identificado na placa subgengival da mãe (54,55).

Dados como estes justificam a necessidade de prosseguimento das investigações

sobre o tema.

2.4 ESTRADIOL & PROGESTERONA

Os esteroides sexuais são divididos em três grupos principais, de acordo

com o número de átomos de carbono. Na gestação, o precursor dos hormônios

esteroides é a lipoproteína LDL (low density lipoprotein), transferida a partir da

30

circulação materna para o compartimento placentário. A placenta, entretanto, não

possui todo o arsenal enzimático para a síntese estrogênica, de forma que feto e

placenta se unem nesta tarefa. O córtex adrenal fetal participa do processo

convertendo a pregnenolona materna em sulfato de pregnenolona e posteriormente

em sulfato de dehidroepiandrosterona, este precursor retorna à placenta

prosseguindo a sequencia de conversão até tornar-se estrona e estradiol, que serão

transferidos primordialmente para o organismo materno. Habitualmente são

quantificados no sangue periférico 3 tipos de estrogênios: estriol, estrona e estradiol;

sendo este último o que possui maior atividade biológica. O estriol possui um

centésimo, e a estrona um décimo, da potência do estradiol (15).

A progesterona, por sua vez, é produzida fora do período gestacional pela

glândula adrenal e pelo ovário, sendo mínima a sua secreção no início da fase folicular

do ciclo menstrual. Em torno do décimo dia do ciclo, o folículo dominante promove um

pequeno aumento na produção de progesterona que facilita a ação de feedback

positivo dos estrogênios, viabilizando o pico de hormônio luteinizante (LH)

responsável pelo processo de ovulação (15).

Durante a gestação, a progesterona é essencial para o processo de

nidação do ovo fecundado, possuindo um interessante efeito modulador do sistema

imunológico que permite a adaptação da mãe aos antígenos fetais. Sua produção

deriva inicialmente do corpo lúteo e, posteriormente, entre a sétima e a décima

semana gestacional, a placenta se torna sua principal fonte. Os níveis plasmáticos

deste hormônio ascendem progressivamente chegando a valores em torno de 100 –

200 ng/ml no final da gestação (16).

Na paciente não gestante, durante a fase folicular do ciclo menstrual, ocorre

produção de estradiol pelo folículo dominante que estimula a proliferação endometrial,

preparando o útero para a implantação do blastocisto. Durante a gravidez, os níveis

de estradiol se elevam em torno de 100 vezes. De forma conjunta os estrogênios

(estradiol, estrona e estriol) geram importante aumento do fluxo sanguíneo placentário

e atuam nos diversos sistemas orgânicos, modulando suas funções de forma a suprir

as necessidades do feto em desenvolvimento (16).

As concentrações plasmáticas habituais de estradiol e progesterona, de

acordo com a fase do ciclo menstrual e gravídico, são descritas por Speroff, Glass e

Kase, 1995, conforme ilustrado na Tabela 1.

31

TABELA 1 – Níveis de estradiol e progesterona nas diferentes fases do ciclo

menstrual, durante a gestação e menopausa, adaptada a partir de Speroff, Glass e

Kase, 1995 (15).

Fase avaliada Hormônios

Estradiol Progesterona

Fase folicular 25-75 pg/ml < 1 ng/ml Pico do meio do ciclo 200-600 pg/ml Fase lútea 100-300 pg/ml 5-20 ng/ml Primeiro trimestre de gravidez 1-5 ng/ml 20-30 ng/ml Segundo trimestre de gravidez 5-15 ng/ml 50-100 ng/ml Terceiro trimestre de gravidez 5-25 ng/ml 100-400 ng/ml Pós-menopausa 5-25 pg/ml < 1ng/ml

*1 ng = 1.000 pg

2.5 INFLUÊNCIA DOS HORMÔNIOS ESTERÓIDES NO PERIODONTO

É possível que os esteroides influenciem, direta e indiretamente, a

proliferação, diferenciação e o crescimento celular de forma sistêmica. Como

exemplo, Willershausen, citado por Mealey e Moritz, 2003 (17) relata que progesterona,

pode reduzir a síntese de glicosaminoglicanos, principal constituinte da matriz do

tecido conjuntivo da gengiva e aumentar a metabolização do folato reduzindo a

reparação tecidual. Já os estrogênios estimulam a proliferação e queratinização da

mucosa vaginal, oral e do epitélio gengival (56), também se relacionando com aumento

do fluxo sanguíneo para o útero e outros os tecidos (15).

A progesterona tem pouco efeito na vasculatura sistêmica, mas afeta a

gengiva e outros tecidos não periodontais intra-bucais, gerando aumento da

permeabilidade vascular e da proliferação vascular, além de possibilitar o acumulo de

células inflamatórias. Com níveis de placa bacteriana semelhantes, a reposta

imunológica gengival é exacerbada pelos hormônios esteroides sexuais permitindo

uma resposta tecidual exagerada durante a gestação (18).

No estudo pioneiro de Kornman e Loesche, 1980 (6), alterações hormonais

fisiológicas da gestação foram levadas em consideração para explicar os achados

clínicos da cavidade bucal. Utilizando estradiol e progesterona marcados pelo carbono

14, os autores perceberam que as bactérias previamente isoladas por meio de cultura

captavam estes hormônios de forma variável durante a evolução da gestação. Houve

aumento da captação de estradiol de 4,4% antes da 13ª semana gestacional para

18,1% entre a 21ª-24ª semanas (p<0,05), com retorno aos níveis basais entre 29ª-32ª

32

semanas. Para a progesterona a captação inicial era de 4,1%, passando para 18,4%

(p<0,05) na avaliação de segundo trimestre, acontecendo decréscimo no terceiro

trimestre semelhante ao ocorrido com o estradiol. Paralelamente foi observado

aumento da gengivite entre 18-23 semanas, com posterior redução dos casos, mesmo

sem variação no índice de placa.

Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8) reportou correlação entre a variação dos

níveis de progesterona, do primeiro para o segundo trimestre, com um aumento na

contagem de P. gingivalis. Entre o segundo e o terceiro trimestre, a concentração de

estradiol também se correlacionou com a presença desta bactéria

periodontopatogenica. Todavia, esta pesquisa não detectou associação significativa

entre o aumento da inflamação gengival com a elevação dos hormônios salivares.

Kumar, 2013 (14) afirma que os esteroides sexuais exercem um efeito

predominantemente pró-inflamatório sobre a gengiva, dificultando a diferenciação

entre os efeitos hormonais diretos sobre os microrganismos daqueles relacionados ao

aumento da resposta inflamatória. O estudo conclui não haver evidências suficientes

que relacionem o aumento dos esteroides na gestação com a presença de bactérias

específicas na flora subgengival.

33

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

• Identificar e quantificar a presença de microbiota periodontopatogenica

em gestantes, de diferentes trimestres, comparadas com não gestantes.

3.2 ESPECÍFICAS

• Avaliar o perfil periodontal na gestação e fora dela.

• Avaliar a influência dos dados sócio demográficos no perfil periodontal.

• Avaliar os níveis séricos de estrogênio e progesterona, em diferentes

trimestres da gestação e em pacientes não gestantes.

• Correlacionar os achados clínicos periodontais aos microbiológicos.

• Correlacionar os níveis séricos de estrogênio e progesterona com as

manifestações clínicas e microbiológicas do periodonto.

34

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 POPULAÇÃO

Foram avaliadas 67 mulheres, provenientes de ambulatórios de

Ginecologia e Pré-Natal do SUS em Cuiabá – MT – Brasil, entre fevereiro e agosto de

2017, sendo o desenho do estudo transversal, do tipo caso controle, com amostra por

conveniência.

Foram definidos como critérios de inclusão: idade entre 18 e 35 anos, com

gestação única, confirmada por ultrassonografia. Para o grupo controle foram

selecionadas pacientes na mesma faixa etária com ciclos menstruais regulares e que

não fizeram uso de método contraceptivo hormonal nos últimos 3 meses.

Os critérios de exclusão elencaram: 1) gestações de alto risco conforme

critérios do Ministério da Saúde e National Institute Of Health (NIH) abrangendo

portadoras de comorbidades, obesas, gestações múltiplas e pacientes com idade

materna muito jovem (<15 anos) ou avançada (>35 anos) (57,58); 2) uso de antibióticos

sistêmicos nas últimas quatro semanas; 3) usuárias de corticoides e heparina; 4)

pacientes com limitação de abertura bucal. Pacientes com menos de 18 anos

completos também foram excluídas por necessitarem de autorização de terceiros para

o engajamento no projeto.

