Ações de pequenas concentrações de ouabaína sobre a ...livros01.livrosgratis.com.br/cp027300.pdf · Às amigas do LEMC, Luciana, Edna, Viviane e Juliana, pelos conselhos científicos

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Ações de pequenas concentrações de ouabaína sobre a pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina em ratos espontaneamente hipertensos: Papel do Sistema Renina – angiotensina e da Na+ K+

ATPase

Fabiana Dayse Magalhães Siman

Dissertação de Mestrado em Ciências Fisiológicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas

Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, Maio de 2007

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

2

Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, Maio de 2007

Siman, Fabiana Dayse Magalhães, 1981

Ações de pequenas concentrações de ouabaína sobre a pressão arterial e

reatividade pressórica à fenilefrina em ratos espontaneamente hipertensos:

Papel do Sistema Renina – angiotensina e da Na+ K+ ATPase . [ Vitória] 2007

xix, 117 p. 29;7 cm (UFES, M.S., Ciências Fisiológicas, 2007) Dissertação, Universidade Federal do Espírito Santo, PPGCF 1. Ouabaína 2. Hipertensão Arterial

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Ações de pequenas concentrações de ouabaína sobre a pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina em ratos espontaneamente hipertensos: Papel do Sistema Renina – angiotensina e da Na+ K+

ATPase

Fabiana Dayse Magalhães Siman

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Aprovada em __________, por:

___________________________________________________

Prof. Dr. Dalton Valentim Vassallo – Orientador, UFES.

___________________________________________________

Profª. Drª. Maria José Campagnole-Santos – ICB – UFMG.

___________________________________________________

Profª. Drª. Ivanita Stefanon – PPGCF, UFES.

Coordenador do PPGCF:

____________________________________________

Prof. Dr. José Geraldo Mill

Universidade Federal do Espírito Santo

Vitória, Maio de 2007

4

“No fim tudo dá certo, se não deu certo é

porque ainda não chegou ao fim”

Fernando Sabino

5

Dedico esse trabalho aos meus

pais e ao Eduardo.

6

Agradecimentos

A Deus, por sempre guiar meus passos e estar presente em todos os

momentos da minha vida.

Aos meus pais por todo amor, ensinamentos e educação com os quais vocês

me criaram. Se estou aqui hoje é por causa de vocês, e serei eternamente

grata por tudo. Obrigada pela paciência e compreensão nos meus momentos

de ausência. Aos meus irmãos, pelo incentivo e apoio, mesmo à distância.

Ao meu orientador Dalton Valentim Vassallo, nosso querido “Chefe”. Obrigada

por ter me acolhido no LEMC desde a iniciação científica e por ter acreditado

em meu trabalho. Agradeço por toda orientação, amizade, ensinamentos e

incentivos. Você é muito mais que um orientador, é um pai, um amigo que

sempre me tranqüiliza nas minhas horas de ansiedade e desespero. Obrigada

por esta grande oportunidade.

À minha amiga Alessandra, pela orientação, apoio e incentivo para a

realização desse trabalho. Obrigada por toda paciência nos meus momentos

de desespero, pelos conselhos científicos e pessoais. Se estou aqui hoje,

muito tenho que lhe agradecer, desde quando fazia iniciação científica. Você

é hoje pra mim, mais que uma colega de laboratório e co-orientadora, é minha

grande amiga. E sempre que tenho oportunidade, gosto de lhe falar o quanto

sou grata e feliz por sua amizade.

Ao Eduardo, por todo amor, compreensão, paciência e incentivo. Aquele que

sempre me apoiou e esteve presente em todos os momentos, principalmente

“naqueles momentos de desespero”. A você, o meu amor hoje e sempre.

7

À Rosangela, José Carlos, Dona Vanda e Guilherme. Obrigada por me

acolherem em suas casas nesse momento da minha vida. Obrigada pelo

carinho e apoio. Serei eternamente grata por tudo que fizeram e ainda fazem

por mim aqui em Vitória.

À Ivanita, nossa querida “Chefa”, por também ter me acolhido no LEMC, por

toda amizade e ensinamentos.

Aos companheiros do LEMC, pela amizade e aprendizado científico.

Às amigas do LEMC, Luciana, Edna, Viviane e Juliana, pelos conselhos

científicos e pessoais, pelo incentivo e companheirismo.

Aos colegas da Pós-Graduação, em especial, minha amiga Ágata, pelo

incentivo e apoio em todos os momentos.

Aos professores e funcionários da Pós-graduação.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

pelo apoio financeiro.

8

Sumário

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Lista de Siglas e Abreviaturas

Resumo

Abstract

I. Introdução.................................................................................................23

1.1. Na+K+ ATPase .........................................................................28

1.2. Fator endógeno inibidor da Na+K+ ATPase..........................33

1.3. Ouabaína e a fisiopatogenia da hipertensão arterial ..........37

II. Objetivos ..................................................................................................46

2.1. Objetivo geral..............................................................................46

2.2. Objetivos específicos.................................................................46

III. Materiais e Métodos ...............................................................................48

3.1. Animais experimentais .........................................................48

3.2. Metodologia empregada para avaliação dos valores pressóricos

.................................................................................................48

3.3. Protocolos experimentais .....................................................49

3.3.1. Avaliação da pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade

pressórica à fenilefrina antes e após administração de ouabaína

.........................................................................................49

3.3.2. Efeito do tônus simpático nas ações da ouabaína sobre a

pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina

......................................................................................50

3.3.3. Influência da Na+K+ ATPase sobre os efeitos produzidos pela

ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à

fenilefrina. ......................................................................51

3.3.4. Envolvimento do Sistema Renina Angiotensina sobre o efeito da

ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à

fenilefrina .......................................................................52

9

3.4. Expressão dos dados e análise estatística..........................53

3.5. Fármacos e reagentes utilizados..........................................54

IV. Resultados..............................................................................................56

4.1. Avaliação da Pressão Arterial Basal, Freqüência Cardíaca e

Reatividade Pressórica à fenilefrina antes e após tratamento

agudo com ouabaína.·...........................................................56

4.1.1. Efeitos da ouabaína na Pressão Arterial e Freqüência Cardíaca

Basal ............................................................................56

4.1.2. Efeitos da ouabaína sobre a reatividade pressórica à fenilefrina

na Pressão Arterial Sistólica e Pressão Arterial Diastólica

.....................................................................................58

4.2. Efeito do tônus simpático nas ações da ouabaína sobre a pressão

arterial, freqüência cardíaca e reatividade pressórica a fenilefrina

................................................................................................60

4.2.1. Resultado do bloqueio ganglionar com hexametônio na pressão

arterial basal e freqüência cardíaca basal antes e após

tratamento com ouabaína.............................................60

4.2.2. Efeito do bloqueio autonômico com hexametônio sobre a

reatividade pressórica à fenilefrina antes e após tratamento com

ouabaína ......................................................................62

4.3. Influência da Na+K+ ATPase sobre os efeitos produzidos pela

ouabaína na pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade

pressórica à fenilefrina. .......................................................65

4.3.1. Efeito do bloqueio com canrenona na pressão arterial basal e

freqüência cardíaca basal antes e após tratamento com

ouabaína. .....................................................................65

4.3.2. Efeito do bloqueio com canrenona sobre a reatividade

pressórica à fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.

.....................................................................................67

10

4.4. Envolvimento do Sistema Renina Angiotensina sobre o efeito da

ouabaína na pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade

pressórica à fenilefrina .........................................................70

4.4.1. Efeito do losartan na pressão arterial basal e freqüência

cardíaca basal antes e após tratamento com ouabaína

.....................................................................................70

4.4.2. Efeito do bloqueio dos receptores para angiotensina II na

reatividade pressórica antes e após tratamento com ouabaína.

.....................................................................................72

V. Discussão ................................................................................................76

5.1. Efeitos da ouabaína na Pressão Arterial, Freqüência Cardíaca

Basal e Reatividade Pressórica à fenilefrina .......................77

5.2. Efeito do hexametônio na pressão arterial e reatividade pressórica

à fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína. ........80

5.3. Efeito da canrenona na pressão arterial e reatividade pressórica à

fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.............82

5.4. Efeito do losartan na pressão arterial e reatividade pressórica à

fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína..............86

VI. Conclusão...............................................................................................91

VII. Referências............................................................................................92

11

Lista de Figuras

Página

Figura 1: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e

(B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=7) e após (Oua,

n=7) 1 hora de tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína.

57

Figura 2: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela

fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B)

Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=7) e após (Oua, n=7) 1

hora de tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína. 59


(B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da

administração de hexametônio (Hexa) e após tratamento com 0,18

µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6).

61



Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da

administração de hexametônio (Hexa, n=6) e após tratamento com

0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa+Oua, n= 6).

63

Figura 5: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de

concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a Pressão

Arterial Diastólica após administração de hexametônio e após

tratamento com hexametônio+ouabaína.

64



administração de canrenona (Can) e após tratamento com 0,18

µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6).

66

12




administração de canrenona (Can, n=6) e após tratamento com 0,18

µg/Kg de ouabaína (Can+Oua, n= 6).

68


concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a Pressão

Arterial Diastólica após administração de canrenona e após

tratamento com canrenona+ouabaína.

69



administração de losartan (Los) e após tratamento com 0,18 µg/Kg

de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).

71




administração de losartan (Los, n=6) e após tratamento com 0,18

µg/Kg de ouabaína (Los+Oua, n= 6).

73


concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a (A) Pressão

Arterial Sistólica e (B) Pressão Arterial Diastólica após administração

de losartan e após tratamento com losartan+ouabaína.

74

13

Lista de Tabelas

Tabela 1: Parâmetro da Pressão Arterial Sistólica Basal (PAS),

Pressão Arterial Diastólica Basal (PAD) e Freqüência Cardíaca Basal

(FC) antes (Ct) e após (Oua) tratamento com 0,18 µg/Kg de

ouabaína; (n= 7)..

56

Tabela 2: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e

sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina

da PAS e PAD, antes (Ct) e após (Oua) tratamento com 0,18 µg/Kg

ouabaína,( n=7).

58

Tabela 3: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS),

Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes

(Ct), depois da administração de hexametônio (Hexa) e após

tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6).

60



da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de hexametônio

(Hexa) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa +

Oua); (n= 6).

62



(Ct), depois da administração de canrenona (Can) e após tratamento

com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6).

65

14



da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de canrenona

(Can) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua);

(n= 6).

67



(Ct), depois da administração de losartan (Los) e após tratamento

com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).

70



da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de losartan (Los)

e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).

72

15

Lista de Siglas e Abreviaturas AMPc – 3’5’-monofosfato cíclico de adenosina

ATP – 5’-trifosfato de adenosina

AV3V – região anteroventral do terceiro ventrículo

Can – canrenona

Ct – controle

dAAC – diferença da área abaixo da curva

ECA – enzima conversora de angiotensina

FC – freqüência cardíaca

FE – fenilefrina

GMPc – 3’5’- monofosfato cíclico de guanosina

Hexa – hexametônio

L-NAME – NG-nitro-L-arginina metil ester

Los – losartan

MnPO – núcleo pré-óptico mediano

Oua – ouabaína

PAD – pressão arterial diastólica

PAS – pressão arterial sistólica

PKA – proteína quinase dependente de AMPc

PKC – proteína quinase C

PKG – proteína quinase dependente de GMPc

SHR – rato espontaneamente hipertenso

16

RESUMO

17

Resumo

A ouabaína (Oua) é um inibidor endógeno da Na+K+ATPase (NKA) e está presente

em concentrações nanomolares no plasma de diversos mamíferos, como ratos e

humanos. Seu papel na manutenção e/ou desenvolvimento da hipertensão tem sido

sugerido em diversos trabalhos, uma vez que demonstram a presença de níveis

elevados desse inibidor em diversas formas de hipertensão. Assim, este estudo

objetivou a investigação dos efeitos da administração aguda de concentrações

fisiológicas de Oua na pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica

(PAD), freqüência cardíaca (FC) e reatividade pressórica à fenilefrina (FE) em ratos

espontaneamente hipertensos (SHRs), bem como os possíveis mecanismos

hipertensores desse glicosídeo cardíaco. Para isso, foram utilizados machos SHR,

com 3 meses de idade. Todos os animais foram anestesiados com uretana e

submetidos à canulação da artéria carótida e veia jugular para a medida de pressão

arterial e administração de fármacos, respectivamente. A pressão arterial e

reatividade pressórica à FE (0,03 a 100 µg/Kg, in bolus) foi avaliada antes e após da

administração de Oua (0,18 µg/Kg). A influência do hexametônio (Hexa, 5mg/Kg),

canrenona (Can, 1mg/kg) e losartan (Los, 10mg/Kg) nas ações desse digitálico

sobre a PAS, PAD, FC e reatividade pressórica à FE também foi avaliada. Após a

administração de Oua houve aumento da PAS e PAD, sem alterar, entretanto, a FC

e reatividade pressórica à FE. O Hexa não bloqueou os efeitos da Oua sobre a PAS

e PAD, porém após o co-tratamento de Hexa mais Oua, houve aumento da

sensibilidade à FE na PAD, sem alterar, entretanto, a reatividade à FE na PAS. A

Can bloqueou os efeitos da Oua sobre a PAS, mas não foi capaz de bloquear esses

efeitos sobre a PAD. Após o co-tratamento de Can mais Oua houve aumento da

reatividade à FE na PAD sem alterar, entretanto, esse parâmetro na PAS. A

administração de Los bloqueou os efeitos pressóricos da Oua. O co-tratamento de

Los mais Oua reduziu acentuadamente a reatividade pressórica à FE na PAS e

PAD. Em conclusão, estes resultados sugerem que a Oua, em concentração

fisiológicas, aumenta a pressão arterial de SHRs. Seus efeitos sobre a PAS parecem

ser dependentes da inibição da Na+K+ATPase, bem como, do sistema renina-

angiotensina. Já os efeitos sobre a PAD parecem ser dependentes apenas, do

sistema renina-angiotensina. Apesar da Oua não ter alterado a reatividade

pressórica à FE, após as intervenções farmacológicas com Hexa, Can e Los

18

realizadas, observou-se que esse glicosídeo cardíaco pode estar ativando

mecanismos pressores e depressores que, em conjunto, se anulam e assim, não

alteram a reatividade pressórica à FE. Possivelmente, esses mecanismos envolvem

a participação do sistema nervoso central, da Na+K+ATPase e do sistema renina-

angiotensina.

19

ABSTRACT

20

Abstract

Ouabain (Oua) is an endogenous inhibitor of the Na+ pump and it is present in

nanomolar concentration in the plasma of several mammalians, such as rats and

humans. Its role in the maintenance and/ or development of hypertension has been

suggested in several studies that show the presence of high plasma levels this

inhibitor in several forms of hypertension. Therefore, this study investigated the

effects of acute administration of physiological concentrations of ouabain on the

systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP), heart hate (HR) and

pressor reactivity to phenylephrine (PHE) in spontaneously hypertensive rats (SHR),

as well as the possible pressor mechanisms of action of this cardiac glycoside. For

this, hypertensive rats; with 3 months age, were used. All animals were anesthetized

with urethane and the jugular vein and the carotid artery were dissected and

cannulated for drug infusion and arterial blood pressure measurements, respectively.

The blood pressure and pressor reactivity to PHE (0,03-100 µg/Kg, in bolus) was

investigated before and 60 min after ouabain (0,18 µg/Kg) treatment. The influence of

hexamethonium (Hexa, 5mg/Kg), canrenone (Can, 1mg/kg) and losartan (Los,

10mg/Kg) in the actions of this cardiac glycoside on SBP, DBP, HR and pressor

reactivity to PHE was evaluated. The administration of Oua increased SBP and DBP,

and did not change the HR and pressor reactivity to PHE. Hexa administration did

not change the effects on blood pressure induced by Oua, but after the co-treatment

Hexa plus Oua, there was an increment of sensitivity (pD2) to PHE on DBP, without

altering the pressor reactivity to PHE on SBP. Can blocked the effects of Oua on

SBP, but did not block these effects on DBP. After the co-treatment Can plus Oua

there was an increment of pressor reactivity to PHE on DBP without altering this

parameter on SBP. The administration of Los blocked the pressor effects of Oua.

