UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA

ANDERSON RODRIGUES DE OLIVEIRA

EFEITOS DA TERAPIA LASER DE BAIXA INTENSIDADE ASSOCIADA AO EXERCÍCIO AERÓBIO NO REPARO DE TENOTOMIA DO TENDÃO DE

AQUILES DE RATOS DIABÉTICOS

NATAL

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA

ANDERSON RODRIGUES DE OLIVEIRA

EFEITOS DA TERAPIA LASER DE BAIXA INTENSIDADE ASSOCIADA AO EXERCÍCIO AERÓBIO NO REPARO DE TENOTOMIA DO TENDÃO DE

AQUILES DE RATOS DIABÉTICOS

Dissertação apresentada ao programa de pós graduação em Fisioterapia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – como requisito para obtenção do título de Mestre em Fisioterapia. Orientador: Prof. Dr. Wouber Hérickson de Brito Vieira. Co-orientador: Prof. Dr. Bento João da Graça Azevedo Abreu

NATAL 2016

Oliveira, Anderson Rodrigues de. Efeitos da terapia laser de baixa intensidade associada aoexercício aeróbio no reparo de tenotomia do tendão de aquiles deratos diabéticos / Anderson Rodrigues de Oliveira. - Natal,2016. 64f: il.

Orientador: Prof. Dr. Wouber Hérickson de Brito Vieira. Coorientador: Prof. Dr. Bento João da Graça Azevedo Abreu.

Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia. Centro de Ciências da Saúde.Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Diabetes Mellitus - Dissertação. 2. Fototerapia -Dissertação. 3. Exercício - Dissertação. 4. Tendão de Aquiles- Dissertação. 5. Cicatrização - Dissertação. I. Vieira,Wouber Hérickson de Brito. II. Abreu, Bento João da GraçaAzevedo. III. Título.

Catalogação da Publicação na FonteUniversidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

ANDERSON RODRIGUES DE OLIVEIRA

EFEITOS DA TERAPIA LASER DE BAIXA INTENSIDADE ASSOCIADA AO EXERCÍCIO AERÓBIO NO REPARO DE TENOTOMIA DO TENDÃO DE

AQUILES DE RATOS DIABÉTICOS

Dissertação apresentada ao programa de pós graduação em Fisioterapia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – como requisito para obtenção do título de Mestre em Fisioterapia.

Aprovado em: ______/______/______

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Wouber Herickson de Brito Vieira

Orientador

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende

Examinadora Interna da UFRN

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Prof. Dr. Nivaldo Antonio Parizotto

Examinador externo à UFRN

Universidade Federal de São Carlos - UFSCAR

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, José e Áurea, minha fonte de inspiração e força

e maiores exemplos de amor e dedicação.

AGRADECIMENTOS

À DEUS, por me iluminar, proteger e dar saúde e força para seguir no caminho

certo. Sem a sua proteção divina nada disso seria possível.

Aos meus pais, JOSÉ GOMES E ÁUREA RODRIGUES, que sempre fizeram um

grande esforço para me proporcionar uma ótima educação. Muito obrigado por

todos os ensinamentos, amor e compreensão. Esta conquista é de vocês. Amo

vocês.

À minha avó, FRANCISCA, por todo o carinho e amor demonstrado em toda

minha vida.

À minha irmã, ALINE, por todo carinho, incentivo e por sempre torcer pelo meu

sucesso. Te amo.

Ao meu sobrinho, GUILHERME, por todos os abraços e sorrisos ao me ver

chegar em casa. Saiba que seu carinho sempre me encheu de energia e me deu forças para seguir em frente. Amo você.

A todos os meus familiares, pelas palavras de esforço e conforto durante esta caminhada.

À minha noiva, KARINNA, por ser essa companheira inseparável que eu sei que

posso contar em todos os momentos. Muito obrigado por todo o amor,

compreensão, paciência e parceria. Você é meu porto seguro e inspiração para seguir conquistando todos os objetivos. Simplesmente, Te amo.

Ao meu orientador, WOUBER HERICKSON, que com toda a sua competência,

amizade, profissionalismo, humildade e respeito sempre soube me mostrar o

melhor caminho a seguir nessa longa e difícil jornada. Muito obrigado por toda a

confiança, paciência e apoio. Você é um ser humano admirável e seus ensinamentos estarão sempre comigo.

Ao meu co-orientador, BENTO ABREU, que esteve presente em todos os

momentos, bons ou turbulentos, e deu todo o suporte e incentivo necessário para

a realização dessa pesquisa. Saiba, que todo seu empenho serviu como

inspiração e me deu forças para chegar até essa conquista.

Aos amigos do grupo Diabetes DMOR, que foram incansáveis para que cada

etapa deste trabalho fosse cumprida com maestria. Foram dois anos de muita

abdicação de todos, mas também, foram anos de muito aprendizado. Muito obrigado por todo o empenho, sem vocês este trabalho não seria possível.

Aos IC’s, CAROL, ROBSON, WIGLYANE, HESLI, VITÓRIA E JOÃO, que

participaram intensamente de todo o trabalho. Muito obrigado pelo o esforço e

parceria de vocês e me desculpem pelos finais de semanas “perdidos”. Espero

ter contribuído de alguma forma na formação de vocês e saibam que pude aprender muito com cada um.

Aos amigos, DÁFINY, FLAVIO E RAUL, que sempre estavam dispostos e de

prontidão para colaborar ativamente com este trabalho. Muito obrigado por todos

os ensinamentos e parceria. Vocês são pessoas que fazem a diferença em qualquer grupo.

Aos professores colaboradores, NAISANDRA, ADRIANA REZENDE E MARCIO CORRÊA, por todo apoio durante o projeto, disponibilizando seus alunos e

laboratórios para execução de cada etapa.

Aos amigos e parceiros de Brasília, em especial a Professora RITA DE CASSIA MARQUETI, por me receber tão carinhosamente na UNB e ter feito de tudo para

que fosse possível concluir com êxito este trabalho

Aos amigos de trabalho que se tornaram amigos para a vida, EMMANOEL, ROSA, ALANE E GABRIEL, por todas as palavras de incentivo e apoio durante

todo esse período. A amizade e compreensão de vocês foi fundamental.

A todos os professores, que participam da minha formação desde a graduação. Todos tiveram papel importante para a minha vida acadêmica e profissional.

Enfim, a todos que estiveram ao meu lado e que, de uma forma ou de outra, contribuíram para a conclusão deste trabalho

Sumário

1. Introdução...............................................................................................14

2. Justificativa..............................................................................................19

3. Objetivos.................................................................................................20

4. Hipóteses................................................................................................21

5. Materiais e métodos................................................................................22

5.1 Animais...................................................................................................22

5.2 Indução do Diabetes Mellitus por Estreptozotocina...............................22

5.3 Indução da lesão no Tendão de Aquiles................................................23

5.4 Protocolo de Exercício Aeróbio..............................................................25

5.5 Protocolo de Administração da TLBI......................................................26

5.6 Eutanásia dos Animais e Dissecação do TA..........................................27

5.7 Técnica de Histologia.............................................................................28

5.8 Técnicas de Biologia Molecular..............................................................29

5.8.1 Coleta e Processamento do Material para as análises de Biologia Molecular.....................................................................................................29

5.9 Análise das Propriedades Mecânicas....................................................32

5.10 Fluxograma do experimento.................................................................35

6. Análises Estatísticas................................................................................36

6. Resultados..............................................................................................37

7. Discussão................................................................................................49

8. Conclusão...............................................................................................54

9. Referências.............................................................................................55

Anexos..........................................................................................................63

Lista de figuras

Figura 1 – Anestesia e indução da DM..............................................................23

Figura 2 – Exposição cirúrgica do TA................................................................24

Figura 3 – Indução da lesão no TA......................................................................24

Figura 4 – Sutura da incisão cirúrgica ................................................................24

Figura 5 – Progressão do exercício aeróbio na esteira.......................................25

Figura 6 – Posicionamento para aplicação da LBTI............................................27

Figura 7 – Aplicação da TLBI no TA....................................................................27

Figura 8 – Extração do TA..................................................................................28

Figura 9 – TA extraído........................................................................................28

Figura 10 – Dispositivo de análise biomecânica................................................33

Figura 11 – Gráfico de análise biomecânica......................................................34

Figura 12 – Fluxograma do experimento............................................................35

Figura 13 – Imagens histológicas.......................................................................39

Figura 14 – Análise biomecânica – carga máxima..............................................40

Figura 15 – Análise biomecânica – distensão máxima........................................40

Figura 16 – Análise biomecânica – Rigidez........................................................41

Figura 17 – Análise biomecânica – Energia absorvida........................................42

Figura 18 – Análise biomecânica – Área de secção transversa..........................42

Figura 19 – Análise biomecânica – Stress..........................................................43

