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QBQ4020 – Bioquímica Metabólica Início: 03/08/2015 Fim: 08/12/2015 Dias e horário: sextas-feiras das 19hs às 22h40 Local: sala 04 B6 inferior Professor: Roberto K. Salinas Contato: roberto@iq.usp.br; sala 1001 do bloco 10 inferior Disciplina obrigatória para “Licenciatura Noturno” (sexto semestre) e “Química Ambiental” (sexto semestre) Pré-requisitos: Introdução à bioquímica e Química orgânica II Bibliografia: Stryer e Lehninger

Mês Dia Assunto Agosto 7 Hemoglobina e mioglobina, cooperatividade

14 Cinética enzimática, equação de Michaelis-Menten 21 Cinética enzimática

Mecanismos de catálise e tipos de inibição 28 Cinética

Membrana biológica Compostos ricos em energia (ex. ATP, GTP) Transporte de membrana

Setembro 4 Revisão de estruturas de carboidratos Introdução ao metabolismo dos carboidratos

11 Semana da Pátria 18 Revisão para Prova 1 25 Semana da Química

Outubro 02 Prova 1 09 Via glicolítica

Ciclo de Krebs 16 Cadeia de transporte de elétrons e fosforilação oxidativa 23 Degradação e síntese de glicogênio

Neoglicogênese Regulação, enzimas alostéricas Integração do metabolismo de carboidratos, sinalização por insulina e glucagon

30 Metabolismo de ácidos graxos Fotossíntese

Novembro 06 Revisão 13 Prova 2 – não cai fotossíntese 20 Dia da consciência negra 27 Biossíntese de carboidratos em plantas e bactérias

Dezembro 04 Prova 3 Dezembro 11 Prova substitutiva (aberta) Dezembro 15 Data máxima para cadastro de notas Média Final = (P1 + P2 + P3)/3 Observação: 1) Os alunos que entregarem os exercícios obterão até 0.25 pontos na média final caso necessitem. 2) A nota da prova substitutiva substitui a menor nota.

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Introdução à Bioquímica

Roberto Salinas – roberto@iq.usp.br Instituto de Química - USP

19 de agosto de 2015

1. Estrutura de proteínas Proteínas são polímeros de aminoácidos conectados por ligações peptídicas. A ligação peptídica ocorre devido a uma reação de condensação entre o grupo amino do primeiro aminoácido e a extremidade carboxila do segundo aminoácido (Figura 1):

Figura 1: Reação de condensação entre Alanina e Serina formando um dipeptídeo Ala-Ser com eliminação de uma molécula de H2O. As cargas líquidas do peptídeo e dos aminoácidos não estão mostradas. A ligação peptídica é planar devido à existência de delocalização de elétrons do nitrogênio e do oxigênio da ligação amida. A planaridade da ligação peptídica possui enormes consequências conformacionais. A primeira delas é que a conformação do esqueleto polipeptídico pode ser descrita por apenas três ângulos diedrais: o ângulo ω ao redor da ligação peptídica, e os ângulos φ e Ψ do carbono alfa. Os ângulos φ e Ψ são correlacionados e nem todas as combinações são permitidas devido ao impedimento esterico gerado entre a carbonila e o N-H da ligação peptídica, e entre as cadeias laterais de aminoácidos vizinhos. O gráfico de correlação entre φ e Ψ é chamado de Diagrama de Ramachandran em homenagem ao biofísico indiano que o desenvolveu, e ainda é a principal ferramenta utilizada para avaliar a qualidade estereoquímica das estruturas de proteínas (Figura 2).

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Figura 2. Diagrama de Ramachandran. As regiões delimitadas pelas linhas verdes demarcam combinações permitidas de Ψ e Φ. Pontos fora das regiões delimitadas pelas linhas verdes indicam um aminoácido com algum problema ou correspondem a glicinas. Estruturas tridimensionais de proteínas com resolução atômica podem ser obtidas experimentalmente através de cristalização e Difração de Raios-X, Ressonância Magnética Nuclear em solução, e mais recentemente Crio-Microscopia Eletrônica. Conservação e homologia de sequências Proteínas são polímeros de aminoácidos. A sequência de aminoácidos de uma proteína é chamada estrutura primária. A estrutura tridimensional de uma proteína é determinada pela sequência de aminoácidos. A função biológica de uma proteína está intimamente relacionada com a estrutura tridimensional. A predição da estrutura tridimensional de uma proteína a partir da sequência de aminoácidos não é tarefa simples, especialmente para moléculas com mais de 100 aa. No entanto, a análise da estrutura primária pode oferecer pistas importantes sobre topologia (presença de hélices transmembranares), estrutura secundária e grau de desordem. A relação evolutiva entre proteínas de diferentes organismos pode ser inferida a partir de comparações entre sequências de aminoácidos. Famílias de proteínas que compartilham a mesma estrutura e a mesma função podem ser facilmente identificadas com base em similaridades entre sequências de aminoácidos. Membros de uma mesma família são chamados de proteínas homólogas. A função de uma

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proteína desconhecida pode eventualmente ser deduzida a partir da comparação de sua sequência de aminoácidos com milhares de sequências de proteínas contidas nos bancos de dados (por exemplo UNIPROT). Duas proteínas contendo ao menos 30% de identidade de sequência geralmente compartilham a mesma estrutura e função. Aminoácidos conservados são geralmente importantes para a função. Geralmente, quando estes aminoácidos são alterados no decorrer da evolução as propriedades físico-químicas são mantidas. Este fenômeno é chamado de mutação conservativa. Por exemplo, a mutação de uma Ile por uma Val na mesma posição pode ser tolerável pois trata-se de dois aminoácidos hidrofóbicos. Ou a mutação de um aspartato por um um ácido glutâmico também pode ser tolerável pois trata-se de dois aminoácidos com carga negativa na cadeia lateral. As alterações Ile – Val e Asp - Glu seriam duas mutações conservativas (Figura 3).