The co-treatment of Los plus Oua reduced the pressor reactivity to PHE on SBP and

DBP. In conclusion, these results suggest that Oua, in nanomolar concentrations,

increased the blood pressure of SHR. The effect on the SBP seems to be dependent

on the inhibition of Na+ pump, as well as, on the renin angiotensin system. The effect

on the DBP also seems to be dependent on the renin angiotensin system. Although

Oua did not alter the pressor reactivity to PHE, after the following pharmacologic

interventions of Hexa, Can and Los performed it was observed that this cardiac

glycoside, can be activating both pressor and depressor mechanisms that are

21

annulled without altering the pressor reactivity to PHE. It’s possible that these

mechanisms involve the participation of the Central Nervous System, Na+ pump and

the renin angiotensin system.

22

INTRODUÇÃO

23

1. INTRODUÇÃO

A perfusão tecidual adequada é garantida pela manutenção da força motriz da

circulação, a pressão sanguínea, em níveis adequados e razoavelmente constantes.

A manutenção dessa pressão dentro de uma faixa relativamente estreita de variação

se dá pela interação de complexos mecanismos, como a força propulsora cardíaca,

a capacidade de dilatação elástica da aorta e a resistência ao fluxo sanguíneo,

exercida, predominantemente, pelas arteríolas e artérias de pequeno calibre

(Irigoyen et al., 2003). A pressão sanguínea oscila entre um nível máximo e um nível

mínimo, sendo, portanto, de natureza pulsátil. O nível máximo de pressão é

alcançado durante a sístole, e o nível mínimo, durante a diástole. A geração da

pressão sistólica inicia-se durante o período que precede imediatamente a abertura

da válvula aórtica e início da fase de ejeção. Já a pressão diastólica é gerada

durante o relaxamento ventricular, e é dependente do volume de sangue que

permanece dentro do vaso arterial, volume esse que varia de acordo com a

resistência vascular (Michelini, 1999). Em indivíduos adultos, consideram-se valores

normais de pressão sistólica abaixo de 120 mmHg e a diastólica abaixo de 80

mmHg. Quando a pressão arterial atinge faixas de 120/80 a 139/89 mmHg,

considera-se um estágio de pré-hipertensão, e, se estes valores ultrapassam 140/90

mmHg, classifica-se como hipertensão arterial (Joint National Commitee on

Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood pressure, JNC 7).

A hipertensão arterial é um importante problema de saúde pública, por ser um

dos maiores fatores de risco de morbi-mortalidade cardiovascular e cerebrovascular,

apresentando custos médicos e socioeconômicos elevados, decorrentes

principalmente das suas complicações, tais como: doença cerebrovascular, doença

arterial coronariana, insuficiência cardíaca, insuficiência renal crônica e doença

vascular de extremidades. Estima-se que a hipertensão arterial afeta

aproximadamente 20% da população adulta em sociedades industrializadas e que,

em todo o mundo, pelo menos 500 milhões de pessoas têm ou terá pressão arterial

elevada. Inquéritos de base populacional, realizados em algumas cidades do Brasil,

mostram prevalência de hipertensão arterial de 22,3% a 43,9% (V Diretrizes

Brasileiras de Hipertensão Arterial, 2006).

Em uma pequena fração de casos, a hipertensão é originada de causas

específicas, como doença vascular renal ou excesso de produção de aldosterona ou

24

catecolaminas, sendo classificada, nesses casos, como hipertensão secundária.

Entretanto, a maioria dos pacientes, cerca de 95%, apresenta níveis elevados de

pressão arterial de causa desconhecida, sendo então classificada, como hipertensão

primária ou essencial (Kaplan, 1998).

Apesar de não ter uma causa definida, sabe-se que a hipertensão arterial

essencial é uma entidade clínica multifatorial. Sabendo que a pressão arterial é

resultante da combinação instantânea entre o débito cardíaco e resistência vascular

periférica, fatores que alteram esses determinantes primários da pressão arterial,

podem desencadear então, um processo hipertensivo. Entretanto, a resistência

vascular periférica elevada é uma das principais características da hipertensão

arterial (Folkow et al., 1982; Lund-Johansen, 1983).

Dentre os diversos fatores que contribuem para a gênese e/ou manutenção

da hipertensão arterial essencial, estão incluídos fatores neurogênicos, genéticos,

hormonais, estruturais e ambientais. Dentre os mecanismos neurogênicos,

evidências apontam o aumento da atividade simpática, modulada por diferentes

aferências e substâncias, na patogênese da hipertensão (Wyss, 1993). A atividade

simpática aumentada pode interagir também com outros fatores que contribuem

para o desenvolvimento da hipertensão arterial. Assim, as catecolaminas, além de

aumentarem o tônus dos vasos de resistência nas fases iniciais da hipertensão, são

também estimuladoras de mecanismos tróficos nos vasos, os quais manteriam a

hipertensão por indução de hipertrofia vascular (Yu, 1996).

Existem evidências também de fatores genéticos, que são determinantes para

a pressão arterial. Diversos estudos familiares demonstraram a agregação familiar

da hipertensão arterial, tanto entre irmãos, quanto entre pais e filhos (Havlik, 1979).

Além disso, outra evidência para a existência de fatores genéticos determinando os

níveis de pressão arterial de um indivíduo foi o desenvolvimento de uma série de

modelos animais para hipertensão arterial, como por exemplo, os ratos

espontaneamente hipertensos (SHR), onde as características ligadas à hipertensão

arterial são geneticamente determinadas (Warden, 1997). A questão racial também

influencia os níveis de pressão arterial. Níveis elevados de pressão arterial são mais

freqüentes entre adultos e crianças da raça negra, com uma razão de prevalência

negros/brancos entre 1,5 e 1,7 em estudos brasileiros (Lessa, 1998). Essa diferença

tem sido atribuída a diversos fatores como menor excreção renal de sódio e

potássio, menor supressão da atividade da renina plasmática após exposição à

25

sobrecarga de sódio e níveis mais elevados de insulina com valores de glicemia de

jejum mais baixos (Alpert, 1993; Berenson, 1995).

Em relação aos fatores ambientais, podemos citar a obesidade e resistência à

insulina, o tabagismo, o sedentarismo, o consumo de sal e outros (Folkow, 1982;

Irigoyen, 2003).

Como fator estrutural realça-se o remodelamento vascular, ou seja,

alterações da estrutura dos vasos de resistência. Este processo consiste na

capacidade da parede vascular reorganizar seus componentes celulares e

extracelulares em resposta a um estímulo crônico, como, por exemplo, aumento do

fluxo sanguíneo ou aumento da pressão intraluminar. Estudos mostram que a

hipertensão essencial está associada com a redução do lúmen e aumento da

relação parede: lúmen nos vasos de resistência (Mulvany, 2000; 2002).

Quanto aos mecanismos humorais causadores da hipertensão, são possíveis

citar a ativação do sistema renina-angiotensina e a disfunção endotelial. O endotélio

é um dos fatores mais importantes no controle do tônus vasomotor. Este tem a

capacidade de produzir substâncias vasodilatadoras e vasoconstritoras. É o

equilíbrio entre essas substâncias que contribui para a manutenção do tônus

vascular. A disfunção endotelial resulta do desequilíbrio na produção das

substâncias vasoativas, ou seja, aumento da produção de vasoconstritores

(endotelina, angiotensina II, tromboxano A2) e/ou menor produção de substâncias

vasodilatadoras (óxido nítrico, prostaciclina, fator hiperpolarizante derivado do

endotélio) (Rubanyi, 1993). Além disso, as espécies reativas derivadas do oxigênio

participam do processo de disfunção endotelial (Bouloumie et al., 1997). Os ânions

superóxidos, formados pelo metabolismo de diversos sistemas aeróbicos, se

combinam com o óxido nítrico, formando o composto denominado peroxinitrito. Este,

por sua vez, é altamente citotóxico, e reduz os efeitos vasodilatador, antiproliferativo,

antiinflamatório e antiaterogênico do óxido nítrico (Miller et al., 1998). Todos esses

fatores, em conjunto, acarretam aumento do tônus vasomotor e conseqüente

aumento da pressão arterial.

Além do endotélio, outro fator humoral importante na gênese da hipertensão,

é o sistema renina-angiotensina, considerado um sistema endócrino que apresenta

seus componentes da cascata enzimática produzidos em locais bem definidos (Kifor

& Dzau, 1987). Ele foi originalmente descrito como um sistema sistêmico, mas

recentemente, estudos indicam a existência de um sistema renina-angiotensina

26

tecidual ou local, já que a maioria dos seus componentes está localizada em vários

tecidos do organismo (Dzau, 1989; Danser, 1996; Paul et al., 2006). O substrato

desse sistema, o angiotensinogênio, é produzido no fígado e clivado na circulação

sanguínea pela renina, que é secretada no aparato justaglomerular dos rins, para

formar o decapeptídeo angiotensina I (Hackenthal et al., 1990; Hall, 2003; Persson

et al., 2004). A angiotensina I, sob ação da enzima conversora de angiotensina

(ECA), é clivada, formando o octapeptídeo angiotensina II (Corvol et al., 1995;

Costerousse et al., 1998). Além das angiotensinas I e II, outras angiotensinas são

produzidas como a angiotensina 1-7, angiotensina III e a angiotensina IV, e têm sido

associadas a respostas específicas, porém, a angiotensina II constitui o principal

peptídeo desse sistema e promove diversos efeitos hemodinâmicos que contribuem

para o aumento da pressão arterial (Ardaillou & Chansel, 1997; Santos et al., 2000).

As ações da angiotensina II são mediadas através da sua interação com

receptores específicos de membrana, principalmente o AT1 e AT2, sendo estas

ações distintas, em função do tipo de receptor (De Gasparo et al., 1995). A

existência de um receptor AT4 para angiotensina tem sido relatada, porém seus

efeitos ainda não foram caracterizados (Burns et al., 2004; Chai et al., 2004). A

angiotensina II, via interação com receptores AT1, promove vasoconstrição, aumento

da resistência vascular periférica e da pressão arterial. Além disso, estimula a

liberação de aldosterona, endotelina-1, vasopressina e aumenta a atividade do

sistema nervoso simpático. Ainda, a estimulação dos receptores AT1 é capaz de

promover aumento da produção de radicais livres, crescimento e migração celular,

produção de proteínas da matriz extracelular e inflamação (Weir & Dzau, 1999; Allen

et al., 2000; Touyz & Berry, 2002). Em contrapartida, através da interação com

receptores AT2, a angiotensina II promove relaxamento do músculo liso vascular,

inibição do crescimento e da proliferação celular e estimulação da apoptose (Dzau et

al., 1993; Weir & Dzau, 1999; Siragy, 2000). Tendo em vista que os efeitos da

angiotensina II via receptores AT1, promovem aumento da pressão arterial, fármacos

antihipertensivos, como os inibidores da ECA e/ou antagonistas de receptores AT1,

foram desenvolvidos e são amplamente utilizados na clínica (Weir & Dzau, 1999;

Ferrario, 2006).

Todos estes fatores citados acima, associados ou isoladamente, contribuem

para a gênese e/ou manutenção da hipertensão arterial. Além desses fatores, foi

sugerido na década de sessenta, a existência de um hormônio, inibidor da Na+K+

27

ATPase, que se encontrava elevado em algumas patologias como a hipertensão

arterial (de Wardener, 1961; Haddy & Overbeck, 1976, Hamlyn, 1982). Surge então,

mais um agente importante no processo hipertensivo.

Para melhor compreensão das ações desse agente, é necessário um

detalhamento da Na+K+ ATPase , o sítio de ligação desse hormônio chamado

ouabaína.

28

1.1. Na+K+ ATPase

A Na+K+ ATPase, também conhecida como bomba de sódio, descrita por

Skou em 1957, é uma proteína integral de membrana, presente na maioria das

células eucarióticas. Faz parte da família de ATPases tipo P, que são responsáveis

pelo transporte ativo de uma variedade de cátions através da membrana, como o

sódio, hidrogênio, magnésio, potássio, cálcio, cobre e cádmio (Scheiner-Bobis,

2002). Esse grupo de proteínas integrais de membrana colabora para processos

fundamentais na célula, como a geração de potencial de membrana e a contração

muscular, sendo caracterizado pela sua função de hidrólise do ATP. Assim, todas

estas enzimas usam a energia armazenada em ATP para o transporte desses

cátions contra um gradiente de concentração (Stekhoven & Bonting, 1981;

Horisberger, 2004).

A bomba de sódio é formada pelas subunidades α, β e γ (Blanco & Mercer,

1998). A subunidade α, com peso molecular aproximado de 113 kDa, é composta de

6-7 domínios transmembranais. É responsável pelas propriedades catalíticas e de

transporte da enzima, contendo sítios de ligação para cátions, trifosfato de

adenosina (ATP), e compostos digitálicos (Rose & Valdes, 1994). A subunidade β,

com aproximadamente 55 kDa, possui apenas um domínio transmembrana e é

altamente glicosilada. Esta subunidade é essencial para a maturação e atividade

normal da enzima, e parece estar envolvida na modulação da afinidade da enzima

ao K+ e Na+, além de facilitar o ancoramento e estabilização da subunidade α na

membrana (Blanco & Mercer, 1998). Quanto à terceira subunidade, γ, com peso

molecular aproximado de 14kDa, pouco se sabe. Estudos mostram que a presença

da subunidade γ modifica o sítio externo de ligação do cátion à bomba de sódio, por

um mecanismo direto ou alostérico, alterando assim, a sensibilidade da Na+K+

ATPase ao potássio (Béguin et al., 1997). Recentemente, um grupo de pequenas

proteínas, chamado de proteínas “FXYD”, foi identificado (Sweadner & Rael, 2000).

A subunidade γ faz parte desse grupo, sendo chamada de FXYD2. Os membros

desse grupo têm sido associados com a bomba de sódio, sendo caracterizados pela

capacidade de modular a função dessa enzima (Sweadner & Rael, 2000; Cornelius

& Mahmmoud, 2003; Horisberger, 2004; Lindzen, 2006). Entretanto, a significância

fisiológica da subunidade γ ainda é pouco conhecida, e são necessários então, mais

estudos para descobrir o seu exato papel.

29

Como as outras proteínas essenciais da célula, a bomba de sódio é expressa

como várias isoenzimas. Assim, existem múltiplas isoformas das subunidades α e β,

cuja expressão varia de acordo com cada tecido (Blanco & Mercer, 1998). A

subunidade α possui quatro isoformas: α1, α2, α3 e α4. A isoforma α1 está presente

em praticamente todos os tecidos, já a isoforma α2 está predominantemente nos

adipócitos, músculo esquelético, coração e cérebro. A isoforma α3 é abundante no

sistema nervoso central, estando também presente no coração, células sanguíneas

e ovários, enquanto a isoforma α4 foi descrita apenas em testículos de ratos

(Shamraj & Lingrel, 1994; Blanco & Mercer, 1998). As isoformas α1, α2 e α3 também

estão presentes no músculo liso vascular (Sahin-Erdemli et al., 1994). Em relação à

afinidade aos compostos digitálicos, estas isoformas se diferem. Destas, nos

roedores, a que apresenta maior sensibilidade à ouabaína é a α3, seguida pela α2 e

α1, sendo esta última, a menos sensível (Rose & Valdes, 1994; Blanco & Mercer,

1998). Já a subunidade β pode ser encontrada sob três isoformas: β1, β2 e β3. As

isoformas β1e β2 têm sido encontradas em diferentes tecidos de mamíferos enquanto

a β3 tem sido detectada em anfíbios, ratos e humanos (Martin-Vasallo et al., 1989).

Assim sendo, ambas isoformas da bomba de sódio exibem uma expressão tecido-

específica, sendo que a isoenzima α1β1 é encontrada em quase todos os tecidos

(Blanco & Mercer, 1998).

