Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado em ...repositorio.pgsskroton.com.br/bitstream/123456789/14286/1/MARIA... · enveredando em novos horizontes da pesquisa. Agradeço

Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado em Biociência Animal

MARIA LÚCIA APARECIDA SPANGA VIEIRA DOS SANTOS

PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-Leptospira spp. EM CÃES DA REGIÃO DO PANTANAL BRASILEIRO

Cuiabá 2018



Dissertação apresentada à UNIC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biociência Animal.

Orientador: Doutor Lázaro Manoel de Camargo Co-orientadora: Doutora Andréia Lima Tomé Melo

Cuiabá 2018

FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP)

Bibliotecária Elizabete Luciano /CRB1-2103

S238p Spanga, Maria Lúcia.

Pesquisa de Anticorpos ANTI-Leptospira spp. em Cães da Região do Pantanal Brasileiro. / Maria Lúcia Aparecida Spanga Vieira dos Santos. Cuiabá-MT, 2018.

50p. Inclui Lista de Figuras e Quadros.

Dissertação apresentada à UNIC – Universidade de Cuiabá, como requisito para obtenção do título de Mestre em Biociência Animal.

Orientador: Prof.Dr. Lázaro Manoel de Camargo Co-orientadora: Drª Andréia Lima Tomé Melo

1.Cães. 2.Leptospira spp. 3.Soroaglutinação Microscópica. 4.Pantanal.

CDU 619



Dissertação apresentada à UNIC, no Mestrado em Biociência Animal, área de concentração em Saúde Animal como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre, conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:

BANCA EXAMINADORA

___________________________________ Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo

UNIC

__________________________________ Prof.ª Dr.ª Andréia Lima Tomé Melo

UNIC

__________________________________ Prof.ª Dr.ª Ana Helena Benetti Gomes

UNIC

Cuiabá, 11 de Abril de 2018.

Dedico este trabalho à querida amiga Solange Atilho, pelo apoio incondicional nessa etapa acadêmica da minha vida, pelo abrigo na segurança do seu lar durante as estadias em Cuiabá, onde pude testemunhar a fé que move montanhas. Mateus 21:21

AGRADECIMENTOS

Ao meu Orientador Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo, pela confiança depositada no meu desempenho, pelo modo afetuoso e cordial que sempre demonstrou nos atendimentos as minhas inquietações, meu muito obrigada.

À minha co-orientadora Prof.ª Dr.ª Andréia Lima Tomé Melo, pela generosidade em fornecer todos os elementos necessários para esta Dissertação, por fazer de forma tão precisa a ponte entre as ciências biológicas e as ciências veterinárias, me enveredando em novos horizontes da pesquisa. Agradeço a presteza e profissionalismo que manteve em todo esse período.

À Coordenação do Mestrado em Biocência Animal, na pessoa do Prof. Marcelo Diniz dos Santos, que esteve sempre atento ao bom andamento da minha trajetória acadêmica, meu muito obrigada.

Meus agradecimentos ao Professor Doutor: Daniel Moura de Aguiar - Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, ao Professor Doutor: Sérgio Santos de Azevedo - Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, e ao Mestre e aluno de Doutorado: Diego Figueiredo da Costa - Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), pela disponibilização e análise do material biológico utilizado.

Aos meus colegas de turma e tantos outros que conheci dentro da instituição, agradeço os encontros cordiais.

RESUMO

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira, cuja importância mundial está no fato de acometer o homem e uma parcela razoável dos animais domésticos e selvagens. Embora haja estudos sobre este agente em algumas regiões do país, observa-se que no bioma do Pantanal as informações a respeito desta doença na população canina local são escassas. Pesquisas envolvendo animais domésticos podem complementar estudos epidemiológicos em saúde pública e, como no Brasil os cães possuem um convívio muito próximo com o ser humano, é evidente que dados obtidos sobre a doença nesses animais podem fornecer informações importantes a respeito da infecção. Nesse sentido, o presente estudo objetivou realizar a pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp. pela técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) em 429 amostras de soros de cães provenientes de quatro municípios (Poconé - MT, Santo Antônio de Leverger - MT, Barão de Melgaço - MT e Corumbá - MS) localizados na região do Pantanal Brasileiro, procurando determinar possíveis associações entre os resultados dos exames sorológicos e os questionários sanitários. Assim, do total de cães avaliados pela SAM (título ≥100), verificou-se que 34 (7,93%; IC 95%: 5,63%-11,00%) cães tinham anticorpos anti-Leptospira spp. Os títulos encontrados variaram entre 100 a 1600 e todos os municípios analisados tinham cães sororeagentes para o agente pesquisado. Do total de cães soreagentes, 1,25% (2/160) eram do ambiente urbano e 11,90% (32/269) eram do ambiente rural. A análise estatística mostrou que as variáveis habitat, área e idade (48-72 meses) estavam associadas com a ocorrência de anticorpos anti-Leptospira spp. nos cães avaliados (P < 0.05). Estes resultados demonstram que os cães da região pantaneira tiveram contato com agentes do gênero Leptospira, o que representa uma informação relevante para a saúde pública local, principalmente devido à implicação zoonótica da doença. Palavras-chave: Cães. Leptospira spp. Soroaglutinação Microscópica. Pantanal.

ABSTRACT

Leptospirosis is a zoonosis caused by bacteria of the genus Leptospira, whose worldwide importance lies in the fact that it affects man and a reasonable portion of domestic and wild animals. Although there are studies on this agent in some regions of the country, it is observed that in the Pantanal biome the information about this disease in the local canine population is scarce. Researches involving domestic animals may complement epidemiological studies in public health and, as in Brazil, dogs have a close relationship with humans, it is evident that data obtained on this disease in these animals can provide important information about this infection. In this sense, the present study aimed to verify the presence of anti-Leptospira spp. antibodies by the Microscopic Soroagglutination Test in 429 samples of dogs from four municipalities (Poconé - MT, Santo Antônio de Leverger - MT, Barão de Melgaço - MT e Corumbá - MS) located in the Brazilian Pantanal region, in order to determine possible associations between the results of the serological tests and health questionnaires. Thus, of the total number of dogs evaluated (titer ≥100), it was verified that 34 (7.93%, 95% CI: 5.63% -11.00%) dogs had antibodies against Leptospira spp. The titers found ranged from 100 to 1600 and all analyzed municipalities had seroreagent dogs for the investigated agent. Of the total of positive dogs, 1.25% (2/160) were from the urban environment and 11.90% (32/269) were from the rural environment. Statistical analysis showed that the variables habitat, area and age (48-72 months) were associated with the occurrence of anti-Leptospira spp. antibodies in the evaluated dogs (P <0.05). These results demonstrate that dogs from the Pantanal region had contact with agents of the genus Leptospira, which represents information relevant to local public health, mainly due to the zoonotic implication of the disease. Keyword: Dogs. Leptospira spp. Microscopic Soroagglutination. Pantanal.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Distribuição dos cães sororeagentes para Leptospira spp.

38

Tabela 2 – Distribuição dos prováveis sorovares infectatantes e titulações de anticorpos anti-Leptospira spp. encontrados nos cães dos munípios analisados

39

Tabela 3 Análise das variáveis e os resultados da SAM (≥100) nos cães da região do Pantanal.

43

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Gama de hospedeiros para alguns isolados de sorogrupos comuns de Leptospira spp. que infectam animais e o homem.

15

Quadro 2 – Estirpes de Leptospira spp. empregadas como antígenos no teste da Soroaglutinação Microscópica (SAM).