Proteína A GVDEQRFRIEVIDDDVFEEDECFYIRLFN-------PSEGVK----------LAVPMIAT Consenso G ++ R+ +IDDD+FEEDE F + L N EG+ L P AT Proteína B GETQKEIRVGIIDDDIFEEDENFLVHLSNIRVSTEASDEGILEASRVSTLACLGSPSTAT

Figura 3. Exemplo de alinhamento de sequências de duas proteínas “A” e “B” de organismos diferentes mas com a mesma função, detectar a concentração de Ca2+ intracelular. Note que “gaps” foram introduzidos na sequência da proteína “A” para optimizar o alinhamento com a proteína “B”. Função: proteínas que ligam Oxigênio (O2) Proteínas assumem diversas funções, mas uma das funções mais comuns é a ligação específica e reversível de outras moléculas. A molécula que se liga à proteína é chamada de ligante. O ligante liga-se a um sítio de ligação, o qual deve ser complementar em forma, tamanho, carga e hidrofilicidade ou hidrofobicidade ao ligante (modelo chave-fechadura). A interação entre o ligante e a proteína é específica, de forma que a proteína pode distinguir o ligante entre milhares de outras moléculas parecidas. Exemplo: enzimas reconhecem especificamente o substrato. No caso das enzimas, o sítio de ligação ao ligante é conhecido como sítio catalítico. Enzimas frequentemente reconhecem um substrato de acordo com um modelo de complementariedade espacial, chave-fechadura. Proteínas são flexíveis, isto é, experimentam conformações distintas que se interconvertem em diferentes escalas de tempo. A interação com um ligante frequentemente induz uma mudança conformacional na proteína de forma a tornar o sítio de ligação o mais complementar possível ao ligante, um processo conhecido como “induced fit”. Alternativamente, a proteína em solução está em equilíbrio entre distintas conformações sendo que apenas uma delas é espacialmente complementar ao ligante. A interação com o ligante desloca o equilíbrio conformacional no sentido da conformação complementar, um processo conhecido como “seleção de confôrmeros” ou “modelo sequencial”. A hemoglobina e a mioglobina foram as duas primeiras proteínas cuja estrutura tridimensional foi determinada experimentalmente. Elas transportam oxigênio. Proteínas não são capazes de coordenar oxigênio, para isso elas utilizam íons metálicos como Fe(II). O Fe(II) normalmente liga-se à proteína na forma complexada a um grupo prostético chamado Heme. O heme é uma protoporfirina que liga um íon

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Fe2+ (Figura 4). O grupo Heme está ligado não covalentemente à proteína (veja PDB 1MBO).

Figura 4. Grupo Heme encontrado na mioglobina e na hemoglobina. O íon Fe2+ faz ligações de coordenação com os quatro átomos de nitrogênio do anel. O Fe2+ ainda pode formar duas outras ligações de coordenação que são formadas com as histidinas proximal e distal (veja PDB 1MBO). A mioglobina consiste de um único polipeptídeo de 153 aminoácidos. O equilíbrio de associação entre a mioglobina e uma molécula de O2 é descrito como:

𝐾𝑎 = [!"]! [!]

= !!!!

(1) onde P é a proteína, L é o ligante, e ka e kd são as constantes de velocidade de associação (segunda ordem) e de dissociação (primeira ordem) do complexo. A fração de sítios ocupados pelo ligante é dada por θ: 𝜃 = !"#çã!  !"  !"#$%í!"#  !"#$%$&

!"#$%í!"  !"!#$= [!"]

!" ![!]= !" ! [!]

!" ! ! ![!]= !"[!]

!" ! !!= [!]

! !!! , (2)

em que [L] é a concentração de ligante total. O comportamento de θ em função de [L] é uma hipérbole (Figura 5). É fácil observar que quando a proteína possui menor afinidade (maior Kd) é necessário adicionar maior quantidade de ligante para atingir saturação (Figura 5). Note que Kd (constante de dissociação) é equivalente à concentração de ligantes necessária para saturar 50% dos sítios de ligação. Portanto o valor de Kd é uma medida clara da afinidade de uma proteína pelo ligante.

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Figura 5. Simulação da curvas de ligação para um complexo ligante:proteína com afinidade estimada por um Kd de 10 µM (azul) e 100 µM (vermelho). Em água, o grupo heme liga-se ao monóxido de carbono (CO) com 20 mil vezes maior afinidade do que ao oxigênio. Por outro lado, quando o heme está ligado na mioglobina a diferença de afinidade cai para 200 vezes. Detalhes estruturais, em particular a interação com a histidina distal explicam porque a afinidade do grupo heme pelo CO diminui. A hemoglobina possui estrutura quaternária, ela é um tetrâmero formado por duas subunidades α e duas subunidades β. Ambas as subunidades α e β são homólogas à mioglobina, mas mesmo assim apresentam baixa identidade de sequência (Figura 6). 1MBO:mioglobina -VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE cadeia alfa -VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFD------LSHGSA beta beta VHLTPEEKSAVTALWGKVNV--DEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNP *: : * *.** . * : * *:: .* * * * .. 1MBO:mioglobina DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH cadeia alfa QVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHL beta beta KVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHF .:* ** .* *: : : . : *:: *. * :: :.::.. :: .* : 1MBO:mioglobina PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKE cadeia alfa PAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR- beta beta GKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH- :* .:.: :* : . . :: **:

Figura 6. Alinhamento de sequência da mioglobina (PDB 1MBO) com as cadeias alfa e beta da hemoglobina (PDB 1HGA).

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.010

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1isoterma de ligacao

concentracao de ligante total (mol/l)

thet

a (%

siti

os o

cupa

dos

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Apesar de diferenças na sequência de aminoácidos, as estruturas tridimensionais da mioglobina (PDB 1MBO) e da hemoglobina (PDB 1HGA) são muito parecidas. A hemoglobina possui quatro grupos heme, um em cada subunidade, podendo transportar até 4 moléculas de O2.

