Sandra Rodrigues Mascarenhas

Regulação de Timócitos por Ouabaína: mudanças fenotípicas

e funcionais

Tese de Doutorado submetida à

Universidade Federal do Rio de Janeiro

visando a obtenção do grau de Doutor em

Ciências

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2006

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2

Sandra Rodrigues Mascarenhas

Regulação de Timócitos por Ouabaína: mudanças fenotípicas e

funcionais

Tese de doutorado submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro

visando a obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas

(Fisiologia)

Orientadora: Vivian M. Rumjanek

Profa. Titular do Instituto de Bioquímica Médica

CCS/UFRJ

universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2006

3

FICHA CATALOGRÁFICA

Rodrigues-Mascarenhas, Sandra

REGULAÇÃO DE TIMÓCITOS POR OUABAÍNA: MUDANÇAS

FENOTÍPICAS E FUNCIONAIS.

Rio de Janeiro: UFRJ/CCS/ICB/ Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho e Instituto de Bioquímica Médica, 2006.

p. 162

Tese de Dourorado em Ciências Biológicas (Fisiologia)

1. Na+/K+ATPase 2. Ouabaína 3. Timócitos 4. MAPKs

3. Cálcio 4. NFAT

4

Regulação de Timócitos por Ouabaína: mudanças fenotípicas e

funcionais

Sandra Rodrigues Mascarenhas

Tese de Doutorado submetida ao corpo docente do curso de pós-

graduação do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade

Federal do Rio de Janeiro-UFRJ, como parte dos requisitos necessários à

obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia)

Aprovada por: Dr. Julio Scharfstein – IBCCF/UFRJ

Dra. Carmen Cabanelas Pazos de Moura – IBCCF/UFRJ

Dr. Célio Geraldo Freire de Lima – IBCCF /UFRJ

Dra. Vivian M. Rumjanek – Instituto de Bioquímica/UFRJ (Orientadora)

Dr. Robson Coutinho-Silva – IBCCF/UFRJ (Revisor)

Suplente Externo: Dr. Alberto Felix Antonio da Nóbrega – IMPPG/UFRJ

Suplente Interno: Dra. Doris Rosenthal – IBCCF/UFRJ

universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Janeiro 2006

5

Este trabalho foi realizado no laboratório de Imunologia

Tumoral com os auxílios financeiros concedidos pela CAPES,

FAPERJ e CNPq/PRONEX.

6

Esta tese é dedicada `a minha avó Marina in memoriam.

Nada passou despercebido.

7

AGRADECIMENTOS

Vivian Mary não é apenas minha orientadora. Após tantos anos de convivência, estabelecemos um vínculo que vai muito além da relação profissional. Conseguimos nos comunicar até pelo olhar e nossos diálogos podem ser incompreensíveis para quem está por perto. Aliás, isto vem tomando grandes proporções com nossas aulas de LIBRAS (linguagem brasileira de sinais), que fazem parte de nosso mais novo projeto. Sinto-me muito honrada em conviver com uma pessoa tão brilhante. Conversar com ela sobre ciência, cinema, os melhores livros e TODO o resto é sempre muito prazeroso, e geralmente termina com ótimas risadas. Não é possível descrever o enorme carinho que sinto e como ela tem influenciado todo o meu pensamento científico e minha vida. Obrigada pelos ensinamentos, pela dedicação, amizade, incentivo e cumplicidade.

Não consigo imaginar o que seria de nosso laboratório e, principalmente de mim, sem a Dra. Ottilia, que me acompanha desde a iniciação científica. Ela esteve presente em muitas fases da minha vida, desde de quando comecei a ir para o Fundão sozinha até o dia em que fui estudar na Espanha. Minha querida Mary Poppins sempre esteve ao meu lado e acima de tudo, me apoiou nos melhores e nos piores momentos. Além disso, ela sabe absolutamente tudo de química e suas explicações sobre o assunto demonstram uma clareza, simplicidade e inteligência muito raras. Sua orientação também moldou meu pensamento científico e foi imprescindível para minha formação como pesquisadora e ser humano. É muito bom contar uma amizade tão valiosa.

Ao Professor Leopoldo de Meis, pela oportunidade de participar da peça de teatro O Método Científico.

Ao Professor Franklin Rumjanek, pelo apoio ao longo de minha formação e pela colaboração nos experimentos de PCR.

Ao Professor Jorge Moscat e à Maria Teresa Diaz-Meco, que não poderiam ter me recebido melhor em seus laboratórios durante minha permanência em Madrid. Muito obrigada pela confiança!

Aos membros da banca desta tese, Dr. Julio Scharfstein, Dra. Carmen Cabanelas Pazos de Moura e Dr. Célio Geraldo Freire de Lima, além do revisor Dr. Robson Coutinho-Silva e dos suplentes Dr. Alberto Felix Antonio da Nóbrega e Dra. Doris Rosenthal, obrigada por aceitarem tão prontamente o meu convite.

Ao corpo técnico do laboratório: Jack, minha fiel escudeira e amiga, Tião, pela confiança e cumplicidade, e ao Emílio e André pelo apoio e por manterem o nosso biotério.

Neste laboratório, fiz amizades que durarão toda uma vida, principalmente com os mais antigos. Gostaria de agradecer à Neusinha, que é muito querida. A distância que nos separa, agora nem tanto, jamais interferiu na nossa amizade. Mesmo após meses sem nos falar pessoalmente, qualquer encontro acontece como se estivéssemos nos encontrado no dia anterior, salvo para disputa em ver quem fala mais e conta todas as novidades.

My best friend Luis, companheiro de ciência, cinema, viagens e barzinhos. Eu assumo que às vezes temos opiniões diferentes no que se refere à filmes, e que quase sempre discutimos, ardorosamente, depois de uma sessão de cinema, enquanto a Lane e o Fernando morrem de rir. Mas tudo sempre se resolve quando chegamos numa pizzaria maravilhosa. Numa coisa

8

nunca discordamos: saudade não tem idade. Muito sucesso para você em João Pessoa.

À Karencita, obrigada pelo companheirismo, principalmente nas viagens com o pessoal do teatro, e por ser sempre tão solícita. Fiquei muito feliz pela sua conquista, mas sinto saudade dos velhos tempos de laboratório...

À Mabeline, você é uma super-amiga e sempre soube de todos os meus compromissos. Não sei como eu vou me organizar sem você por aqui, acho que vou ter que usar uma agenda. Passamos por muitos momentos juntas, todas as viagens, papos e eventos “extra-curriculares” estão guardados na memória. Teremos que destilar nossos “venenos” via internet. Muita sorte para você aí em Salvador.

À Claudia, minha jornalista favorita, nós somos tão parecidas! Como é bom ter alguém que me entende perfeitamente. È só eu começar a abanar as mãos para você perceber tudo e vice-versa! Além disso, você é sempre muito presente e atenciosa. Eu valorizo muito nossa amizade.

Ao Flavinho, por ser uma pessoa tão boa e solícita. Sua presença no laboratório torna tudo melhor.

À Flavia, por todo apoio e colaboração nos experimentos na fase final desta tese.

À Andréia e à Nívea, pela colaboração nos experimentos de PCR. À todos os membros do laboratório: Alcira, Clarice, Clarissa, Daniela,

Eduardo, Fernanda, Juliana, Raphael, Renata, Rodrigo , Nathália, Tiago, Obrigado pela ótima convivência

Às melhores amigas que eu poderia ter encontrado na Espanha: Pilar,

Marijosé e Raquel. Fue todo muy rápido, pero intenso, no? Muchas gracias !!!!!!

Ao meu quarteto de amigas preferido: Aline, Consuelo, Julia e Luciana.

Ao Meu Fernando, o melhor de todos, morar com você tem sido maravilhoso. Ainda bem que você está sempre ao meu lado, participando de tudo e comemorando todas as vitórias. Ninguém ouviu minhas apresentações tantas vezes. Você já deve estar sabendo de quase tudo sobre ouabaína e timócitos, né? Caso tudo corra bem, onde vamos comemorar depois da tese? À minha família, principalmente a meu pais, Ailton e Marisa, meus grandes incentivadores! Vocês acompanharam de perto todas as etapas de minha formação e sempre se orgulharam de mim! Ao meu irmão Ricardo por me salvar sempre que o computador resolve que não vai mais funcionar. À Cleide, minha tia predileta, por todo o apoio.

9

LISTA DE ABREVIATURAS

ACTH: Hormônio adrenocorticotrópico

AP1: Proteína ativadora de transcrição 1

ATP: Trifosfato de adenosina

CD: “clusters of differentiation” moléculas de superfície

Con A: concanavalina A

CRAC: “calcium–release activated calcium”

CTR: grupo controle

DAG: diacilglicerol

DiBAC4: bis-oxonol (bis- [ácido 1,3 – dibutilbarbitúrico] – trimetilneoxonol)

DiOC6: iodeto de 3,3`-diexilcarbocianina

DMSO: dimetilsulfóxido

DN : timócitos duplo negativos (CD4-CD8-)

DNA: ácido desoxirribonucleico

DP: timócitos duplo positivos (CD4+CD8+)

EGF:fator de crescimento epidermal

EGFR: receptor de EGF

EGTA (E): ácido etileno glicol-bis (oxietilenonitrilo) tetraacético

EGTA: ácido etileno glicol-bis (oxietilenonitrilo) tetracético

ERK: “extracellular signal-regulated kinase”

FCCP: diciano carbonil (para-trifluorometoxi) fenilhidrazona

FITC: isotiocianato de fluoresceína

FL: níveis de fluorescência

HC: hidrocortisona

10

IL: interleucina

IP3 : inositol trifosfato

JNK: “c-Jun N-terminal kinase”

Kca: canal de potássio dependente de cálcio

LAK: célula ativada por linfocina

Linfócito T : linfócito que expressa o receptor da célula T (TCR)

MAPK: proteína cinase ativada por mitógeno

MHC: complexo principal de histocompatibilidade

Na+/ K+ ATPase: Sódio-potássio ATPase

NK: células natural killer

OUA: Ouabaína

PBS: tampão salina fosfato

PE: ficoeritrina

PHA: fitohemaglutinina

PI: iodeto de propídeo

PIP2: fosfatidilinositol-bifosfato

PKC : proteína cinase C

PLC: fosfolipase C

PMA: 13-acetato-12- miristato de forbol (éster de forbol)

RNAm: ácido ribonucleico mensageiro

RPMI: Roswell Park Memorial Institute

SERCA: Ca++ ATPase de retículo sarco/endoplasmático

SFB: soro fetal bovino

SP: timócitos que só expressam CD4 ou CD8

TCR: receptor de célula T

11

TG: tapsigargina

TNF: fator de necrose tumoral

TPA: 12,13, 20-triacetato de forbol (éster de forbol)

12

RESUMO

Recentemente descrita como uma substância endógena, cujos níveis

estão aumentados em situações de estresse, a Ouabaína é utilizada há mais

de cem anos para tratamento de insuficiência cardíaca. Classicamente, a

Ouabaína é capaz de inibir a Na+/K+ATPase, sendo este seu mecanismo de

ação terapêutico. Neste trabalho, demonstramos que a Ouabaína é capaz de

modular o fenótipo e a função de timócitos. Esse esteróide induz o aumento da

expressão da molécula de superfície CD69 e este efeito depende do influxo de

Ca++ extracelular. Dados da literatura demonstraram que, na presença de

mitógenos e glicocorticóides, a enzima Na+/K+ ATPase adquire uma

conformação com maior afinidade pela Ouabaína. Mostramos que em timócitos

ativados pelo mitógeno concanavalina A, a Ouabaína foi capaz de inibir a

proliferação e a expressão de CD25. Este efeito envolveu a redução da

fosforilação da MAPK p38 e dos níveis de NFATc1. No modelo in vivo,

demonstramos que a Ouabaína foi capaz de sinergizar com o glicocorticóide

hidrocortisona magnificando seus efeitos na atrofia do timo. Este efeito sugere

que a Ouabaína possua um papel fisiológico.

