Staphylococcus Dra. Elsa Masae Mamizuka USP Dr. Antônio Carlos Pignatari Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia - LEMC

Staphylococcus

Dra. Elsa Masae Mamizuka

USP

Dr. Antônio Carlos PignatariDiretor do Laboratório Especial de Microbiologia - LEMC

Introdução a cocos Gram-positivos Características do Gênero StaphylococcusStaphylococcus aureusEnzimas ExtracelularesTestes de aglutinação rápida para coagulasePadrões de HemóliseRegulação de Fatores de VirulênciaStaphylococcus epidermidisOutras espécies de StaphylococcusIdentificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínicaChave Geral para a Identificação de StaphylococcusStaphylococcus saprophyticusDetecção de resistência de Staphylococcus aureus à oxacilina e ou vancomicinaResistência aos AntibióticosStaphylococcus aureus resistente à oxacilina-ORSAMétodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxaclina ( meticilina)Resistência à VancomicinaDetecção da VISA/VRSARelação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

índice

Introdução a cocos Gram-positivos

Os cocos Gram positivos (CG+) compõem um grupo de grande importância clínica. São responsáveis por inúmeras e variadas afecções e síndromes.

Os CG+ anaeróbios facultativos de importância clínica pertencem a uma de duas famílias:

Micrococcaceae ou Streptococcaceae

Pesquisa de catalase na bactéria

A partir da caracterização da amostra como CG+ através da coloração de Gram, a determinação da família é feita pela prova da catalase.

A prova da catalase consiste em colocar uma amostra de bactéria em contato com o peróxido de hidrogênio, e pesquisar a formação de bolhas de oxigênio.

2H2O2 2H2O + O2 catalase


Micrococcaceae+

As bactérias desta família são catalase POSITIVAS

Streptococcaceae-

As bactérias desta família são catalase NEGATIVAS


Esta estrutura característica lembra cachos de uva.

Características do Gênero Staphylococcus

As sp mais importantes na clínica

S. lugundensis

S. schleiferi

S. sciuri

S. lentus

S. caseolyticus

S. hyicus

S. chromogenes

S. intermedius

S. delphini

S. carnosus

S. simulans

S. cohnii

S. xylosus

S. saprophyticus

S. gallinarium

S. kloosii

S. equorum

S. arlettae

S. epidermidis

S. capitis

S. warnei

S.saccharolyt.

S. caprae

S. hominis

S. haemolyticus

S. auricularis

S. aureus


As mais importantes no laboratório clínico são:

S. lugundensis

S. schleiferi

S. sciuri

S. lentus

S. caseolyticus

S. hyicus

S. chromogenes

S. intermedius

S. delphini

S. carnosus

S. simulans

S. cohnii

S. xylosus

S. saprophyticus

S. gallinarium

S. kloosii

S. equorum

S. arlettae

S. epidermidis

S. capitis

S. warnei

S.saccharolyt.

S. caprae

S. hominis

S. haemolyticus

S. auricularis

S. aureus


Staphylococcus aureus

De todas as espécies do gênero, o S. aureus é o mais importante. É responsável pelo segundo maior número de infecções em seres humanos.

O S.aureus está presente no trato respiratório superior, especialmente nas narinas, de aproximadamente 60% da população em geral, e assim permanece sem causar doença em condições normais.

O gênero Staphylococcus é composto por várias espécies:

S. lugundensis

S. schleiferi

S. sciuri

S. lentus

S. caseolyticus

S. hyicus

S. chromogenes

S. intermedius

S. delphini

S. carnosus

S. simulans

S. cohnii

S. xylosus

S. saprophyticus

S. gallinarium

S. kloosii

S. equorum

S. arlettae

S. epidermidis

S. capitis

S. warnei

S.saccharolyt.

S. caprae

S. hominis

S. haemolyticus

S. auricularis

S. aureus


O nome “aureus” significa “dourado” em latim, qualidade atribuída ao pigmento amarelado característico produzido pela bactéria.


Enzimas Extracelulares

A enzima extracelular mais importante é a coagulase. A produção de coagulase é exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um critério para a identificação de uma amostra como pertencente à espécie.

coagulase

protrombinaFibrinogênio Fibrina

EstafilotrombinaCausa coagulação

Fatores de Virulência do Staphylos

Staphylos não é o único que produz coagulase

No laboratório clínico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A bactéria em questão é inoculada num tubo com plasma de coelho. Se o plasma coagular, a espécie é S. aureus.