A presença de quatro sítios de ligação e 4 subunidades afeta profundamente as características da hemoglobina como molécula carreadora de oxigênio. A curva de ligação do oxigênio na hemoglobina é sigmoide, indicando que oxigênio liga-se cooperativamente à proteína (Figura 7). Em um processo cooperativo, a interação do ligante com o primeiro sítio altera a afinidade do segundo sítio e assim por diante.

Como consequência da cooperatividade observada na curva de ligação a oxigênio, a porcentagem de saturação da hemoglobina varia muito mais rapidamente com a concentração de oxigênio do que no caso da mioglobina que não é cooperativa. Por exemplo, no equilíbrio de ligação mostrado na Figura 7, nota-se que para ir de 20% a 80% de saturação seria necessário aumentar a concentração de ligante apenas duas vezes, de 12.6 para 25.2 nM (Figura 7). Enquanto que no caso de um equilíbrio não cooperativo como exemplificado na Figura 5, a concentração de ligante deveria ser aumentada aproximadamente 10 vezes para aumentar a fração de sítios ocupados de 20 a 80%. Portanto, uma proteína cooperativa é muito mais sensível a pequenas alterações na concentração de ligante. Esta característica torna a hemoglobina capaz de captar oxigênio nos pulmões, onde a pressão de O2 é maior, e liberar nos tecidos onde a pressão de O2 é menor.

Figura 7. Curva de Hill para uma proteína com 4 sítios de ligação e Kd 0.1 µM. A concentração total de proteína é 1 mM.

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.040

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4curva de Hill

concentracao de ligante (mol/l)

v (n

umer

o de

siti

os o

cupa

dos

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A ligação cooperativa de um ligante com oxigênio em uma consequência da interação entre as subunidades. A estrutura quaternária da hemoglobina envolve um grande número de interações fracas (eletrostática, ligação de hidrogênio e van der Waals) entre as subunidades alfa e beta. Estas interações são cruciais para modular a afinidade dos diferentes sítios de ligação pelo oxigênio. Como ? Monod, Wyman e Changeaux propuseram um modelo para explicar a cooperatividade da hemoglobina. Este modelo, chamado de “concerted model”, propõe que a hemoglobina está em equilíbrio entre um estado tenso (“T”) e outro relaxado (“R”):

O O2 liga-se mais fortemente ao estado R deslocando o equilíbrio na direção da forma “T”. Assim, quando O2 liga-se à primeira subunidades todas as outas subunidades mudam de conformação para a forma “R” concomitantemente. Exercícios para a aula 1

1. A proteína A interage com o ligante X com Kd 10-6 M. A proteína B interage com o mesmo ligante mas com Kd 10-9 M. Qual proteína possui maior afinidade pelo ligante X? Explique.

2. A proteína calcineurina liga-se à calmodulina com uma velocidade de

associação de 103 M-1s-1, e uma constante de dissociação, Kd, de 10 nM. Calcule a velocidade de dissociação do complexo (koff), inclua as unidades adequadas.

3. Desenhe a curva de desnaturação de uma proteína A em função da

temperatura. Assuma que a proteína A seja pequena, e portanto o equilíbrio de desnaturação envolve apenas dois estados. Em seguida, suponha que um mutante foi construído. Este mutante envolve a troca de dois resíduos de Ser por Cys, de tal forma que as duas cisteínas estão próximas uma da outra na estrutura tridimensional da proteína, e formam uma ponte dissulfeto estabilizando a estrutura. Desenhe sobre o mesmo gráfico, a curva de desnaturação do mutante.

4. Estudos de transporte de oxigênio em fêmeas grávidas mostraram que as

curvas de saturação com oxigênio do sangue do feto e do sangue materno são diferentes. Os eritrócitos do feto contém uma variante estrutural da hemoglobina (HbF), que consiste de duas subunidades α e duas γ (a2g2). Enquanto que a hemoglobina da mãe (HbA) consiste de α2β2. Qual hemoglobina possui maior afinidade pelo oxigênio nas condições nativas? Explique.

   

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5. Depois de passar alguns dias em altitudes muito elevadas, a concentração de BPG nos eritrócitos aumenta. Qual será o efeito do aumento da concentração de BPG na curva de saturação da hemoglobina? Proponha uma explicação para porque essa adaptação seria benéfica para o funcionamento do organismo em altas altitudes. Desenhe gráficos para fundamentar a sua resposta. 2. Cinética enzimática Enzimas são catalisadores em sistemas biológicos. As características mais notáveis das enzimas são o seu poder catalítico e a sua especificidade. Quase a totalidade das enzimas são proteínas, porém algumas moléculas de RNA também são capazes de promover catalise. O exemplo mais conhecido de riboenzima é o RNA ribossomal. Uma das funções mais importantes desempenhadas pelas proteínas é o reconhecimento específico de ligantes através da formação de interações não covalentes. Enzimas utilizam esta capacidade para interagir com o substrato (ligante) posicionando-o de forma adequada para que reações químicas possam ocorrer. Enzimas catalisam reações químicas porque estabilizam o estado de transição. Elas catalisam apenas uma reação química, sendo que a ocorrência de reações colaterais é rara em comparação com reações não catalisadas. A tabela 1 ilustra o ganho em velocidade de reação promovido por enzimas selecionadas: Tabela 1: Aumento de velocidade de reação proporcionado por certas enzimas

Enzima Velocidade da reação não catalisada

Velocidade da reação catalisada

Anidrase carbonica 1.3×10-1 s-1 1×106 s-1 Triose fosfato isomerase 4.3×10-6 s-1 4.3×103 s-1 Carboxipeptidase A 3.0×10-9 s-1 578 s-1 Enzimas são altamente específicas para o substrato. Um exemplo desta especificidade são as proteases, enzimas que catalisam a reação de clivagem da ligação peptídica. A papaína é uma protease que não discrimina o aminoácido adjacente à ligação peptídica, assim ela reconhece diferentes sequências de aminoácidos. A tripsina, por outro lado, cliva somente ligações peptídicas adjacentes a lisinas ou argininas, que são aminoácidos de cadeia lateral longa e carregados positivamente. Outro exemplo é a DNA polimerase, uma enzima que catalisa a formação da ligação fosfodiéster para

Chapter 5 Protein Function S-55

(a) Which hemoglobin has a higher affinity for oxygen under physiological conditions, HbA or HbF?Explain.