13

ABSTRACT

Ouabain, used for more than one hundred years for cardiac insufficiency, has

been recently described as an endogenous substance that is elevated under

stress situations. Classically, ouabain is capable of inhibiting Na+/K+ ATPase

this being its well-known mechanism of action for therapeutic purposes. The

present work demonstrates that is capable of modulating both the phenotype

and the function of thymocytes. This steroid induces an increase in the

expression of the surface molecule CD69 and this effect is dependent on the

influx of external Ca++. There are published information that in the presence of

mitogens and glucocorticoids the enzyme Na+/K+ ATPase acquires a

conformation with increased affinity for ouabain. In the present work, ouabain

was capable of inhibiting the proliferation and the expression of CD25 molecule

of thymocytes activated by the mitogen concanavalin-A. This effect involved a

decrease in the phosphorilation of MAPK p38 and in the levels of NFATc1. In

the in vivo model, we demonstrated that ouabain was capable of a synergic

effect with the glucocorticoid hydrocortisone magnifying thymic atrophy. This

effect suggests that ouabain might play a physiological role.

14

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................... ......4

1.1 . A Na+/K+ ATPase.........................................................................................5

1.1.1. Isoformas da Na+/K+ ATPase e sua distribuição celular.................8

1.2. A Ouabaína.................................................................................................10

1.3. Efeitos da Ouabaína no sistema imunológico............................................15

1.4. O Microambiente tímico.............................................................................17

1.4.1. Maturação de timócitos................................................................19

1.5. MAPKs e a maturação de timócitos...........................................................23

1.6. Mobilização de cálcio intracelular..............................................................27

1.7. Proteínas NFAT..........................................................................................29

2. OBJETIVOS...................................................................................................32

2.1. Objetivo Geral..................................................................................33

2.2. Objetivos Específicos.......................................................................33

3.MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................34

3.1. Reagentes e Soluções ................................................................... 35

3.2. Animais............................................................................................ 38

3.3. Tratamento in vivo com OUA e HC………………………………..….38

3.4. Obtenção da suspensão de timócitos............................................. 39

3.5- Viabilidade utilizando iodeto de propídeo........................................39

3.6- Viabilidade celular utilizando o kit de anexina.................................40

3.7- Exposição das células tímicas aos agentes: OUA,

Concanavalina-A, TPA, TG e EGTA.....................................................40

3.8- Ensaio de proliferação.....................................................................41

3.9- Marcação de antígenos de superfície..............................................41

3.10- Marcação de antígenos intracelulares………………………………42

15

3.11 - Dosagem de Ca ++ intracelular......................................................42

3.12- Potencial de membrana mitocondrial.............................................43

3.13- Potencial de membrana plasmática...............................................43

3.14- Medida de fluorescência................................................................43

3.15- Western Blot..................................................................................44 3.16- Extração de RNA……………………………………………………...44

3.17- Síntese de cDNA………………………………………………………45

3.18- Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)………………………46

3.19- Análise Estatística..........................................................................47

4.RESULTADOS................................................................................................48

4.1. Expressão das subunidades α da Na+/K+ATPase em timócitos..... 49

4.2. Papel do Ca++ extracelular nos efeitos desencadeados por

Ouabaína.................................................................................................51

4.3. Efeito de Ouabaína em timócitos estimulados com o mitógeno

concanavalina-A......................................................................................53

4.4. Efeito de Ouabaína na despolarização da membrana plasmática em

timócitos estimulados com o mitógeno concanavalina-

A..............................................................................................................55

4.5. Efeito da Ouabaína associado à hidrocortisona na atrofia do timo

utilizando o modelo in vivo......................................................................57

5.DISCUSSÃO..................................................................................................60

6.CONCLUSÕES..............................................................................................69

7.BIBLIOGRAFIA..............................................................................................73

8.ANEXOS........................................................................................................90

7.1. ANEXO 1..........................................................................................91

16

7.2. ANEXO 2........................................................................................106

7.3. ANEXO 3........................................................................................130

7.4. ANEXO 4........................................................................................156

7.5. ANEXO 5........................................................................................162

17

1. INTRODUÇÃO

18

1.1. A Na+/K+ATPase

A enzima Na+/K+ATPase, descrita por Skou em 1957, localiza-se na

membrana plasmática e transporta ativamente os íons Na+ e K+ contra o

gradiente eletroquímico. Esta atividade mantém baixos níveis citosólicos de

Na+ e altas concentrações de K+ em praticamente todas as células animais

(JUHASZOVA e BLAUSTEIN, 1997). Sua atividade enzimática é fundamental

para a manutenção do volume e do pH celular, para a atividade de células

nervosas e musculares, possuindo um papel central na função renal através da

reabsorção de Na+ e água (BLONSTEIN e GRAFOVA,1988).

A Na+/K+ ATPase é composta por heterodímeros com três tipos de

subunidades, α, β e γ, que associam-se formando múltiplas isoformas.

(PRESSLEY, 1996; SWEADNER, 1989).

A subunidade α possui dez segmentos transmembrana. Na sua região

intracelular, estão localizados o sítio de fosforilação e de associação a

nucleotídeos. Já na sua porção extracelular, estão localizados os dois sítios de

associação à Ouabaína. A subunidade β possui apenas um segmento

transmembrana, que possui um extenso domínio extracelular, com diversos

sítios de fosforilação. As subunidades α e β associam-se, de forma covalente, a

uma terceira subunidade, que antes fora considerada uma contaminação

resultante do processo de purificação. Este pequeno polipeptídeo hidrofóbico

foi denominado subunidade γ ( BLANCO e MERCER, 1998 e MOBASHERI,

2000) (Fig.1).

19

Figura 1: Esquema da estrutura da Na+/K+ ATPase. Estão representadas as

subunidades α, β e γ. P- corresponde ao sítio de fosforilação, N- corresponde ao sítio

de ligação de nucleotídeo. Retirado de HORISBERGER, 2004

Além de ser a responsável pelas funções catalítica e transportadora da

Na+K+ ATPase, a subunidade α possui os sítios de ligação dos cátions Na+ e K+.

A cadeia β está relacionada à modulação da afinidade desses íons, à

manutenção da estrutura e estabilidade da Na+/K+ ATPase. Já a subunidade γ,

parece estar envolvida na modulação da atividade cinética dessa enzima.

Durante a sua atividade, a Na+/K+ ATPase adquire mudanças

conformacionais. Os sítios de ligação aos cátions estão localizados na região

transmembrana dessa bomba e podem ser acessados através de suas porções

intracelular (conformação E1) e extracelular (conformação E2). Três íons Na+

α γ

20

associam-se à enzima através de sua região citosólica e são transportados

para o ambiente externo. Em seguida, já no estado conformacional E2, os

sítios de ligação ao K+ estão disponíveis, e duas moléculas desse íon são

transportadas para a região intracelular. Em cada ciclo dessa atividade

enzimática, há a hidrólise de uma molécula de ATP (Fig 2).

Figura 2: Esquema representando a atividade da Na+/K+ ATPase e suas

mudanças conformacionais. Retirado de HORISBERGER, 2004 .

21

1.1.1. ISOFORMAS DA Na+/K+ ATPASE E SUA DISTRIBUIÇÃO

CELULAR

As diferentes isoformas da Na+/K+ ATPase resultam da associação das

diversas formas moleculares da cadeia α ( α1, α2, α3, α4) e da cadeia β (β1,

β2, β3). No entanto, apenas uma isoforma da cadeia γ foi identificada até o

momento (BLANCO e MERCER, 1998).

Todas as cadeias α possuem afinidade pela Ouabaína, com exceção da

cadeia α1 presente em roedores, que é pelo menos cem vezes mais resistente

à Ouabaína quando comparada às outras subunidades. A cadeia α3 possui

maior sensibilidade à Ouabaína do que a cadeia α2. Dessa forma, de acordo

com a distribuição das isoformas da Na+/K+ATPase, com o estágio de

desenvolvimento do organismo e com a combinação das subunidades nas

diferentes espécies, o efeito inibitório da Ouabaína pode ser bastante variável.

Na maioria dos tecidos em que foi analisada a expressão da subunidade

α, todas as cadeias foram encontradas, com exceção da cadeia α4, presente

somente nos espermatozóides (SHAMRAJ e LINGREL, 1994). A cadeia α1,

presente em praticamente todos os tecidos, corresponde a 99% das

subunidades α identificadas no rim, o que explica porque altas doses de

Ouabaína (50-500uM) são necessárias para produzir mobilização de Ca++ em

células renais (AIZMAN et al, 2001). A subunidade α2 é encontrada de forma

predominante em adipócitos, células musculares, células cardíacas e em

células da glia. A subunidade α3 é encontrada de forma abundante nos tecidos

do sistema nervoso, principalmente em neurônios (BLANCO e MERCER,

1998).

22

Em relação a isoforma β da Na+/K+ATPase, dados demonstraram que a

subunidade β1 está associada à subunidade α1 na maioria dos tecidos. A

isoforma β2 foi identificada no sistema nervoso, músculo esquelético, glândula

pineal, próstata, testículos, osteoblastos e condrócitos. A isoforma β3 é

abundante nos testículos, mas está presente em níveis baixos no cérebro,

músculo esquelético, pulmão, coração, estômago, cólon, fígado e em

condrócitos (MOBASHERI, 2000)

No entanto, pouco se sabe sobre a distribuição das subunidades da

Na+/K+ATPase no sistema imunológico. Em ratos de 2 semanas de idade, a

isoforma α1 é mais abundante no timo do que no baço. Por outro lado, em

animais adultos, esta subunidade só foi identificada em níveis intermediários no

baço e em níveis ainda menores no timo (SHYJAN e LEVENSON, 1989). Além

disso, Spach e Aschenasy encontraram uma maior atividade dessa enzima em

timócitos, quando comparados a linfócitos maduros de linfonodo, baço e de

sangue periférico (SPACH e ASCHENASY, 1973).

Outra característica das isoformas da Na+/K+ATPase está relacionada à

sua distribuição na membrana plasmática. Em algumas células, a subunidade

α1 possui uma distribuição homogênea, enquanto as cadeias α2 e α3 estão

concentradas em microdomínios (JUHASZOVA e BLAUSTEIN, 1997). Já foi

descrita a co-localização da cadeia α2 com os trocadores Na+/Ca++. Isto

permite que mudanças na concentração de íons ocorram de forma restrita, sem

que toda célula seja afetada (JUHASZOVA e BLAUSTEIN, 1997).

23

1.2- A OUABAÍNA

Previamente conhecida como um composto de origem vegetal, extraída

das raízes da árvore Ouabaio, de sementes da Strophantus Gratus e da

Strophantus Kombé, a Ouabaína foi descrita como um componente endógeno

presente em mamíferos superiores (HAMLYN, 1991).

A Ouabaína é um glicosídeo derivado de esteróides e de forma diferente

da maioria dos hormônios de origem esteroidal, é capaz de inibir uma proteína

que se localiza na membrana plasmática, a Na+/K+ ATPase

(BLAUSTEIN,1993). A interação da região lipofílica da Ouabaína à Na+/K+

ATPase depende da conformação dessa enzima. O primeiro sítio de ligação de

baixa afinidade à Ouabaína está disponível na conformação E1 da Na+/K+

ATPase, localizado na porção extracelular da cadeia α, entre os segmentos 1

e 2. O segundo sítio de ligação, com alta afinidade pela Ouabaína, está

disponível quando essa enzima atinge um estado conformacional ativo,

denominado E2. Este sítio de ligação está localizado entre os segmentos 5 e 6

da cadeia α (LINGREL et al, 1998, QIU et al, 2003).

Mesmo antes do conhecimento deste mecanismo de ação, glicosídeos

com atividade cardiotônica foram utilizados há mais de 2 séculos na clínica

para tratamento de insuficiência cardíaca (GOTO et al, 1992; BLAUSTEIN,

1993). Atualmente sabe-se que a inibição parcial da Na+K+ ATPase pela

Ouabaína, em doses terapêuticas e através da reversão do trocador Na+/Ca++,

induz um aumento do Ca++ intracelular que, por sua vez, dispara a contração

cardíaca (Fig.3) (HANSEN, 1984; HELLER, 1990; BALASUBRAMANYAM et al,

1994).

24

Figura 3: Efeito de Ouabaína na contração cardíaca. A inibição da Na+/K+

ATPase causa um aumento dos níveis de Na+ intracelular, que é capaz de reverter o

trocador Na+/Ca++. O influxo de Ca++ produzido pela reversão do trocador é capaz de

disparar a contração cardíaca.