Se não coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente


Proteína A (SpA)Tem a habilidade de se ligar à porçãoFC de IgG, impedindo, portanto que elasirva de fator de opsonização na fagocitose.

IgG

S. aureusSpA (Atn)

Fab

Fc

Fab

Testes de aglutinação rápida para coagulase

• Testa a presença de proteina A e fator de coagulação

(clamping factor)• Fornece resultado + em 5 a 20 seg.• Mostra correlação de 80% com mét.classico• preço e mbalagem com 150un. U$116.00

• Teste de aglutinação do latex azul para detecção do clumping

factor e protein A associado à Staphylococcus aureus • Resultado em 60 seg• Sensibilidade/especificidade: 99/92%• Inclui partícula de latex , cartão p/teste, haste, e controles

positivo e negativo• Preço: embalagem de 105 um. U$ 105.62• Validade 18 meses

Padrões de Hemólise

esverdeado

Regulação de Fatores de Virulência

Os fatores de virulência produzidos por S. aureus não são expressados a toda hora, são dependentes da fase de crescimento da bactéria.

tempo

no de células

Proteína A adesinas coagulase hemolisinasToxinas Alimento em abundância

Proteína A adesinas coagulase hemolisinas toxinas

alimento

Taxa estacionária

A segunda espécie mais importante do gênero Staphylococcus é o Staphylococcus epidermidis.

O Staphylococcus epidermidis faz parte da flora normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores.

Staphylococcus epidermidis

Importante na infecção hospitalar

O Staphylococcus epidermidis é uma espécie bem menos virulenta do que S. aureus. Não apresentam a produção de coagulase e algumas cepas apresentam a produção muito tímida de certas enzimas proteolíticas.

Todavia, isto não significa que S. epidermidis não possa ser patogênico. Esta espécie tem muitos fatores de adesão e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plástico (cateter, próteses, stents, etc.).


O Staphylococcus epidermidis é um risco para pacientes imunocomprometidos e para usuários de drogas intravenosas, podendo causar endocardite e infecções generalizadas não-piogênicas.

Staphylococcus epidermidis pode causar septicemia, endocardite, peritonite, ventriculite e infecções em locais com prótese.


Outras espécies de Staphylococcus

No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina.


Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina.


Gênero Catal. Motilidade NaCl 5% Oxidase Aeróbio Tétrade

Estrito

Staphylococcus + neg + neg não não

Planococcus + + + neg + variável

Micrococcus + neg + + variável variável

Enterococcus neg variável + neg não não

Streptococcus neg neg variável neg não não

Aerococcus neg neg + neg não +

Stomatococcus * variável neg neg neg não variável

* aderente ao meio

Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica

Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus

Coco GRAM +

Micrococcaceae

catalase+

Streptococcaceae-

DNAse

+

Staphylococcus sp.

Sensível à

novobiocina? -

Coagulase

- Staphylococcus

aureus+

+

Staphylococcus

não saprophyticus

Staphylococcus grupo saprophyticus



Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua sensibilidade à novobiocina.

Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus

Espécies de Staphylococcus

do gruponão saprophyticus

(Grupo epidermidis)

Espécies de Staphylococcus

do grupo saprophyticus

S. saprophyticus

S. cohnii

S. xylosus

S. epidermidis

S. haemolyticus

S. hominis

S. capitis

S. warneri

Staphylococcus saprophyticus

O Staphylococcus saprophyticus é de interesse clínico pois frequentemente causa infecção do trato urinário, especialmente em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e pielonefrite, e em casos extremos bacteremia.

As outras espécies de Staphylococcus de interesse clínico causam infecções parecidas com o S. epidermidis, e o tratamento é igual. Logo, o mais importante é discriminar o Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do Staphylococcus coagulase negativa.

Detecção de resistência de Staphylococcus aureus à oxacilina e ou vancomicina

Resistência aos Antibióticos

Sir Alexander Fleming

A primeira vez que um antibiótico foi usado, clinicamente, foi contra uma infecção por Staphylococcus aureus.

A penicilina funcionou bem contra infecções estafilocócicas até os anos 60, quando rapidamente começaram a surgir cepas resistentes à penicilina.


Para contornar o problema, foi criado o beta-lactâmico sintético meticilina, que era resistente à ação das beta-lactamases.

meticilina


Anel b-lactâmico

A meticilina funcionou bem até os anos 70, quando começaram a surgir as cepas resistentes a meticilina (MRSA).

meticilina



penicilina

PBP2a

Todo antibióticos beta-lactâmico se liga a enzimas que participam da síntese da parede celular chamadas PBPs (Proteínas Ligadoras de Penicilina). O MRSA desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP é plenamente funcional mas não tem afinidade por beta-lactâmicos.