Figura 20 – Análise biomecânica – Strain...........................................................44

Figura 21 – Análise biomecânica – Módulo elástico............................................44

Figura 22 – Análise biomecânica – Densidade de energia..................................45

Figura 23 – Expressão de mRNA – Expressão relativa de col 1..........................46

Figura 24 – Expressão de mRNA – Expressão relativa de col 3..........................46

Figura 25 – Expressão de mRNA – Expressão relativa de MMP2.......................47

Figura 26 – Expressão de mRNA – Expressão relativa de MMP9......................48

Lista de tabelas

Tabela 1 – Parâmetros da Laserterapia............................................................26

Tabela 2 – Resultados dos dados clínicos........................................................37

Tabela 3 - Análise semi – quantitativa das variáveis histológicas.....................38

Lista de siglas e abreviações

AST – Área de secção transversa

COL1 – Colágeno 1

COL3 – Colágeno 3

DM – Diabetes Mellitus

EA – Exercício aeróbio

GC – Grupo Controle

GCL – Grupo Controle Lesionado

GD – Grupo Diabético

GD-TLBI – Grupo Diabético Laser

GD-EX – Grupo Diabético Treinado

GD-EX+TLBI – Grupo Diabético Treinado Laser

GLUT4 – Transportador de Glicose Tipo 4

HE – Hematoxilina e Eosina

TA – Tendão de aquilies

TLBI – Terapia Laser de Baixa Intensidade

MMP2 – Metaloproteinase 2

MMP9 – Metaloproteinase 9

VEGF – Fator de Crescimento Endotelial Vascular

AMPK - Proteína Quinase Ativada por AMP

Resumo

Diabetes Mellitus (DM) é uma doença complexa que exige uma assistência

médica contínua para a redução dos fatores de risco, além do controle

glicêmico.A hiperglicemia característica dessa doença produz glicação de

proteínas e consequente acúmulo de produtos finais da glicação em vários

tecidos humanos, entre eles, o tendão. O exercício aeróbio (EA) e a terapia laser

de baixa intensidade (TLBI) têm sido utilizados no manejo de tendinopatias em indivíduos com ou sem DM. Objetivo: O objetivo desse estudo foi observar o

efeito da TLBI associada ao EA no processo de reparo de tenotomia parcial do

tendão de Aquiles (TA) de ratos diabéticos. Métodos: Foram utilizados 91

animais divididos nos seguintes grupos: grupo controle (GC), grupo controle

lesionado (GCL), grupo diabético (GD), grupo diabétido laser (GD-TLBI), grupo

diabético exercício (GD-EX) e grupo diabético exercício laser (GD-EX+TLBI). Os

animais foram submetidos a intervenção com EA utilizando um protocolo com

aumento progressivo de tempo (12 à 60min) e velocidade (4 à 9 m/min) 5 vezes

por semana durante 3 semanas, e a TLBI (660nm, 10mW, 4 J/cm² em um único

ponto por 16 segundos aplicado 3 vezes por semana). Foram analisadas as

características morfológicas, biomecânicas e moleculares. Para os dados que

apresentaram distribuição normal foi utilizado o teste ANOVA one-way e post

hoc de Tukey e para os dados que não apresentaram distribuição normal foi

utilizado teste de Mann Whitney e post hoc de Dunn’s. Foi adotado p<0.05 para significância estatística. Resultados: Houve melhoras significativas nas

variáveis de carga máxima, distensão, energia absorvida, stress, área de secção

transversa, módulo elástico e densidade de energia nos animais dos grupos GC

e GDTL quando comparados aos grupos diabéticos (p<0,05). A associação do

EA e TLBI promoveu aumento da expressão gênica de colágeno I e modulou a

expressão das MMP2 e MMP9 (p<0,05). Não foi observada melhora significativa nas variáveis morfológicas estudadas. Conclusão: a TLBI associada ao EA

promove melhora nas propriedades mecânicas e no controle da expressão gênica do colágeno I e da MMP2 e MMP9 de ratos diabéticos.

Palavras-chave: Diabetes Mellitus. Fototerapia. Exercício. Tendão de Aquiles.

Cicatrização

Abstract

Diabetes Mellitus (DM ) is a complex disease that requires continuous medical

care for the reduction of risk factors in addition to glycemic control. The typical

hyperglycemia of this disease produces glycosylation of proteins and so the

consequence is the accumulation of glycosylation final products in various human

tissues, among them, the tendon. The aerobic exercise (AE) and the low level

laser therapy (LLLT) have been used to treat tendinopathies in individuals with or without DM. Objective: The aim of this study was to watch the effect of the LLLT

and the AE, in association, in partial tenotomy of the tissue repair of the Achilles tendon (AT) of diabetic rats. Methods: 91 animals were utilized and divided in to

the following groups: control group (GC), injured control group (GCL), diabetic

group (GD), diabetic group LLLT (GD – TLBI), diabetic group trained (GD - EX)

and diabetic group trained laser (GD-EX+TLBI). The animals were submitted to

intervention with AE, using a protocol with a progressive increase of time (12 to

60 min) and speed of (4 to 9 m/min), and the LLLT (660 nm laser, 10mW, 4 J/cm²,

single point for 16 seconds, three times for week). It was analyzed morphological,

biomechanical and molecular characteristics. For data showing normal

distribution was used one-way ANOVA test and post hoc Tukey and data without

normal distribution was used Mann Whitney test and post hoc Dunn's. It was accepted p <0.05 for statistical significance Results: The biomechanical tests

indicated major improvement in the GC and GD-EX+TLBI groups when

compared with the diabetic groups in the following variables: maximum load,

strain, absorbed energy, stress, cross section area, elastic modulus and energy

density (p<0.05). The analysis through molecular biology indicated that the

association of aerobic exercise and LLLT generated an increase of the collagen

I gene expression and modulated the expression of the MMP2 and MMP9

(p<0.05). No observed any major improvement in the morphological variable

studied. Conclusion: the LLLT associated with aerobic exercise promotes and

increase of the mechanical properties, in the control of collagen I gene expression

and of the MMP2 and MMP9 of the diabetic rats. Keywords: Diabetes Mellitus. Phototherapy. Exercise. Achilles Tendon. Healing

14

1.Introdução

Diabetes Mellitus (DM) é uma complexa doença crônica que exige uma

assistência médica contínua para a redução dos fatores de risco, além do

controle glicêmico. Sua prevalência é mundial e estima-se que existam em torno

de 387 milhões de pessoas diabéticas em todo o mundo. Estima-se ainda um

crescimento de 205 milhões até 2035, principalmente pelo aumento dos fatores de risco tais como obesidade, sedentarismo e demais hábitos de vida.1,2

A DM em humanos é classificada em diversos tipos, sendo os principais

o tipo primário (1) ou tipo secundário (2). A DM do tipo 1 é causada pela

destruição de células pancreáticas ß numa reação imune. Verifica-se um grupo

heterogêneo de alterações ou distúrbios que possuem como característica

comum a hiperglicemia. Já o DM tipo 2 ocorre por uma combinação de

resistência à insulina e disfunção de células ß, e representa cerca de 90% dos

casos dessa doença. Nesta forma de DM, os níveis de insulina plasmática são

normais ou elevados, enquanto que os níveis de glicose são muito elevados. Isto

pode ocorrer pela falta da resposta normal de algumas células à insulina, as

chamadas células insulino-resistentes. Fatores genéticos, estilo de vida e falta de atividade física são fatores de risco para o desenvolvimento do DM tipo II.3,4

A hiperglicemia oriunda dessa doença pode causar sérios danos aos

sistemas orgânicos, especialmente aos sistemas nervoso e circulatório (vasos

sanguíneos). No entanto, danos severos às estruturas e função do sistema

locomotor têm sido reportados, advindos principalmente da neuropatia periférica

que se instala em pacientes diabéticos, sendo esta responsável pelos défices sensoriais nas partes distais do corpo.5

Sabe-se que a hiperglicemia crônica produz glicosilação de proteínas e

consequente acúmulo de produtos finais da glicosilação em vários tecidos

humanos.6 Isso pode indicar que músculos, cartilagens, tendões e ligamentos

podem ser afetados por alterações estruturais mesmo antes da instalação da neuropatia diabética.7

15

A Limitação na mobilidade articular é manifestação relativamente

frequente na DM e pode envolver estruturas moles como os tendões dos flexores

plantares, e, notadamente, o tendão do calcâneo- popularmente conhecido como

tendão de Aquiles (TA).8 A estrutura tendínea é altamente adaptada para

suportar cargas geradas pela musculatura e transmiti-las aos ossos e, dessa

maneira, propiciar o movimento. O TA é formado pelos músculos gastrocnêmio

e sóleo, que se inserem no calcâneo, sendo considerado o maior e mais forte

tendão do corpo humano, podendo resistir a forças superiores a 12 vezes o peso

corporal.9

Curiosamente, o TA se encontra também entre os tendões mais

comumente lesados na DM.10 Este apresenta-se significativamente espessado

em pacientes diabéticos com ou sem neuropatia diabética, talvez por glicação

dessa estrutura.11 Interessantemente, desde 1957 já se sabe clinicamente do

espessamento tendíneo e ligamentar em mãos e pés de pacientes diabéticos;12

em decorrência do armazenamento anormal de fibras colágenas, embora não

ocorram necessariamente alterações nas propriedades elásticas na superfície e

aponeurose plantar de jovens diabéticos do tipo I.13

Outros autores14, utilizando técnicas de ultrassonografia, evidenciaram

além do espessamento do TA, desorganização das fibras tendíneas bem como

calcificações no tendão em pacientes com DM. Essas alterações estruturais por

sua vez podem predispor a alterações nas propriedades biomecânicas no tecido

tendíneo, como por exemplo, o aumento da rigidez tecidual e predispor os

indivíduos diabéticos não só a rupturas, mas também à pressão aumentada no ante-pé e, consequentemente, à úlceras de pressão neste local.