(b) What is the physiological significance of the different O2 affinities?(c) When all the BPG is carefully removed from samples of HbA and HbF, the measured O2-saturation

curves (and consequently the O2 affinities) are displaced to the left. However, HbA now has agreater affinity for oxygen than does HbF. When BPG is reintroduced, the O2-saturation curvesreturn to normal, as shown in the graph. What is the effect of BPG on the O2 affinity of hemoglobin?How can the above information be used to explain the different O2 affinities of fetal and maternalhemoglobin?

Answer The affinity of hemoglobin for O2 is regulated by the binding of the ligands H!, CO2,and BPG. The binding of each ligand shifts the O2-saturation curve to the right—that is, theO2 affinity of hemoglobin is reduced in the presence of ligand. (a) decreases the affinity; (b) increases the affinity; (c) decreases the affinity; (d) decreases the affinity.

4. Reversible Ligand Binding The protein calcineurin binds to the protein calmodulin with an associationrate of 8.9 " 103 M#1s#1 and an overall dissociation constant, Kd, of 10 nM. Calculate the dissociationrate, kd, including appropriate units.

Answer Kd, the dissociation constant, is the ratio of kd, the rate constant for the dissociationreaction, to ka, the rate constant for the association reaction.

Kd $ kd!ka

Rearrange to solve for kd and substitute the known values.

kd $ Kd " ka $ (10 " 10#9 M)(8.9 " 103 M#1s#1) $ 8.9 " 10#5 s#1

5. Cooperativity in Hemoglobin Under appropriate conditions, hemoglobin dissociates into its foursubunits. The isolated a subunit binds oxygen, but the O2-saturation curve is hyperbolic rather than sig-moid. In addition, the binding of oxygen to the isolated a subunit is not affected by the presence of H!,CO2, or BPG. What do these observations indicate about the source of the cooperativity in hemoglobin?

Answer These observations indicate that the cooperative behavior—the sigmoid O2-bindingcurve and the positive cooperativity in ligand binding—of hemoglobin arises from interactionbetween subunits.

6. Comparison of Fetal and Maternal Hemoglobins Studies of oxygen transport in pregnant mammalsshow that the O2-saturation curves of fetal and maternal blood are markedly different when measuredunder the same conditions. Fetal erythrocytes contain a structural variant of hemoglobin, HbF, consistingof two a and two g subunits (a2g2), whereas maternal erythrocytes contain HbA (a2b2).

1.0

0.5

0

v

42 6 8 10pO2 (kPa)

HbF!BPG

HbA!BPG

2608T_ch05sm_S54-S62 2/1/08 5:56PM Page S-55 ntt 102:WHQY028:Solutions Manual:Ch-05:

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formar uma nova dupla-fita de DNA. Ela é praticamente insensível a erros incorporando menos de um nucleotídeo errado a cada mil. Dessa forma a DNA polimerase é uma enzima altamente específica para a fita de DNA molde. Equilíbrio O sentido de uma reação química depende da variação da energia livre de Gibbs envolvida (∆G = Gprodutos - Greagentes). Reações com ∆G negativo são espontâneas, enquanto que reações com ∆G positivo não são espontâneas e precisam de energia para ocorrer. Reações com ∆G = 0 estão no equilíbrio. O valor do ∆G depende apenas dos estados inicial e final, independe do caminho. A magnitude e o sinal do ∆G nada informam sobre a velocidade com que as reações ocorrem. Por exemplo, a reação de oxidação de glicose (C6H6O6) a CO2 e H2O é espontânea, mas não ocorre a taxas perceptíveis na ausência de enzimas. O ∆G de combustão da glicose é o mesmo caso a reação seja catalisada ou não. O grau de espontaneidade de uma reação química depende do valor do ∆G, o qual depende, por sua vez, das concentrações de reagentes e produtos conforme a equação 3:

∆𝐺 =  ∆𝐺°+ 𝑅𝑇𝑙𝑛 !"#$%&#'!"#$"%&"'

, (3) sendo que

∆𝐺° = −𝑅𝑇𝑙𝑛𝐾!" . (4) A Tabela 2 mostra a correlação entre constantes de equilíbrio e ∆G. Note como reações com ∆G positivo não ocorrem na direção esperada, ao contrário de reações com ∆G negativo (Tabela 2).

Tabela 2. Relação entre Keq e ∆G. Keq ∆G (kJ/mol) 10-6 34.2 10-3 17.1 1.00 0.00 101 -5.7 103 -17.1

6. Reações químicas que não são espontâneas (∆G0 > 0) podem tornar-se espontâneas ajustando-se as concentrações de reagentes e produtos. Este aspecto é determinante em condições celulares. Por exemplo, considere a reação de isomerização de dihidroxicetona-fosfato (DHAP) em gliceraldeido-3-fosfato (GAP) que ocorre durante a via glicolítica. A razão entre as concentrações de DHAP e GAP no equilíbrio é 0.0475 a 298 K e pH 7 (R = 8315 JK-1mol-1). Pergunta-se:

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i) A reação de isomerização de DHAP em GAP nas condições de equilíbrio é espontânea?

ii) A reação será espontânea quando as concentrações de DHAP e GAP forem 200 µM e 3 µM, respectivamente?

Enzimas aceleram reações químicas mas não alteram o equilíbrio da reação, que é dado apenas em função da diferença de energia livre entre produtos e reagentes (Figura 8). A velocidade das reações químicas é expressa a partir de uma medida da variação da concentração de produtos ou reagentes em função do tempo. Considere o equilíbrio entre dihidroxicetona-fosfato (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (GAP) ilustrado abaixo:

Este equilíbrio possui velocidades no sentido da formação de gliceraldeido-3-fosfato ou dihidroxicetona-fosfato. A velocidade da reação direta é expressa como:

𝑣 = ![!"#$]!"