(PVN) ligadora de penicilina = enzima


Devido a este mecanismo de resistência, as cepas MRSA/ORSA são resistentes não só à penicilina, mas a todos os antibióticos beta-lactâmicos!

No laboratório clínico, deve-se reportar num antibiograma resistência a todos os beta lactâmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas às vezes são suscetíveis = ocorre apenas “in vitro”) quando a amostra for MRSA mesmo quando são sensíveis a alguns beta lactâmicos in vitro.

A PBP2a é codificada pelo gene mecA. Este gene é carreado num elemento genético móvel chamado de Cassete Cromossômico Estafilocócico mec (SCCmec).

ModalidadeNivel de

expressãomecA PBP2a bla

CIM meticilinaFreq deSubp-RMaioria Subp-R

Borderline-BORSA

Baixo - - +++ 8 - -

MOD-SA Baxo - PBP 1,3,4 + 8 - -

Heterogênea Baixo + + + 1,5-3 200 107

Heterogênea Medio + + + 6-12 400 10-5

Heterogênea Alto + + + 10-200 800 103

Homogênea Alto + + +/- 800 800 1

b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulação resistente.

Staphylococcus aureus resistente à oxacilina-ORSA

Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à

oxaclina ( meticilina)

Para detectar a resistência a oxacilina no laboratório clínico, pode-se utilizar atécnica de disco difusão em ágar (Kirby-Bauer).

Também pode-se detectar cepas MRSA através de um ágar screening de oxacilina que é ágar Müller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentração de oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colônias indica resistência a oxacilina.

Para a determinação da concentração inibitória mínima de oxacilina, o método de macrodiluição em caldo deve ser feito com caldo Müller-Hinton com uma concentração final de 4% de NaCl.

O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina é uma alternativa válida em casos de dúvida, com uma eficácia diagnóstica praticamente similar ao do método de referência de dilução em ágar hiper salino, a concentração crítica de 6 µg/ml de oxacilina (NCCLS,1997).

Sistemas automatizados de micro diluição nem sempre oferecem sensibilidade, especificidade e eficácia suficientes para a detecção deste tipo de cepas, quando comparado aos métodos de referência (Sánchez, 1998),

Um método alternativo, rápido e eficaz, embora nem sempre aplicável em rotina, é a detecção do gene mecA, por métodos de amplificação por PCR (Murakami et al., 1991). Este método teria a vantagem de não estar sujeito às condições do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em grande número de isolados, empregado em casos de dúvida com valores de CIM próximo do limite.

Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à

oxacilina ( meticilina)

Resistência à Vancomicina

O mecanismo de resistência à vancomicina em Staphylococcus aureus ainda não foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes.

Em S. aureus, ocorrem fenômenos bizarros e pouco ortodoxos em relação à resistência à vancomicina. Primeiramente, a morfologia das colônias de VRSA é heterogênea, dando a impressão de contaminação.

VSSA VRSA VRSA

VSSA

VRSA

VRSA


Em 1997, foi relatada no Japão, a primeira cepa clínica de Staphylococcus aureus resistente à vancomicina (VRSA), pelo Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade Juntendo em Tóquio.

Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcus aureus resistentes à vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referência de queimados.

Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001.

ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCINOliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm; Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu, Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhDFaculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui, and Hiramatsu)


Outro fenômeno comum à oxacilina e a vancomincina é a ocorrência da resistência heterogênea (hetero-resistência) de S. aureus a estes antibióticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de vancomicina (<4g/mL), ou a oxacilina (<2g/mL), sendo consideradas sensíveis por métodos tradicionais de avaliação sensibilidade. Todavia, no caso da vancomicina por ex. estas cepas podem conter subpopulações de células que apresentam um MIC 8g/mL, numa freqüência de 1:106 células. Estas células não são detectadas por métodos tradicionais (antibiograma e MIC).

A única forma de se detectar uma cepa hetero-VRSA é através de uma análise de populações, onde se inocula diferentes diluições de uma suspensão bacteriana em meio de cultura sóilido adicionado de concentrações crescentes de vancomicina.


Quando o resultado é plotado num gráfico obtém-se três possibilidades distintas de curva:

VRSA

hetero-VRSA

VSSA


Sensível à Vancomicina

Observou-se também, por morfometria, que enquanto as cepas sensíveis à vancomicina apresentavam um espessamento da parede celular normal, VRSA apresentavam uma espessura bem maior, e a hetero-VRSA ficando entre a VRSA e VSSA


Parece portanto, que a resistência à vancomicina está ligada a uma exacerbação da síntese da parede celular, em que inúmeros genes regulatórios estariam envolvidos.