35

LISTA DE ABREVIATURAS

LPS Lipopolissacarídeo

SAM Soroaglutinação Microscópica

OMS Organização Mundial da Saúde

PCR Reação em Cadeia Pela Polimerase

DNA Ácido Desoxirribonucleico

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................12

2 REVISÃO DE LITERATURA: LEPTOSPIROSE ..................................................13

2.1 ETIOLOGIA..........................................................................................................13

2.2 EPIDEMIOLOGIA.................................................................................................14

2.2.1 Leptospirose canina........................................................................................16

2.2.2 Leptospirose nos animais de produção........................................................17

2.2.3 Leptospirose nos animais silvestres.............................................................18

2.3 PATOGENIA.........................................................................................................19

2.4 SINAIS CLÍNICOS................................................................................................20

2.5 DIAGNÓSTICO....................................................................................................21

2.6 TRATAMENTO E PROFILAXIA...........................................................................23

2.7 SAÚDE PÚBLICA.................................................................................................23

REFERÊNCIAS..........................................................................................................25

3 OBJETIVOS............................................................................................................30

3.1 OBJETIVO GERAL...............................................................................................30

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................30

4 ARTIGO

Pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp. em cães da região do Pantanal

Brasileiro...................................................................................................................31

RESUMO....................................................................................................................31

ABSTRACT................................................................................................................32

INTRODUÇÃO...........................................................................................................33

MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................................34

RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................36

CONCLUSÃO............................................................................................................44

REFERÊNCIAS..........................................................................................................45

12

1 INTRODUÇÃO

A leptospirose é uma doença zoonótica de importância mundial que acomete

muitas espécies de animais, e é causada pela infecção por espiroquetas do gênero

Leptospira, as quais são bactérias filamentosas, finas e flexíveis, que formam

espirais finos com extremidades em forma de gancho. Trata-se de uma enfermidade

de importância mundial que acomete o homem, animais domésticos e silvestres,

sendo responsável por perdas econômicas na agropecuária e com grande

repercussão na saúde pública (FÁVERO et al., 2002; BATISTA et al., 2005;

GREENE, 2015).

A bactéria tem distribuição cosmopolita e sua ocorrência tem forte

associação com períodos de elevados índices pluviométricos (ACHA; SZYFRES,

1986; PLANK; DEAN, 2002). Na presença de hospedeiros e, em condições

ambientais favoráveis, as leptospiras podem permanecer por semanas ou meses em

regiões tropicais e subtropicais (PLANK; DEAN, 2002).

Nesse sentido, o Pantanal, que é um bioma caracterizado por ser a maior

planície alagável do planeta, alberga uma grande diversidade de fauna e propicia

condições ecológicas favoráveis ao desenvolvimento do gênero Leptospira, em

virtude da possibilidade da bactéria sobreviver por mais tempo em áreas alagadas e

com elevadas temperaturas (LINS et al., 1986; ALHO et al., 1987). Nas últimas

décadas, a região do Pantanal tem sido citada em estudos epidemiológicos e

sorológicos de leptospirose para animais de produção e silvestres (RIBEIRO et al.,

1999; FÁVERO et al., 2002; GIRIO et al., 2003; VIEIRA et al., 2011; ROMANI, 2012).

Sabe-se que o rato de esgoto (Rattus novergicus) e o cão (Canis lupus

familiaris) são os principais reservatórios deste patógeno no ambiente urbano

(SUEPAUL et al., 2010). Assim, a relação estreita entre cães e os homens ao longo

da história, faz com que a espécie tenha um papel importante na epidemiologia da

doença (MELLO; MANHOSO, 2007; GHNEIM et al., 2007; BATISTA et al., 2005).

Apesar da grande relevância dos cães na epidemiologia da leptospirose,

estudos sobre o gênero Leptospira nesses animais na região pantaneira são

escassos. Além disso, a beleza proporcionada pela paisagem pantaneira cativa

pessoas de todo o mundo e resulta num afluxo de turistas para a região. Aliado a

isso, há também a ocupação humana local e o convívio próximo entre o ser humano

13

e os cães, o que justifica a realização de pesquisas que enfoquem e busquem dados

sobre saúde animal. Ademais, investigações nesse âmbito são necessárias para o

estabelecimento de práticas de controle e profilaxia em relação a este agente nos

cães da região, considerando a forte influência ambiental dos ritmos que o sistema

hídrico pantaneiro pode exercer sobre a disseminação desta bactéria, o que poderia

comprometer a saúde pública regional em função do caráter zoonótico desta

doença.

2 REVISÃO DE LITERATURA: LEPTOSPIROSE

2.1 ETIOLOGIA

O agente etiológico da leptospirose pertence à ordem Spirochaetales, família

Leptospiraceae, gênero Leptospira. Classicamente, o gênero foi dividido em duas

espécies: Leptospira interrogans - lato sensu, que contém todas as cepas

patogênicas, e Leptospira biflexa sensu lato, que contém todas as cepas saprofíticas

do ambiente. Nesses dois grupos de leptospiras foram identificados diferentes

sorovares, com base na reatividade humoral distinta a diferentes componentes de

carboidratos no lipopolissacarídeo da membrana externa. A variante sorológica ou

sorovar é a menor unidade taxonômica do gênero; os sorovares são microrganismos

antigenicamente e, com frequência, epidemiologicamente distintos em determinada

espécie (GREENE, 2015).

Sorotipos que são antigenicamente relacionados têm sido tradicionalmente

agrupados em sorogrupos (KMETY; DIKKEN, 1993). Segundo a classificação

taxonômica clássica, com base em sorogrupos e sorovares e na patogenicidade, as

leptospiras podem ser divididas em dois grandes grupos: patogênicas e saprófitas.

As patogênicas, que podem infectar o homem e os animais são: Leptospira

interrogans, L. borgpetersenii, L. inadai, L. kirschneri, L. noguchii, L. weillii e L.

santarosai; possuem mais de 200 sorovares agrupados em 23 sorogrupos. As

espécies saprófitas de vida livre são: L. biflexa, L. wolbachii e L. hollandia; possuem

38 sorovares agrupados em 6 sorogrupos, estas são encontradas principalmente em

14

água doce, e os registros de infecção no homem e animais são raros (FAINE, 1982;

ACHA; SZYFRES, 1986; KMETY; DIKKEN, 1993).

Com o advento dos métodos genéticos, microrganismos do gênero Leptospira

foram classificados em 20 genomoespécies com base na sua relação genética.

Nessa nova classificação genética, as espécies estão classificadas em patogênicas

(L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii, L. alexanderi, L. weilii, L. borgpetersenii, L.

santarosai, L. kmetyi, L. canicola, L. grippotyphosa, L. icterohaemorrhagiae e L.

pomona), oportunistas/intermediárias (L. inadai, L. fainei, L. broomii, L. licerasiae e L.

wolffii) e não patogênicas (L. biflexa, L. meyeri e L. wolbachii) (GENOVEZ, 2016).

As leptospiras são bactérias filamentosas, finas e flexíveis (0,1 a 0,2 μm de

largura e 6 a 12 μm de comprimento) que formam espirais finos com extremidades

em forma de gancho, e com a presença de dois filamentos axiais de constituição

protéica denominados de flagelos periplasmáticos, os quais são responsáveis pela

motilidade rotacional do microrganismo. São constituídas de membrana

citoplasmática e parede celular de peptídeoglicano, bem como por uma membrana

externa com porção fosfolipídica e outra de lipopolissacarídeo (LPS).

São bactérias aeróbicas sendo que as estirpes patogênicas são isoladas

entre 28 a 30 ºC e as saprófitas entre 11 e 13 ºC, em pH de 7,2 a 7,6. Meios

líquidos, semissólidos e sólidos são empregados no cultivo bacteriano. São bem

visualizadas por iluminação de campo escuro ou contraste de fase e não se coram

bem pela técnica de Gram. Esses microrganismos não resitem a ambientes secos,

radiação solar direta, pH ácido (< 6) e elevada salinidade. Podem ser preservadas

em temperaturas de -70 ºC e em nitrogênio líquido (- 196 ºC) (GENOVEZ, 2016).

2.2 EPIDEMIOLOGIA

A bactéria está mundialmente distribuída e sua ocorrência tem forte




regiões tropicais e subtropicais (PLANK; DEAN, 2002). Nas regiões que apresentam

clima seco, ocorrem infecções acidentais próximas aos corpos d’água represados,

15

com altas concentrações de animais no seu entorno, e em regiões temperadas, as

infecções são sazonais e ocorrem com maior frequência nos meses chuvosos

(SZYFRES, 1976). A infecção pode disserminar-se entre a mesma espécie animal e

entre espécies diferentes, de maneira cíclica. Urina, fetos abortados, placentas,

descargas cervicovagianis, e sêmen são as principais vias de eliminação do

patógeno. De maneira geral as portas de entrada da bactéria no organismo

hospedeiro se dão em pele íntegra ou lesionada com abrasões e na mucosa

conjuntiva, nasofaríngea e genitourinária (GENOVEZ, 2016).