As pacientes foram alocadas conforme sua condição clínica em 4 grupos:

Grupo 1 (n = 16) – primeiro trimestre da gestação (até 98 dias);

Grupo 2 (n = 21) – segundo trimestre da gestação (entre 99 e 196 dias);

Grupo 3 (n = 15) – terceiro trimestre da gestação (a partir de 197 dias);

Grupo 4 (n = 15) – mulheres não gestantes (grupo controle);

Foi aplicado questionário próprio para a coleta de dados obstétricos e

ginecológicos (ANEXO 1), sendo realizada avaliação socioeconômica, utilizando a

classificação da Associação Brasileira de Empresas e Pesquisa - Critério de

Classificação Econômica Brasil 2014 (ABEP, 2014). Todas as pacientes avaliadas

assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO 2). Este estudo

recebeu parecer favorável nº 1.898.399 emitido pelo Comitê de Ética em Pesquisa na

35

Universidade de Cuiabá (ANEXO 3).

4.2 EXAME CLÍNICO PERIODONTAL

O exame clínico odontológico foi realizado imediatamente antes ou após o

atendimento obstétrico ou ginecológico, sem realização prévia de profilaxia e/ou

escovação supervisionada, com a paciente sentada, sob luz natural e com auxílio de

um espelho clínico (SSWhite Duflex®, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e sonda periodontal

milimetrada tipo Williams (Hu-Friedy® Mfg Co Inc. Chicago, IL, EUA). Foi realizado

exame periodontal, dente por dente, com registro dos dados (ANEXO 4).

As mensurações clínicas analisadas foram: índice de placa visível (IPV),

índice de sangramento gengival (ISG), profundidade de sondagem (PS) e nível de

inserção clínica (NIC). O índice de placa visível (IPV) é um parâmetro dicotômico que

considera a presença ou não de biofilme visível em todas as faces dos dentes,

avaliando a capacidade de controle de placa do paciente. A avaliação do ISG ocorreu

após a inserção de uma sonda periodontal milimetrada, cerca de 0,5 mm dentro do

sulco gengival, fazendo-a percorrer toda sua extensão delicadamente, aguardando 30

segundos para verificar a ocorrência de sangramento na gengiva marginal (59).

O diagnóstico periodontal foi estabelecido após a avaliação bucal, sendo

classificado como: saúde (quando < 30% dos sítios periodontais apresentavam

presença de sangramento gengival); gengivite (quando > 30% dos sítios periodontais

apresentavam sangramento gengival) e periodontite (na presença de quatro ou mais

dentes com um ou mais sítios apresentando PS ≥ 4mm e perda de inserção clínica ≥

3mm no mesmo sítio (32).

Entre os parâmetros subgengivais, a profundidade de sondagem (PS),

aferiu a distância compreendida entre a margem gengival até a porção mais apical do

epitélio juncional. O nível de inserção clínica (NIC), avaliou a distância entre a junção

amelocementária e a porção mais apical do epitélio juncional, sendo considerada

periodontite leve a perda de 1 a 2 mm de inserção, moderada variando entre 3±4 mm

e severas quando maior ou igual a 5 mm (32). As medições foram realizadas em seis

sítios por dente (mesio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mesio-lingual, lingual,

disto-lingual) para todos os dentes exceto os terceiros molares e anotadas nas fichas

clínicas periodontais (59).

Após avaliação clínica odontológica as pacientes com necessidade de

36

tratamento foram encaminhadas à Clínica de Odontologia da Universidade de Cuiabá.

4.3 AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS SÉRICOS DE ESTRADIOL E

PROGESTERONA

As amostras de sangue foram coletadas por punção venosa periférica, pela

equipe do laboratório de análises clínicas do Hospital Geral Universitário, Cuiabá –

MT, sendo a dosagem hormonal efetuada pelo método de quimioluminescência

utilizando os testes Access Estradiol e Access Progesterone (Access Immunoassay

Systems, Beckman Coulter, Inc. 250 S. Kraemer Blvd. Brea, CA, EUA).

Entre as gestantes, a alíquota de sangue para dosagem de estradiol e

progesterona foi recolhida durante a realização dos exames da rotina pré-natal. Para

as pacientes não gestantes, a amostra foi coletada entre o 7°-13º dias da fase folicular

do ciclo.

Os resultados dos testes foram determinados automaticamente pelo

software do sistema utilizando um modelo matemático de curva logística de quatro

parâmetros ponderada (4PLC). O nível mínimo detectável de progesterona

distinguível de zero para o teste Access Progesterone (calibrador Access

Progesterone Calibrator S0) foi 0,10 ng/mL (0,32 nmol/L) e para o teste Access

Estradiol (calibrador Access Estradiol Calibrator S0) foi 20 pg/mL (73 pmol/L), com

95% de confiança.

4.4 COLETA MICROBIOLÓGICA

As coletas microbiológicas subgengivais foram realizadas após a avaliação

clínica, com o auxílio de um cone de papel n° 30 autoclavado (Dentsply, Maillefer,

Ballaigues, Suíça). Foram coletadas amostras microbianas intrasulculares dos sítios

mesio-vestibulares dos dentes 11, 16, 26, 31, 36 e 46. Na ausência desses elementos,

foram obtidas amostras dos dentes adjacentes. Para a coleta, cada dente foi isolado

com roletes de algodão esterilizados e o biofilme dental supragengival removido com

rolete de algodão esterilizado (59).

O cone de papel foi inserido na porção mais apical do sulco periodontal e

mantido em posição por 60 segundos (31). Em seguida, os cones de papel de cada

indivíduo foram colocados em minitubos tipo Eppendorf (Bio-Rad®, Hercules, CA,

37

EUA) e mantidas a temperatura de - 80°C até seu processamento.

4.5 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA

Para a avaliação microbiológica, a extração do DNA genômico foi realizada

com auxílio do kit PureLinkTM Genomic DNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad,

CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante.

As amostras de cada paciente foram combinadas em pool, o tubo A

contendo os cones de papel e o tubo B contendo o swab e a alça coletora. Foi

adicionado 1,0 ml de água ultrapura aos minitubos e o material foi homogeneizado em

agitador mecânico (Vórtex, QL 901, Biomixer) por 30 segundos e 500 μL da amostra

foram centrifugados (3 min x 10.000 rpm, 27ºC).

Após a remoção do sobrenadante, foi adicionado 180 μL de Lisozima,

sendo realizada ressuspensão no Vórtex por 30 segundos e incubação a 37ºC por 30

minutos. A seguir, 20 μL de Proteinase K foram adicionados aos tubos contendo a

suspensão de células bacterianas (pellet) e em seguida novamente colocados no

Vórtex por 30 segundos. Foi adicionado 200 μL de PureLinkTM Genomic

Lysis/Binding Buffer sendo realizada nova homogeneização com o agitador mecânico,

por 30 segundos.

Cada minitubo foi incubado à 55ºC por 120 min, sendo retirados e

recolocados no agitador mecânico por 30 segundos em intervalos de 20 minutos. Após

esses procedimentos, foi adicionado 200 μL de etanol (100%) ao lisado e o minitubo

foi agitado por 5 segundos até a formação de uma solução homogênea.

Ao término desse processo, todo o lisado (aproximadamente 600 μL) foi

transferido para uma coluna (contendo membrana de sílica - “PureLinkTM Spin

Column”) acoplado a um tubo de coleção. Esse conjunto foi centrifugado por 1 min x

10.000 rpm, 27ºC. Em seguida, foram realizadas dois enxagues da membrana com

500 μL de Wash Buffer 1 (10.000 rpm por 1 min) e Wash Buffer 2 (10.000 rpm por 3

min), o tudo coletor foi desprezado e a coluna foi acondicionada em um novo minitubo.

Finalmente, 30 μL de PureLinkTM Genomic Elution Buffer foi utilizado na eluição do

DNA fixado na membrana de sílica, com posterior centrifugação por 1 min x 10.000

rpm, 27ºC. A coluna foi removida e descartada, o minitubo foi incubado a -20ºC.

As cepas bacterianas foram provenientes da Fundação Oswaldo Cruz,

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, cultivadas no laboratório de

38

microbiologia da Universidade de Cuiabá.

4.6 CONFECÇÃO DOS PRIMERS, DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO

MICROBIANA (qPCR)

Os primers empregados foram desenhados de acordo com a sequência

específica altamente conservada do gene 16S do DNA ribossomal bacteriano de cada

microrganismo envolvido e sintetizados pela Life Technologies do Brasil LTDA, São

Paulo-SP (Invitrogen Tech-LineSM). A busca das sequências alvo desejadas foi

realizada por consulta ao NCBI Nucleotide Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). O

software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/) foi utilizado para a confecção dos primers

(Tabela 2).

