Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao

Separao por membranas

Extrao em sistemas de duas fases lquidas

Processos de Separao por Membranas Os processos mais empregados para purificao de

bioprodutos so os que utilizam a diferena de presso como fora motriz; no de partculas em suspenso, existem diferentes membranas com diferentes tamanhos e distribuio de poros caracterizando 4 processos:

Em razo da natureza e do tipo de solutos e da presena ou

Microfiltrao; Ultrafiltrao; Nanofiltrao. Osmove inversa.

Principais caractersticas dos processos que utilizam diferena de presso como fora motriz

Faixas de tamanho de poros das membranas

Microfiltrao similar a uma filtrao clssica que utiliza membranas

sintticas como barreira seletiva Emprega membranas microporosas, isotrpicas ou anisotrpicas, com tamanho de poros entre 0,05 a 5 mm empregada para reter partculas em suspenso, tanto no ar quanto em misturas aquosas So membranas totalmente permeveis aos compostos solveis, independentemente do valor de suas massas molares Aplicao: filtrao estril, tanto de lquidos quanto de gases

Ultrafiltrao Emprega membranas microporosas anisotrpicas, com

dimetros de poros entre 1 e 500 nm. Capaz de reter macromolculas em soluo, e

permevel a todos os solutos de baixa massa molar Bastante utilizada na purificao quanto na

concentrao de protenas e enzimas

Osmose Inversa Utiliza membranas anisotrpicas densas, portanto, so permeveis

apenas ao solvente, em geral, gua, retendo, praticamente, todas as molculas solveis e materiais em suspenso; Alta presso faz a gua atravessar a membrana no sentido da soluo

mais concentrada para a menos concentrada.

Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao

Separao por membranas

Extrao em sistemas de duas fases lquidas

Extrao em sistemas de duas fases aquosasUtilizada na purificao de antibiticos e cidos orgnicos; Consiste na separao da molcula-alvo e impurezas baseada em suas diferentes solubilidades nas fases lquidas

Extrao em sistemas de duas fases aquosas Sistemas de duas fases aquosas so formados pela

reunio de determinados polmeros, polieletrlitos, ou polmeros em combinao com solutos de baixa massa molar formando quatro grupos: 2 polmeros no-inicos. Polieletrlito e um polmero no-inico; 2 polieletrlitos Polmero no-inico e um composto de baixa massa

molecular

Extrao em sistemas de duas fases aquosas Sistemas formados por polietilenoglicol e um sal so

intensamente empregados por apresentarem rpida separao das fases, baixo custo e elevada seletividade na separao de molculas com base na solubilidade

Extrao em sistemas de duas fases aquosasDuas solues aquosas imiscveis;

Molcula-alvo P apresenta maior solubilidade na fase de topo em relao fase de fundo;

Maior grau de pureza da molcula-alvo se os contaminantes apresentarem solubilidade maior na fase de fundo

Diagrama de Equilbrio em sistemas de duas fases aquosas (SDFA)Curva de equilbrio de um sistema PEG/fosfato

Reta TMB: linha de amarrao (tie-line)

Curvas de equilbrio do sistema PEG/fosfato de potssio em funo dos parmetros massa molecular e pH do meio

Coeficiente de Partio (K) Grandeza adimensional que representa a relao entre

as concentraes da molcula de interesse na fase de topo e na fase de fundo no equilbrio: K= CTiCFi CTi = Concentrao de soluto i na fase de topo (g/L); CFi= Concentrao de soluto i na fase de fundo (g/L);Utilizado para avaliao da extenso das separaes nos sistemas de duas fases aquosas; Ocorrncia de purificao: coeficientes distintos para a molcula de interesse e para as demais molculas.