Os estudos epidemiológicos realizados mostraram que as preferências

quanto ao hospedeiro podem mudar com o passar do tempo e região geográfica. Os

sorovares são mantidos na natureza por numerosos reservatórios em mamíferos

silvestres e domésticos com infecção subclínica ou hospedeiros de manutenção, que

atuam como fonte potencial de infecção da doença para os seres humanos e outros

hospedeiros animais acidentais. Os hospedeiros acidentais infectados desenvolvem

doença clínica mais grave e eliminam os microrganismos por um período mais curto

do que os hospedeiros reservatórios (GREENE, 2015) (Quadro 1).

Sorogrupo selecionado

Principal reservatório Conhecido

Hospedeiros acidentais

Outros animais

domésticos

Animais silvestres representativos

Cão Gato Humano

Bratislava Rato, suíno, equino?

+ – + Bovino,equino. Camundongo, porco-espinho, raposa, marsupial.

Autumnalis Camundongo. + – + Bovino. Rato, guaxinim, gambá, marsupial.

Icterohaemor_ rhagiae

Rato. + + + Bovino, suíno, cobaia.

Gambá, raposa, macaco.

Pomona Bovino, suíno, gambá.

+ + + Caprino, coelho.

Camundongo, porco-espinho, lobo, cervo, raposa.

Canicola Cão. + + + Bovino, equino, suíno.

Rato, tatu, porco-espinho, marsupial.

Batavia Cão, rato, camundongo.

+ + + Bovino. Porco-espinho, rato, tatu.

Hardjo Bovino. + – + Suíno, equino. Bovidae silvestres.

Australis Rato. + – + Cão. Marsupial.

Zanoni Rato. + – + Bovino, cão. Marsupial.

Grippotyphosa Rato, gambá. + + + Bovino, suíno, caprino.

Bovino, suíno, caprino, cobaia.

Quadro 1 – Gama de hospedeiros para alguns isolados de sorogrupos comuns de Leptospira spp. que infectam animais e o homem. Fonte: adaptado de Doenças infecciosas em cães e gatos (GREENE, 2015).

16

2.2.1 Leptospirose canina

Entre os animais domésticos, a principal fonte de infecção da leptospirose

para a população humana é o cão, em consequência do contato direto com os seres

humanos podendo esses animais eliminar leptospiras vivas através da urina durante

meses, mesmo sem apresentar sinais clínicos (FAINE et al., 1999).

São transmitidas entre hospedeiros por contato direto ou, mais comumente,

indireto. A transmissão direta ocorre por meio de contato com urina infectada,

transferência venérea e placentária, ferida de mordedura ou ingestão de tecidos

infectados. As aglomerações de animais, como as observadas em canis,

teoricamente poderiam ser consideradas como risco ambiental de infecção; todavia,

essa transferência não foi bem documentada (GREENE, 2015; MELLO; MANHOSO,

2007; FAINE et al., 1999; KMETY; DIKKEN, 1993).

Em algumas regiões geográficas, existe um aumento aparente na incidência

sazonal da leptospirose canina no final do verão e no outono, ou nas regiões com

estações frias e chuvosas no inverno. Existem vários cenários para a ocorrência

geográfica e temporal da leptospirose em cães, e foram feitas observações

semelhantes para a doença nos seres humanos. Devido à necessidade de água, a

incidência da doença ou os surtos frequentemente aumentam durante períodos de

maior pluviosidade ou enchentes, respectivamente, sobretudo em regiões tropicais

(GREENE, 2015).

Os sorovares mais prevalentes encontrados em pesquisa e que

determinaram a situação da leptospirose canina no Brasil foram Canicola,

Copenhageni, Icterohaemorrhagiae seguido pelo Autumnalis (MELLO; MANHOSO,

2007).

Os roedores são considerados os principais reservatórios da infecção, sendo

o rato de esgoto (Rattus novergicus) e os cães (Canis lupus familiaris) os principais

reservatórios da leptospirose no ambiente urbano. Estudos indicam que os

sorovares presentes nos roedores em um determinado local são semelhantes aos

encontrados em cães que cohabitam o mesmo ambiente (SUEPAUL et al., 2010).

A relação estreita entre cães e os homens ao longo da história, faz com que

a espécie tenha um papel importante na transmissão da doença, pois mantém a

bactéria por longo período nos rins, eliminando o patógeno através da urina sem

17

apresentar sinais clínicos, ou até mesmo após a melhora clínica (MELLO;

MANHOSO, 2007; BATISTA et al., 2005). Cães são bons sentinelas para detectar a

presença de leptospirose no ambiente (GHNEIM et al., 2007) e são representantes

chave para o entendimento da epidemiologia da doença, sendo que o diagnóstico e

tratamento dos animais doentes são importantes para se evitar a infecção humana

(OLIVEIRA, 2010).

2.2.2 Leptospirose nos animais de produção

Os bovinos são reservatórios naturais da sorovariedade Hardjo, sendo a

Leptospira borgpetersenii sorovar Hardjobovis a mais comum entre esses animais,

enquanto a Leptospira interrogans sorovar Hardjoprajitno também é encontrada em

algumas partes do mundo. Ambas as sorovariedades possuem a habilidade de

colonizar e persistir no trato reprodutor de vacas e touros, sugerindo a possibilidade

da transmissão venérea. Em vacas prenhes, o agente pode ser encontrado no útero,

levando a abortamento, natimortalidade e doença neonatal (ELLIS, 2015). Já em

relação à leptospirose em ovinos e caprinos observa-se que os sorovares mais

prevalentes são: Pomona, Autumnalis, Sejroe, Icterohaemorragiae, Gripotyphosa e

Ballum (OLIVEIRA; ARSKY; CALDAS, 2013).

Em equinos de diversos países a sorologia para leptospirose tem se mostrado

bastante variável, não demonstrando a ocorrência de um sorovar preferencial.

Consequentemente, a incidência de cada sorovar de Leptospira spp. varia conforme

as características regionais. Em éguas gestantes é comum o relato de reabsorção

embrionária precoce, abortos no terço final da gestação ou nascimento de potros

prematuros e fracos (THOMASSIAN, 2005).

Já nos suínos, os sorovares de leptospiras mais comumente encontrados, e

causadores da doença são: Pomona, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Canicola,

Gryppotyphosa, Bratislava e Muenchen (SOBESTIANSKY et al., 1999). A

leptospirose está classificada como uma doença de grande importância do ponto de

vista sócio-econômico e/ou sanitário, com considerável repercussão no comércio de

animais e produtos de origem animal (NAVES et al., 2012).

18

2.2.3 Leptospirose nos animais silvestres

Diferentes investigações têm descrito a importância dos animais silvestres

como organismos vitais no ciclo epidemiológico de enfermidades que atingem o

homem e animais domésticos (CUTLER; FOOKS; VAN DER POEL, 2010; PAVLIN;

SCHLOEGEL; DASZAK, 2009). Estima-se que 60% de dos patógenos emergentes

são zoonóticos e que 70% tem origem na fauna silvestre (CUTLER; FOOKS; VAN

DER POEL, 2010).

Animais exercem importante papel na epidemiologia da leptospirose, na

quais as espécies silvestres são susceptíveis a infecção por uma ampla variedade

de sorovares do gênero Leptospira (LILENBAUM et al., 2005; CHAPMAN;

GILLESPIE; GOLDBERG, 2005).

Nas últimas décadas a região do bioma do Pantanal tem sido citada em

estudos epidemiológicos e sorológicos de leptospirose para animais de produção e

silvestres (RIBEIRO et al., 1999; FÁVERO et al., 2002; GIRIO et al., 2003; VIEIRA et

al., 2011; ROMANI, 2012).