A Na+K+ ATPase funciona como um sistema de transporte ativo, responsável

pela manutenção dos gradientes de sódio e potássio através da membrana

plasmática. Esta enzima, usando a energia da hidrólise de uma molécula de ATP,

transporta 3 íons sódio do meio intracelular e 2 íons potássio do meio extracelular. O

gradiente eletroquímico gerado pela bomba de sódio é responsável pela

manutenção do balanço osmótico da célula, pela manutenção do potencial de

membrana da célula e pelas propriedades excitáveis das células musculares e

nervosas. Em adição, o gradiente eletroquímico do sódio, fornece energia para os

sistemas de transporte secundário, como o transporte de íons (cálcio, cloreto,

fosfato, hidrogênio), e de substratos como a glicose e aminoácidos. Nos rins, a

Na+K+ ATPase tem um papel importante na reabsorção de sódio e água, fator

essencial para a manutenção do volume extracelular e pressão sanguínea. Assim,

esta enzima é essencial, pois controla diversas funções vitais para a célula (Blanco

& Mercer, 1998; Scheiner-Bobis, 2002; Geering, 2006).

30

Além disso, a Na+K+ ATPase, através do controle da concentração

citoplasmática de sódio, influencia também as concentrações de cálcio, via trocador

Na+/Ca2+, participando então, da contração do músculo liso e cardíaco (Marin &

Redondo, 1999; Geering, 2006). Como o íon sódio tem um papel crítico na

manutenção do balanço de cálcio no músculo liso, existe então, uma relação entre o

íon sódio e a manutenção do tônus vascular, e consequentemente, uma relação

entre sódio e hipertensão. Assim, muitos estudos foram desenvolvidos associando

alterações da atividade da bomba de sódio e hipertensão essencial (Blaustein, 1986;

O’Donnell & Owen, 1994).

A atividade da bomba de sódio é regulada por diversos fatores. Estudos

demonstraram que esta enzima, em células de músculo liso vascular, pode ser

estimulada por tratamentos que aumentam a concentração intracelular de sódio e/ou

redução da concentração intracelular de potássio (O’Donnell & Owen, 1994;

Aydemir-Koksoy & Allen, 2001; Zhou et al., 2003). Agentes vasoativos e hormônios

também podem modular a atividade da bomba de sódio, seja pela alteração da

concentração de sódio intracelular ou por outros mecanismos, como a fosforilação

por proteínas quinases. Dependendo do tecido, a ativação de proteínas quinases

pode induzir a um aumento ou diminuição da atividade dessa enzima (Blanco &

Mercer, 1998). Agentes que aumentam os níveis intracelulares de 3’5’-monofosfato

cíclico de adenosina (AMPc) levam à ativação da proteína quinase dependente de

AMPc (PKA), que por sua vez, promove fosforilação da bomba de sódio, podendo

inibir ou estimular essa enzima. Estudos mostraram que a PKA inibe a atividade da

Na+K+ ATPase na alça de Henle e ducto coletor, e estimula no túbulo proximal, nos

rins (Horiuchi et al., 1993; Béguin et al., 1996; Feraille et al., 1995; Therien &

Blostein, 2000).

A ativação da proteína quinase C (PKC) também é um mecanismo de

regulação da Na+K+ ATPase, podendo também inibir ou estimular essa enzima, de

acordo com cada tecido. A ação da PKC se dá através da ativação da via da

fosfolipase A2 ou por fosforilação direta da subunidade α da Na+K+ ATPase, levando

à endocitose dessa enzima (Vasilets et al., 1990; 1997). Outra proteína quinase

envolvida na regulação da atividade da bomba de sódio é a proteína quinase

dependente de GMPc (PKG) (Vaandrager & Jonge, 1996; Therien & Blostein, 2000).

A PKG, que é ativada por 3’5’-monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), promove

inibição da Na+K+ ATPase no músculo esquelético, cérebro, entre outros, e ativação

31

dessa enzima em artérias, músculo liso pulmonar, entre outros. As tirosinas

quinases também estão sendo mencionadas como moduladoras da atividade da

Na+K+ ATPase. Especificamente, elas parecem ter um papel importante na

estimulação da bomba de sódio promovida pela insulina nas células do túbulo

proximal renal (Feraille et al., 1999; Therien & Blostein, 2000).

Por estas vias, hormônios, íons e fatores endoteliais podem regular a

atividade da bomba de sódio. Sua regulação se dá a curto ou a longo prazo. A

regulação a curto prazo envolve efeitos diretos na cinética enzimática ou

translocação da bomba de sódio de estoques intracelulares para a superfície celular.

Já a regulação a longo prazo, envolve mecanismos que afetam a síntese ou

degradação da enzima (Ewart & Klip, 1995; Therien & Blostein, 2000;). Estudos

mostram que a aldosterona é capaz de aumentar a expressão da bomba de sódio,

sendo que este aumento de síntese protéica é dependente de mudanças na

concentração citoplasmática de sódio (Bonvalet, 1998; Ikeda et al., 1991). As

catecolaminas também regulam a atividade da bomba de sódio. Trabalhos mostram

que a dopamina promove inibição da atividade dessa enzima, enquanto as

catecolaminas adrenérgicas, epinefrina e norepinefrina, estimulam sua atividade

(Aperia et al., 1992; Fryckstedt et al., 1993; Wang et al., 1998). Além disso, os

fatores derivados do endotélio, são capazes também de regular a atividade da Na+K+

ATPase. A angiotensina II, endotelina-1 e óxido nítrico agem estimulando, enquanto

que a prostaciclina e prostaglandina E2, inibem a atividade da bomba de sódio

(Gupta et al., 1994b; Marin & Redondo, 1999).

Em adição aos efeitos regulatórios mediados por íons, hormônios e fatores

endoteliais, recentes experimentos têm revelado um novo mecanismo regulatório

que envolve a interação da Na+K+ ATPase com pequenas proteínas da família

FXYD. Em contraste com a regulação hormonal, a interação das proteínas FXYD

não produz mudanças na expressão da bomba de sódio, mas modifica as

propriedades de transporte da Na+K+ ATPase via tecido-específico e isoforma-

específica (Geering, 2006).

Sabendo, então, da importância da bomba de sódio para as funções vitais da

célula, alterações na atividade da Na+K+ ATPase através de modificações na sua

expressão ou função, têm sido correlacionados com várias desordens, incluindo

doenças cardiovasculares, neurológicas, renal e metabólica (Rose & Valdes, 1994;

Laski & Kurtzman, 1996). Além disso, como a atividade da bomba de sódio está

32

relacionada com a homeostasia do sódio e controle do tônus vascular, alterações na

sua expressão e/ou atividade estão envolvidas então, com a gênese e/ou

manutenção da hipertensão arterial.

Vários estudos têm demonstrado a relação entre Na+K+ ATPase e

hipertensão. Magliola et al. (1986), mostraram um aumento do transporte ativo de

Na+ e K+ no músculo liso vascular, durante a hipertensão produzida por

mineralocorticóides e sal. Isto parece ser resultado do aumento no “turnover” dos

sítios iônicos da bomba de sódio, ou possivelmente, da incorporação de mais

bombas de sódio na membrana. Em SHR, foi demonstrado um aumento da atividade

da Na+K+ ATPase quando comparado aos animais controles (Wistar Kyoto) (David-

Dufilho et al., 1984). Por outro lado, há uma hipótese de que a atividade da bomba

de sódio está diminuída na hipertensão, seja por um defeito inerente da enzima, ou

por um inibidor endógeno da bomba (Hamlyn et al., 1982). Este inibidor provoca um

aumento dos níveis de sódio intracelular e consequentemente, um aumento do tônus

vascular, aumentando assim a pressão arterial. Assim, diversos trabalhos têm

demonstrado que o plasma de animais hipertensos possui um fator circulante capaz

de inibir a bomba de sódio estando, portanto relacionado com a gênese e/ou

manutenção da hipertensão arterial (Blaustein, 1977; Hamlyn et al., 1982; Magargal

& Overbeck, 1986).

33

1.2. Fator endógeno inibidor da Na+K+ ATPase

Os glicosídeos cardíacos foram descobertos por William Withering, em 1785,

quando investigava as ações das folhas de uma planta chamada foxglove, que

posteriormente, foi denominada Digitalis purpurea. Desde então, por mais de 200

anos, os esteróides cardiotônicos produzidos pelas plantas digitálicas têm sido

utilizados no tratamento da insuficiência cardíaca. Eles são divididos em dois

grupos: cardenolídeos e bufadienolídeos. A ouabaína, um cardenolídeo, foi

descoberta por um antropologista francês, quando analisava o veneno de flexas da

tribo Maasai, na África, a mais de cem anos atrás. Esta substância é originada da

semente de plantas africanas como a Strophantus gratus ou da árvore Ouabaio

(Acocanthera ouabaio) (Withering, 1785). A planta Strophantus e a árvore Ouabaio

são membros da família Apocynaceae, que inclui um variado número de espécies

que produzem substâncias cardioativas. Esteróides cardiotônicos hidrofóbicos como

a digoxina e digitoxina são rotineiramente utilizados na clínica já que podem ser

administrados oralmente, diferentes da ouabaína, que requer administração

parenteral (Blaustein, 1993).

Em 1953, Schatzmann descobriu que os esteróides cardiotônicos são

inibidores específicos da bomba de sódio e que o receptor para esses compostos é

a própria Na+K+ ATPase presente na membrana plasmática. Assim, os glicosídeos

cardíacos exercem sua ação farmacológica através da inibição da bomba de sódio.

Por causa da ação altamente seletiva dos digitálicos de se ligar na subunidade α da

bomba de sódio, têm surgido especulações sobre a possível existência de um

ligante endógeno, uma vez que a seqüência de aminoácidos e a conformação do

sítio de ligação dos digitálicos, presente na bomba de sódio, têm sido altamente

conservadas em todas as espécies (Hauptman & Kelly, 1999; Schoner, 2002).

A procura pelo ligante endógeno começou na década de 60 quando

de Wardener et al. (1961) demonstraram um hormônio circulante natriurético que

participava na regulação da excreção de sódio pelos rins, após administração

intravenosa de salina. Em 1969, pesquisas sugeriram que esse fator endógeno seria

um inibidor da Na+K+ ATPase (Kramer et al.,1969). Buckalew et al. (1970)

demonstraram também que cães com sobrecarga de salina apresentavam uma

substância plasmática que inibia o transporte de sódio através das membranas

34

epiteliais, sugerindo, mais uma vez, que o ligante endógeno era um inibidor da

bomba de sódio. Seis anos depois, Haddy & Overbeck (1976) demonstraram que

esse hormônio natriurético inibidor da Na+K+ ATPase participava na gênese de

hipertensões dependentes de volume, já que nessas situações, a atividade da

bomba de sódio se encontrava reduzida. Como a ação desse hormônio era similar

às ações da ouabaína nos vasos sanguíneos, o termo ouabain-like começou a ser

empregado na literatura (Haddy et al., 1978). E, em 1980, após Gruber et al.

demonstrar que esse fator endógeno possuía reação cruzada com anticorpos anti-

digoxina, ele passou a ser chamado, também, de fator digitalis-like.

A correlação entre o fator endógeno inibidor da Na+K+ ATPase e a pressão

sanguínea foi demonstrada apenas na década de 80. Pesquisadores mostraram que

o plasma de alguns pacientes com hipertensão essencial continha um inibidor da

Na+K+ ATPase que se correlacionava com a ingestão de sódio e com os níveis

pressóricos desses pacientes (Poston et al., 1981; Hamlyn et al., 1982; Hasegawa et

al., 1987). Por muitos anos, vários laboratórios tentaram realizar a caracterização

química desse hormônio. Em 1991, Hamlyn et al. purificaram o ligante endógeno do

plasma humano e constataram que este fator digitalis-like é estruturalmente,

biologicamente e imunologicamente semelhante à ouabaína. Várias evidências

surgiram então comprovando essa semelhança do fator digitalis-like com a

ouabaína: suas características físico-químicas como a massa do íon protonado e

sua composição elementar (C29H45O12), a alta afinidade pelo sítio de ligação dos

glicosídeos cardíacos na bomba de sódio, suas propriedades de inibição da Na+K+

ATPase, suas ações cardiotônicas e vasopressoras, a alta reatividade cruzada com

anticorpos policlonais para ouabaína, além das suas propriedades de eluição em

diversos sistemas de cromatografia (Hamlyn et al., 1991; Mathews et al., 1991;

Ludens et al., 1991; Bova et al., 1991). Todas essas características são semelhantes

ao composto digitálico ouabaína derivado da Strophantus gratus e Acocanthera

ouabaio.

Fortes evidências sugerem que as maiores fontes de produção de ouabaína

nos mamíferos são a glândula adrenal (Ludens et al., 1992; Laredo et al., 1994) e o

hipotálamo (de Wardener & Clarson, 1985). Estudos têm demonstrado que a síntese

desse digitálico ocorre na região do córtex da adrenal, mais especificamente na

zona glomerulosa, já que a remoção seletiva da medula adrenal não influencia nas

suas concentrações plasmáticas (Ludens et al., 1992; Laredo et al., 1995). Além

35

disso, Pamnani et al. (1981) mostraram que lesões na região anteroventral do

terceiro ventrículo (AV3V) abolia as respostas do fator endógeno após expansão

aguda de volume em ratos, sugerindo então que a região anteroventral do terceiro

ventrículo é mais um local de síntese da ouabaína. Estudos mais recentes têm

evidenciado outras fontes de produção da ouabaína. D’Urso et al. (2004)

observaram que o coração de ratos é capaz de produzir ouabaína e que sua

concentração aumenta durante a isquemia. Além disso, detectaram que a

concentração de ouabaína presente nesse tecido é aproximadamente duas vezes

maior que aquela presente no plasma.

A via de biossíntese desse composto em mamíferos foi demonstrada através

da administração de certos precursores e conseqüente aumento da síntese de

esteróides cardiotônicos. Assim, a progesterona e a pregnenolona têm sido

relatadas como precursoras da ouabaína (Perrin et al., 1997; Hamlyn et al., 1998).

Sua produção pode ser estimulada pelo aumento da concentração plasmática de

sódio e pela expansão de volume extracelular (de Wardener et al., 1961; Blaustein,

1993; Yamada et al., 1997). Além disso, tem sido demonstrado que cultura de

células adrenais bovinas libera ouabaína após exposição à adrenocorticotropina e

angiotensina II, sendo que a angiotensina II atua via receptor AT2 (Laredo et al.,

1997). Agonistas α1adrenérgicos também estimulam a liberação de ouabaína,

indicando que o sistema nervoso simpático está envolvido na regulação da liberação

desse hormônio na corrente sanguínea (Laredo et al., 2000). Em contrapartida,

Göõz et al. (2003) observaram que a secreção de ouabaína pela glândula adrenal de

ratos é modulada por mecanismos nicotínicos. Seus resultados mostraram que a

acetilcolina e nicotina exógena são potentes ativadores da secreção de ouabaína,

evidenciando a presença de receptores nicotínicos funcionais de acetilcolina nas

células do córtex da adrenal de ratos e uma conseqüente regulação colinérgica na

secreção desse hormônio. O exercício físico também estimula a liberação de

ouabaína. Concentrações plasmáticas de ouabaína aumentam rapidamente durante

o exercício físico em cachorros e humanos, diminuindo posteriormente com o

repouso, sob controle da norepinefrina e angiotensina II (Bauer et al., 2005).

Concentrações elevadas de ouabaína têm sido encontradas em algumas

condições como insuficiência renal crônica (Hamlyn et al., 1996),

hiperaldosteronismo (Rossi et al., 1995), insuficiência cardíaca congestiva (Gottlieb

et al., 1992), infarto agudo do miocárdio (Bagrov et al., 1994), hipertensão essencial

36

(Hamlyn et al., 1982), entre outras. Diante disso, sabendo que a hipertensão arterial

é um importante fator de risco para doenças cardiovasculares e, portanto, relevante

alvo de estudo, vários pesquisadores procuram mostrar a relação entre ouabaína e a

fisiopatogenia da hipertensão arterial.