Apesar de Ringer propor em 1885 a existência de um fator cardiotônico

endógeno e de Skou demonstrar, em 1960, que a Ouabaína é capaz de inibir a

Na+/K+ ATPase; foi somente em 1991 que Hamlyn e colaboradores

caracterizaram a Ouabaína endógena, encontrada no plasma humano,

produzida pela adrenal, pelo hipotálamo e pela hipófise (FERRANDI et al.,

1997; HAMLYN et al., 1991; LAREDO et al., 1994). A Ouabaína endógena foi

descrita como sendo estruturalmente, biologicamente e imunologicamente

Ouabaína

Na+/K+ ATPase

Reversão do trocador Na+/Ca++

Na+ Ca++

Contração Cardíaca

25

indistinguível da Ouabaína proveniente de vegetais (HAMLYN et al, 1991)

(Fig.4).

Figura 4: Estrutura química da Ouabaína. Retirado de HINSON et al, 1995

Na glândula adrenal, a etapa inicial da síntese da Ouabaína endógena

parece estar relacionada com a clivagem da cadeia lateral da molécula de

colesterol e com o metabolismo seqüencial de progesterona e pregnenolona

(HAMLYN et al, 2003). Além disso, sugere-se que as enzimas-chave que

participam da síntese de esteróides, como a enzima citocromo P-250, também

estão associadas à produção de Ouabaína pela adrenal (LICHTSTEIN et al,

1998). No entanto, os eventos mais distais da síntese deste digitálico ainda não

foram totalmente elucidados.

A secreção de Ouabaína pela adrenal é dependente de ACTH, dessa

forma sua liberação ocorre em circunstâncias similares àquelas onde há

secreção de corticóides (LAREDO et al, 1994; SOPHOCLEOUS et al, 2003).

Além de ACTH, sabe-se que a angiotensina II é capaz de estimular a secreção

da Ouabaína endógena pela adrenal (LAREDO et al, 1994; SCHONER et al,

2000). Em relação ao sistema nervoso, a produção da Ouabaína parece ser

regulada por neurônios adrenérgicos centrais (YAMADA et al ,1995).

K

K

26

Diversas evidências demonstram que a síntese de Ouabaína pode ser

modificada de acordo com o estado fisiológico em que se encontra o

organismo. Níveis elevados de Ouabaína foram encontrados em pacientes

hipertensos (SCHONER, 2000) assim como em diferentes modelos de ratos

com hipertensão (HUANG e LEENEN, 1996).

A Ouabaína também participa da resposta do organismo ao estresse

agudo. Já foi demonstrado que o exercício físico é capaz de aumentar os

níveis de Ouabaína em ratos, cachorros e seres humanos alguns minutos

após o início da atividade física (GOTO et al, 1995; BAUER et al , 2005). Este

fenômeno parece ser regulado pela secreção de norepinefrina e de

angiotensina, visto que o uso de β bloqueadores ou de inibidores da enzima

conversora de angiotensina são capazes de inibir esse efeito (BAUER et al,

2005). Estímulos patológicos como hipóxia e isquemia também são capazes de

aumentar a síntese de Ouabaína (de ANGELIS e HAUPERT, 1998). Esses

dados sugerem que a Ouabaína poderia funcionar com um hormônio

relacionado ao estresse.

O papel fisiológico da Ouabaína ainda é desconhecido. No entanto,

alguns grupos sugerem que essa substância poderia funcionar como um

hormônio natriurético (FERRANDI et al, 1997; BLAUSTEIN, 1993). De acordo

com alguns trabalhos, a Ouabaína teria um papel importante no crescimento,

diferenciação e morte celular por apoptose (LICHTSTEIN et al, 2000;

KOMETIANI, et al, 1998; HUANG et al,1997 e ISAEV et al, 2000).

Vários trabalhos demonstraram que a Ouabaína é capaz de ativar

diferentes vias de sinalização. Em miócitos cardíacos, a inibição parcial da

Na+/K+ ATPase pela Ouabaína estimula a hipertrofia celular e regula a

27

transcrição de diversos genes (LINGREL e KUNTZWEILER, 1994). Estes

efeitos da Ouabaína envolvem a ativação de múltiplas vias, incluindo a ativação

da cinase Src e a fosforilação em resíduos de tirosina do receptor do fator de

crescimento epidermal (EGF). Este fenômeno precede a ativação da cascata

de sinalização que envolve RAS, RAF,MEK e ERK. Além disso, a geração de

espécies reativas de oxigênio (ROS) também está envolvida na sinalização

desencadeada por essa substância (HAAS et al, 2000 ) (Fig. 5). Também foi

descrito nesse mesmo modelo, que a Ouabaína é capaz de aumentar os níveis

do RNA mensageiro de c-jun e c-fos e do fator de transcrição AP-1 (PENG et

al, 1996).

Figura 5: Esquema de algumas vias de sinalização desencadeadas por

Ouabaína em miócitos. Modificado de SCHEINER-BOBIS e SCHONER, 2001.

28

Dados obtidos em células epiteliais renais demonstram que a inibição

parcial da Na+/K+ ATPase pela Ouabaína é capaz de induzir a ativação de NF-

κB através de oscilações nos níveis de Ca++ citosólico. No entanto, a inibição

parcial da Na+/K+ATPase causada por níveis baixos de K+ extracelular e pela

despolarização não foram capazes de mimetizar os efeitos obtidos na

presença de Ouabaína (AIZMAN et al, 2001).

1.3. EFEITOS DA OUABAÍNA NO SISTEMA IMUNOLÓGICO

A Ouabaína é capaz de regular várias funções imunológicas

(ECHEVARRIA-LIMA e RUMJANEK, 2006).

Durante a proliferação induzida por mitógenos (MARAKHOVA et al,

2005; SZAMEL e RESCH, 1981) e na presença de glicocorticóides (LYOUSSI

e CRABBE, 1996) há um aumento da síntese da Na+/K+ATPase e uma

mudança conformacional, para o seu estado de maior afinidade pela Ouabaína.

Este digitálico é capaz de exercer efeitos inibitórios sobre a proliferação

linfocitária induzida por diversos mitógenos (QUASTEL e KAPLAN, 1968;

MORAES et al, 1989), éster de forbol (TPA) (OLEJ et al, 1994) e interleucina-2

(IL-2) (STOECK et al, 1983; OLEJ et al, 1998), assim como a geração de

células LAK (OLEJ et al, 1994), sem no entanto, inibir a atividade citotóxica

dessas células (OLEJ et al, 1994, MORAES et al, 1989). Em timócitos, a

Ouabaína também é capaz de inibir a proliferação de desencadeada por

concanavalina-A (SZAMEL et al, 1981).

Foi demonstrado que a Ouabaína é capaz de bloquear a transição de G1

(etapa que precede a síntese de proteínas) para a fase S (etapa de síntese de

29

DNA) do ciclo celular e aumentar a expressão de CD69 em linfócitos maduros

ativados com éster de forbol ou PHA (PIRES et al, 1997). A molécula CD69

não é expressa de forma constitutiva em linfócitos não ativados (HARA et al,

1986; CEBRIÁN et al, 1989; RISSO et al,1989).

Em linfócitos maduros de sangue periférico, a isoforma hipotalâmica da

Ouabaína é capaz de induzir morte celular (ANNER et al, 1994). De forma

semelhante, foi descrito que a Ouabaína inicia o processo de apoptose em

células Jurkat (ORLOV et al, 1999). Nosso grupo demonstrou que em linfócitos

estimulados com o mitógeno PHA, a Ouabaína induz um aumento da

expressão do proto-oncogen c-myc, levando parte dessa população à morte

por apoptose (OLEJ et al, 1998). Dados recentes de nosso laboratório

demonstraram que esse fenômeno não está relacionado com a expressão da

molécula CD95/Fas (ESTEVES et al, 2005).

Em timócitos murinos, baixas concentrações de Ouabaína são capazes

de aumentar os níveis de Ca++ intracelular (ECHEVARRIA-LIMA et al., 2003). A

inibição da Na+/K+ATPase através de concentrações elevadas de Ouabaína

causa despolarização da membrana plasmática de timócitos e potencializa a

morte induzida por glicocorticóides (MANN et al., 2001). A redução dos níveis

de K+ intracelular promovida pela Ouabaína está diretamente relacionada à

apoptose, visto que o K+ é capaz de inibir a atividade das caspases

(BORTNER et al, 1997). Dessa forma, na presença de um estímulo capaz de

induzir apoptose, a Ouabaína poderia magnificar esse efeito.

Entre as evidências de que a Ouabaína seria capaz de aumentar a

atividade de caspases, está o aumento de produção de IL-1β por macrófagos

tratados com o glicosídeo (DORNAND et al, 1984). No entanto, outras citocinas

30

com IL-1α (MATSUMORI et al, 2000) e TNF α (FOEY et al, 1997; MATSUMORI

et al, 1997) também podem se encontrar aumentadas, independente da

ativação de caspases.

1. 4 . O MICROAMBIENTE TÍMICO

A maioria dos linfócitos T são gerados no timo, órgão localizado no

mediastino superior (Fig.6), através de um processo que se inicia no fim da

fase embrionária e continua até a vida adulta. Durante a ontogenia das células

T, a expressão de vários genes e seus produtos é ativada e desativada

diversas vezes em uma ordem definida, o que permite distinguir diversos

estágios e diferentes subpopulações no ambiente intratímico (KISIELOW e

BOEHMER, 1995).

A partir do final do século XIX resultados de experimentos que envolviam

timectomia e subseqüente avaliação de mudanças morfológicas na adrenal e

nas gônadas, geraram o conceito de que o timo seria um órgão com funções

endócrinas.

Atualmente sabe-se que as células presentes neste órgão são capazes

de secretar e sofrer influências do sistema neuro-imuno-endócrino, que

engloba diversas citocinas, neuropeptídeos e hormônios produzidos por esses

três sistemas (RUMJANEK et al, 2006) .

No microambiente tímico, o processo de seleção dos timócitos envolve

diversas etapas como maturação, diferenciação, proliferação e morte celular.

Existe uma grande rede de interações no timo, os timócitos interagem com

células epiteliais e endoteliais tímicas, macrófagos, células nurse, fibroblastos,

31

células dendríticas e com proteínas da matriz extracelular. À medida que os

timócitos vão sofrendo o processo de diferenciação no timo, direcionam-se

para o centro do órgão ou medula, onde a quantidade de timócitos torna-se

reduzida devido ao processo de seleção tímica (Fig.6).

Figura 6: Esquema representando a redução da densidade de timócitos

na medula do timo e as diferentes subpopulações celulares. Retirado de Cellular

Immunology.

32

1. 4.1. MATURAÇÃO DE TIMÓCITOS

As células precursoras das células T, provenientes da medula óssea,

chegam ao córtex do timo sem as moléculas de superfície CD4, CD8 e CD3,

esta última está associada ao receptor da célula T ou TCR. Estas células, que

não expressam CD4 ou CD8, são chamadas de células duplo negativas (DN).

As células imaturas DN possuem quatro estágios de diferenciação bem

definidos através da expressão de CD25 (cadeia α do receptor de IL-2) e de

CD44: CD25- 44+, CD25+ 44+, CD25+ 44- e CD25- 44- (RODEWALD e

FEHLING, 1998) (Fig.7). A redução dos níveis de CD25 está relacionada com

a expressão do pré-TCR, formado pela associação da cadeia β do TCR com

uma cadeia α que ainda não sofreu rearranjo gênico.

Figura 7: Desenvolvimento inicial de timócitos. Esquema ilustrando as principais

fases de maturação dos timócitos DN. Modificado de CANTRELL , 2002.

Célula tronco hematopoética

Proliferação/sobrevivência dependente de c-kit/IL-7 de células epitelias tímicas

Proliferação/sobrevivência dependente da sinalização via pre-TCR

Expressão do pre-TCR

Proliferação pós-seleção/sobrevivência dependente de citocinas produzidas pelo estroma tímico

Timócitos DN

33

Inicialmente os timócitos DN expressam baixos níveis de CD8 em sua

superfície e progressivamente adquirem a expressão de CD4. Desta forma,

estes timócitos sofrem uma transição do estágio DN para o estágio duplo

positivo (DP), onde passam a expressar as moléculas CD4 e CD8 (SPRENT et

al, 1988). Estas células duplo positivas dividem-se em um número limitado e

começam a expressar TCRs αβ já rearranjados (KISIELOW e BOEHMER,

1995) e se tornam, então, células expressando CD4, CD8 e CD3.