= 𝑘[𝐷𝐻𝐴𝑃] (5) onde a constante de velocidade “k” é expressa em s-1. Reações que são diretamente proporcionais à concentração do reagente são chamadas de “reações de primeira ordem”. Reações bimoleculares e cuja velocidade é proporcional à concentração de dois reagentes são chamadas “reações de segunda ordem”, neste caso a constante cinética é expressa em M-1s-1. Catálise enzimática A velocidade de uma reação química é diretamente proporcional à energia de ativação. Enzimas agem como catalisadores biológicos, e atuam para diminuir a barreira de energia de ativação conforme mostrado na Figura 8, acelerando a reação. A forma pela qual enzimas diminuem a barreira de energia é através da estabilização do estado de transição. A primeira etapa de uma reação catalítica é a formação de um complexo específico entre enzima e substrato. Dessa forma, a enzima é capaz de orientar o(s) substrato(s) adequadamente para que a reação química ocorra.

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Figura 8. Diagrama de energia livre em função da coordenada de reação para uma reação na ausência (preto) e presença da enzima (vermelho). A enzima estabiliza a o estado de transição, diminuindo a barreira de energia de ativação. A velocidade das reações químicas depende da constante de velocidade e das concentrações dos reagentes. Portanto, não é de estranhar que a velocidade de uma reação enzimática, medida a partir da taxa de formação do produto “P”, aumente com a concentração de enzima:

v = k[E]total . (6) A velocidade da reação também aumenta com a concentração de substrato como seria de esperar. O curioso é que a velocidade de reação aumenta linearmente para baixas concentrações de substrato, mas deixa de aumentar em altas concentrações de substrato e atingir um valor máximo (Vmax) (Figura 9). Com certeza, a velocidade de uma reação não catalisada não apresenta este efeito de saturação.

Figura 9. Velocidade inicial (v0) em função da concentração de substrato (azul). Comparação com enzimas diferentes apresentando menor KM (verde) ou maior Vmax (vermelho). Para compreendermos a origem deste efeito de saturação é preciso considerar as condições em que as medidas foram realizadas. Medidas de velocidades de reações enzimáticas são geralmente realizadas nos intervalos de tempo iniciais da reação, e

Produtos

Reagentes

ET‡G0

Coordenada de reação

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

[Substrato] (M)

v 0

controlemaior Vmaxmenor KM

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em condições de baixíssima concentração de enzima e um excesso de substrato. Quando a enzima é misturada com um excesso de substrato, há um período inicial durante o qual as concentrações de intermediários, de complexo enzima-substrato (ES) aumentam até atingir valores estacionários. Uma vez que os intermediários atingiram concentrações estacionarias, as velocidades de reação alteram-se muito pouco com o tempo. Leonor Michaelis e Maud Menten propuseram em 1913 um modelo simples para explicar as características cinéticas observadas na Figura 9. O modelo de Michaelis-Menten pressupõe que o complexo ES é um intermediário da reação catalítica. O complexo enzima-substrato também costuma ser chamado de “complexo de Michaelis”:

A reação catalítica é dividida em duas etapas. Inicialmente ocorre a interação entre uma molécula da enzima e outra do substrato, formando o complexo “ES”. Este primeiro equilíbrio é considerado rápido e reversível, e não envolve alterações das ligações químicas. O complexo ES é mantido por interações não covalentes. As reações químicas ocorrerão em uma segunda etapa, na qual o complexo ES se decompõe em enzima livre e produto. Esta segunda etapa segue uma cinética de primeira ordem, dependente da constante k2 ou kcat. O complexo ES também pode ser formado a partir da reação reversa entre enzima e produto. Mas como as medidas são realizadas nos instantes iniciais em que a concentração de produto é muito pequena, a reação reversa pode ser ignorada. Esta análise também assume que a decomposição de ES em enzima e produto livres é rápida, e portanto pode ser ignorada. O esquema final é:

Com um pouquinho de álgebra e assumindo-se a condição de estado estacionário, é possível chegar a uma equação simples para a velocidade inicial de reação em função da concentração de substrato e das constantes cinéticas. Esta é a chamada “equação de Michaelis-Menten”, e reproduz muito bem o comportamento ilustrado na Figura 9:

𝑣! =!![!]![!]

!!!!!!!!

![!]= !!"#[!]

!!![!] . (7)

A constante cinética k2 ou kcat é frequente chamada de “turnover”. Ela representa o número máximo de moléculas de substrato convertidas em produto por unidade de tempo. A constante kcat é uma constante de velocidade de primeira ordem. Na presença de excesso de substrato, a velocidade inicial v0 atinge o valor máximo (Vmax) que depende apenas da constante catalítica kcat.

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𝑉!"# = 𝑘![𝐸]!"!#$ (8) KM é igual à concentração de substrato na qual a metade da velocidade máxima (v0 = Vmax/2) é atingida. Dessa forma KM representa a concentração de substrato necessária para se atingir uma taxa razoável de conversão de substratos em produtos. E na situação particular em que k2 << k-1, KM representa a constante de dissociação do complexo ES. As tabelas 3 e 4 apresentam os valores do turnover e de KM para algumas enzimas.

A Figura 9 ilustra o efeito de variações de KM e Vmax sobre o comportamento cinético de uma enzima. Tabela 3. Turnover de algumas enzimas

Enzima kcat (s-1) Anidrase carbonica 6.0×105 Acetilcolinesterase 2.5×104

Lactato desidrogenase 1.0×103 Tabela 4. KM de algumas enzimas

Enzima Substrato (s-1) KM (µM) Anidrase carbonica CO2 8.0×103 β-galactosidase Lactose 4.0×103

Arginina-tRNA-sintetase Arginina 3 Normalmente, em condições fisiológicas, a velocidade de uma reação enzimática é dada pela razão kcat/KM, que é uma constante de velocidade de segunda ordem aparente:

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

[Substrato] (M)

v 0

controlemaior Vmaxmenor KM

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𝑣! =

!!"#!!