37

1.3. Ouabaína e a fisiopatogenia da hipertensão arterial

Aproximadamente 50% dos caucasianos com hipertensão essencial

apresentam níveis circulantes de ouabaína elevados, redução da freqüência

cardíaca e aumento de massa ventricular e volume sistólico (Manunta et al., 2000),

sendo que os níveis de ouabaína correlacionam diretamente com pressão arterial

média, espessura da parede do ventrículo esquerdo e resistência periférica total

(Manunta et al., 1999; Pierdomenico et al., 2001). Além disso, estudos demonstram

que administração prolongada de ouabaína induz hipertensão em ratos (Yuan et al.,

1993; Manunta et al., 1994; Rossoni et al., 2002a).

Esse efeito pressor da ouabaína tem sido explicado pela sua propriedade de

inibir a bomba de sódio nas células musculares lisas. Como a bomba de sódio é

responsável pelo efluxo de 3 íons sódio e influxo de 2 íons potássio, quando o

glicosídeo se liga e inibe essa enzima, ocorre um aumento de sódio intracelular, e

com isso, despolarização celular. Consequentemente ocorre abertura dos canais de

cálcio dependentes de voltagem e aumento de cálcio intracelular (Vassalle, 1987;

Marin et al., 1988). O aumento de sódio intracelular também promove redução ou

inibição da atividade do trocador Na+/Ca2+, aumentando as concentrações de cálcio

intracelular. Com isso, o retículo sarcoplasmático é capaz de estocar uma

quantidade maior de cálcio (Blaustein, 1993; Wasserstrom & Aistrup, 2005). Assim,

através da amplificação nas concentrações intracelulares de cálcio, a ouabaína pode

aumentar a contração do músculo liso vascular. Todavia, os efeitos da ouabaína no

transiente de cálcio não são limitados ao músculo liso vascular, podem ser visto

também nos neurônios (Blaustein et al., 1991), plaquetas (Roevens et al., 1990) e

músculo cardíaco (Lee, 1985). Além disso, como a recaptação de noradrenalina nas

terminações perivasculares simpáticas envolve um sistema de co-transporte

dependente da concentração intracelular de sódio, a inibição da Na+K+ ATPase pela

ouabaína provoca um aumento da liberação de noradrenalina e uma redução na sua

captação, induzindo assim, contração do músculo liso vascular (Vanhoutte & Lorenz,

1984; Marin et al., 1988).

A ação vascular da ouabaína tem sido demonstrada em alguns trabalhos.

Ross Jr et al. (1960) mostraram que a administração de doses terapêuticas de

ouabaína provocou aumento da pressão arterial em cães anestesiados em

38

decorrência do aumento da resistência vascular periférica. Em humanos, doses

terapêuticas de ouabaína têm uma ação vasoconstritora direta no músculo liso

vascular do antebraço de pacientes normotensos (Mason & Braunwald, 1964). A

ação vascular direta da ouabaína também foi demonstrada por Marin et al. (1988),

quando a ouabaína foi capaz de induzir contração em artérias cerebrais de gatos.

Em artérias femorais, esses autores demonstraram que a ouabaína estimulava a

liberação de noradrenalina dos terminais adrenérgicos e, com isso, induzia

contração. Isso confirma a hipótese acima citada onde a ouabaína é capaz de

induzir contração do músculo liso vascular em decorrência do aumento de cálcio

intracelular e da liberação de noradrenalina nas terminações simpáticas. D’Amico et

al. (2003) também demonstraram que microinjeções de ouabaína são capazes de

aumentar a resistência vascular e com isso, aumentar a pressão arterial sem alterar,

entretanto, o débito cardíaco. O aumento de pressão arterial média observado neste

experimento estava associado ao aumento da resistência periférica total e redução

do fluxo para órgãos como rins, estômago, intestino e músculo esquelético. A

ouabaína é também capaz de aumentar a contração de músculos traqueais através

do aumento de cálcio intracelular decorrente da inibição da bomba de sódio e,

também, através da liberação de acetilcolina nas terminações nervosas, como

conseqüência do aumento cálcio (Espinosa-Tanguma et al., 2004).

Além da ação vascular direta da ouabaína, trabalhos mostram que esse

digitálico pode promover hipertensão por ação no sistema nervoso central. Huang et

al. (1994) mostraram que em ratos normotensos, com dieta alta ou regular de sódio,

a administração periférica e central de ouabaína, agudamente, era capaz de

aumentar a pressão arterial. Essa hipertensão era prevenida por administração

intracerebroventricular de anticorpos antiouabaína, sugerindo que a ouabaína teria

um efeito central de aumentar o tônus simpático e induzir hipertensão. Em ratos

hipertensos, como Dahl-Sal sensíveis e SHR, a alta ingestão de sódio pode causar

uma exacerbação da hipertensão por liberação de ouabaína no sistema nervoso

central e conseqüente aumento da atividade simpatoexcitatória (Leenen et al., 1993;

Leenen et al., 1994; Huang & Leenen, 1994; 1996a). Além disso, esse digitálico é

capaz de promover prejuízo do barorreflexo (Huang & Leenen, 1999). Esse

mecanismo pressor da ouabaína é mediado pelo sistema renina-angiotensina

cerebral, já que suas ações pressoras são inibidas pela administração de

antagonista de receptor AT1 para angiotensina II (Huang & Leenen 1996b;1999;

39

Zhang & Leenen, 2001). Além disso, ratos transgênicos deficientes de

angiotensinogênio central tiveram as respostas pressoras provocadas pela ouabaína

atenuadas, confirmando o importante papel do sistema renina-angiotensina central

nos efeitos simpatoexcitatórios desse digitálico (Huang et al., 2001).

A existência de um componente central no efeito hipertensor da ouabaína foi

mostrada também por Songu-Mize et al. (1982), que após lesão da região AV3V em

ratos Doca-sal, observaram uma redução da pressão arterial e melhora na atividade

da bomba de sódio. Assim, esses pesquisadores sugeriram a existência de uma

substância circulante que seria secretada na região AV3V, responsável pelo

desenvolvimento da hipertensão nesses animais. Estudos de Veerasingham &

Leenen (1999), demonstraram também que a região AV3V é essencial para a

hipertensão induzida por administração de salina e ouabaína, possivelmente por

aumento do tônus simpático. No entanto, a exata localização do sítio de ação da

ouabaína ainda não foi bem estabelecida. Estudos demonstram que uma das áreas

na qual a ouabaína é liberada e exerce suas ações é o núcleo pré-óptico mediano

(MnPO), e que a ouabaína e angiotensina II nesse núcleo tem um papel importante

nas respostas cardiovasculares decorrentes da alta ingestão de sal em SHR

(Budzikowski & Leenen, 1997; 2001).

Vários pesquisadores já demonstraram que a administração crônica de baixas

doses de ouabaína desenvolve hipertensão em ratos (Yuan et al., 1993; Manunta et

al., 1994). Yaun et al. (1993), mostraram que a administração crônica de ouabaína

produz elevação sustentada da pressão arterial por aumento da resistência vascular

tanto em animais normotensos como em hipertensos. Manunta et al. (1994) também

demonstraram que a administração crônica de ouabaína induzia hipertensão,

cursando com aumento dos níveis de ouabaína no plasma, rins, hipotálamo e

glândula pituitária anterior. Essa hipertensão parece ser dependente, pelo menos em

parte, de mecanismos centrais associados com aumento do tônus simpático,

subseqüente à ativação do sistema renina-angiotensina cerebral, como já

mencionado acima (Huang & Leenen, 1999; Zhang & Leenen, 2001; Cheung et al.,

2006). Além disso, uma outra via hipertensinogênica da ouabaína foi caracterizada

recentemente. Di Filippo et al. (2003) demonstraram que o tratamento crônico com

ouabaína aumenta o conteúdo cerebral de endotelina-1 e que esta contribui para as

ações periféricas da ouabaína, como o aumento da resistência vascular renal e

40

redução do fluxo sanguíneo renal. A administração de antagonistas de receptores

ETA para endotelina-1 bloqueia os efeitos hemodinâmicos desse digitálico, sugerindo

então, mais uma via hipertensora da ouabaína. Resultados de D’Amico et al. (2003),

também demonstraram que a administração aguda de ouabaína na área cinzenta

periaquedutal provoca aumento da resistência periférica total e pressão arterial,

provavelmente por ativação de endotelina-1 cerebral.

Desse modo, as ações vasculares da ouabaína modificando a resistência

vascular periférica associada aos seus efeitos sobre o sistema nervoso central, ou

seja, de aumento do tônus simpático, poderiam estar relacionados com a gênese

e/ou manutenção da hipertensão arterial.

Entretanto, a maior parte dos trabalhos de reatividade vascular desenvolvidos

utilizaram concentrações elevadas de ouabaína (da ordem de mM), maiores que

aquelas encontradas no plasma de pacientes ou animais hipertensos (cerca de

10nM, Hamlyn & Manunta, 1992). Sabendo que a concentração fisiológica de

ouabaína, encontrada no plasma de pacientes normotensos, é da ordem de 0,2 a

0,7nM (Blaustein, 1993), surgiu uma questão: Qual seria o mecanismo pelo qual a

inibição da bomba de sódio mediada pela ouabaína poderia modular a atividade

celular sob condições fisiológicas?

Esse mecanismo foi descrito pelo grupo do professor Blaustein com a

identificação de uma microrregião da célula denominada plasmerosome. Trabalhos

mostram que a isoforma α1 da bomba de sódio está distribuída uniformemente na

membrana plasmática, enquanto as isoformas α2 e α3 estão confinadas a

microdomínios da membrana plasmática justapostos ao retículo sarcoplasmático

(Juhaszova & Blaustein, 1997a; 1997b). Esse microdomínio foi, então, denominado

de plasmerosome, região onde estão localizados o trocador Na+/Ca2+ e as isoformas

α2 e α3 da Na+K+ ATPase, que possuem maior afinidade pela ouabaína. Essa

microrregião da membrana plasmática parece ser importante na regulação do

homeostase do cálcio e mediar as ações dos esteróides cardiotônicos, como a

ouabaína. Assim, a inibição das isoformas α2 e α3 da Na+K+ ATPase por esse

digitálico, aumenta a concentração de sódio intracelular, resultando na redução da

atividade do trocador Na+/Ca2+ e conseqüente aumento local de íons cálcio. Esse

cálcio é captado pela Ca2+ ATPase do retículo sarcoplasmático e estocado no

interior dessa organela (Blaustein et al., 1998). Desse modo, após estímulo de um

agonista vasoconstritor, a resposta contrátil resultante seria amplificada em

41

decorrência de uma maior liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático. Assim

sendo, esse mecanismo explica como baixas concentrações de ouabaína poderiam

modificar a resistência vascular e dessa forma, contribuir para o processo

hipertensivo.

Então, além da ação direta da ouabaína sobre o músculo liso vascular e sua

ação sobre o sistema nervoso central, a ouabaína é capaz de sensibilizar o leito

vascular aumentando a responsividade a agentes vasopressores (Songu-Mize et al.,

1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999; 2001). Isso representa um

mecanismo adicional através do qual esse digitálico endógeno, em baixas

concentrações, pode contribuir para a gênese e/ou manutenção da hipertensão.

No entanto, as ações agudas e crônicas da ouabaína sobre o sistema

vascular parecem ser distintas. Enquanto a ouabaína promove aumento da

reatividade vascular quando administrada agudamente (Songu-Mize et al., 1995;

Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999; 2001), de forma crônica, a reatividade

vascular se apresenta aumentada, reduzida ou sem alterações, dependendo do leito

vascular estudado (Cargnelli et al., 2000; Kimura et al., 2000; Rossoni et al., 2002a).

Trabalhos de Cargnelli et al. (2000) observaram que o tratamento crônico com

ouabaína era acompanhado por uma redução da resposta contrátil à fenilefrina em

anéis de aorta, enquanto em anéis de artéria renal, foi observado um aumento da

resposta contrátil à fenilefrina após tratamento com ouabaína (Kimura et al., 2000).

Rossoni et al. (2002a), demonstraram em aorta e artéria mesentérica superior de

ratos hipertensos pelo tratamento com ouabaína, uma redução da resposta

vasoconstritora à fenilefrina, enquanto na artéria caudal, nenhuma resposta foi

encontrada. Essas alterações estavam associadas com aumento da modulação

negativa do endotélio, provocada por uma maior liberação de óxido nítrico (Rossoni

et al., 2002b). Além disso, esses pesquisadores observaram alterações sobre a

atividade e expressão da Na+K+ ATPase, variando de acordo com o leito vascular

estudado. A aorta apresentou aumento da atividade e expressão da Na+K+ ATPase,

a artéria caudal apresentou redução enquanto na artéria mesentérica não houve

alteração (Rossoni et al., 2002a). Essas alterações na bomba de sódio podem

explicar, juntamente com a modulação endotelial, as diferenças nas respostas

contráteis à fenilefrina observada nesses vasos de ratos hipertensos por ouabaína.

O aumento da atividade da Na+K+ ATPase promove hiperpolarização, contribuindo

42

assim, para a redução das respostas contráteis à fenilefrina na aorta. Já a redução

da atividade da Na+K+ ATPase, ocorrida na artéria caudal, promove aumento de

sódio intracelular e conseqüente aumento de cálcio, aumentando assim as respostas

contráteis, que se contrapõe à modulação endotelial, resultando na inalteração da

reatividade vascular (Rossoni et al.,2002a).

Mais tarde, esse mesmo grupo de pesquisadores, demonstrou que o

tratamento crônico com ouabaína é acompanhado de uma maior liberação de óxido

nítrico das terminações nitrérgicas vasculares, justificando a redução da resposta

contrátil induzida por estímulos elétricos em artérias mesentéricas (Xavier et al.,

2004a). Esses resultados sugerem que a ouabaína, cronicamente, provoca

alterações da reatividade vascular de maneira distinta dependendo do leito arterial

estudado, e que a modulação endotelial negativa observada em alguns leitos

arteriais, constitui um mecanismo de contraposição ao quadro hipertensivo gerado

por esse digitálico. Entretanto, resultados recentes de Xavier et al. (2004b; c)

demonstraram que as alterações vasculares periféricas observadas após tratamento

crônico com ouabaína não são conseqüentes da elevação da pressão arterial ou

ativação do sistema renina-angiotensina, uma vez que o tratamento com losartan

não preveniu essas alterações. Assim, ainda são necessários mais estudos para

elucidar as alterações vasculares promovidas pela administração crônica de

ouabaína.

As ações agudas da ouabaína também cursam com alterações de reatividade

vascular e modulação endotelial, dependendo do animal e leito vascular estudado.

Ponte et al. (1996a; b), mostraram que o endotélio modula positivamente as ações

da ouabaína em aortas de ratos SHR, provavelmente pela liberação de um fator

vasoconstritor, uma vez que na ausência do endotélio, a resposta contrátil induzida

pela ouabaína foi reduzida. Padilha et al. (2004), também demonstraram que o

endotélio modula positivamente as ações da ouabaína no leito vascular caudal de

animais SHR, através da liberação de angiotensina II. No entanto, em animais com

hipertensão provocada por NG-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), o endotélio é

capaz de liberar um fator capaz de abrir canais para potássio, reduzindo assim, a

resposta contrátil à fenilefrina induzida por concentrações nanomolares de ouabaína

(Rossoni et al., 2003). Já em animais normotensos, o endotélio parece exercer uma

43

modulação negativa nas ações da ouabaína, através da liberação de um fator

vasodilatador (Ponte et al., 1996a; b; Rossoni et al., 1999).

