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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA,

UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, PIBIT E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período : _08_/_2014_ a _07_/_2015_ ( ) PARCIAL (x) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Ações para criação de uma rede de instituições para Integração de pesquisa, ensino e extensão no âmbito da Segurança Alimentar e Nutricional para melhoramento da cadeia do açaí (Euterpe oleracea). Nome do Orientador: Agenor Valadares Santos Titulação do Orientador: Doutor Faculdade: Biotecnologia Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas (ICB) Laboratório: Laboratório de Biotecnologia de Enzimas e Biotransformações (LaBEB) Título do Plano de Trabalho: Bioprospecção de microrganismos presentes no fruto de açaí produtores de enzimas capazes de degradar corantes têxteis. Nome do Bolsista: Hermano Luiz Almeida de Lima Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq – AF ( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA – AF ( ) PIBIC/ INTERIOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR ( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR (X) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/PIBIT

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1. INTRODUÇÃO

Mais de 10% dos corantes têxteis utilizados pela indústria não tingem as peças de roupa

e acabam sendo despejados em lagos e rios (Pearce et al., 2003). Esses corantes, além de

esteticamente afetarem o local, são poluentes e danosos para o meio ambiente, uma vez que

podem afetar a fauna e a flora do local, afetando os níveis de oxigênio, a cadeia fotossintética

dos organismos do local, entre outros. (Wang, 1990).

A bioprospecção é utilizada há séculos pela sociedade e possuía grande gama de

aplicações, sendo uma delas a biorremediação. A biorremediação consiste na utilização de

organismos biológicos na remoção completa ou total de contaminantes de um determinado

local e surgiu como uma alternativa para os meios de tratamento físico-químicos já existentes.

Tais métodos de remediação não são muito eficazes e são caros. Assim, a biorremediação é

recomendada pela comunidade científica pelos seus bons resultados em laboratório,

demonstrando eficácia e rapidez (Gaylarde et al., 2005).

Uma das aplicações da biorremediação é na degradação de corantes despejados por

indústrias têxteis. Pesquisas envolvendo a degradação de corantes têm sido realizadas

frequentemente, principalmente envolvendo microrganismos que são capazes de produzir

enzimas que hidrolisam os corantes, realizando a descoloração dos mesmos. Essas pesquisas

têm demonstrado resultados muito promissores, possibilitando acumular conhecimentos para

que a aplicação da biorremediação possa sair do laboratório e ser utilizada em larga escala

(Khan et al., 2013).

O Pará é o estado com a maior produção de açaí (Euterpe oleracea) no Brasil e

representou aproximadamente 56% da produção nacional do fruto em 2012. (IBGE, 2014). O

açaí é amplamente estudado para compreender a sua composição e suas aplicações na

pesquisa e na indústria. (Ulbricht et al., 2012). A biodiversidade do fruto do açaí ainda é

desconhecida, e com os devidos estudos pode demonstrar um grande potencial em diversas

aplicações, uma delas sendo a biorremediação de corantes têxteis.

2. JUSTIFICATIVA

Tendo em vista que o despejo de corantes têxteis é um problema que necessita ser

combatido e os métodos mais comumente utilizados não possuem uma boa eficácia e custo

baixo, é necessário se criar novos métodos de remediação dos locais contaminados. A

3

utilização de microrganismos e suas enzimas pela biorremediação é a melhor alternativa já que

consegue degradar os corantes de forma rápida, gera menos danos ao meio ambiente, se

utiliza de fontes naturais de microbiota e possuem um custo mais baixo.

Sendo o açaí um fruta de grande importância na Amazônia, com crescente destaque

nacionalmente e como as informações sobre a microbiota do açaí ainda são escassas, estudos

envolvendo a aplicação dos microrganismos desse fruto são importantes, gerando a

possibilidade de aumentar o valor da cadeia produtiva do açaí, valorizando um produto regional

e criando um produto eficaz na remoção da poluição de rios e lagos contaminados pelos

corantes têxteis despejados pela indústria.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Isolar microrganismos dos frutos do açaí e testar a sua capacidade de degradação de

corantes têxteis.

3.2 Objetivos específicos

Realizar uma triagem dos microrganismos com a melhor capacidade de degradar

corantes têxteis.

Verificar em quais concentrações dos corantes e pH ocorre a degradação dos

corantes.

Verificar se a degradação dos corantes é originada da atividade de enzimas

extracelulares.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Obtenção do suco do açaí

Seguindo a metodologia utilizada por Pompeu et al (2009), após a lavagem, os frutos

foram amolecidos com água a 45°C durante 50 minutos sendo colocados em uma

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despolpadeira mecânica, sendo que os frutos foram colocados em um cilindro e o processo

ocorreu em um período de 4,5 minutos, sendo adicionado 1,5 L de água de acordo com o que

foi descrito por Rogez (2000).