𝐸 [𝑆]. (9) Em uma condição em que a concentração de substrato for muito menor do que o KM,

𝑣! =!!"#!!

[𝐸]!"!#$[𝑆]. (10) A razão kcat/KM depende tanto da eficiência da reação catalítica kcat, como da afinidade entre enzima e substrato, KM. Esta razão é uma boa medida da especificidade da interação entre enzima e substrato como mostra a Tabela 5. Neste caso , fica evidente que a quimotripsina possui preferência por substratos volumosos como a fenilalanina. Tabela 5. Preferências da quimotripsina pelo substrato

Ester de amino ácido kcat/KM (M-1s-1) Glicina 1.3×10-1 Valina 2.0

Fenilalanina 1.0×105 É interessante imaginar o quão eficiente uma enzima pode ser. A resposta para essa pergunta depende do limite da razão kcat/KM. Suponha que a decomposição do complexo ES em enzima e produtos seja muito mais rápida do que a velocidade de dissociação do complexo (k2 >> k-1), neste caso o limite é dado por k1, a constante de velocidade de formação do complexo “ES”. O limite para k1 é a velocidade de difusão das moléculas em solução, um número da ordem de 108 a 109 M-1s-1. Enzimas que possuem valor kcat/KM nesta faixa são ditas “perfeitas”, pois atingiram a perfeição catalítica (Tabela 6). Tabela 6 Enzimas que atingiram perfeição catalítica Enzima kcat/KM (M-1s-1)

Acetilcolinesterase 1.6×108 Anidrase carbônica 8.3×107

Catalase 4.0×107 Representação gráfica dos dados É muito útil linearizar a equação de Michaelis-Menten para determinar os valores de kcat e KM, e também para examinar desvios da idealidade. Dessa forma, um gráfico de 1/v em função de 1/[S] obedeceria a uma equação de reta igual a:

!!= !!

!!"#

![!]+ !

!!"#. (11)

A análise dessa equação indica que o ponto em que o gráfico cruza o eixo das ordenadas equivale a 1/Vmax e que o coeficiente angular é dado por KM/Vmax. Inibição

  16  

Enzimas podem ser inativadas pelo aumento da temperatura, ou pela interação não covalente com inibidores, pequenas moléculas que competem com o substrato pelo sítio ativo. Estes inibidores são chamados de “competitivos”. No caso de um inibidor competitivo, o mecanismo de Michaelis-Menten teria que ser alterado para:

E não é difícil derivar a equação de Michaelis-Menten levando em conta o equilíbrio entre a enzima e o inibidor competitivo:

𝑣 = !!"#[!]

!! !! !!!

![!]. 12

Observa-se que o KM aparente aumentou por um fator de (1+[I]/KI), ou seja, a afinidade aparente entre enzima e substrato diminuiu. Note que o inibidor competitivo não afeta o Vmax, apenas KM. Mecanismos De onde vem o poder catalítico e a especificidade das enzimas? Nós já vimos que as enzimas formam um complexo com o substrato através da formação de interações não covalente, e que elas interagem melhor com o estado de transição. Como isto ocorre? Estruturas cristalográficas e ensaios de mutação sítio-dirigida permitiram obter a resposta em alguns casos. Os mecanismos descritos abaixo trazem exemplos de um ou mais tipos de catálise: a)catálise covalente: em que o sítio ativo contem um núcleofilo poderoso que liga-se covalentemente a parte do substrato durante a catálise b)catálise ácido-base: uma molécula que não seja a água assume o papel de doador/aceptor de prótons c)catálise por aproximação: enzimas facilitam proximidade entre os substratos trazendo-os para uma mesma superfície de interação d)catálise por íon metálico: íons metálicos agem cataliticamente, por exemplo ao facilitar a formação de nucleófilos. Proteases Enzimas proteolíticas possuem a tarefa de acelerar a reação de hidrólise da ligação peptídica.

  17  

Embora esta reação seja termodinamicamente favorável, ela é extremamente lenta na ausência de um catalisador. Para promover a clivagem da ligação peptídica a enzima deve facilitar um ataque nucleofílico no grupo carbonila da ligação peptídica. A quimotripsina emprega um nucleofico forte capaz de fazer este ataque nucleofilico. Este nucleofilo é o grupo hidroxil da cadeia lateral de uma serina extraordinariamente reativa. A reatividade extraordinária da Ser195 vem do fato de que o grupo OH da cadeia lateral forma uma ligação de hidrogênio com a His57. O grupo NH da His57 forma, por sua vez, uma ligação de hidrogênio com a cadeia lateral do Asp102. Este arranjo, conhecido como “tríade catalítica”, estabiliza uma carga negativa na cadeia lateral da Ser195, que se torna extraordinariamente ácida (Figura 10).

Figura 10. Tríade catalítica da quimotripsina formada pela Ser195, His57 e Asp102. A rede de ligações de hidrogênio torna o grupo OH da Ser195 extremamente reativo e estabiliza um oxiânion. O mecanismo proposto para a reação catalítica envolve um ataque nucleofilico do oxigênio da cadeia lateral da Ser195 sobre a carbonila do substrato, que assume configuração teatraédrica intermediário e uma carga negativa no oxigênio da carbonila. Esta carga negativa será estabilizada por grupos NH da proteína, que formam o chamado “oxyanion hole”. O passo seguinte envolve a clivagem da ligação peptídica ao mesmo tempo em que o próton ligado à His57 é transferido para o grupo amino da cadeia polipeptídica livre. Como resultado, a enzima permaneceu acilada por parte da cadeia polipeptídica. Portanto, este mecanismo envolve a formação de