Estudos sobre a presença de leptospiras em animais silvestres e

sinantrópicos foram realizados em roedores, edentatas, carnívoros, artiodáctilos e

primatas, os quais podem atuar como fonte de infecção e potenciais disseminadores

dos diferentes sorovares de Leptospira spp. (OLIVEIRA et al., 2013). No Pantanal,

EMBRAPA, (1999) relacionou o porco monteiro com a ocorrência da sorovariedade

Tarassovi em bovinos, devido à estreita relação entre as duas populações e

considerou os equinos da região como a segunda espécie doméstica em maior

densidade no Pantanal.

Um estudo realizado no Pantanal sul-matogrossense com animais silvestres,

utilizou as técnicas sorológicas e moleculares para a detecção de sorovares

predominantes entre as espécies: Pomona e Butembo para veado campeiro

(Ozotoceros bezoarticus); Hardjo para cachorro do mato (Cerdocyon thous),

Icterohaemorrhagiae para jaguatirica (Leopardus pardalis) e Pomona para quati

(Nasua nasua) (VIEIRA et al., 2011).

19

2.3 PATOGENIA

No caso da leptospirose canina observa-se que as bactérias penetram nas

mucosas das vias digestiva, respiratória e genital ou na pele íntegra, escoriada,

arranhada ou amolecida pela água. Uma vez dentro do ambiente mais aquecido do

corpo de um mamífero, ocorrem alterações de transcrição que intensificam a

patogenicidade da espiroqueta (LO et al., 2006; MATSUNAGA et al., 2006;

PALANIAPPAN; RAMANUJAM; CHANG, 2007). Após penetrar no organismo, a

bactéria dissemina-se pela circulação sanguínea e multiplica-se ativamente no

endotélio vascular, sistema linfático, líquor e órgãos parenquimatosos (rins, baço,

pumões, fígado, olhos, trato genitourinário e sistema nervoso central), dando início a

um quadro agudo septicêmico, com sinais clínicos pouco específicos, denominado

de leptospiremia (ACHA, 2003).

O período de incubação é de 5 a 10 dias, no qual o organismo responde

imunologicamente pelo sistema de defesa, onde as células T e células B

dependentes são estimuladas. A gravidade da leptospirose pode ser associada com

a intensidade da resposta imunitária humoral (FONSECA, 2012). A fagocitose tem

início e a maioria das leptospiras é digerida nos vacúolos de macrófagos e netrófilos,

sendo que essa atividade fagocítica das células polimorfonucleadas é iniciada por

anticorpos opsonizantes (SAMBASIVA et al., 2003). Após essa fase de fagocitose

das bactérias, elas passam a se albergar nos túbulos renais, onde o sistema

imunológico tem maior dificuldade de atuação e inicia-se a fase leptospiúrica, onde

haverá a eliminação do microrganismo pela urina (FONSECA, 2012). A eliminação

renal da bactéria ocorre desde 72 horas após a infecção até semanas a meses em

animais domésticos e por toda a vida em roedores (PAES, 2016).

A aderência de fagócitos, a liberação de citocinas e a agregação plaquetária

somadas à intensa multiplicação bacteriana no endotélio vascular resultam em

quadros hemorrágicos, edema, congestão e vasculite generalizados. A colonização

renal determia lesões nas células do epitélio tubular e edema do parênquima, com

consequente redução da perfusão renal, levando a um quadro de insuficiência renal

aguda. Há também hepative em função da ação das toxinas produzidas pelo

patógeno, além de vasculite, hemorragia pulmonar, uveíte e meningite (PAES,

2016).

20

Já em relação à patogenia da leptospirose nos animais de produção, após a

penetração, as leptospiras patogênicas percorrem as vias linfáticas e disseminam-se

pelo organismo do animal acometendo principalmente os pulmões, fígado e baço,

multiplicando-se por cerca de uma semana. Em fêmeas gestantes, a bactéria pode

atravessar a placenta e chegar ao feto em qualquer fase da gestação, causando

perdas embrionárias, abortamentos, natimortalidade e nascimento de crias

debilitadas. Além disso, observa-se lesão direta das células endoteliais de pequenos

vasos, resultando em hemorragia disseminada. As lesões aparecem entre 48 e 72

horas da infecção, acompanhadas por petéquias e segue-se então, a fase de

leptospiremia, com estágio febril. Nos bovinos infectados, o tempo necessário para o

estabelecimento de lesões varia conforme a dose, a virulência e a toxicidade da

bactéria infectante (GENOVEZ, 2016).

2.4 SINAIS CLÍNICOS

Em cães com leptospirose observa-se, na fase aguda da doença, a

presença de apatia, anorexia, letargia, febre (39,5 °C a 40 °C), calafrios e

hipersensibilidade muscular generalizada. Subsequentemente, ocorrem vômitos,

desidratação rápida e colapso vascular periférico, além de taquipneia, pulso rápido e

irregular e perfusão capilar deficiente. Os defeitos da coagulação e a lesão vascular

são aparentes, como hematêmese, hematoquezia, melena, epistaxe e petéquias

disseminadas.

Os cães com doença terminal ficam deprimidos e apresentam hipotermia,

não havendo tempo para o desenvolvimento de insuficiência renal e hepática. As

infecções subagudas caracterizam-se por anorexia, vômitos, desidratação e

aumento da sede.

Em muitos cães com leptospirose subaguda, a temperatura retal encontra-se

na faixa de referência. A relutância em se mover e a hiperestesia paraspinal podem

resultar de inflamação muscular, meníngea ou renal. É possível que ocorra perda de

peso, habitualmente associada a uma redução da ingestão de alimento em

consequência da hiperestesia associada à inflamação, ou da uremia (GREENE,

2015).

21

Há também a presença de icterícia na esclera, mucosas conjuntival, oral e

genital e em áreas mais claras da pele, como pavilhão auricular e abdômen. A urina

adquire coloração escura e redução da frequência de micção, naa uscultação

pulmonar indica a ocorrência de pneumonia e pleurite (PAES, 2016).

Já os bovinos com leptospirose apresentam um quadro clínico caracterizado

por infertilidade, abortamentos, natimortalidade, nascimento de bezerros fracos e

portadores renais e mastite flácida em bovinos leiteiros. E nos equinos, dependendo

do sorovar infectante, pode haver tanto manifestação reprodutiva quanto sistêmica.

Em relação aos suínos nos animais jovens observa-se febre anorexia, conjuntivite,

icterícia hemoglobinúria e distúrbios neurológicos, enquanto que nos adultos o

abortamento é muito comum (GENOVEZ, 2016).

2.5 DIAGNÓSTICO

O diagnóstico da leptospirose pode ser realizado pela demonstração do

agente (métodos diretos) e por métodos indiretos (provas sorológicas) do agente ou

do material genético (SARMENTO et al., 2012; FAINE et al., 1999; SANTA ROSA;

PESTANA 1963). Entre as provas indiretas mais utilizadas temos a pesquisa de

anticorpos, que podem ser detectados no sangue aproximadamente de 5 a 7 dias

após o início dos sintomas, bem com o cultivo do agente etiológico e o isolamento

(GRENNE, 2015)

A Soroaglutinação Microscópica (SAM) é uma técnica de diagnóstico

baseada na detecção de anticorpos, sendo o método considerado como prova

padrão ouro pela Organização Mundial da Saúde (OMS). A SAM com antígenos

vivos é a mais utilizada em todo o mundo e baseia-se em primeiro lugar na reação

entre anticorpos presentes no soro contra os antígenos encontrados na superfície da

bactéria (FAINE et al., 1999; LEVETT, 2001).

Diversos fatores afetam a especificidade e a sensibilidade desta prova, tais

como: coleção de estirpes empregadas como antígenos, idade e densidade dos

cultivos, diluição inicial dos soros, temperatura e tempo de incubação (FÁVERO et

al., 2002).

22

A recomendação oficial para a prova da SAM aplicada à leptospirose é que

a coleção de antígenos empregada contenha um representante por sorogrupo

(SARMENTO et al., 2012), sendo importânte o acrécimo de sorovares autóctones da

região, que ampliaria a capacidade discriminadora do teste (BROD et al., 2005).