4.2 Isolamento e cultivo de microrganismos

O suco proveniente destes frutos foi diluído em solução salina e inoculado em meio de

cultura TSA. Os microrganismos foram isolados utilizando técnicas de diluição seriada seguida

de inoculação em meio sólido TSA. Posteriormente as colônias isoladas foram selecionadas e

novamente inoculadas utilizando a técnica de estrias compostas para confirmar o isolamento.

As culturas foram submetidas à coloração de Gram para confirmar o isolamento e se ter a

informação se eram Gram positivas ou negativas.

4.3 Testes de degradação com diferentes concentrações de corantes

Após o isolamento dessas colônias, elas foram inoculadas em 5 ml de meio líquido LB

adicionado de diferentes concentrações de três corantes têxteis vermelhos (ácido, disperso e

azoico) e um corante têxtil azul índigo (diazoico). As concentrações escolhidas para o teste

foram 0,02%, 0,1%, 0,2% e 1%. Observando-se em quais dessas concentrações ocorreu a

degradação dos corantes e os melhores resultados.

4.4 Testes de degradação variando-se o valor pH do meio de cultura

Definidas as melhores concentrações dos corantes no meio, foram testados diferentes

valores de pH, em uma faixa entre 5 e 10, para verificar se a acidez ou a basicidade do meio

líquido afetariam o processo de degradação. Os resultados foram verificados em um período de

24 e 48 horas através da observação da coloração do meio.

4.5 Inoculação em meio quimicamente definido

As colônias foram inoculadas em placas contendo meio quimicamente definido

Middlebrook 7H9 acrescidas dos corantes na concentração previamente definida. A utilização

do meio quimicamente definido propicia saber todos os nutrientes presentes no meio de cultura

e tem como função evitar que proteínas presentes nos meios complexos.

5

4.6 Teste de degradação dos corantes através de extrato livre de microrganismos

Um extrato livre de microrganismos foi obtido através da centrifugação (10.000 RPM a

4ºC durante 10 minutos) do meio líquido contendo as colônias isoladas. Esse extrato foi

adicionado à solução contendo um dos corantes dissolvido em água destilada e foi observado

se a atividade de degradação ocorreu para verificar se ela era originada de atividade

enzimática.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO:

143 colônias foram isoladas e quando submetidas à coloração de Gram, 81 mostraram

ser Gram positivas e 63 mostraram ser Gram negativas. Desses isolados que foram testados

com diferentes concentrações de corante, as concentrações que apresentaram melhores

resultados foram de 1% para os três corantes vermelhos (8,7 g.L-1) e 0,2% para o corante azul

1,7 g.L-1). A partir dessa seleção, obtivemos 23 isolados positivos do total de 143 e terem

apresentado melhores índices de degradação em um espaço de tempo de 24 e 48 horas.

Com um número reduzido de colônias e com concentrações selecionadas de corantes,

os testes realizados com a definição de pH do meio de cultura demonstraram uma ampla faixa

de atividade ótima, que variou de pH 6,0 até pH 10,0. Pelo fato do pH 5,0 ser

consideravelmente ácido, a degradação dos corantes não foi observada. Daneshvar et al.

(2001) testaram a influência do pH na degradação de corantes através de microalgas, obtendo

resultados para pH ótimo em uma faixa que foi de pH 5 até 11, demonstrando que mesmo com

uma considerável mudança no pH, a degradação ainda pode ocorrer. Os resultados podem ser

visualizados nas figuras 1, 2, 3, 4 e 5.

Figura 1: Amostras de degradação do corante azul índigo diazoico em pH 10 após a inoculação com as bactérias do açaí. Nos tubos o número indica a cultura

utilizada e em C o meio de cultura não inoculado para controle.

91 117 122 129 131 152 153 162 159 C

6

Figura 2: Amostras de degradação do corante vermelho azoico em pH 9 após a inoculação com as bactérias do açaí. Nos tubos o numero indica a cultura

utilizada e em C o meio de cultura não inoculado para controle.

Figura 3: Amostras de degradação do corante vermelho disperso em pH 8 após a inoculação com as bactérias do açaí. Nos tubos o numero indica a cultura

utilizada e em C o meio de cultura não inoculado para controle.

Figura 4: Amostras de degradação do corante azul índigo diazoico em pH 7 após a inoculação com as bactérias do açaí. Nos tubos o numero indica a cultura

utilizada e em C o meio de cultura não inoculado para controle.

Figura 5: Amostras de degradação do corante vermelho ácido em pH 6 após a inoculação com as bactérias do açaí. Nos tubos o numero indica a cultura

utilizada e em C o meio de cultura não inoculado para controle.