Além disso, trabalhos do nosso laboratório demonstram que concentrações

nanomolares de ouabaína, de forma aguda, próximas àquelas encontradas no

plasma de animais e pacientes hipertensos, são capazes de aumentar a pressão

arterial de animais hipertensos anestesiados e sensibilizar o leito arterial caudal

desses animais à resposta pressora induzida pela fenilefrina (Vassallo et al., 1997;

Rossoni et al., 2001). Barker et al. (2001) mostraram que baixas concentrações de

ouabaína causam aumento da pressão diastólica em ratos normotensos

anestesiados, sendo que essa ação, não é modulada por reflexos autonômicos,

sugerindo que o efeito pressor da ouabaína é mediado indiretamente pela liberação

de norepinefrina dos terminais simpáticos, bem como por ação direta no músculo

liso vascular. Desse modo, esses resultados sugerem que concentrações

nanomolares de ouabaína, administradas agudamente, podem aumentar a

resistência vascular através da sensibilização do músculo liso vascular a agentes

vasopressores, contribuindo assim, para o processo hipertensivo.

No presente estudo foram utilizados ratos SHR uma vez que são mais

sensíveis às ações de baixas concentrações de ouabaína do que os normotensos

(Vassallo et al., 1997). Os ratos espontaneamente hipertensos mimetizam a

hipertensão arterial humana (Okamoto & Aoki, 1963). A similaridade desse modelo

com a hipertensão essencial se dá pela predisposição genética a altos níveis de

pressão arterial, sem etiologia específica, pelo aumento da resistência vascular

periférica sem alterações de volume, e respostas similares aos tratamentos com

fármacos (Frohlich, 1986). Estudos demonstram que os níveis de pressão arterial

nesses animais se elevam após a terceira (Lais et al., 1977) ou quarta semana de

idade (Lee, 1985). Tem sido observado que no estágio pré-hipertensivo, ocorre

aumento da atividade simpática (Judy et al., 1976; Tucker & Johnson, 1984; Brock et

al., 1996), alterações estruturais na parede dos vasos sanguíneos (Lee, 1985;

Rizzoni et al., 1994; van Gorp et al., 2000; Dickhout & Lee, 2000) e disfunção

endotelial (Mombouli & Vanhoutte, 1999; Safar et al., 2001). Todos esses fatores

contribuem para o aumento da pressão arterial observado nesses animais.

44

Trabalhos recentes do nosso laboratório (Padilha et al., 2004) demonstraram

que concentrações fisiológicas de ouabaína aumentam a pressão arterial e

reatividade vascular in vitro de ratos SHR, mas não alteram esses parâmetros em

ratos normotensos, mostrando mais uma vez que ratos hipertensos são mais

sensíveis à ação desse digitálico. No entanto, os mecanismos pelos quais a

ouabaína exerce seus efeitos sobre a pressão arterial e reatividade vascular in vivo

nesses animais, ainda não foram esclarecidos. Portanto, o presente estudo visa

elucidar esses possíveis efeitos e respectivos mecanismos hipertensinogênicos do

tratamento agudo com pequenas concentrações de ouabaína.

45

OBJETIVOS

46

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Estudar o efeito do tratamento agudo com pequenas concentrações de

ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina em ratos

espontaneamente hipertensos (SHR).

2.2. Objetivos Específicos

• Avaliar os efeitos da ouabaína sobre a pressão arterial sistólica e

diastólica basal, e freqüência cardíaca, em animais hipertensos anestesiados.

• Estudar o efeito da ouabaína sobre a resposta pressora à fenilefrina.

• Verificar se os reflexos autonômicos interferem nas ações da ouabaína

sobre a pressão arterial basal e reatividade pressórica à fenilefrina.

• Investigar, se os efeitos da ouabaína na pressão arterial basal e

reatividade pressórica à fenilefrina, estão diretamente ligados à sua ação sobre a

Na+K+ ATPase.

• Averiguar a participação do Sistema Renina Angiotensina sobre os

efeitos na pressão arterial basal e reatividade pressórica à fenilefrina produzidos

pela ouabaína.

47

MATERIAIS E MÉTODOS

48

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais experimentais

Foram utilizados ratos espontaneamente hipertensos (SHR), machos, com

idade aproximada de 12 semanas, pesando entre 250 a 300g. Esses animais foram

cedidos pelo Biotério do Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas da

Universidade Federal do Espírito Santo. Os animais foram mantidos em gaiolas, sob

condições controle de temperatura e ciclo claro-escuro de 12 horas, tendo livre

acesso à água e alimentação. O uso e cuidado destes animais experimentais foram

realizados de acordo com os princípios éticos da pesquisa com animais,

estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

3.2. Metodologia empregada para avaliação dos valores pressóricos

Os animais foram anestesiados com uretana (1,2 g/ Kg, i.p.) e submetidos à

cateterização da artéria carótida direita e veia jugular direita, para medidas

hemodinâmicas e administração de drogas, respectivamente. O plano anestésico foi

acompanhado com testes como pinçar o rabo do animal, e o anestésico foi

suplementado quando necessário. As canulações foram realizadas com um cateter

de polietileno (PE 50, Clay-Adams) preenchido com salina heparinizada (100 UI/ml).

Após a cateterização, o cateter arterial foi conectado a um transdutor de pressão

(Stathan P23 AA) acoplado a um pré-amplificador, que por sua vez, estava

conectado a um sistema Biopac de aquisição de dados (MP100 Biopac Systems,

Inc; CA). Foram feitos registros contínuos da pressão arterial sistólica (PAS),

pressão arterial diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC), durante todos os

protocolos experimentais.

49

3.3. Protocolos experimentais

3.3.1. Avaliação da pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade

pressórica à fenilefrina antes e após administração de ouabaína.

Com a finalidade de avaliar o efeito de concentrações nanomolares de

ouabaína na pressão arterial e na reatividade pressórica à fenilefrina, após um

período de 30 minutos de estabilização dos níveis pressóricos, foram feitos os

registros controle de pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e freqüência

cardíaca basais. Em seguida, doses crescentes de fenilefrina (0,03 a 100 µg/Kg, in

bolus, em um volume de 5 µl/100g) foram administradas para a obtenção de uma

curva concentração-resposta. Após a realização da curva concentração-resposta à

fenilefrina e estabilização da pressão arterial, foi realizado o tratamento agudo de

ouabaína (0,18 µg/Kg, i.v. em um volume de 17µl/100g). Uma hora depois, os

valores de pressão arterial e freqüência cardíaca basais foram novamente

mensurados e uma segunda curva concentração-resposta à fenilefrina foi realizada.

A concentração de ouabaína utilizada neste protocolo segue estudos prévios

do nosso laboratório, onde Vassallo et. al. (1997) sugerem que o tratamento com

0,18 µg/kg de ouabaína leva a concentrações plasmáticas nanomolares deste

digitálico, caso se assuma que este fármaco foi diluído em 40ml de volume

extracelular por 100g de rato. Esta dose se refere a aproximadamente 0,3nmol/Kg,

uma concentração que aumenta a pressão arterial de animais hipertensos mas não

altera a pressão arterial de animais normotensos (Vassallo, 1997; Rossoni et al.,

2001; Rossoni et al., 2003 ).

Para verificar a estabilidade do protocolo experimental, em um outro grupo de

animais (controle temporal), o mesmo protocolo acima foi realizado. Porém, no

momento da administração de ouabaína, foi administrada uma solução veículo

(salina 0,9%, iv), sendo que, o volume de salina administrado era equivalente ao

volume de ouabaína utilizado nos animais do grupo tratado agudamente com

ouabaína.

50

3.3.2. Efeito do tônus simpático nas ações da ouabaína sobre a pressão

arterial e reatividade pressórica à fenilefrina.

Estudos mostram que em animais hipertensos, a ouabaína tem uma ação

central ativando via simpatoexcitatória e reduzindo o tônus da via simpatoinibitória,

exacerbando a hipertensão destes animais (Huang & Leenen, 1996a). Sabendo

disso, esse protocolo teve a finalidade de avaliar uma possível participação do

Sistema Nervoso Autônomo, nas ações de concentrações nanomolares de ouabaína

sobre a pressão arterial basal e reatividade pressórica à fenilefrina.

Para isso, foi utilizado hexametônio, um antagonista de receptores nicotínicos

ganglionares autonômicos. Foram realizados então, dois grupos: um grupo controle,

apenas com hexametônio (Hexa), e um com pré-tratamento de hexametônio,

seguido da administração de ouabaína (Hexa + Oua).

No grupo controle, foram realizados registros basais da pressão arterial e da

freqüência cardíaca após a estabilização desses parâmetros e, em seguida, uma

curva concentração-resposta a fenilefrina foi feita. Após a estabilização da pressão

arterial, foi administrado hexametônio e após 30 minutos, uma nova curva

concentração-resposta foi realizada e os valores basais de pressão arterial e

freqüência cardíaca foram novamente mensurados.

No grupo Hexa + Oua, após a estabilização da pressão arterial, foram

realizados registros basais da pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e

freqüência cardíaca e, em seguida, foi administrado lentamente hexametônio (5

mg/kg i.v. em um volume de 4µl/100g). Após 30 minutos da administração deste

bloqueador, foram realizadas, novamente, as mensurações hemodinâmicas basais

e, em seguida, ouabaína (0,18 µg/kg) foi administrada. Após 1 hora, os valores

basais de pressão arterial e freqüência cardíaca foram novamente registrados e foi

realizada uma curva concentração-resposta à fenilefrina.

A dose de hexametônio utilizada nesse protocolo foi baseada em estudos

prévios do nosso laboratório (Rossoni et al, 2003; Padilha et al, 2004).

51

3.3.3. Influência da Na+K+ ATPase sobre os efeitos produzidos pela

ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina.

Esse protocolo teve a finalidade de avaliar se o efeito da ouabaína sobre a

pressão arterial e reatividade pressórica a fenilefrina estão diretamente ligados à sua

propriedade de inibir a Na+K+ ATPase. Para isso, foi utilizado canrenona, um

metabólito da espironolactona que tem a propriedade de se ligar ao sítio receptor

dos digitálicos na bomba de sódio, antagonizando a ligação da ouabaína neste sítio.

Para a realização deste protocolo, foram feitos dois grupos, um grupo

controle, apenas com canrenona (Can), e um com pré-tratamento com canrenona

seguido da administração de ouabaína (Can + Oua).

No grupo controle, foram realizados registros basais após a estabilização da

pressão arterial e da freqüência cardíaca e, em seguida, uma curva concentração-

resposta à fenilefrina foi feita. Após a estabilização da pressão arterial, foi

administrado canrenona e após 30 minutos, uma nova curva concentração-resposta

foi realizada e os valores basais de pressão arterial e freqüência cardíaca foram

novamente aferidos.

No grupo Can + Oua, após a estabilização da pressão arterial, foram

realizados registros basais da pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e

freqüência cardíaca e, em seguida, foi administrado canrenona (1 mg/kg i.v. em um

volume de 4µl/100g). Após 30 minutos da administração de canrenona, foram

realizadas, novamente, as mensurações hemodinâmicas e, em seguida, ouabaína

foi administrada. Após 1 hora, os valores basais de pressão arterial e freqüência

cardíaca foram novamente registrados e foi realizada uma curva concentração-

resposta à fenilefrina.

A dose de canrenona utilizada nesse protocolo foi baseada em prévios

estudos do nosso laboratório (Vassallo et al, 1998). Esta concentração de

canrenona, de 1 mg/kg, é considerada uma baixa concentração, que não altera a

contratilidade miocárdica, o tônus vascular e a pressão arterial.

52

3.3.4. Envolvimento do Sistema Renina Angiotensina sobre o efeito da

ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina.

Buscando averiguar uma possível participação do Sistema Renina

Angiotensina nas ações da ouabaína sobre a pressão arterial e reatividade

pressórica à fenilefrina, foi realizado o pré-tratamento com losartan, um inibidor de

receptores do tipo AT1 para angiotensina II.

Dois grupos foram feitos para a realização deste protocolo. Um grupo

controle, apenas com losartan (Los) e um com pré-tratamento com Losartan,

seguido da administração de ouabaína (Los + Oua).

No grupo controle, foram realizados registros basais da pressão arterial e

freqüência cardíaca após a estabilização desses parâmetros e, em seguida, uma

curva concentração-resposta à fenilefrina foi feita. Após a estabilização da pressão

arterial, foi administrado losartan e após 30 minutos, uma nova curva concentração-

resposta foi realizada e os valores basais de pressão arterial e freqüência cardíaca

foram novamente mensurados.

No grupo Los + Oua, após a estabilização dos níveis pressóricos e

mensurações basais da pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e

freqüência cardíaca, foi administrado losartan (10 mg/kg i.v. em um volume de

4µl/100g). Após 30 minutos da administração deste inibidor de receptores para

angiotensina II, foram realizadas, novamente, as mensurações hemodinâmicas e,

em seguida, ouabaína foi administrada. Seguida 1 hora, os valores basais de

pressão arterial e freqüência cardíaca foram novamente registrados e foi realizada

uma curva concentração-resposta à fenilefrina.

A dose de losartan utilizada nesse protocolo foi baseada em prévios estudos

do nosso laboratório (Padilha et al, 2004).

53

3.4. Expressão dos dados e análise estatística

Os resultados foram expressos como média +/- erro padrão da média (EPM).

Os valores de n significam o número de animais utilizados em cada grupo

experimental.

As respostas vasopressoras induzidas pela fenilefrina sobre a pressão

arterial, foram expressas no momento do pico de pressão após administração de

cada dose desse fármaco.

Para a determinação dos valores de resposta máxima (Rmáx) e pD2 (-log

EC50, que corresponde ao valor da concentração de fenilefrina que produz 50% da

resposta máxima), foi realizada uma análise de regressão não-linear, obtida através

da análise das curvas concentração-resposta.

Com a finalidade de comparar a magnitude de efeito dos fármacos sobre a

resposta pressora à fenilefrina, alguns resultados foram expressos como diferença

da área abaixo da curva (dAAC) de concentração-resposta à fenilefrina. A AAC foi

calculada para cada curva concentração-resposta e a diferença está expressa como

porcentagem da diferença da AAC (%dAAC) da curva controle correspondente.

A análise estatística dos resultados foi realizada por teste t, pareado e/ou não-

pareado, e análise de variância (ANOVA) uma via para medidas repetidas ou

completamente randomizadas, seguida pelo teste post-hoc de Tukey. Os resultados

foram considerados estatisticamente significantes para valores de p< 0,05.

O programa estatístico GraphPad Prism Software (San Diego, CA, USA) foi

utilizado para análise e apresentação gráfica dos dados obtidos.

54

3.5. Fármacos utilizados

- Canrenona (Sigma)

- Cloreto de sódio (Merck)

- Heparina Sódica (Roche)

- Hexametônio, cloreto (Sigma)

- L-Fenilefrina (Sigma)

- Losartan (Sigma)

- Ouabaína, octahidrato (Sigma)

- Uretana (Sigma)

Todos os fármacos foram dissolvidos em solução salina (0,9%) e mantidos a

-20°C.

55

RESULTADOS

56

4. RESULTADOS

4.1. Avaliação da Pressão Arterial Basal, Freqüência Cardíaca e Reatividade

Pressórica à fenilefrina antes e após tratamento agudo com ouabaína.

4.1.1. Efeitos da ouabaína na Pressão Arterial e Freqüência Cardíaca Basal.

A anestesia com uretana foi responsável pela redução da pressão arterial nos

animais espontaneamente hipertensos. Entretanto os valores de pressão arterial

sistólica e pressão arterial diastólica foram mantidos elevados nestes animais

quando comparados a animais normotensos, confirmando estudos prévios do nosso

laboratório (Vassallo, 1997; Rossoni et al., 2001; Rossoni et al., 2003).

Uma hora após a administração endovenosa de 0,18 µg/Kg de ouabaína

ocorreu uma elevação significativa da pressão arterial sistólica e diastólica. Porém, a

ouabaína não produziu nenhuma alteração na freqüência cardíaca (Tabela 1; Figura

1).