  18  

um intermediário covalente, e a próxima etapa deve se a hidrólise desse intermediário covalente. Na próxima etapa uma molécula de água ocupa o lugar do grupo amino do substrato. A His57 age como uma base e abstrai um próton da água, enquanto o grupo hidroxila ataca a carbonila do intermediário que colapsa liberando a segunda metade do peptídeo e regenerando a enzima. Este mecanismo não explica a especificidade da enzima. A quimiotripsina cliva ligações peptídicas adjacentes a cadeias laterais grandes e volumosas, como fenilalanina. O reconhecimento do substrato envolve a interação da cadeia lateral na posição amino-terminal à ligação que será clivada, com um bolsão hidrofóbico. Este bolso hidrofóbico possui, no caso da quimiotripsina, maior afinidade por cadeias laterais aromáticas e volumosas. A quimiotripsina é uma protease da classe das serino-proteases, pois utiliza a cadeia lateral de uma Serina para fazer o ataque nucleofílico na carbonila. Outras classes de proteases utilizam uma estratégia semelhante, as cisteíno-proteases, aspartil-proteases e as metalo-proteases. Nestas três classes de proteases, o mecanismo de catálise segue o mesmo padrão. Primeiro ocorre a ativação de um agente nucleofílico capaz de realizar um ataque sobre a carbonila da ligação peptídica que será clivada. No caso das cisteíno-proteases, esse agente será uma cisteína que assume a função da serina. No caso das metaloproteases ou aspartil-proteases, o ataque nucleofílico é efetuado por uma molécula de água reativa. Frequentemente, o grupo carbonila que sofre o ataque também é polarizado, de forma a assumir menor densidade eletrônica. O terceiro aspecto importante é a estabilização do intermediário teatraédrico através da formação do “oxyanion hole”. No caso das metalo-proteases, um íon metálico, por exemplo Zn2+, interage com uma molécula de água polarizando-a e tornando-a altamente reativa. Anidrase carbônica A anidrase carbônica é uma enzima cuja função é acelerar a reação de hidratação de CO2 formando o ânion bicarbonato:

As constantes k1 (pseudo-primeira ordem) e k-1 (primeira ordem) são 0.15 s-1 e 50 s-1, respectivamente, na ausência de catalisador. Portanto o equilíbrio da reação é deslocado no sentido da formação de CO2. Anidrase carbônica acelera a reação de hidratação de CO2 para velocidades kcat = 106 s-1. A enzima possui um íon Zn2+ coordenado por três histidinas, o quarto ponto de coordenação do Zn2+ é satisfeito por uma molécula de H2O. O turnover da anidrase-carbônica é altamente dependente do pH, e apresenta uma transição de um estado de baixa atividade em pH baixo para um estado de alta

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atividade em pHs maiores que 9, sendo que o ponto médio dessa transição é o pH 7. O grupo responsável por essa transição é uma molécula de água que está coordenada pelo Zn2+. A interação com o Zn2+ faz com que o pKa da molécula de água diminuísse de 15.7 para 7.0. Esta molécula de água é capaz de perder um próton facilmente devido ao pKa mais baixo, formando um radical hidroxila que é capaz de realizar um ataque nucleofílico no CO2 gerando um íon bicarbonato. Exercícios 6. Uma enzima recém descoberta catalisa a reação descrita abaixo.

O valor do turnover encontrado para esta enzima é 600 s-1. Quando [E]T = 20×10-9 M e [T] = 40 µM, a velocidade máxima da reação é v0 = 9.6 µMs-1. Calcule o KM para o substrato. 7. Em um experimento diferente usando [E]T = 10 nM a velocidade inicial de reação encontrada foi v0 = 3 µMs-1. Qual foi a concentração de substrato utilizada neste experimento? 8. Uma enzima que catalisa a reação de conversão entre duas moléculas “X” e “Y” é isolada de duas espécies de bactérias. As enzimas possuem o mesmo Vmax, mas possuem valores de KM diferentes. A enzima A possui KM = 2.0 µM, enquanto que a enzima B possui KM = 0.5 µM. A gráfico abaixo mostra a cinética de duas reações efetuadas com a mesma concentração de enzima e [X] = 1 µM. Qual curva corresponde a qual enzima?

9. O exame da estrutura de uma enzima permite formular hipóteses sobre a contribuição de cada aminoácidos para a estrutura e para a atividade da enzima. Uma forma de testar essas hipóteses é usar técnicas de DNA recombinante para gerar mutantes, e examinar os efeitos das mutações sobre a estrutura e atividade da enzima. A lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima que catalisa a redução de piruvato com NADH para formar lactato. Um esquema do sítio ativo da enzima, contendo piruvato e NADH ligados, está mostrado abaixo:

S-66 Chapter 6 Enzymes

(c) An enzyme that catalyzes the reaction X zy Y is isolated from two bacterial species. The enzymeshave the same Vmax, but different Km values for the substrate X. Enzyme A has a Km of 2.0 !M,while enzyme B has a Km of 0.5 !M. The plot below shows the kinetics of reactions carried outwith the same concentration of each enzyme and with [X] ! 1 !M. Which curve corresponds towhich enzyme?

Answer(a) Here we want to find the value of [S] when V0 ! 0.25 Vmax. The Michaelis-Menten

equation is

V0 ! Vmax[S]/(Km " [S])

so V0 ! Vmax when [S]/(Km " [S]) ! 0.25; or

[S] ! 0.33Km ! 0.33(0.0050 M) ! 1.7 # 10$3 M

(b) The Michaelis-Menten equation can be rearranged to

V0/Vmax ! [S]/(Km " [S])

Substituting [S] ! %12% Km into the equation gives

V0/Vmax ! 0.5 Km/1.5Km ! 0.33

Similarly, substituting [S] ! 2Km gives

V0/Vmax ! 0.67

And substituting [S] ! 10Km gives

V0/Vmax ! 0.91

(c) The upper curve corresponds to enzyme B ([X] is greater than the Km for this enzyme),and the lower curve corresponds to enzyme A. When the initial concentration of sub-strate is greater than Km, the rate of the reaction is less sensitive to the depletion of substrate at early stages of the reaction and the rate remains approximately linear for alonger time.

9. Applying the Michaelis-Menten Equation I A research group discovers a new version of happyase,which they call happyase*, that catalyzes the chemical reaction

HAPPY 88zy88 SAD

The researchers begin to characterize the enzyme.(a) In the first experiment, with [Et] at 4 nM, they find that the Vmax is 1.6 !M s$1. Based on this ex-

periment, what is the kcat for happyase*? (Include appropriate units.)