30 50 122 168 163 152 159 153 129

1

9 9

152 111

1

9 9

C

1

9 9

39 131 152 153 163 C

122 117 111 109 91 50 48 39 30 11 3 C

C 3 11 18 20 39 30 41 47 48 50 91

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Os resultados obtidos após 24 horas da inoculação nos meios contendo o corante

vermelho ácido, o vermelho disperso e o corante azul índigo diazoico foram positivos, já

demonstrando uma boa capacidade de degradação. Uma exceção foi no caso do corante

vermelho azoico no qual os resultados apareceram somente após 48 horas em alguns casos e

em alguns valores de pH (5, 6, 7 e 8) não foi possível observar a degradação do corante.

As atividades de algumas colônias em descorar os quatro corantes podem ser

visualizadas nos gráficos a seguir nas figuras 6, 7, 8 e 9.

A B

Figura 6: Observa-se degradação do corante vermelho disperso. Nos gráficos A e B observamos o resultado após 24 horas. No gráfico C

observamos o resultado após 48 horas.

C

X

8

A B

Figura 7: Observa-se degradação do corante vermelho ácido. Nos gráficos A e B observamos o resultado após 24 horas. Nos gráficos C e D observamos o

resultado após 48 horas.

Figura 8: Observa-se degradação do corante vermelho azoico após um período de 48 horas.

C D

9

Os resultados obtidos demonstraram que dois corantes vermelhos (ácido e disperso) e o

corante azul (diazoicos) foram degradados mais rapidamente, enquanto que um dos corantes

vermelhos (azoico) apresentou maior dificuldade em ser degradado de morando um tempo de

24 horas a mais que os demais corantes. Os corantes que foram degradados mais rápidos

possuem classificações de corantes ácidos, diazoicos, e dispersos. O único corante que não foi

degradado de forma tão eficiente possui uma classificação de corante azoico.

Resultados similares para a degradação de corantes ácidos, dispersos e diazoicos já

foram relatados em várias publicações. Saratale et al. (2009) alcançaram resultados positivos

para a degradação do corante diazoico Verde Reativo 19 utilizando Micrococcus glutamicus.

Junnarkar et al. (2006) conseguiram degradar o corante diazoico Vermelho Direto 81 ao utilizar

um consórcio de bactérias. Couto et al. (2005) conseguiram degradar o corante ácido Azul

Brilhante de Remazol R utilizando a lacase de Trametes hirsuta. Kurade et al. (2012) utilizaram

um consórcio de bactérias e leveduras para degradar o corante disperso Escarlate RR e

Sugimori et al. (1999) utilizaram Cunninghamella polymorpha para degradar o corante disperso

Azul Disperso 60.

A B

Figura 9: Observa-se degradação do corante azul índigo diazoico. No gráfico A e B observamos o resultado após 24 horas. No gráfico C e D observamos o

resultado após 48 horas.

C D

10

Vários dos trabalhos realizados até hoje utilizando sistemas biológicos e suas enzimas

para a degradação de corantes utilizaram corantes azoicos e muitos conseguiram resultados

positivos (Tan et al., 2012; Saratale et al., 2013; Ali et al., 2013), porém neste trabalho os

resultados envolvendo o corante azoico foram os que apresentaram resultados mais lentos

para a degradação destes corantes.

O teste de degradação realizado com as colônias inoculadas no meio quimicamente

definido e posteriormente inoculadas em meio líquido foram positivos em 24 horas,

demonstrando que as colônias que cresceram na placa com o meio quimicamente definido

eram as colônias de interesse. Os resultados podem ser visualizadas na figura 10.

O teste realizado com o extrato livre de microrganismos demonstrou uma atividade

positiva, indicando que a degradação do corante têxtil se deu pela atividade de enzimas

extracelulares liberadas pelos microrganismos isoladas do açaí. Zhang et al. (2012) isolaram

uma lacase recombinante de Escherichia coli e realizaram testes de degradação com uma

variedade de corantes, obtendo resultados positivos. Trovalest et al. (2007) purificaram e

utilizaram a lacase de Pycnoporus sanguineus para degradar o corante ácido Azul Ácido 62. Os

resultados podem ser observados nas figuras 11 e 12.

Figura 11: Amostras de degradação do corante azul índigo diazóico em pH 9,0 após o extrato livre de microrganismos ser adicionado na

solução.

Figura 10: Amostras de degradação do corante azul índigo diazoico com a utilização de colônias previamente inoculadas em meio

quimicamente definido Middlebrook 7H9.

11 111 122 131 C 152 159 162 163 168

11

6. CONCLUSÃO

Este projeto é um projeto pioneiro em explorar o potencial das bactérias isoladas do açaí

para a degradação de corantes têxteis. Esses microrganismos e, principalmente suas enzimas,

demonstraram uma ótima capacidade de aplicação na biorremediação de locais poluídos por

corantes têxteis, fornecendo assim uma alternativa eficaz e segura. Isso demonstra mais uma

possibilidade de uso do açaí, que é uma planta regional e que é cada vez mais explorada e

utilizada em diversas áreas da indústria. Portanto, um estudo mais específico e detalhado

dessas enzimas será realizado para que se obtenha um produto que posteriormente poderá ser

utilizado em uma escala maior.