O colágeno é uma proteína que representa o maior constituinte da matrix

extracelular de tecidos conectivos, representando cerca de 70% do peso seco

de um tendão15. Esta estrutura possui baixos índices de renovação e tem sido

considerada uma forte candidata para extensa modificação por glicosilação16.

Produtos finais da glicação já foram associados ao aumento de pontes cruzadas

no colágeno, criando um aumento da rigidez mecânica17, assim como uma diminuição na susceptibilidade para digestão enzimática18 .

16

Uma característica morfológica que chama bastante atenção em animais

e indivíduos com tendinopatia crônica é o aumento significativo de colágeno do

tipo III em relação ao colágeno do tipo I no tendão acometido. O colágeno I é

organizado em fibrilas dispostas paralelamente umas às outras e é considerado

o principal responsável pela força tênsil do tecido. O colágeno do tipo III, por sua

vez, apresenta-se disposto majoritariamente no endotendão e possui importante

papel no processo de reparo tecidual. Sua presença abundante em estágios

avançados do reparo do tecido pode causar enfraquecimento das propriedades

mecânicas do tecido, já que as fibras de colágeno do tipo III são mais finas e extensíveis que as fibras de colágeno do tipo I19-21.

Além disso, já foi observado uma hiperexpressão de metaloproteases do

tipo 2 (MMP2) e 9 (MMP9) em TAs degenerados e rompidos de humanos20,21.

Outras metaloproteases também estão relacionadas à gênese de afecções no

tendão. A atividade enzimática dessas proteínas é considerada a grande

responsável pela degradação da matrix extracelular, processo crucial para a renovação de colágeno nos tecidos.

O processo de reparo do tendão depende da habilidade dos tenócitos em

responder ao estímulo induzido pela lesão na matriz e envolve uma complexa

sequência de fases. Esse processo de reparo ocorre por meio de três fases que

se sobrepõem. Brevemente, a (1) fase inflamatória envolve o recrutamento de

células inflamatórias, fagocitose de tecido necrótico, liberação de substâncias

vasoativas e início da hiperplasia vascular e estimulação da proliferação de

tenócitos. Após alguns dias, inicia-se a (2) fase proliferativa (ou de regeneração)

que tem como característica principal a migração de células para o local de lesão

e a grande síntese de colágeno do tipo III, podendo durar até 21 dias. A (3) fase

de remodelamento começa aproximadamente entre três e seis semanas após

lesão e prossegue por um tempo indefinido. Nesta fase, o tecido torna-se fibroso

e há uma diminuição da celularidade e diminuição da síntese de colágeno e

glicosaminoglicanos. Uma maior proporção de colágeno do tipo I é produzida

nessa fase o que ocasiona um aumento progressivo da força tênsil23. Alguns

autores consideram ainda uma quarta fase, a (4) fase de maturação, que ocorre

17

após dez semanas (podendo durar até um ano) e envolve a troca gradual de

tecido fibroso pelo tecido tendíneo reparado24.

A taxa de recuperação do tendão é baixa, principalmente pela baixa

síntese de proteínas estruturais, baixo consumo de oxigênio e carga excessiva

que deve ser suportada, mesmo quando o tendão encontra-se lesado e de certa

forma protegido. Dentro deste contexto, a elucidação de meios para incremento

do reparo tendíneo tem sido bastante destacada. Além de sobrecarga mecânica,

diversos fatores de diferenciação e crescimento podem estimular o reparo

tecidual como o VEGF e TGF-β.25-28

Atualmente, a prática regular de exercício, aliada ao tratamento insulínico

e ao planejamento da dieta, tem sido considerada uma das principais

abordagens no tratamento da diabetes tipo 1. Tal medida objetiva aproximar as

condições metabólicas do paciente a um estado fisiológico normal, impedindo ou

retardando as complicações crônicas do DM29,30.

Vários estudos têm mostrado os efeitos benéficos do exercício no controle

dos níveis de glicose sanguínea, tanto em experimentação animal como em

seres humanos31-,35. Sabe-se que o estímulo da contração muscular leva à

translocação do GLUT4, o principal transportador da glicose no miocárdio, para

a membrana plasmática pela via de sinalização da AMPK (proteína quinase

ativada por AMP). Este processo leva ao aumento da captação da glicose36.

Mesmo quando pequena, a redução da glicemia causada pelo exercício pode

ser suficiente para evitar certas alterações morfológicas causadas pela

hiperglicemia37.

Especificamente no tendão, sabe-se que esse tem uma grande

capacidade para responder a diferentes tipos de exercício físico, dentre eles o

aeróbio38-40. Entretanto, os efeitos benéficos do exercício no aumento da

resistência tênsil do tendão tem sido observado em animais ou humanos

saudáveis. Pelo que nos consta há somente um estudo averiguando o efeito do

exercício aeróbio nas propriedades mecânicas do TA em ratos diabéticos, o qual

evidenciou que o exercício moderado proporciona uma modulação na

capacidade elástica e na força máxima de deformação do TA de ratos diabéticos

semelhante ao obtido em animais do grupo controle41. Os autores sugerem que

18

o exercício aeróbio colabora na redução da progressão das complicações

relacionadas ao DM e aumenta as propriedades mecânicas do TA.

Uma outra modalidade terapêutica que pode facilitar ou acelerar o

processo de reparo tendíneo envolve a Terapia Laser de Baixa Intensidade

(TLBI). Esta constitui-se em uma radiação eletromagnética luminosa com

características especiais capaz de interagir com os tecidos biológicos, cujo

fisioterapeuta pode utilizar de forma segura e eficaz na modulação de respostas

terapêuticas42. Nesse sentido, estudiosos têm expressado sobre a influência do

laser de baixa intensidade em várias condições musculoesqueléticas, entre elas

a tendinopatia e ruptura do TA visando a diminuição de processos inflamatórios,

dolorosos e, sobretudo, aceleração do processo de reparo tecidual43-45. Em

modelos animais, a TLBI tem proporcionado aumento da força tênsil e de demais

propriedades biomecânicas de TAs lesionados, melhora do reparo tecidual e

realinhamento do colágeno estudados por meio de análises ultraestrutural,

biomecânicas e histológicas, principalmente se administrado em fases iniciais do

reparo tendíneo46-48.

Na reabilitação é comum a associação de recursos terapêuticos no

tratamento de diferentes condições musculoesqueléticas. Nesse sentido, tem

sido sugerido que o laser de baixa intensidade quando associado ao exercício

aeróbio pode ter seus efeitos biológicos potencializados a partir de uma

modulação enzimática49. Dessa forma, a TLBI associada ao exercício aeróbio

pode ser uma estratégia terapêutica capaz de interferir positivamente no

processo de reparo tecidual do TA conforme sugerido por outros autores50.

Entretanto, essa associação não tem sido investigada no processo de reparo

tecidual do TA de ratos diabéticos.

19

2. Justificativa

É sabido que o DM causa grande impacto sobre as estruturas que

compõem o sistema locomotor, gerando um ciclo-vicioso composto por

inatividade, sedentarismo e piora do diabetes. Além disso, o espessamento e

aumento da rigidez do TA observados em indivíduos com DM crônica pode ser

considerado um fator de risco para rupturas parcial ou total. Essas condições

podem acarretar alterações nas transferências de cargas no pé nesses

pacientes e, consequentemente, favorecer ao surgimento de úlceras de pressão

no membro inferior. Estas representam um grande fator de risco para

amputações nos membros inferiores51, e podem atingir até 32% da população

diabética52.