TABELA 2 – Sequência de primers e sondas de DNA para cada um dos

microrganismos estudados.

Cepas Primers e Sondas Sequência

ATCC 25922 (E. coli)

Universal (F) Universal (R) Universal (Probe)

TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA TGCGGGACTTAACCAACA CACGAGGTGACGACAAGCCATGCA

ATCC 29522 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)

A. Actinomyc (F) A. Actinomyc (R) A. Actinomyc (Probe)

CAAGTGTGATTAGGTAGTTGGTGGG TTCATTCACGCGGCATGGC ATCGCTAGCTGGTCTGAGAGGATGGCC

ATCC 43037 (Tannerella forsythia)

T. forsythia (F) T. forsythia (R) T. forsythia (Probe)

AGCGATGGTAGCAATACCTGTC TTCGCCGGGTTATCCCTC CACGGGTGAGTAACG

W83 (Porphyromonas gingivalis)

P. gingivalis (F) P. gingivalis (R) P. gingivalis (Probe)

ACCTTACCCGGGATTGAAATG CAACCATGCAGCACCTACATAGAA ATGACTGATGGTGAAAACCGTCTTCCCTTC

ATCC 10557 (Streptococcus oralis)

S. oralis (F) S. oralis (R) S. oralis (Probe)

TTGGGTCAATTGCCCTTTGAC GTCCAAACAAGCCACCACTT ACAACATATCAACAGGCGCA

A identificação e quantificação absoluta das bactérias de Aggregatibacter

actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia

(Tf), Streptococcus oralis (So) e Universal (Un) nas amostras clínicas foi realizada

através da qPCR pelo equipamento StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA,

EUA), utilizando pares de primers específicos por sistema de amplificação com

sondas TAQMAN® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Em seguida, os

mesmos foram testados, em relação à especificidade, empregando o programa NCBI

39

BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

A concentração dos primers, bem como, as condições ideais para o

processo de amplificação (concentrações dos reagentes/determinação das

temperaturas envolvidas) foram previamente estabelecidas para cada conjunto de

primers Foward e Reverse incluídos no estudo.

A qPCR foi realizada utilizando uma solução de 25 µL contendo 0,5 µL de

200 nmol de cada primer, 0,5 µL de 200 nmol de sonda Taqman, 12,5 µL de Taqman

Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) 9 µL de água

estéril e 2 µL de solução de DNA.

Inicialmente, para a realização da curva padrão, foi utilizado o DNA extraído

a partir da bactéria pura, onde foi feita a leitura em espectrofotômetro (NanoDrop® ND-

1000 UV-vis, NanoDrop Technologies, Wilmington, EUA) por meio da avaliação das

absorbâncias a 260 nm e da relação entre as absorbâncias a 260/280 nm. Obteve-se

uma concentração inicial entre 0,5-0,6 ug/µL de cada DNA bacteriano, em seguida

realizou-se 8 diluições seriadas (101-108) para confecção da curva padrão. A curva

padrão (a qual possuía concentração conhecida) foi utilizada para converter os scores

de Ct (Cycle treshold) obtidos com as amostras de fluido em números exatos de

concentração de DNA.

Uma vez determinados os limites de quantificação, as amostras clínicas

foram processadas juntamente com a curva padrão (controle positivo) respectivas de

cada espécie bacteriana, em triplicatas, e os valores médios foram utilizados para o

cálculo dos níveis bacterianos. As reações foram realizadas respeitando-se uma

eficiência de amplificação para a curva padrão entre 110% a 93% (slope = -3,10 a -

3,50) e um coeficiente de correlação (R2) ≥ 0,98%. Para o ensaio da qPCR ter alta

eficiência, a inclinação da curva padrão (slope) deve ser próxima de -3,30 (60).

O controle negativo foi realizado substituindo o DNA pela mesma

quantidade de água estéril, a fim de checar possíveis contaminações.

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados clínicos e microbiológicos foram submetidos a tratamento

estatístico específico, utilizando o programa Statistical Package for the Social

40

Sciences (SPSS) versão 20.

Cada parâmetro clínico foi obtido por dois examinadores, cegos e

previamente calibrados conforme metodologia descrita por Araujo et al. (2003) (61).

Para as variáveis contínuas (profundidade de sondagem) foi utilizado o EPM (erro

padrão da medida) e para as variáveis categóricas, (índices de placa e gengival) foi

utilizado o teste Kappa. Assim 10 exames foram repetidos num intervalo de 30 dias e

submetidos à análise. As examinadoras foram consideradas calibradas mediante

EPM ≤ 0,8 e K > 0,8 e < 0,95.

Para responder aos objetivos do estudo foram utilizadas, além de técnicas

básicas de análise exploratória como média, mediana, desvio padrão, frequência

absoluta e relativa, o teste Qui-quadrado para analisar a relação entre variáveis

qualitativa e para comparar os grupos aos pares empregamos a comparação múltipla

de Tukey. Já na relação entre variáveis quantitativas, foi utilizado a Correlação de

Pearson. Por fim, nas análises de comparação de médias entre co-variáveis

qualitativas, utilizamos o teste de ANOVA.

Os testes de hipóteses desenvolvidos nesse trabalho consideraram uma

significância de 5%, e a hipótese nula foi rejeitada quando p-valor foi menor ou igual

a 0,05.

41

5 RESULTADOS

5.1 POPULAÇÃO ESTUDADA

Entre as 67 pacientes que completaram o estudo, a idade média foi de

24,67 ± 1,26 anos, não havendo diferença entre os grupos (p = 0,704); entre as

gestantes a média foi de 24,71 anos e no grupo controle de 24,53 anos (p = 0,909). A

idade gestacional evidenciou pequena variabilidade dentro de cada grupo.

Em relação aos dados epidemiológicos, incluindo raça, paridade e classe

socioeconômica os grupos se apresentaram homogêneos (Tabela 3). A única

diferença ocorreu em relação ao estado civil, sendo encontrada maior prevalência de

pacientes com companheiro nos grupos 2 e 3 (p= 0,047).

TABELA 3 – Descrição de dados epidemiológicos - frequência absoluta e relativa,

média e desvio padrão (teste Qui-quadrado; p<0,05).

Dados epidemiológicos

Grupos

Total p-valor

1 2 3 4

Estado Civil

Com Companheiro

% (N)

50 (8)

86 (8)

80 (8)

53 (8)

69 (8)

0,047 Sem Companheiro

% (N)

50 (8)

14 (8)

20 (8)

47 (8)

31 (8)

Raça Caucasiana

% (N)

38 (6)

19 (8)

40 (8)

27 (8)

30 (8)

0,502 Não Caucasiana

% (N)

63 (10)

81 (8)

60 (8)

73 (8)

70 (8)

Paridade Com Filhos

% (N)

63 (10)

67 (8)

67 (8)

53 (8)

63 (8)

0,970 Sem Filhos

% (N)

38 (6)

33 (8)

33 (8)

47 (8)

37 (8)

Classe SE*

Classe E % (N)

19 (3)

24 (8)

27 (8)

7 (8)

19 (8)

0,527 Classe D

% (N)

81 (13)

67 (8)

60 (8)

80 (8)

72 (8)

Classe C2 % (N)

0 (0)

10 (8)

13 (8)

7 (8)

7 (8)

Classe B2 % (N)

0 (0)

0 (8)

0 (8)

7 (8)

1 (8)

Média de idade (anos) Desvio padrão

23,50 +/-5,6

24,90 +/-5,0

25,73 +/-4,9

24,53 +/-6,0

24,67 +/-5,3

0,704

Média da idade gestacional (dias) Desvio padrão

77

+/-14,24 157,48

+/-28,46 236,13

+/-26,77 - - -

*SE = classe socioeconômica

42

5.2 RESULTADOS CLÍNICOS

Em relação ao diagnóstico clínico periodontal, no grupo 1 houve uma maior

proporção de indivíduos com gengivite, nos grupos 2 e 3 as maiores proporções de

indivíduos com periodontite e no grupo 4 a maior proporção de indivíduos com saúde

(Tabela 4), entretanto não houve diferença estatística entre os grupos (p = 0,1035).

TABELA 4 – Comparação do diagnóstico clínico periodontal nos grupos (teste Qui-

quadrado; p<0,05).

Grupos Diagnóstico Clínico Periodontal

Total p-valor Saúde Gengivite Periodontite

1 % 38 63 0 100

0,1035

(N) (6) (10) (0) (16)

2 % 33 33 33 100

(N) (7) (7) (7) (21)

3 % 40 33 27 100

(N) (6) (5) (4) (15)

4 % 53 40 7 100

(N) (8) (6) (1) (15)

Corroborando a não variabilidade do diagnóstico clínico periodontal,

verificou-se que nas avaliações de PS, NIC, IPV e ISG não houve diferença estatística

entre os grupos (Tabela 5).