Já a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) é um diagnóstico precoce

da leptospirose no homem e em espécies animais que tem uso crescente, pois a

técnica apresenta alta sensibilidade e especificidade, permitindo amplificar partes

mínimas do DNA de um microrganismo provenientes de amostras biológicas

diversas, como humor aquoso, urina, soro sanguíneo, líquor, e tecidos,

respectivamente (BAL et al., 1994; BROWN et al., 1996; BROWN et al., 2003;

ROMERO et al., 1998).

Mas a PCR tem com limitação a incapacidade de identificar o sorovar

infectante, e embora isso não seja significativo para o paciente, a identificação do

sorovar tem valor importância epidemiológica em se tratando de saúde pública

(LEVETT, 2004).

A sensibilidade da PCR pode variar de acordo com a escolha dos pares de

oligonucleotídeos iniciadores, padronização dos reagentes empregados na técnica,

seleção do material biológico, forma de conservação e tempo de estocagem da

amostra, uma vez que o DNA pode facilmente sofrer degradação (VELOSO et al.,

2000). Anahi et al. (2013) compararam o desempenho das técnica SAM e PCR em

um levantamento da infecção por Leptospira spp. em mamíferos silvestres do

Pantanal sul-matogrossense, e apesar de não terem encontrado diferença

significativa entre as duas técnicas, os autores concluem que cada técnica pode ser

utilizada em momentos diferentes de acordo com as circunstâncias.

Outro método de diagnóstico é a microscopia de campo escuro que baseia-

se na visualização direta da espiroqueta na urina de animais suspeitos. No entanto,

em virtude da necessidade de um microscópio adequado, operador treinado e

quantidade mínima de bactérias viáveis (105 leptospiras/ml), o método apresenta

entre 30 a 60% de sensibilidade e cerca de 60 a 80% de especificidade (GENOVEZ,

2016).

Há também a possibilidade de isolamento do agente com identificação do

sorogrupo/sorovar responsável pela infecção por meio do sangue, derrames

cavitários, urina, fígado e rins colocados em meios seletivos para cultivo

microbiológico (PAES, 2016).

23

2.6 TRATAMENTO E PROFILAXIA

A eficácia do tratamento da leptospirose canina depende do diagnóstico

precoce da doença, sendo que a instituição de terapia na fase inicial da doença traz

bons resultados. De maneira geral, o tratamento inclui o uso de antimicrobianos, na

qual o tratamento de suporte para animais com leptospirose depende da gravidade

da infecção e da existência de disfunção renal e hepática, bem como de outros

fatores que causam complicações (GREENE, 2015).

No caso dos animais de produção é também indicado a utilização de

antimicrobianos. Entretanto, a relação custo/benefício da antibioticoterapia deve

levar em conta o valor dos animais, o destino do rebanho e o tipo de criação, sendo

que o tratamento é sempre recomendável quando houver risco de transmissão aos

humanos (GENOVEZ, 2016).

A prevenção da leptospirose envolve o combate aos roedores, higienização

periódica das instalações, quarentena para animais recém-adquiridos e isolamento e

tratamento dos animais doentes. A vacinação também é uma importante medida

profilática, pois as vacinas comerciais contra leptospirose são efetivas em reduzir a

ocorrência da doença e a gravidade da sintomatologia clínica (PAES, 2016).

2.7 SAÚDE PÚBLICA

A leptospirose é uma importante zoonose com distribuição mundial e a

incidência da leptospirose humana tem crescido em países da América Latina

associada aos desastres naturais e ao crescimento desordenado das cidades

(OLIVEIRA; GUIMARÃES, 2009). Os sorovares que mais acometem humanos são

Icterohaemorrhagiae e Canicola. A bactéria é transmitida dos animais para os

humanos direta ou indiretamente, através do contato com a urina infectada de

roedores, animais domésticos ou silvestres, bem como pelo consumo de água e

alimentos contaminados. Nesse sentido, os cães têm papel importante na

transmissão do patógeno para os humanos em virtude do contato com urina ou

sangue de animais doentes ou portadores. Também pode ser observado o caráter

24

ocupacional da doença em humanos, principalmente aquelas pessoas que estão em

contato direto com excretas, carcaças e fetos abortados de animais de produção,

especialmente bovinos e suínos (PAES, 2016; GENOVEZ, 2016).

25

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30

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Realizar a pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp. em cães da região do

Pantanal Brasileiro.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar a pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp. pela técnica de

Soroaglutinação Microscópica (SAM) em cães dos municípios de Poconé/MT,

Santo Antônio de Leverger/MT, Barão de Melgaço/MT e Corumbá/MS.

Determinar possíveis associações entre os resultados dos exames sorológicos e

os questionários sanitários que podem ser relevantes para o desenvolvimento da

infecção pelo agente pesquisado.

31


A survey of anti-Leptospira spp. antibodies in dogs from the Brazilian Pantanal Region

RESUMO

SPANGA, M.L. Pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp. em cães da região do Pantanal Brasileiro. 2018. Dissertação (Mestrado em Biocência Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2018.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira, cuja importância mundial está no fato de ela acometer o homem e uma parcela razoável dos animais domésticos e selvagens. Embora haja estudos sobre este agente em algumas regiões do país, observa-se que no bioma do Pantanal as informações a respeito desta doença na população canina local são escassas. Pesquisas envolvendo animais domésticos podem complementar estudos epidemiológicos em saúde pública e, como no Brasil os cães possuem um convívio muito próximo com o ser humano, é evidente que dados obtidos sobre a doença nesses animais podem fornecer informações importantes a respeito da infecção. Nesse sentido, o presente estudo objetivou realizar a pesquisa de anticorpos anti-Leptospira spp. pela técnica de Soroaglutinação Microscópica (SAM) em 429 amostras de soros de cães provenientes de quatro municípios (Poconé - MT, Santo Antônio de Leverger - MT, Barão de Melgaço - MT e Corumbá - MS) localizados na região do Pantanal Brasileiro, procurando determinar possíveis associações entre os resultados dos exames sorológicos e os questionários sanitários. Assim, do total de cães avaliados pela SAM (título ≥100), verificou-se que 34 (7,93%; IC 95%: 5,63%-11,00%) cães tinham anticorpos anti-Leptospira spp. Os títulos encontrados variaram entre 100 a 1600 e todos os municípios analisados tinham cães sororeagentes para o agente pesquisado. Do total de cães soreagentes, 1,25% (2/160) eram do ambiente urbano e 11,90% (32/269) eram do ambiente rural. A análise estatística mostrou que as variáveis habitat, área e idade (48-72 meses) estavam associadas com a ocorrência de anticorpos anti-Leptospira spp. nos cães avaliados (P < 0.05). Estes resultados demonstram que os cães da região pantaneira tiveram contato com agentes do gênero Leptospira, o que representa uma informação relevante para a saúde pública local, principalmente devido à implicação zoonótica da doença. Palavras-chave: Cães. Leptospira spp. Soroaglutinação Microscópica. Pantanal.

32

ABSTRACT

SPANGA, M.L. A survey of anti-Leptospira spp. antibodies in dogs from the Brazilian Pantanal Region. 2018. Dissertation (Master Animal Bioscience) - University of Cuiabá, Cuiabá, 2018. Leptospirosis is a zoonosis caused by bacteria of the genus Leptospira, whose worldwide importance lies in the fact that it affects man and a reasonable portion of domestic and wild animals. Although there are studies on this agent in some regions of the country, it is observed that in the Pantanal biome the information about this disease in the local canine population is scarce. Researches involving domestic animals may complement epidemiological studies in public health and, as in Brazil, dogs have a close relationship with humans, it is evident that data obtained on this disease in these animals can provide important information about this infection. In this sense, the present study aimed to verify the presence of anti-Leptospira spp. antibodies by the technique of Microscopic Soroagglutination in 429 samples of dogs from four municipalities (Poconé - MT, Santo Antônio de Leverger - MT, Barão de Melgaço - MT e Corumbá - MS) located in the Brazilian Pantanal region, in order to determine possible associations between the results of the serological tests and health questionnaires. Thus, of the total number of dogs evaluated (titer ≥100), it was verified that 34 (7.93%, 95% CI: 5.63% -11.00%) dogs had antibodies against Leptospira spp. The titers found ranged from 100 to 1600 and all analyzed municipalities had seroreagent dogs for the investigated agent. Of the total of positive dogs, 1.25% (2/160) were from the urban environment and 11.90% (32/269) were from the rural environment. Statistical analysis showed that the variables habitat, area and age (48-72 months) were associated with the occurrence of anti-Leptospira spp. antibodies in the evaluated dogs (P <0.05). These results demonstrate that dogs from the Pantanal region had contact with agents of the genus Leptospira, which represents information relevant to local public health, mainly due to the zoonotic implication of the disease. Keyword: Dogs. Leptospira spp. Microscopic Soroagglutination. Pantanal.