Fatores que influenciam no coeficiente de partio K Interaes hidrofbicas Cargas superficiais / pH

Diferena de potencial eltrico entre as fases Efeito de salting-out da fase salina Diferenas de viscosidade

Diferenas de densidade Diagramas de fases (ex.: concentrao de PEG e sal) Massa molecular da biomolcula

Mtodos de Purificao de alta resoluo:

Cromatografia

CromatografiaPrincpio Geral: Reteno e Liberao da molcula-alvo A matriz slida capaz de reter a molcula por um determinado perodo de tempo (tempo de reteno) Eluio do fluido e consequente separao da molcula-alvo

Cromatografia

Cromatografia

Cromatografia Cromatografia de excluso molecular Cromatografia de troca-inica Cromatografia de interao hidrofbica

Cromatografia de afinidade

Cromatografia de excluso molecularProcesso: Os solutos de um meio lquido (protenas, peptdeos,

anticorpos) so adsorvidos ou retidos em um leito de material poroso;

As molculas sofrem partio em virtude das diferenas no

tamanho das espcies entre um solvente (fase mvel) e uma fase estacionria de porosidade definida; fase lquida mvel (eluente), resulta na separao das diferentes molculas

A posterior remoo gradual dos solutos por ao de uma

Cromatografia de excluso molecularSeparao por tamanho das molculas

A ordem de recuperao seletiva das molculas no fluxo eluente tem incio com as maiores molculas, prosseguindo em direo s menores.

Cromatografia de excluso molecular Eluio de uma mistura

de trs protenas de massas moleculares diferentes em uma coluna de permeao em gel, com a formao de faixas distintas medida que a amostra permeia a coluna

Cromatografia de excluso molecular Aplicaes: Dessalinizao Determinao de massas moleculares Determinao de tamanho de poros

Cromatografia de troca-inica Baseia-se na afinidade que componentes de uma amostra

tem com os stios inicos em uma matriz slida, ou seja, existe uma competio entre ons de interesse e contaminantes pelos grupos carregados da matriz ou da fase estacionria. adsoro de protenas

As resinas empregadas apresentam elevada capacidade de A fase estacionria, eletricamente carregada, tem a

capacidade de reter solutos que esto na fase mvel e apresentam cargas de sinais opostos

Controle de pH e fora inica

Cromatografia de troca-inicaMatrizes de troca-inica: Trocadores aninicos: contm grupos positivamente carregados e

adsorvem protenas com carga lquida negativa Trocadores catinicos: contm grupos negativamente carregados

e adsorvem protenas com carga lquida positiva Aps serem adsorvidos matriz, os solutos podem ser eludos

por deslocamento com outros ons, com a mesma carga da protena adsorvida, porm com maior fora de interao com a fase estacionria.

Cromatografia de troca-inica

Princpio bsico da cromatografia de troca inica

Cromatografia de interao hidrofbica Baseia-se na reteno das molculas pela interao da

sua regio hidrofbica com a matriz A protena colocada em meio com elevada

concentrao de sal (expe a regio hidrofbica, aumentando a interao com a matriz)

Cromatografia de interao hidrofbicaMolcula de protena

Cromatografia de interao hidrofbica Modelos de adsoro

a: modelo uniponto; b e c: adsoro uniponto; d: foras hidrofbicas de intensidades diferentes em razo das irregularidades na superfcie da matriz.

Cromatografia de Afinidade Tcnica de separao altamente especfica que

depende das interaes entre os pares de materiais biolgico: enzima-substrato, enzima-inibidor, antgeno-anticorpo. O ligante imobilizado em uma matriz porosa

Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas ativas de formas desnaturadas

Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas nativas de formas desnaturadas

O complexo formado entre o ligante e a protena tem que ser reversvel; A protena eluda e o ligante regenerado.

Cromatografia Ampliao de EscalaCritrios: Manter os mesmos graus de pureza, rendimento, atividade biolgica e, se possvel, rendimento, alcanados em escala de bancada; Purificao de miligramas a gramas de produto; Principal caracterstica: aumento do dimetro da coluna e a

manuteno constante da altura do leito cromatogrfico, exceto para excluso molecular (ainda deve ser aumentado em 10 % a altura do leito);

Cromatografia Ampliao de EscalaParmetros que devem ser mantidos constantes:

Volume da fase estacionria; Grau de empacotamento; Altura do leito cromatogrfico; Velocidade linear de alimentao (vazo volumtrica dividida pela rea de corte transversal da coluna).

Parmetros que devem ter o valor aumentado: Dimetro da coluna; Fluxo volumtrico; Volume de amostra

Colunas industriais Altura de leito em torno de 30 cm e dimetro da ordem de 1 m. Maiores volumes de colunas da ordem de 700 a 2000 L (ex.: purificao do soro de queijo)

Cromatografia Ampliao de Escala