TABELA 5 – Comparação dos parâmetros clínicos de avaliação periodontal nos

grupos (teste de ANOVA; p<0,05).

Grupos Parâmetros Avaliados PS NIC IPV ISG

1 Media 2,46 0,94 0,67 0,39 Mediana 2.40 1,00 0,82 0,26 Desvio padrão 0,46 0,58 0,36 0,36

2 Media 2,28 1,36 0,65 0,41 Mediana 2,30 1,00 0,60 0,25 Desvio padrão 0,70 0,81 0,32 0,35

3 Media 2,55 1,48 0,41 0,26 Mediana 2.30 1,00 0,30 0,15 Desvio padrão 0,61 0,71 0,33 0,32

4 Media 2,33 1,00 0,49 0,22 Mediana 2,30 1,00 0,50 0,26 Desvio padrão 0,58 0,74 0,31 0,17

p-valor 0,546 0,099 0,074 0,217 PS: profundidade de sondagem; NIC: nível clínico de inserção; IPV: índice de placa visível; ISG: índice de sangramento gengival.

43

O teste Qui-quadrado não evidenciou associação entre o diagnóstico

clínico periodontal e os dados epidemiológicos (idade da paciente, paridade, raça,

estado civil e nível socioeconômico) nos diferentes grupos. O mesmo ocorreu entre

as gestantes quando fizemos o ajuste de acordo com a idade gestacional.

5.3 RESULTADOS MICROBIOLÓGICOS

Para avaliar a diferença entre os grupos, em relação à quantidade total de

bactérias, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis (Tabela 6). Observou-se que o grupo

controle (grupo 4) foi o que apresentou a menor quantidade média de bactérias e que

a carga bacteriana foi mais elevada no grupo 1, seguido pelos grupos 2 e 3. Porém,

não houve diferença estatística entre os grupos (p = 0,4336).

TABELA 6 – Quantificação de periodontopatógenos, total e por espécie, nos diferentes

grupos (teste de Kruskal-Wallis; p<0,05).

Grupos Microorganismos

Total Pg Aa Tf So Un

1 Media 12.658.073 561.991 89.805 202.344 36.623 3.953.290 Mediana 9.612.764 0 46.013 23.945 0 3.281.499 Desvio Padrão 9.221.776 1.320.099 156.964 329.860 102.610 3.830.708

2 Media 11.809.621 410.656 72.545 67.940 35.554 2.999.282 Mediana 8.673.809 40 18.709 1.147 0 1.429.628 Desvio Padrão 11.519.511 1.244.766 138.342 133.984 79.832 3.661.119

3 Media 10.449.415 134.774 59.857 31.498 18.508 2.386.648 Mediana 9.048.468 0 35.481 5.264 0 1.414.154 Desvio Padrão 8.267.627 372.516 78.484 47.464 35.241 3.458.882

4 Media 9.262.006 114.705 25.573 380 10.763 1.407.833 Mediana 4.273.116 0 24.561 0 0 917.895 Desvio Padrão 9.975.699 422.722 22.010 483 19.993 1.261.805

p-valor 0,4336 0,3198 0,3056 0,0061 0,9911 0,0651 Total: contagem bacteriana total; Pg: Porphyromonas gingivalis; Aa: Aggregatibacter actinomycetemcomitans; Tf: Tannerella forsythia; So: Streptococcus oralis; Un: Universal.

Por outro lado, quando os periodontopatógenos de interesse foram

quantificados individualmente, a detecção de Tf revelou diferenças significativas, com

p igual a 0,0061 (Tabela 6). Foi identificado que no grupo controle a média para esta

bactéria é bem mais baixa que nos demais e, partindo deste dado, optou-se pela

realização da comparação múltipla de Tukey buscando identificar quais grupos

apresentavam diferenças entre si.

Este segundo teste confirma que, ao comparar o grupo 1 com os grupos 3

44

(p = 0,048) e 4 (p = 0,014), existem diferenças na quantificação de Tf. Já entre os

grupos 1 (média 202.344) e o grupo 2 (média de 67.940) não foi observada

significância estatística (p = 0,119).

A frequência relativa das bactérias periodontopatogenicas estudadas foi

comumente superior a 50% nesta população. Aa foi encontrado em todas as pacientes

avaliadas (100%) e Pg esteve presente em mais da metade das gestantes no grupo

2 (52%). Para Tf, as taxas de detecção entre as gestantes, foram superiores a 80%,

atingindo 88% no grupo 1, 81% no grupo 2 e 87% no grupo 3.

Nota-se que ao agruparmos todas as gestantes (grupo gestante =

G1+G2+G3), a quantidade total de bactérias subgengivais exerceu influencia sobre o

diagnóstico clínico (p = 0,006), conforme Tabela 7. Ao comparamos pacientes com

diagnóstico de saúde periodontal, com aquelas que clinicamente apresentavam

doença (gengivite ou periodontite), verificou-se que nestas últimas as médias foram

progressivamente maiores. Na comparação múltipla de Tukey, as diferenças entre

saúde x gengivite, e saúde x periodontite, determinaram um valor de p = 0,041 e 0,008

respectivamente.

TABELA 7 – Associação entre quantificação bacteriana total e diagnóstico clínico

periodontal (teste ANOVA; p<0,05).

Grupos Quantificação

Bacteriana Diagnóstico Clínico Periodontal

Saúde Gengivite Periodontite p-valor

1 Media 2.475.898 6.264.945 - x -

0,119 Mediana 1.911.377 4.210.644 - x - Desvio padrão 1.874.674 5.335.504 - x -

2 Media 902.626 3.640.720 6.214.584

0,146 Mediana 526.191 2.753.431 3.935.374 Desvio padrão 845.962 2.373.493 7.915.453

3 Media 459.090 2.312.813 6.287.668

0,024 Mediana 216.069 2.316.411 3.936.126 Desvio padrão 566.618 924.803 5.511.489

Gestantes* (G1+G2+G3)

Media 1.259.385 4.531.753 6.241.160 0,006 Mediana 648.389 3.353.085 3.935.374

Desvio padrão 1.435.355 4.103.691 6.834.248

4 Media 1.402.892 1.903.534 744.473

0,736 Mediana 889.354 1.142.871 744.473 Desvio padrão 1.255.824 1.947.505 - x -

*Gestantes = agrupamento de todas as gestantes (G1 + G2 + G3)

Quando analisadas separadamente, de acordo com o trimestre

45

gestacional, observou-se que a associação entre quantificação bacteriana e

diagnóstico clínico se perpetua apenas para o grupo 3 (p = 0,024). Com o teste da

comparação múltipla de Tukey, nota-se que neste grupo, a quantidade média de

bactérias em gestantes com saúde foi significativamente menor do que naquelas com

periodontite (p = 0,020). Não houve diferença nas comparações entre saúde x

gengivite e gengivite x periodontite.

Na quantificação específica dos periodontopatógenos, foi observado que

Aa, Pg e So não demostraram associação com o diagnóstico clínico em nenhum dos

grupos, porém a quantidade de Tf se correlacionou positivamente com o diagnóstico

de gengivite entre as gestantes (Tabela 8).

TABELA 8 – Associação entre a quantidade de Tf e o diagnóstico clínico periodontal

(teste ANOVA; p<0,05).

Grupos Quantificação

de Tf Diagnóstico Clínico Periodontal


1 Media 16.094 314.093 - x -

0,079 Mediana 124 117.005 - x - Desvio padrão 39.094 378.808 - x -

2 Media 14.468 91.976 97.375

0,454 Mediana 1.175 1.027 1.024

Desvio padrão 26.630 145.232 181.705

3 Media 27 41.870 65.738

0,073 Mediana 30 61.592 37.468

Desvio padrão 25 36.642 70.709

Gestantes* (G1+G2+G3)

Media 10.421 181.551 85.871

0,031 Mediana 94 55.519 17.936

Desvio padrão 26.721 288.904 146.850

4 Media 246 456 986

0,334 Mediana 0 405 986 Desvio padrão 456 503 - x -

*Gestantes = agrupamento de todas as gestantes (G1 + G2 + G3)

Ao avaliar a influência dos dados epidemiológicos nos resultados

microbiológicos, foi encontrada correlação positiva entre idade e a presença Aa no

grupo 1 (p 0,023). No grupo 1 a presença de Aa e So mostraram correlação inversa

com o nível socioeconômico, com valores de p = 0,019 e 0,031 respectivamente;

sendo que Aa manteve o mesmo padrão no grupo 3, com p = 0,030. Não foram

encontradas correlações entre a quantificação bacteriana e a raça, paridade, estado

civil e idade gestacional.