PUBLICAÇÕES

Resumo do trabalho aceito na 23rd International Union for Biochemistry and Molecular

Biology com o título “Bioprospecting Of Microorganisms Present In The Açaí Berry Producers

Of Enzymes Capable Of Degrading Textile Dyes” a ser apresentado no período de 24 a 29 de

Agosto. Os autores do trabalho são Hermano Luiz Almeida de Lima (Graduando em

Biotecnologia - UFPA), Raoní Kempfer Pantoja (Graduando em Biotecnologia - UFPA), Hervé

Louis Ghislan Rogez (Professor Associado - UFPA), Agenor Valadares dos Santos (Professor

Adjunto - UFPA). Resumo disponível no Anexo 1.

ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES

O projeto continuará com purificação das enzimas que degradam os corantes e fazer um

estudo cinético das mesmas.

Figura 12: Amostras de degradação do corante vermelho azóico em pH 9,0 após o extrato livre de microrganismos ser adicionado na

solução.

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Biotechnology, v.11, n.24, p. 6603-661.

DIFICULDADES Eventos de contaminação de culturas. PARECER DO ORIENTADOR

O Aluno Hermano Luiz Almeida de Lima desenvolveu as atividades neste projeto a

partir de março de 2015 apresentando um grande aprendizado. O Aluno ainda purificará as

enzimas que degradam os corantes e fazer um estudo cinético das mesma. Estamos

aguardando o resultado de bolsas da FAPESPA. O aluno teve um aproveitamento excelente no

desenvolvimento deste projeto.

DATA : ___10___/____08_____/____2015____

_________________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR

____________________________________________

ASSINATURA DO ALUNO

INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e da instituição

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ANEXO 1:

09609 - Poster Session 3

J - 170 - BIOPROSPECTING OF MICROORGANISMS PRESENT IN THE AÇAÍ BERRY

PRODUCERS OF ENZYMES CAPABLE OF DEGRADING TEXTILE DYES.

Hermano Luiz Almeida de Lima 1, Raoní Kempfer Pantoja 1, Hervé Louis Ghislain

Rogez 2, Agenor Valadares dos Santos 1

1 Universidade Federal do Pará, Laboratório de Biotecnologia de Enzimas e Biotransformações (Pará, Brasil), 2 Universidade Federal do Pará, Centro de Valorização Agroalimentar de Compostos Bioativos da Amazônia (Pará, Brasil)

INTRODUCTION The discharge of textile dyes on large scale into rivers and lakes is a toxic process for the environment. The use of enzymes in the dye degradation process has been an interesting alternative because of its reduced cost and high efficiency due to the application of microorganisms and plants. OBJECTIVES The aim is to isolate microorganisms from açaí berries (Euterpe oleracea) with the potential to degrade textile dyes. MATERIALS AND METHODS The açaí berries were reaped and processed for the attainment of the juice. The juice was inoculated in TSA medium and the microorganisms were isolated through serial dilution. These microorganisms were isolated again through streaking, then submitted to Gram staining. The colonies were inoculated in liquid medium LB containing different concentrations of three red-colored and an indigo-colored dyes and it was verified in which concentrations their degradation happened. These colonies were inoculated once again in liquid medium with selected concentrations of the dyes and specific pH (from 5 to 10). To evaluate if the degradation was a result of the activity of extracellular enzymes, the microorganisms-free extract was analyzed in different dyes. DISCUSSION AND RESULTS Out of the 143 isolated, it was observed that 81 were Gram-positive and 63 Gram-negative and 23 colonies were selected with the potential to degrade the dyes in concentrations of 1% for three dyes and 0,2% for one dye. The dye degradation activity showed to be diverse when the medium’s pH was varied. The values of optimum pH for the degradation observed in the majority of the microorganisms were in the range between 6 and 10. It was observed that the dye degradation activity was originated from extracellular enzymes present in the microorganism-free extract. CONCLUSIONS The isolated microorganisms from the açaí showed a good capacity to degrade the textile dyes, with this activity being originated from extracellular enzymes, demonstrating the biotechnological potential of these microorganisms.

Keywords: Açaí, Enzyme, Bioprospecting

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FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO :

1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?

2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho ? 3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos

propostos? 4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre

a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo?

5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório 6. Parecer Final:

Aprovado ( ) Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações) Reprovado ( )

7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________ Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.

Data : _____/____/_____.

________________________________________________

Assinatura do(a) Avaliador(a)