CENTRO UNIVERSITÁRIO DO PARÁ – CESUPA

CENTRO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE – CCBS

CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE SOLUÇÃO INJETÁVEL DE VITAMINA C

JOHNNY FRANÇA

LEONAN ALVES

JOÃO BATISTA OLVEIRA

KERMERSON

FRANCISCO ADALBERTO MACHADO

RENATA DIAS

BELÉM-PARÁ

2012

1. Objetivo:

O teste de endotoxina bacteriana é usado para detectar ou quantificar endotoxinas de

bactérias gram negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado.

Utiliza-se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus polyphemus ou do

Tachypleus tridentatus preparado e caracterizado como reagente LAL.

2. Método:

Método de coagulação em gel é baseado na formação de coágulo ou gel (método

semi-quantitativo). No método de coagulação em gel, a determinação do ponto final

da reação é feita a partir de diluições da substância sob teste em comparação direta

com diluições paralelas da endotoxina padrão. As quantidades de endotoxinas são

expressas em unidades de endotoxina (UE) definidas.

3. Determinação da Concentração de Endotoxina por Acido Ascórbico

Injetável:

a. Apresentação da amostra: 100 mg/Ml

b. Material:

- Tubos de ensaio;

- Pipetas automática;

- Agitador automático;

- Bico de bussen;

- Banho maria;

c. Procedimento analítico:

Primeiramente preparou-se o pool ,ou seja, Transferiu-se o volume da solução

injetável de ácido ascórbico para erlenmeyer (10 ampolas), em seguida

preparou-se diluições 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:100. Na diluição 1:2 transferiu-se

250 µL do pool para um tubo de ensaio, na qual são acrescentados mais 250 µL

de água pirogênica, conseguinte essa solução e agitada por 1 minuto,

conseguinte preparou-se a diluição 1:4 na qual é retirada 250 µL dessa diluição

1:2 e acrescenta mais 250 µL de água pirogênica e assim repeti-se o

procedimento respectivamente até a diluição 1:16 respectivamente. Já as

diluição 1:100 é necessário transferir 10 µL do pool e acrescentar 0.99 ml de

água pirogênica e por fim agitar por 1 minuto.

Logo depois de preparar as diluições misturou-se um volume de LAL com igual

volume das soluções acima, amostra, padrões, e controle negativo do teste em

tubos, em duplicatas. Incubaram-se os tubos por 1 hora a 37 ºC ± 1 ºC, evitando

vibrações. Após este período retirou-se os tubos um a um e verificando se houve

formação do gel, sendo que se verificou que não houve formação de gel logo

considerando um resultado negativo.

4 Resultados:

Determinação da Máxima Diluição Valida (MDV):. A MDV é a máxima

diluição válida permitida de um produto, na qual o limite de endotoxina pode ser

determinado. Para produtos que não têm uma concentração limite de endotoxina

oficial publicada (USP ou FDA), a equação de MDV considera a Mínima

Concentração Válida (MCV). A MCV é a menor concentração da amostra que

pode ser analisada E ainda possuir a sensibilidade adequada.

M: é a dose humana máxima por kg no período de uma hora.

K: é 5,0 UE kg -1 para drogas parenterais.

λ: sensibilidade declarada do Reagente LAL utilizado (0,06 UE mL-1).

CMV = M . λK

= 100 .0,06

5 = 1.2

DMV = MCMV

= 100x 1,2

0,06 = 87

d. Concentração de Endotoxina = 2 . 0,125

CE = 2 . 0,125

CE = 0,25 UE/mL

Laudo: > 0,12 UE/mL