Um evento de grande importância fisiológica no desenvolvimento e

seleção de timócitos, que ocorre durante a transição de células DN para

timócitos DP, é a diminuição da expressão dos níveis da proteína anti-

apoptótica bcl-2 (ANDJELIC et al, 1993; VEIS et al, 1993) e o aumento da

expressão de APO-1/Fas (ANDJELIC et al, 1994). Este fato pode estar

relacionado com a grande susceptibilidade desta subpopulação sofrer

apoptose. No timo, 90% das células sofrem de forma fisiológica o processo de

morte celular por apoptose, que é essencial para a seleção tímica, contribuindo

para a formação de parte do repertório imunológico.

Essas células, que expressam CD4, CD8 e baixos níveis de TCR,

correspondem à população mais sensível a glicocorticóides (CONKEY et al,

1989), e também são aquelas que irão sofrer seleção tímica.

A ligação do TCR dessas células (CD4+, CD8+ e CD3low) a moléculas de

MHC (complexo principal de histocompatibilidade) associadas à peptídeos

endógenos no epitélio tímico é o primeiro passo para “seleção positiva e

negativa” (TEH et al, 1988; SCOTT et al, 1989).

34

Os timócitos serão selecionados de acordo com sua habilidade em

reconhecer o peptídeo ligante do MHC expresso nas células epiteliais tímicas.

Além disso, a avidez dessas interações envolve moléculas da matriz

extracelular e diversas moléculas de adesão. Linfócitos T que expressam TCR

com pouca afinidade pelo complexo antígeno MHC sofrem apoptose por um

processo conhecido como “morte por negligência”. Por outro lado, timócitos

que expressam TCR com alta afinidade pelo MHC sofrem apoptose através de

um processo chamado “seleção negativa”. Porém, as células que expressam

TCR com afinidade intermediária pelo MHC são desviadas da apoptose e se

diferenciam em timócitos maduros por um processo denominado “seleção

positiva”. (DEFTOS et al, 1998; KISIELOW e BOEHMER, 1995).

A seleção positiva induz o aumento da expressão de TCR (SHORTMAN

et al, 1991; KEARSE et al, 1995) e da molécula CD69 (SWAT et al, 1993;

BENDELAC et al, 1992). Desta forma, timócitos que estão passando pelo

processo de seleção positiva expressam altos níveis de CD69 de forma

constitutiva na superfície celular. A molécula do CD69 tem sido descrita como

um marcador de ativação celular (SWAT et al, 1993), que indica que o sinal do

TCR via MHC foi transmitido aos timócitos (BENDELAC et al, 1992; SWAT et

al, 1993).

Esse passo da maturação tímica também envolve uma escolha entre a

diferenciação celular em linhagens CD4+ ou CD8+, que são chamadas células

SP (single positive).

Um evento importante que ocorre durante essa diferenciação para

timócitos SP é a aquisição da resistência a glicocorticóides. Timócitos duplo

positivos são muito sensíveis a glicocorticóides, enquanto os timócitos SP mais

35

maduros são relativamente resistentes (SCOLLAY et al, 1984; SCREPANTI et

al, 1989; COHEN, 1992). As células que foram “positivamente selecionadas” a

sobreviver e se diferenciar em SP são exportadas do timo para a periferia

(BOEHMER, 1988). Um resumo dessas mudanças fenotípicas pode ser

observado na Fig.8.

Figura 8: Maturação de timócitos e a interação com seu micro-ambiente. Esquema ilustrando a diferenciação de timócitos, incluindo o processo de seleção

Seleção Positiva

36

positiva e as células do micro-ambiente tímico. Retirado de ANDERSON e

JENKINSON, 2001

De um modo geral, os linfócitos T são divididos em duas classes: a

primeira delas corresponde a linfócitos T citotóxicos, também conhecidos como

linfócitos T CD8+, que geralmente interferem na aceitação de transplantes, em

infecções virais e outras anormalidades, como o desenvolvimento de células

tumorais. A segunda classe de linfócitos T compreende os linfócitos T helper,

ou linfócitos T CD4+, que cooperam com os linfócitos B na resposta mediada

por anticorpos contra antígenos como toxinas bacterianas e possuem um

importante papel regulatório (BOEHMER e KISIELOW,1991).

1.5. MAPKS E A MATURAÇÃO DE TIMÓCITOS

O desenvolvimento e a maturação de timócitos envolvem várias vias de

sinalização, inclusive as de MAPKs (proteína cinase ativada por mitógeno). De

forma geral, a sinalização enzimática desencadeada pelas MAPKs envolve a

ativação de pelo menos três cinases diferentes: p38 MAPK, ERK (do inglês

extracellular signal -regulated kinase) e JNK (do inglês c-Jun N-terminal kinase)

(Fig. 9). A transdução de sinais desencadeada por estas cinases, que foram

conservadas ao longo da evolução, tanto no reino animal, quanto no vegetal,

tem papel primordial na proliferação, diferenciação e morte celular (RINCÓN,

2001).

As MAPKs são ativadas pela fosforilação em seus resíduos de treonina

e tirosina por outras cinases, denominadas MKKs (Map-kinase kinases).

37

Figura 9: Vias de sinalização das MAPKs. Vários estímulos podem ativar as MAPKs

com a subseqüente ativação de fatores de transcrição. Modificado de RINCÓN, 2001.

A p38 MAPK foi originalmente identificada em resposta ao estímulo de

estresse celular. Em células T esta cinase é ativada pela cross-link do TCR e

por moléculas acessórias. Já foram identificadas quatro isoformas da p38

NFATc1

38

MAPK, a p38 α e δ são as principais isoformas presentes em linfócitos T. A p38

MAPK é especialmente ativada pelas MKK 3, MKK4 e MKK6 (Fig.9).

A ativação de p38 MAPK é necessária para a expansão e

desenvolvimento inicial de timócitos imaturos, no estágio DN com os fenótipos

CD25- 44+ e CD25+ 44+ (DIEHL et al, 2000) (Fig.10). A ativação dessa MAPK

também é capaz de contribuir para o processo de seleção positiva, porém, de

forma menos significativa que a ERK (HSU et al, 2003).

Além de estar envolvida na maturação de timócitos, dados recentes

demonstraram que a inibição parcial de p38 é capaz de inibir a proliferação e a

produção de interleucina-2 por timócitos estimulados com o mitógeno

concanavalina A (HSU et al, 2003). Também já foi descrito que a MAPK p38

regula o aumento da expressão da molécula CD25 induzida por IL-2 (NGUYEN

et al , 2000 ).

A ERK, subdividida em ERK1 e ERK2, possui um papel importante na

diferenciação de timócitos imaturos DN, com o fenótipo CD25+ 44- (Fig.10) e

está relacionada com a proliferação de células imaturas através da sinalização

desencadeada pelo pré-TCR. A ativação desta MAPK também está envolvida

com o processo de seleção positiva em timócitos DP e com o

comprometimento com a linhagem CD4 (SHARP et al, 1997).

A MAPK ERK também está relacionada com os efeitos da Ouabaína em

miócitos. Através do receptor de EGF e da via de RAS, o mecanismo de ação

desse digitálico envolve a ativação de ERK (HASS et al, 2000 ).

39

Figura 10: Ativação de MAPKs durante o desenvolvimento inicial de timócitos.

Retirado de RINCÓN, 2001.

As JNKs possuem diversas isoformas, mas pouco se sabe sobre seu

papel na diferenciação de timócitos. A ativação de JNK parece estar associada

40

ao processo de deleção de timócitos DP durante a seleção negativa (RINCÓN

et a, 1998).

Apesar do progresso nos últimos anos, o estudo do papel das MAPKs no

desenvolvimento de células T ainda não foi completamente elucidado.

1. 6. MOBILIZAÇÃO DE CÁLCIO INTRACELULAR

O cálcio é uma molécula multifatorial que pode ativar uma grande

quantidade de vias e sinalizar diferentes processos. Variações dos níveis de

cálcio intracelular são fundamentais para o processo de seleção tímica.

Vários fatores podem estar relacionados aos efeitos desencadeados por

esse íon como: o tipo celular envolvido, a concentração de cálcio intracelular; a

localização de cálcio dentro da célula e a origem dos níveis de cálcio citosólico,

origem essa que pode ser intracelular, liberada por organelas (mitocôndria,

retículo endoplasmático), ou extracelular .

A concentração de Ca2+ extracelular é de, aproximadamente, 10-3 M

enquanto o nível de Ca2+ intracelular fica em torno de 10-7 a 10-8 M. Qualquer

variação na concentração de Ca2+ citosólico é visto como um sinal para a

célula. Este rigoroso controle dos níveis citosólicos é feito por ATPases,

trocadores Na+ / Ca2+, canais e proteínas capazes de formar complexos com

Ca2+.

O retículo endoplasmático é a principal organela responsável pela

captação, liberação e armazenamento de cálcio, controlando a concentração

de Ca2+ livre no citoplasma. Em células do músculo esquelético, esse retículo

recebe o nome de retículo sarcoplasmático e é a organela responsável pela

41

contração/relaxamento muscular (HASSELBACH e MAKINOSE, 1962). No

entanto, outras organelas, como a mitocôndria, tem um papel importante no

armazenamento e controle dos níveis de Ca2+.

O aumento de cálcio citosólico está relacionado a processos que

envolvem divisão, ativação, diferenciação, função e morte celular.

O conceito de que um aumento na concentração citosólica de Ca++ livre

poderia iniciar o processo de apoptose em timócitos tem sido sugerido por

diversos estudos onde um aumento na concentração citosólica de Ca++ é

observado previamente à fragmentação genômica e à morte celular

(McCONKEY et al, 1988; AW et al, 1990). Evidências para o papel do Ca++ na

ativação de endonucleases e na morte celular originaram-se em estudos onde

ionóforos de Ca++ foram utilizados para induzir apoptose em células intactas e

em experimentos que demonstram que o uso de quelantes de Ca++ previnem

de forma efetiva esse tipo de morte celular (McCONKEY et al, 1989).

O aumento dos níveis intracelulares de Ca++ também está diretamente

relacionado com o processo de desenvolvimento, ativação e proliferação de

timócitos, sendo capaz de ativar diversas vias de sinalização e a secreção de

diferentes citocinas envolvidas nesses processos (FISHER et al, 1991).

Dessa forma, drogas que modulam a concentração de cálcio intracelular

podem direcionar as células para destinos diferentes, mesmo quando os níveis

de cálcio citosólico se assemelham. A Ouabaína é capaz de aumentar os níveis

de Ca++ citosólico em várias células, inclusive em linfócitos

(BALASUBRAMANYAM et al, 1994), sendo que em todas essas células, isso

se dá por influxo de Ca++ externo. Em timócitos, o aumento de Ca++ produzido

por Ouabaína depende de fontes extra e intracelulares (ECHEVARRIA-LIMA et

42

al, 2003) e pouco se sabe sobre os efeitos relacionados ao aumento de Ca++

citosóloco nessas células. No entanto, é conhecido que em linfócitos a

liberação de Ca++ de estoques intracelulares pode ativar o fator de transcrição

NFAT.

1.7- PROTEÍNAS NFAT

O fator nuclear de células T ativadas (NFAT) foi inicialmente identificado

em linfócitos T estimulados, como um fator de transcrição indutível capaz de

associar-se ao promotor de IL-2 (SHAW et al, 1988). Atualmente, estima-se

que toda célula expresse pelo menos um membro das proteínas da família

NFAT.

A família NFAT é capaz de modular diversos fenômenos biológicos,

como o desenvolvimento, proliferação, diferenciação e morte celular. Essas

proteínas cooperam com outros fatores de transcrição, como o AP-1, na

indução da expressão gênica de diversas citocinas, como a IL-2 (MACIÁN,

2005).

A família dos fatores de transcrição NFAT possui cinco membros: NFAT

1 (também conhecido como NFATp ou NFATc2), NFAT2 (também conhecido

como NFATc ou NFATc1), NFAT3 (também conhecido como NFATc4), NFAT4

(também conhecido como NFATx ou NFATc3) e NFAT5.