Lesões no TA de pacientes diabéticos podem ter, portanto, grande

impacto clínico e funcional. Nesse estudo, foi utilizada uma ampla metodologia

para elucidar o processo de reparo tecidual no tendão de animais diabéticos.

Além disso, visou-se observar se a TLBI e o exercício aeróbio, associados ou

não, pode reverter as alterações tendíneas ou incrementar o reparo tecidual após

indução do DM e lesão mecânica aguda e, por quais mecanismos essas

modalidades terapêuticas poderiam atuar.

Dessa forma, com essa pesquisa, pretende-se consolidar uma linha de

pesquisa iniciada há poucos anos e que envolve o processo de reparo tecidual

do tendão em algumas condições patológicas, como na DM, e sob a associação

de determinadas formas de intervenção, como a Terapia Laser de Baixa

Intensidade e o exercício físico.

20

3. Objetivos

3.1. Objetivo Geral

Analisar o efeito da Terapia Laser de Baixa Intensidade associada ao

Exercício Aeróbio no processo de reparo de tenotomia parcial do tendão de Aquiles de ratos diabéticos.

3.2. Objetivos específicos

• Analisar as propriedades mecânicas do TA de ratos diabéticos com ou sem administração da TLBI e Exercício Aeróbio;

• Avaliar as alterações morfológicas no TA de ratos diabéticos com ou sem

administração da TLBI e Exercício Aeróbio;

• Quantificar a proporção de colágeno I e III e Metaloproteinases 2 e 9 no

TA de ratos diabéticos com ou sem administração da TLBI e Exercício aeróbio;

21

4. Hipótese

Esse estudo parte da hipótese que o exercício aeróbio associado a TLBI

promove melhora nas propriedades morfológicas, biomecânicas e/ou moleculares do TA de ratos diabéticos

22

5. Materiais e métodos

5.1 Animais Foram utilizados 91 ratos (Rattus norvegicus), da linhagem Wistar, com

idade de 45 a 60 dias, pesando cerca de 230-280 g, provenientes do Biotério do

Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Os animais foram aleatoriamente separados em cinco grupos: - GC: animais normoglicêmicos sem lesão no TA (12 animais);

- GCL: animais normoglicêmicos com lesão no TA (12 animais);

- GD: animais diabéticos com lesão no TA (16 animais);

- GD-TLBI: animais diabéticos com lesão no TA e aplicação da TLBI (13

animais); - GD-EX: animais diabéticos com lesão no TA e submetidos ao exercício aeróbio

(18 animais);

- GD-EX+TLBI animais diabéticos com lesão no TA e submetidos ao exercício

aeróbio associado a aplicação da TLBI (20 animais);

A discrepância em relação ao número de animais entre os grupos se deve

à possível mortalidade de animais do grupo diabético treinado (que pode chegar

a 40% em nossas observações prévias) e à própria seleção de animais

“corredores”, que pode restringir o número de animais selecionado para integrar

o grupo.

Os animais permaneceram alojados em caixas de polipropileno providas

de bebedouro e comedouro durante período de ambientação de uma semana.

Foram alocados quatro (4) animais por caixa (41 x 34 x 16 cm), mantidas em

condições controladas de temperatura (24±2°C) e de iluminação (ciclo de 12

horas claro/ 12 horas escuro), além de ração e água ad libitum.

Todos os procedimentos experimentais foram submetidos e aprovados

pelo comitê de ética no uso de animais (CEUA-UFRN) com protocolo

nº038/2014(2). (Anexo 1)

5.2. Indução do Diabetes Mellitus por Estreptozotocina

Após jejum prévio de 14 horas, os animais dos grupos GD, GD-TLBI, GD-

EX e GD-EX+TLBI foram anestesiados por inalação de gás isoflurano (Figura 1)

23

e receberam dose única de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich, St.

Louis,USA) (40 mg/kg de peso corporal) dissolvida em tampão citrato 0,1M , pH

4,5, por meio de injeção intravenosa (veia peniana).

Os animais dos grupos GC e GCL receberam a mesma dosagem de

veículo (tampão citrato 0,1M) sem o composto diabetogênico (estreptozotocina).

Este procedimento fez com que o estresse sofrido pelos animais

normoglicêmicos fosse igual ao dos animais que foram manipulados para a

indução do diabetes.

Após uma semana, a glicemia foi mensurada por meio de amostra

sanguínea retirada da veia caudal utilizando glicosímetro portátil Accu - Chek

Advantage (Roche diagnostics, Indianapólis, IN, USA).

Figura 1 – Anestesia e indução da DM

5.3. Indução da Lesão no Tendão do Aquiles

Para indução da lesão no TA, os animais foram anestesiados com

inalação de gás Isoflurano. A lesão no TA foi realizada seguindo o protocolo

descrito e reproduzido na literatura53-55 que consiste na realização de uma

tenotomia parcial no TA dos animais. De forma sucinta, após exposição cirúrgica

do tendão (Figura 2), foi provocada lesão no terço médio do TA do membro

24

inferior direito, utilizando uma agulha calibre 18 gauge (Figura 3). Em seguida, a

pele foi suturada com fio de nylon 4.0 (Figura 4) e os animais permaneceram

alocados em gaiolas com água e alimentação ad libitum.

Figura 2 – Exposição cirúrgica do TA

Figura 3 – Indução da lesão no TA

Figura 4 – Sutura da incisão cirúrgica

25

5.4. Protocolo de Exercício Aeróbio

O exercício aeróbio foi realizado por meio de esteira motorizada (Insight®,

São Paulo, SP, Brasil). Foi elaborado um protocolo de exercício físico moderado,

adaptado do proposto por Oliveira (2012) 41. Os animais dos grupos que

realizaram atividade física passaram por um período de ambientação à esteira

durante duas semanas antes do início dos experimentos. Após esse período, os

grupos foram separados de forma homogênea e somente os animais que

possuíram a habilidade de correr no aparelho foram mantidos no experimento.

O protocolo de exercício foi realizado 5 dias por semana durante 3

semanas, totalizando 15 sessões. Os animais iniciaram o exercício aeróbio no

dia seguinte a indução da lesão no TA. Foi realizado um protocolo com

incrementos na carga por meio do ajuste na velocidade e tempo, conforme

descrito na Figura 5. Assim, a velocidade e duração do exercício foram

aumentados de forma progressiva, visando uma maior adaptação dos animais

após a tenotomia do TA. Durante o período de exercícios, os animais foram

monitorados pelos pesquisadores, em relação a problemas de descarga de peso

ou qualquer desconforto. Durante o repouso, os animais dos grupos GD-EX e

GD-EX+TLBI permaneceram alocados em suas respectivas gaiolas com

atividade livre.

Figura 5 – Progressão do exercício aeróbio na esteira

26

5.5. Protocolo de Administração da TLBI O aparelho de Laser de Baixa Intensidade devidamente calibrado

(MMoptics, São Carlos, SP, Brasil) foi disposto por contato direto no terço médio

do TA direito dos animais (figuras 6 e 7) dos grupos GD-TLBI e GD-EX+TLBI,

conforme descrito por outros autores 50,56. A irradiação teve início no dia seguinte

a indução da lesão no TA durante 3 semanas aplicadas em dias alternados (3

vezes por semana) totalizando 9 sessões. Para o grupo GD-EX+TLBI as

irradiações foram realizadas imediatamente após a sessão de exercício também

em dias alternados semelhante ao GD-TLBI visando aproveitar as condições de

estresse oxidativo e, portanto, favoráveis a aplicação do laser49. Os parâmetros

utilizados na TLBI estão descritos na tabela 1.

Tabela 1- Parâmetros da Laserterapia

Comprimento de Onda 660 nm (Vermelho)

Modo de emissão Contínuo

Potência

Irradiância

10 mW

0,25 W/cm²

Diâmetro Spot 0,04 cm2

Energia por Ponto 0,16 J

Número de pontos 1

Dose 4J/cm²

Técnica de Aplicação Pontual com contato em um ângulo de 90 graus com a superfície do tecido.

Tempo de Aplicação 16s

Fonte: 50,56

27

Figura 6 – Posicionamento para aplicação da TLBI

Figura 7 – Aplicação da TLBI no TA

5.6. Eutanásia dos animais e Dissecação do TA Após 21 dias de lesão, os animais foram sacrificados com alta dose do

anestésico tiopental (> 100 mg/kg de peso) pela via intraperitoneal.