33

INTRODUÇÃO

A leptospirose é uma doença zoonótica de importância mundial que acomete

muitas espécies de animais, e é causada pela infecção por espiroquetas do gênero

Leptospira, as quais são bactérias filamentosas, finas e flexíveis, que formam

espirais finos com extremidades em forma de gancho. Trata-se de uma enfermidade

de importância mundial que acomete o homem, animais domésticos e silvestres,

sendo responsável por perdas econômicas na agropecuária e com grande

repercussão na saúde pública (FÁVERO et al., 2002; BATISTA et al., 2005;

GREENE, 2015).

A bactéria tem distribuição cosmopolita e sua ocorrência tem forte




regiões tropicais e subtropicais (PLANK; DEAN, 2002).

Nesse sentido, o Pantanal, que é um bioma caracterizado por ser a maior

planície alagável do planeta, alberga uma grande diversidade de fauna e propicia

condições ecológicas favoráveis desenvolvimento do gênero Leptospira, em virtude

da possibilidade da bactéria sobreviver por mais tempo em áreas alagadas e com

elevadas temperaturas (LINS et al., 1986; ALHO et al., 1987). Nas últimas décadas,

a região do Pantanal tem sido citada em estudos epidemiológicos e sorológicos de

leptospirose para animais de produção e silvestres (RIBEIRO et al., 1999; FÁVERO

et al., 2002; GIRIO et al., 2003; VIEIRA et al., 2011; ROMANI, 2012).

Sabe-se que o rato de esgoto (Rattus novergicus) e o cão (Canis lupus

familiaris) são os principais reservatórios deste patógeno no ambiente urbano

(SUEPAUL et al., 2010). Assim, a relação estreita entre cães e os homens ao longo

da história, faz com que a espécie tenha um papel importante na epidemiologia da

doença (MELLO; MANHOSO, 2007; GHNEIM et al., 2007; BATISTA et al., 2005).

Apesar da grande relevância dos cães na epidemiologia da leptospirose,

estudos sobre o gênero Leptospira nesses animais na região pantaneira são

escassos. Além disso, a beleza proporcionada pela paisagem pantaneira cativa

pessoas de todo o mundo e resulta num afluxo de turistas para a região. Aliado a

isso, há também a ocupação humana local e o convívio próximo entre o ser humano

34

e os cães, o que justifica a realização de pesquisas que enfoquem e busquem dados

sobre saúde animal. Ademais, investigações nesse âmbito são necessárias para o

estabelecimento de práticas de controle e profilaxia em relação a este agente nos

cães da região, considerando a forte influência ambiental dos ritmos que o sistema

hídrico pantaneiro pode exercer sobre a disseminação desta bactéria, o que poderia

comprometer a saúde pública regional em função do caráter zoonótico desta

doença.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem

Para execução deste trabalho foram avaliadas 429 (160 provenientes de área

urbana e 269 de área rural) amostras de soros de cães coletadas em um estudo

anterior, no período de 2009 a 2012, de quatro municípios localizados na região do

Pantanal: i) Poconé (16º 15' 24" S; 56º 37' 22" O); ii) Santo Antônio de Leverger (15º

51' 47" S; 56º 04' 47" O); iii) Barão de Melgaço (16º 11' 49" S; 55º 58' 03" O) e iv)

Corumbá (19º 00' 33"S; 57º 39' 44" O) (MELO et al., 2011; 2017).

As amostras de sangue dos cães foram colhidas por venopunção da jugular

para obtenção do soro e um questionário sanitário abrangente foi aplicado a cada

proprietário do cão que foi selecionado para a colheita de sangue. As informações

coletadas incluíram principalmente habitat (urbano ou rural), área (não alagável e

alagável), sexo e idade do animal (MELO et al., 2011; 2017).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Uso de Animais da

Universidade de Cuiabá (CEUA/UNIC), sob número de protocolo 008/2016.

Soroaglutinação Microscópica (SAM)

A Soroaglutinação Microscópica (SAM) é a técnica recomendada pela OIE

(2012), na qual os antígenos vivos utilizados foram mantidos em meio líquido

(EMJH, Difco, Detroit, MI, EUA) de acordo com os protocolos oficiais (ZUERNER,

2005) (Quadro 2).

35

Espécie Sorovar Sorogrupo Amostra de referência

L. biflexa Patoc Semaranga Patoc I (ATCC 23582)

L. borgpetersenii Ballum Ballum Mus 127

L. borgpetersenii Castellonis Ballum Castellon 3

L. borgpetersenii Javanica Javanica Veldrat Batavia 46

L. borgpetersenii Mini Mini Sari

L. borgpetersenii Tarassovi Tarassovi Perepelicin

L. borgpetersenii Whitcombi Celledoni Whitcomb

L. interrogans Australis Australis Ballico

L. interrogans Autumnalis Autumnalis Akiyami A

L. interrogans Bataviae Bataviae Van Tienen

L. interrogans Bratislava Australis Jez Bratislava

L. interrogans Canicola Canicola Hond Utrecht IV

L. interrogans Copenhageni Icterohaemorrhagiae M 20

L. interrogans Hardjo Sejroe Hardjoprajitno

L. interrogans Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis

L. interrogans Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae RGA

L. interrogans Pomona Pomona Pomona

L. interrogans Pyrogenes Pyrogenes Salinem

L. interrogans Wolffi Sejroe 3705

L. kirschneri Butembo Autumnalis Butembo

L. kirschneri Cynopteri Cynopteri 3522 C

L. kirschneri Grippotyphosa Grippotyphosa Moskva V

L. noguchii Panama Panama CZ 214 K

L. santarosai Guaricurus Sejroe Bov. G

L. santarosai Shermani Shermani 1342 K

Quadro 2 - Estirpes de Leptospira spp. empregadas como antígenos no teste da Soroaglutinação Microscópica (SAM).

As cepas de referência foram cultivadas em EMJH por 5-10 dias a 28 °C em

estufa DBO® (Eletrolab, São Paulo, São Paulo, Brasil) até o crescimento na

densidade de 1-2 x 108 leptospiras/mL. As culturas foram examinadas

microscopicamente para assegurar que estavam livres de autoaglutinação e

contaminação; e subculturas foram realizadas semanalmente para manutenção dos

cultivos. Para cada reação foi utilizado um controle negativo, empregando-se

solução salina tamponada (NaCl 0,9%) aos ensaios. Cada amostra de soro foi

inicialmente diluída a 1:50 em solução salina tamponada. Após esta etapa, uma

alíquota desta diluição contendo 50 μL foi adicionada em microplacas de vinil de

fundo plano contendo 96 poços (Costar, Corning, NY, EUA), e logo após, foi

acrescentado o mesmo volume de cada antígeno correspondente nos poços,

respeitado a marcação das placas, obtendo-se uma diluição final de 1:100. Cada

amostra sorológica foi testada frente à bateria antigênica compreendida por 24

sorovares. As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37 °C por 90

min. Cada amostra foi observada em microscopia de campo escuro e classificada de

36

acordo com os procedimentos descritos abaixo, conforme Martins e Lilenbaum

(2013).

As leituras foram realizadas em microscópico óptico (Zeiss, Standort

Göttingen, Vertrieb, Alemanha), com condensador seco de campo escuro, em

magnificação máxima de 200 vezes, observando-se a formação de aglutinações. As

amostras sorológicas foram inicialmente analisadas na diluição de 1:100 e, aquelas

que apresentavam nível de aglutinação igual ou superior a 50% foram então,

novamente diluídas numa razão geométrica de dois (1:200, 1:400 e 1:800). O título

sorológico foi representado para recíproca da maior diluição que apresentou

resultado positivo. O maior título alcançado foi utilizado para identificar o sorovar

infectante. Os animais foram considerados positivos quando apresentaram títulos

≥100.