Em timócitos, o NFAT4 é expresso de forma predominante em células

DP, enquanto os níveis de NFAT1 e NFAT2 são expressos em níveis menores

do que aqueles encontrados em linfócitos maduros. No entanto, em timócitos

ativados por IL-2, há uma redução na ativação de NFAT4 e um aumento da

43

ativação de NFAT2. A proteína NFAT3 não é expressa no sistema imunológico

(ADACHI et al., 2000).

Com exceção do NFAT5, que é modulado por variações de tonicidade

celular induzida por estresse osmótico, todas as proteínas NFAT são reguladas

pela sinalização desencadeada por Ca++ /calcineurina.

A ativação clássica de NFAT envolve a ativação da fosfolipase C, que é

capaz de clivar PIP2 (fosfatidilinositol-bifosfato) em IP3 (inositol trifosfato) e DAG

(diacilglicerol). A molécula IP3 libera estoques intracelulares de Ca++ do retículo

endoplasmático gerando a abertura dos canais de Ca++ CRAC (do inglês Ca++

release activated channel) presentes na membrana plasmática, mantendo o

alto nível intracelular de Ca++. O Ca++ associa-se a calmodulina, que por sua

vez, ativa a calcineurina, uma fosfatase de resíduos de serina/treonina. Desta

forma, as proteínas NFAT são defosforiladas pela calcineurina, o que expõe

uma seqüência de localização nuclear (NLS, do inglês nuclear localization

signal) permitindo sua translocação nuclear e ativação da transcrição gênica

(MACIÁN et al, 2005; HOGAN et al, 2003) (Fig. 11).

Os sinais desencadeados por Ca++ e calcineurina estão envolvidos na

regulação da proliferação e no desenvolvimento de timócitos. Além disso, a

sinalização via pré-TCR induz um aumento no nível de Ca++ intracelular que

resulta na ativação de NFAT (MACIAN , 2005).

44

Figura 11: Ativação clássica de NFAT. Modificado de MACIÁN, 2005.

Dados recentes demonstraram que a MAPK p38 está diretamente

envolvida na ativação de NFAT2. Apesar da p38 promover a expulsão nuclear

de NFAT2, esta MAPK é capaz de aumentar a sua síntese, ativar a sua

tradução e o seu promotor no DNA ( WU et al , 2003).

Ativação de PLC

Núcleo

Membrana

45

2. OBJETIVOS

46

2.1.OBJETIVO GERAL:

Estudar a importância da Ouabaína no sistema imunológico in vivo e in

vitro, utilizando linfócitos imaturos (timócitos) .

2.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1- Estudar a expressão das subunidades α1, α2, α3 e α4 da

Na+/K+ATPase no timo através da técnica de PCR.

2- Estudar o fenótipo de timócitos na presença de Ouabaína e o papel

do cálcio extracelular.

3- Estudar vias de sinalização envolvidas nos efeitos desencadeados por

Ouabaína em timócitos ativados in vitro com o mitógeno Concanavalina A.

Serão analisados o papel das MAPKs, p-38 e ERK, do fator de transcrição

NFAT, expressão de CD25 e proliferação celular.

4- Estudar o efeito da Ouabaína em timócitos, in vivo, associado à

inoculação do glicocorticóide hidrocortisona, em diferentes idades. Serão

avaliados morte celular, potencial de membrana mitocondrial e as

subpopulações afetadas.

47

3. MATERIAIS E MÉTODOS

48

3.1- Reagentes e soluções

Anticorpo anti-CD69 murino (Pharmingen)- acoplado a PE em meio RPMI

Anticorpo anti-CD25 murino (R e D systems )- acoplado a PE em meio RPMI

Anticorpo anti-CD4 murino (R e D systems)- acoplado a PE em meio RPMI

Anticorpo anti-CD8 murino (R e D systems )- acoplado a FITC em meio RPMI

Anticorpo anti-NFATc1 murino (Santa Cruz Biotechnology)- acoplado a PE

em meio RPMI.

Anticorpo anti-P-ERK murino (Santa Cruz Biotechnology)- diluído 1000 vezes

no momento do uso.

Anticorpo anti-P-p38 murino (BD, Biosciences Pharmingen)- acoplado a PE

em meio RPMI.

Concanavalina A (Sigma)- Solução estoque 1mM em PBS, mantida a -20oC.

DiBAC4- bis-oxonol (bis- [ácido 1,3 – dibutilbarbitúrico] – trimetineoxonol)

(Molecular Probes ) - Solução estoque 10mM em DMSO, mantida a -20oC.

DiOC6- iodeto de 3,3`-diexilcarbocianina (Molecular Probes)- Solução

estoque 40µM em etanol, mantida a -20oC.

DTT (SuperScript)- solução estoque 0.1M, mantido a -20ºC.

49

EGTA- solução estoque 100mM em PBS, mantida a 4oC.

FCCP- carbanyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (Sigma)-

Solução estoque 10mM em etanol, mantida a -20oC.

FURA-2 AM (Molecular Probes)- utilizado na concentração de 1,5µM em RPMI

com 10% de SFB mantido a -20oC.

Iodeto de Propídeo - solução estoque 100µg/mL em meio RPMI, mantida a

4oC.

Kit Anexina (R and D systems)- Kit para detecção de apoptose utilizado de

acordo com as instruções contidas no manual.

Líquido de Cintilação (Reagen)- 0, 2g de POPOP em 1 litro de Tolueno.

Oligo (dT) (Dialab)- solução estoque 0,5ug/ul , mantido a -20ºC.

Ouabaína (Sigma)- com 10% de SFB, na concentração de 100nM em RPMI.

Dissolvida e diluída no momento do uso.

PBS- NaCl 8g (Merck), KCl 0,2g (Reagen), NaH2PO4 . H2O 1,15g (Reagen) e

Na2 HPO4 . 7H2O 0,2g (Reagen) em 1 litro de água deionizada com o pH

ajustado para 7,4.

RPMI- meio de cultura-1640 (Sigma) suplementado com β-mercaptoetanol 5 x

10-5 M, tampão Hepes 25mM, penicilina 60mg/l e estreptomicina 10mg/l.

Salina- NaCl (Sigma) 0,9% em água destilada.

50

SFB (Gibco ou Highclone) - soro fetal bovino inativado por 30 minutos a 56oC,

estocado em alíquotas de 50ml e mantido a -20oC.

Succinato sódico de hidrocortisona Solu-Cortef (Upjohn)- mantida em

temperatura ambiente e dissolvida e diluída na momento do uso em RPMI.

Tampão da fita simples (SuperScript)- composto por Tris-HCL 50mM pH 8.3;

KCl 75 mM e MgCL2 3mM.

Tampão de lise (western blot)- composto por 5 mM de Tris-HCl, pH 7.4, 2mM

de EDTA, 10 µl de protease, 10 mg/ml de benzamidina, 5 mg/ml de leupeptina,

5 mg/ml de inibidor de tripsina.

Tapsigargina (Sigma)- Soluçãp estoque 1mM em DMSO, mantida a -20oC.

Diluída em RPMI com de 10% SFB no momento do uso. Utilizada nas

concentrações de 10, 20 e 50nM.

Timidina Triciada (Amersham Pharmacia Biotech)- Solução estoque 5µCi/ml

mantida a -20 oC. Utilizada na concentração 0,5 µCi/ml por poço.

TPA (Sigma)- Solução estoque 1mg/mL em DMSO, mantida a -20 oC. Utilizada

na concentração de 16nM em RPMI.

51

3.2- Animais

Foram utilizados camundongos machos da estirpe Balb/c, C57Bl-6 e sv-

129 de 9 dias a 2 meses de idade. Os animais, provenientes do Laboratório de

Imunologia Tumoral e do “ Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa”, foram

mantidos em um regime de luz de 24 horas e supridos com ração e água.

3.3- Tratamento in vivo com OUA e HC

Foram utilizados camundongos isogênicos, machos ou fêmeas de

diferentes idades, das cepas Balb/c ou C57Bl-6. Estes animais foram mantidos

no biotério do laboratório de Imunologia Tumoral com temperatura controlada,

água e alimento à vontade.

Todos os tratamentos foram realizados através de injeção

intraperitoneal. Nos experimentos preliminares foram realizados 6 grupos com

dois animais cada: grupo 1- grupo controle tratado com 100µl de RPMI, grupo

2: tratado com OUA na concentração de 0,56 mg/kg, grupo 3: tratado com HC

na concentração de 70mg/kg, grupo 4: tratado com HC na concentração de

140mg/kg, grupo 5: tratado previamente (1hora de antecedência) com OUA na

concentração de 0,56mg/kg seguido de HC na concentração de 70mg/kg,

grupo 6: tratado previamente (1hora de antecedência) com OUA na

concentração de 0,56mg/kg seguido de HC na concentração de 140mg/kg .

Nos experimentos seguintes, 4 grupos de camundongos foram utilizados

como descrito acima, mas só foi utilizada 1 concentração de HC: 140mg/kg.

Foram adicionados mais 2 grupos para controlar o estresse produzido pela

52

inoculação: grupo 5: tratado previamente (1hora de antecedência) com OUA

na concentração de 0,56mg/kg seguido de RPMI e grupo 6: tratado

previamente (1hora de antecedência) com RPMI seguido de HC na

concentração de140mg/kg.

Após 21 horas, os animais foram sacrificados e o peso dos timos

mensurado através de uma balança analítica. Em seguida, foi realizada a

suspensão de timócitos como descrito abaixo.

3.4- Obtenção da suspensão de timócitos

Os camundongos foram sacrificados através de deslocamento cervical.

O timo foi retirado e mantido, por alguns minutos, em soro fetal bovino. Os

órgãos foram macerados com um êmbolo de uma seringa para obtenção da

suspensão celular em uma rede de nylon sobre placa de Petri contendo meio

RPMI + 10% de soro fetal bovino. A suspensão de timócitos foi centrifugada a

300g durante 7 minutos. Os timócitos foram novamente suspensos em meio

RPMI + 10% de soro fetal bovino para contagem celular através de um

microscópio sob contraste de fase.

3.5- Viabilidade utilizando iodeto de propídeo

À suspensão de timócitos, num volume de 500 µL, acrescentou-se 5µL

de uma solução de iodeto de propídeo (PI) para obter-se a concentração final

de 1µg/mL. Imediatamente após, as células foram analisadas em citômetro de

53

fluxo. As células marcadas com PI perderam a integridade de membrana e

estão em necrose.

3.6- Viabilidade celular utilizando o kit de anexina

A molécula de Anexina associa-se à fosfatidil serina presente na

superfície de células em apoptose precoce. Células marcadas com o iodeto de

propídeo (PI) representam a população em necrose. As células marcadas com

iodeto de propídeo (PI) e também com Anexina são denominadas células

duplo-positivas e representam células que sofreram necrose secundária. As

células viáveis são aquelas que não estão marcadas. Os experimentos foram

executados de acordo com as instruções contidas no manual presente no Kit

de Anexina.

3.7- Exposição das células tímicas aos agentes: OUA e Concanavalina-A,

TPA, TG e EGTA

Para cultura, 5x 105 células foram incubadas em meio RPMI + 10% de

soro fetal bovino na presença ou ausência das seguintes soluções: 100nM de

Ouabaína, 2,5µg/ml do mitógeno Concanavalina-A, 16nM do éster de forbol

TPA , 10, 20 e 50nM do inibidor da SERCA ATPase tapsigargina e 10mM do

quelante de Ca++ EGTA. .

54

3.8- Ensaio de proliferação

A proliferação de timócitos foi determinada através da incorporação de

3H-timidina no DNA celular.

As células foram incubadas na estufa a 37º C com 5% de CO2 na

presença e ausência do mitógeno Concanavalina A e/ou OUA por 18h. Seis

horas antes do final da incubação, adicionou-se 0,5 µCi/ml de [3H]-timidina em

cada poço. Ao final do ensaio as células foram recolhidas e colocadas em

papéis de filtro, que foram deixados secar, lavados, deixados para secar mais

uma vez, colocados no líquido de cintilação e a radioatividade medida no

contador líquido de cintilação (1600 CA TRI–CARB Liquid Scintillation Analyzer

Packard). Os resultados do ensaio de proliferação foram expressos em

contagem por minuto (cpm).