46

5.4 RESULTADOS HORMONAIS

Os níveis de estradiol e progesterona foram consideravelmente mais

baixos no grupo controle e, refletiram a evolução da idade gestacional, aumentando

progressivamente entre os grupos de 1 a 3. Para estradiol, foram detectadas

diferenças entre os níveis séricos do grupo 4 em relação aos demais, com p igual a

0,002; 0,005 e < 0,001 na comparação com os grupos 1, 2 e 3 respectivamente. Entre

as gestantes, não houve diferença estatística entre os grupos. Os níveis séricos de

progesterona variaram significativamente, exceto entre os grupos 1 e 4; porém,

mesmo nesta comparação observa-se um valor de p = 0,071 demonstrando tendência

a diferença entre os dois grupos.

5.4.1 Correlação entre os níveis hormonais e diagnóstico clínico

Neste trabalho não foi observada associação entre os níveis séricos de

estradiol e/ou progesterona com diagnóstico periodontal clínico (Tabela 9).

TABELA 9 – Associação entre diagnóstico clínico e os níveis séricos de estradiol e

progesterona (teste de ANOVA; p<0,05).

Hormônio Grupos Nível sérico Diagnóstico Clínico Periodontal


Estr

ad

iol

1 Media 985,8 1.400,8 - x -

0,434 Mediana 1.000 1.000 - x - Desvio padrão 102,6 1.243,2 - x -

2 Media 1.000 1.120,0 1.452,6

0,492 Mediana 1.000 1.000 1.000 Desvio padrão 0 268,3 1.012,0

3 Media 2.266,7 1.000 1.000

0,207 Mediana 1.000 1.000 1.000 Desvio padrão 1.962,3 0 0

4 Media 42,6 70,5 32,0

0,412 Mediana 39,0 58,0 32,0 Desvio padrão 13,1 60,8 - x -

Pro

ge

ste

ron

a

1 Media 26,0 28,0 - x -

0,700 Mediana 27,6 27,6 - x - Desvio padrão 6,4 11,7 - x -

2 Media 53,5 51,7 60,8

0,846 Mediana 47,6 40,0 40,0 Desvio padrão 24,2 29,4 38,3

3 Media 99,2 88,7 97,6

0,947 Mediana 95,1 97,9 105,7 Desvio padrão 71,1 36,9 41,6

4 Media 0,480 0,943 0,600

0,309 Mediana 0,300 0,620 0,600 Desvio padrão 0,334 0,728 - x -

47

5.4.2 Correlação entre os níveis hormonais e avaliação microbiológica

No primeiro trimestre Pg se correlacionou com os níveis de progesterona

(p 0,041), conforme Tabela 10. Não foi encontrada correlação entre a quantidade total

de bactérias e os níveis de estradiol e/ou progesterona.

TABELA 10 - Correlação dos níveis séricos de estradiol e progesterona com a

quantificação bacteriana por espécie, nos diferentes grupos (Correlação de Pearson;

p<0,05).

Hormônio Grupos Correlação

p-valor Espécie Bacteriana

Un Pg Aa Tf So

Estr

ad

iol

1 Corr (r)* -0,247 -0,113 -0,126 -0,162 0,002 p-valor 0,357 0,677 0,642 0,548 0,995

2 Corr (r) -0,184 -0,128 -0,189 -0,215 -0,163 p-valor 0,512 0,649 0,501 0,441 0,563

3 Corr (r) -0,255 -0,147 -0,299 -0,269 -0,205 p-valor 0,359 0,601 0,279 0,332 0,464

4 Corr (r) -0,056 -0,223 -0,060 0,193 -0,212 p-valor 0,842 0,423 0,832 0,490 0,449

Pro

ge

ste

ron

a 1

Corr (r) 0,333 0,516 -0,124 0,391 -0,169 p-valor 0,208 0,041 0,646 0,134 0,532

2 Corr (r) 0,197 0,102 0,070 0,009 -0,137 p-valor 0,392 0,659 0,762 0,969 0,553

3 Corr (r) 0,075 -0,248 -0,082 0,064 -0,014 p-valor 0,791 0,372 0,772 0,821 0,959

4 Corr (r) 0,049 -0,010 0,010 0,363 -0,201 p-valor 0,863 0,970 0,971 0,184 0,472

*Corr (r) = correlação

48

6 DISCUSSÃO

O presente estudo realizou uma investigação transversal, avaliando a

ocorrência de alterações quantitativas e/ou qualitativas da flora subgengival de

gestantes, em diferentes trimestres, comparadas com mulheres não gestantes.

Em relação à idade, a média encontrada foi de 24,67 anos (± 1,26),

compatível com a de outros autores (6,8,47,60,62); exceto Bieri et al., 2012 (63) que

trabalharam com gestantes argentinas com idade média em torno dos 32 anos. Foram

excluídas pacientes identificadas como “gestantes de alto risco”, pois, diversos

trabalhos tem relacionado a doença periodontal com desfechos obstétricos adversos

(19,20,49,64,65). Desta forma, evitou-se um viés de seleção, excluindo pacientes que

apresentassem previamente condições passíveis de influenciar negativamente a

gestação ou que já pudessem ser portadoras de alterações da flora subgengival, tais

como diabéticas, hipertensas, tabagistas e pacientes com mau passado obstétrico.

Embora o termo “gestação de alto risco” inclua critérios variáveis, passíveis de

influências regionais, ele reflete condições nas quais a vida ou a saúde da mãe e/ou

do feto e/ou do recém-nascido têm maiores chances de serem atingidas que as da

média. Optou-se então pela adoção dos parâmetros definidos pelo Ministério da

Saúde em concordância com National Institute of Health (57,58).

De uma forma geral nossa população demonstrou homogeneidade para a

idade, paridade, raça e nível sócio econômico, o que tornou válida as comparações

entre os 4 grupos. Apenas para o critério estado civil, foi observada uma maior

proporção de pacientes com companheiro nos grupos 2 e 3 (p = 0,047). O tamanho

da amostra foi comparável à de outros estudos sobre o mesmo tema (6,8,47,63,66–68).

O nível socioeconômico não apresentou correlação com a contagem

bacteriana total, possivelmente por termos trabalhado com uma população usuária do

SUS, com nível sócio econômico bastante homogêneo, no qual 72% das pacientes

pertenciam à classe D e 19% à classe E, perfazendo 91% da amostra. Apenas

associações pontuais com esta variável foram observadas, como por exemplo a

correlação inversa com Aa nos grupos 1 e 3. Raça, estado civil e paridade também

não demonstraram associação com o diagnóstico clínico periodontal e contagem

bacteriana.

Como não possuíamos o conhecimento prévio do status periodontal da

49

paciente, foi possível avaliar a flora de mulheres apresentando saúde, gengivite e

periodontite, em concordância com os trabalhos de Kornman e Loesche, 1980 (6) e de

Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8); mas diferindo de Usin et al., 2013 (62) que optaram

por selecionar pacientes que apresentassem sinais clínicos de inflamação periodontal.

Este aspecto nos permitiu uma avaliação geral, não influenciada pela presença

majoritária de indivíduos portadores de alterações periodontais, nos quais se

pressupõe a presença de microbiota mais patogênica.

Em relação à técnica adotada para quantificação bacteriana, nosso

trabalho tem por vantagem a utilização de qPCR, o que viabiliza a identificação e

quantificação dos periodontopatógenos com maior sensibilidade, diferenciando-o de

publicações prévias que utilizaram a avaliação microbiológica por meio de cultura (6,8)

e PCR convencional (62).

Quanto à avaliação hormonal, verificamos serem escassos os trabalhos

que efetivamente quantificaram os níveis de estradiol e progesterona na gestação,

correlacionando-os com achados do biofilme subgengival (6,8,69,70). Todavia,

considerando o caráter sistêmico das alterações fisiológicas relativas à gravidez,

julgamos relevante a avaliação dos níveis séricos destes hormônios, assim como

Kornman e Loesche, 1980 (6). Os demais autores realizaram a dosagem hormonal

salivar, mas esta não foi nossa opção visto que o foco da pesquisa foi a avaliação

subgengival. Neste sentido, o fluido crevicular que banha as estruturas periodontais,

por se tratar essencialmente de um transudato do plasma, apresenta níveis hormonais

muito semelhantes a este (71).

Os níveis séricos de progesterona, em todos os grupos, foram semelhantes

aos descritos por Speroff, Glass e Kase, 1995 (15) (tabela 1). Para este hormônio, os

valores encontrados durante a pesquisa foram cerca de 50x, 100x e 200x mais

elevados nos grupos 1, 2 e 3, respectivamente, quando comparados com o grupo 4.