Posteriormente à eutanásia, foi realizada a excisão do TA direito dos ratos em

todos os grupos. Os tendões foram dissecados livremente do tecido mole externo

e extraído conjuntamente com o osso do calcâneo e partes distais do complexo

gastrocnêmio-sóleo. A porção tendínea do músculo plantar foi cuidadosamente

removida, para evitar influência nos testes biomecânicos (Figuras 8 e 9). Os

tecidos extraídos destinados aos exames biomecânicos foram embebidos em

28

solução salina e congelados (-20ºC). Para a análise de biologia molecular, o

tecido do TA dos ratos de cada um dos grupos foi coletado com auxílio de

ferramentas estéreis, livres de contaminação com RNAses. Após rápida

inspeção, tecidos não-tendinosos foram retirados com o auxílio de uma lente de

aumento (10x) e colocados em microtubos de 1,5 mL, livres de DNAses e

RNAses, contendo Rna Latter (Ambion, Walthan, MA, USA). Em seguida, o

material foi conservado a -80 oC, até o procedimento de extração do RNA total.

Foi realizada coleta de sangue para análise da glicemia que foi feita no

departamento de Farmácia da UFRN.

Figura 8 – Extração do TA

Figura 9 – TA extraído

5.7. Técnicas de Histologia

Os TAs dos animais de todos os grupos destinados à análise histológica

foram imediatamente fixados em formalina 10%, seguindo protocolos

29

histológicos convencionais de HE –Hematoxilina de Harris, Eosina57. Após 24

horas de fixação, fragmentos do TA foram submetidos a técnicas histológicas de

rotina (desidratação, diafanização e inclusão em parafina) e cortados em

microsecções longitudinais de 5 μm e 7 μm de espessura para confecção de

lâminas histológicas. Nesse estudo, foi utilizado fragmentos do terço médio do

TA. A análise das lâminas ocorreu por meio de uma imagem digitalizada de um

campo histológico em microscópio de luz com objetiva planacromática de 10x da

região central do eixo longitudinal do tendão. De acordo com o estudo prévio58,

para alterações histológicas no tendão do supraespinal em modelo animal de

overuse, foi observada a organização das fibras colágenas, índices de

celularidade e morfologia das células. A confecção das lâminas e as imagens

microscópicas foram realizadas no Departamento de Morfologia da UFRN

(DMOR-UFRN).

A análise histológica foi feita por avaliador cego aos grupos estudados.

Núcleos de tenócitos, celularidade, arranjo das fibras, vascularização e

hialinização foram avaliados e quantificados pela escala de quatro (4) pontos59.

5.8. Técnicas de Biologia Molecular 5.8.1. Coleta e Processamento do Material para as Análises de Biologia Molecular - Extração do RNA total

A extração de RNA total foi baseada na utilização do reagente TRIzol

(Invitrogen Inc, Walthan, MA, USA) seguindo as recomendações do fabricante e

levando em consideração as ponderações descritas na literatura63. Esse

reagente fornece amostras de RNA total altamente purificadas, livres de

interferentes, ideal para reações de RT-PCR (Reverse Transcriptase –

Polimerase Chain Reaction). Para isso, cada amostra de tecido (N = 5 por grupo)

foi macerada em almofariz previamente tratado com H2O2 a 10% para

eliminação de RNAses e esterilizados por autoclavagem, na presença de N2

líquido. As amostras foram colocadas em tubos e levadas a FastPrep24 (MPbio,

30

Santa Ana, CA, USA). Após adição de clorofórmio e glicogênio, os tubos foram

centrifugados a 12.000g a 4 °C, durante 15 minutos, e a fase aquosa superior foi

coletada e transferida para um outro microtubo estéril. O RNA presente nesta

fase foi precipitado por meio da adição de Isopropanol 100% e após nova

centrifugação (12.000 x g, 4 oC, 15 min.) o pelete foi lavado três vezes com

etanol 75% e finalmente solubilizado em um volume de 10 μL de H2O tratada

com DEPC. As amostras foram conservadas a -80 °C até sua posterior utilização.

Para quantificar a extração do Rna foi utilizado o Quibit Flurometer

(Invitrogen Inc, Walthan, MA, USA) e para verificar a integridade e qualidade do

RNA extraído, as amostras foram submetidas ao espectofotômetro Nanodrop

2000 (Thermo Scientific, Walthan, MA, USA). Os procedimentos de extração e

quantificação do Rna foram realizado na Universidade de Brasília (UNB –

Campus Ceilândia) e na Universidade Católica de Brasília (UCB-vCampus asa

noste) - Síntese da primeira fita de cDNA

Para a síntese da primeira fita de cDNA total, uma alíquota das amostras

de RNA total, contendo aproximadamente 5 µg foi transferida para microtubos

de 200 µL. A esta foram adicionados o tampão de reação Sensiscript Kit

(Quiagen, Valencia, CA, USA) concentrações finais de 3 mM de MgCl2, 0,5 mM

de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), e 20 pmol dos iniciadores não

específicos Oligo-deoxirribonucleotídeo T (Oligo-dT, 18 mer). Os tubos foram

então incubados em banho-maria a 70 °C por 5 minutos e transferidos para o

gelo. Em seguida, foi adicionada 1 unidade/µL da enzima transcriptase reversa

ImProm-IITM, e os tubos foram colocados em um termomixer (Eppendorf) à

temperatura de 25 °C durante 5 minutos. Em seguida, os tubos foram colocados

a uma temperatura de 42°C, durante 60 minutos para a realização da síntese da

primeira fita de cDNA. As amostras de cDNA foram colocadas em um banho-

maria a 70°C, durante 15 minutos para inativação transcriptase reversa e

armazenadas a -80°C. A visualização da eficiência da reação foi realizada por

meio de uma eletroforese em gel de agarose a 1%.

31

Para estimar a concentração das amostras de cDNA, uma alíquota do

extrato total foi diluída em tampão TE, e mensurada a sua absorbância a 260

ηm. O cálculo utilizado para estimar a concentração de RNA foi o seguinte:

[RNA] = 40 µg/mL x Fator de Diluição x Leitura da Absorbância a 260 ηm

[cDNA] = 50 µg/mL x Fator de Diluição x Leitura da Absorbância a 260 ηm - Análise da Expressão dos mRNAs por RT-qPCR

A medida quantitativa da expressão do mRNA nos tendões foi realizada

pela RT-PCR em tempo real utilizando o sistema de amplificação TaqMan® RT-

PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O sinal de fluorescência

emitido pelo fluoróforo da sonda TaqMan® foi detectado em tempo real no

equipamento ABI Prism 7500 FAST (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

A análise da expressão gênica foi realizada por método de quantificação relativa utilizando o gene GAPDH como gene de referência.

Para a amplificação pela PCR em tempo real foram selecionados ensaios

TaqMan de iniciadores e sondas marcadas com fluoróforo para os

genes COL1A1 (Rn01463848_m1), COLL3 (Rn01437681_m1), MMP-

2 (Rn01538170_m1), MMP-9(Rn00579162_m1) e GAPDH (Rn00579162_m1)

(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

Na etapa de PCR em tempo real, além dos ensaios TaqMan, demais

reagentes foram fornecidos em solução 2x concentrada denominada Master Mix

contendo dNTPs com dUTP, AmpErase® UNG, enzima AmpliTaq Gold® DNA

Polimerase, uma referência passiva e tampão de reação Gold PCR (Applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA). Foi utilizado volume final de 10 µL por reação

em duplicata sendo utilizado 2 µL de cDNA por reação.

O programa da PCR em tempo real utilizado foi constituído de: 1- um ciclo

2min a 50ºC, (ativação da Uracil N-glicosilase - UNG); 2- um ciclo de 10min a

95ºC, (inativação da UNG); 3- 40 ciclos de 15s a 95ºC (desnaturação) e 1min a

60ºC (hibridização e extensão). Os sinais de fluorescência emitidos pelos

fluoróforos das sondas TaqMan® foram detectados pelo equipamento ABI Prism

7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os dados foram analisados

utilizando-se o programa Sequence Detection Software v 1.2.3 (Applied

32

Biosystems, Foster City, CA EUA) que gera curvas semi-logarítmicas dos sinais

de amplificação.

Esse programa fornece o parâmetro ciclo em que o sinal de fluorescência

é significativo, denominado cycle treshold (Ct). Para cada amostra, o Ct de cada

gene é registrado e comparado com o do gene GAPDH que é utilizado com gene

de referência.

Os valores de Ct obtidos nesses ensaios foram utilizados para o cálculo

da expressão relativa de mRNA de cada gene alvo em relação à do GAPDH

(gene de referência). Essa relação é denominada Delta Ct (ΔCt) e é calculada

pela fórmula:

ΔCt = (Ct gene alvo – Ct controle endógeno)

Os dados de ΔCt foram transformados em escala logarítmica (2-ΔCt) para

comparar dados de expressão absoluta entre as fases de treinamento físico e

tratamento com laser. A metodologia foi baseada no método de 2-ΔCt, descrito por

Livak.64 Todos os procedimentos da RT-qPCR foram realizados no

departamento de farmácia da UFRN.