3.9- Marcação de antígenos de superfície

Para a marcação das moléculas de superfície CD3, CD69, CD25, CD4 e

CD8, 5 x 105 timócitos foram centrifugados a 1200 r.p.m. Para impedir ligações

inespecíficas, as células foram previamente mantidas na presença de soro de

camundongo por 5 minutos e posteriormente incubadas por 20 minutos a 4oC

em 10 µL de anti-CD3, anti-CD69, anti-CD25, anti-CD4 ou anti-CD8 acoplado

com PE ou FITC. No fim da incubação, os timócitos foram lavados e suspensos

em PBS para leitura em citômetro de fluxo.

55

3.10- Marcação de antígenos intracelulares

Para a marcação intracelular de p38 fosforilada (P-p38) as células foram

fixadas com 2% de paraformaldeído por 10 minutos a 37oC. Em seguida, as

células foram lavadas e permeabilizadas no gelo com 90% de metanol por 15

minutos. Neste ponto, as células podem ser mantidas a -20oC por várias

semanas. Antes da marcação as células foram lavadas 3 vezes em PBS e

incubadas com anti-P-p38 por 20 minutos . No fim da incubação, os

timócitos foram lavados e suspensos em PBS para leitura em citômetro de

fluxo.

3.11 - Dosagem de cálcio intracelular

As células foram incubadas por 40 minutos à temperatura ambiente na

presença de FURA-2 na dose de 1,5 µM. Após esse período, os timócitos

foram lavados duas vezes e suspensos em uma solução de PBS suplementado

com cloreto de cálcio 1mM. Em seguida, o número de células foi ajustado para

1x 106 células/ml e a mobilização de cálcio analisada por espectrofluorimetria.

O fluorímetro utilizado foi o F4500 Hitachi e a leitura realizada em 340nm de

excitação e 505nm de emissão. Após 100 segundos para definir a linha de

base, as células foram estimuladas com os reagentes e a fluorescência emitida

medida nos próximos 600 segundos.

56

3.12- Potencial de membrana mitocondrial

Para avaliar o potencial de membrana mitocondrial, 1x 106 células

foram lavadas e incubadas na presença e na ausência de DiOC6 5nM, em

500µl de RPMI, por 40 minutos a 370C. Como controle positivo, o FCCP na

concentração de 50µM, foi adicionado aos 20 minutos finais de incubação.

Após esse período as amostras foram analisadas por citometria de fluxo

utilizando o canal FL1.

3.13- Potencial de membrana plasmática

Para avaliar o potencial de membrana plasmática, 1x 106 células foram

lavadas e incubados na presença e na ausência de DiBAC4 150nM em RPMI,

por 30 minutos a 370C. Como controle positivo, 50µl de uma solução de cloreto

de potássio 5M foi adicionada aos 10 minutos finais. As amostras foram

analisadas por citometria de fluxo utilizando o canal FL1.

3.14- Medida de fluorescência

Foi realizada em citômetro de fluxo (FACSCAN II, Becton Dickinson)

equipado com laser de íons de argônio de 15mW em 488nm, resfriado a ar. A

fluorescência verde emitida pelo isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi

detectada após passagem em filtro de 530nm (FL1). A fluorescência laranja da

ficoeritrina (PE) foi detectada após passagem em filtro de 585nm (FL2).

57

3.15 -Western Blot

Os timócitos foram lisados no gelo em tampão de lise e os extratos

celulares aplicados em géis de poliacrilamida 8%. Após a corrida, os géis

foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Hybond ECL;

Amersham Pharmacia Biotech), bloqueados com 5% de leite e incubados com

anti-fosfo-ERK (sc-7383; Santa Cruz Biotechnology) overnight. As bandas

foram visualizadas após a adição de reagentes de detecção (Amersham).

3.16- Extração de RNA

Para a extração de RNA foram utilizados 10mg de tecido,

imediatamente estabilizados e protegidos com o reagente de estabilização

RNAlater. O método de homogenização foi realizado utilizando o motor politron.

As instruções foram seguidas de acordo com o manual do fabricante (QIAGEN,

RNeasy Mini Handbook, terceira edição, páginas 50 -55). De modo resumido, o

tecido foi lisado na presença de um tampão de isotiocianato de guanidina, que

é capaz de inativar RNAases. Em seguida foi adicionado o etanol, que favorece

a ligação do RNA total em uma mini coluna (RNeasy mini column). Na

membrana da mini coluna os contaminantes são eliminados. Dessa forma, o

RNA de alta qualidade é eluido em 30µL de água. Abaixo, está um esquema

resumido do processo de extração.

58

3.17- Síntese de cDNA

Para a síntese de cDNA, realizada em um tubo de microcentrífuga livre

de nucleases, foram adicionados os seguintes componentes: 1µl de Oligo(dT),

2,4µg de RNA total e 1µl de dNTP, completando para um volume final de 12 ul

de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC), um inibidor de RNAses. Essa

mistura foi aquecida a 65º por 5 minutos e colocada no gelo rapidamente. O

Timo

1-Adicionar o reagente de estabilização, RNAlater.

2 e 3-Lisar e homegenizar

4-Adicionar etanol

6-Lavar 3 vezes

5-Ligação do RNA total à membrana

7-Eluir RNA total

59

conteúdo do tubo foi centrifugado rapidamente e foi adicionado 4µl do tampão

da fita simples, 2µl de 0,1M DTT e 1 µl de água DEPC. O tubo foi centrifugado

novamente e incubado a 42º C por 2 minutos. Adicionou-se 1 µl (200 unidades)

de SuperScriptTM II RT e essa mistura foi homogeneizada cuidadosamente. O

tubo foi incubado a 42º C por 50 minutos. Após essa etapa, o tubo foi aquecido

a 70ºC por 15 minutos para inativar a reação.

3.18- Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)

A Reação de Polimerização em Cadeia foi realizada em um volume de

20µl contendo 2 µl de cDNA, 200µM de dNTP, 0,8 µM de cada primer, 2

unidades de Taq polimerase e 1x tampão Taq (tris-HCl 10mM pH 8.4, KCl,

50mM 0,1% de TritonX-100, MgCl2 1,5mM). As amostras foram colocadas no

termociclador, num total de 40 ciclos:

94º C por 3 min 94º C por 1 min 55º C por 1 min 72o C por 1 min 72o C por 5 min

Os primers utilizados foram :

Beta actina murino –sense ACACCCGCCACCAGTTCGCC Beta actina murino -anti –sense GCACAGTGTGGGTGACCCCGTCTC NA+/K+ATPase-α1- sense GGCTTATGGCATCCGAAGTG NA+/K+ATPase -α1- anti sense GACATCCTCCGCATTGAT NA+/K+ATPase -α2-sense GAATGGGTTTCTACCATCGCG

60

NA+/K+ATPase -α2- anti sense GCACAGAACCACCACGTGAC NA+/K+ATPase -α3 -sense GGCAGCCCAGGAACCCACGC NA+/K+ATPase -α3-anti sense AGGACAGGAAGGCAGCGAGG NA+/K+ATPase -α4- sense CCTGCTGAACCCCTGCATCTTC NA+/K+ATPase -α4-anti sense TTTGTTGGCGTTTTCTTTGTAA 3.19- Análise Estatística

Foi realizada utilizando o teste de variância Anova: fator único e o teste-

T. Os valores significativos possuem p < 0,05.

61

4. RESULTADOS

62

4.1. Expressão das subunidades α da Na+/K+ATPase em timócitos

A enzima Na+/K+ATPase é um heterodímero composto por três

subunidades α, β e γ. A subunidade α corresponde ao sítio catalítico dessa

enzima e possui o sítio de ligação da Ouabaína.

Até o momento foram identificadas quatro isoformas da cadeia α com

diferentes afinidades pela Ouabaína. A cadeia α1 presente em roedores é pelo

menos cem vezes mais resistente à Ouabaína quando comparada às outras

subunidades. A cadeia α3 possui maior sensibilidade à Ouabaína do que a

cadeia α2. Dessa forma, de acordo com a distribuição das isoformas da

Na+/K+ATPase, e com a combinação das subunidades nas diferentes espécies,

o efeito da Ouabaína na Na+/K+ATPase pode ser bastante variável.

Spach e Aschenasy encontraram uma maior atividade Na+/K+ATPase

inibível por Ouabaína em timócitos (SPACH e ASCHENASY, 1973). No

entanto, pouco se sabe sobre a distribuição das isoformas da cadeia α da

Na+/K+ATPase no timo.

Nosso trabalho, utilizando PCR, demonstrou que timócitos são capazes

de expressar todas as isoformas da cadeia α (Fig. 12), com exceção da cadeia

α4 descrita apenas nos espermatozóides. Estes foram utilizados como controle

positivo da expressão da isoforma α4 (Fig. 12). A presença da subunidade α3,

que possui a maior afinidade pela Ouabaína, e da subunidade α2, com

afinidade intermediária pela mesma, pode justificar a maior atividade da

Na+/K+ATPase inibível por Ouabaína descrita em timócitos anteriormente

(SPACH e ASCHENASY, 1973).

63

Figura 12: Expressão das subunidades α da Na+/K+ATPase em timócitos.

α 3 α 4 α 4-espermatozóide

actina α 1 α 2

β actina-501pb

α2-348pb α1-217pb

α4-468pb

α3-408pb

64

4.2. Papel do Ca++ extracelular nos efeitos desencadeados por

Ouabaína

A Ouabaína na concentração de 100nM é capaz de induzir mobilização

de Ca++ em timócitos (ECHEVARRIA-LIMA et al, 2003). Dados do nosso

laboratório também demonstraram que a Ouabaína é capaz de aumentar a

expressão de CD69 em linfócitos maduros de sangue periférico ativados por

PHA ou TPA (PIRES et al , 1997).

Timócitos que estão na fase duplo-positivo (CD4+ CD8+) ou no início da

fase SP (CD4+CD8- ou CD4-CD8+), apresentam CD69 constitutivo na

membrana (SWAT et al, 1993). A expressão da molécula de superfície CD69

está relacionada ao aumento dos níveis intracelulares de Ca++. Existem dados

demonstrando que, em células T Jurkat, a inibição do influxo de cálcio gera um

bloqueio da expressão de CD69 induzida por tapsigargina (AUSSEL et al,

1996).

Dessa forma foi estudado o papel de Ouabaína na expressão de CD69,

na presença e ausência de Ca++ extracelular, através do uso do quelante de

Ca++ EGTA. O efeito de Ouabaína na expressão de CD69 também foi

comparado ao efeito de outras substâncias capazes de mobilizar Ca++, como o

inibidor da Serca ATPase, tapsigargina e o éster de forbol TPA.

Nossos dados demonstraram que a Ouabaína foi capaz de aumentar a

expressão de CD69 após 18h de cultura (ANEXO1-Fig.3). A expressão de

CD69 induzida por tapsigargina e TPA pode ser observada de forma mais

precoce, após 6h de incubação (ANEXO1-Fig.2 e Fig.3).

65

O aumento dos níveis de CD69 depende do influxo de Ca++ proveniente

do ambiente extracelular, visto que o quelante de Ca++ EGTA foi capaz de inibir

totalmente a expressão dessa molécula desencadeada por Ouabaína e

tapsigargina. A expressão de CD69 induzida por TPA foi parcialmente reduzida

na presença de EGTA (ANEXO1-Fig.5).

A indução de CD69 não parece estar relacionada com o processo de

maturação de timócitos. A Ouabaína não foi capaz de alterar a proporção de

células expressando CD4 e CD8 em sua superfície. No entanto, apesar do TPA

e da tapsigargina diminuírem a proporção de células DP, esse fenômeno

parece estar relacionado a uma internalização de molécula CD4, como descrito

anteriormente (BIGBY et al, 1990; TAGAWA et al, 1991) (ANEXO1-Fig.7).

Este conjunto de dados, publicado na revista Life Sciences (ANEXO 1),

demonstrou que a Ouabaína, assim como a tapsigargina e o TPA, foi capaz de

alterar a expressão de CD69 em timócitos. No entanto, a Ouabaína não foi

capaz de induzir uma maturação subseqüente dessas células. Nosso trabalho

sugere que, para a indução da expressão de CD69, o influxo de Ca++ externo é

fundamental para a sinalização desencadeada, independente dos níveis de

Ca++ alcançados.