Para o estradiol, é descrito aumento em torno de 100x durante a gestação, em relação

aos níveis pré-gravídicos, mas as variações entre os diferentes trimestres apresentam

superposição de seus valores (15). Este fato foi confirmado neste trabalho, sendo

detectada média estatisticamente semelhante entre as gestantes dos diferentes

grupos. Os valores observados na gravidez foram em torno de 20-50 vezes superiores

ao do grupo 4, e, possivelmente, valores mais elevados não foram revelados devido

a utilização de metodologia semi-quantitativa para a dosagem hormonal. Apesar disto

50

os níveis de estradiol foram efetivamente diferentes entre as gestantes e o grupo

controle.

Nesta pesquisa que a progesterona foi o esteroide que mais

adequadamente ilustrou as modificações hormonais entre os trimestres gestacionais,

revelando diferenças significativas entre todos os grupos de gestantes (grupos 1, 2 e

3). Apenas a comparação entre o grupo 1 e o grupo controle não alcançou

significância (p = 0,071), embora já demostre tendência à diferença. O mesmo não

ocorreu para os níveis de estradiol, mas acreditamos que a menor variação dos títulos

hormonais entre as gestantes tenha decorrido em virtude da ascensão progressiva de

seus títulos com evolução da idade gestacional dentro de um mesmo grupo.

A utilização de quatro critérios objetivamente mensuráveis para avaliação

clínica periodontal – NIC, PS, IPV e ISG – também diferencia e agrega valor a este

trabalho. Anteriormente, nos trabalhos de Kornman e Loesche, 1980 (6); Jonson,

Howland e Bowden, 1988 (69), Yokoyama et al., 2008 (70), Carrillo-de-Albornoz et al.,

2009 (8) e Bieri et al., 2012 (63) não foi incluída a avaliação do NIC, mas de acordo com

Armitage (2000) os casos de periodontite necessitam ser avaliados e estratificados

com base na perda de inserção clínica, pois este parâmetro possui maior

especificidade do que a profundidade de sondagem, sendo então de fundamental

importância.

A respeito do diagnóstico clínico periodontal, nossa investigação não

detectou variação entre os grupos. A condição clínica se distribuiu de forma

especialmente equitativa nos grupos 2 e 3; no grupo 1 a frequência relativa de

gengivite foi de 63% e no grupo 4 observou-se saúde periodontal em 53% das

mulheres; todavia esta variação não alcançou diferença estatística. A avaliação

individual dos parâmetros clínicos, ISG, IPV, PS e NIC apontou uma tendência para

aumento do ISG no grupo 3 e do IPV no grupo 1 sem, contudo, apresentar valor de p

significativo. Nota-se que apesar de não ter sido detectada associação entre gestação

e alterações periodontais, o p-valor de 0,1035 reforça que eventualmente esta relação

poderá ser detectada em novos estudos com uma amostra maior.

Em relação aos parâmetros clínicos de avaliação periodontal, Kornman e

Loesche, 1980 (6) descrevem ascensão significativa do ISG entre o primeiro e segundo

trimestres; enquanto que no grupo não grávido não houve alteração dos parâmetros

clínicos durante o período do estudo. Estes autores evidenciaram que o IPV se

51

manteve inalterado ao longo da gravidez e pós-parto, sendo a mesma estabilidade

observada nos diferentes grupos do presente trabalho. Entretanto, em relação ao ISG,

nossos achados são discordantes, pois, não foi observada diferença quando

comparamos os grupos 1 e 2 (p = 0,999) e mesmo quando agrupamos as pacientes,

classificando-as como gestantes e não gestantes, não foi observada variação (p =

0,124).

Sobre este ponto nossos dados concordam com o trabalho de Jonson et

al., 1988 (69) que também não observaram alterações para ISG e PS, comparando

grávidas e não grávidas. Estes autores também não identificaram variação

significativa durante a progressão da gravidez, assim como em nossa pesquisa.

Em relação à caracterização quantitativa da flora subgengival durante o

período gestacional observamos que a literatura reforça a ausência de alterações

significativas durante a gestação, demostrada neste trabalho pela ausência de

diferenças entre os grupos em relação à quantificação bacteriana total, em

concordância com os estudos prévios de Löe e Silness, 1963 (72); Cohen et al., 1971

(73); Kornman e Loesche, 1980 (6); Tilakaratne et al., 2000 (46) e Novak et al., 2008 (52).

Todavia, mesmo com uma carga bacteriana semelhante, muitos autores relataram

aumento da gengivite no período gestacional (6,8–10,17,47,63,67,74) o que não foi

confirmado em nosso estudo. Esta discordância pode ter sido ocasionada por

diferenças metodológicas e nos critérios de avaliação clínica.

Adriaens et al., 2009 (75) investigaram longitudinalmente alterações

microbiológicas subgengivais durante a gravidez e 4 a 6 semanas pós-parto, utilizando

hibridização DNA-DNA. Os autores relatam que os níveis subgengivais de bactérias

associadas à periodontite não mudaram, havendo redução quantitativa de 17 das 37

espécies analisadas apenas na comparação entre o primeiro trimestre e o período

pós-parto. Nenhuma alteração ocorreu entre a 12ª e 28ª semanas da gravidez e a

quantificação de Aa, Pg, Tf e de T denticola não variou.

Entre gestantes portadoras de periodontite, Novak et al., 2008 (52), não

observou diferenças qualitativas para os sete microrganismos

peridodontopatogenicos por eles estudados. A literatura aponta, entretanto,

alterações qualitativas pontuais, tais como o aumento de B. melaninogenicus

intermedius no segundo trimestre (6), maior proporção de Prevotella intermedia no

primeiro trimestre e de Pg e Aa no terceiro trimestre (8).

52

Nosso estudo está de acordo com o exposto, pois não foram observadas

variações em relação ao número total de bactérias encontradas nos diferentes grupos

(p = 0,4336), contudo, detectou-se variação espécie especifica. A quantificação de Tf

revelou diferença estatisticamente significativa no biofilme subgengival com p =

0,0061. O grupo 1 apresentou média muito mais alta do que a encontrada no grupo 3,

havendo decréscimo numérico desta bactéria com a evolução da gestação. É possível

que alterações relativas à Tf no decorrer da gravidez não tenham sido detectadas em

estudos que utilizaram cultura microbiana por se tratar de uma bactéria anaeróbia, de

difícil cultivo (76) o que foi superado nesta metodologia com a utilização qPCR. A

respeito da diferença observada entre o grupo 1 e grupo 4, nossos dados confirmam

os achados de Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8), que já haviam demostrado queda

abrupta na detecção de Tf avaliando mulheres 3 meses após o parto.

Esta pesquisa observou divergência com o exposto na literatura ao termos

identificado altas prevalências de Tf e Aa em uma população sem comorbidades. De

acordo com Aas et al., 2005 (77), mais de 700 espécies bacterianas já foram detectadas

na cavidade oral, distribuindo-se de forma não homogênea entre os indivíduos, sendo

altamente diversificada e específica em relação ao sítio e indivíduo analisado. Em

média, para cada sítio específico, encontra-se 20 a 30 espécies predominantes

diferentes, mas de forma geral não se detecta espécies geralmente associadas a

periodontite e cárie, o que não foi confirmado em nossa amostra. Pg esteve presente

em mais da metade das gestantes do segundo trimestre (52%), Tf demonstrou

prevalência superior a 80% em todos os grupos de gestantes e Aa foi encontrado

virtualmente em todas as pacientes avaliadas (em apenas 1 indivíduo não foi

detectada).

Acreditamos que o uso de qPCR tenha promovido um aumento da nossa

capacidade de identificar tais bactérias, mas também é possível que ao termos

abordado uma população de baixo nível socioeconômico, haja um real

comprometimento, ainda que subclínico, de sua saúde periodontal. Por se tratarem

de pacientes jovens, é possível que manifestações periodontais mais exuberantes

ainda não tenham tido tempo suficiente para se apresentarem.

A influência de fatores socioeconômicos no agravamento das condições

periodontais é confirmada pela Pesquisa Nacional de Saúde Bucal, quando

comparamos as regiões com maior renda per capta, com as mais pobres, havendo

53

decréscimo do número de indivíduos hígidos nestas últimas (78). Neste âmbito,

observamos no trabalho atual correlação inversa entre nível sócio econômico e a

presença de uma espécie altamente patogênica (Aa), ainda que esta associação não

tenha se manifestado em todos os grupos.