5.9. Análise das Propriedades Mecânicas

Com o intuito de estudar a variação de resistência mecânica em função

da força de estiramento, foi desenvolvido um dispositivo pelo departamento de

Física da UFRN (Figura 10), capaz de exercer uma tensão mecânica controlada

sobre o TA e deste obter o gráfico de resistência (figura 11) para diferentes

valores de força mecânica (F(N)). O sistema consiste em uma célula de força

com um resistor variável calibrado para gerar sinal proporcional a carga

mecânica a ela imposta. Esta célula está baseada em uma base de microscópio

com possibilidade de posicionamento controlado micrometricamente. Foi

utilizado protocolo anteriormente descrito na literatura65.. Brevemente, a parte

distal dos músculos sóleo e gastrocnêmio (N = 5 por grupo), TA e parte do

calcâneo foram retirados em conjunto e congelados in situ até a realização dos

testes mecânicos. Os tendões foram descongelados overnight e os

experimentos realizados em condições controladas de temperatura (25°C) e

33

umidade, com uso de solução salina (0,9% NaCl) para prevenção de

ressecamento.

A área de secção transversa (AST) dos TAs seccionados foi obtida por

mensurações longitudinais e transversais obtidas por paquímetro digital.

Para as demais análises, os tendões foram conectados em seus pólos por

placas metálicas e acoplados ao dinamômetro. Subsequentemente, teste de

força foi realizado com a velocidade de 10 mm/min. A força máxima de ruptura

(carga máxima durante ruptura do tecido, em N), elongamento (grau de extensão

durante carga máxima, em mm) e energia absorvida no ponto de falha (em Nmm)

foram mensurados de acordo com estudos prévios66. O comprimento do TA

situado entre as placas metálicas foi inicialmente considerado como

comprimento inicial. Durante o teste, o diagrama força-deslocamento foi

expresso. Os diagramas de tendões controles e diabéticos foram analisados

para máxima carga durante ruptura (N), distensão máxima (elongamento no

ponto de ruptura/ comprimento inicial), rigidez, energia absorvida para ruptura

tecidual (J), área de secção transversa, estresse, tensão, módulo elástico e

densidade de energia. Todos os dados foram mensurados utilizando o software

OriginPro 8 e normalizados para valores arbitrários em uma escala de 0-1.

Figura 10 – Dispositivo de análise biomecânica

34

Figura 11 – Gráfico de análise biomecânica

35

5.10. Fluxograma do experimento

N = 91 animais

GC GCL GD GD-TLBI GD-EX GD-EX+TLBI

N=12 N=12 N=16 N=13 N=18 N=20

Figura 12 – Fluxograma de experimentos.

INDUÇÃO

DM

INDUÇÃO

DM

INDUÇÃO

DM

INDUÇÃO

DM

TENOTOMIA NO TENDÃO DE AQUILES (7 DIAS APÓS INDUÇÃO DA DM)

TLBI (3x/sem)

EXERCÍCIO AERÓBIO (5x/sem)

EXERCÍCIO AERÓBIO

+TLBI

EUTANÁSIA (APÓS 21 DIAS DE INTERVENÇÃO)

EXTRAÇÃO DO TENDÃO DE AQUILES PARA ANÁLISE HISTOLÓGICA, BIOMECÂNICA E BIOLOGIA MOLECULAR / COLETA DE SANGUE PARA ANÁLISE BIOQUIMICA

36

6. Análises Estatísticas Os dados inicialmente foram submetidos ao teste de normalidade de

Kolmogorov-Smirnov. Os dados que apresentaram distribuição normal foram

analisados a partir de seus valores de média ± desvio padrão por meio de uma

análise de variância (ANOVA) com desdobramentos para cada tratamento e as

diferenças significativas entre as médias foram analisadas por meio do teste de

Tukey. Para as variáveis que não apresentaram distribuição normal foi utilizado

o teste não paramétrico de Kruskal Wallis e o post hoc de Dunn’s. Foi adotado

como significância estatística um P<0,05 (5%). As análises foram feitas com o

auxílio do programa SPSS (Versão 22; IBM) e os gráficos utilizando o Software

Graphpad 5.

37

7. Resultados

Estão apresentados abaixo os dados clínicos, a análise histológica por Hematoxilina e eosina, dados biomecânicos e expressão gênica.

7.1 Dados clínicos

Os dados da glicose e peso corporal estão expressos na tabela 2. Como

esperado, os níveis de glicose foram maiores nos grupos GD, GD-TLBI, GD- EX

e GD- EX+TLBI em comparação com os grupos controle (p<0,001), confirmando

o sucesso da indução da DM. A hiperglicemia foi associada aos sinais clínicos

como poliúria, polidipisia e polifagia nos animais dos grupos diabéticos observados durante a inspeção diária (dados não mostrados).

Com relação ao peso corporal, no início do experimento os animais

apresentaram peso com distribuição normal em todos os grupos (p>0,05) e ao

final do experimento foi observado redução significativa no peso corporal dos

grupos diabéticos em relação ao grupo controle (p<0,001).

Tabela 2. Glicose e peso corporal no início e final do experimento nos diferentes grupos.

GC GCL GD GD-TLBI GD-EX GD- EX+TLBI

Peso inicial

(g)

247,5±23,5 247,5±23,5 258,3±13,6 257,1±9,2 252,5±20,7 245,5±11,1

Peso final

(g)

284,3±23,4 284,3±23,4 213,0±35,6* 232,0±23,7* 229,9±32,4* 216,1±20,4*

Glicose

(mg/dL)

155,1±38,9 155,1±38,9 550,2±74,1** 541,7±106,6* 518,6±65,4* 478,4±119,8**

Todos os dados estão expressos em média e desvio padrão.

*P< 0,05 vs. Grupo controle. **P< 0,001 vs. grupo controle

38

7.2 Análise histológica

7.2.1 Coloração por Hematoxilina e Eosina

Na análise histológica, o GC apresentou scores normais (0) em todas as

variáveis analisadas (tabela 3). Entre os grupos que sofreram lesão, o GCL

apresentou melhores resultados em todas as suas análises quando comparado

aos demais, com destaque para a vascularização. Os demais grupos obtiveram

resultados diferentes, porém não foi observada diferenças significativas em todas as comparações (Figura 13).

Tabela 3. Análise semi – quantitativa das variáveis histológicas em todos os grupos

GC GCL GD GD-TLBI GD-EX GD-

EX+TLBI

P

Núcleo de

tenócitos

0 2.00 2.25 2.25 2.50 2.67 0.11

Celularidade 0 1.00 2.00 2.50 2.50 2.67 0.06

Arranjo das

fibras

0 1.50 1.50 1.75 1.00 1.33 0.24

Vascularização 0 0.00 1.25 0.50 0.75 2.33 0.08

Hialinização 0 1.00 1.50 2.25 2.75 2.67 0.07

Dados expressos em escala de 4 pontos: 0 (normal), 1 (leve), 2 (moderado) e 3 (grave).

39

Fig 13. Imagens histológicas. (A) Celularidade (GCL), (B) Celularidade (GD-TLBI), (C)

Hialinização (GCL), (D) Hialinização (GD-EX+TLBI), (E) Tenócitos (GC), (F) Tenócitos (GD).

7.3 Análise biomecânica

Na análise biomecânica foram avaliados os parâmetros de carga máxima,

distensão máxima, rigidez, energia absorvida, área de secção transversa, estresse, tensão, módulo elástico e densidade de energia.

O GD-EX+TLBI apresentou maior carga máxima (Figura 14), com diferença estatística, quando comparado ao grupo GCL (p=0.005).

A B

C D

E F

40

Fig 14. Carga máxima em valores arbitrários (0-1). Os dados foram expressos em média e desvio

padrão. **p<0.01 GD-EX+TLBI vs. GCL. Anova One-Way com post hoc de Tukey para determinar as diferenças entre os grupos.

O GD-EX+TLBI apresentou maior distensão (figura 15) quando

comparado com os grupos GCL (p=0.002), GD (p=0.001) e GD-TLBI (p=0.007). Já o GC apresentou melhora na distensão quando comparado ao GD (p=0.02).

Fig 15. Distensão máxima em valores arbitrários (0-1). Os dados foram expressos em média e

desvio padrão. **p<0.01 GD-EX+TLBI vs. GCL, GD e GD-TLBI. Anova One-Way com post hoc

de Tukey para determinar as diferenças entre os grupos.

41

Não foi observada diferenças significativas entre os grupos na variável rigidez. (Figura 16)

Fig 16. Rigidez em valores arbitrários (0-1). Os dados foram expressos em média e desvio

padrão. *p<0.05. Anova One-Way com post hoc de Tukey para determinar as diferenças entre

os grupos.