66

4.3. Efeito de Ouabaína em timócitos estimulados com o mitógeno

concanavalina-A

Mitógenos são capazes de aumentar a síntese da Na+/K+ATPase e sua

atividade (MARAKHOVA et al, 2005; SZAMEL et al, 1981) induzindo, dessa

forma, uma mudança de conformação nessa enzima, que adquire um estado

conformacional denominado E2 (MARAKOVA et al, 2005; SZAMEL et al,

1981). Nesta conformação a Na+/K+ATPase disponibiliza o sítio de ligação de

maior afinidade à Ouabaína (LINGREL et al, 1998).

A Ouabaína é capaz de inibir a proliferação linfocitária induzida por

diversos mitógenos (QUASTEL e KAPLAN,1968; MORAES et al,1989, OLEJ et

al, 1994, STOECK et al, 1983). Em timócitos murinos, a Ouabaína também é

capaz de inibir a proliferação desencadeada por concanavalina-A (SZAMEL et

al, 1981). No entanto, o mecanismo de ação pelo qual a Ouabaína exerce

esses efeitos não foi elucidado.

O artigo referente ao ANEXO 2 analisa o papel de Ouabaína na

proliferação celular induzida por concanavalina-A e as vias de sinalização

envolvidas.

Os resultados confirmaram que a Ouabaína inibe a proliferação

desencadeada por concanavalina-A em timócitos (ANEXO2, FIG.1A). Este

efeito está diretamente relacionado com a ausência da cadeia α do receptor de

IL-2, CD25, pois timócitos ativados na presença de Ouabaína apresentam uma

inibição significativa desta molécula (ANEXO2, FIG.1B). O efeito de Ouabaína

em timócitos ativados não envolve morte celular (ANEXO2, FIG.2) nem

modificações no processo de maturação (ANEXO2, FIG.3).

67

A MAPK p38 está relacionada com a proliferação e com a expressão de

CD25 em timócitos ativados. Foi possível demonstrar que a Ouabaína foi capaz

de reduzir a fosforilação da MAPK p38 induzida por concanavalina-A

(ANEXO2, FIG.4A), mas não interfere nos níveis de fosforilação da MAPK ERK

no tempo estudado (ANEXO2, FIG.4B).

Dados recentes da literatura demonstraram que a p38 é capaz de

aumentar os níveis de NFATc1 e ativar este fator de transcrição. Nossos dados

demonstraram que a Ouabaína é capaz de reduzir a expressão de NFATc1

após 6 e 18 horas de cultura (ANEXO2, FIG.5).

Com esse trabalho (ANEXO 2), que se encontra submetido para

publicação, concluímos que em timócitos ativados, a concentração de 100 nM

de Ouabaína é capaz de inibir a fosforilação de p38 causando uma redução

nos níveis de NFATc1 e da expressão subseqüente de CD25. A ausência do

receptor de IL- 2 impede que timócitos ativados por Con A prossigam no ciclo

celular.

68

4.4. Efeito de Ouabaína na despolarização da membrana plasmática

em timócitos estimulados com o mitógeno concanavalina-A

Em linfócitos humanos maduros de sangue periférico, a ativação por

mitógenos resulta na despolarização da membrana plasmática. Neste mesmo

modelo, a Ouabaína é capaz de aumentar a despolarização induzida por

mitógenos (ESTEVES et al., 2005). Por outro lado, um possível efeito de

Ouabaína na despolarização de membrana plasmática em timócitos ativados

ainda não é conhecido.

Nossos resultados demonstraram que, após 6h e 18h de cultura, a

presença de Ouabaína por si só, na concentração de 100nM, não é suficiente

para despolarizar timócitos. No entanto, a concanavalina A foi capaz de induzir

despolarização dessas células em 6 e 18h. Esta despolarização é menor após

18h de cultura e pode refletir o mecanismo compensatório das células em

recuperar o potencial de membrana, sintetizando mais moléculas da

Na+/K+ATPase (BORTNER et al, 2001). Neste período de incubação (18h), a

Ouabaína, inibindo a Na+/K+ATPase, foi capaz de reverter esse processo

compensatório aumentando, de forma significativa, a despolarização induzida

por concanavalina-A (Fig.13)

69

Figura 13: Efeito de Ouabaína na despolarização da membrana plasmática em

timócitos estimulados com o mitógeno concanavalina-A. Timócitos foram tratados

com Ouabaína 100nM e/ou 2,5µg/ml de concanavalina-A por 6 e 18h de cultura. O

corante DiBAC4 foi utilizado para detectar o potencial de membrana plasmática. Os

números representam o percentual de células despolarizadas.

6h 18h

Even

tos

DIBAC

6h 18h

Even

tos

DIBAC

6h 18h

Even

tos

DIBAC

70

4.5. Efeito da Ouabaína associado à hidrocortisona na atrofia do

timo utilizando o modelo in vivo.

Sabe-se que os glicocorticóides, assim como os mitógenos, são capazes

de ativar a Na+/K+ ATPase, permitindo uma maior afinidade dessa bomba à

Ouabaína (LYOUSSI e CRABBE, 1996). Dessa forma, a Ouabaína atuando

numa Na+/K+ ATPase ativa é capaz de aumentar a despolarização induzida por

glicocorticóides (MANN et al., 2001). Apesar de ser um indutor clássico do

processo de apoptose em timócitos (WYLLIE e MORRIS, 1982), os

glicocorticóides são fundamentais para o desenvolvimento de linfócitos T,

participando da fisiologia do timo (VACCHIO et al, 1998).

A Ouabaína é uma substância endógena, cujos níveis estão aumentados

em situações de estresse, na mesma circunstância onde há aumento da

secreção de glicocorticóides.

Utilizando um modelo in vivo, analisamos o efeito de Ouabaína

associado ao do glicocorticóide hidrocortisona, no timo de camundongos com

diferentes idades. O conjunto desses dados está presente no artigo referente

ao ANEXO 3, que se encontra aceito para publicação na revista Bioscience

Reports.

A associação entre Ouabaína e hidrocortisona é capaz de exacerbar a

atrofia do timo e a redução da celularidade observada na presença de

hidrocortisona. A Ouabaína por si só não é capaz de alterar o peso desse

órgão (ANEXO 3, Tabela 1). Este efeito só pode ser observado em animais de

até 13 dias de idade (Fig.14).

71

Figura 14: O sinergismo entre Ouabaína e hidrocortisona ocorre em animais de

até 13 dias. Camundongos Balb/c de 9-13 dias e de 25-50 dias foram inoculados i.p.

com 0,56 mg/kg de Ouabaína e/ou com 140 mg/kg de hidrocortisona. Após 21h os

animais foram sacrificados e o peso do timo foi analisado através de uma balança

analítica. Resultado referente a 4 experimentos por grupo.

25- 60 dias*

0102030405060708090

Pes

o do

Tim

o (m

g)

Controle OUA HC OUA + HC

0

10

20

30

40

50

609-13 dias

*

25-60 dias

72

Através do uso de um kit de anexina e do estudo do volume celular,

observamos que o sinergismo no processo de apoptose também é uma

característica do tratamento in vivo de Ouabaína e hidrocortisona (ANEXO 3,

Fig.2). Este fenômeno também se reflete no número de células com perda do

potencial de membrana mitocondrial (ANEXO 3, Fig.5).

A associação entre Ouabaína e hidrocortisona tem como alvo as

mesmas subpopulações, sendo capaz de aumentar os efeitos produzidos. O

tratamento com hidrocortisona é capaz de reduzir a subpopulação DP e a

Ouabaína magnifica este efeito (ANEXO 3, Tabela 2).

Após o tratamento com as duas substâncias foi possível observar um

aumento na proporção de células CD69 positivas (ANEXO 3, Fig.3). Células

que expressam altos níveis de CD69, CD69high, correspondem às células SP

que estão no final do processo de maturação e são resistentes à

glicocorticóides. Por outro lado, timócitos CD69low, são mais imaturos e

sensíveis ao efeitos desses hormônios. Nossos dados demonstraram que

apesar do aparente aumento da expressão de CD69, o número absoluto de

células CD69high, não se altera enquanto o número de células CD69low é

reduzido na presença de Ouabaína e hidrocortisona (ANEXO 3, Fig.4). Este

dado indica que a população CD69high é resistente ao efeito desse tratamento e

provavelmente corresponde às células mais maduras.

73

5.DISCUSSÃO

74

O presente trabalho demonstrou que a Ouabaina é capaz de modular

timócitos in vitro e in vivo. A enzima Na+/K+ ATPase possui sítios de ligação

para a Ouabaína, funcionando como seu receptor. Este glicosídeo se liga a

subunidade α desta ATPase (BLAUSTEIN,1993). Fomos capazes de detectar

em timócitos a presença de três isoformas da subunidade α da Na+/K+

ATPase: α1, α2 e α3. É provável que a expressão das três isoformas, inclusive

a α3 que é a mais sensível à Ouabaina (O’BRIEN et al, 1994), explique os

dados da literatura que sugerem que timócitos possuem uma atividade Na+/K+

ATPase muito elevada (SPACH e ASCHKENASY, 1973). Também existem

descrições de que a Na+/K+ ATPase murina é bastante resistente à Ouabaina

(ERDEMANN et al, 1984; SWEADNER, 1989) e o fato de timócitos

expressarem as subunidades α2 e α3, justificaria a susceptibilidade dessas

células à concentração de 100nM de Ouabaina utilizada neste estudo

Já havia sido descrito pelo nosso grupo (ECHEVARRIA-LIMA et al.,

2003) que timócitos expostos à Ouabaína mobilizavam Ca++ de uma maneira

dose dependente. Só uma pequena proporção desse Ca++ vem do meio

externo (30%), sugerindo que a maior parte é mobilizada de estoques

intracelulares, característica de ativação de uma via de sinalização celular.

Quando fomos investigar se a sinalização produzida por ouabaína seria capaz

de induzir maturação ou diferenciação de timócitos in vitro, verificamos que

essas células passavam a expressar CD69 18h após tratamento com

Ouabaína. Também verificamos que o influxo de Ca++ era essencial para a

expressão de CD69, não só aquele induzido por Ouabaína, mas também

aquele induzido por tapsigargina e o éster de forbol TPA. No entanto, outras

moléculas ligadas ao processo de maturação celular de timócitos (expressão

75

de CD25, CD4 ou CD8) não tiveram a sua expressão regulada por Ouabaína,

apesar de tanto tapsigargina quanto TPA serem capazes de afetar a expressão

de CD4 ou CD8 em timócitos. O aumento da expressão da molécula CD69

induzida por Ouabaína havia sido descrito em linfócitos maduros ativados por

mitógenos apesar da proliferação dessas células estar inibida (PIRES et al,

1997).

A Ouabaína também foi capaz de inibir a proliferação de timócitos

ativados por concanavalina A, como já havia sido descrito por outros autores

(SZAMEL et al, 1981). Fomos capazes de demonstrar que essa inibição da

proliferação de timócitos não se refletiu em uma mudança na proporção de

células expressando CD4 ou CD8 e não envolveu a indução de um processo

de apoptose. No entanto, semelhante ao descrito em linfócitos maduros

(DORNAND et al, 1987, BRODIE et al, 1995), a Ouabaína inibiu a expressão

de CD25, o receptor de IL-2, induzida por concanavalina A. Este mitógeno

induz a ativação do fator de transcrição nuclear NFAT capaz de associar-se ao

promotor da citocina IL-2. Esta citocina estimula um aumento da expressão de

seu receptor em uma alça de feedback positiva (KABOURIDIS et al, 1990) e já

foi mostrado que ouabaína inibe a produção de IL-2 (SZAMEL et al, 1995). É

possível que a inibição do receptor de IL-2 por ouabaína seja secundária à

inibição da produção da citocina IL-2 e dentro deste contexto os nossos

resultados mostraram que Ouabaína inibe a produção de NFATc1 em timócitos

estimulados por concanavalina A.

Outros autores (WU et al, 2003) demonstraram que os níveis de NFAT

estão relacionados à ativação da proteína cinase p38. Comprovamos que esta

proteína cinase está aumentada em timócitos ativados por concanavalina A,

76

como já descrito anteriormente (HSU et al, 2003). Como nossos resultados

mostraram que Ouabaína inibe a ativação de p38 em timócitos ativados por

concanavalina A, esta é, provavelmente, a razão dos níveis diminuídos de

NFAT.