Até agora, todavia, ninguém parece saber por certo quais genes estão envolvidos e até que ponto. Uma das grandes limitações no estudo do mecanismo de resistência à vancomicina em S. aureus é que a emergência da resistência é um fenômeno ainda raro. Existem ainda poucas cepas no Mundo atualmente


Detecção da VISA/VRSA

Detecção da VISA/VRSA

Pelo laboratório de referência

Resistência a Macrolídeos

Os macrolídeos são antibióticos de primeira escolha só para Streptococcus pneumoniae, dentre os Gram positivos.

Os macrolídeos utilizados na clínica são:

•Eritromicina• Claritromicina• Azitromicina

Único macrolídeo disponível por 40

anos!!

O lançamento dos novos macrolídeos recentemente aumentou o uso destas drogas.


Os macrolídeos são inibidores da síntese protéica bacteriana. Os ribossomos bacterianos têm duas subunidades: 30S e 50S.

Os macrolídeos têm afinidade pela subunidade 50S do ribossoma bacteriano.

ribossomatRNA

mRNA

aa

Os macrolídeos interferem na síntese de proteínas por bloquear o sítio ativo do ribossoma por impedimento estérico.


A resistência aos macrolídeos ocorreu pela primeira vez, em 1953. A bactéria metilava o rRNA que perdia afinidade aos macrolídeos. A metilação é feita por uma adenina N6-metiltransferase, cujo gene é denominado erm [Erythomycin Ribosome Methilation].

Os genes erm geralmente estão localizados em elementos genéticos móveis, tal como transposons, geralmente inseridos no cromossoma. Alguns destes transposons residem em plasmídios.

Os genes erm muitas vezes estão associados à presença de genes que conferem resistência à tetraciclina (genes tet).


As lincosamidas (clindamicina) e as estreptograminas têm o mesmo alvo (50S

rRNA) que é modificado pelos genes erm.


Estes antibióticos são denominados como pertencentes ao grupo MLS

Os genes erm conferem resistência tanto à eritromicina quanto à clindamicina. Mas a resistência à clindamicina só é detectada in vitro com a indução por eritromicina.

erm- erm+


Clindamicina

(mal indutor)

Eritromicina

(bom indutor)

Achatamentodo Halo

Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no

antibiograma

• Para Staphylococcus aureus e coagulase negativos oxacilina resistentes, não testar cefalosporinas, penicilinas de amplo espectro ou Imipenem, pois falso resultados sensíveis podem ocorrer.

• S. saprophyticus mantem boa sensibilidade e não precisam ser testadospois dificilmente apresentam resistência à SMXTMP, quinolonas e nitrofurantoína, (drogas de escolha).

• Staphylococcus aureus ou coagulase negativos sensíveis à penicilina são sensíveis a todos os beta-lactâmicos. Testar pelo disco de penicilina e não de ampicilina. Se produtoras de beta-lactamase pelo testes acidimétrico, iodométrico ou da cefalosporina cromogênica(nitrocefin) considerar resistente a ampicilina e penicilina.

• Staphylococcus resistente a penicilina é produtor de penicilinase e é resistente a todas as penicilinas: ampicilina, amoxicilina, piperacilina e ticarcilina. A associação de penicilinas com inibidores: sulbactam, clavulanato e tazobactam só terão atividade para os estafilococos oxacilina-sensíveis.

• Staphylococcus aureus e outros coagulase negativos quando resistentes oxacilina considerar como resistentes a :Penicilinas (penicilina, ampicilina com e sem inibidor de beta-lactamase[sulbactam], amoxicilina com e sem inibidor [clavulanato], piperacilina com e sem inibidor, Ticarcilina com e sem inibidor), cefalosporinas de 1a, 2a, 3a, 4ª , Aztreonam( droga sem atividade contra Gram positivos), e Carbapenens(Imipenem, Meropenem e ertapenem)

• Staphylococcus spp com teste para gene mecA+= oxacilina R (existem testes de aglutinação específicos para detectar este gene.

• Staphylococcus spp podem desenvolver resistência durante a terapia com quinolonas, por isso amostras diferentes devem ser sempre testadas e não repetir o antibiograma anterior.

• Todo Staphylococcus aureus com halo para vancomicina 14mm deve-se testar a CIM e aqueles com CIM4g enviar a Laboratório de referência.

Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no

antibiograma

Prevalência de resistência

Prevalência de resistência

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