O GD-EX-TLB apresentou maior energia absorvida, com diferença

significativa quando comparado aos grupos GCL (p=0.000), GD (p=0.000), GD-

TLBI (p=0.003) e GD-EX (p=0.006). (Figura 17)

42

Fig 17. Energia absorvida em valores arbitrários (0-1). Os dados foram expressos em média e

desvio padrão. **p<0.01 GD-EX+TLBI vs. GCL, GD, GD-TLBI e GD-EX. Anova One-Way com

post hoc de Tukey para determinar as diferenças entre os grupos.

O GCL apresentou a maior área de secção transversa quando comparado

aos grupos GD-EX+TLBI (p=0.01), GC (p=0.001) e o GD-TLBI (p=0.04). (Figura

18)

Fig 18. Área de Secção Transversa (AST) em mm². Os dados foram expressos em média e

desvio padrão. *p<0.05 GD-EX+TLBITL, GC e GD-TLBI vs. GCL. Anova One-Way com post hoc

de Tukey para determinar as diferenças entre os grupos.

43

Na variável stress, o GD-EX+TLBI foi superior estatisticamente quando

comparado ao GCL (p=0.000), GD (p=0.01) e GD-EX (p=0.006). Já o GC foi

superior quando comparado aos grupos GCL (p=0.000), GD (p=0.01), GD-TLBI

(p=0.004) e GD-EX (p=0.04). (Figura 19)

Fig 19. Estresse expresso em valores arbitrários (0-1). Os dados foram expressos em média e

desvio padrão. *p<0.05 GD-EX+TLBI vs. GCL, GD e GD-EX. *# p<0.05 GC vs. GCL, GD, GD-

TLBI e GD-EX Anova One-Way com post hoc de Tukey para determinar as diferenças entre os

grupos.

Não foi observada diferença significava entre os grupos na variável strain.

(Figura 20)

44

Fig 20. Tensão expresso em valores arbitrários (0-1). Os dados foram expressos em média e

desvio padrão. *p<0.05. Anova One-Way com post hoc de Tukey para determinar as diferenças

entre os grupos.

Os grupos GD-EX+TLBI (p=0.02) e GC (p=0.005) apresentaram maiores

valores na variável módulo elástico quando comparados ao GCL. (Figura 21)

Fig 21. Módulo Elástico (v.a). Os dados foram expressos em média e desvio padrão. *p<0.05

GD-EX+TLBI vs. GCL. ** p<0.01 GC vs. GCL. Anova One-Way com post hoc de Tukey para

determinar as diferenças entre os grupos.

45

A densidade de energia apresentou diferença significativa entre o GD-

EX+TLBI e os grupos GCL (p=0.007), GD (p=0.03) e GD-EX (p=0.03) e na

comparação entre o GC com os grupos GCL (p=0.004), GD (p=0.02), GD-

TLBI(p=0.04) e GD-EX (p=0.02). (Figura 22)

Fig 22. Densidade de energia em valores arbitrários (0-1). Os dados foram expressos em média

e desvio padrão. *p<0.05 GD-EX+TLBI vs. GCL, GD e GD-EX. *# p<0.05 GC vs. GCL, GD,

GD-TLBI e GD-EX. Anova One-Way com post hoc de Tukey para determinar as diferenças entre

os grupos.

Não foi observada diferenças estatística entre os grupos GD-EX+TLBI e

GC em nenhuma das variáveis analisadas.

7.4 Análise da expressão gênica

Foi analisada a expressão dos genes COLL1A1, COLL3, MMP2 e MMP9

nos grupos GCL, GD, GD-TLBI, GD-EX e GD-EX+TLBI. Devido à perda

amostral não foi possível realizar a análise do GC.

Com relação ao gene COLL1A1 foi observado um aumento significativo

na expressão do GD-EX+TLBI quando comparado aos grupos GD-TLBI

(p=0.046) e GD-EX (p=0.006). (Figura 23)

46

Fig 23. Expressão relativa do Colágeno 1. Os dados foram expressos em mediana e erro padrão. ^ p<0.05 GD-EX+TLBI vs GD-TLBI+GD-EX. Teste de Kruskal Wallis com post hoc de Dunn’s

para determinar as diferenças entre os grupos.

Na análise do gene COLL3 foi observado um aumento significativo da

expressão do GCL (p=0.046) e GD-EX-TLBI (p=0.030) na comparação ao GD-

EX. (Figura 24)

Fig 24. Expressão relativa do Colágeno 3. Os dados foram expressos em mediana e erro padrão. ^ p<0.05 GCL e GD-EX+TLBI vs GD-EX. Teste de Kruskal Wallis com post hoc de Dunn’s para

determinar as diferenças entre os grupos.

47

Já na análise da MMP2 foi observado um aumento significativo na

expressão do GD-EX-TLBI (p=0.020) quando comparado ao GD-TLBI. (Figura

25)

Fig 25. Expressão relativa da MMP2. Os dados foram expressos em mediana e erro padrão. ^

p<0.05 GD-EX+TLBI vs GD-TLBI. Teste de Kruskal Wallis com post hoc de Dunn’s para

determinar as diferenças entre os grupos.

Na análise da expressão da MMP9 foi observada redução significativa

na expressão do grupo GD-TLBI (p=0.035) quando comparado ao GD. (Figura

26)

48

Fig 26. Expressão relativa da MMP9. Os dados foram expressos em mediana e erro padrão. ^

p<0.05 GD-TLBI vs GD. Teste de Kruskal Wallis com post hoc de Dunn’s para determinar as

diferenças entre os grupos.

Foi observado que o GD-EX+TLBI não apresentou diferença para o GCL

em nenhuma das variáveis analisadas.

49

8.0 Discussão Este estudo teve como objetivo principal analisar os efeitos da associação

do exercício aeróbio e TLBI no processo de reparo de tenotomia do TA de ratos

diabéticos. Os resultados dessa pesquisa indicam, inicialmente, que o modelo

de indução da DM pela estreptozotocina foi eficiente devido aos sinais clínicos

apresentados pelos animais ao longo do experimento. Além disso, a associação

do exercício aeróbio e TLBI promoveu uma melhora nas propriedades

biomecânicas do TA, bem como, uma maior expressão gênica do colágeno do

tipo 1 e maior regulação da expressão da MMP2 e MMP9. No entanto, não foi

observada alterações nas propriedades histológicas dos tendões.

O modelo experimental escolhido nesse estudo mostrou - se eficaz, visto

que em poucos dias após administração da estreptozotocina, os animais dos

grupos diabéticos apresentaram os sinais clínicos da DM como polidipsia,

poliúria, polifagia e debilitação do quadro motor geral, bem como apresentaram

perda de massa significativa e altos níveis glicêmicos (acima de 250 mg/dL).

Esta substância possui mecanismo citotóxico nas células ß-pancreáticas,

provocando diabetes do tipo 1 quando administrada em animais em jejum.67

As propriedades biomecânicas de carga máxima, distensão máxima,

rigidez absorvida, área de secção transversa, stress, módulo elástico e

densidade de energia apresentaram melhores resultados no GD-EX+TLBI. Este

dado sugere que a associação entre exercício aeróbio e TLBI promoveu a

melhora nas propriedades biomecânicas. O exercício aeróbio neste estudo foi

realizado previamente a aplicação da TLBI, sendo assim, o maior estresse

oxidativo provocado pelo exercício aeróbio potencializou os efeitos da TLBI.49

Apesar de não existir relatos na literatura acerca da combinação entre

esses dois recursos para o tratamento de tenotomia em indivíduos diabéticos, o

exercício aeróbio tem se mostrado como um importante recurso para a

restauração das propriedades biomecânicas do TA de ratos diabéticos. Oliveira

et al.41 aplicaram um protocolo de treinamento aeróbio em ratos diabéticos e

observaram melhoras significativas nas propriedades biomecânicas do TA.

Adicionalmente, Ng.& Fng (2008).50 realizaram estudo utilizando

diferentes doses da TLBI (1 ou 4J/cm²) e diferentes durações (15 ou 30 min ) de

50

exercício aeróbio na esteira no tratamento de tendinopatia do TA, no entanto,

não houve associação das terapias e os animais utilizados não eram diabéticos.

Foi observado pelos autores que doses maiores (4 J/cm²) da TLBI e tempos de

treino aeróbio maiores (30 min) foram capazes de restaurar as propriedades

biomecânicas do TA.

A expressão de mRNA do colágeno I foi maior no GD-EX+TLBI quando

comparado aos grupos GD-TLBI e GD-EX, e a expressão de mRNA do colágeno

III foi maior nos grupos GCL e GD-EX+TLBI quando comparado ao GD-EX.