Com a finalidade de verificar a estabilidade do protocolo experimental, foi

realizado o controle temporal, onde no momento da administração de ouabaína era

administrada uma solução veículo (salina 0,9%, iv). A solução veículo não modificou

a pressão arterial após uma hora da sua administração, comprovando então a

estabilidade desse protocolo (PAS: Ct: 142 ± 7,3; Salina: 144 ± 5,3; PAD: Ct: 96,2 ±

6,1; Salina: 105 ± 4,0; FC: Ct: 369 ± 9,0; Salina: 396 ± 17,2; Teste t pareado; p>0,05;

n=5).

Tabela 1: Parâmetro da Pressão Arterial Sistólica Basal (PAS), Pressão Arterial Diastólica Basal (PAD) e Freqüência Cardíaca Basal (FC) antes (Ct) e após (Oua) tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína; (n= 7).

Grupo PAS basal

(mmHg)

PAD basal

(mmHg)

FC basal

(bpm)

Ct 137 ± 5,1 93,7 ± 7,7 394 ± 10,2

Oua 150 ± 4,7 * 116 ± 3,5 * 381 ± 16,9

Os resultados estão expressos em média ± EPM. Teste t pareado; *p<0,05 vs Ct.

57

A)

B)

Figura 1: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=7) e após (Oua, n=7) 1 hora de tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína. Teste t pareado; *p<0,05 vs Ct.

0

100

200

*

Ct

Oua

PAS (mmHg)

0

50

100

150

*

Ct

Oua

PAD (mmHg)

58

4.1.2. Efeitos da Ouabaína sobre a reatividade pressórica à fenilefrina na

Pressão Arterial Sistólica e Pressão Arterial Diastólica.

A administração de fenilefrina aumentou, de maneira concentração-

dependente, a pressão arterial sistólica e diastólica dos animais espontaneamente

hipertensos. Contudo, o tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína não foi capaz de

modificar a resposta máxima nem a sensibilidade ao agonista alfa 1-adrenérgico na

pressão arterial sistólica e diastólica (Tabela 2; Figura 2).

A estabilidade desse protocolo experimental também foi verificada com a

realização de uma curva concentração-resposta à fenilefrina antes e uma hora após

da administração da solução veículo (salina 0,9%). Observou-se que a solução

veículo não foi capaz de modificar os parâmetros de sensibilidade na resposta

pressora à fenilefrina (pD2, PAS: Ct: -2,56 ± 0,08 vs Salina: -2,81 ± 0,02; p>0,05;

Teste t; PAD: Ct: -2,91 ± 0,09 vs Salina: -3,05 ± 0,13; p>0,05; Teste t), nem a

resposta máxima a esse agente vasoconstritor (Rmax, PAS: Ct: 309 ± 21,86 vs

Salina: 299 ± 24,87; p>0,05; Teste t; PAD: Ct: 210 ± 10,56 vs Salina: 199 ± 14,62

p>0,05; Teste t; n=5).

Tabela 2: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina da PAS e PAD, antes (Ct) e após (Oua) tratamento com 0,18 µg/Kg ouabaína,( n=7).

Os resultados estão expressos em média ± EPM. Teste t pareado para comparações de Rmax e pD2; p>0,05.

Grupo Rmax pD2

PAS

Ct

Oua

278 ± 17,3

273 ± 18,9

-2,20 ± 0,7

-2,95 ± 0,05

PAD

Ct

Oua

185 ± 4,4

179 ± 5,8

-2,78 ± 0,42

-3,09 ± 0,13

59

A)

B)

Figura 2: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=7) e após (Oua, n=7) 1 hora de tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína. Teste t pareado para comparações de Rmax e pD2; p>0,05.

-6 -5 -4 -3 -2 -1

100

200

300

Ct

Oua

FE log [M]

PAS (mmHg)

-6 -5 -4 -3 -2 -1

50

100

150

200Ct

Oua

FE log [M]

PAD (mmHg)

60

4.2. Efeito do tônus simpático nas ações da ouabaína sobre a pressão arterial,

freqüência cardíaca e reatividade pressórica à fenilefrina.

Considerando que mecanismos reflexos autonômicos poderiam estar

mascarando os efeitos da ouabaína sobre a pressão arterial, freqüência cardíaca e

reatividade pressórica, foi realizado o co-tratamento com hexametônio.

4.2.1. Resultado do bloqueio ganglionar com hexametônio na pressão arterial

basal e freqüência cardíaca basal antes e após tratamento com ouabaína.

A infusão de hexametônio diminuiu a pressão arterial sistólica e diastólica,

porém não provocou alteração na freqüência cardíaca. O tratamento com

concentrações nanomolares de ouabaína, mesmo na presença de hexametônio foi

capaz de aumentar a pressão arterial sistólica e diastólica, mas não provocou

alteração na freqüência cardíaca (Tabela 3; Figura 3).

Tabela 3: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS), Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes (Ct), depois da administração de hexametônio (Hexa) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6).

Grupo PAS basal

(mmHg)

PAD basal

(mmHg)

FC basal

(bpm)

Ct 149 ± 5,2 103 ± 5,9 359 ± 11

Hexa

Hexa+Oua

118± 4,9 *

145 ± 4,4 + 79 ± 7,4 *

103 ± 7,8+ 336 ± 12

348 ± 9,8

Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via; *p< 0,05 Hexa vs Ct, + p<0,05 Hexa+Oua vs Hexa.

61

A) B) Figura 3: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da administração de hexametônio (Hexa) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6). ANOVA 1 via; *p< 0,05 Hexa vs Ct, + p<0,05 Hexa+Oua vs Hexa.

0

50

100

150

+

*

Ct

Hexa

Hexa + Oua

PAD (mmHg)

0

100

200

+

*

Ct

Hexa

Hexa + OuaPAS (mmHg)

62

4.2.2. Efeito do bloqueio autonômico com hexametônio sobre a reatividade

pressórica à fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.

A administração de hexametônio não alterou a reatividade pressórica à

fenilefrina. O tratamento com ouabaína, na presença de hexametônio não modificou

a resposta máxima e sensibilidade ao agente vasoconstritor na pressão sistólica

(Tabela 4; Figura 4 A). Em relação à pressão diastólica, após a eliminação da

influência do Sistema Nervoso Autônomo com a administração de hexametônio, a

ouabaína aumentou a sensibilidade à fenilefrina, sem alterar, entretanto, a resposta

máxima (Tabela 4; Figura 4 B).

Este resultado também pode ser evidenciado através da análise da diferença

da área abaixo da curva (dAAC) da pressão arterial diastólica, onde o efeito

concentração-dependente da fenilefrina foi de maior magnitude após o co-

tratamento de hexametônio mais ouabaína (PAD: 17,2 ± 5,53 %) quando comparada

àquele obtido após administração apenas de hexametônio (PAD: 0,7 ± 4,59 %;

p<0,05) (Figura 5).

Tabela 4: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de hexametônio (Hexa) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6).

Grupo Rmax pD2

PAS

Ct

Hexa

Hexa+Oua

276 ± 18,0

285 ± 12,7

294 ± 10,8

-2,80 ± 0,09

-2,89 ± 0,07

-2,97 ± 0,14

PAD

Ct

Hexa

Hexa+Oua

179 ± 12,8

185 ± 8,7

192 ± 6,0

-2,95 ± 0,11

-3,06 ± 0,13

-3,34 ± 0,12*

Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; *p< 0,05 vs Ct.

63

A)

B)

Figura 4: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da administração de hexametônio (Hexa, n=6) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa+Oua, n= 6). ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; *p<0,05 Hexa+Oua vs Ct.

-6 -5 -4 -3 -2 -1

100

200

300

Ct

Hexa

Hexa+Oua

FE log [M]

PAS (mmHg)

-6 -5 -4 -3 -2 -1

50

100

150

200

Ct

Hexa

Hexa+Oua

FE log [M]

PAD (mmHg)

*

64

Figura 5: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a Pressão Arterial Diastólica após administração de hexametônio e após tratamento com hexametônio+ouabaína. Teste t não-pareado; *p<0,05 vs Ct/Hexa.

0

25

50

Ct vs Hexa Ct vs Hexa+Oua

*% dAAC

65

4.3. Influência da Na+K+ ATPase sobre os efeitos produzidos pela

ouabaína na pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade pressórica à

fenilefrina.

Após análise da influência do Sistema Nervoso Autônomo sobre os efeitos

pressores da ouabaína, avaliou-se a influência da bomba de sódio sobre as ações

desse digitálico. Assim, com a finalidade de avaliar se os efeitos da ouabaína sobre

a pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade pressórica à fenilefrina estão

diretamente ligados à sua propriedade de inibir a Na+K+ ATPase, foi realizado o co-

tratamento com canrenona.

4.3.1. Efeito do bloqueio com canrenona na pressão arterial basal e

freqüência cardíaca basal antes e após tratamento com ouabaína.

A administração de canrenona per se, não modificou a pressão arterial

sistólica e diastólica basal, assim como a freqüência cardíaca. O tratamento com

ouabaína, na presença de canrenona, não produziu alteração na pressão arterial

sistólica e freqüência cardíaca, porém a ouabaína foi capaz de aumentar a pressão

arterial diastólica para valores acima da condição controle, mesmo após tratamento

com canrenona (Tabela 5; Figura 6).

Tabela 5: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS), Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes (Ct), depois da administração de canrenona (Can) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6).

Grupo PAS basal

(mmHg)

PAD basal

(mmHg)

FC basal

(bpm)

Ct 140 ± 4,2 94,8 ± 4,4 341 ± 13,7

Can

Can+Oua

146 ± 9,8

155 ± 2,7 96,8 ± 7,3

114,0 ± 4,2*

362 ± 6,6

362± 8,1

Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via; *p< 0,05 Can+Oua vs Ct e Can.

66

A)

B)

Figura 6: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da administração de canrenona (Can) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6). ANOVA 1 via; *p< 0,05 Can+Oua vs Ct e Can.

0

100

200

Ct

Can

Can + Oua

PAS (mmHg)

0

50

100

150

*

Ct

Can

Can + Oua

PAD (mmHg)

67

4.3.2. Efeito do bloqueio com canrenona sobre a reatividade pressórica à

fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.

A canrenona não alterou a reatividade pressórica à fenilefrina. O tratamento

com ouabaína, após a infusão de canrenona, também não modificou a resposta

máxima e sensibilidade ao agente vasoconstritor na pressão arterial sistólica e

diastólica (Tabela 6; Figura 7).

No entanto, a análise da diferença da área abaixo da curva da pressão arterial

diastólica, analisando as doses 0,03 a 1 µg/Kg, ou seja, as seis primeiras doses da

curva, mostrou que o aumento da reatividade pressórica à fenilefrina foi de maior

magnitude após a administração de canrenona e ouabaína (PAD: 37,5 ± 5,8 %)

quando comparada àquela obtida após administração apenas de canrenona (PAD:

19,8 ± 4,0 %, p<0,05) (Figura 8).

Tabela 6: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de canrenona (Can) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6).

Grupo Rmax pD2

PAS

Ct

Can

Can + Oua

305 ± 7

301 ± 8,2

269 ± 19

-2,7 ± 0,06

-2,9 ± 0,05

-2,8 ± 0,04

PAD

Ct

Can

Can + Oua

184 ± 7,3

197 ± 4,8

186 ± 6

-3,0 ± 0,28

-3,1 ± 0,06

-3,0 ± 0,07

Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; p>0,05.

68

A)

B)

Figura 7: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da administração de canrenona (Can, n=6) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can+Oua, n= 6). ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; p>0,05.

-6 -5 -4 -3 -2 -1

100

150

200

250

300

350

Ct

Can

Can+Oua

FE log [M]

PAS (mmHg)

-6 -5 -4 -3 -2 -1

50

100

150

200

Ct

Can

Can+Oua

FE log [M]

PAD (mmHg)

69

Figura 8: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC), das doses de 0,03 a 1µg/Kg, sobre a Pressão Arterial Diastólica após administração de canrenona e após tratamento com canrenona+ouabaína. Teste t não-pareado; *p<0,05 vs Ct/Can.

0

25

50

*

Ct vs Can Ct vs Can+Oua

% dAAC

70

4.4. Envolvimento do Sistema Renina Angiotensina sobre o efeito da ouabaína

na pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade pressórica à fenilefrina.

Buscando averiguar uma possível influência do Sistema Renina Angiotensina

nas ações da ouabaína sobre a pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade

pressórica à fenilefrina, foi realizado o pré-tratamento com losartan.

4.4.1. Efeito do losartan na pressão arterial basal e freqüência cardíaca basal

antes e após tratamento com ouabaína.

A administração de losartan provocou uma diminuição da pressão arterial

sistólica e diastólica, mas não alterou a freqüência cardíaca. Na presença de

losartan, a ouabaína não foi capaz de promover alterações na pressão arterial

sistólica e diastólica basal, e nem na freqüência cardíaca (Tabela 7; Figura 9).

Tabela 7: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS), Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes (Ct), depois da administração de losartan (Los) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).

Grupo PAS basal

(mmHg)

PAD basal

(mmHg)

FC basal

(bpm)

Ct 128 ± 4,2 72,5 ± 4 332 ± 13,3

Los

Los+Oua

113 ± 2,9 *

110 ± 3,7 + 57,1 ± 5 *

53,6 ± 4,9 + 337 ± 18,6

334 ± 13,6

Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via; *p< 0,05 Los vs Ct; +p<0,05 Los+Oua

vs Ct.

71

A)

B)

Figura 9: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da administração de losartan (Los) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6). ANOVA 1 via; *p< 0,05 Los vs Ct; +p<0,05 Los+Oua vs Ct.

0

100

200

Ct

Los

Los + Oua

* +PAS (mmHg)

0

50

100

* +

Ct

Los

Los + Oua

PAD (mmHg)

72

4.4.2. Efeito do bloqueio dos receptores para angiotensina II na reatividade

pressórica antes e após tratamento com ouabaína.

O losartan per se, não alterou a reatividade pressórica à fenilefrina. Após o

tratamento com losartan, a ouabaína produziu uma diminuição da resposta máxima

à fenilefrina na pressão arterial sistólica, sem alterar, entretanto, a sensibilidade. Em

relação à pressão arterial diastólica, não houve mudanças de resposta máxima e

sensibilidade à fenilefrina após tratamento com losartan e ouabaína (Tabela 8;

Figura 10).

Contudo, a análise da diferença da área abaixo da curva das situações Ct,

Los e Los+Oua mostrou que a diminuição da reatividade pressórica à fenilefrina foi

de maior magnitude após a administração de losartan e ouabaína (PAS: -23,1 ± 2,13

%; PAD: -30,0 ± 4,89 %) quando comparada àquela obtida após administração

apenas de losartan (PAS: -10,0 ± 2,16 %; PAD: -15,1 ± 2,30 %, p<0,05) (Figura 11 A

e B).

Tabela 8: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de losartan (Los) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).

Grupo Rmax pD2

PAS

Ct

Los

Los+Oua

281 ± 8,1

275 ± 7,7

246 ± 6,9 *

-2,7 ± 0,15

-2,5 ± 0,10

-2,7 ± 0,06

PAD

Ct

Los

Los+Oua

173 ± 7,5

162 ± 5,7

159 ± 9,9

-2,6 ± 0,52

-2,9 ± 0,09

-2,8 ± 0,11

Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; *p<0,05 Los+Oua vs Ct e Los.

73

A)

B) Figura 10: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da administração de losartan (Los, n=6) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los+Oua, n= 6). ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; *p<0,05 Los+Oua vs Ct e Los .

-6 -5 -4 -3 -2 -1

100

200

300 Los+Oua

Los

Ct

*

FE log [M]

PAS (mmHg)

-6 -5 -4 -3 -2 -1

50

100

150

200

Ct

Los

Los+Oua

FE log [M]

PAD (mmHg)

74

A) B) Figura 11: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a (A) Pressão Arterial Sistólica e (B) Pressão Arterial Diastólica após administração de losartan e após tratamento com losartan+ouabaína. Teste t não-pareado; *p<0,05 vs Ct/Los.