Também estudamos uma outra MAPK, a ERK, que possui um papel

importante na diferenciação de timócitos (SHARP et al, 1997). No entanto, no

tempo estudado, a fosforilação de ERK por Concanavalina A não foi inibida por

Ouabaína.

Portanto, em timócitos ativados por concanavalina A, a Ouabaína inibe a

fosforilação de p38 causando uma redução dos níveis de NFATc1(Fig.15) e na

expressão subseqüente de IL-2 e CD25. A ausência do receptor de IL-2 e da

citocina impede que timócitos ativados prossigam no ciclo celular parando as

células em G1, semelhante ao que foi observado em linfócitos do sangue

periférico (PIRES et al, 1997).

Linfócitos ativados por mitógenos apresentam um aumento bifásico na

atividade da Na+/K+ ATPase. Esse aumento bifásico decorre de uma ativação

inicial da bomba nos primeiros 30 minutos (MARAKHOVA et al, 1998) seguido

de uma fase que representa um aumento no número de moléculas de Na+/K+

ATPase, na membrana plasmática como resultado de nova síntese dessa

molécula (SEVERINE et al, 1987). Nós mostramos que timócitos ativados por

concanavalina A apresentam uma despolarização da membrana plasmática e

que com o passar do tempo essa despolarização diminui, provavelmente como

resultado de síntese de novas moléculas de Na+/K+ ATPase que compensam

as mudanças ocorridas na membrana plasmática. A adição de ouabaína inibe a

77

atividade da bomba impedindo que esta compense as diferenças iônicas e

aumentando dessa forma a despolarização (BORTNER et al, 2001).

Figura 15: Esquema representando os efeitos de Ouabaína em células

ativadas por concanavalina A . A seta verde representa a ativação desencadeada

por concanavalina A. Em vermelho, estão representados os efeitos inibitórios de

Ouabaína em células ativadas.

MKKKs

MKKs MKK3/MKK4/MKK6

MAP-cinases p38

Fator de Transcrição NFATc1

Síntese de IL-2

Proliferação

Expressão de CD25

Ouabaína

Concanavalina A

78

Já existiam evidências mostrando que a Ouabaína em concentrações

menores que 1mM não era capaz de despolarizar a membrana de timócitos

(ECHEVARRIA-LIMA et al, 2003), mas em altas concentrações era capaz de

sinergizar com glicocorticóides na indução da despolarização produzida (MANN

et al., 2001).

É sabido que a Ouabaína se liga com alta afinidade ao estado E2 da

Na+/K+ATPase (LINGREL et al, 1998). Esta conformação é adquirida quando

células são estimuladas por mitógenos (MARAKHOVA et al, 2005; SZAMEL et

al, 1981) ou tratadas com glicocorticóides (LYOUSSI e CRABBE, 1996). Isto

poderia justificar o fato De a Ouabaína, na dose utilizada por nós, só produzir

efeitos na despolarização em células estimuladas por esses agentes. Dessa

forma, a Ouabaína se ligaria com maior afinidade à enzima ativada,

desencadeando seus efeitos.

Também fomos capazes de demonstrar um sinergismo entre ouabaína e

glicocorticóides in vivo. É sabido que animais expostos a glicocorticóides

apresentam involução tímica (SEYLE, 1936, COHEN, 1992), e camundongos

injetados com Ouabaína apresentaram uma exacerbação dos efeitos

produzidos por glicocorticóides o que pode ser observado sob a forma de

diminuição do peso do timo e da celularidade desse órgão. Ouabaína produziu

um aumento na apoptose produzida por glicocorticóides em timócitos, visto que

um sinergismo foi observado em relação à externalização de fosfatidil serina e

colapso do potencial de membrana mitocondrial. A população atingida foi a de

timócitos duplo-positivos, a mesma afetada por glicocorticóides. Como

resultado da apoptose exacerbada dessas células imaturas, pode ser

79

observado um aumento na proporção de células maduras expressando níveis

altos de CD69.

Além de induzir apoptose em linfócitos estimulados por PHA (OLEJ et al,

1998) e de exacerbar os efeitos de glicocorticóides na despolarização da

membrana plasmática em timócitos (MANN et al., 2001), a Ouabaína é capaz

de induzir apoptose (ORLOV et al, 1999) e de amplificar os efeitos da morte

induzida por FAS (NOBEL et al, 2000, BORTNER et al, 2001) em células

Jurkat,. Esse esteróide também interfere no processo de morte celular em

vários outros modelos. A Ouabaína magnifica os efeitos de insultos

apoptóticos em células de músculo liso (ORLOV et al, 2004), em neurônios do

córtex (XIAO et al, 2002) e em células da glia (TAKAHASHI et al, 2000).

A redução nos níveis intracelulares de K+ é um pré-requisito para a

indução de apoptose, visto que, em concentrações normais, esse íon inibe a

atividade de caspases e nucleases (BORTNER et al, 1997). O efeito da

Ouabaína na redução dos níveis de K+ poderia favorecer a ativação de

caspases induzida por glicocortidóides. Isto poderia contribuir para o

sinergismo observado entre Ouabaína e hidrocortisona na atrofia do timo. No

entanto, esse sinergismo entre glicocorticóides e Ouabaína in vivo só pode ser

observado em animais jovens.

Durante o desenvolvimento de roedores a concentração plasmática total

de corticoesterona segue um perfil que está diretamente relacionado com a

idade dos animais. Em animais jovens, entre os dias 6 e 12 após o nascimento,

os roedores apresentam a menor concentração de corticoesterona

identificada no plasma (menos de 0,5µg/dl). Após esta idade, os níveis desse

hormônio começam a subir subitamente e quando os animais atingem 24 dias,

80

a concentração de corticoesterona pode chegar a 25,0 µg/dl (HENNING,

1978).

Existem evidências de que só após 21 dias o córtex da adrenal de

camundongos está totalmente diferenciado, justamente onde há a produção

dos níveis elevados de glicocorticóides (OOSTERWEGEL et al, 1992).

Corroborando esses dados, sabe-se que o período que corresponde ao

aumento dos níveis corticoesterona é o mesmo onde há mudanças enzimáticas

no fígado e no intestino, sugerindo um papel importante desse hormônio em

mediar a maturação e a função das células desses órgãos (GREENGARD,

1970, MOOG et al, 1971). Este conjunto de dados sugere que a partir dessa

idade, que também corresponde a maturação sexual, esses animais passam

por uma mudança endócrina que envolve involução tímica e que talvez

prejudique a observação do sinergismo.

A involução tímica como resultado do estresse e liberação de

glicocorticóides da adrenal é um fenômeno conhecido desde a descrição de

Seyle em 1936. Além de ser produzida pelo hipotálamo e hipófise, a Ouabaína

também é produzida na adrenal (FERRANDI et al., 1997; HAMLYN et al.,

1991; LAREDO et al., 1994) e participa da resposta do organismo ao estresse

(GOTO et al, 1995; BAUER et al , 2005). No entanto, ainda é desconhecido se,

semelhante ao visto com glicocorticóides, este digitálico passa a ser produzido

em uma determinada fase do desenvolvimento do animal.

O trabalho de Gommol (1967) demonstrou que glicosídeos cardíacos

são capazes de alterar o tamanho e a função da adrenal. Em roedores, a

administração crônica de Ouabaína in vivo é capaz de aumentar o peso da

adrenal de forma significativa. Este efeito pode ser notado macroscopicamente

81

após o 5o dia de tratamento com a Ouabaína. Além disso, esse digitálico

também é capaz de aumentar a produção de corticoesterona por essa

glândula (GOMMOL, 1967).

O que nossos resultados parecem demonstrar é que o efeito produzido

por estresse no timo, até então atribuído à liberação de glicocorticóides,

represente na realidade um somatório da liberação de corticóides e Ouabaína.

A Ouabaína poderia atuar diretamente no timo, favorecendo a ativação de

caspases, e/ou então poderia aumentar a produção de glicocorticóides.

Finalmente, o fato de Ouabaína ser capaz de regular alguns aspectos da

maturação e proliferação dos timócitos e de ser produzida in vivo sugerem que

possa exercer um papel fisiopatológico nessas células que não foi até agora

levado em consideração.

82

6. CONCLUSÕES

83

•O tratamento in vitro com Ouabaína 100nM foi capaz de aumentar a

expressão de CD69 após 18 horas de incubação. Outras substâncias também

capazes de mobilizar Ca++, como a tapsigargina e o éster de forbol, são

capazes de induzir a expressão de CD69 em períodos de incubação mais

curtos.

• A expressão da molécula de superfície CD69 não está correlacionada com o

processo de morte celular nem com o processo de maturação.

• O aumento da expressão de CD69 induzido por Ouabaína foi dependente da

entrada de Ca++ proveniente do ambiente extracelular, visto que a presença do

quelante de Cálcio, EGTA, foi capaz de bloquear totalmente a indução de

CD69 .

.•A Ouabaína, na concentração de 100nM, foi capaz de reduzir, de forma

significativa, a proliferação de timócitos desencadeada pelo mitógeno

Concanavalina A. Na presença deste mitógeno, a Ouabaína diminuiu níveis de

expressão de CD25, que corresponde ao receptor da cadeia α da IL-2. Este

dado sugere que ausência deste receptor está relacionada com a redução na

proliferação observada.

•O tratamento de timócitos com Ouabaína e Concanavalina A não alterou a

expressão de fosfatidil serina, nem esteve relacionado com necrose celular. O

padrão de expressão de CD4 e CD8 também não foi alterado.

•A via de sinalização envolvida no efeito de Ouabaína em timócitos ativados

por Concanavalina A esteve relacionada com a inibição da fosforilação da

MAPK p38 e não com a ativação de ERK no tempo estudado. Este mesmo

tratamento também foi capaz de reduzir os níveis de NFAT, que recentemente

foi descrito como alvo da MAPK p38.

84

• No modelo in vivo, a Ouabaína foi capaz de sinergizar com a hidrocortisona,

induzindo uma morte maciça de timócitos, que se refletiu numa redução

significativa do peso e da celularidade do órgão em questão. A morte

desencadeada pelo tratamento com a combinação de Ouabaína e

hidrocortisona aumentou o número de células que expressam fosfatidil serina,

indicando que o processo de apoptose está diretamente envolvido neste

fenômeno.

•A Ouabaína foi capaz de sinergizar com a hidrocortisona induzindo perda do

potencial de membrana mitocondrial. Este dado está de acordo com o aumento

do número de células em apoptose após esse tratamento.

•A inoculação de Ouabaína e hidrocortisona afetou as mesmas subpopulações

que a inoculação somente com hidrocortisona. Há uma redução no percentual

de células DP. Também foi possível identificar que a população de células

CD69+ é resistente ao tratamento em questão.

Este conjunto de dados sugere que a Ouabaína pode possuir um papel

fisiológico o qual pode ser modulado em situações de estresse, onde

também há a secreção de glicocorticóides.

Os efeitos de Ouabaína atuando sobre uma Na+/K+ATPase inativa induzem

a expressão de CD69, que depende do influxo de Ca++ proveniente do

ambiente extracelular (etapa 1, esquema da pág. 72). A sinalização

desencadeada pela Ouabaína, atuando sobre uma Na+/K+ATPase ativada,

envolve a inativação da MAPK p38 e redução dos níveis do fator de

transcrição NFAT, culminando com a inibição da proliferação celular

85

induzida pelo mitógeno Concanavalina A (etapa 2, esquema abaixo). A

etapa 3 do esquema refere-se ao efeito da Ouabaína atuando sobre uma

Na+/K+ATPase ativada por hidrocortisona. A Ouabaína poderia exercer

seus efeitos através do aumento da síntese de glicocorticóides e/ou

através da redução dos níveis de K+, que favorece a ativação de

caspases.

Etapas: 1 2 3

Esquema representando os efeitos de Ouabaína em timócitos murinos

obtidos neste trabalho.

Con A ou HC

Na+/K+ ATPase inativa

Mudança de conformação/ maior afinidade por OUA

OUA OUA

Ca++

Ca++

CD69

p38 P

NFATc1

CD25

Proliferação

Ativação de Caspases

Apoptose

K+

Ausência de Inibição de caspases e glicocorticóides

OUA OUA

86

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8. ANEXOS

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ANEXO 1

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