Time

[Y]

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O mecanismo da reação é similar ao mecanismo de outras reduções por NADH. O estado de transição envolve o grupo carbonil do piruvato fortemente polarizado:

Pergunta-se: i) Um mutante da LDH no qual a Arg109 foi substituída por Gln mostra apenas 5 % de ligação a piruvato e 0.07 % da atividade da enzima selvagem. Proponha uma explicação para os efeitos desta mutação ii) Você espera que a substituição da Arg171 por uma lisina afete a afinidade da enzima pelo piruvato? Por quê?

(b) Using the Living Graph for Equation 6–30 and the kinetic parameters in (a), create a plot inwhich both a and a! are 1.0. Now observe how the plot changes when a " 2.0; when a! " 3.0;and when a " 2.0 and a! " 3.0.

(c) Using the Living Graphs for Equation 6–30 and the Lineweaver-Burk equation in Box 6–1, createLineweaver-Burk (double-reciprocal) plots for all the cases in (a) and (b). When a " 2.0, doesthe x intercept move to the right or to the left? If a " 2.0 and a! " 3.0, does the x interceptmove to the right or to the left?

Answer(a) When [S] increases from 0.2 to 0.4 mM, V0 increases by a factor of 1.96. When [S] " 10

mM, V0 " 50 mM s#1. When [S] increases from 100 to 200 mM, V0 increases by a factor of1.048.

(b) When a " 2.0, the curve is shifted to the right as the Km is increased by a factor of 2.When a! " 3.0, the asymptote of the curve (the Vmax) declines by a factor of 3. Whena " 2.0 and a! " 3.0, the curve briefly rises above the curve where both a and a! " 1.0,due to a decline in Km. However, the asymptote is lower because Vmax declines by afactor of 3.

(c) When a " 2.0, the x intercept moves to the right. When a " 2.0 and a! " 3.0, the xintercept moves to the left.

Data Analysis Problem23. Exploring and Engineering Lactate Dehydrogenase Examining the structure of an enzyme re-

sults in hypotheses about the relationship between different amino acids in the protein’s structure andthe protein’s function. One way to test these hypotheses is to use recombinant DNA technology togenerate mutant versions of the enzyme and then examine the structure and function of these alteredforms. The technology used to do this is described in Chapter 9.

One example of this kind of analysis is the work of Clarke and colleagues on the enzyme lactatedehydrogenase, published in 1989. Lactate dehydrogenase (LDH) catalyzes the reduction of pyruvatewith NADH to form lactate (see Section 14.3). A schematic of the enzyme’s active site is shown below;the pyruvate is in the center:

Chapter 6 Enzymes S-75

NH2

H3C

OC H

HC

CH3

O(NADH)Pyruvate

O

CO

N

C

H

H3C CH2

CH3

Ile250

Lactate dehydrogenase

Gln102

OH

H

C

Thr246

–

H

C

OO

Asp168

His195 +

–

HN

N

CNHH

HNH

NH

Arg109

+

C

HNH

NH

HHN

Arg171

+

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S-76 Chapter 6 Enzymes

The reaction mechanism is similar to many NADH reductions (Fig. 13–24); it is approximately thereverse of steps 2 and 3 of Figure 14–7. The transition state involves a strongly polarized carbonylgroup of the pyruvate molecule as shown below:

(a) A mutant form of LDH in which Arg109 is replaced with Gln shows only 5% of the pyruvate bind-ing and 0.07% of the activity of wild-type enzyme. Provide a plausible explanation for the effectsof this mutation.

(b) A mutant form of LDH in which Arg171 is replaced with Lys shows only 0.05% of the wild-typelevel of substrate binding. Why is this dramatic effect surprising?

(c) In the crystal structure of LDH, the guanidinium group of Arg171 and the carboxyl group of pyru-vate are aligned as shown in a co-planar “forked” configuration. Based on this, provide a plausibleexplanation for the dramatic effect of substituting Arg171 with Lys.

(d) A mutant form of LDH in which Ile250 is replaced with Gln shows reduced binding of NADH. Pro-vide a plausible explanation for this result.

Clarke and colleagues also set out to engineer a mutant version of LDH that would bind and re-duce oxaloacetate rather than pyruvate. They made a single substitution, replacing Gln102 with Arg;the resulting enzyme would reduce oxaloacetate to malate and would no longer reduce pyruvate tolactate. They had therefore converted LDH to malate dehydrogenase.

(e) Sketch the active site of this mutant LDH with oxaloacetate bound.(f) Provide a plausible explanation for why this mutant enzyme now “prefers” oxaloacetate instead

of pyruvate.(g) The authors were surprised that substituting a larger amino acid in the active site allowed a

larger substrate to bind. Provide a plausible explanation for this result.

Answer(a) In the wild-type enzyme, the substrate is held in place by a hydrogen bond and an ion-

dipole interaction between the charged side chain of Arg109 and the polar carbonyl ofpyruvate. During catalysis, the charged Arg109 side chain also stabilizes the polarizedcarbonyl transition state. In the mutant, the binding is reduced to just a hydrogen bond,substrate binding is weaker, and ionic stabilization of the transition state is lost, reducingcatalytic activity.

(b) Because Lys and Arg are roughly the same size and have a similar positive charge, theyprobably have very similar properties. Furthermore, because pyruvate binds to Arg171 by(presumably) an ionic interaction, an Arg to Lys mutation would probably have littleeffect on substrate binding.

(c) The “forked” arrangement aligns two positively charged groups of Arg residues with thenegatively charged oxygens of pyruvate and facilitates two combined hydrogen-bond andion-dipole interactions. When Lys is present, only one such combined hydrogen-bondand ion-dipole interaction is possible, thus reducing the strength of the interaction. Thepositioning of the substrate is less precise.

(d) Ile250 interacts hydrophobically with the ring of NADH. This type of interaction is notpossible with the hydrophilic side chain of Gln.

!OOC"ACH3

AC

OGG

O–

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