Ct x Los Ct x Los+Oua

-30

-20

-10

0

10

20

30

*

% d AAC

Ct x Los Ct x Los+Oua

-40

-20

0

20

40

*

% d AAC

75

DISCUSSÃO

76

5. DISCUSSÃO

Os dados obtidos nesse estudo demonstram que pequenas concentrações

de ouabaína são capazes de aumentar a pressão arterial de ratos espontaneamente

hipertensos, exacerbando o quadro hipertensivo desses animais. Esse mecanismo

hipertensor parece ser dependente da sua ação sobre a bomba de sódio e do

sistema renina-angiotensina. Já em relação às possíveis alterações na reatividade

pressórica à fenilefrina, considerando que, no experimento in vivo, todos os

mecanismos de controle cardiovascular estão em funcionamento, essa concentração

de ouabaína, per se, não modificou os parâmetros de reatividade pressórica.

Contudo, após as intervenções farmacológicas realizadas, sugerimos que a

ouabaína ativa mecanismos pressores e depressores que em conjunto, se anulam, e

assim, não alteram a reatividade pressórica à fenilefrina.

Os presentes achados mostram que os efeitos da fenilefrina sobre a pressão

arterial diastólica, na presença de ouabaína, encontram-se aumentados após

bloqueio com hexametônio e canrenona, e diminuídos após bloqueio com losartan.

Já a reatividade à fenilefrina na pressão arterial sistólica, na presença de ouabaína,

encontra-se inalterada após bloqueio com hexametônio e canrenona, e diminuída

após bloqueio dos receptores AT1. Em conjunto, esses resultados de reatividade

vascular indicam que a ouabaína atua através de mecanismos periféricos,

dependentes do sistema renina-angiotensina e da sua ação sobre a bomba de

sódio, além de sofrer modulação do sistema nervoso central.

Estudos do nosso grupo demonstraram que concentrações nanomolares de

ouabaína aumentam a pressão arterial de ratos com hipertensão renovascular e

hipertensão L-NAME, e não promovem alterações na pressão arterial dos animais

normotensos (Rossoni et al., 2001; 2003). Em ratos SHR, o tratamento com baixas

concentrações de ouabaína também eleva a pressão arterial e reatividade

pressórica à fenilefrina, mas não modifica esses parâmetros nos animais controles

(Vassallo et al., 1997). Entretanto, os mecanismos hipertensinogênicos do

tratamento agudo com pequenas concentrações de ouabaína nos ratos

espontaneamente hipertensos ainda não foram esclarecidos. Sendo assim, foram

desenvolvidos alguns protocolos experimentais para investigar esses possíveis

mecanismos.

77

5.1. Efeitos da ouabaína na Pressão Arterial, Freqüência Cardíaca Basal

e Reatividade Pressórica à fenilefrina.

Estudos demonstram que os níveis de ouabaína endógena se encontram

elevados em uma grande parte dos pacientes com hipertensão essencial, e são

correlacionados com a pressão arterial (Goto et al., 1990; Rossi et al., 1995;

Manunta et al., 1999; 2001). Em animais, a administração prolongada desse

digitálico é capaz de induzir hipertensão (Yuan et al., 1993; Manunta et al., 1994;

Rossoni et al.,2002a; Dostanic et al., 2005). Sendo assim, esse hormônio tem sido

amplamente relacionado com o desenvolvimento e/ou manutenção do processo

hipertensivo.

Os efeitos da ouabaína são usualmente explicados por sua propriedade de

inibir a bomba de sódio em diversos tecidos, incluindo o músculo liso vascular,

levando ao acúmulo de sódio intracelular e conseqüente aumento de cálcio

mioplasmático, através da abertura de canais de cálcio dependentes de voltagem e

redução da atividade do trocador Na+/Ca2+ (Vassalle, 1987; Marin et al., 1988;

Blaustein, 1993). Além disso, a inibição da bomba presente nos nervos simpáticos

aumenta a liberação de noradrenalina e reduz sua captação (Vanhoutte & Lorenz,

1984; Barker et al., 2001). Desse modo, o resultado final da inibição da bomba de

sódio é a contração do músculo liso vascular e assim, aumento da resistência

vascular periférica, mecanismo importante na gênese e/ou manutenção da

hipertensão arterial. A hipertensão desenvolvida pela ouabaína tem sido relacionada

também aos seus efeitos sobre o sistema nervoso central. Trabalhos mostram que

esse digitálico promove hiperatividade simpática através da ativação dos sistemas

renina-angiotensina (Huang & Leenen, 1994; Zhang & Leenen, 2001) e endotelina

(Di Filippo et al., 2003), além de causar prejuízo da atividade barorreflexa (Huang &

Leenen, 1999).

É importante ressaltar que o efeito vasoconstritor direto da ouabaína ocorre

em altas concentrações desse composto (Ross Jr et al.,1960; Mason & Braunwald,

1964; Marin et al., 1988). Como a ouabaína plasmática se encontra em baixas

concentrações, um outro mecanismo tem sido proposto para explicar sua ação

pressora. Esse mecanismo se baseia na sensibilização do músculo liso a agentes

vasopressores (Songu-Mize et al., 1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999;

2001). Recentemente, foi identificada uma microrregião da célula, onde estão

78

localizados o trocador Na+/Ca2+ e as isoformas α2 e α3 da Na+K+ ATPase, que

possuem maior afinidade pela ouabaína (Juhaszova & Blaustein, 1997a; 1997b). A

inibição da bomba de sódio nessa região promove aumento local de cálcio

mioplasmático, que é captado pela Ca2+ ATPase do retículo sarcoplasmático e

estocado no interior dessa organela (Blaustein et al., 1998). Assim, após estímulo de

um agonista vasoconstritor, a resposta contrátil resultante é amplificada em

decorrência de uma maior liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático. Dessa

forma, a ouabaína é capaz de aumentar a resistência vascular através da

sensibilização do músculo liso a agentes vasopressores, contribuindo para o

processo hipertensivo.

Buscando averiguar as ações pressoras e os mecanismos

hipertensinogênicos de baixas concentrações de ouabaína nos ratos SHR, o

presente trabalho mostrou que a administração aguda de concentrações fisiológicas

desse digitálico promove aumento da pressão arterial sistólica e diastólica. Esses

achados corroboram estudos prévios do nosso grupo onde a ouabaína promoveu

aumento da pressão arterial de animais hipertensos anestesiados e sensibilizou o

leito arterial caudal desses animais à resposta pressora induzida pela fenilefrina,

sugerindo que os animais hipertensos são mais sensíveis ao efeito pressórico

induzido pela ouabaína (Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 2001; Padilha et al.,

2004). Em relação à freqüência cardíaca, não houve alterações após administração

desse digitálico, corroborando dados já demonstrados no nosso laboratório (Rossoni

et al., 2001). O aumento na pressão arterial sistólica pode estar relacionado com o

efeito clássico desse digitálico de inotropismo positivo através da inibição da bomba

de sódio (Cattel & Gold, 1938; Blaustein, 1993; Wasserstrom & Aistrup, 2005;

Altamirano et al., 2006). Já o aumento da pressão arterial diastólica indica que a

ouabaína promove aumento da resistência vascular periférica (Blaustein, 1993).

Como já evidenciado em estudos prévios, concentrações nanomolares de

ouabaína são capazes de promover sensibilização do músculo liso vascular a

agentes vasopressores, em animais espontaneamente hipertensos (Vassallo et al.,

1997) e com hipertensão renovascular (Rossoni et al., 2001), nas condições

experimentais in vivo. Entretanto, a reatividade pressórica testada nesses estudos

foi realizada apenas com 3 concentrações de fenilefrina, dificultando a análise da

sensibilidade e resposta máxima ao agente vasoconstritor. No presente estudo, foi

79

realizada uma curva concentração-resposta à fenilefrina completa, com 11

concentrações desse vasoconstritor. Nessa situação, o tratamento com ouabaína,

per se, não alterou os parâmetros de reatividade pressórica à fenilefrina. Contudo,

essa mesma concentração de ouabaína in vitro, foi capaz de aumentar a resposta à

fenilefrina em leito arterial caudal de ratos SHR (Padilha et al., 2004). Como o

presente experimento foi realizado em condições in vivo, podem estar ocorrendo

respostas compensatórias do organismo que justifiquem a ausência de alterações

na reatividade pressórica após tratamento com ouabaína.

Conforme já descrito acima, a habilidade da ouabaína de aumentar a pressão

arterial de ratos anestesiados pode ser resultado de mecanismos centrais e/ou

periféricos. Esses mecanismos se baseiam no aumento da atividade simpática, na

ação direta da ouabaína sobre o músculo liso vascular, e na sensibilização da

musculatura vascular a agentes vasopressores (Blaustein, 1993; Huang & Leenen,

1994; Songu-Mize et al., 1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999; 2001).

Assim, objetivando investigar qual seria o mecanismo hipertensinogênico da

concentração de ouabaína utilizada no presente estudo, foram realizadas algumas

intervenções farmacológicas que serão discutidas a seguir.

80

5.2. Efeito do hexametônio na pressão arterial e reatividade pressórica à


Tem sido demonstrado que, tanto em animais normotensos quanto

hipertensos, a ouabaína, cronicamente, induz hipertensão através de mecanismos

centrais. Esses mecanismos se baseiam no aumento da atividade simpática e

prejuízo da atividade barorreflexa, uma vez que o bloqueio ganglionar com

hexametônio normaliza a pressão arterial e freqüência cardíaca dos ratos tratados

cronicamente com ouabaína (Huang et al., 1994).

No presente estudo, diferente dos estudos crônicos acima citados, os efeitos

pressores da administração aguda de concentrações fisiológicas de ouabaína nos

animais espontaneamente hipertensos não foram bloqueados pelo hexametônio.

Esses resultados corroboram estudos prévios do nosso grupo, onde a ouabaína nas

concentrações de 6 e 18µg/Kg, de forma aguda, aumenta a pressão arterial de ratos

normotensos através de mecanismos periféricos, uma vez que o bloqueio dos

reflexos cardiovasculares não abole seu efeito pressor (Barker et al., 2001). Ross Jr.

et al. (1960), também evidenciaram que os efeitos pressores agudos da ouabaína

em cães anestesiados não são bloqueados após infusão de hexametônio, sugerindo

uma ação periférica desse digitálico diretamente sobre a musculatura lisa vascular.

Diferentemente, dados de Rossoni et al. (2003), mostram que em animais

hipertensos L-NAME, o efeito pressor provocado por 0,18 µg/Kg de ouabaína é

abolido após bloqueio com hexametônio. Isso indica que os mecanismos

hipertensores da ouabaína diferem em relação ao tipo de tratamento e modelo

animal estudado.

Assim sendo, os presentes resultados indicam que concentrações

nanomolares desse digitálico, de forma aguda, não têm ações nos neurônios pré-

ganglionares e/ou sistema nervoso central dos ratos espontaneamente hipertensos.

Portanto, parece que a ouabaína, em condições fisiológicas, age através de

mecanismos periféricos, que resultam em aumento da pressão arterial.

Quando a reatividade pressórica à fenilefrina foi testada após co-tratamento

de hexametônio e ouabaína, não foram observadas alterações de sensibilidade e

resposta máxima do agente vasoconstritor na pressão arterial sistólica. Entretanto,

após a remoção da influência do Sistema Nervoso Autônomo, a ouabaína aumentou

81

a sensibilidade da fenilefrina na pressão arterial diastólica. Isto pode ser evidenciado

através da análise da pD2 e da diferença da área abaixo da curva. Esses efeitos

sobre a reatividade pressórica foram, em parte, diferentes dos efeitos da ouabaína

em condições basais. Esses resultados indicam que os reflexos autonômicos, na

presença de ouabaína, modulam a reatividade pressórica à fenilefrina na pressão

arterial diastólica. Desse modo, após eliminação da influência do Sistema Nervoso

Autônomo, a ouabaína pode estar agindo diretamente no músculo liso vascular ou

mediando a liberação de catecolaminas nos terminais simpáticos, e assim,

aumentando a reatividade pressórica à fenilefrina na pressão arterial diastólica.

Esses achados corroboram estudos do nosso grupo onde, em ratos normotensos,

baixas concentrações de ouabaína produzem respostas pressoras por ações nos

terminais simpáticos e no músculo liso vascular (Barker et al., 2001).

Após avaliação da influência dos efeitos centrais da ouabaína, o próximo

objetivo desse estudo foi avaliar se a ação hipertensora desse digitálico está

relacionada com sua propriedade de inibir a bomba de sódio.

82

5.3. Efeito da canrenona na pressão arterial e reatividade pressórica à


Classicamente, os efeitos da ouabaína são explicados por sua capacidade de

se ligar à subunidade α da Na+K+ATPase e, assim, inibir a atividade da bomba de

sódio (Skou & Esmann, 1992; Lingrel, 1992). Essa inibição, por sua vez, resulta no

acúmulo de sódio intracelular e conseqüente aumento de cálcio mioplasmático,

através da abertura de canais de cálcio dependentes de voltagem e redução da

atividade do trocador Na+/Ca2+ (Vassalle, 1987; Marin et al., 1988; Blaustein,

1993ALE). Além disso, a inibição da bomba presente nos nervos simpáticos

aumenta a liberação de noradrenalina e reduz sua captação (Vanhoutte & Lorenz,

1984; Barker et al., 2001). O resultado final dessa inibição é a contração do músculo

liso vascular e assim, aumento da resistência vascular periférica, mecanismo

importante na gênese e/ou manutenção da hipertensão arterial.

Diante disso, objetivando avaliar se o efeito hipertensor agudo de

concentrações fisiológicas de ouabaína é dependente da inibição da bomba de

sódio, foi utilizada canrenona, que tem sido descrita como um bloqueador dos

efeitos da ouabaína, principalmente nos estados hipertensivos dependentes de

volume (Grichois et al., 1986; Pamnani et al., 1990). A canrenona é um metabólito

do fármaco anti-hipertensivo espironolactona, um inibidor competitivo da aldosterona

(Sadée et al., 1973; Marver & Kocco, 1983). Em adição a esses efeitos anti-

hipertensivos da canrenona, trabalhos sugerem que sua ação inibitória sobre os

efeitos da ouabaína, contribui para seus efeitos hipotensores e, assim, sua utilização

pode ser recomendada nas condições hipertensivas que são acompanhadas de

aumento dos níveis plasmáticos de ouabaína (De Mendonça et al., 1985; 1988;

Semplicini et al., 1995). O efeito da canrenona de antagonizar as ações da ouabaína

se deve ao fato de que esse metabólito também se liga na bomba de sódio e assim,

bloqueia o sítio de ligação para os digitálicos (Finotti & Palatini, 1981; Balzan et al.,

2003). Sua ação sobre a bomba de sódio é dependente da concentração utilizada.

Assim, baixas concentrações de canrenona são capazes de inibir a bomba de sódio

(Finotti & Palatini, 1981) ao contrário de altas concentrações, que estimulam (Garay

et al., 1985). Portanto, baseado em estudos anteriores do nosso grupo (Vassallo et

al., 1998), o presente estudo utilizou baixas concentrações de canrenona,

83

conhecidas por não alterar a contratilidade miocárdica, o tônus vascular e a pressão

arterial.

Os presentes resultados mostram que a canrenona foi capaz de abolir o efeito

hipertensor da ouabaína sobre a pressão arterial sistólica. Isso indica que o efeito

inotrópico positivo da ouabaína, se deve à sua ação inibitória sobre a bomba de

sódio. A expressão das isoformas da Na+K+ATPase no coração varia dependendo

das espécies. As isoformas α1 e α2 estão presentes no coração de roedores,

enquanto α1, α2 e α3 são expressas no coração humano (Orlowski & Lingrel, 1988;

Shamraj et al., 1991; Jewell et al., 1992). Embora a isoforma α1 apresente baixa

afinidade pela ouabaína, estudos em camundongos geneticamente modificados têm

demonstrado que esta, juntamente com a isoforma α2, de alta afinidade pela

ouabaína, são inibidas por concentrações nanomolares desse digitálico, produzindo

assim, efeito inotrópico positivo, corroborando os presentes resultados (Dostanic et

al. 2004; Larson et al., 2006). Esses autores demonstraram também que essas

isoformas estão funcionalmente e fisicamente acopladas ao trocador Na+/Ca2+, e,

quando a atividade desse trocador é inibida, o efeito cardiotônico da ouabaína é

abolido. Isso confirma a hipótese de que a inibição da Na+K+ATPase leva a uma

redução ou inibição da atividade do trocador, e conseqüente aumento de cálcio

intracelular, promovendo assim, efeito inotrópico positivo.