Em decorrência da parceria estabelecida com a Universidade Federal de

Campina Grande (UFCG), as amostras foram processadas pela técnica de SAM na

Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária (UAMV), Centro de Saúde e Tecnologia

Rural (CSTR), Patos, Paraíba.

Análise estatística

O estudo de associação entre os resultados dos exames sorológicos e dos

questionários foi realizado a partir do teste do Qui-quadrado (2) ou Teste Exato de

Fischer, quando necessário, utilizando o programa EpiInfo 7.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Do total de cães avaliados pela SAM (título ≥100), verificou-se que 34 (7,93%;

IC 95%: 5,63%-11,00%) cães tinham anticorpos anti-Leptospira spp. O sorogrupo

mais frequente foi o Icterohaemorrhagiae com 19 (4,42%) animais sororeagentes,

seguido pelo Australis com 7 (1,63%). Os sorogrupos Tarassovi, Hebdomadis e

Autumnalis apresentaram 2 (0,46%) cães soropositivos cada um, enquanto que o

sorogrupo Grippotyphosa apenas 1 (0,23%). Em uma amostra não foi possível

37

determinar provável sorogrupo relacionado com a infecção, pois a mesma regiu

igualmente tanto para o sorovar Grippotyphosa quanto para o Copenhageni.

Neste estudo os títulos encontrados foram de 100 (n=2), 200 (n=11), 400

(n=17), 800 (n=2) e 1600 (n=2), e destes, somente um cão urbano tinha título de 200

e outro de 400; os demais eram todos de ambiente rural. Todos os muncípios

analisados tinham cães sororeagentes para Leptospira spp., e na Tabela 1 é

possível observar a distribuição dos cães sororreagentes para cada sorovar

considerando a maior titulação, e o provável sorogrupo infectante.

Já os sorovares detectados e as titulações encontradas de acordo com cada

local pesquisado estão sumarizados na Tabela 2.

38

Tabela 1 – Distribuição dos cães sororreagentes para Leptospira spp.

Amostra Título da amostra frente ao sorovar Provável sorovar

infectante Provável sorogrupo

infectante Hebdomadis Canicola Tarassovi Castellonis Autumnalis Bratislava Icterohaemorrhagiae Grippotyphosa Pomona Copenhageni

16

200

100 Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae 34

400

Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae

164

200

400

Grippotyphosa Grippotyphosa 165

100

Tarassovi Tarassovi

183

100

200 200 400

200 200 200 Bratislava Australis 191

200

800

Bratislava Australis

192

200

Bratislava Australis 194

400


195 100

Hebdomadis Hebdomadis 196 100

100

400


200 200

Hebdomadis Hebdomadis 201

200

Tarassovi Tarassovi

207

400

200 Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae 211

100

100 200 Copenhageni Icterohaemorrhagiae

225

100

100

200 Copenhageni Icterohaemorrhagiae 246 200

400 Copenhageni Icterohaemorrhagiae

294

200 Copenhageni Icterohaemorrhagiae 303

200

Autumnalis Autumnalis

321

100 200


100 200


329

100

200 200 200 200 400 200 400 Indeterminado Indeterminado 330

400

Autumnalis Autumnalis

331

200

400

400 800 Copenhageni Icterohaemorrhagiae 346

200

200


351

200

200

200 400 Copenhageni Icterohaemorrhagiae 354

100


360

100 400


100

200

200 100 200 400 Copenhageni Icterohaemorrhagiae

373

200

200

400

Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae 415

100

200

1600

400 400 Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae

416

200

400

1600

200 400 Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae 421

200


424

200

400

200 200 Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae 429

400


39

Tabela 2 – Distribuição dos prováveis sorovares infectatantes e titulações de anticorpos anti- Leptospira spp. encontrados nos cães dos munípios analisados.

Provável sorovar infectante

Poconé Santo Antônio de Leverger Barão de Melgaço Corumbá

Positivos/ testados (%)

Títulos detectados (nº de cães)







Icterohaemorrhagiae 4/319 (1,25) 200 (1), 400 (3) 0/16 (0) - 5/45 (11,11) 200 (1), 400 (2), 1600 (2) 1/49 (2,04) 400 (1)

Grippotyphosa 1/319 (0,31) 400 (1) 0/16 (0) - 0/45 (0) - 0/49 (0) - Tarassovi 2/319 (0,62) 100 (1), 200 (1) 0/16 (0) - 0/45 (0) - 0/49 (0) - Bratislava 4/319 (1,25) 200 (1), 400 (2), 800 (1) 0/16 (0) - 1/45 (2,22) 400 (1) 2/49 (4,08) 200 (2)

Hebdomadis 2/319 (0,62) 100 (1), 200 (1) 0/16 (0) - 0/45 (0) - 0/49 (0) - Copenhageni 4/319 (1,25) 200 (3), 400 (1) 2/16 (12,50) 400 (2) 2/45 (4,44) 400 (2) 1/49 (2,04) 800 (1) Autumnalis 1/319 (0,31) 200 (1) 0/16 (0) - 0/45 (0) - 1/49 (2,04) 400 (1)

Indeterminado 0/319 (0) - 0/16 (0) - 0/45 (0) - 1/49 (2,04) 400 (1)

40

O presente estudo demonstrou a presença de anticorpos anti-Leptospira spp.

em 34/429 (7,93%) cães de quatro municípios que pertencem ao bioma pantaneiro.

Trata-se de um levantamento sorológico relevante para a área de estudo já

que pesquisas sobre este agente na população canina do Pantanal ainda são

escassos. Há trabalhos que revelam a ocorrência de animais sororreagentes para

Leptospira spp. em outras regiões do Brasil, cujos resultados são bastante variáveis

(JOUGLARD; BROD, 2000; MASCOLLI et al., 2002; MAGALHÃES et. al., 2006;

AGUIAR et al., 2007; AZEVEDO et al., 2011; SANTOS et al., 2017).

Inquéritos sorológicos mostram a participação de vários sorovares na infecção

leptospírica canina (LANGONI et al., 2015), na qual os anticorpos formados no

animal são dirigidos contra o sorovar específico, no entanto, pode existir reações

cruzadas entre diferentes sorovares, e o cão ser reagente a vários sorovares

simultaneamente, dificultando a identificação do sorovar mais frequente

(HAGIWARA, 2003). Por esse motivo, quando um animal apresentou co-aglutinação

de dois ou mais sorovares, se considerou a sorovariedade de maior titulação como

um indicador da identidade do provável sorogrupo responsável pela infecção

(HASHIMOTO et al., 2010; LANGONI et al., 2015).

O sorogrupo mais frequente foi o Icterohaemorrhagiae com 19 (4,42%)

animais, dos quais 10 tiveram reação frente ao sorovar Icterohaemorrhagiae (2 cães

urbanos e 8 rurais) e 9 cães rurais reagiram ao sorovar Copenhageni. A presença do

sorovar Icterohaemorrhagiae pode ter relação com condições sanitárias e

ambientais que facilitam o contato com o seu hospedeiro natural, o rato de esgoto

(Rattus novergicus) (BARCELLOS; SABROZA, 2001; SUEPAUL et al., 2010;

HAGIWARA, 2003). De modo similar, outros estudos relatam também uma maior

frequência para este sorovar em São Paulo, Paraná e Rio Grande do Sul

(MAGALHÃES et al., 2006; HASHIMOTO et al., 2010; MESQUITA et al., 2017).

Girio et al. (2003) em pesquisa com animais domésticos e silvestres na região

de Nhecolândia, Mato Grosso do Sul, observaram que o sorovar

Icterohaemorrhagiae foi mais frequente em ovinos (Ovis aries) domésticos, porcos-

monteiros ou javali (Sus scrofa) em estado feral, ovinos (Ovis aries) vivendo em

estado feral, e veado-campeiro (Ozotoceros bezoarticus), demonstrando que várias

espécies de animais silvestres, domésticos ou que vivem em estado feral podem

manter leptospiras no ecossistema matogrossense e serem fonte de infecção para

cães especialmente os de pastoreio e caça.