Fazendo jus ao conceito de que a presença de biofilme bacteriano é o

principal fator determinante para o desenvolvimento de gengivite e doença periodontal

(32), observamos em nossa pesquisa que a quantidade total de bactérias subgengivais

se correlacionou positivamente com um agravamento do diagnóstico clínico nas

gestantes de forma geral (p = 0,006). Notamos também uma associação entre a

contagem de Tf e a ocorrência de gengivite entre as gestantes, quando consideradas

em conjunto (p = 0,031).

Conforme a classificação de Socransky et al., 1998 (24), esta bactéria possui

forte característica periodontopatogenica, pertencendo ao complexo vermelho, no

qual estão agrupados os microrganismos responsáveis pela cronificação e

agressividade da doença. É provável que tenhamos encontrado associação entre Tf

e gengivite, e não com periodontite, em função de termos avaliado uma população

jovem, ainda sem manifestações clínicas mais avançadas, tal como foi comentado

anteriormente em relação a alta prevalência de bactérias periodontopatogenicas

nestas pacientes.

Quanto à avaliação dos níveis hormonais, justifica-se sua dosagem devido

à presença de receptores para os esteroides sexuais nos tecidos gengivais. Durante

a gestação, os efeitos da elevação dos estrogênios e progesterona na vasculatura

gengival poderiam explicar o edema, eritema, aumento do fluido crevicular e

sangramento. Altos níveis de esteroides estão associados a uma maior

permeabilidade vascular no sulco gengival e possivelmente justificam a exacerbação

da secreção de fluido crevicular nesta situação (17,18).

É importante frisar que as variações nos níveis dos esteroides sexuais

ocorrem no período gestacional e também fora dele, sendo importante que pacientes

não gestantes sejam avaliadas sempre na mesma fase do ciclo menstrual. Este

cuidado foi observado durante nosso estudo e a investigação de pacientes do grupo

controle ocorreu sempre na fase folicular tardia, entre o 7º-13º dias do ciclo.

54

A fase lútea já havia sido estudada por Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8),

enquanto Kornman e Loesche, 1980 (6) avaliaram as pacientes não grávidas sempre

na mesma fase do ciclo menstrual, porém sem descrever especificamente em qual

período. Optamos por avaliar as pacientes do grupo controle durante a fase folicular

do ciclo menstrual, pois esta exibe maior contraste em relação ao período gestacional,

em especial, devido à mínima influência da progesterona nesta fase do ciclo.

Após a avaliação estatística dos dados, não detectamos associação entre

os níveis séricos de estradiol e/ou progesterona com diagnóstico periodontal clínico,

nem com a quantidade total de bactérias entre os grupos. Entretanto, observamos que

a frequência relativa de gengivite entre a gestantes foi 33% nos grupos 2 e 3, e 63%

no grupo 1. Estes achados clínicos concordam com Mealey e Moritz, 2003 (17), que

relataram ocorrência de gengivite em torno de 30-100% das gestantes.

Para Hugoson, 1971 (18) a alteração gengival tende a se iniciar no 2º mês

de gestação, piorando no 8º e regredindo após o parto, sendo assim correlacionada

com os níveis hormonais. Nós não observamos este padrão de comportamento, não

havendo aumento do número de pacientes acometidas por gengivite quando

comparamos os grupos 2 e 3 e, portanto, não confirmamos a correlação com a

elevação dos níveis de estradiol e progesterona. Interrogamos a possibilidade de que

em nosso estudo, parte das pacientes foi adequadamente reclassificada como

portadora de periodontite, e não de gengivite exclusivamente, ao adotarmos também

o critério de NIC como parâmetro de avaliação periodontal, o que pode ter provocado

a discordância assinalada.

No grupo 1, Pg se correlacionou com os níveis de progesterona (r = 0,516;

p = 0,041), assim como no trabalho de Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8). Acredita-

se que Pg tenha se favorecido da elevação súbita dos níveis de progesterona no

primeiro trimestre da gestação (15), utilizando-a com fator de crescimento em

substituição à vitamina K. A não persistência desta correlação ao longo do segundo e

terceiro trimestre sugerem uma saturação das vias metabólicas envolvidas.

Comportamento semelhante já foi descrito para outro bacilo periodontopatogenico por

Carrillo-de-Albornoz et al., 2009 (8) e Kornman e Loesche, 1980 (6) que observaram

correlação positiva entre os níveis dos esteroides sexuais e presença de Prevotella

intermedia, Bacteróides melaninogenicus ss. e Fusobacterium nucleatum, porém

estes periodontopatógenos não foram avaliados em nossa pesquisa. Identificamos

55

uma tendência para correlação positiva entre quantificação bacteriana e nível de

estradiol no grupo 2 (p 0,093), porém sem atingir a significância estatística.

Este trabalho demonstrou diferenças quantitativas de Tf durante a

gestação, comparando os grupos 1 e 3, mas a maior prevalência de Tf entre as

gestantes do grupo 1 não demonstrou correlação positiva ou negativa com os níveis

hormonais, sugerindo que sua variação, não foi influenciada pelos esteroides

estudados. Todavia, o estudo de Laine et al., 1988 (79) evidenciou um aumento

significativo da peroxidase salivar durante o terceiro trimestre, e é possível que o papel

antibacteriano desta enzima tenha favorecido o decréscimo deste periodontopatógeno

durante a gestação. O efeito estrogênico sobre o comportamento desta enzima

também foi observado por Leimola-Virtanen et al., 2000 (80) avaliando mulheres antes

e após a menopausa.

56

7 CONCLUSÕES

Neste trabalho o diagnóstico clínico periodontal se correlacionou

positivamente com a quantificação da microbiota subgengival durante a gestação. Na

avaliação qualitativa dos periodontopatógenos, observamos que Tanerella forsithya

foi mais frequente entre gestantes de 1º trimestre quando comparadas com gestantes

do 3º trimestre e não gestantes, havendo decréscimo na sua quantificação durante a

gravidez. Este periodontopatógeno, por sua vez, se associou a um aumento dos casos

de gengivite entre as gestantes.

Observou-se correlação positiva entre os níveis séricos de progesterona

com a presença de Pg, mas não foi identificada influencia hormonal ou das variáveis

epidemiológicas sobre o diagnóstico clínico e contagem bacteriana total. Alta

prevalência de bactérias reconhecidamente patogênicas foi encontrada nesta

população de mulheres jovens, sem grande comprometimento atual de suas

condições clínicas, sugerindo que ações preventivas poderiam evitar uma futura

deterioração do seu status periodontal.

57

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65

ANEXOS

ANEXO 1

FICHA PARA COLETA DE DADOS

Identificação da Paciente

Data da entrevista:

Data da coleta microbiológica:

Nº na Pesquisa

Nome:

Endereço:

Local em que está sendo realizado o PN:

Nº do Prontuário:

Idade:

Data de nascimento: Raça: ( ) Branca ( ) Não Branca

Estado Civil:

Você tem Companheiro? ( ) Sim ( ) Não

Mora com você? ( ) Sim ( ) Não

Telefones para contato:

Outros telefones para contato:

66

Levantamento Socioeconômico

1 - Nível Educacional da Paciente (1), Chefe da Família(2):

Nunca estudou

1 a 4 série do 1 grau

5 a 8 série do 1 grau

2 grau incompleto

2 grau completo

universitário incompleto

universitário completo

2 - Renda mensal em salários mínimos:

1 – ( ) Até 1 2 – ( ) 2 3 – ( ) 3 4 – ( )

entre 3 e 5

5 – ( )

entre 5 e 10

6 – ( )

entre 10 e 20

7 – ( ) +20 8 – ( )

não recebe salário

9 – ( ) Não respondeu

3 - Anote na coluna correspondente a quantidade de bens que possui:

Televisão em cores 0 1 2 3 4 ou mais

Radio 0 1 2 3 4 ou mais

Banheiro da sua residência 0 1 2 3 4 ou mais

Automóvel 0 1 2 3 4 ou mais

Empregada mensalista 0 1 2 3 4 ou mais

Maquina de lavar 0 1 2 3 4 ou mais

Videocassete ou DVD 0 1 2 3 4 ou mais

Geladeira 0 1 2 3 4 ou mais

Freezer 0 1 2 3 4 ou mais

4 - Como você mora atualmente?

1 ( ) Casa própria 2 ( ) Casa alugada 3 ( ) Quarto alugado

4 ( ) Apartamento próprio 5 ( ) Apartamento alugado

6 ( ) Habitação coletiva (hotel, pensionato, república) 7 ( ) Outra situação

5 - Quem mora com você?

1 ( ) Moro sozinho(a) 2 ( ) Pai e/ou mãe 3 ( ) Esposo(a) / companheiro(a) 4 ( ) Filhos(as) 5 ( ) Irmãos(ãs)

6 ( ) Outros parentes, amigos(as) ou colegas 7 ( ) Outra situação

6 - Quantas pessoas moram em sua casa?