O bloqueio dos efeitos desse digitálico sobre a pressão arterial sistólica

produzido pela canrenona confirma dados do nosso laboratório, onde em ratos

normotensos, a canrenona foi capaz de bloquear os efeitos pressóricos de

1,8 mg/Kg e 18 µg/Kg de ouabaína (Vassallo et al, 1998). Desse modo, esses dados

indicam a importância da inibição da Na+K+ ATPase nas ações da ouabaína sobre a

pressão arterial sistólica.

Entretanto, a canrenona não bloqueou os efeitos da ouabaína sobre a

pressão arterial diastólica. Isso indica que esse digitálico pode estar atuando através

de outros mecanismos hipertensinogênicos, que são independentes da inibição da

Na+K+ATPase. Evidências na literatura mostram que a ação hipertensora da

ouabaína parece ser independente da sua propriedade de inibir a bomba de sódio

(Manunta et al., 2001). Isso é baseado em trabalhos que observaram que o

tratamento com glicosídeos cardíacos como a digoxina e digitoxina, não são

capazes de induzir hipertensão arterial em ratos, ao contrário da ouabaína (Guthrie,

1984; Manunta et al., 2000; Kimura et al., 2000). Além disso, Manunta et al. (2001),

84

comparando o efeito hipertensivo da ouabaína e de alguns dos seus isômeros, como

a iso-ouabaína e a dihidro-ouabaína, com seu efeito sobre a atividade da

Na+K+ATPase, demonstraram que o efeito hipertensor da ouabaína e seus isômeros

é independente da sua potência inibitória sobre a bomba de sódio. A análise da

estrutura-atividade dessas substâncias mostrou que a ouabaína é o inibidor mais

potente da atividade da Na+K+ATPase comparada à iso-ouabaína e à dihidro-

ouabaína, porém estes últimos possuem uma atividade hipertensora mais

pronunciada. Isso levanta a possibilidade de que a bomba de sódio parece não ser o

alvo inicial ou principal do mecanismo pelo qual a ouabaína induz aumento

sustentando da pressão arterial. Diante dessas evidências, novos sítios de ligação

para a ouabaína, distintos da Na+K+ATPase, em células adrenocorticais têm sido

descritos, os quais podem estar relacionados com os efeitos hipertensores desse

digitálico (Ward et al., 2002). Além disso, a localização desses receptores no córtex

da adrenal e sua especificidade pela ouabaína, sugerem que esses novos sítios

podem estar envolvidos na regulação e/ou secreção da ouabaína endógena.

Assim, os presentes achados sobre a pressão arterial diastólica corroboram a

idéia de que a ação hipertensora da ouabaína parece ser independente da sua

propriedade de inibir a bomba de sódio (Manunta et al., 2001). Além disso, baseado

nos estudos de Ward et al. (2002), os efeitos hipertensores da ouabaína podem ser

mediados por novos sítios de ligação para esse digitálico. Isto explicaria o presente

resultado, sugerindo que a ouabaína atuando por outro sítio de ligação, distinto da

Na+K+ ATPase, pode aumentar a resistência vascular periférica, aumentando assim,

a pressão arterial diastólica.

Os resultados da diferença da AUC da curva concentração resposta à

fenilefrina, na pressão arterial diastólica, mostram uma maior magnitude da

reatividade pressórica após co-tratamento de canrenona e ouabaína. Esse aumento

da reatividade está sendo produzido, provavelmente, por outros efeitos pressores da

ouabaína, independentes da sua ação sobre a Na+K+ATPase. Essa sugestão é

baseada em estudos prévios do nosso laboratório onde foi demonstrado que a

ouabaína, em concentrações fisiológicas, é capaz aumentar a produção local de

angiotensina II, contribuindo assim para o aumento de reatividade pressórica à

fenilefrina observado no leito arterial caudal após infusão aguda de ouabaína

85

(Padilha et al., 2004). Assim, mesmo tendo seu sítio ativo principal bloqueado pela

canrenona, a ouabaína estaria atuando através de outros mecanismos pressores, e

provocando o aumento da reatividade pressórica à fenilefrina na pressão arterial

diastólica. Em relação à pressão arterial sistólica, o co-tratamento com canrenona e

ouabaína não altera a reatividade pressórica à fenilefrina. Provavelmente os efeitos

pressores desse digitálico, independentes da sua ação sobre a Na+K+ATPase, não

foram suficientes para alterar a pressão arterial sistólica, diferente do que aconteceu

na pressão arterial diastólica.

Conforme já descrito acima, estudos do nosso laboratório mostraram que in

vitro, concentrações fisiológicas de ouabaína sensibilizam o músculo liso vascular de

ratos SHR, sendo essa ação mediada pela liberação de angiotensina II local

(Padilha et al., 2004). Baseado nessas evidências, o presente estudo buscou

averiguar se as ações pressoras da ouabaína e seu efeito sobre a reatividade

pressórica à fenilefrina observados, in vivo, podem ser mediados pelo sistema

renina-angiotensina.

86

5.4. Efeito do losartan na pressão arterial e reatividade pressórica à


Diversos trabalhos têm evidenciado o envolvimento do sistema renina-

angiotensina central nas ações pressoras da ouabaína (Takahashi et al., 1984;

Doursout et al., 1992). Recentemente, o grupo do Professor Leenen tem

demonstrado que as respostas simpatoexcitatórias e pressoras observadas em ratos

tratados cronicamente com ouabaína são mediadas pela estimulação de receptores

AT1 no sistema nervoso central, uma vez que a administração de antagonistas

desses receptores abole o efeito pressor da ouabaína (Huang & Leenen 1996b;

1999; Zhang & Leenen, 2001). Isso indica que a ouabaína ativa especificamente o

sistema renina-angiotensina cerebral (Cheung et al., 2006). Entretanto, trabalhos do

nosso grupo mostraram que a ouabaína, perifericamente, é capaz de estimular a

atividade da ECA endotelial e promover aumento da liberação de angiotenina II,

indicando assim, o envolvimento do sistema renina-angiotensina local nas ações da

ouabaína sobre o músculo liso vascular (Padilha et al., 2004). Os presentes

resultados mostram que o tratamento com losartan aboliu os efeitos pressores

agudos da ouabaína. Isso corrobora os trabalhos acima citados evidenciando a

participação do sistema renina-angiotensina nas ações agudas de concentrações

fisiológicas de ouabaína.

Conforme descrito anteriormente, o aumento da pressão arterial sistólica após

administração de concentrações fisiológicas de ouabaína parece ser dependente da

ação inibitória desse digitálico sobre a bomba de sódio, já que esse efeito foi

bloqueado pela canrenona. Em adição a esses achados, o aumento da pressão

arterial sistólica provocado pela ouabaína também foi abolido após administração de

losartan. Isso indica que além do efeito sobre a bomba de sódio, há a participação

do sistema renina-angiotensina nas ações desse digitálico. Baseado nas

informações de que a ouabaína é capaz de estimular o sistema renina-angiotensina

(Huang & Leenen 1996b; 1999; Padilha et al., 2004), a angiotensina II formada pode

estar estimulando a liberação de catecolaminas dos terminais simpáticos, o que irá

promover aumento da contratilidade cardíaca, aumentando assim a pressão arterial

sistólica (Weir & Dzau, 1999; Paul et al., 2006). Em relação à pressão arterial

diastólica, como a canrenona não bloqueou os efeitos pressores da ouabaína,

sugerimos que esses efeitos são mediados, neste caso, pelo sistema renina-

87

angiotensina, já que o losartan aboliu o aumento da pressão arterial diastólica

provocado pela ouabaína. Assim, a ouabaína estaria estimulando o sistema renina-

angiotensina (Huang & Leenen 1996b; 1999; Padilha et al., 2004), sendo que, a

angiotensina II formada, atuando na musculatura lisa vascular, promove

vasoconstrição e conseqüente aumento da resistência vascular periférica,

aumentando a pressão arterial diastólica (Weir & Dzau, 1999; Paul et al., 2006).

Esse efeito pressor da ouabaína mediado pelo sistema renina-angiotensina e

independente da sua ação sobre a bomba de sódio, poderia estar ocorrendo através

da sua ligação aos seus novos receptores, recentemente descobertos (Ward et al.,

2002). Desse modo, esses dados mostram a importância do sistema renina-

angiotensina nos efeitos pressores agudos de concentrações fisiológicas de

ouabaína, sugerindo então, um mecanismo adicional de atuação deste digitálico.

Os resultados de reatividade pressórica à fenilefrina demonstraram que após

co-tratamento de losartan e ouabaína, ocorreu uma acentuada diminuição da

reatividade pressórica à fenilefrina na pressão arterial sistólica e diastólica, além da

redução da resposta máxima à fenilefrina da pressão arterial sistólica. Isso indica

que, após a retirada da influência do sistema renina-angiotensina, a ouabaína

produziu ações opostas aos protocolos anteriores, ou seja, reduziu significantemente

a reatividade pressórica à fenilefrina. Esses dados sugerem que a ouabaína está

promovendo um efeito adicional de estimular uma via vasodilatadora ou depressora,

ou então, inibir uma via vasoconstritora ou pressora do sistema cardiovascular.

Trabalhos in vitro do nosso grupo, demonstraram que essa concentração de

ouabaína utilizada no presente estudo, promove liberação de angiotensina II no

endotélio do leito vascular caudal de ratos SHR, aumentando assim a sensibilidade

desse leito a agentes vasoconstritores, como a fenilefrina. Por outro lado, essa

mesma concentração de ouabaína é capaz de aumentar a atividade funcional da

Na+K+ATPase (Padilha et al., 2004). A estimulação da bomba de sódio por

concentrações nanomolares de ouabaína também já foi evidenciada por Gao et al.

(2002) em miócitos ventriculares de cobaias. Baseado nessas informações, a

ouabaína, em concentrações fisiológicas, pode estar atuando através da

estimulação da bomba de sódio. Isto explicaria os resultados de reatividade

pressórica encontrados, onde, na ausência do sistema renina-angiotensina, a

ouabaína poderia estimular a Na+K+ATPase, promovendo inotropismo negativo e

88

redução da reatividade pressórica à fenilefrina. Além disso, vale ressaltar também

que a angiotensina II é capaz de estimular a bomba de sódio (Brock et al., 1982;

Garvin, 1991; Yingst et al., 2004). Assim, a angiotensina II liberada pela ação da

ouabaína, poderia, além das suas ações clássicas sobre o sistema cardiovascular,

estimular a bomba de sódio, contribuindo para o efeito inotrópico negativo e redução

da reatividade pressórica à fenilefrina observados.

Uma outra explicação para essa redução acentuada da reatividade pressórica

à fenilefrina após administração de losartan e ouabaína, seria uma possível

estimulação de receptores AT2. Já é conhecido que as ações da angiotensina II são

mediadas via receptores de membrana AT1 e AT2, e que a estimulação desses

receptores produz efeitos distintos (Bumpus et al., 1991; Weir & Dzau, 1999).

Enquanto a estimulação dos receptores AT1 desencadeia ações como

vasoconstrição, ativação de processos inflamatórios e proliferação celular (Weir &

Dzau, 1999; Allen et al., 2000; Touyz & Berry, 2002), a estimulação de AT2 promove

efeitos de vasodilatação e inibição da proliferação celular (Dzau et al., 1993; Weir &

Dzau, 1999; Siragy, 2000). Tendo em vista que a estimulação de receptores AT2

ativa cascatas de sinalização celular via fosfatases enquanto a estimulação de

receptores AT1 ativa kinases, não é surpresa que as ações desses receptores sejam

antagonistas (Weir & Dzau, 1999; Touyz & Berry, 2002; Booz, 2004). Trabalhos

demonstram que o bloqueio de receptores AT1 é acompanhado pelo aumento dos

níveis plasmáticos de angiotensina II. Quando esses receptores são efetivamente

bloqueados, a angiotensina II se liga seletivamente aos receptores AT2,

desencadeando efeitos opostos (Masaki et al., 1998; Carson et al., 2001). Sendo

assim, a estimulação dos receptores AT2 contribui significantemente para os efeitos

hemodinâmicos benéficos dos bloqueadores de receptores AT1 (Cosentino et al.,

2005). Portanto, como a ouabaína pode ativar o sistema renina-angiotensina através

da estimulação da ECA endotelial (Padilha et al., 2004), a angiotensina II formada,

poderia estar atuando via receptores AT2, já que os receptores AT1 estão bloqueados

pelo losartan. Isto antagoniza os efeitos inotrópicos positivos e vasoconstritores da

estimulação de receptores AT1, o que justificaria a redução da reatividade pressórica

à fenilefrina da pressão arterial sistólica e diastólica observada no presente estudo.

Além disso, vale ressaltar também, uma possível ação de outros peptídeos do

sistema renina-angiotensina, como por exemplo, a angiotensina - (1-7). Trabalhos

demonstram que esse peptídeo realiza efeitos opostos aos da angiotensina II no

89

sistema cardiovascular (Santos & Ferreira, 2007), diminuindo a hipertrofia e fibrose

(Tallant et al., 2005; Grobe et al., 2006; 2007), exercendo efeitos antitrombótico

(Kucharewicz et al., 2000), antiangiogênico (Machado et al., 2000) e antiarrítmico

(Ferreira et al., 2001; Santos et al., 2004), além do seu efeito vasodilatador

dependente do endotélio através da estimulação da produção de óxido nítrico,

prostaglandinas e fator de relaxamento dependente do endotélio (Santos et al.,

2005; Ferreira & Santos, 2005; Ferrario, 2006; Santos & Ferreira, 2007; Sampaio et

al., 2007). Esses efeitos podem ser resultantes da interação da angiotensina – (1-7)

com seu próprio receptor, denominado Mas, ou também através da interação

indireta desse peptídeo com os receptores AT1 e AT2 via receptor Mas (Santos et al.,

2000; Ferreira & Santos, 2005; Santos & Ferreira, 2007). Assim, a ativação do

sistema renina-angiotensina pela ouabaína, poderia resultar em formação de

angiotensina – (1-7), via ECA-2, o que também poderia justificar a redução da

reatividade pressórica à fenilefrina observada nesse estudo.

90

CONCLUSÃO

91

6. CONCLUSÃO

- O tratamento agudo com pequenas concentrações de ouabaína foi capaz de

aumentar a pressão arterial de animais espontaneamente hipertensos anestesiados.

- Os efeitos pressores da ouabaína sobre a pressão arterial sistólica basal são

dependentes da inibição da Na+K+ATPase, bem como, do sistema renina-

angiotensina. Já os efeitos sobre a pressão arterial diastólica são dependentes

apenas, do sistema renina-angiotensina.

- Apesar da ouabaína não ter alterado a reatividade pressórica à fenilefrina,

após as intervenções farmacológicas realizadas, observou-se que esse digitálico

pode estar ativando mecanismos pressores e depressores que, em conjunto, se

anulam e assim, não alteram a reatividade pressórica à fenilefrina. Possivelmente,

esses mecanismos envolvem a participação do sistema nervoso central, da

Na+K+ATPase e do sistema renina-angiotensina.

Em conclusão, os resultados obtidos no presente estudo demonstram que

pequenas concentrações de ouabaína, em ratos hipertensos, promovem efeitos

pressores através de sua ação sobre a bomba de sódio, mas também, através do

sistema renina-angiotensina, sugerindo assim, um mecanismo de ação adicional

desse digitálico para o desenvolvimento e/ou manutenção da hipertensão.

92

REFERÊNCIAS

93

7. REFERÊNCIAS

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