41

Já na cidade de Cuiabá, capital matogrossense, cujas àguas são drenadas

para o Pantanal, Silva (2010) encontrou frequência baixa 2 (1,72%) de cães

infecctados pelo sorovar Icterohaemorrhagiae.

O sorovar Copenhageni é mantido por roedores sinantrópicos, com alta

prevalência em cães e humanos nas grandes metrópoles brasileiras (RODRIGUES

et al., 2013). Leptospiras patogênicas dos sorovares Canicola e Icterohaemorrhagiae

estão associadas à maioria dos casos clínicos de leptospirose em cães (STOKES et

al., 2007).

O sorogrupo Australis (sorovar Bratislava) foi o segundo mais frequentre, com

7 (1,63%) cães positivos, sendo todos de ambiente rural. A sorovariedade Bratislava

já foi relatada em espécies silvestres (ULLMANN et al., 2012), em bovinos (JULIANO

et al., 2000; HOMEM et al., 2001; TOMICH et al., 2007; FIGUEIREDO et al., 2009;

OLIVEIRA et al., 2010), em ovinos (HERRMANN et al., 2004) e em cães (AGUIAR et

al., 2007; CASTRO et al., 2011).

Silva et al. (2015) em pesquisa realizada no Pantanal, mencionaram que os

sorovares predominantes nas reações da Soroaglutinação Microscópica (SAM)

foram Bratislava e Grippotyphosa, encontrando tanto animais domésticos quanto

selvagens reagentes ao sorovar Bratislava, demontrando assim, a circulação do

mesmo pela região pantaneira.

A sorovariedade Bratislava, cuja ocorrência já foi registrada anteriormente em

bovinos no Pantanal de Mato Grosso por Pellegrin et al. (1999), também já foi

descrita com elevada prevalência em equinos (SANTA ROSA et al., 1968;

CORDEIRO et al., 1974). Segundo estudo realizado por Pellegrin e colaboradores

(1999), depois dos bovinos, os equinos podem ser considerados a segunda espécie

doméstica de maior densidade no Pantanal. Então, a grande presença dos equinos

na região pantaneira, aliada ao contato frequente principlamente com os cães rurais,

poderia refletir nos resultados encontrados neste trabalho a cerca do sorovar

Bratislava.

Os sorogrupos Tarassovi (sorovar Tarassovi), Hebdomadis (sorovar

Hebdomadis) e Autumnalis (sorovar Autumnalis) apresentaram 2 (0,46%) cães de

ambiente rural soropositivos cada um. Hashimoto et al. (2010) no Paraná também

encontraram baixa frequência dos sorovares Autumnalis e Hebdomadis, e nenhum

Tarassovi em caninos. Já em estudo realizado em Uberlândia, Estado de Minas

Gerais, os sorovares de maior frequência foram o Autumnalis (34,2%) e Tarassovi

42

(23,7%), não sendo evidênciados cães sororreagentes ao sorovar Hebdomadis

(CASTRO et al., 2011). E na cidade de Cuiabá, Mato Grosso, Silva (2010) obteve a

maior frequência para o sorovar Patoc (29,31%), seguido por Autumnalis (25,86%)

nos cães analisados.

A presença de animais reagentes para a sorovariedade Tarassovi pode estar

relacionada à presença de suínos domésticos e ferais, considerados um dos

principais reservatórios desta sorovariedade (FAINE 1982; GARNER; OJBRIEN,

1988).

O sorogrupo Grippotyphosa (sorovar Grippotyphosa) apresentou apenas 1

(0,23%) cão de ambiente rural reagente. A sorovariedade Grippotyphosa é

frequentemente relatada em animais selvagens, principalmente em roedores, como

capivara (Hidrochaeris hidrochaeris), e em marsupiais, como (Didelphis spp.)

(CORRÊA et al., 2004), podendo estes exercerem papel de reservatório da

sorovariedade para os animais domésticos em diversos estados brasileiros (SILVA

et al., 2015).

Dessa maneira, a infecção do cão está na dependência da existência do

portador natural nas proximidades. Assim, cães que adquirem a infecção pelo

sorovar Grippotyphosa são os cães de caça ou que residem em áreas suburbanas,

onde podem ser encontrados os roedores e outros mamíferos silvestres

(HAGIWARA, 2003), o que não deixa de ser uma realidade observada

principalmente nos cães rurais deste estudo.

Embora haja um consenso geral de que a imunidade desenvolvida é

específica do sorovar, existe certo grau de reatividade cruzada entre os diferentes

sorogrupos (HAGIWARA; LUSTOSA; KOGIKA, 2004). Um mesmo animal pode

reagir para mais de um sorovar, considerando como responsável pela infecção o de

maior título, e como co-aglutinantes os demais sorovares reagentes (LANGONI et

al., 2015).

Do total de cães soreagentes para Leptospira spp., 1,25% (2/160) eram do

ambiente urbano e 11,90% (32/269) eram do ambiente rural. A análise estatística

mostrou que as variáveis habitat, área e idade (48-72 meses) estavam associadas

com a ocorrência de anticorpos anti-Leptospira spp. nos cães avaliados (P < 0.05)

(Tabela 3).

43

Tabela 3 – Análise das variáveis e os resultados da SAM (≥100) nos cães da região do Pantanal.

Variáveis analisadas

Nº de cães

Analisados Positivos para Leptospira spp.

Número (%) P-valor

Habitat Urbano Rural

160 269

2 (1,25)

32 (11,90)

0,00

Área

Área não alagável Área alagável

256 173

13 (5,08) 21 (12,14)

0,01

Sexo

Macho Fêmea

258 171

25 (9,69) 9 (5,26)

0,13

Idade*

0-12 meses

124

8 (6,45)

0,60 12-24 meses 100 5 (5,0) 0,30 24-48 meses 94 8 (8,51) 0,98 48-72 meses 50 8 (16,0) 0,04 >72 months 48 4 (8,33) 0,78

* 13 cães não tiveram a idade determinada pelos seus proprietários. Destes, apenas 1 tinha anticorpos anti-Leptospira spp. (título de 400 para o sorovar Icterohaemorrhagiae).

A presença de associação entre a variável habitat e a presença de anticorpos

anti-Leptospira spp. pode ser explicada pelo fato de haver em áreas rurais

hospedeiros naturais ou acidentais para Leptospira spp., entre animais silvestres e

domésticos, os quais estão distribuídos por toda a planície pantaneira estudada

(ALHO et al., 1987). Ademais, grande parte dos cães rurais tem o hábito de caça e

cotidianamente podem estar expostos a esse tipo de infecção.

Além disso, estes resultados mostram que o tipo de área está associado com

a ocorrência de anticorpos contra Leptospira spp., sendo que um maior número de

animais reagente foi verificado em área alagável. Sabe-se que esta bactéria se

desenvolve muito bem em locais com períodos de elevados índices pluviométricos

(ACHA; SZYFRES, 1986; PLANK; DEAN, 2002). E em relação à região de estudo,

nota-se que é um bioma caracterizado por ser a maior planície alagável do planeta,

e possui uma grande diversidade de fauna, o que propicia condições ecológicas

favoráveis ao desenvolvimento do gênero Leptospira, em virtude da possibilidade da

bactéria sobreviver por mais tempo em áreas alagadas e com elevadas

temperaturas (LINS et al., 1986; ALHO et al., 1987).

44

Quanto à idade, verificou-se associação entre os cães reagentes e que estão

na faixa etária de 48-72 meses, o que poderia ser explicado pelo maior tempo de

exposição ao agente pelos cães mais velhos. Em outro estudo, foi observado que a

faixa etária compreendida entre 1 e 5 anos pode ser considerada um fator de risco

para ocorrência da leptospirose canina (SILVA, 2010).

CONCLUSÃO

A partir dos resultados observados no presente estudo, é possível inferir que

os cães da região pantaneira tiveram contato com agentes do gênero Leptospira, o

que representa uma informação relevante para a saúde pública local, principalmente

devido à implicação zoonótica da doença.

45

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