(Contando com seus pais, irmãos ou outras pessoas que moram na mesma casa)

1 ( ) Moro sozinho (a) 2 ( ) Duas pessoas 3 ( ) Três pessoas

4 ( ) Quatro pessoas 5 ( ) Cinco pessoas 6 ( ) Mais de seis pessoas

67

Dados Obstétricos

1- Esta foi a primeira vez que você ficou grávida? ( ) Sim ( ) Não

2- Você teve algum aborto?

Não

Sim

Quantidade – Provocado

Quantidade – Espontâneo

3- Número de gestações prévias? _____________

4- Possui quantos filhos? ______________

5- Semana de Gestação na data de hoje: __________

6- Quantos de seus filhos nasceram de parto normal? __________ e de cesariana? _________

7- Todos os seus filhos nasceram vivos? ( ) Sim ( ) Não

8- Quantos nasceram mortos? _____________

9- Desta vez você queria ficar grávida? ( ) Sim ( ) Não

10- Data de início dos cuidados pré-natal: ___________________

11- Data da última menstruação: __________________________

12- Peso anterior/atual: _________/________

13- Estatura: ____________

14- Hospitalização na gravidez: _______

Número de dias:________________

Motivo:_______________________

15-

Antecedentes Familiares

Sim Não

Diabetes

Hipert. Art.

Gemelares

Câncer

Outros

16-

Antecedentes Pessoais

Sim Não

Infecção Urinária

Infertilidade

Diabetes

Hipert. Crônica

Cirurg Pélv. Uterina

Câncer

Outros

68

Dados Ginecológicos

1- Você ficou grávida alguma vez ? ( ) Sim ( ) Não

2- Você teve algum aborto?

Não

Sim

Quantidade – Provocado

Quantidade – Espontâneo

3- Número de gestações prévias? _____________

4- Possui quantos filhos? ______________

5- Quantos de seus filhos nasceram de parto normal? __________ e de cesariana? _________

6- Todos os seus filhos nasceram vivos? ( ) Sim ( ) Não

7- Quantos nasceram mortos? _____________

8- Data da última menstruação: __________________________

9- Você usa anticoncepcional? ( ) Sim ( ) Não

10- Você já usou anticoncepcional alguma vez? ( ) Sim ( ) Não

11- Há quanto tempo você não usa anticoncepcional ? __________________________

12- Seus ciclos menstruais são regulares? ? ( ) Sim ( ) Não

13- Peso anterior/atual: _________/________

14- Estatura: ____________

15- Hospitalização anterior: _______

Número de dias:________________

Motivo:_______________________

16-

Antecedentes Familiares

Sim Não

Diabetes

Hipert. Art.

Gemelares

Câncer

Outros

17-

Antecedentes Pessoais

Sim Não

Infecção Urinária

Infertilidade

Diabetes

Hipert. Crônica

Cirurg Pélv. Uterina

Câncer

Outros

69

ANEXO 2

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Título do Projeto: Avaliação periodontal clínica e microbiológica, nos diferentes

trimestres da gestação, correlacionada com os níveis sanguíneos de estradiol e

progesterona.

Pesquisador (a) responsável: Profa. Renata Santos de Souza Massoni

Telefone para contato: (65) 99978-9447 e (65) 8112-2528 (inclusive ligações a cobrar)

Pesquisadores participantes: Profa. Dra. Alessandra Nogueira Porto

Profa. Ms. Fernanda Zanol

Você está sendo convidada para participar, como voluntária, em uma pesquisa. Após

ser esclarecida sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine

ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador

responsável. Em caso de recusa você não será penalizada de forma alguma. Desde logo fica

garantido o sigilo das informações. Caso tenha dúvidas você pode procurar a Universidade de

Cuiabá (UNIC) Unidade Beira Rio pelo telefone (65) 3363-1271. Queremos também lhe

informar que este estudo foi avaliado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade

de Cuiabá, localizado na Avenida Manoel José de Arruda, 3100, Bloco de Saúde I, sala 328 -

Jardim Europa – Cuiabá –MT, CEP: 78.065-900, Fone: (65)3363-1271 e E-mail:

[email protected]. O horário de funcionamento do CEP é de segunda a sexta-feira das

14:00 as 17:30 horas.

O presente projeto pretende avaliar a saúde bucal de mulheres dentro e fora do período

gestacional, contribuindo com a disseminação de bons hábitos para o processo de saúde bucal

e geral; estimulando também o processo da amamentação e fornecendo orientações que se

estendam após o parto, no cuidado pessoal e com o bebê. As pacientes serão divididas em

grupos de acordo com o tempo de gravidez: no primeiro grupo ficarão as gestantes com até 98

dias de gravidez, no segundo grupo gestantes com 99 a 196 dias de gravidez e no terceiro grupo

gestantes com 197 ou mais dias de gravidez. Um quarto grupo será formado pelas pacientes

que não estão gestantes.

Você será convidada a responder um questionário informando dados socioeconômicos,

obstétricos ou ginecológicos. Também lhe será perguntado sobre seus hábitos e higiene, sobre

o impacto da saúde bucal em sua vida e também sobre o seu nível de ansiedade. Caso se sinta

constrangida, ou desconfortável de qualquer forma, você pode se recusar a responder qualquer

destas perguntas, não implicando em prejuízo algum ao seu atendimento.

Nessa investigação científica, serão examinados a presença de doença cárie, doença

periodontal, dentes perdidos, dentes restaurados e exame microbiológico. O exame é uma

observação da boca, com toda técnica, segurança e higiene. Será realizado por um examinador

Doutor em Periodontia, em uma sala pré-definida do ambulatório de pré-natal, sob luz natural,

com auxílio de espelho clínico e sonda periodontal milimetrada. O exame em geral não gera

desconforto para quem será examinado, serão utilizadas máscara, gorro e luvas descartáveis,

assim como de material previamente esterilizado para garantir a higiene e sua segurança. Os

benefícios que você terá na participação serão indiretos e relacionados a um melhor

conhecimento a respeito das doenças bucais e, no caso das gestantes, quais as possíveis

complicações para a grávida e seu bebê.

mailto:[email protected]

70

Será realizada uma coleta única de sangue por punção venosa no antebraço para dosar

os hormônios estradiol e progesterona. A coleta vai ocorrer na mesma oportunidade em que

serão realizados os seus exames de rotina de pré-natal ou ginecológica, evitando-se punção

exclusivamente para este fim. A data e horário para a realização destes exames serão agendados

pela secretária do ambulatório de medicina e a coleta será executada por um técnico de

enfermagem nas dependências do laboratório de análises clínicas do Hospital Geral

Universitário ou no posto de coleta do ambulatório de medicina da UNIC Beira Rio.

As informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em nenhum

momento. Não haverá qualquer tipo de constrangimento ou coação para o preenchimento deste

termo de consentimento, sendo dada total liberdade de recusar a participar em qualquer tempo.

Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos resultados será feita de forma a

não identificar os voluntários. Ainda essa coleta não trará nenhuma alteração ou prejuízo na

paciente ou no bebê, visto que não haverá procedimento invasivo.

Caso seja detectado algum problema de saúde bucal que exija atendimento

odontológico, você será devidamente orientado(a) procurar tratamento na Faculdade de

Odontologia da UNIC, sendo as gestantes encaminhadas à Clínica de Pacientes Especiais e as

não gestantes para a Clínica de Atenção Básica.

Nome e assinatura do pesquisador (a)

_______________________________________________

CONSENTIMENTO DE PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO

Eu,__________________________________________________________RG:_____

____________CPF _________________________, número do prontuário:

____________________, abaixo assinado, concordo em participar do estudo “Pré-Natal

Odontológico: Integração da Odontologia e Medicina”, como sujeito. Fui devidamente

informado (a) e esclarecido (a) pelo(a) pesquisador (a) _____________________ sobre a

pesquisa, os procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios

decorrentes de minha participação. Foi me garantido que posso retirar meu consentimento a

qualquer momento, sem que isso leve á qualquer penalidade ou interrupção de meu

acompanhamento, assistência ou tratamento. Local:___________________________ Data:_____________________

Nome e assinatura do sujeito ou responsável: _________________________________________

Presenciamos a solicitação do consentimento e esclarecimento sobrea pesquisa e a aceitação do sujeito

em participar.

Nome:__________________________________________________Assinatura_________________

Nome: _________________________________________________ Assinatura_________________

71

ANEXO 3

72

73

74

ANEXO 4

Documents

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU …repositorio.pgsskroton.com.br/bitstream/123456789/14287/1/RENATA... · todos os dias o que realmente importa em nossas vidas. ... “Ainda