Neste estudo, acredita-se que a associação do exercício aeróbio com a TLBI

favoreceu o realinhamento das fibras tendíneas e o aumento na expressão do

colágeno I, tornando o tendão mais extensível e resistente. A descarga de peso

precoce e o estresse mecânico provocado pelo exercício aeróbio na esteira,

promoveu um maior alinhamento das fibras tendíneas e maior síntese de

colágeno I. Tal efeito, provavelmente, foi potencializado pela TLBI na modulação

do processo inflamatório nos primeiros dias de lesão. Dessa forma, a associação

dos recursos foi benéfica para a uma maior síntese de colágeno I.

A expressão de mRNA do colágeno I e III durante no tendão vai depender

da fase do processo de reparo. Na fase proliferativa observa-se uma maior

expressão de mRNA do colágeno III, pois nesta fase observa-se um pico na

síntese deste tipo de colágeno, que decresce na fase de remodelamento, onde

ocorre o realinhamento das fibras e o aumento da expressão de mRNA do

colágeno I no tendão.68

Ahmed (2012).69 utilizaram modelo de tenotomia no TA de ratos diabéticos

e constataram que os tendões dos ratos diabéticos apresentaram menor

expressão de colágeno 1 (-35%) e colágeno 3 (-55%), quando comparados aos

tendões de animais não diabéticos. Corroborando com nossos achados, Zhang

(2016).70 compararam os efeitos do exercício aeróbio moderado no tendão

patelar de ratos e observaram que os animais submetidos ao exercício

apresentaram uma aceleração no processo de reparo e uma maior expressão

de mRNA de colágeno 1 e 3. Dessa forma, pode-se afirmar que a DM altera a

expressão do colágeno e a associação de recursos proposta por este estudo, foi

eficaz em regular o processo de reparo e estimular a expressão do colágeno.

51

As MMPs são importantes reguladores do remodelamento da matrix extra

celular e tem seus níveis alterados durante o reparo do tendão. A MMP2 teve

sua expressão aumentada no GD-EX+TLBI quando comparado ao GD-TLBI e a

MMP9 teve redução significativa no GD-TLBI quando comparado ao GD. Esta

maior expressão no GD-EX+TLBI, sugere que a combinação de terapias

promoveu uma aceleração no processo de reparo, visto que, a alta expressão

dessa enzima nessa fase de reparo indica um maior realinhamento e

remodelamento de fibras tendinosas, bem como, pode ter havido uma maior

expressão em decorrência dos efeitos agudos do exercício.

Oshiro (2003).71 observaram em modelo de laceração do tendão em ratos

que a MMP9 tem seu pico de expressão entre 7 e 14 dias após a lesão e a MMP2

mantem seu pico até o 28º dia pós lesão. Segundo Sharam e Maffulli 68, estes

resultados demonstram uma participação da MMP9 apenas na degradação do

colágeno e a ação da MMP2 na degradação e remodelamento do colágeno. Em

recente revisão, Nascimento (2015)72, observaram que o aumento da expressão

das MMPs pode estar relacionada com a resposta adaptativa aguda do exercício.

Marcos et al.73 avaliaram a expressão da MMP9 no TA com tendinite induzida

por colagenase de ratos saudáveis. Os animais foram submetidos a tratamento

medicamentoso com diclofenaco de sódio ou TLBI (35,71 e 107,14 J/cm²) e

constataram, assim como neste estudo, que a TLBI foi capaz de reduzir a

expressão gênica da MMP9. Apesar da dose utilizada ter sido muito alta em

comparação a este estudo, pode-se constatar que doses menores da TLBI

também são capazes de controlar a degradação promovida pelas MMPs. Essas

divergências entre dosagens da TLBI nos diferentes estudos, demonstra que há

a necessidade de estudos investigando o real papel de cada variável manipulável

nos equipamentos de fototerapia como comprimento de onda, potência, energia,

irradiância dentre outras, no sentido de buscar padronizações para diferentes

tecidos e condições clinicas.

No presente estudo não foi observado melhora nas propriedades

histológicas avaliadas. Apesar do tempo de DM desse estudo ter sido de 28 dias,

acredita-se que esse tempo pode não ter sido suficiente para alterar as

propriedades morfológicas analisadas, além disso o estágio avançado do

processo de reparo tecidual pode ter dificultado a observação das diferenças

52

entre os grupos. Esse resultado corrobora com os achados de Volper (2015).74

que em seu estudo não observaram diferenças nas estruturas das fibras, arranjo

das fibras e celularidade no TA em ratos diabéticos induzidos por STZ em

diferentes fases da DM, aguda (1 semana) e crônica (10 semanas). Em

contraste, Oliveira et al.76, demonstraram que a DM induzida quimicamente foi

capaz de alterar a espessura, celularidade e vascularização do TA em ratos após

24 dias de indução da DM.

Aldioust (2014)75, observaram a redução do processo inflamatório por

meio da histologia, no TA de ratos diabéticos com aplicação de Laser com

comprimento de onda de 632,8 nm, potência média de 7,2 mW e densidade de

energia de 2,9 J/cm². Diferentemente do presente estudo, os ratos foram

sacrificados no 5º dia pós lesão e nesse período o processo inflamatório agudo

ainda está presente, sendo um período satisfatório para observar a ação

antiinflamatória do Laser . Neste estudo os animais foram sacrificados no 21º dia

pós lesão e os tendões estavam na transição entre as fases de proliferação e

remodelamento do processo de reparo tecidual o que impossibilitou a

observação dos efeitos agudos da TLBI na modulação do processo inflamatório,

no entanto, o uso da TLBI neste estudo foi realizado desde o 1º dia pós lesão, o

que possivelmente, favoreceu a melhora observada nas variáveis biomecânicas

e moleculares.

Na prática clínica da fisioterapia é comum a combinação terapêutica de

recursos, no entanto, atualmente, essas combinações ainda são carentes de

investigações cientificas, o que dificulta a aplicação correta nos pacientes. Os

resultados desta pesquisa indicam que a associação do exercício aeróbio com a

TLBI pode restaurar os danos causados nos tendões de ratos diabéticos. No

entanto, ainda se faz necessário, um maior esclarecimento acerca dos

parâmetros a serem utilizados, como a duração e intensidade do exercício

aeróbio e potência e dose da TLBI, visto que, a literatura atual é conflitante

nestes aspectos. Pelo o que nos consta, este estudo foi o primeiro que avaliou

os efeitos da associação destes dois recursos no tendão de ratos diabéticos,

desta forma, se faz necessário a realização de mais estudos para se esclarecer

todos os parâmetros dessa combinação, avaliar os efeitos desta associação nas

diferentes fases de reparo tecidual, visto que, neste estudo foi avaliado apenas

53

na fase de remodelamento. Ressalta-se ainda a necessidade de pesquisas

clínicas para se avaliar os efeitos em seres humanos.

54

8. Conclusão

A associação do exercício aeróbio com a TLBI promoveu efeitos benéficos

nas propriedades biomecânicas, na expressão de mRNA de colágeno tipo I e na

regulação da expressão de mRNA das MMPs 2 e 9 no TA de ratos diabéticos

induzidos por STZ. No entanto, não foi observado diferença entre os grupos nas

propriedades morfológicas analisadas. Como esse foi o primeiro estudo a avaliar

essa associação em tenotomia de animais diabéticos, ressalta-se a necessidade

de pesquisas que investiguem a combinação de diferentes parâmetros da TLBI

e do exercício aeróbio, bem como, que avaliem diferentes fases do processo de

reparo tecidual tanto do tendão como de outros tecidos musculoesqueléticos de

ratos diabéticos, além, de se investigar os efeitos desta combinação em seres humanos.

55

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63

ANEXO 1 Parecer da comissão de ética no uso de animais – CEUA

64

PROTOCOLO N.º 038/2014 (2)

Professor/Pesquisador: WOUBER HERICKSON DE BRITO VIEIRA

Natal (RN), 31 de julho de 2014.

Prezado Professor/Pesquisador,

Vimos, através deste documento, informar que o projeto “EFEITO DA TERAPIA

LASER DE BAIXA INTENSIDADE ASSOCIADA AO EXERCÍCIO AERÓBIO NO

REPARO DO TENDÃO DO CALCÂNEO DE RATOS COM DIABETES MELLITUS

INDUZIDA POR

ESTREPTOZOTOCINA”, protocolo n° 038/2014, após análise das adequações, foi

considerado APROVADO por esta Comissão.

Informamos ainda que, segundo o Cap. 2, Art. 13 do Regimento, é função do professor/pesquisador responsável pelo projeto a elaboração de relatório que deverá ser entregue tão logo a pesquisa seja concluída.

Relatório: OUTUBRO 2015.

Agradecemos a sua atenção e nos colocamos a disposição para eventuais

esclarecimentos.

Cordialmente,

UFRN – Campus Universitário – Centro de Biociências Av. Salgado Filho, S/N – CEP: 59072-970 – Natal/RN e-mail: ceua@reitoria.ufrn.br

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS - CEUA

John Fontenele Araujo Coordenador da CEUA